WO1989009769A1 - Substance q-2819 and process for its preparation - Google Patents

Substance q-2819 and process for its preparation Download PDF

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WO1989009769A1
WO1989009769A1 PCT/JP1989/000402 JP8900402W WO8909769A1 WO 1989009769 A1 WO1989009769 A1 WO 1989009769A1 JP 8900402 W JP8900402 W JP 8900402W WO 8909769 A1 WO8909769 A1 WO 8909769A1
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WO
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chrysosporium
strain
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culture
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Application number
PCT/JP1989/000402
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Inventor
Harumitsu Imai
Hidenori Yazawa
Koji Nagai
Takeshi Saito
Shu Fang; Liang
Original Assignee
Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Shanghai Institute Of Materia Medica Academia Shin
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Publication date
Application filed by Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai Institute Of Materia Medica Academia Shin filed Critical Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/92—Naphthopyrans; Hydrogenated naphthopyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a substance Q-281, a method for producing the substance, and a strain producing the substance.
  • Q-2819 substances have the effect of removing reactive oxygen species in the body and preventing or reducing the production of peroxidized lipids, so they are used as therapeutic agents for various diseases that may be caused by these reactive oxygen species. Useful.
  • Oxygen is indispensable for living organisms to maintain life, such as energy production and metabolism.
  • Oxygen is a so-called reactive oxygen species such as oxygen anion radical, hydrogen peroxide, and hydroxyradical by a reaction in an energy producing system, an enzymatic reaction, a reaction by ultraviolet light, or radiation.
  • Reactive oxygen species are useful for living organisms, such as oxygen-adding enzymes and bactericidal action of leukocytes, but are abundant in living organisms such as oleic acid, linoleic acid, y-norenic acid, and arachidonic acid. It promotes the peroxidation of unsaturated fatty acids that form phospholipids in biological membranes, forming lipid peroxides.
  • This lipid peroxide induces the generation of alkoxy radicals and hydroxy radicals in the same manner as the above-mentioned reactive oxygen species, attacks biological membranes, and causes membrane damage or inactivation of various useful enzymes (metabolism). (10) Special Oxygen for 1980.
  • Special Oxygen for 1980.
  • Enzymes involved in the metabolic deactivation of the above-mentioned reactive oxygen species such as monooxide dismutase (SOD), pitalase, and glutathione peroxidase, and various antioxidants such as «—tocopherol (vitamin E) Vitamins with oxidizing ability exist Therefore, normal living body is maintained by these actions.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-152374 discloses a hydroxybutenolide derivative having a scavenging effect on reactive oxygen species and organic radical species, and the derivative is characterized by ischemic heart dysfunction, It describes that it has a therapeutic and preventive / improving effect on mnemonic disorders such as ischemic cerebral dysfunction and ischemic renal disorder.
  • the compound of the present invention has a lipid peroxide production inhibitory action and a superoxide ionone radicals action, and is useful as a prophylactic and therapeutic agent against the above various diseases. It is.
  • antiarrhythmic agents include, for example, antiarrhythmic agents, antimyocardial infarction agents, anticerebral infarction, blurring, senile dementia preventive agents, circulatory system improving agents such as improved treatment after subarachnoid hemorrhage, renal function Ameliorant, stress anesthetic ulcer treatment, anti-atherosclerotic, anti-inflammatory, platelet aggregation inhibitor,
  • examples include an autoimmune disease therapeutic agent, an anti-rheumatic agent, an anti-scleroderma case, an anti-pulmonary fibrosis agent, an anti-retinopathy agent, and a cataract prevention / treatment agent.
  • the present invention relates to a Q-2819 substance, a method for producing the substance, and a microorganism producing the substance.
  • the compound Q-2819 of the present invention is a compound specified by the following physicochemical properties and chemical structural formula.
  • the target compound of the present invention also includes the above isomers or salts thereof. (Brief description of drawings)
  • Figure 1 shows the UV absorption spectrum of the Q-28 19 substance.
  • Figure 2 shows the infrared absorption spectrum of the Q-2819 substance.
  • FIG. 3 shows the 1 H nuclear magnetic resonance spectrum of the Q-28 19 substance.
  • FIG. 4 shows a 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum of the Q-2819 substance.
  • Figure 5 shows the mass spectroscopy spectrum of the Q-2819 substance.
  • FIG. 6 shows the sacred oxygen benign activity of the Q-28 19 substance.
  • FIG. 7 shows the antioxidant activity of Q-2819 substance.
  • FIG. 8 shows the activity of the Q-2819 substance to inhibit Fe W -induced lipid peroxidation.
  • the activity of removing the reactive oxygen species of the Q-28 19 substance of the present invention is shown together with the measuring method.
  • the superoxide anion scavenging activity of the compound of the present invention was measured by the method of Mc Cord and Fridovich (J. Biol. Chem. 244 (22) 6049-6055, 1969). It was measured.
  • Chi Sunawa 1 X 10- 4 M EDTA, 1 X 10- M full et Li Shi Bok chrome C (Ferri cytochrome C).
  • 5 x 10- 5 M 5 X 10 one 2 M force Li containing xanthine (Xanthine) Xanthine oxidase in potassium phosphate buffer (pH 7.8) to increase the absorbance at 550 nm to 25 CC per minute (Xanthine Oxidase :) was added to the reaction system.
  • One unit (u) of SOD activity is defined as an activity that suppresses the increase in absorbance at 550 nm to 50% in the present reaction system, and indicates the superoxide side activity of the compound of the present invention.
  • the SOD was expressed as a concentration showing 1 unit of activity.
  • the Q-2819 substance exhibited a superb oxidized two ounce force venge activity.
  • the Q-2819 substance, at 3.8 X 10- 4, showed SOD 1 unit of the enzyme activity of the same order of activity.
  • an antioxidant has the activity of decolorizing the stable radical 1,1-diphenyl-12-vitaryl hydrazyl (DPPH). Therefore, the antioxidant activity of the compound of the present invention (Q-2819) was measured according to the method of Blois (Nature 181 1199-1200, 1958) as follows.
  • DPPB was dissolved in ethanol so as to be 0.1 ⁇ ⁇ , mixed with the test compound, and the absorbance at 517 nm was measured after 30 minutes.
  • Fig. 7 shows the results.
  • the cerebral cortex of a Wistar male rat (body weight 200 g) was excised and 50 A double volume of ice-cold 5 OmM Tris-HCI buffer (pH 7.7) was added, homogenized, and used as a tissue trituration solution. A ferric chloride solution is added to the tissue trituration solution to generate lipid peroxide. Lipid peroxide was quantified with thiobarbituric acid (TBA) according to the Yagi method (Vitamin 37 105-112, 1968).
  • TSA thiobarbituric acid
  • the compound (Q-2819) of the present invention inhibits Fe-induced lipid peroxidation.
  • the compound of the present invention is mixed with a pharmacologically acceptable carrier, excipient, diluent, or the like known per se, and mixed with a pharmaceutical composition [eg, tablets, capsules (software)] according to a method known per se. Capsules and microcapsules), liquids, suppositories, injections, nasal preparations] can be safely administered orally or parenterally.
  • a pharmaceutical composition eg, tablets, capsules (software)
  • the dosage varies depending on the administration subject, administration route, symptoms, etc., but when orally administered to the above mammal, the compound (I) is usually administered in a single dose of about 0.1 mg / l to 100 mgZkg body weight, preferably Administer about O.sm Zkg 50mg Zkg body weight about 1 to 3 times a day.
  • a suppository When administered parenterally, for example, a suppository may be administered as compound (I) at a dose of about 5 mg to 10 mg / kg once or twice a day. As an injection, it is desirable to give about O.imgZkg ⁇ : L0mg / 3 ⁇ 4g once or twice a day as compound (I).
  • binders eg, hydroxypropyl propylcellulose, hydroxymethyl propylmethyl cellulose, macrogol, etc.
  • disintegrants eg, starch, carboxysimyl cellulose cellulose) Etc.
  • excipients eg, Lactose, starch, etc.
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc, etc.
  • isotonic agents eg, glucose, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, Clobutanol, methyl para-oxybenzoate, propyl para-oxybenzoate, etc.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium tantalate buffer, etc.
  • a solubilizing agent eg, polybutylpyrrolidone, triacetin, propylene glycol, etc.
  • a solubilizing agent eg, polybutylpyrrolidone, triacetin, propylene glycol, etc.
  • the Q-21819 substance is obtained by cultivating a microorganism producing the Q-281 substance belonging to the genus Crizosporium, accumulating the Q-289 substance in the culture, and then removing the substance from the culture. It can be manufactured by sampling.
  • An example of fungi belonging to the chestnut Sosuporiumu genus for use in the present invention is a cedar forest China Beijing Beihai Park: Collected the click re Sosupori isolated from a soil sample ⁇ beam Es pin one (Chrysosporium sp. ) Q-28 19 strains. The morphological and physiological characteristics of this strain are as follows.
  • This strain is an imperfect filamentous fungus that forms no conidia on stems that have branched off from aerial mycelia, with no complete generation developed in various media.
  • the aerial mycelium has a length of 50 Am, a width of 0.5 to 2 m, a colorless ... smooth surface and a partition wall. Branches are sharp and often invade primary and secondary, forming dendritic structures. Conidiophores are clearly distinct from aerial hyphae Indistinguishable. Conidia are formed one by one at the tip of the hypha and are also formed in the middle of the hypha, often with 2 to 4 conidia on the same hypha. It is also observed that one piece is formed at the tip of a short branch generated from the side of the hypha.
  • Conidia are unicellular, colorless or pale, with small wart-like projections on the surface, subspherical to club-shaped, cut at the lower end, and 3 to 4.1.5 to 2.5 Am in size.
  • the conidium formed in the middle of the hypha is cut at both ends in a sagging shape and is wider than the hypha supporting it. Chlamydospores are not formed.
  • the colonies on the malt agar medium are 24, reach 2.5 cm in diameter in 2-3 weeks, do not spread very much and rise with dense mycelia, and the surface is powdery or felty. The color is white at the beginning of the cultivation, and then becomes pale brown with pink. The color on the back is yellow-brown. Colonies on potato dextrose agar differ from colonies on malt agar in that they appear grayish green in 2-3 weeks and diffuse a yellow-brown pigment into the medium. In addition, it is considered as Wapec. Therefore, this strain was named Chrysosporium sp. Strain Q-2819. This strain has been deposited with the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the name BP-2370 No. BP-2370. This strain was imported from the People's Republic of China via the Yokohama Plant Protection Center under the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Directive 62, No. 522, Permission Direction Number.
  • the chrysosporium sp.Q-2819 strain of the present invention is not limited to strains isolated from nature, but also those obtained by artificially mutating the strain with ultraviolet rays, X-rays, chemical agents, etc., and those naturally mutant strains. Inclusion Is what you do.
  • the cultivation of the Q-2819 substance-producing bacterium belonging to the genus Chrysosporium is performed according to the method for culturing general microorganisms, but the deep culture method using a liquid medium is usually advantageous.
  • the medium used for the culture may be any medium containing a nutrient used by the producing bacterium. That is, a synthetic medium, a semi-synthetic medium, or a natural medium is used.
  • the composition of the medium is, for example, D-xylose, glucose, D-fractose, L-rhamnoose, mannitol, glycerin as a carbon source. , Dextrin, starch, vegetable oils, etc.
  • Nitrogen sources include meat extract, peptone, gluten meal, cottonseed oil, soybean powder, peanut powder, fish meal, corn steep liquor, dried yeast, yeast extract, and ammonium sulfate. , Ammonium nitrate, urea and other organic or inorganic nitrogen sources are used.
  • metal salts sulfates such as Na, K, Mg, Ca, Zn, and Fe, nitrates, chlorides, carbonates, and phosphates are added as necessary.
  • an antibiotic generation promoting substance such as methionine, cystine, cystine, methyl oleate, lard oil, silicone oil, surfactant, or a defoaming agent is appropriately used.
  • the culturing temperature is desirably in the range of about 18 to 28, preferably around 25, and the pH of the medium is preferably about 25. Good results are obtained when kept in the range of about 5 to 10, preferably about 6 to 8.
  • the cultivation period varies depending on the composition of the medium, temperature, etc., but is generally about 1 to 5 days, and the target substance is selectively accumulated at the end of the cultivation.
  • a common microorganism The method of isolating antibiotics from the culture of is applied. Since the Q-2819 substance is contained in the culture solution, remove the cells by centrifugation or filtration, and then extract the effective substance from the filtrate. In other words, use the difference in solubility and solubility in an appropriate solvent, the difference in precipitation and the rate of precipitation from a solution, the difference in adsorption affinity with various adsorbents, and the difference in distribution between two liquid phases. It is separated, collected, and purified by the means used to produce common antibiotics. This method can be used alone as needed, or combined in any order and applied repeatedly.

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Description

明 細 書 Q - 2 8 1 9 物 質及 び そ の 製 法
(技 術分野 ）
本発明は、 Q - 2 8 1 9物質、 該物質の製造法および該物質を生 成する菌株に関する。
Q - 2 8 1 9物質は、 生体内における活性酸素種を除去し、 過酸 化脂質の生成の防 It乃至低下作用を有する為、 これら活性酸素種 に起因すると思われる各種疾患の治療薬と して有用である。
(背 景 技術 ）
生体にとって酸素は、 エネルギー産生、 代謝等生命の維持に必 要不可欠である。 酸素は、 エネルギー産生系での反応、 酵素反応、 紫外線、 放射線による反応で酸素ァニオ ンラ ジカル、 過酸化水素， ヒ ドロキシラ ジカル等の所謂活性酸素種となる。 活性酸素種は、 酸素添加酵素、 白血球の殺菌作用等生体にと り有用である半面、 生体に豊富に存在するォ レイ ン酸、 リ ノ ール酸、 y ノ レン酸、 ァ ラキ ドン酸等の生体膜のリ ン脂質を形成する不飽和脂肪酸の過酸 化を促進し、 過酸化脂質を形成する。 この過酸化脂質は、 上記活 性酸素種と同様にアルコキシラジカルゃヒ ドロキシラジカルの発 生を惹起し、 生体膜を攻撃し、 膜障害乃至種々の有用酵素類の失 活を招く （代謝丄 （10) 1 9 7 8年特集活性酸素 ）。 しかるに生 体内には例えば、 スーノ、。一オキサイ ドジスムターゼ （ S OD ) 、 力 タラーゼ、 グルタチォ ンペルォキシダ一ゼ等の上記活性酸素種の 代謝失活に関与する酵素類や、 《 — トコフ エロール （ ビタ ミ ン E ) を始めとする各種の抗酸化能を有する ビタ ミ ン類等が存在してお り、 これらの作用により正常な生体維持がなされている。 しかし 何らかの理由により、 これらの物質による適切な防御機構に欠損 が生じたり、 またはこれらの防御機構の能力を超える活性酸素種 の発生や、 過酸化脂肪質の生成、 蓄積が起ることがしばしば認め られる。 かかる防御機構の欠損等が生じた場合、 過酸化が連鎖反 応的に進行し、 種々重大な生体障害が惹起する。 これら障害の代 表的なものとして、 血小板凝集による各種疾病、 炎症、 肝障害、 動脈硬化、 溶血、 老化乃至老人性疾患、 網膜症、 肺障害、 或種薬 物による心及び肺障害、 虚血性血管疾患、 虚血性心疾患、 虚血ー 再還流時の臓器障害等が挙げられている [実験医学 £ (12)，
1 986年特集 生体内フリーラジカルと疾患 ] 。
一般に抗酸化作用を有する薬剤は、 上記疾病の予防および治療 を目的として開発されたものである。
たとえば、 特開昭 6 3 - 1 5 2 3 7 4においては活性酸素種及び有機 ラジカル種の消去作用を有するヒ ドロキシブテノライ ド誘導体が 開示されており、 該誘導体が虚血性心機能障害、 虚血性脳機能障 害、 虚血性腎障害等の諳障害に対し治療及び予防改善効果がある ことが記載されている。
本発明化合物は、 過酸化脂質の生成抑制作用及びスーパ—ォキ サイ ドア二オンラジカルス力べンジ作用を有しており、 上記の種 々の疾患に対して、 予防薬及び治療薬として有用である。
これら使用の具体例としては、 たとえば抗不整脈剤、 抗心筋梗 塞剤、 抗脳梗塞、 ぼけ、 老人性痴呆症予防剤、 クモ膜下出血後 の治療改善などの循環器系改善剤、 腎機能改善剤、 ス ト レス性消 化器潰瘍治療剤、 抗動脈硬化剤、 抗炎症剤、 血小板凝集抑制剤、 自己免疫疾患治療剤、 抗リ ューマチ剤、 抗強皮症例、 抗肺繊維症 剤、 抗網膜症剤、 白内障予防 · 治療剤などが挙げられる。
(発 明 の 開示）
本発明は Q- 2819物質、 該物質の製造法および該物質を生成 する微生物に関する。
本発明の化合物 Q -2819物質は、 下記理化学的性状および化 学構造式によって特定される化合物である。
化学構造式 ：
Figure imgf000005_0001
理化学的性状 ：
Q- 2819 物 質
(1) 紫外線吸収スベク トル 第 1図 （メタノ一中）
(2) 赤外線吸収スぺク トル 第 2図 （臭化カ リ ウム錠）
(3) ¾-核磁気共鳴スぺク トル 第 3図 （ DMSO- -d6 500Μζ )
(4) 13c-核磁気共鳴スぺク トル 第 4図 （ DMSO - -d6 , 125Mz )
(5) 質量分析（EI- MS ) 第 5図 258 (M + )
(6) 分 子 量 258
(7) 分 子 式 14 005
(8) 微黄色針状晶
(9) 占 275— 280
ο) 比旋光度 [ « ] 0° ( CI, DMSO ) O— 2 8 1 Q 物 皙 塩基性、 中性、 酸性の区別 酸性物質 溶 解 性 DMS Ω ドリ J ジン アル力り J フ
に可溶 o
メタノール、 エタノール、 ァセ 卜 ノ、 , 13 卜ー 卜 リ ノレ、 酸 ナルに雞' 。
水、 クロロホゾレム、 ベンゼン、 へキサンに不溶。
(13) 薄層クロマ トグラフィ一 o Rf = 0.32
ぐシリカゲル 60 F254 を (クロ口ホルム ： メタノール 使用。 = 5 : 1 )
o Rf = 0.26
UVランプ 254 nm検出。〉
(酢酸ェチル ： メタノール 5 ： 1 )
o Rf 0.63
(クロ口ホルム ： メタノール
：醉酸 1 0： 2： 0.1 ) Q- 2819物質は、 上記化学構造式から明らかなよう に、 上記式 ( I ) 以外に下記 2種類の互変異性体として存在しう る。
Figure imgf000006_0001
また、 これらの化合物は、 酸性物質であ り、 塩を形成する。 塩 としてはアルカ リ金属塩、 塩基性アミノ酸の塩が挙げられる。 ァ ルカリ金属塩としては、 たとえばナ トリ ウム塩、 カ リウム塩など が挙げられる。 塩基性アミノ酸としては、 たとえばアルギニン塩 リ ジン塩、 オル二チン塩などが挙げられる。 本発明の目的化合物は、 上記異性体またはそれらの塩も包含する。 ( 図面の簡単な説明 ）
第 1 図は、 Q- 28 1 9物質の紫外線吸収ス ペク トルを示す。
第 2図は、 Q - 28 1 9物質の赤外線吸収スペク トルを示す。
第 3図は、 Q- 28 1 9物質の 1 H 核磁気共鳴スペク トルを示す。 第 4図は、 Q- 28 19物質の 13C-核磁気共鳴スぺク トルを示す。 第 5図は、 Q- 28 19物質の質量分析スペク トルを示す。
第 6 図は、 Q— 28 1 9物質のスーパ一ォキサイ ドア二オ ンス力 ベンジ活性を示す。
第 7図は、 Q- 281 9物質の抗酸化活性を示す。
第 8図は、 Q- 28 19物質の FeW - induced脂質過酸化抑制活 性を示す。
(発明を実施するための最良の形態 ）
本発明の Q- 28 1 9 物質の活性酸素種の除去活性を測定方法と と も に示す。
(A) スーパ一ォキサイ ドア二オ ンス 力べン ジ活性の測定
試 験 方 法
本発明化合物 （Q— 28 19 )のス ーパ一ォキサイ ドアニォ ンスカ ベ ンジ活性の測定を Mc Cord と Fr idovichの方法 （ J. Biol . Chem. 244 (22) 6049-6055, 1969 ) を用いて測定した。 すなわ ち、 1 X 10— 4 M EDTA、 1 X 10— M フ エ リ シ 卜 クローム C ( Ferri cytochrome C ) . 5 x 10— 5 Mキサンチン （ Xanthine ) を 含む 5 X 10一2 M力 リ ゥムリ ン酸緩衝液 （ potassium phosphate buffer ) ( pH 7.8 ) 中に 550 nmの吸光度の増加力 25 "C 1 分 間あたり 0.025 になるよう に キサ ンチ ン ォキ シダー ゼ ( Xanthine Oxidase：) を加えて反応系とした。 SOD活性 1 ュニッ ト （u ) は、 本反応系における 550 nm の吸光度の増加 を 50 %に抑制する活性と定義されており、 本発明化合物のス ーパ一ォキサイ ドア二オンス力べンジ活性を、 SOD 1ュニッ トの活性を示す濃度で表わした。 第 6 図に示すよう に、 Q— 2819物質は、 スーパ一ォキサイ ドア二オンス力べンジ活性を示した。 また Q— 2819物質は、 3.8 X 10— 4 で、 SOD 1 ユニッ トの酵素活性と同程度の活性 を示した。
(B) 抗酸化活性の測定法
試 験 方 法
一般に抗酸化剤と呼ばれているものは、 安定なラジカルである 1， 1 —ジフエニル一 2—ビタ リ ル ヒ ドラ ジル （ DP PH ) を脱色 する活性を有している。 そこで本発明化合物 （Q- 2819 ) の 抗酸化活性の測定は Blois の方法 （Nature 181 1199— 1200， 1958年） に従い、 以下のよう におこなった。
即ち、 DPPB [をエタノールに 0·1πιΜになるよう に溶解し、 試 験化合物と混合し、 30分後に 517nmの吸光度を測定した。 その結果を第 7図に示す。
Q - 2819 は、 α— トコフエロールと同程度の抗酸化能を有し ていた ο
(C) 過酸化脂質生成抑制活性の測定法
試 験 方 法
Wistar系雄性ラ ッ ト （体重 200 g )の大脳皮質を摘出し、 50 倍量の氷冷 5 OmM Tris-HCI buff er ( pH 7.7 ) を加え、 ホモ ジナイズし、 組織磨砕液と した。 この組織磨碎液に、 塩化第二 鉄溶液を加え、 過酸化脂質を生成させる。 過酸化脂質の定量は、 八木法 （ ビタ ミ ン 37 105— 112, 1968年） に従い、 チォバル ビツール酸 （ TB A ) で定量した。
その結果を第 8 図に示す。
本発明化合物 （Q- 2819 ) は、 Fe- induced脂質過酸化を
IC50 = 5 X 10 5 Mで抑制した。
本発明化合物はそれ自体公知の薬理的に許容される担体、 賦 形剤、 希釈剤などと混合し、 自体公知の方法に従つ.て、 医薬組 成物 [ 例、 錠剤、 カプセル剤 （ ソフ トカプセル、 マイクロカプ セルを含む ） 、 液剤、 坐剤、 注射剤、 経鼻剤 ] と して経口的も しく は非経口的に安全に投与することができる。 投与量は投与 対象、 投与経路、 症状などによっても異なるが、 上記哺乳動物 に経口的に投与する場合、 化合物 （I) と して通常 1 回量と して 約 0.1 mg / 〜 lOOmgZkg体重、好ましく は約 O.sm Zkg 50mg Zkg体重を 1 日 1〜 3回程度投与する。
また、 非経口的に投与する場合、 たとえば坐剤と しては化合 物 （I) と して約 5mg〜 10mg/kg 1 日 1 ないし 2回投与すれば よい。 注射剤としては化合物 （I)として約 O.imgZkg〜： L0mg/¾g を 1 日 1 ないし 2回行う ことが望ましい。
上記経口製剤、 例えば錠剤を製造する際には、 結合剤 （例、 ヒ ドロキ シプロ ピルセルロー ス、 ヒ ドロキ シメ チルプロ ピルメ チルセルロース、 マク ロゴールなど ） 、 崩壊剤 （ 例、 デ ンプン、 カルボキ シメ チルセルロー ス カル シウムな ど ） 、 賦形剤 （ 例、 乳糖、 デンプンなど） 、 滑沢剤 （例、 ステアリ ン酸マグネシゥ ム、 タルクなど） などを適宜配合することができる。
また、 非経口製剤、 たとえば注射剤を製造する際には、 等張 化剤 （例、 ブ ドウ糖、 D—ソルビ トール、 D —マンニトール、 塩化ナ トリウムなど ） 、 防腐剤 （例、 ベンジルアルコール、 ク 口ロブタノ一ル、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安息 香酸プロピルなど ） 、 緩衝剤 （例、 リ ン酸緩衝液、 醉酸ナ トリ ゥム緩衝液など） などを適宜配合することができる。
なお、 本発明化合物は、 塩を形成しない場合は水に難溶であ るため、 必要に応じて溶解補助剤 （例、 ポリ ビュルピロ リ ドン、 ト リァセチン、 プロピレングリ コールなど） を配合することが できる。
Q— 2 8 1 9物質は、 ク リ ゾスポリウム属に属する Q— 2 8 1 9 物質生産菌を培養し、 培養液中に Q - 2 8 1 9物質を蓄積させ、 ついで培養液からこの物質を採取することによつて製造するこ とができる。 本発明で使用されるクリ ソスポリウム属に属する 菌類の一例としては、 中華人民共和国北京市北海公園のスギ林で :採集された土壌試料から分離されたク リ ソスポリ ゥム エス ピ 一 ( Chrysosporium sp. ) Q- 2 8 1 9 株を挙げることができる。 この菌株の形態学的 · 生理学的特徴は下記の通りである。
本菌株は、 種々の培地で完全世代の発達が認められず、 気生 菌糸から分枝して生じた柄上に分生子を形成する不完全糸状菌 である。 気生菌糸は、 長さ 5 0 Am、 幅 0. 5〜2 « m、 無色 …滑面 で隔壁を有する。 分枝は鋭角的で、 しばしば一次及び二次的に 輸生し、 樹状構造を形成する。 分生子柄は、 気生菌糸と明瞭に 区別できない。 分生子は、 菌糸の先端に 1個づっ形成されるほ か、 菌糸の中間にも作られ、 しばしば 2〜 4個の分生子が同一 菌糸上に生じる。 また、 菌糸の側部から生じた短枝の先にも 1 個づっ形成されるのが観察される。
分生子は単細胞で、 無色または淡色、 表面はいぼ状の小突起 を持ち、 亜球状からこん棒状で、 下端が裁断状をなし、 大きさ は 3〜 4. 1.5 〜 2.5 Amである。 菌糸の中間に形成され る分生子は、 両端が裁断状でたる形をなし、 それを支える菌糸 よ り幅が広い。 厚膜胞子は形成されない。
麦芽寒天培地上のコロニーは、 24で、 2〜 3週間で直径 2.5 cmに達し、 あまり広がらず密な菌糸で盛り上がり、 表面は粉末状 ないしフェル ト状である。 色調は、 培養初期は白色、 やがてピ ンクがかったうす茶色を呈す。 裏面の色調は黄茶色である。 ポ テ ト · デキス トロース寒天培地上のコロニーは、 2〜 3週間で 灰緑色を呈し、 培地中に黄茶色の色素を拡散する点で、 麦芽寒 天培地上のコロニーと異なる。 また、 ッァペックと考えられる。 そこで、 本菌株をク リ ソスポリゥム エス ピー（ Chrysospor ium sp. ) Q-2819株と命名した。 本菌株は、 工業技術院微生物 工業技術研究所に微ェ研条寄第 BP- 2370号として寄託され ている。 なお本菌株は、 横浜植物防疫所を経由して、 農林水産 省指令 62横植第 522号 の許可指令番号のもとに、 中華人民共 和国よ り輸入された菌株である。
なお、 本発明のクリ ソスポリゥム エスピー Q- 2819株は天然か ら分離された菌株の他にこれを紫外線、 X線、 化学薬剤等で人 ェ的に変異させたもの及びそれらの自然変異株についても包含 するものである。
本発明において、 クリ ソスボリゥム属に属する Q - 2 8 1 9 物 質生産菌の培養は一般微生物の培養方法に準じておこなわれる が、 通常は液体培地による深部培養法が有利である。 培養に用 いられる培地としては、 該生産菌が利用する栄養源を含有する 培地であればよい。 すなわち合成培地、 半合成培地あるいは天 然培地が用いられ、 培地の組成は、 たとえば炭素源としては D —キシロース、 グルコース、 D —フラク ト一ス、 L 一ラムノ —ス、 マンニ トール、 グリ セリ ン、 デキス ト リ ン、 殿粉、 植物 油などが、 窒素源としては肉エキス、 ペプトン、 グルテンミ一 ル、 綿実油、 大豆粉、 落花生粉、 魚粉、 コー ンスチープリ カ—、 乾燥酵母、 酵母エキス、 硫酸ァンモニゥム、 硝酸ァンモニゥム、 尿素その他の有機または無機の窒素源が用いられる。 また金属 塩としては Na， K，Mg， Ca， Zn, Fe などの硫酸塩、 硝酸塩、 塩 化物、 炭酸塩、 燐酸塩などが必要に応じて添加される。 さらに 必要に応じて、 メチォニン、 システィ ン、 シスチン、 ォ レイ ン 酸メチル、 ラー ド油、 シリコ ン油、 界面活性剤などの抗生物質 生成促進物質又は消泡剤が適宜使用される。
培養条件としては好気的条件下に培養するのが一般的に有利で、 培養温度は約 1 8〜2 8での範囲が望ましく、好ましくは約 2 5 で附近が用いられ、 培地の pHは約 5〜10、 好ましくは約 6〜 8の範囲に保持すると好結果が得られる。 培養期間は培地の組 成、 温度などによつて変動するが、 一般的に 1〜 5 日程度でよ く、 培養終了時に目的物質が選択的に蓄積される。
培養物より本発明の目的物を単離採取するには通常の微生物 の培養物よ り抗生物質を単離する方法が適用される。 Q- 2819 物質は培養液中に含有されるので、 遠心分離または沪過によ り 菌体を除去した後、 沪過液から有効物質の抽出をおこなう。 すなわち適当な溶剤に対する溶解性および溶解度の差、 溶液か らの析出性および析出速度の差、 種々の吸着剤に対する吸着親 和性の差、 2種の液相間における分配の差などを利用する一般 の抗生物質の製造に用いられる手段によって、 分離、 採取、 精 製される。 この方法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは任 意の順序に組合せ、 また反復して適用できる。
つぎに、 実施例によって本発明をさ らに詳細に説明する。 以上、 本発明の製造法を説明したが、 以下に実施例によ り、 さ らに説明する。
実 施 例
グル コ ース 1.0 %、 ポテ ト · ス ターチ 2.0 %、 酵母エキス 0.5 %、 ポリペプ ト ン 0.5 %及び炭酸カルシウム 0.4 % を含む培地 ( pH 7.0 ) を作製しこれを 500 容三角フラ ス コに各 60 m ずつ 分注し 120 "Cで 20分間滅菌したものに、 ベネッ ト寒天培地上に 生育させたク リ ソ スポ リ ゥム エス ピー Q— 2819 の菌糸を力 き取って接種し 28 "Cで 3 日間振盪培養を行ない種培養液とする。 つぎに前述した同じ組成の培地を 2 Z 調製し、 これを 500 容 三角フ ラ ス コ に各 100 m ずつ分注し 120でで 20分間 滅菌した ものに種培養液を 3.0 %の割合で植菌した。 28でで 5 日間 振盪 培養を続ける。 このよ う にして得られた培養液を pH 8.5 に調整 した後、 ラジオライ ト #600 (昭和化学工業製） を加えて攪拌し た後、 過すると泸液 1.6 が得られる。 この沪液を pH 4.5 に 調整した後、 2.5 の酢酸ェチルを加えてよく攪拌する。 酢酸ェ チル層を分離して、 これに無水硫酸ナ トリウムを加えて脱水する。 脱水した酢酸ェチル層を減圧濃縮すると褐色粉末 42 Omgが得られ た。 褐色粉末 420mgを少量のクロ口ホルム ： メタノール （ 25:1) の混合溶剤に溶解した後、 ヮコーゲル C一 200 (和光純薬製） 10 gを上述した混合溶剤にて充塡した力ラムに乗せ、 同じ混合溶剤 を展開溶媒とする力ラム ' クロマ トグラフィ ーを行なう。 Q— 2819物質の検出には簡便なシリ カゲル薄層クロマ トグラフィー を利用した。 すなわち、 カラムクロマ トグラフィーの溶出液の各 分画を TLCプレー ト · シリカゲル 60F254 (メルク社製） にスポ ッ トして、 クロ口ホルム ： メタノール （ 5 ： 1 ) の混合溶剤で展 開して、 紫外線ランプ （ 254nm) で Rf 0.32を示し、 かつ SOD 様活性を示す Q- 2819物質を検出する。 Q-2819 物質だけが 存在するカラム · クロマ トグラフィ一の画分を集めて減圧濃縮す ると純粋な Q- 2819物質が微黄色粉末と して 120mg得られた。 この微黄色粉末は少量の酢酸ェチルに加熱溶解して、 放冷するこ とによ り Q- 2819物質が微黄色針状晶として得られる。

Claims

請 求 の 範 囲
(1) 下記化学構造式で表わされる Q- 2819物質、その互変異性体 またはそれらの塩
Figure imgf000015_0001
(2) クリ ソスポリゥム属に属する Q- 2819物質生産菌を培養し. 培養液中に Q- 2819物質を蓄積させ、 ついで培養液からこの 物質を採取することを特徴とする下記化学構造式で表わされる Q- 2819物質、 その互変異性体 またはそれらの塩の製造法
Figure imgf000015_0002
(3) ク リ ソスポリ ウム属に属する菌株がク リ ソスポリ ゥム エス ピ— Q— 2819株 （微ェ研条寄第 BP— 23 70 号 ） である請 求の範囲第 (2)項記載の製造法
(4) ク リ ソスポリ ゥム エス ピー Q— 2819株 （微ェ研条寄第 BP- 2370号 ） 及び Q- 2819物質を生産するその突然変異 株
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