WO1986006585A1

WO1986006585A1 - Solution synthetique pour la conservation prolongee de concentres erythrocytaires

Info

Publication number: WO1986006585A1
Application number: PCT/FR1986/000155
Authority: WO
Inventors: Odile Kane; Serge Goll
Original assignee: Centre Regional De Transfusion Sanguine De Strasbo
Priority date: 1985-05-06
Filing date: 1986-05-05
Publication date: 1986-11-20
Also published as: FR2581289A1; JPS62503029A; EP0221123A1

Abstract

La solution contient du saccharose, de l'adénine, du glucose, un tampon phosphate, de la guanosine et du bicarbonate de sodium et est caractérisée en ce qu'elle renferme, en outre, un substrat constituant une source de G6P, tel que le galactose, un agent favorisant le métabolisme érythrocytaire pris dans le groupe qui comprend notamment la DHA, l'acide glucuronique ou ses sels, le xylitol, le gulonate, le xylulose et en ce qu'elle contient, en outre, du chlorure de magnésium. Application à la mise en suspension de concentrés érythrocytaires dans cette solution, pour assurer une conservation pendant environ 8 à 9 semaines.

Description

SOLUTION SYNTHETIQUE POUR LA CONSERVATION PROLONGEE

DE CONCENTRES ERYTHROCYTAIRES La présente invention couvre les domaines pharma¬ ceutique, transfusionnel et génie biologique tel que, par exemple, les cultures cellulaires et les sciences biologi¬ ques, et a pour objet une solution synthétique pour la con¬ servation prolongée des concentrés érythrocytaires.

Dans la description ci-après sont utilisées les abréviations suivantes : CE concentré érythrocytaire

SAG saline, adénine, glucose

SAG-Mannitol saline, adénine, glucose, mannitol

PAGGS phosphate, adénine, glucose, guanosine, saline

PAGGS-Sorbitol phosphate, adénine, glucose, guanosine, saline, sorbitol

DHA dihydrox acétone

ACD acide, citrate, dextrose

ATP adénosine, triphosphate

ADP adénosine, diphosphate

2,3-DPG 2,3 diphosphoglycérate

Hb hémoglobine mg milligramme μmol/Hb micromoles par gramme d'hémoglobine mOsm/Kg d'eau milliosmoles par kilogramme d'eau j. jour L'invention concerne une solution synthétique des¬ tinée à la conservation des concentrés érythrocytaires d'ori¬ gine humaine ou animale, de préférence appauvris en leuco¬ cytes et en plaquettes, pendant au moins 8 semaines entre + 2°C et + 6^βC. Les hématies ainsi conservées remplacent les hématies fraîches ou conservées de façon classique, dans tou¬ tes leurs applications, et en particulier dans les cas d'uti¬ lisation clinique, transfusionnelle ou de recherche.

Une unité de sang total est la quantité de sang prélevée sur anticoagulant chez un donneur, en une seule fois, soit 350 à 450 ml. Cependant le sang total-est rarement utilisé car il est rarement nécessaire en clinique et il con¬ duit à une perte importante de plasma nécessaire à la prépa¬ ration de fractions spécifiques. On préfère donc, générale¬ ment, utiliser des concentrés érythrocytaires. Un concentré érythrocytaire (CE) est la masse de globules rouges qui pro¬ vient de ce prélèvement, qui est séparée du plasma en système clos, et qui présente un hématocrite compris entre 70% et 80%.

Un CE ainsi défini a théoriquement la même date de péremption que l'unité de sang total dont il est issu. En réalité on observe en cours de stockage une baisse de la fonction respiratoire plus rapide que dans le sang entier, et après une à deux semaines de conservation l'apparition d'agrégats leucoplaquettaires et de voiles fibrineux plus nombreux qui ralentissent considérablement la transfusion.

Pour obvier à cet inconvénient, il a été proposé de préparer des CE très secs, à savoir présentant un hématocrite voisin de 85% à 90%, et de leur ajouter un milieu de conser¬ vation synthétique qui abaisse 1'hématocrite et améliore les qualités des hématies tout en permettant une récupération de plasma maximale.

Ainsi, le SAG mis au point par Hδgmann (Hôgmann CF., Hedlung K. and Sahlestrom Y. : Clinical usefulness of red cells preserved in protein poor médium. New Engl. J. Med. 299 : 1377 (1978)) permet une conservation de 35 jours. Cependant, l'hémolyse est très importante, a savoir de l'or dre de 3% à 4%, le taux de 2,3-DPG est inférieur à 10% a bout de 21 jours et après 35 jours l'ATP atteint la valeu limite de 2 μmol/g Hb (cf. P. Hervé and Coll. : Préservation of human erythrocytes in the liquid state : Biological re sults with a new médium) .

Le SAG-Mannitol également proposé par Hôgmann (Hôg mann and coll. Vox Sang. 41. 274-281, (1981)) permet une con servation de 35 jours avec une hémolyse moindre, mais cepen dant élevée, à savoir comprise entre 0,5% et 1%. Avec cett solution, les qualités des hématies ne sont pas améliorées.

Par US-A 4 267 269 on connaît une variante d SAG-Mannitol appelée ADSOL, qui donne des résultats sembla bles : chute rapide du 2,3-DPG, valeur limite de l'ATP aprè 5-6 semaines et hémolyse encore trop élevée.

On connaît également le PAGGS, proposé par Seidl, qui permet une conservation de 35 jours mais avec une hémo lyse importante, à savoir de 2% à 3%.

Le PAGGS-Sorbitol, également proposé par Seidl, permet une conservation de 6 semaines. Ces deux milieux on été étudiés (cf. Conservation des globules rouges dans de solutions équilibrées, nutritives, enrichies mais sans pro téines. Annales pharmaceutiques françaises. J. Saint Blancard. 1983, 41, n^β 3 ; p. 213-228), et il a été relev que l'hémolyse est de 0,5% à 1%, l'ATP devient limite aux j 42-45 et la charge énergétique est à 0,75 à j. 42. Le taux d 2,3-DPG est inférieur à 10% à partir de j. 40. Ce milieu es actuellement le meilleur existant utilisé. Les concentré érythrocytaires en PAGGS-Sorbitol gardent les qualités d sang frais pendant une quinzaine de jours et peuvent êtr conservés pendant 5 à 6 semaines. La fonction respiratoire est mieux préservée que dans les autres milieux, car le 2,3-DPG est conservé plus longtemps.

Le PAGGS-Sorbitol présente, toutefois, l'inconvé- nient d'une hémolyse spontanée restant importante, à savoir de 0,5% à j. 42, d'un faible taux de 2,3-DP^'G, de l'ordre de

19%, après j. 35, et d'une durée de conservation limitée à 5 à 6 semaines maximum.

DD-152 719 décrit un procédé de conservation d'érythrocytes à l'aide d'une solution contenant du glucose, du saccharose, du citrate de sodium, de l'acide citrique, du chlorure de sodium, du phosphate disodique et éventuellement du sulfate d'adénine et de la guanosine. Le saccharose est présent dans une proportion relativement importante, de l'or- dre de 58-60 mmoles/litre, bien qu'une fourchette de 10- 100 mmoles/litre soit indiquée, et il peut être remplacé par le mannitol ou d'autres disaccharides ou des alcools. Au bout de 6 semaines de conservation, le taux d'ATP des érythrocytes est de 50% de la valeur normale, l'hémolyse est annoncée com- me étant de l'ordre de 1% au bout de la même période et le brevet ne précise pas le taux de 2,3-DPG encore présent.

US-A 4 356 172 décrit une solution qui présente un intérêt moindre, surtout pour la transfusion. En effet, du fait qu'elle • contient de l'inosine, elle oblige l'utilisa- teur à pratiquer une adsorption sur charbon actif, puis à la¬ ver les hématies avant de pouvoir les transfuser.

La demande de brevet européen N° 99 315 décrit une solution protectrice destinée à la conservation de cellules fonctionnelles et plus particulièrement d'hématies déconge- lées, pendant une semaine au moins, laquelle solution protec¬ trice contient, de manière connue, de l'adénine, du glucose et un tampon phosphate et est caractérisée en ce qu'elle con¬ tient une quantité relativement importante de saccharose (47 g±2) et en ce que le tampon phosphate est présent à une concentration élevée qui confère à la solution une osmolarité de 330±10 mOsm et un pH de 7,40±0,10.

Le B.P. 2 158 372 décrit une solution anti¬ coagulante de conservation du sang total, qui contient, outre les anticoagulants usuels (citrate et acide citrique) une source d'énergie pour les hématies, constituée par du dex¬ trose ou l'un de ses équivalents tels que le fructose, le mannose ou le galactose, à raison de 3,4-3,8 g/litre, au moins 5 mmoles/litre de dihydroxyacétone (DHA) qui a pour rô¬ le d'augmenter et/ou de maintenir la teneur en 2,3-DPG du sang conservé, et de préférence 5 à 100 mmoles et mieux en¬ core 10 à 30 mmoles, ainsi que, le cas échéant, de l'adénine (0,1-1,0 mmole/1) , de l'inosine (5-30 mmoles/1) , du pyruvate (0,1-20 mmoles/1) ou de l'acide ascorbique ou ascorbate (0,5-20 mmoles/1) , et éventuellement du phosphate disodique, ces derniers composants pouvant être présents par paires dans la solution protectrice. La solution décrite dans ce brevet est annoncée comme permettant la conservation du sang pendant au moins 3 semaines, sans altération du taux de 2,3-DPG ni, mais aucun résultat expérimental n'est donné à cet égard, du taux d'ATP.

CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 88, N^β 9, 27 Février 1978, Abrégé N° 60556n, décrit une solution de conservation de sang total ou d'érythrocytes qui contient du citrate, du dextrose, de l'adénine, de la guanosine et du bicarbonate de sodium, ainsi que dans le cas de la solution de conservation d'érythroc tes, du xylitol et des ions phosphate. La durée de conservation annoncée est de 3 semaines et l'influence favo¬ rable qu'exercerait la présence des ions HCO3" sur le main¬ tien du taux de 2,3-DPG, est rapportée. MOORE et AL. (TRANSFUSION, Vol. 20, N^β 1, Janvier-

Février 1980 p. 24-31) décrivent l'addition de la DHA dans des solutions anticoagulantes, éventuellement conjointement avec de l'adénine et du glucose, pour maintenir le taux de 2,3-DPG dans les hématies au bout de 42 jours de stockage à + 4^βC et maintenir, au bout de ce laps de temps, leur concen- tration en ATP à une valeur "suffisante". La DHA y est cepen¬ dant utilisée à concentration élevée (30 mmoles), tandis que le glucose y est présent à raison de 32 mmoles et l'adénine à raison de 0,5 mmole. Les mêmes Auteurs décrivent également (TRANSFUSION, Vol. 21, N° 6, Novembre-Décembre 1981, p. 723- 731) des solutions de conservation d'érythrocytes contenant outre les composants ci-dessus (dont la DHA à concentration plus élevée encore : 52 mmoles) de 1*ascorbate-2-phosphate. Alors que le taux de 2,3-DPG est satisfaisant au bout de 42 jours, par contre l'ATP se conserve mal et descend jusqu'à 40% au bout de 42 jours.

La présente invention a pour but de pourvoir à une solution pour la conservation des hématies jusqu'à 8 semaines au moins, tout en améliorant leurs qualités tout^' au long de la conservation, et en particulier leur fonction respiratoire immédiate en conservant plus longtemps le 2,3-DPG, leur taux d'ATP, leur pourcentage d'hémolyse, leur taux de nucléotides, etc ...

L'invention a également pour but, par rapport aux solutions existantes, de diminuer autant que possible les quantités d'adénine, de glucose et, éventuellement, de saccharose, afin d'éviter des surcharges inutiles en cas de transfusion massive.

A cet effet, l'invention a pour objet une solution synthétique pour la conservation prolongée des concentrés érythrocytaires d'origine humaine ou animale déleucocytés ou non, caractérisée en ce qu'elle présente avantageusement la composition suivante, en mmoles/1 : Saccharose 18 à 28 Adénine 0,8 à 1,6

Glucose 30 à 80

Substrat constituant une source de G6P 17 à 39

Phosphate monosodique 2,6 à 4,2 Phosphate disodique 11 à 17 Agent favorisant le métabolisme érythrocytaire 4 à 20,6 Guanosine 1,4 à 2,8

Bicarbonate de sodium 37 à 73 Chlorure de magnésium 0,2 à 1,8 Chlorure de sodium 13 à 31

Eau distillée qsp 1000 ml et en ce que l'osmolarité de la solution est de 300±20 mOsm/Kg d'eau et le pH est de 7,80±0,20. L'ajustement de l'osmolarité à 300±20 mOsm/Kg qui est la même que celle du sang, qui est réalisé à l'aide de chlorure de sodium, permet d'éviter aux hématies de subir des chocs hyper- ou hypotoniques. En outre, un pH élevé, qui est ajusté en proportionnant convenablement les quantités de phosphate monosodique et disodique et de bicarbonate de so¬ dium, permet au métabolisme érythrocytaire de s'effectuer pendant un temps prolongé.

Selon un mode de réalisation avantageux de la solu¬ tion conforme à l'invention, le substrat constituant une source de G6P (glucose-6-phosphate) est avantageusement le galactose, qui a pour caractéristique de constituer une sour¬ ce de G6P même en l'absence des enzymes qui participent à la phase concernée du métabolisme des sucres et qui sont l'hexo- kinase (HK) et la phosphofructokinase (PFK) ou en cas de ra- lentissement de l'activité de ces enzymes.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de la solution conforme à l'invention, l'agent favorisant le méta¬ bolisme érythrocytaire est pris dans le groupe qui comprend la dihydroxyacétone (DHA), l'acide glucuronique à l'état li- bre ou sous la forme de ses sels, le xylitol, le gulonate, le xylulose.

Conformément à une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est la DHA, elle est présente dans la composition à raison de 4 à 8 mmoles/litre.

Conformément à une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est l'acide glucuro- nique ou l'un de ses sels, il est présent dans la composition à raison de 5 à 21 mmoles/litre.

Conformément à une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est le gulonate ou le xylulose, il est présent dans la solution à raison de 5 à

21 mmoles/litre.

Conformément à une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est le xylitol, il est présent dans la composition à raison d'au moins

10 mmoles/litre.

La littérature décrit des solutions de conservation d'érythrocytes dans lesquelles le saccharose est présent dans des proportions considérables, alors que la composition con- forme à l'invention permet de réduire σonsidéralement le taux de saccharose.

De même, tous les Auteurs qui font état de la DHA, l'utilisent dans des proportions qui peuvent être jusqu'à 10 fois supérieures et plus, aux quantités préconisées con- formément à la présente invention.

La présence dans la solution conforme à la présente invention, de chlorure de magnésium est particulièrement im¬ portante par l'apport de magnésium qu'il introduit dans la solution, et qui vise à remplacer le magnésium du plasma, le magnésium étant un co-facteur indispensable à de nombreuses réactions enzymatiques du métabolisme des hématies.

Selon un mode de réalisation préféré de la solution conforme à la présente invention, celle-ci présente la compo¬ sition suivante, en mmoles/1 : Saccharose 23±1

Adénine 1,2±0,1

Glucose 55±2

Galactose 22±2 Phosphate monosodique 3,4±0,2 Phosphate disodique 14±2 Dihydroxyacétone 6±1

Guanosine 2,1±0,2

Bicarbonate de sodium 55±5 Chlorure de magnésium 0,75±0,25 Chlorure de sodium 22±2

Eau qsp 1000 ml

Le mélange de solution et de CE est avantageuse¬ ment effectué dans un rapport compris entre 1/1,8 et 1/2,5 pour l'obtention d'un hématocrite moyen compris entre 55% et 65%, de sorte que les CE ainsi traités peuvent être conservés pendant environ 8 à 9 semaines à une température comprise en¬ tre 2°C et 6°C avant utilisation, sans autre traitement que le réchauffement. Pendant ce délai, la viabilité et les qua- lités fonctionnelles des hématies ainsi conservées demeurent excellentes. En outre, la destruction des hématies pendant la conservation reste minime et en tout cas beaucoup plus faible qu'avec les solutions connues.

Ainsi, les CE conservés dans la solution conforme à l'invention, à une température comprise entre + 2°C et + 6^βC, gardent les qualités du sang frais pendant 3 à 4 semaines et celles de sang transfusable pendant 8 à 9 semaines. Exemple d'utilisation :

On recueille 400 à 450 ml de sang provenant d'un donneur dans une poche en PVC contenant 63 ml d'anti¬ coagulant citrate, phosphate, dextrose. Dans les heures sui¬ vant le prélèvement, la poche est centrifugée pendant envi¬ ron 10 minutes à 3000 g, puis le plasma est décanté et la couche leucoplaquettaire est éliminée. 90 à 110 ml de la solution conforme à l'invention sont alors ajoutés au CE ainsi obtenu, puis la poche est con¬ servée à une température comprise entre 2^βC et 6°C. Le pH de départ est de 7,20, l'osmolarité de 300 mOsm/Kg et l'hémato- crite de 60%. Dans le présent exemple la solution mise en oeuvre est la solution dont la composition a été donnée ci-dessus en tant que mode de réalisation préféré de l'invention.

Le tableau ci-dessous représente les résultats obtenus au bout de 5 semaines et de 8 semaines : Temps de conservation 5 sem. 8 sem. pH 6,80 6,65

ATP (μmol/g Hb) 4,07 soit 107% 2,87 (76%) 2,3-DPG (μmol/g Hb) 3,6 (27%) 1,8 (14%) Charge énergétique 0,82 0,75 ATP/ADP 3,6 2,4

Pool des nucléotides 0,340 0,288

(mol/mol Hb) Capacité de phosphorylation 368 200

(moles^-1 ) Pourcentage d'hémolyse 0,15 0,20

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven¬ tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au con- traire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1^e) Solution synthétique pour la conservation pro¬ longée des concentrés érythrocytaires d'origine humaine ou animale déleucocytés ou non, caractérisée en ce qu'elle pré- sente avantageusement la composition suivante, en mmoles/1 : Saccharose 18 à 28

Adénine 0,8 à 1,6

Glucose 30 à 80

Substrat constituant une source de G6P 17 à 39

Eau distillée qsp 1000 ml et en ce que l'osmolarité de la solution est de 300±20 mOsm/Kg d'eau et le pH est de 7,80±0^",20.

2^e) Solution selon la revendication 1, caractérisée en ce que le substrat constituant une source de G6P (gly- cose 6-phosphate) est avantageusement le galactose, qui a pour caractéristique de constituer une source de G6P même en l'absence des enzymes qui participent à la phase concernée du métabolisme des sucres et qui sont l'hexokinase (HK) et la phosphofructokinase (PFK) ou en cas de ralentissement de l'activité de ces enzymes. 3°) Solution selon la revendication 1 ou la reven¬ dication 2, caractérisée en ce que l'agent favorisant le mé¬ tabolisme érythrocytaire est pris dans le groupe qui comprend la dihydroxyacétone (DHA), l'acide glucuronique à l'état li¬ bre ou sous la forme de ses sels, le xylitol, le gulonate, le xylulose. 4^e) Solution selon la revendication 3, caractérisée en ce que dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est la DHA, elle est présente dans la composition à raison de 4 à 8 mmoles/litre. 5^e) Solution selon la revendication 3, caractérisée en ce que dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est l'acide glucuronique ou l'un de ses sels, il est présent dans la composition à raison de 5 à 21 mmoles/litre. 6°) Solution selon la revendication 3, caractérisée en ce que dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est le gulonate ou le xylulose, il est présent dans la solution à raison de 5 à 21 mmoles/litre. 7^e) Solution selon la revendication 3, caractérisée en ce que dans le cas où l'agent favorisant le métabolisme érythrocytaire mis en oeuvre est le xylitol, il est présent dans la composition à raison d'au moins 10 mmoles/litre.

8^e) Solution selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle présente la composi¬ tion préf rentielle suivante, en mmoles/1 : Saccharose 23±1

Adénine 1,2±0,1

Glucose 55±2 Galactose 22±2

Phosphate monosodique 3,4±0,2 Phosphate disodique 14±2 Dihydroxyacétone 6±1

Guanosine 2,1±0,2 Bicarbonate de sodium 55±5

Chlorure de magnésium 0,75±0,25 Chlorure de sodium 22±2

Eau qsp 1000 ml

9^e) Solution selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est mélangée à du CE en suspension dans la solution dans un rapport compris entre 1/1,8 et 1/2,5 pour l'obtention d'un hématocrite moyen com¬ pris entre 55% et 65%, de sorte que les CE ainsi traités peu¬ vent être conservés pendant environ 8 à 9 semaines à une tem¬ pérature comprise entre + 2°C et + 6°C avant utilisation, sans autre traitement que le réchauffement.