WO1986000924A1 - Process for preparing human proline hydroxylase - Google Patents

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WO1986000924A1
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Yoshiki Nagai
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Yoshiki Nagai
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C12Y114/11002—Procollagen-proline dioxygenase (1.14.11.2), i.e. proline-hydroxylase
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
    • F16F—SPRINGS; SHOCK-ABSORBERS; MEANS FOR DAMPING VIBRATION
    • F16F2224/00—Materials; Material properties

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing human proprolin hydroxylase [EC1, 14, 11, 2], which plays an important role in collagen biosynthesis.
  • Proline hydroxylase is an enzyme that exists in the cells of living organisms and plays a major role in the biosynthesis of collagen [Cardinale, G et al. (1974) Adv Enzymol 41: 245-
  • proline hydrolase activity was measured using the method of Hut ton CHutton.JJ (1966) Anal Bio 16: 384-394]. J9 is unsuitable for multi-sample treatment, and some researchers cannot measure serum proline hydroxylase activity due to the presence of inhibitors in serum.
  • the present inventors have established a method for isolating proline hydroxylase using a human placenta, which is easily available in large quantities, as a raw material in place of human fetus D, which is difficult to obtain.
  • Establishing the radioimmunoassay method using enzymes and specific antibodies against them, and measuring the concentration of proline hydroxylase in human serum, is a useful tool for diagnosing acute hepatitis and embolizing therapies for primary liver cancer. & ter arte-
  • Purification of proline hydroxylase using the raw material of human placenta can be performed by electrophoresis [Davis, JD (1964) Ann NY] in addition to the above-mentioned method using human fetus of Kuutti et al. Acad Sci 121: 404-427], fluorescent staining method with aniline nonaphthalene selenonate [Ha ⁇ tman, BK et al. (1969) Anal Biochem 30: 391-394] and electric extraction method Hashizume, S et al. (1984) Electrophoresis 5: 30-34] (1) It can be carried out by a method applied sequentially.
  • Dav includes, further follow the method of Dav is, e.
  • Perform electrophoresis on a reacting gel After completion of the electrophoresis, the proteins on the gel were stained with anilaninonaphthalenesulfonate according to the method of Hartman et al.], And illuminated with ultraviolet light to clarify the positions of the protein bands on the gel. Cut out the band that has proline hydroxylase activity from the gel. The target proline hydroxylase is extracted from the cut gel pieces by applying the electric extraction method of Hashizume et al., And the purification is completed. This purification method showed no significant difference in yield compared to the method of Kuutti et al., Which used human fetuses as a raw material.
  • a radioimmunoassay system was established using the isolated proline hydroxylase and a specific antiserum obtained by immunizing an animal (eg, a heron) with the proline hydroxylase. Measuring the concentration of hydroxylase can be used to diagnose acute hepatitis and to determine primary liver cancer.
  • FIG. 1A shows a polyataryladogel electrophoresis image of proline hydroxylase D purified from human placenta only by the method of Kuutti et al. There is a secondary band below the primary band.
  • Figure 1B shows the electrophoresis method and the method by Kuutti et al.
  • FIG. 1 shows a polyacryl gel gel electrophoresis image of proline hydroxylase purified by the subsequent electroextraction method. Both A and B stained with Coomassie and Brilliant Blue.
  • No. 2 The figure is a diagram of the immunospread method showing the specific antigen-antibody reaction between proline hydroxylase and Egret antiserum. a) Crude enzyme in the purification stage of ammonium sulfate fraction. b) Purified proline hydroxylase. c) Egret antiserum against purified proline hydroxylase.
  • Fig. 3 shows serum proline hydroxylase levels in normal and various sick people.
  • Fig. 4 shows serum proline hydroxylase levels before and after embolization therapy for primary liver cancer. 3 shows changes in serum proline hydroxylase levels in patients with primary liver cancer who underwent embolization therapy.
  • the protein precipitated in a 20-70% saturated fraction was collected by centrifugation, and 1.7 ⁇ of 0.1 M sodium chloride, 0.1 M glycine, and 10 M were added to the precipitate.
  • An aqueous solution containing dithylitol and 10 mM tris-hydrochloride ⁇ 7.8 was added to suspend the precipitate, and the mixture was dialyzed twice for 12 hours against 20 volumes of a buffer of the same composition.
  • the eluted fractions having proline hydroxylase activity were collected, concentrated to 25.5 m using an oral membrane with an ultra-molecular weight of 30,000, and then centrifuged at 20,000 xg for 10 minutes to remove insoluble substances. Removed. Subsequently, the supernatant was transferred to a Bio el A-1.5 m column (4.4 X
  • the gel was passed through the IOICT and the effluent was collected on a fraction collector.
  • the proline hydroxylase activity of each fraction and the absorbance at 23 Onm were measured, and the fractions with high proline hydroxylase activity corresponding to the absorbance were collected.
  • the collected fraction was concentrated again to 9.8 m ⁇ using the above-mentioned ultra-perforated membrane. A portion of this solution is prepared according to Davis
  • Fig. 1A After electrophoresis on a 7% polyacrylamide gel, staining with Coomassie brilliant tongue was performed. As shown in Fig. 1A, two bands, a main band and a subband, were observed. Most of the proline hydroxylase activity was in the main band. Slight enzymatic activity was also observed in the secondary band, but the specific activity was lower than that of the primary band, and although the details were unknown, it was considered to be a substance different from the primary band. Therefore, the above concentrate was dialyzed against Davis electrophoresis buffer according to the method of Davis. The solution after dialysis was electrophoresed on a 7 ° h polyacrylamide gel, and the method of Hartman et al. Was used!
  • the gel is immersed in a solution of arylonaphthalenesolefonate to stain the protein band, and the band corresponding to the main band in Fig. 1A on the stained gel is exposed to the fluorescence emitted under ultraviolet irradiation. I checked the position and cut the whole gel. Proline hydroxylase contained in the cut gel pieces was extracted from the gel pieces using an electric extraction device by Hashizume et al. Thus, the purification was completed. The purified human placental pro-purified lin hydroxylase preparation was re-purified as described above. When confirmed, the electrophoresis pattern showed a single band (Fig. 1B).
  • Fig. 2 is a diagram of the Ouih- ter- lony immunodiffusion method, and a single line was observed between the antiserum and the crude enzyme, and between the antiserum and the purified enzyme. Has fused. This indicates that the enzyme used for immunization is pure and that the antiserum is a specific antiserum.
  • this specific antiserum j 1) Establish the radioimmunoassay method and trace-quantify proline hydroxylase, 2) Presence of proline hydroxylase in tissues by histochemical method could be identified. Replacement Next, Rajioi Munoa Ssi method to establish, proline is clinical medicine to measure the hydroxylase concentration human serum by using a pure prolyl hydroxylase which expired label in this specific antiserum 125 1 It shows that it is useful.
  • the present inventors have established a radioimmunoassay method based on the two-antibody method [Morgan, CR et al. (1963) Diabetes 12: 115-126], and have studied the serum hydroxylation of normal individuals and patients with various diseases.
  • the result of measuring the concentration of the enzyme is shown in Fig. 3.
  • the serum proline hydroxylase concentrations in the serum of three healthy individuals ranged from 155 to 400 ng m ⁇ , with an average of 253 ng Zm and a standard deviation of 59 n ⁇ m ⁇ .
  • the serum concentrations of seven patients with acute hepatitis were distributed in the range of 385-3,260 ng m ⁇ , with an average value of 982 ng / £ and a standard deviation of l, 020 n ⁇ n, which was significantly higher than that of normal subjects. (P ⁇ 0.001.) Patients with chronic hepatitis, liver cirrhosis, primary liver cancer, and gastric cancer could not be significantly different from normal subjects. High values in acute hepatitis indicate acute hepatitis. It is considered that the enzyme was released into the blood from hepatocytes that had died of death.
  • CYamada, R (1980) Osaka City Med J 26: 81-96] is widely practiced, but comparing the concentrations of proline hydroxylase in serum before and after that, as shown in Fig. 4, six times In all cases of embolization therapy, elevated proline hydroxylase levels have been observed after therapy. This is considered to be due to the necrosis of the tumor tissue caused by embolization therapy and the release of proline hydroxylase present in the tumor tissue into the blood.
  • Figure 5 shows the change in serum proline hydroxylase levels in patients with primary liver cancer who underwent two embolization treatments. The fact that embolization therapy caused tissue necrosis was described in detail. I'm wearing
  • 0MP1 It can be used for diagnosis of acute hepatitis and for embolization therapy for primary liver cancer.

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Description

明 細 書
ヒ トプロ リン水酸化酵素の製造方法
技術分野
本発明は， コラーゲンの生合成に重要な役割を果すところのヒ トプロリ ン水酸 化酵素 〔ECl, 14, 11 , 2〕の製造方法に関するものである。
背景技術
プロリン水酸化酵素は生物の細胞内に存在し， コラーゲンの生合成に主要な役 割を演ずる酵素である 〔Cardinale, Gら（1974) Adv Enzymol 41:245-
300〕 。 ヒ ト血清中のこの酸素の臨床的意義について初めて論じたのは， Stein ら 〔Stein, Dら（1970) Lancet I, 106-109〕 である。 彼らは主として，
Hut ton CHutton.JJ (1966) Anal B i och 16 :384- 394〕の方法 ¾用い て， ヒ ト血清中のプロリン水^化酵素の活性を測定したが， その方法は操作が煩 雑るために多検体処理には不適であ J9, また， 研究者の中には血清中の阻害物質 の存在るどのために血清中のプロリ ン水酸化酵素の活性の測定ができない， とす
G
る者もお （たと ぱ Takeuchi ら 〔Takeuchi , Tら（1966) astroenterol- ogy 56:744-750〕） ， 臨床応用のためには問題が多い方法と考えられる。 それに代つて多検体測定の目的に便利なラジオィムノア ッセィ法によ]?, 血清 中のプロリン水酸化酵素濃度を測定しようとする試みは Tudermanらによって開 発された 〔 Tuderman，： Lら（1975) Eur J B iochem 60 :399-405〕。 彼ら以 前に既に Kuutti らによ J ヒ ト胎児から同酵素を精製する方法が開発されて^;
l Rヒ Aひ、 〔Kimtti， E-Rら（1975) Eur J Biochem 57:181-188〕 ， Tuderman らはその方法によって精製された酵素とそれに対する特異抗体を用いてラジオイ ムノア ツセィ法を確立したのである。 し力 し， 入手困難なヒ ト胎児を酵素精製の 原料として用いることのために， 実際に該方法を実施することは容易でない。 ヒ ト血清中のプロリン水酸化酵素濃度を測定するためのラジオィ ムノアッセィ法を 開発するためには， ヒトの材料から精製したプロリン水酸化酵素を用いることが 必要であるが， ヒト胎児以外のヒ トの材料からプロリン水酸化酵素を精製する試 みはいまだなされていない。 またヒ ト血清中のプロリン水酸化酵素濃度を測定す ることの臨床的意義も， これまで本質的には不明であった。 そこで本発明者は， 入手困難なヒ ト胎児の代わ Dに， 容易にしかも大量に入手 可能るヒ ト胎盤を原料として用いて， プロリン水酸化酵素を単離する方法を確立 し， 得られた酵素とそれに対する特異抗体を用いて， ラジオィ ムノアツセィ法を 確立し， それによつてヒト血清中のプロリン水酸化酵素の濃度を測定することは， 急性肝炎の診断， 並びに原発性肝癌に対する塞栓療法（ Transcat &ter arte- 判
rial embol izat ion )の効果铺定に有用であることを証明した。
発明の開示
本発明であるヒト胎盤の原料に用いてのプロリン水酸化酵素の精製は， 上記， Kuutti らのヒト胎児を原料に用いて行った方法に加えて電気泳動法 〔Davis, JD (1964) Ann NY Acad Sci 121:404—427〕 ， ァニ リ ノナフタ レンスノレ ホネートによる螢光染色法 〔Ha^tman, BKら（1969) Anal Biochem 30: 391-394〕 及び電気抽出法 Hashizume, Sら（1984) Electrophoresis 5:30-34〕¾順次応用した方法によ 行うことが出来る。 すなわち， まず Kmitti らの方法に従い， ホモゲネ一シ ヨ ン， 硫酸ア ンモニゥムによる分画， ポリ一 L— プロ リ ンをリ ガンドとするァフ ィ ニティ 一クロマ トグラフ ィ一， 及び Bio Gel A-1.5mによるゲル口過を順次行う。 こうして得られた酵素溶液はなお不雑物を ひ
Λ^ & 0 ΡΙ 含んでいるため， さらに Dav i sの方法に従い，ホ。リアク リルア ドゲル上で電気 泳動を行う。 泳動終了後， Hartman らの方法に従いゲル上の蛋白質をァニリ ノ ナフタレンスルホネートによ]?螢光染色し， 紫外線を照射してゲル上の蛋白質バ ンドの位置を明らかにしながら， ゲル上の複数のバンドのうちプロリン水酸化酵 素の活性をもつバンドをゲルごと切 取る。 切 取ったゲル片から Hashizume らの電気抽出法を応用して目的とするプロリン水酸化酵素を抽出し， 精製を完了 する。 本精製法は， ヒ ト胎児を原料とする Kuut t i らの方法と比較しても収率に おいて大差がなかった。
この発明の効果を列挙すれば以下のとお]?である。
1) 従来の方法のみによってはヒト胎盤から純粋なプロリン水酸化酵素を精製す 方
ることができないため， 従来の旁法に電気泳動法及びそれに続く電気抽出法を加 えることによ 精製 ¾完成させたこと。
本
2) ヒ ト胎盤を原料とする旁法は， ヒ ト胎児を原料とする従来の方法に比べ収率 に大差がなく， 従つて原料をよ )容易に且つ大量に入手することが可能であるた めに， 精製酵素をよ 容易に且つ大量に製造することが可能であること。
3 ) 単離したプロリ ン水酸化酵素， 及びこれを動物（例えばゥサギ）に免疫して 得られる特異抗血清を用いてラジオィムノアツセィ系を確立し， ヒ ト血清中のプ 口リ ン水酸化酵素の濃度を測定することは， 急性肝炎の診断， 並びに原発性肝癌 判
の塞栓療法の効 定に有用であったこと。
図面の簡単 説明 第 1図 Aは， Kuut t i らの方法のみによってヒ ト胎盤よ D精製されたプロリン 水酸化酵素のポリアタリルァ ドゲル電気泳動像を示す。 主バンドの下に副バン ドが見られる。 第 1図 Bは， Kuut t i らの方法に加え， 電気泳動法およびそれに
、 続く電気抽出法を行って精製されたプロリン水酸化酵素のポリアクリルァ ドゲ ル電気泳動像を示す。 A , Bともにクーマシ— ， ブリ リアン トブルー染色。 第 2 図は， プロリン水酸化酵素とゥサギ抗血清との特異的抗原抗体反応を示す免疫拡 散法の図である。 a) 硫酸ア ンモニゥム分画の精製段階の粗酵素。 b) 精製され たプロリ ン水酸化酵素。 c) 精製されたプロリ ン水酸化酵素に対するゥサギ抗血 清。 第 3図は建常人並びに各種疾息息者における血清中プロリン水酸化酵素濃度， 第 4図は原発性肝癌に対する塞栓療法の前後における血清中プロリ ン水酸化酵素 濃度， 第 5図は 2回の塞栓療法を施行された原発性肝癌患者の血清中プロリン水 酸化酵素濃度の推移を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例によってこの発明を具体的に説明する。 実施例
精製はすべて 0— 4 °Cにおいて行った。 10.7 のヒ ト胎盤に等重量の 0. 1 M 塩化ナ ト リ ウム， 0. 1 Mグリ シン， 0. 1 % Tr i ton X-100 , 10 J"Mジ.チ才スレイ ト一ル及び 1 OmM ト リ ス塩酸 pH 7. 8 を含む水溶液を加え， ワー リ ングブレンダ 一中で組織を破砕する。 更に， ガラス一テフロ ン製のホモゲナイザーを用いて組 織を破壊し， 2 0分間放置して酵素の水溶液中への抽出を行った後， 15，000 xg で 3 0分間遠心分離し， 1 4 の上澄液を得た。 この 15, 000 xg 上澄液に粉末の 硫酸ァンモニゥムを徐々に加え， 20-70%飽和の画分に沈殿する蛋白質を遠心分 離によ 捕集した。 沈殿に 1. 7 ^の 0. 1 M塩化ナ ト リ ウム， 0. 1 Mグリシン， 10 ジチ才ス レイ トール及び 1 0 mMト リス塩酸 ρΗ 7· 8を含む水溶液を加え沈殿 を懸濁した後， 2 0倍容の同じ組成の緩衝液に対して 1 2時間ずつ， 2回透析し た。 透析後の溶液から不溶性物質を 15, OOOxg 40分間の遠心分離によ ]9除き， 上澄（ 6 ）にポリ一 L一プロ リ ンをリ ガンドとする Sepharose 4 B ( 1 当 ]5 2.6 のポリ— L—プロリン<分子量 40,000〉 を結合したもの）の 82 m を加え， バッチ法によ ]?ゆるやかに回転するスクリュー ¾用いてー晚 ft拌してプ 口 リ ン水酸化酵素をリ ガンドに吸着させた。 ここでバ ッチ法を用いた理由は， 力 差換 ( α,ν.ρι
^ ラム法では十分な流 ¾^得られず， 酵素が安定な間に吸着を終えることが出来な いからである。 バッチ法によ ]980.5 % のプロリ ン水酸化酵素活性がリ ガンドに 吸着された。 プロリ ン水酸化酵素を吸着したポリ - L一プロリン -Sepharose 4 Bをガラス π過器上に捕集し， 3 0倍容量の上記緩衝液によ] 9洗浄後， カ ラム に充填し（ 1.86X 30 cm)上記緩衝液に 3 のポリ一 L—プロリ ン（分子 量 9, 000) を加えた溶出液によ]?プロ リン水酸化酵素をリガンドから溶離した。 溶出されたプロ リ ン水酸化酵素活性を有する画分を集め， 限外分子量 30,000 の 口過膜を用いて， 25.5 m まで濃縮を行った後， 20,000xg 10 分間の遠心分離 によ 不溶性物質を除去した。 続いて上澄を Bio el A - 1.5mカラム （ 4.4 X
IOICT 上でゲル口過し， 流出液をフラ ク ショ ンコ レクター上に捕集した。 各画 分のプロリン水酸化酵素活性及び 23 Onmにおける吸光度を測定し， 吸光度当た のプロリン水酸化酵素活性が高い画分を集めた。 集めた画分を再度上記限外口 過膜を用いて 9.8 m ·まで濃縮した。 この溶液の一部を Davis の方法に従って
、
7 %ポリアクリルァ ドゲル上で電気泳動した後， クーマ シー ·ブリ リアン トブ ノレ一で染色すると， 第 1図 Aのごとく， 主バンドと副バン ドの 2本のバンドが認 められた。 プロ リン水酸化酵素活性の大部分は主バン ドに存在した。 副バン ドに も僅かな酵素活性が認められたが比活性は主バン ドのそれよ 低く， 詳細は不明 であるが主バンドとは異質の物質と考えられた。 そこで上記濃縮液を Davisの方 法に従い， Davisの電気泳動用緩衝液に対してー晚透析した。 透析後の溶液を 7 °hポリアク リルア^ =ドゲル上で電気泳動した後， Hartman らの方法によ！)ゲル をァ リ ノナフタ レンスノレホネート溶液に浸して蛋白質バンドを染色し， 染色し たゲル上の第 1図 Aの主バンドに相当するバンドを紫外線照射のもとにその発す る螢光によ ]?その位置を確認しながらゲルごと切 取った。 切 取ったゲル片中 に含まれるプロリ ン水酸化酵素は， Hashizume らの電気抽出装置を用いてゲル 片から抽出した。 以上で精製を完了した。 このようにして精製したヒ ト胎盤プロ ミ 純 リ ン水酸化酵素標品を再度ポリア
Figure imgf000007_0001
否を確認した時， 泳動パターンは 1本バン ドを示し（第 1図 B ) , この標品が不 純
雜物を含まない純粋なプロリン水酸化酵素標品であることを示した。 精製結果の 大要は第 1表のとお J?である。 この結果をヒ ト胎児を原料として用いた精製結果
(前掲 Kuut t i らの文献参照） と比較すると収率において大差がなかった。 この精製の最終過程で電気泳動及び電気抽出を行う間に目的物であるプロリ ン 水酸化酵素の活性は電気泳動前の約 1 2 %に， また比活性も失活等によ ]?約 5 0 にそれぞれ減少するが， ヒ ト胎盤を原料に用いて純粋るプロリ ン水酸化酵素を 得るためには， これら両ステップは不可欠である。
第 1表 プロリン水酸化酵素精製の要約
Figure imgf000008_0001
産業上の利用可能性 実施例によ j 単離したヒ ト胎盤プロリン水酸化酵素をゥサギに免疫することに よ ]?同酵素に対する特異抗血清が作製された。 第 2図はオクタローニ—（ Ouih- t er lony)免疫拡散法の図であるが， 抗血清と粗酵素， 抗血清と精製酵素の間に 単一の線が認められ， しかも， この 2つの線は融合した。 これは免疫に用いた酵 素が純品であること， 抗血清が特異抗血清であることを示している。 この特異抗 血清を用いることによ j , 1 ) ラジオィ ムノアツセィ法を確立し， プロリ ン水酸 化酵素を微量定量すること， 2) 組織化学的方法によ 組織内におけるプロリ ン 水酸化酵素の存在を同定することが可能と考えられる。 差換え 次に， この特異抗血清と 1251でラベルきれた純粋プロリン水酸化酵素とを用い てラジオィ ムノア ッセィ法を確立し， ヒ ト血清中のプロリ ン水酸化酵素濃度を測 定することが臨床医学上有用であることを示す。
本発明者は， 二抗体法 〔Morgan,C Rら（1963) Diabetes 12:115- 126〕に よるラジオィムノアツセィ法を確立し， 齄常人及び各種疾患患者の血清中プ口リ ン水酸化酵素の濃度を測定した その結果は第 3図のごとくである。 3 3名の健 常人の血清中プロリ ン水酸化酵素の濃度は， 155-400 ng m^の範囲に分布し， その平均値は 253 ngZm ， 標準偏差は 59 n^m^であった。 一方急性肝炎患者 7名の血清中の濃度は 385-3,260 ng m^の範囲に分布し， その平均値は 982ng / £, 標準偏差は l，020n^n で， 齄常人に比べ有意に高値を示していた（ P < 0.001 。 し力 し， 慢性肝炎， 肝硬変， 原発性肝癌， 胃癌患者においては齄常 人と有意の相違を認めることはできなかった。 急性肝炎における高値は， 急性肝 炎によ 壌死におちいつた肝細胞から該酵素が血中に放出されたことに ると考 えられる。
また手術適応の ¾い原発性肝癌に対して， 今日， 腫瘍部を栄養している動脈を
X線透視下に確認し， 大腿動脈よ 経動脈的にカテーテルを腫瘍部近くにまです すめ， スポンゼル等の塞栓物質を注入し， 腫瘍を壊死におちいらせる塞栓療法，
CYamada, R (1980) Osaka City Med J 26 :81 -96〕が広く実施されてい るが， その前後の血清中プロリ ン水酸化酵素の濃度を比較すると， 第 4図にみる ごとく， 6回の塞栓療法のいづれにおいても， 療法後のプロリン水酸化酵素濃度 の上昇がみられている。 これは塞栓療法によって腫瘍組織が壊死におちい ， 腫 瘍組織中に存在していたプロリン水酸化酵素が血中に放出されたためと考えられ る。 第 5図は， 2回の塞栓療法が施行された原発性肝癌患者の血清中プ口リン水 酸化酵素濃度の推移であるが， 塞栓療法が組織を壊死に陥らせた事実を如実に物 語つている。
かくのごとく， 血清中のプロリン水酸化酵素の濃度をラジオィ ムノアッ セィ法 差^え ， 0MP1 によって測定することは， 急性肝炎の診断， 並びに原発性肝癌に対する塞栓療法 判
の効果铺定に極めて有用であると考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
ヒ ト胎盤を原料として用いることを特徵とする純粋なヒ トプロリン水酸化酵素 の製造方法。
差 ¾ ,1
PCT/JP1984/000387 1983-08-10 1984-07-31 Process for preparing human proline hydroxylase WO1986000924A1 (en)

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