WO1986007093A1 - Process for preparing heterogenic protein - Google Patents

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WO1986007093A1
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heterologous protein
producing
protein
ion
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Hironobu Watanabe
Ryuji Hiramatsu
Yoshizumi Tanabe
Hideyuki Ishikawa
Masanori Nagai
Hirofumi Arimura
Original Assignee
The Green Cross Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a heterologous protein by recovering the heterologous protein from a heterologous protein-producing transformant obtained by a genetic engineering technique.
  • Recombinant DNA technology has made it possible to express and produce heterologous proteins in bacteria and other hosts.
  • HIFN human interferon
  • ⁇ , ⁇ ⁇
  • ⁇ kinase ⁇
  • ⁇ ⁇ human tissue-derived plasminogen activator
  • the heterologous protein often becomes insoluble and precipitates in the host. If the desired proteins form such precipitates, their recovery has the following problems: First, it is necessary to separate and solubilize proteins precipitated in the host from the host substance. Second, the desired protein is often in a biologically inactive form.
  • JP-A-59-161321 JP-A-59-161321
  • a method using a treatment with hydrochloride-guanidine USP-4447649
  • recovery of the desired protein is not sufficient. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method for solubilizing a heterologous protein precipitated in a transformant obtained from a transformant obtained by a genetic engineering technique, and recovering an active form in a biological assay.
  • An object of the present invention is to provide a method for recovering a heterologous protein with high yield.
  • the present invention relates to a method for producing a heterologous protein by culturing a heterologous protein-producing transformant obtained by a genetic engineering technique to produce a heterologous protein, and recovering the produced heterologous protein. Removing the outer cell wall of the transformant produced in step (1), and solubilizing at least one ion selected from chloride ion, thiocyanate ion and ion nitrate with a dissociable salt to dissimilar protein. And a method for producing a heterologous protein.
  • the starting material in the present invention is a transformant capable of expressing a heterologous protein obtained by a genetic engineering technique, the host of which is capable of producing and accumulating a heterologous protein in the body. Particularly, it is a cell.
  • Escherichia coli is exemplified.
  • a method for obtaining various heterologous protein-producing transformants by genetic manipulation may be a known method or a method analogous thereto.
  • Such methods include, for example, Japanese Patent Application No. 59-371119 (applicant: Green Cross) as a method for producing perokinase, and Japanese Patent Application No. 59-2-2 as a method for producing IFN-r. 2980684 (applicant: green cross), as a method of producing HBsAg, disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-104,887 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-48082, TPA.
  • the production method is disclosed in JP-A-59-42321.
  • a transformant for example, it is carried out by treating a transformant (cell) with a cell wall polysaccharide degrading enzyme such as lysozyme.
  • the transformant (cells) is converted into a buffer (pH 5 to 10; preferably PH 7 to 8) containing a chelating agent such as cell wall polysaccharide degrading enzyme and EDTA.
  • the outer cell wall is removed by suspending.
  • the buffer include 10 mM phosphate buffer (pH 8.0), 25 OmM Tris-HCl buffer (PH 8.0) and the like. Concentration of transformants (cells) is 0 D 6 5.
  • the cell wall polysaccharide-degrading enzyme is, for example, 0.1 to 1 mg smf for lysozyme
  • the chelating agent is 10 to 100 mg. It is preferred that each be adjusted to a concentration of 100 mM.
  • the suspension time is preferably 10 to 60 minutes, and the processing temperature is preferably 0 to ⁇ 3.
  • At least one ion selected from chlorine ion, thiocyanate ion and ion nitrate is treated with a dissociable salt.
  • a buffer containing such salts is added.
  • Preferred salts include the above-mentioned ion-dissociating alkali metal salts (such as sodium salts and calcium salts) and alkaline earth metal salts (such as calcium salts and magnesium salts). Particularly preferred are alkaline earth metal chlorides, alkaline metal thionates, and alkaline metal nitrates. More specifically, magnesium chloride, potassium thiocyanate, and thiocyanate are preferred. Sodium and sodium nitrate are preferably exemplified.
  • the final salt concentration is It is 0.15 to 6 M, preferably 0.25 to 3 M in the case of chlorion dissociable salt and ion nitrate dissociable salt, and 0.25 to 1 in the case of thiocyanate ion dissociable salt. 5 M, preferably 0.3-1.0 M.
  • the treatment is usually carried out under the conditions of about 10 to 60 minutes, 0 at ⁇ 3. Thus, the desired protein is solubilized.
  • the heterologous protein is usually recovered.
  • conventional techniques can be used as appropriate as a protein purification method. For example, a fractionation method based on a difference in solubility between an ammonium sulfate fraction, a ethanol fraction, an acrylol fraction, and the like, a centrifugation method, and the like are preferable.
  • the ammonium sulfate fractionation is carried out by combining a 10-20% saturated ammonium sulfate fractionation step and a 40-50% saturated ammonium sulfate fractionation step.
  • the centrifugation is carried out by subjecting to a treatment at 100'Q0 to 25000 r.p.m. for 10 to 60 minutes to remove the precipitate, and collecting the centrifugation supernatant.
  • the collected fraction is then subjected to folding if desired.
  • a buffer having a pH of 6 to 8 or 0.01 to 0.2 (for example, a phosphate buffer) is preferably used.
  • the folding time is preferably 30 hours or more.
  • heterologous proteins can be highly purified by performing a fractionation means (preferably affinity chromatography using a monoclonal antibody), each of which is adapted to the heterologous protein, if desired.
  • a fractionation means preferably affinity chromatography using a monoclonal antibody
  • Highly purified heterologous proteins can be used as Prepared by conventional techniques.
  • the bacteria or bacteria may be removed and sterilized as required, and then excipients, stabilizers, and solubilizers will be examined.
  • the heterologous protein S to which the production method of the present invention is applied may be any as long as the transformant obtained by the genetic engineering technique can be produced.
  • the interferon protein (, ⁇ And r), oral kinase, HBsAg, TPA and the like may be any as long as the transformant obtained by the genetic engineering technique can be produced.
  • the interferon protein (, ⁇ And r) the interferon protein (, ⁇ And r), oral kinase, HBsAg, TPA and the like.
  • Examples and experimental examples are described below to specifically describe the present invention.
  • lysozyme was added to the lysis buffer, and an equal volume of a buffer solution containing 2 M of sodium nitrate was added. Left in O'C for 0 minutes. Next, the mixture was centrifuged at 18000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant, which was passed through 0.1 MKH2P04 (pH 7.0) as an external solution, and then subjected to an interferon-r (IFN- r) is determined by the cpe inhibition method [Havel 1, EA and Vilcek, J., Antimicrob. Agents Chemother *, pp. 476-484 (1972)] [However, virus is Sindbis virus. Was determined using FL 3-1 eel Is derived from human amniotic membrane]. The results are shown in Table 1. The control used was lysozyme treatment followed by freezing and thawing twice.
  • Escherichia coli HB101 strain having plasmid PYS61 Japanese Patent Application No. 59-229864 was cultured, collected, and washed in the same manner as in Example 2 to obtain 2 cells (corresponding to 1.8 ⁇ of culture solution). Then, IFN-r was extracted in the same manner as in Example 2. Table 3 shows the results.
  • lysozyme was removed from the lysis buffer, an equal volume of a buffer solution containing 2% of sodium nitrate was added, and the mixture was left at 0 for 45 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 18000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant, and -mercaptoethanol was added to the supernatant so that the final concentration was 3 OmM, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • This lysis buffer was mixed with 500 volumes of permeate A [30 mM NaCj2, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 reduced daltathione, 10% glycerol. -) As an external solution, and then added reduced daltathione and oxidized dal''tathione to this solution so that the final concentrations are 10 mM and 1 mM, respectively, and left at room temperature overnight. .
  • PA activity was measured after sodium nitrate treatment and then through the membrane. **: Measured PA activity after sodium nitrate treatment, -mercapto treatment, oxidation treatment in buffer containing GSH / GSSG. However, GSH is reduced glutathione and GSSG is oxidized daltathione.
  • Example 1 IFN-r was extracted and recovered from the transformant, and the effects of adding various salts were compared and examined. The results are shown in Table 5. The additives were each added in place of the sodium nitrate of Example 1, and all others were similarly operated. Table 5 shows the additives, amounts added, and IFN-r activities.
  • the present invention thus provided achieves an approximately four-fold improvement in yield as compared with the conventional extraction and recovery methods.
  • the present invention makes it possible to implement a gene recombination technique using Escherichia coli or the like as a host, which has not been able to obtain sufficient production efficiency because it has been accumulated in cells conventionally, at a more industrial level. .

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Description

明 細 書
異種蛋 S質の製造方法
技術分野および発明の開示
技術分野
本発明は、 遺伝子操作技術によって得られた異種蛋白産生性 形質転換体から異種蛋白質を回収することによる異種蛋白質の 製造方法に関する。 '
背景技術
組換え D N A技術により、 異種蛋白質を細菌、 その他の宿主 中で発現 ， 生産させることが可能となった。
たとえば、 ヒ ト イ ンタ ーフヱ ロ ン （以下、 H I F N ) の各型 ( 、 β、 Τ ) 、 ゥ ロキナーゼ、 Τ Ρ Α (ヒ ト組織由来プラス ミノゲン活'性化因子） を含め、 多く のヒ 卜の蛋白質がこれら蛋 白質をコー ドしている D N Aで宿主を形質転換し、 得られた形 質転換体を当該異種蛋白質の発現に好適な条件下で増殖させる ことにより、 宿主内で産生されている。 しかしながら、 異種蛋 白質はしばしば宿主内で不溶化し、 沈殺する。 所望の蛋白質が このような沈殺を形成する場合、 これらの回収には次の問題が ある。 第一に、 宿主内に沈殺している蛋白質を宿主物質より分 離し、 '且つ可溶化させる必要がある。 第二に、 所望の蛋白質は 生物学的には不活性な形態が多い。
この問題を解決するための先行技術として、 蛋白変性剤処理 による方法 （特開昭 5 9 — 1 6 1 3 2 1 ) 、 塩酸—グァニジン 処理による方法 （ U S P — 4 4 7 6 0 4 9 ) が提案されている が、 所望蛋白質の回収は十分ではない。 発明の開示
本発明は、 遺伝子操作技術によつて得られた形質転換体から、 当該形質転換体の体内に沈殺した異種蛋 Θ質を可溶化し、 生物 学的検定において活性な形態を回復させ、 より高収率に異種蛋 白質を回収する方法を提供することを目的とする。
本発明は、 遺伝子操作技術によって得られた異種蛋白産生性 形質転換体を培養して異種蛋白質を産生せしめ、 生産された異 種蛋白質を回収することによる異種蛋白質の製造方法において、 異種蛋白質を体内に産生した形質転換体の細胞外壁を除去後、 塩素イオン、 チォシアン酸イオン、 硝酸イ オンから選ばれる少 なく とも一つのィォンを解離性塩にて異種蛋白質を可溶化する 工程を有することを特徴とする異種蛋白質の製造方法から.なる。 (a)出発原料 ' 本発明における出発原料は、 遺伝子操作技術によって得られ る異種蛋白質発現性となった形質転換体であり、 その宿主は異 種蛋白質を体内に産生、 蓄積しう るもの、 特に菌体である。 好 適には、 大腸菌が例示される。
遺伝子操作によって各種異種蛋 e質産生性形質転換体を得る 方法は、 既知の方法またはそれに準ずる方法に従えばよい。 か かる方法としては、 例えば、 ゥロキナーゼを生産する方法とし て特願昭 5 9 — 3 7 1 1 9 (出願人 ： ミ ドリ十字） 、 I F N— rを生産する方法として特願昭 5 9 — 2 2 9 8 6 4 (出願人 ： ミ ドリ十字） 、 H B s A gを生産する方法として特開昭 5 8一 1 0 4 8 8 7および特開昭 5 9 — 4 8 0 8 2、 T P Aを生産す る方法として特開昭 5 9 — 4 2 3 2 1 にその開示がある。 (b)形質転換体からの異種蛋 S質の回収
形質転換体細胞壁の除去 ：
例えば、 形質転換体 （菌体） をリゾチームのような細胞壁多 糖分解酵素にて処理することによって実施される。 その際、 形 質転換体 （菌体） を、 例えば細胞壁多糖分解酵素及び E D T A のようなキ レー ト剤を舍有する緩衝液 （p H 5 〜 l 0 、 好ま し く は P H 7 〜 8 ) に懸濁させる ことによつて細胞外壁を除去する。 緩衝液としては、 たとえば、 1 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 、 2 5 O m Mト リ ス塩酸緩衝液 （P H 8. 0 ) 等が例示される。 形質転 換体 （菌体） の濃度は 0 D 6 5。 が 1 0 0 〜 2 0 0 となる濃度で あることが好ま し く 、 また、 細胞壁多糖分解酵素は、 例えばリ ゾチームの場合、 0. 1 〜 1 m gス mf、 キ レー ト剤は 1 0 〜 1 0 0 mMの濃度に各々調整される 'ことが好ま しい。 懸濁時間は 1 0 〜 6 0分間、 処理温度は 0 で ± 3 でであることが好ま しい。
可溶化 ：
上記懸濁処理後、 塩素イ オ ン、 チォ シア ン酸イ オ ン、 硝酸ィ ォンから選ばれる少な く とも一つのィ ォ ンに解離性の塩にて処 理する。 通常はかかる塩を舍有する緩衝液を加える。 塩として は、 上記ィ ォン解離性のアル力 リ金属塩 （ナ ト リ ウム塩、 カ リ ゥム塩など） 、 アルカ リ土類金属塩 （カルシウム塩、 マグネシ ゥム塩など） などが好ま し く 、 特に塩化アル力 リ土類金属塩、 チオ シァ ン酸アル力 リ金属塩、 硝酸アル力 リ金属塩が好ま しい 具体的には、 塩化マグネシゥム、 チオシァン酸カ リ ウム、 チォ シア ン酸ナ ト リ ウム、 硝酸ナ ト リ ウム等が好適に例示される。 緩衝液は前記と同様のものが使用される。 塩の添加終濃度は、 塩素ィォン解離性塩および硝酸ィォン解離性塩の場合は 0. 1 5 〜 6 M、 好ましく は 0. 2 5〜 3 Mであり、 チォシアン酸イオン 解離性塩の場合は 0. 2 5〜 1. 5 M、 好ましく は 0. 3〜 1. 0 Mで ある。 処理は通常、 1 0〜 6 0分間程度、 0 で ± 3 で程度の条 件で行われる。 かく して、 所望蛋白質は可溶化する。
回収 ：
上記可溶化処理後、 通常、 異種蛋白質の回収が行われる。 回 収には蛋白質の精製法として慣用技術が適宜利用できる。 例え ば、 硫安分画、 ヱタノ一ル分画、 ァク リノ一ル分画等の溶解度 差に基づく分画方法および遠心分離の方法等が好適である。
硫安分画は、 1 0〜 2 0 %飽和硫安分画工程と 4 0〜 5 0 % 飽和硫安分画工程を組み合わせることによつて実施される。
遠心分離は 100'Q0〜25000 r.p.m.、 1 0〜 6 0分間処理に付 し沈澱物を除去し、 遠心上清を回収することによって行われる , 透折 ：
回収画分は所望により、 次いで透折を行う。 透折に際しては 塩濃度の調整のため、 好ましく は PH 6〜 8、 0. 0 1〜 0. 2 の 緩衝液 （例えば、 リ ン酸緩衝液など） が用いられる。 透折時間 は、 好ましく は 3 0時間以上である。
高度精製 ： '
各種異種蛋白質は、 所望により各々異種蛋白質に適応した分 画手段 （好適には、 モノ ク ローナル抗体を用いたァフ ィ 二ティ 一クロマ トグラフィ ー） を行う ことによって高度精製される。 製剤化 ：
高度精製された異種蛋白質は、 各々製剤化目的に応じて自体 慣用技術によって調製される。 医薬品とする場合には、 所望に より除菌 · 滅菌処理を行った後、 賦形剤、 安定剤、 溶解剤の検 討を行い、 液状あるいは乾燥製剤とする。
本発明の製造方法が適用される異種蛋 S質は、 遺伝子操作技 術によって得られた形質転換体が産生しう るものであればいず れでもよ く 、 例えばイ ンタ一フヱロ ン （ 、 ^および r ) 、 ゥ 口キナーゼ、 H B s A g、 T P Aなどが例示される。 · 以下、 本発明を具体的に説明するために実施例および実験例 を示す。
実施例 1
ヒ トイ ンターフェロ ン一 rボリ ペプチ ドをコー ドする D N A 断片が組み込まれたブラス ミ ド P Y S 6 1 (特願昭 59— 229864) を担持する大腸 ¾W 3 1 1 0株を L B +グルコース （gl'ucose) 培地 〔 ト リ スベース （Tris base) 0. 6 3 g、 ポリ ペプ ト ン
(polypeptone) 1 0 g、 酵母抽出物 5 g、 N a C £ 5 g、 グル コース 1 g、 アンビシリ ン 2 O mgを水に溶かし 1 ^ とする〕 で
3 7 で、 一夜培養し、 この培養液 2 m を l O O m の K M— 9培 地 （N a 2H P 04 1 2 0 g、 N a H 2 P O 4 6 0 g、 N a C
2 0 g、 カザミノ酸 3 0 0 g、 酵母抽出物 5 0 gを水に溶かし 10 とする）に接種し、 3 7 でで 1時間培養後、 ト リブトファ ン遺伝子のィ ンデューサーであるィ ン ドールァク リ ル酸を 4 0 加え、 さらに？ 〜 1 0時間培養を続ける。 培養液を 4000 r.p.m.、 2 0分間遠心して集菌し、 3 0 mM N a C £ . 5 0 mM ト リ ス塩酸緩衝液 （PH8.0 ) で洗浄する。 洗浄された菌体を、 溶菌緩衝液 〔 3 0 mM N a C jg 5 0 mM E D T A、 2 5 0 mM ト リス塩酸 （ρΗ8· 0 ) 、 1 0 y¾/mi P M S F (pheny lmethyl sul f on 1 fluoride) ^ 1 mg/ mf B S A (bovine serum albumin ) 、 0. 2 5 mg/m リゾチーム〕 に菌体濃度が O D 650 =
1 6 0 となるよ う に懸濁し、 3 0分間、 0 で に放置した後、 前 記溶菌緩衝液においてリゾチームを舍まず硝酸ナ ト リ ウムを 2 M加えた緩衝液を等量加え、 3 0分間、 O 'Cに放置した。 次に 18000 r. p.m.、 3 0分間遠心して上清を得、 これを 0. 1 M K H 2 P 04 (pH7. 0 ) を外液として透折した後、 イ ンタ ーフ ヱ ロ ン— r ( I F N - r ) の量を c p e阻止法 〔 Havel 1, E. A. and Vilcek, J . , Antimicrob. Agents Chemother*, 2 ¾, 476 〜484頁 （1972) 〕 〔但し、 ウ ィ ルスとしては Sindbis virus. 動物細胞としてはヒ ト羊膜由来の F L 3 — 1 eel Isを用いた〕 により定量した。 結果は表 1 に示す。 なお、 コ ン ト 口ールはリ ゾチーム処理した後凍結融解を 2回操り返したものを使った。
表 1 »
Figure imgf000008_0001
実施例 2
実施例 1 と同様に培養、 集菌、 洗浄した菌体 （実施例 1 と同 じ菌体、 培養液 1. 8 に相当） を 2分し、 菌体濃度が 0 D 650 = 1 6 0 となるように溶菌緩衝液に懸濁し、 3 0分間、 0 で に 放置した後、 溶菌緩衝液からリゾチームを除き、 塩化マグネシ ゥムを 1 M加えた锾衝液を等量加え、 4 5分間、 O 'cに放置し た。 コ ン ト ロ ールとしてリゾチーム処理した後、 凍結融解を 2 回操り返したものを使用した。 次に 10000 r.p.m. 、 1時間遠 心して上清を得、 上清中の I F N - rの量を c p e阻止法によ り定量した。 結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000009_0001
実施例 3
プラ ス ミ ド P Y S 6 1 (特願昭 59— 229864) をもつ大腸菌 H B 1 0 1株を実施例 2 と同様に培養、 集菌、 洗浄した菌体 （培 養液 1.8 £に相当） を 2分し、 実施例 2 と同様に I F N— rを 抽出した。 結果を表 3 に示す。
表 3
I F N - r (IU/ & ) コ ン ト ロ ーノレ 3.6 1 08
実施例 3 (MgCl2) 9.4 x 1 08 実施例 4
T Ρ Αを産生する大腸菌 Η Β 1 0 1株を実施例 1で示したの と同様の方法で培養、 集菌、 洗浄した後、 その菌体を菌体濃度 0 D 65。 = 1 6 0 となるように溶菌緩衝液に懸濁し、 3 0分間、 0 'Cに放置した。 次に溶菌緩衝液からリ ゾチームを除き、 硝酸 ナ ト リウムを 2 Μ加えた緩衝液を等量加え、 4 5分間、 0 でに 放置した。 次に 18000 r.p.m.. 3 0分間遠心して上清を得、 こ の上清に最終濃度が 3 O mMとなるように —メルカプトエタノ ールを加え、 室温にて 2時間放置した。 この溶菌緩衝液を 500 容の透折 A液 〔 3 0 mM N a C j2、 1 0 mM E D T A、 5 0 mM ト リ ス塩酸 （pH 8. 0 ) 1 還元型ダルタチオン、 1 0 %グリ セ リ ン〕 -を外液として透折し、 その後、 この液に最終濃度がそれ ぞれ 1 0 mM、 1 mMとなるよう還元型ダルタチオン、 酸化型ダル'' タチオンを加え、 室温にて一夜放置した。 最後にこの液を 500 容の透折 B液 〔 3 0 mM N a C g、 1 0 mM E D T A、 5 0 mM ト リ ス塩酸、 0. 1 mM還元型ダルタチオン〕 を外液として透折処 理し、 フイブリ ン平板法にて P A活性 （プラスミノゲンァクチ ベータ—活性） を測定した。 結果を表 4に示す。 その結果、 コ ン ト ロール （リゾチーム処理した後凍結融解を 2回操り返した もの） に比べ約 5 0倍の P A活性上昇がみられた。 表 4
Figure imgf000011_0001
* ：硝酸ナ ト リ ゥム処理後、 透折して P A活性を測定。 ** ：硝酸ナ ト リ ゥム処理、 —メルカプト処理、 GSH/GSSG を含む buffer 中で酸化処理後、 P A活性を測定。 但し、 GSH は還元 グルタチオンであり、 GSSGは酸化 型ダルタチオンである。
実験.例 1
実施例 1 に準じて、 形質転換体より I F N - rの抽出、 回収 を行い、 各種塩の添加による効果を比較検討し、 その結果を表 5に示した。 添加物は、 実施例 1 の硝酸ナ ト リ ウムの代わりに 各々添加し、 その他はすべて同様に操り返した。 添加物、 添加 量、 I F N— r活性については表 5に示した。
表 5
Figure imgf000012_0001
かく して提供された本発明は、 従来法による抽出、 回収法に 比して、 約 4倍の収率の向上を達成した。 この結果、 本発明は 従来菌体内蓄積性であることから十分な生産効率を得ることが できなかった大腸菌等を宿主として使う遺伝子組換技術を、 よ り産業レベルで実施可能とするものである。

Claims

請求の範囲
(1) 遺伝子操作技術によって得られた異種蛋白産生性形質転 換体を培養して異種蛋白質を産生せしめ、 生産された異種蛋白 質を回収することによる異種蛋白質の製造方法において、 異種 蛋白質を体内に産生した形質転換体の細胞外壁を除去後、 塩素 イ オ ン、 チォ シア ン酸イ オ ン、 硝酸イ オ ンから選ばれる少なく とも一つのィォンを解離性塩にて異種蛋白質を可溶化する工程 を有することを特徵とする異種蛋白質の製造方法。
(2) 塩がアル力リ金属塩またはアルカ リ土類金属塩である請 求の範囲第 (1)項記載の異種蛋白質の製造方法。
(3) 塩が塩化アルカ リ土類金属塩、 チォ シア ン酸アルカ ^金 属塩、 硝酸アル力リ金属塩から選ばれる少なく とも一種である 請求の範囲第 (1)項記載の異種蛋白質 ©製造方法。
(4) 塩が塩化マグネ シウム、 チォシア ン酸カ リ ウム、 チオ シ ア ン酸ナ ト リ ゥムおよび硝酸ナ ト リ ゥ ムから選ばれる少なく と も一つの化合物である請求の範囲第 (1)項記載の異種蛋白質の製 造方法。
(5) 塩素ィォン解離性塩またはノおよび硝酸ィォン解離性塩 を使用し、 当該塩の濃度が 0. 1 5 〜 6 Mである請求の範囲第 (1) 項記載の異種蛋白質の製造方法。
(6) チォシア ン解離性塩を使用し、 当該塩の濃度が 0. 2 5 〜 1. 5 Mである請求の範囲第 (1)項記載の異種蛋白質の製造方法。
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