WO1986002092A1 - Mouse human hybridoma producing antivirus human antibody, process for its preparation, and antivirus human monoclonal antibody - Google Patents

Mouse human hybridoma producing antivirus human antibody, process for its preparation, and antivirus human monoclonal antibody Download PDF

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WO1986002092A1
WO1986002092A1 PCT/JP1985/000537 JP8500537W WO8602092A1 WO 1986002092 A1 WO1986002092 A1 WO 1986002092A1 JP 8500537 W JP8500537 W JP 8500537W WO 8602092 A1 WO8602092 A1 WO 8602092A1
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human
virus
antibody
mouse
cells
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PCT/JP1985/000537
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Yasuhiko Masufo
Yoh-Ichi Matsumoto
Toru Sugano
Katsuhiko Tomibe
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Teijin Limited
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/087—Herpes simplex virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
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    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/089—Cytomegalovirus

Definitions

  • the present invention relates to a mouse-human hybridoma producing an anti-virus ⁇ human antibody and a method for producing the same, and also to an anti-virus ⁇ human monoclonal.
  • Its purpose is simple herpes virus (Herpes simplex virus, HSV), varicella-zoster virus (Varicel la zoster virus, VZV), site mega. Cytomega-lovirus (CV), influenza virus, rabies virus, Japanese encephalitis virus, mumps virus, hepatitis B virus Antivirus that is useful for the diagnosis and treatment of viral infections such as viruses and rotavirus ⁇ Mouse antibodies that produce human antibodies To provide the
  • lymphocytes or B cells which produce specific antibodies but eventually die, eventually proliferate forever in the incubator.
  • myoma cells myeloma cells
  • Af ic
  • they can produce and secrete the specific antibody for seven consecutive times.
  • a method for establishing a cell line is known.
  • Monoclonal antibodies produced by the octipridema produced by such a method can be used as test chemicals and reagents as pure chemical reagents with high accuracy and reliability. It can be applied to labeling reagents, affinity chromatography, etc., and can also be expected to be used as a therapeutic or prophylactic for various diseases.
  • No. 59-22776 discloses spleen cells (antibody-producing cells) of BALB / G mouse immunized with Influenza virus or rabies virus.
  • the hybridomas of peripheral mice are fused with single cells to obtain hybridomas, and by cloning these hybridomas, monoclones are obtained. It has been disclosed that we have obtained eight anti-virus ⁇ mouse antibodies that produce mouse antibodies. Yes.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-175489 discloses an anti-simple fusion of mouse spleen pancreatic cells immunized with simple virus and mouse myeloma cells. It has been disclosed that a hybridoma producing a mouse virus ⁇ mouse antibody has been obtained.
  • a specific successful example is a mouse producing an anti-virus ⁇ mouse antibody. It is just a mouse hybridoma.
  • the antiviral ⁇ human antibody which is a perispecies protein, is more useful and safer.
  • the humans are pre-immunized with a large amount of virus, and the antibody-producing cells that have been effectively stimulated are collected.
  • it is difficult to use the method used for cell fusion it is difficult to properly collect and adjust antibody-producing cells. No disclosure of successful cases Disclosure of invention
  • the present inventors have conducted intensive studies with the aim of obtaining a mouse-hybrid hybridoma that produces an anti-virus human antibody, and as a result, Vro-human antibody-producing cells sensitized with virus or virus-derived protein or glycoprotein in the presence of mitogen in the presence of mitogen; Urine myeloma cells A---
  • FIG. 1 is an illustration of an X-ray film showing the results of immunoprecipitation of anti-HSV monoclonal antibodies.
  • FIG. 2 is a view showing the protective effect (survival rate) of the monoclonal antibody on HSV infection.
  • FIG. 3 is an SDS-PAGE electrophoresis diagram showing an antigen recognized by an anti-VZV monoclonal antibody.
  • a human antibody-producing cell is a human lymphocyte (or I3 cell) which secretes or has the ability to secrete an antibody.
  • a human lymphocyte or I3 cell
  • cells such as spleen m, lymph node, peripheral blood, bone marrow, tonsils, and adenoids.
  • any source of repertoire can be used, preferably spleen or tonsils or adenoids. It was collected from the sea.
  • mice myeloma cell As a mouse myeloma cell, it is advantageous to use an 8 -azaguanine-resistant strain, and as a known myeloma cell,
  • the human antibody-producing cells prior to fusing human antibody-producing cells with mouse myeloma cells, the human antibody-producing cells are subjected to in vitro mitigation.
  • a human sensitized in the presence of porcine I even a normal human has a lymphocyte capable of producing antibodies against various viruses, but that is not the case. Due to the small number, they cannot be used to obtain the desired hybridoma.
  • antibody-producing cells that produce antibodies against influenzae virus in the body of the human can be obtained. Although it increases to some extent, the degree of the increase is not always sufficient to efficiently obtain the desired hybridoma.
  • the i n of the present invention the degree of the increase is not always sufficient to efficiently obtain the desired hybridoma.
  • the sensitization promotes the differentiation and proliferation of the cells and arbitrarily increases the number of antibody-producing cells targeted. And can be.
  • By performing cell fusion using the antibody-producing cells thus sensitized it is possible to efficiently obtain a target hybridoma. I can't.
  • the virus used in the present invention is not particularly specified, for example, HSV, VZV, CMV, Influenza Virus, Rabies Virus, and Japan.
  • This encephalitis virus You can use Takaze virus, hepatitis B virus, or rotavirus, but by using the subsequent cell fusion, you can use the virus used for sensitization. Since a hybridoma producing antibodies can be obtained, it is necessary to select a sensitizing virus according to the purpose. For sensitization, virus-derived proteins or glycoproteins can be used, even if they are not viruses themselves.
  • PWM pork-width mitogene
  • PHA fit hemagglutinin
  • concanapalin A Preferable is PWM, which is usually used in an amount of 1 to 200 if /, preferably 20 to 100 ⁇ 3 / ⁇ .
  • the concentration of the antigen is 1 ns? / ⁇ l gf Z
  • lymphocytes (antibody-producing cells) concentration of 1 X 10 5 ⁇ 1 X 10 7 cells / ⁇ is Ri Oh appropriate
  • the culture temperature is culture time at 35-40 is 4-10 days, Preferably it is 6 to 8 days.
  • the culture solution may be anything containing serum of humans, cattle, horses, etc., and particularly, a culture solution containing fetal bovine serum (FCS) (eg, RPMI 1640) is preferred.
  • FCS fetal bovine serum
  • the human antibody-producing cells sensitized with the virus thus obtained and the mouse myeloma cells are then subjected to cell fusion according to a known method.
  • antibody-producing cells And myeloma cells from 10: 1 to: 100, preferably 1:
  • an appropriate cell fusion solution for example, about 35% polyethylene glycol (molecular weight of about 1,000 to 6,000) and about 7.5. % Dimethylsulfoxide containing RPMI 1640, stirred at room temperature to 37 ° C for ⁇ to several minutes, and then gradually added with RPMI 1640 with 10% FCS, and finally HAT ( (Hypoxanthin-aminobuterin-thymidine) Adjust so that the cell concentration in the selective culture solution is 1 to 5 x 10 5 cells / ⁇ . This is dispensed into 0.2-well plates, for example, in a 96-well plate, and cultured in air containing 5% C02 at 35-38 for 2-3 weeks.
  • an appropriate cell fusion solution for example, about 35% polyethylene glycol (molecular weight of about 1,000 to 6,000) and about 7.5. % Dimethylsulfoxide containing RPMI 1640, stirred at room temperature to 37 ° C for ⁇ to several minutes, and then gradually added with RPMI 1640 with
  • HA cultures only the 8-primedoma survives, and 8-omagammanin-resistant myeloma cells and fused cells between myelomas can survive. No (unfused antibody-producing cells die in a few days).
  • the antibody titer in the culture is checked, and only the eight antibody-producing antibodies producing the target antibody are selected and isolated (cloning). .
  • the antibody titer in the culture solution is checked by the binding of the antibody to the antigen, such as the radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and fluorescent antibody assays.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the mouse-human hybridoma producing the anti-virus human antibody of the present invention which is selected by cloning, is frozen and stored. And cultivate it in a large amount by an appropriate method. You can do that too. Cell lines (cell lines) or replicated cells of such hybridomas are also included in the scope of the present invention. Further, as long as the cloned hybridoma and substantially the same anti-virus ⁇ human antibody are produced, the range of the mutant strain or the like is within the scope of the present invention. include .
  • the protein derived from HSV or HSV derived from HSV in the presence of mitogen in vitro is required.
  • a method of fusing human antibody-producing cells sensitized with a glycoprotein with mouse myeloma cells may be used.
  • HSV type 1 (for example, KS strain, Hayashida strain) and type 2 (for example, YS-4 strain) are known.
  • the obtained monoclonal antibodies characteristic of the present invention react with the cell membrane and cytoplasm of HSV type 1 or type 2 infected cells, and are almost non-infected cells. It has a molecular weight of about 160,000 and has the property of not reacting.
  • HSV is composed of DNA, core protein, carbide and envelope, and in order to inactivate HSV, it is necessary to use HSV.
  • Antibodies are desired. Envelopes are glycoproteins, and B, C, D, E, F, etc. are known (ST, S. Howaer et al., Infection and Immunity, Volume 34). , 684, 1981), and the human monoclonal antibody of the present invention mainly reacts with glycoproteins. It has the following characteristics.
  • a method of fusing human antibody-producing cells sensitized with a ZV- or VZV-derived protein or glycoprotein with mouse myeloma cells can be used. You should. Monoclonal antibodies characteristic of the present invention obtained by such a method include:
  • the human monoclonal antibody V1 has the characteristic of recognizing glycoprotein antigens having molecular weights of 108K, 105K and 62K, and has the characteristic of detecting human monoclonal antibodies.
  • Noclonal antibody V2 recognizes glycoprotein antigens with molecular weights of 90K and 55K.
  • both V 1 and V 2 are excellent in that they can inactivate virus by 50% at a concentration of less than 13 Z of a monoclonal antibody in the presence of complement. Has neutralizing activity
  • Vero cells (approximately 2 ⁇ 10 8 ) grown in a monolayer were inoculated with 4.4 ⁇ 10 6 PFU (plaque forming unit) / HSV (KOS strain) at 37 ° C. for 2 hours. After adsorption, 2% 24 The cells were cultured in MEM medium containing serum for 24 hours. After washing the cells with phosphate-buffered saline, the cells were destroyed by ultrasound. This was centrifuged at 6000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant, which was overlaid on a 30% solution such as Shaw, and centrifuged at 30,000 rpm for 3 hours. The pellet precipitated at the bottom of the centrifuge tube was used as a virus antigen.
  • Human tonsillar lymphocytes were cultured in culture solution A (RPI 1640 + 20% fetal calf serum + 20 m HEPES + 2 M glutamin + 1 mM Na pyruvate + 0.02 ⁇ / ⁇ serine + 80 ⁇ gf Z Gen. Machine).
  • the cell concentration was 17 ⁇ 10 5 cells.
  • Each of the cell suspensions was put into 12 wells of a culture plate (24 wells). These were divided into 4 groups of 3 holes, the first group was not added, the second group was HSV (antigen) 16 ngp protein ⁇ , the third group was PWM 20 ⁇ 3 /, and the fourth group was not added.
  • the groups received a peripheral dose of HSV and PWM. This culture plate was cultured for 6 days in 37,5% CO 2 -air.
  • P3U1 had been cultured in culture medium B (RPI 1640 + 10% fetal calf serum + 2 ⁇ 1 ⁇ glutamine + 803 3Gentammycin) in advance.
  • the cell concentration at the time of use was 6 ⁇ 10 5 cells / cell.
  • 4 groups of sensitized lymphocytes (with 3 holes together) of the above (2) and P3U1 were separately serum-free RPM Washed twice with I1640.
  • the lymphocytes of each group and 5 ⁇ 10 s P 3 UI were combined in a test tube. After centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded.
  • the cell pellet was well dispersed by tapping the test tube.
  • Polyethylene glycol solution (RPI 1640 5.75 l + Polyethylene glycol 1000 3.5 mi + dimethyl sulfoxyside 0.75) (PEG solution) ) was added, and the cells were slowly suspended. One minute later
  • HSV KOS strain 1 ⁇ protein
  • ⁇ HSV 1 ⁇ protein
  • Falcon * Microtest Fixed to a 96-well plate. This step The hybridoma culture supernatant 60 was added to the plate and left at room temperature for 1 hour. Wash three times with phosphate-buffered saline (Tween-PBS) containing 0.05% Tween20 and then goat anti-human 19G antibody-alkaline phosphor. Then, 60 ⁇ A was added to the solution (200-fold diluted solution), and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • Tween-PBS phosphate-buffered saline
  • the P-neck phenyl phos- phate was mixed with 1 M ethanolamine + 1 mM g CHz. A solution of 0.6 as // ⁇ dissolved in PH 9.8 solution was added. After 30 to 60 minutes, the absorbance of 405 was measured, and the value was calculated by comparison with a standard IgG solution or standard HSV-positive serum.
  • Table 1 shows the number of wells having the hybridoma producing gG and the number of wells producing the anti-HSV antibody. Table 1 shows an example in which the lymphocytes were separated from the three tonsils.In each case, the highest amount of anti-HSV antibody was produced when HSV and PWM were added. A hybridoma has grown. Table 1
  • Cloning of anti-HSV antibody-producing hybridoma Cloning was performed by a limited dilution method. Cells were removed from the wells positive for the anti-HSV antibody, the number of cells was counted, and cells were seeded at 1 / well or 10 / well using the culture solution B. Two weeks later, the cells grew sufficiently. The supernatant was tested for the presence of anti-HSV antibodies by ELISA, and anti-HSV antibody-producing hybridomas were selected. .
  • One of the obtained hybridomas, D34 was added to serum-free medium ITES (16402 RPMI + 1 volume of MEM + 1 volume of F12 + 1 volume of F12 + 8.5 ⁇ 3 + volume of insulin). were cultured in the run-scan full e Li down 2 + d data Roh Lumpur ⁇ Mi down 20 M + Selector Na Lee Bok 2.5 X 10- 8). The culture supernatant was obtained, and the culture supernatant was adjusted to 14 / ⁇ by ultrafiltration (Amicon PM30). This was dialyzed against 0.02 M sodium phosphate (PH 7.8), equilibrated with the same buffer, and applied to foDE52 column (2 X OT ).
  • Human monoclonal antibodies were recovered in the unadsorbed fraction (21 ⁇ ). 'When measured by the enzyme antibody method, the culture supernatant contained 1.9 ⁇ ⁇ / id, and the purified monoclonal monoclonal antibody contained human IgG. When subjected to sodium dodecyl sulfate sodium polyacrylamide (5% gel) electrophoresis, a single band was formed at a molecular weight of about 160,000.
  • the specificity of the monoclonal antibody was examined by the fluorescent antibody method.
  • Hybrid cells containing HSV type 1 KOS-strain infected bellows cells fixed on slide glass with acetone, and containing monoclonal antibodies After reacting the culture supernatant for 1 hour at room temperature, washing, and then washing with a goat anti-human IgG, which is labeled with a full-year lettuce-in-isolate. (10-fold diluted solution) was reacted at room temperature for 1 hour. The slide thus prepared was observed with a fluorescence microscope. As a result, the monoclonal antibody produced by the hybridoma D34,7—4,5-11, H2 and H3 was not able to infect any virus.
  • Immunoprecipitation analysis was performed to determine what components of the virus particles to which the human monoclonal antibodies reacted. Infect V ero cells with HSV type 1 (Fukuda strain) or type 2 (UW 268 strain) and label them isotopically with H-glucosamine or S-methyl nin. I did it. Label the cells with 0.01 MT ris * H Ci-0.15 MNa Ci-1% sodium xycholate-1% Tronx 100-0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS ⁇ 1 mM Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PH 7.4) (dissolved in lysate), to which was added a monoclonal antibody.
  • A1 HSV type 1 human monoclonal antibody D34 A1 HSV type 1 human monoclonal antibody D34
  • virus neutralizing activity of Anti-HSV Monoclonal Antibody was determined as follows. 25 ⁇ JI (culture medium
  • Table 5 shows the neutralizing spectrum of the monoclonal antibody H2 (firewood enclosure). H2 had high neutralizing titers against all strains using HSV types 1 and 2. Table 4
  • the diluted antibody solution was injected into the abdominal cavity of H 2, H 3 and HI 3 G mice, 5 mice and D 34 mice were grouped with 10 BALB / c mice. Administered. Thirty minutes later, ⁇ SV type 1 (Miyama GC + strain) and 2,5 ⁇ 10 5 PFU were intraperitoneally administered, and the survival rate was determined by 15 eyes after feeling. The results are shown in FIG. The amount of antibody required to protect mice from death by 50% is 0.20 mgr / kgr for H2 and ⁇ 3 for H2, respectively.
  • H2 is capable of providing a protective effect 1900 times that of HIgG.
  • VZV Ker-waguchi strain
  • HeL human fetal lung cells
  • the cells were disrupted by ultrasonic treatment for 1 minute and then centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant was put on a rage of cesium chloride and centrifuged at 23,000 rpm for 3 hours. VSV between density 1.4 and 1.2 collected . The virus fraction was further precipitated by centrifugation at 25,000 rpm for 1.5 hours, and the precipitate was dispersed in phosphate buffered saline, and sonication was performed three times for 5 seconds.
  • the virus sample thus obtained was inactivated by irradiation with ultraviolet light, and then used for the following experiments.
  • Human tonsillar lymphocytes were allowed to float in culture solution A at 2.6 ⁇ 10 s / cell. To this was added VZV (final concentration 17 ng proteinino and PWM (20 ⁇ g / ⁇ )) obtained in (1) above, and cultured for 3, 5 or 7 days. The sensitized lymphocytes were fused with the cells in the same manner as in Example III- (3) .Culture of the hybridomas thus formed For the supernatant, IgM or IgG anti-VZV monoclonal antibodies were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay, and the results are shown in Table 6. Table 6 shows that a hybridoma producing an IgG monoclonal antibody against VZV has been obtained.
  • Lymphospheres were isolated by the Ficoll-Pack method from splenes removed by surgery from patients with autoimmune thrombocytopenia.
  • the lymphocytes were sensitized for 6 days by adding VZV (17 ng /) and PWM (2 u ⁇ /) as in Example 5 (23).
  • Cell fusion was carried out in the same manner as in Example 1, (3), and the resulting culture supernatant of the hybridoma was formed.
  • Table 7 shows the number of holes in the 96-hole plate.
  • Cells were removed from the wells positive for anti-VZV activity, the number of cells was counted, and cells were seeded in 96-well culture cells at 1 cell / well or 10 cells / well. After 3 or 4 weeks, the cells proliferated sufficiently. Therefore, the culture supernatant was screened for anti-VZV antibody activity. Thus, as much as possible, the cells originating from those seeded in the cells / well were selected. This operation was repeated two or four times so that all clones had anti-VZV antibody activity.
  • hybridomas Three hybridomas have been established from mouse X-human cell fusion. These hybridomas produced 6 to 25 3 / day ⁇ 10 s cells of monoclonal antibodies. These were named V1, V2 and V6.
  • V, V2 and V6 subclasses and L chain types were determined. Using anti-human anti-human IgG, anti-human IgG2, anti-human IgG3 and anti-human Ig (34 The class was determined and as a result, V1, V2, and V6 also reacted only with the anti-human IgG1 antibody. As a result of ELISA using the anti-human K chain or the insert chain, the three monoclonal antibodies were used. odfIdi / g / es
  • the antigen molecule is analyzed by immunoprecipitation and sodium dodecyl sulfate sodium polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). It was decided.
  • HEL Human fetal lung cells
  • CPE Human fetal lung cells
  • the cells were further cultured at 37 for 18 hours, during which time the cells were collected when the CPE had spread over the entire monolayer cells.
  • the collected cells were washed, and 10 mM Tris H Ci (pH 7.4), 0.15 M Na Ci, mM M phenylmethylsulfonyl full-length guide (Sigma Chemicals Co., St) Loues, o.), MM ethylenediamine acetic acid, 1% Triton X — 100, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% sodium chloride. It was dispersed and solubilized by sonication in mud succinic acid (RIPA buffer). This was hired by a 60% sucrose solution and hired. Insoluble materials were removed by ultracentrifugation at 100,0003, 1 o'clock, and the supernatant was frozen and stored at —70 as an antigen.
  • RIPA buffer mud succinic acid
  • the beads containing the immune complex were centrifuged on a pellet and washed five times with two RIPA buffers and twice with two 10 mM TsH Ci (pH 6.8).
  • the washed immune complexes were eluted with 100 ⁇ l of SDS-sample buffer at 110 ⁇ l.
  • Tris H Ci—Glycine-SDS buffer system (pH 8.3) was performed according to standard procedures.
  • the slab gel was immersed in a 1 M aqueous solution of sodium salicylate, and then dried on a paper roll.
  • the dried gel was exposed to K 0 D A K X — T M ATS film for 21 days at —70 for 7 days.
  • Monoclonal antibody V1 recognizes glycoproteins with molecular weights of 108K, 105K and 62K
  • monoclonal antibody V2 recognizes different glycoproteins with molecular weights of 90K and 55K. Recognized as recognized.
  • V1 (row A) and V2 (row B) were precipitated with [ 3S S] -methyl-2-labeled virus antigen.
  • V 1 (row C) and V 2 (row D) were precipitated with [ 3 H] -glucosamine-labeled antigen.
  • the arrow on the right indicates the mobility of the standard protein.
  • K means kilodalton.
  • V6 showed an electrophoresis pattern completely around V1.
  • Anti-VZV monoclonal antibody-producing cell culture supernatant is collected and subjected to 50% saturated ammonium sulfate for monoclonal antibody.
  • Antibodies were precipitated and dialyzed against phosphate buffered saline. This was used in the following experiments as a monoclonal antibody preparation. The amount of the monoclonal antibody contained in each of the samples was determined by an immuno-one-dimensional diffusion method using an anti-human IgG antibody.
  • Monoclonal antibody preparation was diluted 3-fold with 5% FCS-MEM, and its solution (200 and VZV (Kawaguchi strain, 4000 PFU, 100)) and guinea pig supplement (5 Double-diluted solution, 100 i) or 5% FCS-mixed with 100% iCS, and incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • This virus mixture was added in advance.
  • 5% FCS-MEM containing 2.5% methylcellulose was added to the cells.
  • the layers were cultured in five gastric Shi 7 days C_ ⁇ 2 incubator. as a Later, infected HEL cells were fixed with 10% formalin and
  • the cells were stained with a 0.15% crystal pipet and the number of plaques was counted.
  • the virus activities of the monoclonal antibodies, V1, V2 and V6 were as shown in Table 9.
  • V1 and V2 have excellent neutralizing activity in the presence of complement, requiring no more than 1 monoclonal antibody to inactivate 50% of the virus. You can see.
  • the sensitized lymphocytes obtained from the above-described lymphocyte dispersion were mixed with 5 x 10 s mouse ⁇ myeloma cells (P3U1 strain). ) Were mixed with each other, fused with a polyethylene glycol, and cultured on a HAT medium.
  • CMV antigen did not produce any anti-CMV monoclonal antibody-producing hybridomas, but did not generate many anti-CMV monoclonal antibodies from antigen-sensitized lymphocytes.
  • An antibody-producing clone was generated. These clones were cloned by the limiting dilution method, and seven types of hybridomas C2, C3, C4.23, C5.3, C6.11 and C7.23 were obtained. Obtained .
  • Table 10 The immunological characteristics were as shown in Table 10.
  • an antiviral ⁇ human antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • this hybridoma can be transplanted into an animal to form a tumor, and anti-viral ⁇ human antibodies can be obtained from the ascites or serum.
  • the anti-virus ⁇ human antibody thus obtained is a monoclonal antibody and can be used for the purpose of diagnosing and treating various viral infections. And can be done.

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Description

明 細 書 発明 の名称
抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を産生 す るマ ウ ス 一 ヒ 卜 ハ イ ブ リ ド ー マ及びそ の製造法並び に 抗ウ ィ ルス · ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体
技術分野
本発明 は 、 抗ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を産生 す るマ ウス — ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ー マ と そ の 製造法 、 並び に 抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル に 関 す る 。 そ の 目 的 と す る と こ ろ は 単純へルぺ ス ウ ィ ルス （ H erpes simplex vi rus, H S V ) 、 水痘帯状疱疹 ウ ィ ルス （ V aricel la zoster vi rus, V Z V ) , サイ 卜 メ ガ ロ ウ ィ ルス （ C ytomega - lo vi rus, C V ) , イ ン フ ルエ ンザ ウ イ ルス ， 狂犬病 ウ ィ ルス ， 日 本脳炎ウ ィ ルス ， お た ふ く かぜ ウ ィ ル ス ， B 型肝炎ウ ィ ルス ， ロ タ ウ ィ ルス等の ウ ィ ルス感染症の 診断及び治療等に 役立つ と こ ろ の抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体 を産生 す る 、 マ ウ ス 一 ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ー マ を提供す る こ と に あ る 。
本発明 の他の 目 的は 、 H S V 1 型又 は 2 型 に よ る ウ イ ルス感染症の診断及び治療等 に 役立つ と こ ろ の抗 H S V ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体を提供する こ と に あ る 。 本発明 の も う 一つ の 目 的 は 、 V Z V に よ る ウ ィ ルス感染症の 診 断及び治療等 に役立つ 、 V Z V に 特異的な ヒ 卜 型モ ノ ク ロ ー ナル抗体を提供す る こ と に ある
背景技術
細胞融合の技術を用 いて 、 特異的な抗体を産生す る が や が て は死滅す る運命 あ る リ ンパ球又 は B 細胞 （ 抗体 産生細胞 ） と 、 培養器の中で永久 に 増殖 しつ づけ る ミ エ ロ ー マ細胞 （ 骨髄腫細胞 ） を a fasd A f=i c せる こ と に よ り 、 特 異抗体を 7 続的に産生分泌す る八 ィ プ リ ド一マ （ 融合細 胞 ） 株を樹立さ せ る方法 は公知で あ る 。 かかる方法 に よ つ て 作成さ れた 八 ィ プ リ ド ーマ が産生 する モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は 、 髙い精度 と信頼度を ちつ純粋な化学試薬 と し て 、 検査試薬や標識試薬， ァ フ ィ ニテ ィ ー ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一 な ど に応用 ができ る他 , 各種疾病の治療薬 ， 予 防 薬 と し て の応用 ち期待で き る も ので あ る 。
と こ ろ で 、 モ ノ ク ロ ー ナルな ウ イ ルス抗体を得 ょ ラ と す る場合 に は 、 ゥ ィ ルス抗体産生細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞 と を融合さ せ 、 ク 口 一 二 ング に よ つ て ウ イ ルス抗体産生 性のハ イ プ リ ド ーマ を得れば よ い こ と は一般論 と し て は 知 ら れて い る 。 そ し て 、 具体的 に は 、 例 えば 、 特公昭
5 9 - 2 2 7 6号公報 に は 、 イ ン フ ルェ ンザ ウ イ ルス又 は狂犬 病ウ ィ ルスで免疫さ れた B A L B / G マ ウ ス の脾臓細胞 ( 抗体産性钿胞 ） と 、 周種のマ ウ スの ミ エ □ 一マ細胞 と を融合さ せハ イ ブ リ ド ー マ を得 、 こ れを ク ロ ー ニ ン グ す る こ と に よ つ て 、 モ ノ ク ロ ー ナルな抗ウイ ルス ♦ マ ウ ス 抗体を産生 す る八ィ ブ リ ド ー マ を得た こ と が 開示 さ れて い る 。 ま た 、 特開 昭 58 - 1 75489号公報 に は 、 単純へルぺ ス ウ ィ ルス で免疫 し た マ ウ ス の脾艨細胞 と マ ウ ス の ミ エ ローマ細胞 と を融合させ 、 抗単純へルぺス ウ ィ ルス ♦ マ ウ ス抗体を産生 す る はハ イ プ リ ド ーマを得 た こ と が 開示 さ れて い る 。
以上の ご と く 、 抗 ウ ィ ルス抗体を産生 するハ イ ブ リ ド 一マ に 関 し て は 、 具体的な成功例 は抗ウ ィ ルス ♦ マ ウ ス 抗体を産生す るマ ウ ス 一マ ウ スハ イ ブ リ ドーマだけで あ る 。 し か し 、 ヒ 卜 の病気の診断や治療の た め に は 、 周種 タ ンパ ク で あ る抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体の方が有用でかつ 安全で あ り 、 そ の た め に は 、 ヒ 卜 の抗体産生細胞を用 い て マ ウ ス ー ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ーマゃ ヒ 卜 一 ヒ 卜 ハ イ ブ リ ド 一マ を樹立す る 必要が あ る 。 し か し な が ら 、 動物 の場合 と 異な り 、 ヒ 卜 の場合 に は 、 ヒ 卜 を あ ら か じ め多量の ゥ ィ ルスで免疫 し 有効 に刺 激 さ れた 抗体産生細胞を採取 し て 細胞融合 に 用 い る と い っ た方法を と るわ け に はい かな い ので 、 適切 な抗体産生細胞の採取 ， 調整が困難で あ る と い っ た 問題等があ り 、 未だ明確な 成功例の報告がな い 発明 の 開示
本発明者 ら は 、 抗 ウ ィ ルス · ヒ 卜 抗体を産生 す るマ ウ ス ー ヒ 卜 ハ イ ブ リ ドーマを得る こ と を 目 的 と し て 鋭意研 究を行な っ た 結果、 i n V r oでマ イ 卜 ー ジ ヱ ン の存在下 に ウ ィ ル ス又 は ウ ィ ル ス 由 来の蛋 白若 し く は糖蛋 白 で感 作 し た ヒ 卜 の抗体産生細胞 と 、 マ ウ ス の ミ エ ロ ーマ細胞 A - - ——ノ
と を融合さ せる と い う 方法 に よ っ て 、 抗ウ イ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を産生 するマ ゥ ス 一 ヒ 卜 ノヽイ ブ リ ド ーマ を得る こ と がでさ た 。 そ し て 、 特定 のハ イ プ リ ド ーマ及び /又 はそ れに 由 来する細胞株を培養 し 、 培養物 か ら H S V又 は V
Z Vに特異的 に 反応す る ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体を採取 す る こ と がでさ た 。
図面の簡単な説明
第 1 図 は 、 抗 H S Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の免疫沈降分 祈の結果を示す、 X線フ ィ ルム の 説明 図であ る 。 第 2 図 は 、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体の H S V感染防御効果 （ 生存率 ） を示す 図であ る 。 第 3 図 は 、 抗 V Z Vモ ノ ク ロ ー ナル抗 体の認識抗原を示す 、 S D S - P A G E 泳動 図で あ る
発明.を実施す る た め の最良の形態
本発明 に お い て ヒ 卜 の抗体産生細胞 と は 、 ヒ 卜 の リ ン パ球 （ 又 I3細胞 ） であ つ て 、 抗体を分泌 し て いる又 は 分泌す る 能力 を持 っ た細胞を い う 。 こ れは脾 m , リ ンパ 節 ， 末稍血 ， 骨髄 ， 扁桃， アデ ノ ィ ド等の細胞の 中 に含 ま れて い 。 本発明の 目 的の た め に は 、 い かなる ソ ー ス の リ ンパ球で も用 い る こ と ができ る が 、 好ま し い の は脾 顧又は扁桃又 は ア デ ノ イ ド か ら 採取さ れた も ので あ る 。
マ ウ スの ミ エ ロ ーマ細胞 と し て は 、 8 — ァザグァ ニ ン 耐性株を用 い る の が有利で あ り 、 公知 の もの と し て は 、
B A し B / c マ ウ ス の P 3 X 63A g 8株 ， P 3 - N S 1 / 1 - A g 4 — Ί 株 ， P 3 X 63A 9 8 U 1 株 ， S P 2 O A 914 株 ， P 3 X 63A 9 8.6.5.3株 ， M P C 11— 45.6. T G 1.7株， S P — 1 株等が あ る 。
本発明 に お い て は 、 ヒ 卜 の抗体産生細胞 とマ ウ スの ミ エ ロ ーマ細胞 と を融合さ せ る に先立っ て 、 ヒ 卜 の抗体産 生細胞を i n V roでマ イ 卜 ー ジ I ン の存在下に感作す る ヒ 卜 の場合 、 正常人で も各種 ウ ィ ルス に対す る抗体を 産生 し 得る能力 の あ る リ ンパ球を有 し て い る が 、 そ の数 が少な い た め に そ の ま ま で は 目 的 と す るハ イ プ リ ド ー マ を得る た め に利用 す る こ と がで きな い 。 ま た 、 例え ば 、 ヒ 卜 を イ ン フ ル エ ンザ ワ ク チンで免疫す る と 、 ヒ 卜 の体 内 に イ ン フルエ ンザ ウ イ ルス に対す る抗体を産生す る抗 体産生細胞が あ る程度増加 す る けれ ど も 、 そ の.増加 の程 度 は 、 目 的 と するハ イ ブ リ ド ーマ を効率良 く 得る の に 必 ず し も充分な程で は な い 。 こ れ に対 し 、 本発明 の i n
V Γ0で ヒ 卜 の抗体産生細胞を感作す る方法 に よ れば 、 感作 に よ り 細胞の分化及び増殖を促進 し 目 的 と す る抗体 産生細胞の数を任意 に増大さ せる こ と ができ る 。 か く し て 感作さ れた抗体産生細胞を用 い て 細胞融合を行な う こ と に よ っ て 、 効率良 く 目 的 と す るハ イ プ リ ド ーマ を得る こ と がで ぎ る 。
本発明 に お い て 用 い ら れる ウ ィ ルス と し て は特 に 頃定 はな く 、 例 え ば 、 H S V , V Z V , C M V , イ ン フ ルェ ンザ ウ ィ ルス ， 狂犬病 ウ ィ ルス ， 日 本脳炎ウ ィ ルス ， お た ふ く かぜウ ィ ルス ， B型肝炎 ウ ィ ルス ， ロ タ ウ ィ ルス を用 い る こ と ができるが 、 その後の細胞融合 に よ っ て 、 感作 に用 いた ウ ィ ルス に対す る抗体を産生す るハ イ プ リ ド ー マ が得 ら れるので 、 目 的 に応 じ て感作用 ウ ィ ルス は 選択す る必要があ る 。 ま た 感作の た め に は 、 ウ ィ ルスそ の も ので は な く て も 、 ウ ィ ルス 由 来の蛋 白若 し く は糖蛋 白 を用 い る こ と あ でぎ る 。
マ イ 卜 — ジ ェ ン は 、 リ ンパ球の分化及び増殖を促進さ せる も の な ら 何で も よ いが 、 例 え ば、 ポ ー ク ウ イ ドマ イ 卜 一 ジ ェ ン （ P W M ) , プ ロ テ イ ン A , フ ィ 卜 へ 厶 ァ グ ルチニ ン （ P H A ) ， コ ン カ ナパ リ ン Aが あ る 。 好 ま し い の は P W Mで あ り 、 通常 1 〜 200 if / , 好 ま し く は 20〜 100〃 3 /· の量で用 い ら れる 。
感作の方法 ♦ 条件 は特 に 限定 さ れるも の で は な い が 、 抗原 （ ウ ィ ルス又 は ウ ィ ル ス 由 来の蛋 白若 し く は糖蛋 白 ） の濃度は 1 ns? / 〜 l gf Z , リ ンパ球 （ 抗体産生 細胞 ） の濃度 は 1 X 105 〜 1 X 107 個 / ^が適当で あ り 、 培養温度は 35〜 40 で培養時間 は 4〜 10日 ， 好 ま し く は 6〜 8 日 で あ る 。 培養液 は人 ， 牛 ， 馬等の血清を含むも のな ら何で も良い が 、 特に胎児牛血清 （ F C S ) を含む 培養液 （ 例 え ば R P M I 1640 ) が好 ま し い 。
か く し て得 ら れた ウ ィ ルスで感作 し た ヒ 卜 の抗体産生 細胞 と マ ウ ス の ミ エ ロ ーマ細胞 と は 、 次いで公知 の方法 に従 っ て細胞融合せ し め ら れる 。 例 えば、 抗体産生細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞を 10： 1 〜 ： 100, 好 ま し く は 1 ：
1 〜 1 ： 20の比率で混合 し 、 適当な細胞融合用 溶液、 例 えば約 35%ポ リ ェ チ レ ン グ リ コ ー ル （ 分子量 1， 000〜 6, 000程度 ） お よ び約 7.5%ジ メ チルスルホキ シ ド を含 む R P M I 1640を加 え て 、 室温〜 37°Cで Ί 〜数分間撹拌 し 、 そ の後 10% F C S加 R P M I 1640で徐々 に 积 し 、 最終的 に は H A T ( ヒ ポ キサ ン チン一ア ミ ノ ブテ リ ン ー チ ミ ジ ン ） 選択培養液 に て 細胞濃度が 1 〜 5 X 105 個 Z /^ と な る よ う に 調整す る 。 こ れを 0.2^ずつ 、 例 え ば 96 穴プ レ ー 卜 に 分注 し 、 5 % C 02 を含む空気中で 35〜 38 で 2〜 3週間 培養す る 。 H A Τ培養液中で は八 ィ プ リ ド ー マ の みが生存 し 、 8 - ァ ザグ ァ ニ ン耐性の ミ エ.ロ ー マ細胞及び ミ エ 口 一マ同士 の融合細胞 は生存 し 得な い ( 未融合の抗体産生細胞 は数 日 で死滅す る ） 。 培養後 、 培養液中 の抗体価を チ ェ ッ ク し 、 目 的 と す る抗体を産生 し て い る八 イ ブ リ ド ー マ の みを選択 し 単離する ( ク ロ ー ニ ング ） 。 培養液中 の抗体価の チ ェ ッ ク は 、 ラ ジ 才 ィ 厶 ノ ア ッ セ ィ 法 （ R I A ) , 酵素抗体法 （ E L I S A ) , 螢光抗体法な ど の 、 抗原へ の抗体の結合そ の も の を検出 す る方法 と 、 ウ イ ルスの生物活性を 阻害す る抗体の 活性 を みる方法等で行な う こ と がで ぎ る 。 ク ロ ー 二 ン グ に よ つ て 選択さ れた 、 本発明の抗 ウ ィ ルス · ヒ 卜 抗体を産生 す るマ ウ ス 一 ヒ 卜 ハ イ ブ リ ド一マ は 、 凍結 し て 保存 す る こ と がで さ 、 ま た 、 こ れを適当 な方法で大量 に培養する こ と もでき る 。 かかるハ イ プ リ ド ー マ の セルラ イ ン （ 細 胞株 ） 又 は複製さ れた細胞も本発明 の範囲 に 含 ま れる も の で ある 。 ま た 、 ク ロ ー ン化さ れたハ イ プ リ ド ー マ と 実 質的 に周一 の抗ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を産生 す る 限 り 、 そ の変異株等ち本発明 の範囲 に 含 ま れる 。
本発明 に お い て抗 H S V ♦ ヒ 卜 ク ロ ー ナル抗体を得る た め に は 、 in V roでマ イ 卜 一 ジ ェ ンの存在下 に H S V 又 は H S V由 来の蛋 白若 し く は糖蛋 白 で感作 し た ヒ 卜 の 抗体産生細胞 と 、 マ ウ ス のミ エ ロ ー マ辋胞 と を融合さ せ る と い う 方法を採れば よ い 。 H S V と し て は 、 1 型 （ 例 え ば 、 K〇 S株 ， H ayashida株 ） と 2型 （ 例 え ば、 Y S — 4株 〉 が知 ら れて い る 。 - かかる方法 に よ っ て 得 ら れた 、 本発明 に お い て 特徴的 な モ ノ ク ロ ー ナル抗体 は 、 H S Vの 1 型又 は 2型感染細 胞の細胞膜及び細胞質 と 反応 し 、 非感染細胞 と は ほ と ん ど反応 し な い と い う 性質を有する分子量が約 16万で I g
G型の抗体で あ る 。
H S V は 、 D N A と コ ア ♦ タ ンパ ク ， カ ブシ ッ ドそ し て エ ン ベ ロ ープか ら 成 っ て お り 、 H S Vを不活化す る た め に は 、 エ ンベ ロ ープ に 対する抗体が望 ま れる 。 ェ ンべ ロ ー プは糖蛋 白 で あ り 、 B , C , D , E , F等が知 ら れ て い る が （ S . T . S howa er他、 I nfection and I mmunity , 34巻 ， 684ペ ー ジ ， 1981年 ） ， 本発明 の ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体は、 主 と し て 糖蛋 白 Β と 反応す る と い う 特徴を有す る 。
本発明 に お い て 抗 V Z V · ヒ 卜 モ ノ ク ロ一ナル抗体を 得る た め に は 、 i n V i t r 0でマ ィ 卜一ジ ェ ン の存在下 に V
Z V又 は V Z V 由来の蛋 白 若 し く は糖蛋 白 で感作 し た ヒ 卜 の 抗体産生細胞 と 、 マ ウ ス の ミ エ ロ ー マ細胞 と を融合 さ せ る と い う 方法を採れば よ い 。 かかる方法 に よ っ て 得 ら れた 本発明 に お い て 特徴的な モ ノ ク ロ ー ナル抗体 は 、
V Z V に 特異的 に反応す る 。 そ し て 、 特 に ヒ 卜 型モ ノ ク ロ ー ナル抗体 V 1 は 、 分子量 108K， 105K及び 62 K の 糖 蛋 白抗原を認識す る と い う 特徴 を有 し 、 ま た ヒ 卜 型モ ノ ク ロ ー ナル抗体 V 2 は 、 分子量 90K と 55K の糖蛋 白 抗 原を認識す る 。 そ し て V 1 , V 2 共 に 、 補体の存在下で モ ノ ク ロ ー ナル抗体量 1 3 Z 以下の 濃度で 、 ウ ィ ル ス を 50%不活性化 し 得る と い う 優れた 中和活性を持 っ て い る
以下 、 実施例 に よ り 本発明 を 詳述 す る 実施例 1
( H S V に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を産生 す る ハ イ プ リ ド ー マ ）
(1) H S V抗原の作製
単層 に増殖 し た V ero 細胞 （ 約 2 X 108 個 ） に ， 4.4 X 106 P F U ( プラ ー ク形成単位 ） / の H S V ( K 0 S 株 〉 を接種 し た 。 37で で 2 時間吸着さ せ た の ち 、 2 % ゥ シ血清を含む M E M培地で 24時間培養 し た 。 こ の細胞 を リ ン酸緩衝生理食塩水で洗浄 し た の ち 、 超音波 に よ り 細胞を破壊 し た 。 こ れを 6000 rpm で 30分間遠心 し た 上清 を得、 こ れを 30%シ ョ 等溶液の上 に重層 し 、 30000 rpmで 3 時間遠心 し た 。 遠心管の底に 沈殿 し た ペ レ ツ 卜 を ウ イ ルス抗原 と し て用 いた 。
(2) H S V に よ る リ ンパ球感作
ヒ 卜 の扁桃 リ ンパ球を培養液 A ( R P I 1640 + 20% 胎児牛血清 + 20m H E P E S + 2 M グル タ ミ ン + 1 m M N a ピル ビ ン酸 + 0.02 ^ /^セ リ ン + 80^ gf Z ゲ ン タ マ イ シ ン ） に 浮遊さ せ た 。 細胞濃度 は 17 X 105 個ノ で あ っ た 。 こ の細胞浮遊液を ずつ 、 培養プ レ ー 卜 （ 24穴 ） の 12穴 に入れた 。 そ れ ら を 3 穴ず つ 4 群 に 分け 、 第 1 群 は無添加 、 第 2 群 に は H S V ( 抗原 ） 16 n gp タ ンパ ク ^、 第 3 群 に は P W M 20^ 3 / 、 第 4 群 に は周量の H S V と P W M を添加 し た 。 こ の培養プ レ 一 卜 を 37 ， 5 % C 0 2 一 空気で 6 日 間培養 し た 。
(3) マ ウ ス ♦ ミ エ ロ ー マ細胞 P 3 X 63 A 9 8 U 1 株 ( P 3 U 1 と 格記す る ） と の細胞融合
前も っ て P 3 U 1 を培養液 B ( R P M I 1640+ 10%胎 児牛血清 + 2 Π1Μ グル タ ミ ン + 80 3 ノ ^ゲ ン タ マ イ シ ン ） 中で培養 し て お いた 。 使用 時の細胞濃度 は 6 X 105 個 / で あ っ た 。 上記（2)の感作 リ ンパ球 （ 3 穴を一緒 に し た ） 4 群 と P 3 U 1 を 、 そ れぞれ別 々 に無血清 R P M I 1640で 2 回洗净 し た 。 各群の リ ンパ球 と 5 X 10s 個 の P 3 U I と を試験管の中で一緖 に し た 。 1500 rpm で 5分 間遠心 し 、 上清を捨て た 。 細胞ペ レ ツ 卜 を 、 試験管 を た た く こ と に よ っ て 、 よ く 分散さ せ た 。 こ れ に の ポ リ エ チ レ ング リ コ ー ル液 （ R P M I 1640 5.75 ιώ + ポ リ エ チ レ ング リ コ ール 1000 3.5 mi + ジ メ チル スルホキ サ イ ド 0.75 ) ( P E G液 と 略記 す る ） を加 え て 、 細 胞を ゆ るやか に 浮遊さ せ た 。 1 分後 に
40を加 え 、 さ ら に 1 分後に 1 Bi2 R P M I 、 さ ら に 2分後 に の H A T培養液 （ R P M I 1640+ 2096胎児牛血清 + 80^ 3 / ゲ ン タ マ イ ン シ ン + 95 M ヒ ポ キ サ ン チ ン + 0.4^ Μア ミ ノ プテ リ ン + チ ミ ジ ン ） 、 さ ら に 2分後 に は 4 Αώ·の Η Α 丁 培養液を加 え た 。 最後 に 、 Η A Τ培養液で 細胞浮遊液 と し た 。 こ れを培養プ レ ー 卜 （ 96穴 ） 1 枚 に 蒔い て 、 37で ， 5 % C 02 含有空気中 で培養 し た 。 一週間毎 に 半量の培養液を新 し い H T培養 液 （ H A Tか ら Aを 除去 し た も の ） で交換 し て い きハ イ プ リ ド ー マ を得た 。
(4) ヒ 卜 I g G と 抗 H S V抗体の測定
酵素抗体法 （ E L I S A ) に よ っ て 測定 し た 。 ヒ 卜
I g Gを 測定 する た め に ャ ギ抗 ヒ 卜 i g G抗体 （ ιοχ 3
/ id ) を 、 あ る い は抗 H S V抗体を測定 す る た め に H S V ( K O S株 ） 1 ^ タ ンパ ク Ζ «ώをそ れぞれ フ ア ル コ ン * ミ ク ロ テ ス ト ΕΙの 96穴プ レ ー 卜 に 固定 し た 。 こ のプ レ ー 卜 に ハ イ プ リ ド ー マ培養上清 60 を加 え て 、 室温 で 1 時間放置 し た 。 0.05 % T ween20を含有 す る リ ン酸 緩衝生理食塩水 （ T ween— P B S ) で 3 回 洗净の の ち 、 ャ ギ抗 ヒ 卜 1 9 G抗体 一 アル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ （ 20 00倍希釈液 ） を 60^ A加 え て 、 室温で 1 時間反応 さ せ た 。 さ ら に T ween- P B Sで 3 回洗浄 し た の ち 、 P — 二 卜 口 フ エ ニル フ ォ ス ク エ ー 卜 を 1 Mジ エ タ ノ ール ァ ミ ン + 1 mM g CH z の PH 9.8溶液 に 0.6as/ /^ の割合で 溶か し た 溶液 を加 え た 。 30分か ら 60分後 に 405 の吸光度を測定 し 、 標準 I g G液ある い は標準 H S V陽性血清 と の 比較か ら 、 そ の値を算出 し た 。
全'群 と も 96穴プ レ ー ト 1 枚 に 細胞を蒔き 、 96穴中 の 、 ハ イ ブ リ ド ー マ が成育 し て き た 穴の数 、 さ ら に そ の う ち ヒ 卜 I g Gを産生 し て い る ハ イ プ リ ド ーマ を も つ 穴の数、 そ し て 抗 H S V抗体を産生 し て い る穴の数を 第 1 表 に示 し た 。 第 1 表 に は 、 3つ の扁桃 よ り 、 リ ンパ球を分離 し た例 を示 し た が 、 ど の 場合 に も H S V と P W Mを加 え た と き に最も多 く の抗 H S V抗体産生ハ イ プ リ ド ー マ が成 育 し た 。 第 1 表
扁桃 刺 激 全ハイプリドーマ Ig G産生 抗 HSV抗体産生 無添加 21 20 1
1 HSV 11 9 1
PW 48 48 4
HSV+PWM 64 64 58
無添加 24 11 0
2 HSV 28 13 0
PWM 68 68 1
HSV+PWM 83 80 9
無添加 27
3 HSV 36 12 0
PW 62
HSV+PWM 63 53 1
(5) 抗 H S V抗体産生ハイ プ リ ド ーマ の ク ロ ー ニ ン グ ク ロ ー ニ ン グ は限定希积法を用 い た 。 抗 H S V抗体陽 性の穴 よ り 細胞を取 り 出 し 、 細胞数を数え培養液 Bを用 い 1 個 /穴あ る い は 10個 /穴で細胞を蒔い た 。 2週間後 に 細胞が十分増殖 し た ので 、 そ の上清 に抗 H S V抗体が あ る か否かを E L I S Aに よ っ て 測定 し 、 抗 H S V抗体 産生ハ イ プ リ ド ー マ を選別 し た 。
(6) 抗 H S Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の 調 製
得 ら れた ハ イ プ リ ド ーマの 1 つ D 34を無血清培地 I T E S ( R P M I 16402容 + ダルぺ ッ 卜 M E M 1 容 + F 12 1 容 + イ ン シ ュ リ ン 8.5^ 3 + 卜 ラ ン ス フ ェ リ ン 2 + エ タ ノ ール ァ ミ ン 20 M + セ レ ナ イ 卜 2.5 X 10-8 ) で培養し た 。 そ の培養上清 を得 て 、 こ れを限外瀘過 （ ア ミ コ ン P M 30 ) で 14/ ^ に し た 。 こ れを 0.02 M リ ン酸ナ ト リ ウ ム （ PH 7.8) 透析 し 、 同緩衝 液で平衡化 し fo D E 52カ ラ ム （ 2 X OT ) に かけ た 。 未吸着分画 （ 21δώ ) に ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体が 回収 さ れた 。 '酵素抗体法で測定 し た と き 、 培養上清 に は 1.9^ ^ / id , 精製モ ノ ク ロ ー ナル抗体標品 に は の ヒ 卜 I g Gが含 ま れて い た 。 ドデシル硫酸ナ 卜 リ ウ ム ー ポ リ ア ク リ ルア ミ ド （ 5 %ゲル ） 電気泳動 に かけ る と 、 分子量約 16万の位置 に単一 のバ ン ド が形成さ れた 。 実施例 2
抗 H S Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の性質
(1) 螢光抗体法 に よ り 、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体の特異性を 調 べ た 。 H S V 1 型の K O S株の感染 し た ベ ロ ー 細胞を ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に ァ セ 卜 ンで 固定 し 、 こ れ に モ ノ ク ロ ー ナル抗体を含むハ イ ブ リ ド ー マ培養上清を室温で 1 時 間反応さ せ 、 洗浄後、 さ ら に フ ル 才 レ ツ セ イ ン イ ソ チ 才 シ ァネ ー 卜 で ラベルさ れた ャ ギ抗 ヒ 卜 I g G ( 10倍希釈 液 ） を室温で 1 時間反応 さ せ た 。 こ う し て 作成 し た ス ラ . イ ド を螢光顕微鏡で観察 し た 。 そ の結果 、 ハイ プ リ ド ー マ D 34, 7 — 4 , 5 - 11, H 2そ し て H 3の産生 す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体 は いず れも ウ ィ ルス の感染 し た 細胞の 細胞膜 と 細胞質 に反応 し 、 非感染細胞 に は全 く 反応 し な い こ と が判 っ た 。 さ ら に H S Vの Ί 型の H ay ash i da株や H S V 2型の Y S — 4株の感染 し た細胞 に も反応 す る こ と が判 っ た 。
(2) ク ロ ー ニ ン グさ れた ハ イ プ リ ド ーマ よ り 産生 さ れる モ ノ ク ロ ー ナル抗体 D 34, H 2 , H 3のサブ ク ラ ス と L 鎖を検討 し た 。 ヒ ッ ジ抗 ヒ 卜 I g (3 1 , 抗 ヒ 卜 I g G 2 , 抗 ヒ 卜 I g G 3及び抗 ヒ 卜 I g (3 4を用 い て 才 ク タ 一 口 — ニ ー 法 に よ り サブ ク ラ ス を見た 結果 、 3つ の モ ノ ク ロ ー ナル抗体す べ て が抗 I g G 1 抗体 と の み沈降線を生 じ た 。 さ ら に アル カ リ ♦ フ ォ ス フ ァ タ ーゼ ー ャ ギ抗 ー ヒ 卜 K鎖 ， あ る い は抗 ヒ 卜 入鎮を用 い た E L I S Aに よ り 、 D 34は K鎮 ， H 2 と H 3 は入鎖を も っ て い る こ と が判 明 し た 。
(3) 酵素抗体法 （ E L I S A ) に よ り 、 D 34， H 2 と H 3 の ヘルぺ ス属ウ ィ ルス に対す る反応性を検討 し た 。 第 2表-に示 し た如 く 、 D 34, H 2 , H 3 いず れも試験 し た H S V 1 型お よ び 2型ウ ィ ルスの す べて に 反応 し 、 非感 染宿主 H E L ( human enbryon i c lung) 細胞 に は反応 し な か っ た 。 ま た他の ヘルぺ ス属 ウ ィ ルス ， V Z V , C M Vや ， E pstein— B arr ウ ィ ルス （ E B V ) に も反応 し な か っ た 。 従 っ て 、 こ れ ら 3 つ の モ ノ ク ロ ー ナル抗体 は H S V 1 型 と 2型に対 し て.特異的 に 反応す る こ と がゎ ガ つ た 。
第 2 表
Figure imgf000019_0001
(4) 抗 H S Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の免疫沈降分析
ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体が反応す る ウ ィ ル ス粒子の構 成成分が 、 何で ある か決める た め に 、 免疫沈降分析を行 な っ た 。 V ero 細胞 に H S V 1 型 （ F ukuda 株 ） ま た は 2型 （ U W 268株 ） を感染させ H — グル コ サ ミ ン又 は S — メ チ 才 ニ ンで ア イ ソ ト ー プ標識を行な っ た 。 標識 し た細胞を 、 0.01 M T r i s * H Ci - 0.15 M N a Ci — 1 % デ 才 キシ コ ー ル酸ナ ト リ ウ ム — 1 % T r o n x 100- 0.1% ドデシル硫酸ナ ト リ ウ ム （ S D S 〉 一 1 m M フ エ 二ルメ チルスル フ ォ ニル フ ル才 ラ イ ド （ P H 7.4) ( 溶解液 〉 に よ っ て 溶解 し た 。 こ れ に モ ノ ク ロ ー ナル抗 体を加 え て 、 抗原 ♦ 抗体複合物 を形成さ せ て お き 、 さ ら に プ ロ テ イ ン A — セ フ ァ ロ ー ス 4 B に よ っ て複合体を吸 着精製 し た 。 こ れを 、 0.125M T ris H - % S D S — 3 % 2 — メ ル カ プ ト エ タ ノ ール 一 15 % グ リ セ リ ン ( H 8.2) で 3 分間 100て 処理 し 、 そ の 上清を S D S — ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 に かけ た 。 泳動後ゲ ルを乾燥 さ せ 、 X線 フ イ ルム に 一 70°Cで さ ら し た 。 結果 は第 1 図 と 第 3表 に 示す通 り で あ り 、 八 イ ブ リ ド ー マ D 34と 5 — 11の産生す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体は 、 X線 フ ィ ルム のバ ン ド の重な り 具合か ら 、 いず れも H S V 1 型又 は 2型の糖蛋 白 B に対す る抗体で あ る こ と が わ か っ た 。 周様な実験か ら 7 — 4 , H — 2 , H — 3 も糖蛋 白 B に対 す る抗体で あ る こ と がわ か っ た 。 第 3 表
X線フイルム ウィルス ラ ペ ル モノクローナル抗体
A1 HSV1型 ヒ卜モノクローナル抗体 D34
A2 HSV2型
A3 な し 〃
A4 HSV1型 3 H—グルコサミン ヒ卜モノクローナル抗体 5— 11
A5 HSV1型 マウス抗ー糖蛋白 B抗体
A6 HSV1型 マウス抗—糖蛋白 C抗体
' A 7 HSV1型 マウス抗一糖蛋白 D抗体
B1 HSV1型 ヒトモノクローナル抗体 D34
B2 HSV2型 /,
B3 な し 3SS—メチ才ニン //
B4 HSV1型 マウス抗ー糖蛋白 B抗体
B5 HSV1型 マウス抗一糖蛋白 C抗体
B6 HSV1型 マウス抗ー糖蛋白 D抗体 実施例 3
抗 H S V モ ノ ク ロ ー ナル抗体の ウ ィ ルス 中和活性 モ ノ ク ロ ー ナル抗体の ウ ィ ルス 中和活性 （ 力 価 〉 は以 下の よ う に し て 求め た 。 ウ ィ ルス 液 25 ^ JI ( 培養液
J1 中 に 150P F U を含む ） と 段階希釈 し た モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体液 25, ϋ , 及び補体 と し て 斩鲜モル モ ッ 卜 血清 ( 7.5 % / w ) 25 1 を 、 96穴マ イ ク ロ プ レ ー 卜 中 で 混合 し た 。 37 で 60分間反応さ せ た 後 、 96穴マ ク ロ プ レ 一 卜 中 の V ero 細胞単雇培養へ移 し感染さ せ た 。 37°C の 炭酸ガス培養器で 2 日 間培養後 、 10 %ホルマ リ ンで細胞 を固定 し .0.15 % ク リ ス タ ルバ ィ 才 レ ツ 卜 で染色 し 、 各穴のプラ ー ク を観察 し た 。 ウ イ ルス 中和力 価 は 、 ブラ 二 ク 数 を 80%滅少 させ る モ ノ ク ロ ー ナル抗体溶液 （ 1 mgr / mil ) の最高希駅倍数をあ つ て 表示 し た 。 第 4 表 に 示す よ う に モ ノ ク ロ ー ナル抗体 D 34は H S V に 結合 は す る が 、 H S V 1 型 . 及び 2 型の いず れをち 中和 し な い 。
他の 2 つ の モ ノ ク ロ ー ナル抗体 H 2 と H 3 は 、 補体非 存在下 に お い て も 1 型及び 2 型の両方を 中和 し た 。 第 5 表 は モ ノ ク ロ ー ナル抗体 H 2 の 中和 スぺ ク 卜 ラ ム （ 薪囲 ） を示 し て い る 。 H 2 は H S V 1 型 と 2 型の用 い た 株の全 て に 対 し て 高い 中和力 価を保有 し て い た 。 第 4 表
ェェ
> > モノクローナル抗体の中和力価
M HSV-1 (KOS) HSV-2 (YS-4) +Cネ 一 Cネ +C -C
D34 <2 <2 く 2 <2
H2 256 256 192 192
H3 192 128 192 128
H lg G+ 7.7 5.1 3.8 3.8
* ：中和力価はモルモッ卜補体存在下（ + C)または非存在下
(― C)で測定した （最終港度； 2,5%血清 v/v ) +：健常ヒ卜プール Ig G
第 5 表 モノクローナル抗体 H 2の中和スペクトラム（篛囲）
ウ ィ ル ス 株 中和力価
KOS 256
Miyama 512
Hayashida5G 1024
Fujinaga 4G 128
UW 268 128
YS-4 (TK_ ) 128
YS-4 (TK+ ) 4G 256
8204TN 4G 256 実施例 4
H S V感染 に対す る各種モ ノ ク ロ ー ナル抗体の 防 御効果
段階希訳 し た抗体溶液 を H 2 ， H 3 及び H I 3 G に 関 し て は 5 匹 . D 34に 関 し て は 10匹の B A L B/c マ ウ ス を Ί 群 と し て 腹腔内 へ投与 し た 。 30分後 に Η S V 1 型 （ M iyama G C + 株 ） ， 2,5x 105 P F U を腹 腔内 へ投与 し 、 感後 15曰 目 で生存率を判定 し た 。 結果 は 第 2 図 に 示 し た 。 マ ウ ス の感染死を 50%防御 す る の に 必 要な抗体量 は 、 各々 H 2 が 0.20 mgr / kgr , Η 3 が
0.35 mgr / kgr D 34及び H I g G は各々 40, 380mg r / kgr 以上で あ っ た 。 そ れ故 、 H 2 は H I g G の 1900 倍の 防御効果に 相 当 す る 能力 が あ る こ と に な る 。 実施例 5
V Z V に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を産生 す るハ ィ プ リ ド ー マ
(1) V Z V抗原の作製
ヒ 卜 胎児肺細胞 （ H e L ) の培養液中 に V Z V ( K a- waguchi 株 ） を接種 し 、 細胞変性が現れ て き た 時点で細 胞を ラバ ー ポ リ スマ ンで取 り 出 し た 。 細胞を 1 分閩超音 波処理 し て破壊 し た の ち 、 3000 rpm で 10分間遠心 し た 。 そ の上清を セ シ ウ ム · ク ロ ラ イ ド の扈 に 乗せ て 、 23000 rpm で 3 時間遠心 し た 。 密度 1.4と 1.2の 間 に V S V は 集 ま っ た 。 こ の ウ ィ ルス分画を さ ら に 25000rpm, 1 時間 半の遠心で 沈殿さ せ 、 沈殿を リ ン酸緩衝生理食塩水 に 分 散さ せ て 、 5秒間 3 回超音波処理を行な っ た 。 か く し て 得 ら れ た ウ ィ ル ス標品 を紫外線照射 に よ っ て 不活化 し た の ち 、 以下の実験 に 用 い た 。
(2) V Z V に よ る リ ンパ球の感作 と ハ イ ブ リ ド ー マ の 作製 。
ヒ 卜 扁桃 リ ンパ球を培養液 A に 2.6X 10s 個 / に 浮 遊さ せ た 。 こ れ に 上記（1)で得 ら れた V Z V ( 最終 濃度 17 ngプ ロ テ イ ンノ と P W M ( 20^ g / ^ ) を加 え て 、 3 , 5 , ま た は 7 日 間培養 し た 。 こ う し て 感作 し た リ ン パ球を実施例 Ί — (3)と 同様 に し て細胞融合 し た 。 こ う し て 形成さ れ て き た ハ イ プ リ ド ー マ の培養上清 に つ い て 、 I g Mあ る い は I g G抗 V Z Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体を酵 素抗体法 に よ っ て 測定 し た 。 そ の結果を第 6表 に 示 し た 第 6表 よ り 、 V Z V に対す る I g G型の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を産生 す るハ イ プ リ ド ー マ が得 ら れて い る こ と が わ かる 。
第 6 表
Figure imgf000026_0001
* 感作リンパ球と P3U Iとを、 PEG溶液を入れないで混合したもの である。 すなわち、 ハイプリドーマを形成しない感作リンパ球では Ig G抗 VZVが陽性にならないことを確認するための、 コン卜ロー ルである。 実施例 6
自 己免疫性血小板減少症の 患者 よ り 手術 に よ っ て 取 り 出 さ れた脾臓 よ り 、 リ ンパ球を フ イ コ ー ル · パ ッ ク 法 に よ っ て分離 し た 。 こ の リ ンパ球を実施例 5 の（23と同様 に V Z V ( 17ng/ ) と P W M ( 2 u ^ / ) を加 え て 、 6 日 間感作 し た 。 こ う し て感作 し た リ ンパ球を実施例 1 の（3)と 周様 に し て 細胞融合 し た 。 こ う し て 形成さ れて き た ハ イ プ リ ド ー マ の培養上清 につ い て 、 全体の ヒ ト I g Gお よ び 〖 g M , V Z V感染 H el細胞 に 反応 す る I g G 及び I g M、 さ ら に 非感染 H el細胞 に 反応す る I g G及 び I g Mを酵素抗体法 に よ っ て 測定 し た 。 そ の結果を 、
96穴のプ レ ー 卜 中 の該当穴数 と し て 第 7表 に 示 し た 。
第 7 表 よ り 、 V Z V に 選択的な 1 9 G型モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の産生 が起 っ て い る こ と が わ かる 。 さ ら に 、 そ の よ う な V Z V選択的モ ノ ク ロ ー ナル抗体を 産生 す るハ イ プ リ ド ーマ は V Z V + P W Mの感作で著 し く 増加 し て い る こ と がわ かる 。 P W Mの みで も そ の よ う なハ イ プ リ ド 一 マ は 出現す る が （ 6ノ 55) 、 V Z Vの みの感作 に 較べ て （ 9ノ 27) 、 非選択的なハ イ プ リ ド ー マが増加 し て い る点で欠点が あ る 。 第 7 表
刺 激 全ハイプリドーマ 抗体産生ハイプリドーマ 抗- VZV' > Hel細胞 抗— He I細胞
19 G 10 M 1 y La l y ivi 19 G I(J 無添加 78/96 14 14 0 0 0 0
VZV 84/96 27 17 9 0 0 0
PWM 96/96 55 42 6 1 0 1
VZV+PWM 96/96 69 34 31 1 0 1
実施例 7
抗 V Z V抗体産生ハ イ プ リ ド ーマ の ク ロ ー ニ ング及 び抗 V Z Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の特異性
(1) ク ロ ー ニグ
抗 V Z V活性陽性の穴 よ り 細胞を取 り 出 し 、 細胞数を 計測 し 、 1 細胞 /穴あ る い は 10細胞 /穴だけ 96穴培養ァ レ ー 卜 に 細胞を 蒔い た 。 3な い し 4週間後 に細胞 は十分 増殖 し た ので 、 こ の培養上清中 に 、 抗 V Z V抗体活性が あ る か否かス ク リ 一 二 ン グ し た 。 こ う し て 出来る だけ Ί 細胞 /穴で蒔い た 方か ら 、 由 来す る細胞を選別 し た 。 こ の操作を 2な い し 4回繰返 し 、 す べ て の ク ロ一ン が抗 V Z V抗体活性を保有す る よ う に し た 。
マ ウ ス X ヒ 卜 細胞融合 よ り 3つ のハ イ ブ リ ド ーマ が樹 立さ れた 。 そ れ ら ハ イ プ リ ド ー マ は 6な い し 25 ζ 3 / 日 ♦ 10s 細胞の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を 産生 し て い た 。 こ れ ら を V 1 , V 2 , V 6 と 命名 し た 。
(2) モ ノ ク ロ ー ナル抗体の特異性
V , V 2及び V 6のサブ ク ラ ス と L鎖 タ イ ブを 決定 し た 。 ヒ ッ ジ抗 ヒ 卜 I g G , 抗 ヒ 卜 I g G 2 , 抗 ヒ 卜 I g G 3及び抗 ヒ 卜 I g (3 4 を用 い て 才 ク タ 一 口 一 二法 に よ り サブ ク ラ ス を 決定 し た 。 そ の結果、 V 1 , V 2 , V 6 と も抗 ヒ 卜 I g G 1 抗体 と の み反応 し た 。 さ ら に ァ ル カ リ ホ ス フ ァ タ ーゼ ー ャ ギ I g G抗 ヒ 卜 K鎖 ま た は抗 入鎖を用 い た E L I S Aの結果 、 3つ の モ ノ ク ロ ー ナル odfIdi/g/ es卜
CM
麵 >
ω
^ Λ Z ¾ ,
Figure imgf000030_0001
to
第 8 表 ヒ卜♦モノクロ一ナル抗体 ウイルス 株 V1 V2 V6
HS V 1型 K >OS 0.15 0.01 0.00
FUJ INAGA 0.16 0.05 0.04 寸
HSVZ型 UW 268 O.OD 0.00 0.00
0.09 0.00 0.00
vzv CAQU 0.42 0.90 0.41
BATSON 0.39 0.33 0,35
KAWAGUCH I 1.01 u.oo
OKA 1.08 1.12 1.11
KOBAYASH I 0.63 0.32 0.69
YUBO 0.50 O. 2
CMV AD169 U.U U.U4 U.Ui
H I DAKA 0.04 0.00 0.00
EBV B95-8 0.01 0.00 0.02
宿主細胞 HEL 0.01 0.01 0.02
数値は E L I S A法で得られた吸光度 (405nm )である c 実施例 8
抗 V Z Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の認識抗原分子の 決定 抗原分子 は免疫沈降法 と ドデ シル硫酸ナ 卜 リ ゥ ム ー ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 法 （ S D S — P A G E ) に よ っ て 決定 し た 。
培養 2 日 目 の ヒ 卜 胎児肺細胞 （ H E L ) 単層培養 （ 64 ci ) に 、 卜 リ ブ シ ンで浮遊さ せ た 1 5量の V Z V感染 細胞を接種 し た 。 48時間後 に 80%以上の細胞変性 （ C P E ) が 出現 し た 時点で 、 培地を 、 4 ^の 100^ ci 卜 リ チ ゥ ムグル コ サ ミ ン塩酸塩 （ [ 1.6— 3H ( N ) ] g iucos ami ne ； 20ci/ mmol ； N E N R esearch P roducts B oston , M A ) を含む 1 Z 10グルコ ー ス M E M — 2 % F C S ま た は 5 δώの 50 ci [ 3SS ] — メ チ 才 ニ ン （ 400 ci/ mmoi ； N E N R esearch P roducts ) を含む 1 10メ チ才 ニ ン M E M — 2 % F C S に お き かえ た 。 さ ら に 37 で 18時間培養 し 、 そ の 間 に C P E が単層細胞全体 に 及ん だ時点で細胞を集 め た 。 集め た細胞を 洗浄 し 、 10 mM T ri s H Ci ( pH 7.4) , 0.15 M N a Ci , m M フ エ 二ルメ チルスルホ ニル フ ル 才 ラ イ ド （ S igma C hemical s C o. , S t. L oues, o. ) ， mM ェ チ レ ン ジ ア ミ ン テ 卜 ラ 酢酸 ， 1 % T ri ton X — 100, 0.1 % ソ ジ ゥ ム ドデ シルサル フ エ 一 卜 ， 1 %ソ ジ ゥ ムデ 才 キ シ コ リ ン酸 （ R I P A緩衝液 ） 中で超音波処理 に よ っ て 分散 ， 可溶化 し た 。 こ れを 60%シ ョ 糖溶液に 重雇 し 、 100,0003 , 1 時閻 の超遠心 に よ っ て 不溶物 を取 り 除き 上清を抗原 と し て — 70で に凍結保存 し た 。
[ 3 H ] — グル コ サ ミ ン標識抗原分画 （ 200 ^ , 400, OOOcpm) ま た は [ 3SS ] メ チ ォ ニ ン標識抗原分画 ( 200^ 1 ,200, OOOcpm) とハ イ ブ リ ド ー マ 上清 150 J を混合 し 、 室温で 30分閭 ， さ ら に 4 °Cで Ί 晚反応さ せ た 。 翌朝 、 前も っ て 膨潤 さ せ て お い た プ ロ テ イ ン A — セ フ ァ ロ ー ス C L 4 B ビ ー ズ （ 100 JI の 懸濁 液中 に 3 mgr を含む ： P harmacia F i ne C hemical s, I nc. , T okyo) を加 え 、 4 °Cで 3 時間反応 さ せ た 。 免疫複合体 を 含む ビ ー ズ は遠心 ペ レ ツ 卜 に し 、 2 の R I P A緩衝 液で 5 回 、 さ ら に 2 の 10 mM T s H Ci ( pH 6.8) で 2 回 洗浄 し た 。 洗浄 の 済ん だ免疫複合体 は 、 110 ϋ の S D S — サ ンプル緩衝液を加 え 、 1001； で溶出 させ た 。
S D S — P A G E 可溶化試料の電気泳動 は室温で
T r i s H Ci — グ リ シ ン 一 S D S 緩衝液系 （ p H 8.3 ) の 標準的な方法 に 従 っ て 行な っ た 。 ス ラブゲル は 1 Mサル チル酸ナ 卜 リ ウ 厶水溶液に 浸瀆 し た 後 、 口紙上で乾燥 さ せ た 。 乾燥 さ せ たゲル は — 70で で 7 曰 か ら 21日 間 ， K 0 D A K X — 〇 M A T S フ ィ ルム に 感光さ せ た 。
結果 は第 3 図 に 示 し た 。 モ ノ ク ロ ー ナル'抗体 V 1 は分 子量 108K , 105K及び 62K の糖蛋 白 を認識 し 、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体 V 2 は分子量 90 K と 55 K の異な る糖蛋 白 を 認識 し て い る と 認め ら れた 。 な お 、 第 3 図 に お い て 、 V 1 ( A列 ） と V 2 ( B列 ） は [ 3SS ] — メ チ才ニ ン標識 ウ ィ ルス抗原で沈降さ せた 。 V 1 ( C列 ） と V 2 ( D列 ） は [ 3 H ] — グル コ サ ミ ン 標識抗原で沈降さ せ た 。 右の矢印 は標準 タ ンパ ク 質の移 動度を示 し て い る 。 ま た 、 K は キ ロ ダル 卜 ン を意味 す る 。
ま た V 6 は V 1 と 全 く 周 じ電気泳動パ タ ー ン を示 し た 。 実施例 9
抗 V Z Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体の ウ ィ ルス 中和活性 抗 V Z Vモ ノ ク ロ ー ナル抗体産生細胞の培養上清を集 め て 、 50%飽和硫安に よ っ て モ ノ ク ロ ー ナル抗体を沈殿 さ せ 、 リ ン酸緩衝生理食塩水 に 対 し て透析 し た 。 こ れ を モ ノ ク ロ ー ナル抗体標品 と し て 以下の実験 に 供 し た 。 そ れ ら 標品 に 含 ま れる モ ノ ク ロ ー ナル抗体の量 は 、 抗 ヒ 卜 I g G抗体を用 い た免疫一次元拡散法 に よ っ て 決定 し た 。 モ ノ ク ロ ー ナル抗体標品 を 5 % F C S — M E Mで 3 倍段 階希釈 し 、 そ の 溶液 （ 200 と V Z V ( 川 口 株 ， 4000 P.F U , 100 ） と 、 モル モ ッ ト補 （ 5 倍希釈 液 ， 100 i ) あ る い は 5 % F C S — Μ Ε Μ ( 100χζ i ) と を混合 し 、 37°Cで 1 時間培養 し た 。 こ の ウ ィ ル ス 混合 液を 、 前も っ て培養 し て あ る H E L細胞の単雇培養上 に 加 えて 、 37で で 1 時間 ウ ィ ルス を吸着させた 。 そ の 後 、 2.5%メ チルセル ロ ー ス を含む 5 % F C S — M E Mを重 層 し 、 5 な い し 7 日 間 C〇 2 培養器中で培養 し た 。 そ の 後 、 感染 H E L 細胞を 10% ホルマ リ ン で 固定 し 、 さ ら に
0.15 % ク リ ス タ ルパ イ 才 レ ツ 卜 で染色 し 、 プラ ー ク 数 を計数 し た 。 そ の結果、 モ ノ ク ロ ー ナル抗体 ， V 1 , V 2 と V 6 に つ い て の ウ ィ ルス 活性は 、 第 9 表の如 く で あ っ た 。
V 1 と V 2 は補体存在下で 、 ウ ィ ルス を 50%不活化す る の に 必要な モ ノ ク ロ ー ナル抗体の量が 1 以下 の 、 す ぐれた 中和活性を もつ こ と が わ かる 。
第 9 表 プラークを 50%減少させるに必要なモノクローナル抗体 ( g sd) モノクローナル抗体 補 体 無 し 補 体 加
V1 4.0 0.84
V2 50 0.13
V6 20 6.6
実施例 10
C M V抗原 に よ る イ ン ビ 卜 ロ 感作 と細胞融合
(1) 感作 C M V抗原
H E L細胞 に C M V ( A D 169株 ） を 0, 1moi で感染 さ せて 、 7 日 間 C 〇 2 培養器中で 培養 し た 。 細胞変性 は 100%現わ れて い た 。 こ の C M V — 感染細胞の培養上清 は 、 105 の C M V を含有 し て い た 。 約 250 の培養上清を 、 800 X で 10分間 とそ れ に 引 き続 く
10·, 000 X ？ で 30分間 の遠心分離 を行な い 、 得 ら れ た 上清 を さ ら に 100, 000 X ？ で 1 時間超遠心 に かけ た 。 そ の沈 殿物 を 、 2 の Ί mM E D T A を含む リ ン酸緩衝生 理 食塩水 （ PH 7.4) に 再懸濁 し 、 紫外'線照射 に よ り ウ イ ル ス を不活化 し た 。 こ の標品 を感作抗原 と し て 用 い た 。
(2) イ ン ビ 卜 ロ 感作
特発生血小板減少症の 患者 よ り 摘脾術 に よ っ て 得 ら れた 脾臓の リ ンパ球 1.5x 10s 個 と 、 C M V抗原約 10ng蛋 白 ， ポ ー ク ウ ィ ー ドマイ 卜 ゲ ン （ P W M ) 20 を の培 養液 A の 中で混合 し 、 C 0 2 培養器中で 6 日 間培養 し た 。
(3) 細胞融合
H S V , V Z V の場合 と周様 に 、 上記 リ ンパ 球分散液 か ら 得 ら れる感作 リ ン パ 球 と 、 5 x 10s の マ ウ ス ♦ ミ エ ロ ー マ細胞 （ P 3 U 1 株 ） と を混合 し 、 ポ リ エ チ レ ング リ コ ー ル に よ り 融合 し 、 H A T培地上で 培養 し た 。 そ の結果 、 C M V抗原で刺 激せず に細胞融合 し た と き に は 、 抗 C M V モ ノ ク ロ ー ナル抗体産生ハ イ プ リ ド ー マ が 全 く 生成 し な か っ た が 、 抗原感作 リ ンパ球か ら は多 く の 抗 C M V モ ノ ク ロ ー ナル抗体産生 ク ロ ー ンが生成 し た 。 そ れ ら の ク ロ ー ン を 限界希釈法 に よ り ク ロ ー ニ ン グ し 、 7 種類のハ イ ブ リ ド ーマ C 2 , C 3 , C 4.23 , C 5.3, C 6.11 C 7.23 を得 た 。 こ れ ら の免疫学的特 異性 は 、 第 10表の如 く で あ っ た 。
第 10 表 モ ノ ク □ 一 ナ ル iR 体
ウィルス 株 C 1 C2 C3 C 4.23 し 0.0 G 0.11 し ί.
US V 1型 K0S 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
FUJ INAGA 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
HSV2型 UW 268 0.0 0.0 0.0 ϋ.Ο
YSA 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
V7V CAQU 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 o.u 0.0
OKA 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
CMV AD 169 > .O し 1 ι， 1 i. Qy 1し o ft > υ
ΗΙΠΛΚΑ 1.6 0J 1.0 1.1 1.1 1.0 1.1
EBV 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 非感染 HE L細胞 0.1 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 対 照 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 上記値は 405nmでの吸光度である £
産業上の利用可能性
本発明 のハ イ ブ リ ド ーマ を 、 適当 な方法で大量に培養 す る と 、 培養上清か ら 抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を得る こ と ができる 。 ま た 、 こ のハ イ プ リ ド ー マ を動物 に 移植 し て 腫瘍化 し 、 そ の腹水や 血清か ら 抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を 得る こ と もで き る 。 か く し て 得 ら れる抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体 は モ ノ ク ロ ー ナルな抗体で あ り 、 各種ウ ィ ルス感染 症の診断及び治療等の 目 的の た め に 使用 す る こ と がで き る 。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヒ 卜 の抗体産生細胞 と マ ウ ス の ミ エ ロ ー マ細胞 と を融合させ て得 ら れた 、 抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体を産生 す
- るマ ウ ス 一 ヒ 卜 ハ イ ブ リ ド ー マ及びそ れに 由 来す る細胞 株
2. 抗ウ ィ ルス * ヒ 卜 抗体が 、 単純ヘルぺ ス ウ ィ ルス ( H S V ) 又 は水痘帯状包疹 ウ ィ ルス ( V Z V ) 又 はサ ィ 卜 メ ガ ロ ウ ィ ルス （ C M V ) に対す る 体で あ る 、 ¾ 求の範囲第 1 項記載のマ ウ ス 一 ヒ 卜 ハ ィ プ リ ド ー マ及び そ れ に 由 来す る細胞株 。
3. 抗 ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体が I g G抗体で あ る 、 請求 の範囲窠 1 項記載のマ ウ ス ー ヒ 卜 ハ イ ·ブ リ ド ー マ及びそ れ に 由 来す る細胞株 。
4. ヒ 卜 の抗体産生細胞が脾臓又 は扁桃又 は ア デ ノ ィ ド か ら 採取さ れた細胞であ る 、 請求の篛囲第 1 項記載の マ ウ ス — ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ー マ及びそ れ に 由 来する細胞株
5. 抗単純へルぺ ス ウ ィ ル ス （ H S V ) * ヒ 卜 抗体を 産生 する 、 請求の範囲第 1 項記載のマ ウ ス ♦ ヒ 卜 ハ イ ブ リ ド ーマ D 34, H 2又 は H 3 。
6. 抗水痘帯状包疹 ウ ィ ルス （ V Z V ) ♦ ヒ 卜 抗体を 産生 す る 、 請求の範囲第 Ί 項記載の マ ウ ス * ヒ 卜 ノヽ ィ プ リ ド ー マ V 1 , V 2又 は V 6 。
7. 抗サ イ 卜 ロ ガ ロ ウ ィ ルス （ C M V ) ♦ ヒ 卜 抗体を 39
産生 する請求の範囲第 1 項記載のマ ウ ス · ヒ 卜 ゾヽ イ ブ リ ド ー マ 〇 1 , C 2 ， C 3 , C 4.23 , C 5.3, C 8.11 又 は C 7.23 ， 。
8. i n V roでマ イ 卜 — ジ ェ ン の存在下 に ウ ィ ルス又 は ウ ィ ルス 由 来の蛋 白 若 し く は糖蛋 白 で感作 し た ヒ 卜 の 抗体産生細胞 と 、 マ ウ ス の ミ エ ロ ーマ細胞 と を融合 さ せ る こ と を特徴 と す る 、 抗ウ ィ ルス ♦ ヒ 卜 抗体 を産生 す る マ ウ ス — ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ーマ の製造法
9. マ イ 卜 一ジ ェ ン が ポ ー ク ウ イ ドマ イ 卜 一ジ ェ ン ( P W M ) で あ る 、 請求の範囲第 8 項記載のマ ウ ス一 ヒ 卜 ハ イ ブ リ ド ー マ の製造法 。
10. 感作を胎児牛血清を 含む培養液中で行 .な う 、 請求 の範囲第 8 項記載のマ ウ ス ー ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ー マ の 製造 感作 に 用 い る ウ ィ ルス が 単純 へ ル ぺス ウ ィ ルス
( H S V ) 又 は水痘帯状疱疹 ウ ィ ル ス ( V Z V ) 又 は サ ィ 卜 メ ガ ロ ウ ィ ル ス （ C M V ) で あ る 、 請求の範囲第 8 項記載の マ ウ ス ー ヒ 卜 ハ イ プ リ ド ーマの製造法 。
12. 単純へルぺ ス ウ ィ ルス （ H S V ) 1 型又 は 2 型感 染細胞の細胞膜及び細胞質 と 反応 し 、 非感染細胞 と は ほ と ん ど反応 し な い と い う 性質を有 す る分子量が約 16万で
I g G型の 、 単純へルぺ ス ウ ィ ルス に 対す る ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 。
13. 単純へ ルぺ ス ウ ィ ルス （ H S V ) Ί 型又 は 2 型の 糖蛋 白 B に 反応す る 、 請求の範囲第 12項記載の ヒ 卜 モ ノ ク ロ ー ナル抗体 。
14. 水痘帯状疱疹ウ ィ ルス （ V Z V ) に特異的 に 反応 す る ヒ 卜 型モ ノ ク ロ ー ナル抗体 。
15. 分子量 108K , 105K 及び 62 K の糖蛋 白 抗原を認 識す る請求の範囲第 14項記載の ヒ 卜 型モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 V 1 。
16. 分子量 90 K と 55K の糖蛋 白抗原を認識す る 請求の 範囲第 14項記載の ヒ 卜 型モ ノ ク ロ ー ナル抗体 V 2 。
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