SU1668950A1 - Способ определени активности калпаинов в биологическом материале - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохимии. Цель изобретени  - упрощение и ускорение способа. Эта цель достигаетс  тем, что после центрифугировани  тканевого гомогената или гемолизата эритроцитов провод т гидрофобное св зывание супернатанта с октилсефарозой CL - 4B, отматывают балластные белки и элюируют калпаины 0,5%-ным раствором холата натри . Активность фермента определ ют, использу  в качестве субстрата казеин. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к медицине, а именно к способам определени  активности ферментов, и может быть использовано в клинической практике и дл  исследовательских работ при изучении различных физиологических и патологических состо ний организма человека и животных.

Цель изобретени  - упрощение и ускорение способа за счет возможности многократного использовани  носител .

Способ по сн етс  примерами.

П р и м е р 1. Определение активности калпаинов в сердечной мышце.

Сердце крыс гомогенизируют в 8 объемах 20 мМ трис-HCI буфера рН 7,66, содержащего 4 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и центрифугируют при 25000 g в течение 30 мин. К полученному суперна- танту добавл ют раствор хлорида натри  до конечной концентрации 0,25 М и нанос т на колонку с октил-сефарозой CL-4B (0,9 х 3 см), предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ трис-НС1, 0,25 М NaCI, 4 мМ ЭЛТА, рН 7,0). Балластные белки отмывают буфером А. Дл  элюции калпаинов используют буфер В рН 8,0, содержащий 20 мМ трис-ЛС1. 4 мМ ЭЛТА и 0.5% хлората натри . Рабоча  скорость 30 мл/ч, обьем активной фракции равен 1,5 мл.

В инкубационную смесь, содержащую 0,25% щелочно-денатурированного казеина , 20 мМ трис-HCI, 5 мМ 2-меркаптоэтано- ла, рН 7,5, добавл ют раствор хлорида кальци  до конечной концентрации 2 мМ и выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавл ют 0,4 мл раствора калпаинов и инкубируют при 30°С 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 1,5 мл холодной 8%-ной трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость спектрофотомет- рируют при длине волны 280 нм против контрол , содержащего вместо хлорида кальци  2 мМ ЭДТА.

П р и м е р 2. Определение активности калпаина( 1}в эритроцитах..

Отбирают кровь, использу  в качестве антикоагул нта 3%-ный раствор ЭДТА, и

Ё

О

с

00 Ю

сл о

центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Эритроциты промывают три раза 0,9%-ным раствором хлорида натри  с 2 мМ ЭДТА. Дл  гемолиза используют буфер следующего состава: 20 мМ трис-HCI; 2 мМ ЭДТА, рН 7,5, который добавл ют к эритроцитам в соотношении 1:9 и выдерживают в холодильнике 15 мин. Затем гемолизат центрифугируют 40 мин при 16000 g и далее используют супернатант, с которым провод т операции по примеру 1. Конечна  концентраци  хлорида кальци  в инкубационной смеси 1 мМ.

Способ дает возможность проводить массовые определени  при исследовательской работе и в клинике вследствие упрощени  техники определени  ее удешевлени  при высокой точности и достаточной чувствительности.

В таблице представлены данные сравнительного анализа известного и предлагаемого способов по чувствительности и точности.

В известном способе за единицу активности принимаетс  количество фермента, увеличивающее абсорбцию на 1 ед при 595 нм после 30 мин инкубации при 25°С. В

предлагаемом способе активность калпаи- нов выражена в мкмоль тирозина-мг белка V1 .

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ определени  активности калпаиное в биологическом материале путем измельчени  материала, центрифугировани , помещени  супернатанта на хроматографи- ческую колонну, с последующей элюцией калпаинов, инкубацией элюата с субстратом

   и измерением содержани  продуктов гидролиза , отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и ускорени  способа за счет возможности многократного использовани  носител , в качестве носител  в колонке используют октилсефарозу CL-4B, элюцию провод т 0,5%-ным раствором хо- лата натри , при этом св зывание калпаинов с носителем провод т при рН 7,0, а элюцию - при рН 8,0.