UA99454C2 - Спосіб лікування з використанням глікопегильованого g-csf (варіанти) - Google Patents

Спосіб лікування з використанням глікопегильованого g-csf (варіанти) Download PDF

Info

Publication number
UA99454C2
UA99454C2 UAA200911131A UAA200911131A UA99454C2 UA 99454 C2 UA99454 C2 UA 99454C2 UA A200911131 A UAA200911131 A UA A200911131A UA A200911131 A UAA200911131 A UA A200911131A UA 99454 C2 UA99454 C2 UA 99454C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
peptide
specified
group
glycosyl
amino acid
Prior art date
Application number
UAA200911131A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Девид А. Цопф
Хайнц Лубенау
Original Assignee
Биодженерикс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Биодженерикс Аг filed Critical Биодженерикс Аг
Publication of UA99454C2 publication Critical patent/UA99454C2/uk

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

У даному винаході представлений глікопегильований G-CSF, що має терапевтичну активність і має фармакокінетичні параметри і властивості, поліпшені у порівнянні з ідентичним або близько аналогічним пептидом G-CSF, який не глікопегильований. У винаході представлені також способи стимуляції гематопоезу у суб'єкта, особливо у суб'єкта, що піддавався або буде піддаватися радіаційній або хімічній терапії. Способи і композиції відповідно до винаходу можуть далі застосовуватися для попередження, полегшення і лікування мієлосупресивних ефектів таких терапій.

Description

За дійсною заявкою вимагається пріоритет відповідно до дат подачі попередньої заявки на патент
США Мо 60/909917, поданої З квітня 2007 року; попередньої заявки на патент США Мо 60/911788, поданої 13 квітня 2007 року; і попередньої заявки на патент США Мо 60/986240, поданої 7 листопада 2007 року, зміст яких повністю включений за допомогою посилання в дану заявку для будь-яких цілей.
Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (5-С5Е) являє собою глікопротеїн, який стимулює виживання, проліферацію, диференціювання і функцію клітин- попередників нейтрофільних гранулоцитів і зрілих нейтрофілів. Обидві форми рекомбінантного людського 5-С5Е, використовувані в клініці, являють собою потужні стимулятори гранулопоезу нейтрофілів, ефективні відносно попередження інфекційних ускладнень деяких нейтропенічних станів. Вони можуть використовуватися для прискорення відновлення популяції нейтрофілів після мієлосупресивних впливів. а-С5Е зменшує хворобливість протиракової хіміотерапії шляхом зниження частоти фебрильної нейтропенії, хворобливість високодозової хіміотерапії з одночасною трансплантацією кісткового мозку, а також частоту і тривалість інфекційних захворювань у пацієнтів з важкою хронічною нейтропенією.
Крім того, було показано, що 5-С5Е має терапевтичний ефект при введенні пацієнту після початку інфаркту міокарда.
Добре відомо, що гостра мієлосупресія внаслідок цитотоксичної хіміотерапії є дозообмежувальним фактором при терапії раку. Також спостерігаються побічні ефекти відносно інших нормальних тканин, однак кістковий мозок має найбільшу чутливість до способів лікування, специфічних для проліферуючих клітин, таких як хіміотерапія і радіаційна терапія. Для деяких онкологічних хворих гематопоетична токсичність часто обмежує можливість підвищення дози хіміотерапії. Повторні або високодозові курси хіміотерапії можуть приводити до виснаження пулу кровотворних стовбурових клітин і їх потомства.
Попередження і захист від побічних ефектів хіміотерапії і радіаційної терапії може принести велику користь онкологічним хворим. Було показано, що О-С5БЕ і інші фактори росту зменшують тяжкість таких побічних ефектів шляхом збільшення кількості критичних клітин-мішеней, особливо кровотворних клітин-попередників.
Людський 5-С5Е був клонований у 1986 році групами дослідників з Японії і США (дивіться, наприклад, Мадаїа еї аїЇ., Маїшге 319, 415-418, 1986). Існує дві форми природного людського глікопротеїну, одна з яких містить 175, а інша 178 амінокислот. Для розробки фармацевтичних продуктів із застосуванням технології рекомбінантної ДНК використовувалася більш активна форма, яка зустрічається більш часто, що містить 175 амінокислот.
Рекомбінантний людський (5-С5Е, синтезований у системі експресії БЕ. сої, називається філграстим. Структура філграстиму незначно відрізняється від природного глікопротеїну. Інша форма людського рекомбінантного 5-С5Е називається ленограстим і синтезується в клітинах яєчників китайського хом'ячка (СНО). па-С5Е являє собою мономерний протеїн, який димеризує рецептор 5-С5ЗЕ шляхом утворення комплексу 2:2 з 2 молекул О-С5БЕ і 2 рецепторів (Ногап еї аї., Віоспетівігу, 35(15): 4886-96 (1996)). За допомогою методу рентгенівської кристалографії були виявлені наступні залишки в складі 5-С5Е, що формують частину молекули, взаємодіючу з рецептором: (34, Р5, Аб, 57, 58,19, Р10, 011, 512,115,
К16, Е19, 020,1108, 0109, 0112, 7115, Т116, 9119, Е122, Е123 і 1124 (дивіться, наприклад, Ашоті еї а!., (1999) Маїшге 401: 713).
Наявні в продажу форми гпс-С5Е мають короткочасну фармакологічну дію і часто мають вводитися пацієнту частіше одного разу на день протягом лейкопенічного стану. Більш довгий час напівжиття молекули в циркуляції дозволив би зменшити кількість введень, необхідних для полегшення лейкопенії і попередження інфекцій. Інша проблема наявних у продажу продуктів гпе-С5Е полягає у виникненні дозозалежного болю в кістках. Оскільки біль у кістках, якої зазнають пацієнти, є значним побічним ефектом терапії гпо-С5Е, бажана розробка продукту гО-С5Е, що не викликає болю в кістках, або розробка продукту, що не має цих ефектів у силу своєї природи або ефективності в малих дозах, недостатніх для розвитку болю в кістках. Таким чином, очевидна необхідність розробки поліпшених рекомбінантних молекул 5-05.
Були описані штучно одержані варіанти пО-С5Е (дивіться патенти США МоМо 5581476, 5214132, 5362853, 4904584 і Ківеапааг-Оїівоп еї аї., Віоспетівігу 35: 9034-9041, 1996). Також була описана модифікація пО-С5Е і інших поліпептидів шляхом введення щонайменше одного додаткового вуглеводного ланцюга в порівнянні з нативним поліпептидом (патент США Мо 5218092). Крім того, були описані і вивчені полімерні модифікації нативного ПО-С5Е, включаючи додавання РЕОс-груп (дивіться, наприклад, Заїаке-І5пікама еї аї., (1992) СеїЇ Зігисіште апа ЕРипсіп 17: 157; Вомеп 6ї аї., (1999) Ехрегітепіа! Нетаїйоіоду 27: 425; патенти США МоМо 5824778, 5824784, МО 96/11953, МО 95/21629 і УМО 94/20069).
З рівня техніки відоме приєднання синтетичних полімерів до поліпептидного ланцюга з метою поліпшення фармакокінетичних властивостей глікопротеїнових лікарських засобів. Типовим прикладом полімеру, кон'югованого з пептидами, є поліетиленгліколь (РЕС, ПЕГ). Було показано, що використання РЕС для дериватизації пептидних лікарських засобів знижувало імуногенність пептидів.
Наприклад, у патенті США Мо 4179337 (Рамі5 еї а.) розкриваються неімуногенні поліпептиди, такі як ферменти і пептидні гормони, зв'язані з поліетиленгліколем (РЕС) або поліпропіленгліколем. Для таких пептидів, крім зниженої імуногенності, характерний збільшений час кліренсу з циркуляції в зв'язку зі збільшенням розміру кон'югатів розглянутих пептидів з РЕО.
Один метод приєднання РЕС (і його похідних) до пептидів являє собою неспецифічне зв'язування через амінокислотний залишок пептиду (дивіться, наприклад, патент США Мо 4088538, патент США Мо 4414147, патент США Мо 4055635, а також РСТ МО 87/00056). Інший метод приєднання РЕС до пептидів являє собою неспецифічне окислювання глікозильних залишків на глікопептиді (дивіться, наприклад, М/О 94/05332).
При використанні цих неспецифічних методів поліетиленгліколь приєднується випадково і неспецифічно до реактивних залишків у складі пептидного ланцюга. Очевидно, що для випадкового приєднання молекул РЕС характерний ряд недоліків, включаючи гетерогенність кінцевого продукту й імовірність зниження біологічної або ферментативної активності пептиду. Таким чином, для виробництва лікарських пептидів переважна стратегія дериватизації, яка приводить до одержання специфічно міченого, легко характеризованого і практично гомогенного продукту. Такі способи розроблені.
Специфічно мічені, гомогенні пептидні лікарські засоби можна одержувати іп міго за допомогою ферментів. На відміну від типових неспецифічних способів приєднання до пептиду синтетичного полімеру або іншої мітки, синтези, основані на ферментах, мають переваги регіоселективності і стереоселективності. Два головних класи ферментів, застосовних для синтезу мічених пептидів, включають глікозилтрансферази (наприклад, сіалілтрансферази, олігосахарилтрансферази, М- ацетилглюкозамінілтрансферази) і глікозидази. Ці ферменти можна використовувати для специфічного приєднання цукрів, які далі можна модифікувати для одержання лікарської речовини. Як альтернатива, глікозилтрансферази і модифіковані глікозидази можуть використовуватися для прямого перенесення модифікованих цукрів на поліпептидний ланцюг (дивіться, наприклад, патент
США Мо 6399336 і публікації заявок на патент США 20030040037, 20040132640, 20040126838 і 20040142856, кожна з який включена в дану заявку за допомогою посилання). Також відомі способи, які комбінують елементи як хімічного, так і ферментативного синтезу (дивіться, наприклад, Хататоїо еї а)І., Сагронуаг. Вез. 305:415-422 (1998) і публікацію заявки на патент США 20040137557, включені в дану заявку за допомогою посилання).
У відповідь на потребу в поліпшеному лікарському 5-С5Е, у даному винаході представлений глікопегильований 5-С5Е, який має терапевтичну активність, а також поліпшені фармакокінетичні параметри і властивості у порівнянні з неглікопегильованими ідентичним пептидом 5-С5Е або його близьким аналогом. Далі в даному винаході представлені способи посилення гематопоезу у суб'єкта, особливо у суб'єкта який одержував або буде одержувати лікування у вигляді радіаційної або хіміотерапії.
Відповідно до вищесказаного, в одному аспекті в даному винаході представлені способи і композиції, що стимулюють продукцію стовбурових клітин у реципієнта трансплантата кісткового мозку. Ці способи і композиції включають введення реципієнту трансплантата кісткового мозку деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В одному аспекті полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду через інтактну глікозильну зв'язувальну групу.
В іншому аспекті в даному винаході представлені способи і композиції, які збільшують число гранулоцитів у суб'єкта. Цей спосіб включає стадію введення суб'єкту деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В одному аспекті пептид 5-С5Е має амінокислотну послідовність, наведену в ЗЕО ІО МО:1, а полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до пептиду С-С5Е в області амінокислотної послідовності, яка починається гліцином у положенні 126 і закінчується серином у положенні 143.
Ще в одному аспекті в даному винаході представлені способи і композиції, які підвищують продукцію стовбурових клітин у суб'єкта. Ці способи включають стадію введення суб'єкту деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В подальшому аспекті пептид 5-С5Е включає структуру відповідно до формули б дано оаімАст (ваду ва РЕ де а дорівнює 0 або 1; і
Зіа-РЕС має структуру відповідно до формули соб но он | 5 но. КК ви- ьо о т ; . Я. сідвіс ОН
Нас Ази ну ММ п су де п означає ціле число від 1 до 2000.
В одному аспекті в даному винаході представлені способи попередження, лікування або ослаблення мієлосупресії, особливо мієлосупресії, обумовленої протипухлинною терапією. В одному аспекті цей спосіб включає введення реципієнту деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-СЗЕ і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'юЮюгата може ковалентно приєднуватися до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду С-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
В іншому аспекті в даному винаході представлені способи лікування захворювання у суб'єкта, для якого характерне пригнічення продукції білих кров'яних клітин. В одному аспекті спосіб лікування захворювання включає стадію введення суб'єкту деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'юЮюгата може ковалентно приєднуватися до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
Кількість пептиду, що вводиться суб'єкту, достатня для ефективного полегшення стану суб'єкта.
Ще в одному аспекті в даному винаході представлені способи лікування нейтропенії у ссавця. Ці способи включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'юЮюгата може ковалентно приєднуватися до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду С-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
Ще в одному аспекті в даному винаході представлені способи лікування тромбоцитопенії у ссавця.
Ці способи включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата може ковалентно приєднуватися до пептиду -С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
В одному аспекті в даному винаході представлені способи збільшення популяції кровотворних стовбурових клітин у культурі. Ці способи включають стадію додавання до культури стовбурових клітин ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5БЕ і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата може ковалентно приєднуватися до пептиду С5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
В іншому аспекті в даному винаході представлені способи стимуляції гематопоезу у суб'єкта. Ці способи включають стадію введення суб'єкту ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'юЮюгата може ковалентно приєднуватися до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду С-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
Ще в одному аспекті в даному винаході представлені способи збільшення числа кровотворних клітин-попередників у суб'єкта. Ці способи включають стадію введення суб'єкту ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи.
Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата може ковалентно приєднуватися до пептиду О-
СЕ біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду С-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
В одному аспекті в даному винаході представлені способи стимуляції продукції стовбурових клітин у донора. Ці способи включають стадію введення донору ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата може ковалентно приєднуватися до пептиду -С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
В іншому аспекті в даному винаході представлені способи підвищення тривалого приживлення трансплантата кісткового мозку у реципієнта. Ці способи включають стадію введення реципієнту кісткового мозку пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата може ковалентно приєднуватися до пептиду С-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду С-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
Ще в одному аспекті в даному винаході представлені способи стимуляції кровотворних клітин- попередників у суб'єкта. Ці способи включають стадію введення суб'єкту першої композиції, що містить сполуку формули 1,1-11,4-феніленбіс-(метилен)-біс-1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан (АМОЗ100), і другої композиції, що містить пептид, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду -
СЗЕ ї полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата може ковалентно приєднуватися до пептиду С5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи. Перша і друга композиції можуть вводитися суб'єкту послідовно в будь-якому порядку або одночасно.
В одному аспекті в даному винаході представлена дозована форма для перорального введення.
Ця дозована форма для перорального введення може містити наступні компоненти: (а) пептид, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5З-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група може ковалентно приєднуватися до пептиду С-СЗЕ біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи; (Б) поверхнево-активну речовину (речовини); (с) жирну кислоту (кислоти); ії (4) кишковорозчинний матеріал. В одному аспекті компоненти (а), (Б) і (с) змішують у рідкій фазі і ліофілізують перед об'єднанням з компонентом (4).
В іншому аспекті в даному винаході представлений спосіб підвищення продукції стовбурових клітин у донора, де спосіб включає стадії введення донору деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В подальшому аспекті полімерна модифікуюча група ковалентного кон'югата приєднується до пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи. Ще в одному аспекті винаходу кількість пептиду, що вводиться донору, знаходиться в інтервалі від 1 мг до приблизно 20 мг.
Ще в одному аспекті винаходу представлений спосіб підвищення продукції стовбурових клітин у донора, де спосіб включає стадії введення донору деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В подальшому аспекті полімерна модифікуюча група приєднується до пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи. Ще в одному аспекті кількість пептиду, що вводиться донору, може знаходитися у вигляді одиничної дозованої форми. В одному втіленні одинична доза вибирається з 25, 50, 100 і 200 мкг/кг.
На фіг. 1 наведені дані, які стосуються абсолютної кількості нейтрофілів (АМС) у відповідь на ХМ22 (25 мкг/кг; 50 мкг/кг; 100 мкг/кг) і нейласту (100 мкг/кг).
На фіг. 2 наведені дані, які стосуються кількості СОЗ4-- клітин у відповідь на ХМ22 (25 мкг/кг; 50 мкг/кг; 100 мкг/кг) і нейласту (100 мкг/кг).
Фіг. З являє собою таблицю даних, які стосуються фармакокінетичних параметрів для чотирьох різних дослідних груп.
На фіг. 4 наведені дані, які стосуються абсолютної кількості нейтрофілів (АМС) у відповідь на ХМ22 (6 мг) і нейласту (6 мг).
На фіг. 5 наведені дані, які стосуються кількості СЮОЗ4-- клітин у відповідь на ХМ22 (6 мг) і нейласту (6 мг).
На фіг. 6 наведені дані фармакодинаміки, які стосуються кількості нейтрофілів у відповідь на о-
С5Е, глікоРЕС-С-С5БЕ, нейласту і контрольну композицію у яванських макак.
На фіг. 7 наведені дані фармакокінетики, які стосуються концентрації зазначених композицій у плазмі у яванських макак.
На фіг. 8 наведена схематична модель структури глікоРЕС-(4-С5Е і його рецептора.
На фіг. 9 наведені дані, які стосуються концентрації ХМ22 і нейласти в сироватці крові після введення трьох різних доз ХМ22 і 100 мкг/кг нейласти.
На фіг. 10 наведені дані, які стосуються концентрації ХМ22 і нейласти в сироватці крові після введення 6 мг ХМ22 і 6 мг нейласти.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ І ПЕРЕВАЖНИХ ВТІЛЕНЬ
Скорочення
РЕС, ПЕГ - поліетиленгліколь; РРО, ППГ - поліпропіленгліколь; Ага - арабінозил; Еги - фруктозил;
Рис о - фукозил; ба! - галактозид; саіМАс-М-ацетилгалактозамініл; (зІсС - глюкозид; (ІСМАсС-М- ацетилглюкозамініл; Мап - манозил; МапАс - манозамініл ацетат; Ху! - ксилозил; МецАс - сіаліл (М- ацетилнейрамініл); МбР - манозо-6-фосфат; 5іа - сіалова кислота, М-ацетилнейрамініл і їх похідні й аналоги. "а-С5Е" означає гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор.
Визначення
Якщо не визначено інакше, значення всіх технічних і наукових термінів, використовуваних в даній заявці, в цілому збігається з загальноприйнятими значеннями, відомими фахівцю в галузі техніки, до якої належить даний винахід. Загалом, використовувані в даній заявці номенклатура і лабораторні процедури, що стосуються культури клітин, молекулярної генетики, органічної хімії і хімії і гібридизації нуклеїнових кислот, добре відомі і широко застосовуються в рівні техніки. Для синтезу пептидів і нуклеїнових кислот використовуються стандартні техніки. Загалом, техніки і процедури проводяться відповідно до загальноприйнятих способів, відомих з рівня техніки, і різних загальних керівництв (дивіться затюогоокК еї аїЇ., МоїІесшіаг СіІопіпд: А Гарогаїогу Мапиаї, 2 вид., (1989) Сода 5ргіпд Нагброг
І арогафогу Ргез55, Соїй 5ргіпд Нагрог, МУ, включене в дану заявку за допомогою посилання), посилання на які наводяться в тексті даного документа. Використовувані в даній заявці номенклатура і лабораторні процедури, що стосуються аналітичної хімії й органічного синтезу, описані нижче, добре відомі і широко застосовуються в рівні техніки. Для хімічних синтезів і хімічних аналізів використовуються стандартні техніки або їх модифікації.
Всі олігосахариди, описані в даній заявці описуються повною або скороченою назвою нередукуючого сахариду (тобто сСаїЇї), за яким іде конфігурація глікозидного зв'язку (с або ВД), зв'язок з кільцем (1 або 2), положення в кільці редукуючого сахариду, що бере участь у зв'язку (2, 3, 4, 6 або 8), і повна або скорочена назва редукуючого сахариду (наприклад, СІСМАс). Кожен сахарид переважно являє собою піранозу. В огляді Е55епійаіє ої сіусоріоіоду, ред. Магкі еї аїІ,, С5НІ Ргев55 (1999) розглядається загальноприйнята глікобіологічна номенклатура.
Передбачається, що в олігосахаридах наявні редукуючий і нередукуючий кінці незалежно від того, чи є сахарид на редукуючому кінці редукуючим сахаридом. Відповідно до прийнятої номенклатури, у даній заявці олігосахариди зображуються з нередукуючим кінцем ліворуч і редукуючим кінцем праворуч.
Термін "сіалова кислота" стосується будь-якого представника сімейства дев'ятивуглецевих карбоксилованих цукрів. Представник сімейства сіалових кислот, що найбільш часто зустрічається, являє собою М-ацетилнейрамінову кислоту (2-кето-5-ацетамідо-3,5-дидезокси-О-гліцеро-О- галактононулопіраноз-1-онову кислоту (часто скорочується до Меиб5Ас, МецАс або МАМА). Другий представник сімейства являє собою М-гліколіллоейрамінову кислоту (Мен5Ос або Меисс), де М- ацетильна група МецАс гідроксилована. Третій представник сімейства сіалових кислот являє собою 2- кето-З3-дезоксинонулозонову кислоту (КОМ) (Мадапо еї аї. (1986), 9. Віої. Спет. 261:11550-11557;
Капатогі єї аї!., у. Віої. Спет. 265: 21811-21819 (1990)). Також сюди включаються 9-заміщені сіалові кислоти, такі як 9-0-Сі1-Свацил-Меи5Ас, як 9-О-лактил-Меи5Ас або 9-О-ацетил-Меи5Ас, 9-дезокси-9- фтор-Мен5Ас і 9-азидо-9-дезокси-Меи5Ас. Дивіться огляд сімейства сіалових кислот Маккі,
СПусобріоіоду 2:25-40 (1992), Зіаїїс Асіає: Спетівігу, Меїгабоїїзт апа Еипсііоп, ред. К. 5спапцег (Зргіпдег-
Мепад, Мем ХогКк (1992)). Синтез і використання сполук сіалових кислот у процедурі сіалізації розкриті в заявці на міжнародний патент УМО 92/16640, опублікованій 1 жовтня 1992 року.
Термін "пептид" означає полімер, який складається з мономерів-амінокислот, зв'язаних між собою амідними зв'язками, також називаний поліпептидом. Крім того, сюди включаються неприродні амінокислоти, такі як ДВ-аланін, фенілгліцин і гомоаргінін. Також у даному винаході можуть використовуватися амінокислоти, не кодовані генами. Далі, у даному винаході можуть використовуватися модифіковані амінокислоти, які містять реактивні групи, сайти глікозилування, полімери, лікарські речовини, біомолекули і т. д. Всі амінокислоти, використовувані в даному винаході, можуть являти собою як О-, так і І -ізомери. У загальному випадку, переважним є Г -ізомер. Крім того, у даному винаході можуть використовуватися інші пептидоміметики. При використанні в даній заявці "пептид" означає як глікозиловані, так і неглікозиловані пептиди. Також сюди включаються пептиди, не повністю глікозиловані в системі експресії пептиду. Дивіться огляд Зраїйоїа еї аїЇ.,, у Спетівігу апа
Віоспетівігу ої Атіпо Асіав, Реріідез апа Ргоїеїп5, ред. В. УМеіп5їеїіп, Магсе! ОекКег, Мем МогК, стор. 267 (1983).
Амінокислотна або нуклеотидна послідовність пептиду "гомологічна" іншій послідовності, якщо вони до деякої міри ідентичні. Переважно, щоб гомологічна послідовність була щонайменше приблизно на 85 95 ідентична еталонній послідовності, переважно ідентична приблизно на 90-100 95, більш переважно ідентична щонайменше приблизно на 91 95, ідентична щонайменше приблизно на 92 95, ідентична щонайменше приблизно на 93 95, ідентична щонайменше приблизно на 94 95, ще більш переважно ідентична щонайменше приблизно на 95-99 95, переважно ідентична щонайменше приблизно на 96 95, ідентична щонайменше приблизно на 97 95, ідентична щонайменше приблизно на 98 95, ще більш переважно ідентична щонайменше приблизно на 99 95, і ідентична приблизно на 100 95 референській амінокислотній або нуклеотидній послідовності.
Термін "кон'югат пептиду" стосується різновиду винаходу, де пептид кон'югується з модифікованим цукром як описано в даній заявці.
Термін "амінокислота" стосується природних і синтетичних амінокислот, а також похідних і міметиків амінокислот, які мають подібну функцію з природними амінокислотами. Природними амінокислотами є амінокислоти, кодовані генетичним кодом, а також амінокислоти, що піддаються наступній модифікації, наприклад, гідроксипролін, у-карбоксиглутамат і О-фосфосерин. Аналоги амінокислот означають сполуки, які мають базову хімічну структуру, ідентичну природним амінокислотам, тобто містять а-вуглецевий атом з приєднаними воднем, карбоксильною групою,
аміногрупою і К-групою, тобто гомосерин, норлейцин, метіонінсульфоксид, метіонінметилсульфоній.
Такі аналоги мають модифіковані К-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні ланцюги, але зберігають базову хімічну структуру, ідентичну природним амінокислотам. Амінокислотні міметики означають хімічні сполуки, що мають структуру, відмінну від базової хімічної структури амінокислот, але функція яких подібна з функцією природних амінокислот.
При використанні в даній заявці, термін "модифікований цукор" означає природний або неприродний цукор, приєднаний ферментативним способом до амінокислотного або глікозильного залишку пептиду в способі даного винаходу. Модифікований цукор вибирають із субстратів ферментів, включаючи, але не обмежуючись нуклеотидами цукрів (моно-, ди- і трифосфатами), активованими цукрами (наприклад, глікозилгалідами, глікозилмезилатами) і цукрами, які не є ні активованими, ні нуклеотидами цукрів. "Модифікований цукор" ковалентно функціоналізований "модифікуючою групою". Застосовні модифікуючі групи включають, але не обмежуються фрагментами
РЕС, лікарськими фрагментами, діагностичними фрагментами, біомолекулами і т. д. Модифікуюча група переважно являє собою неприродний або не немодифікований цукор. Точка функціоналізації модифікуючою групою вибирається таким чином, щоб вона не перешкоджала приєднанню "модифікованого цукру" ферментативним шляхом до пептиду.
Термін "водорозчинний" означає фрагменти, що мають деяку виявлювану розчинність у воді.
Способи виявлення і/або вимірювання розчинності у воді добре відомі з рівня техніки. Типові водорозчинні полімери включають пептиди, сахариди, поліефіри, поліаміни, полікарбоксокислоти і т. д. Пептиди можуть мати зміщувані послідовності або складатися з однієї амінокислоти, як наприклад, полілізин. Типовим полісахаридом є полісіалова кислота. Типовим полімером є поліетиленгліколь.
Поліетиленімін являє собою типовий поліамін, і поліакрилова кислота являє собою типову полікарбонову кислоту.
Полімерний ланцюг водорозчинного полімеру може являти собою полієтиленгліколь (тобто РЕФ).
Однак, варто розуміти, що інші споріднені полімери також застосовні в даному винаході і що в зв'язку з цим термін РЕС або поліетиленгліколь є таким, що включає, а не таким, що відрізняє. Термін РЕО включає поліетиленгліколь у будь-якій формі, включаючи алкокси-РЕС, дифункціональний РЕС, багатоплечий РЕС, роздвоєний РЕС, розгалужений РЕС, підвішений РЕС (тобто РЕС або споріднені полімери, одна або більш функціональних груп яких підвішені на полімерному ланцюзі) або РЕС, що містить зв'язки, що руйнуються.
Полімерний ланцюг може бути лінійним або розгалуженим. Розгалужені полімерні ланцюги відомі з рівня техніки. Звичайно розгалужений полімер складається з центральної частини і множини лінійних полімерних ланцюгів, зв'язаних з центральною частиною. Звичайно використовують розгалужені форми РЕС, одержувані шляхом додавання етиленоксиду до різних поліолів, таких як гліцерин, пентаеритрит і сорбіт. Центральна частина також може складатися з декількох амінокислот, таких як лізин. Розгалужений поліетиленгліколь може загалом бути представлений формулою К-(РЕС-ОН)т, де К означає центральну частину, таку як гліцерин або пентаеритрит, а т означає кількість гілок.
Також як полімерний ланцюг можуть використовуватися багатоплечі молекули РЕС, такі як описані в патенті США Мо 5932462, повністю включеному в дану заявку за допомогою посилання.
У даному винаході може використовуватися багато інших полімерів. Особливо застосовні в даному винаході непептидні водорозчинні полімерні ланцюги, що мають від 2 до З00 кінців. Приклади застосовних полімерів включають, але не обмежуються іншими поліалкіленгліколями, такими як поліпропіленгліколь ("РРО"), співполімери етиленгліколю і пропіленгліколю і ним подібних, поліоксіетилований поліол, поліолефіновий спирт, полівінілпіролідон, полігідроксипропілметакриламід, полі-с-гідроксикислота, полівініловий спирт, поліфосфазен, поліоксазолін, полі-ч-акрилоїлморфолін, такий як описаний у патенті США Мо 5629384, повністю включеному в дану заявку за допомогою посилання, а також їх співполімери, терполімери і їх суміші. Незважаючи на те, що молекулярна вага полімерних ланцюгів може розрізнятися, звичайно він знаходиться в інтервалі від приблизно 100 Да до приблизно 100000 Да, часто від приблизно 6000 Да до приблизно 80000 Да.
При застосуванні в даній заявці в контексті введення пептидного лікарського препарату пацієнту, "площа під кривою" ("АС") визначається як повна площа під кривою, яка описує концентрацію лікарського препарату в системному кровотоці пацієнта як функцію від часу від нуля до нескінченності.
При застосуванні в даній заявці в контексті введення пептидного лікарського препарату пацієнту, термін "час напівжиття" або "1/2" визначається як час, необхідний для зменшення наполовину концентрації лікарського препарату в плазмі крові пацієнта. Для одного і того самого пептидного лікарського препарату може існувати декілька різних часів напівжиття залежно від множинних механізмів кліренсу, перерозподілу й інших механізмів, добре відомих з рівня техніки. Звичайно са-час напівжиття і Д-час напівжиття визначаються таким чином, що са-фаза виявляється пов'язаною з перерозподілом, а В-фаза - із кліренсом. Однак, для білкових лікарських препаратів, які більшою частиною не залишають кровотоку, може існувати щонайменше два часи напівжиття, пов'язаних із кліренсом. Для деяких глікозилованих пептидів швидкий кліренс під час В-фази може бути опосередкований рецепторами на макрофагах або ендотеліальних клітинах, які розпізнають термінальні галактозу, М-ацетилгалактозамін, М-ацетилглюкозамін, манозу або фукозу. Більш повільне виведення в В-фазі може бути обумовлене клубочковою фільтрацією в нирках молекул, що мають ефективний радіус «2 нм (приблизно 68 кДа), і/або специфічними або неспецифічними поглинанням і метаболізмом у тканинах. Глікопегилювання може кепувати термінальні цукри (наприклад, галактозу або М-ацетилгалактозамін) і таким чином блокувати швидкий кліренс у а-фазі за допомогою рецепторів, що розпізнають ці цукри. Також воно може збільшувати ефективний радіус молекули і таки чином послабляти її розподіл і поглинання тканинами, що приводить до подовження пізньої В-фази. Таким чином, точний механізм впливу глікопегилювання на час напівжиття в а-фазі і Д- фазі може варіювати залежно від розміру, ступеня глікозилування й інших параметрів, як добре відомо з рівня техніки. Більш докладне роз'яснення терміна "час напівжиття" дивіться Рпаптасешіісаї
Віотесппоіоду (1997, ред. ОБА Стоттеїійп і КО 5іпаеїаг, Нагуиоса Рибіїзпег5, Атеегаат, стор. 101-120).
При використанні в даній заявці, термін "глікокон'югування" означає кон'югування ферментативним шляхом модифікованого цукру з амінокислотним або глікозильним залишком поліпептиду, наприклад, пептиду 5-С5Е згідно із даним винаходом. Підвидом "глікокон'югування" є "глікопегилювання", де модифікуюча група модифікованого цукру являє собою поліетиленгліколь і його алкільні (наприклад, т-РЕС) або реактивні (наприклад, НагМ-РЕСї, НООС-РЕС) похідні.
Терміни "великомасштабний" і "у промислових масштабах" застосовуються взаємозаміно й означають цикл реакцій, вихід якого складає щонайменше приблизно 250 мг, переважно щонайменше приблизно 500 мг і більш переважно щонайменше приблизно 1 г глікокон'югата по завершенні одного циклу реакцій.
При використанні в даній заявці термін "глікозильна зв'язувальна група" означає глікозильний залишок, до якого ковалентно приєднана модифікуюча група (наприклад, молекула РЕС, лікарська речовина, біомолекула); глікозильна зв'язувальна група зв'язує модифікуючу групу з іншою частиною кон'югата. У способах відповідно до винаходу "глікозильна зв'язувальна група" ковалентно приєднується до глікозилованого або неглікозилованого пептиду, таким чином зв'язуючи агент з амінокислотним і/або глікозильним залишком у складі пептиду. "Глікозильну зв'язувальну групу" звичайно одержують з "модифікованого цукру, шляхом ферментативного зв'язування "модифікованого цукру" з амінокислотним і/або глікозильним залишком у складі пептиду. Глікозильна зв'язувальна група може являти собою структуру, одержану із сахариду, що розпадається в процесі утворення касети модифікуюча група-модифікований цукор (наприклад, окислювання -» утворення основи Шиффа -» відновлення), або глікозильна зв'язувальна група може залишатися інтактною. "Інтактна глікозильна зв'язувальна група" означає зв'язувальну групу, одержану з глікозильної групи, де мономер сахариду, що зв'язує модифікуючу групу і іншу частину кон'югата, не зруйнований, наприклад, шляхом окислювання, наприклад, метаперйодатом натрію. "Інтактні глікозильні зв'язувальні групи" відповідно до винаходу можуть бути одержані з природного олігосахариду шляхом додавання глікозильної одиниці (одиниць) або відщеплення однієї або більше глікозидних одиниць від вихідної полісахаридної структури.
При використанні в даній заявці термін "націлювальний фрагмент" означає фрагмент, який селективно локалізується у визначеній тканині або відділі тіла. Локалізація опосередковується специфічним упізнаванням молекулярних детермінант, розміром молекули націлювального агента або кон'югата, іонними взаємодіями, гідрофобними взаємодіями і т. д. Фахівцям у рівні техніки відомі й інші механізми націлювання агента у визначену тканину або відділ тіла. Типові націлювальні фрагменти включають антитіла, фрагменти антитіл, трансферин, НоЗ-глікопротеїн, фактори зсідання крові, білки сироватки, ВД-глікопротеїн, 5-С5Е, СМ-С5Е, М-С5БЕ, ЕРО |і інші.
При використанні в даній заявці термін "лікарський фрагмент" означає будь-який фрагмент, придатний для терапії, включаючи, але не обмежуючи антитілами, протизапальними речовинами, протипухлинними речовинами, цитотоксинами і радіоактивними речовинами. "Лікарський фрагмент" включає проліки біоактивних речовин, конструкта, у складі яких декілька лікарських фрагментів зв'язано з носієм, наприклад, мультивалентні агенти. Лікарський фрагмент також включає білки і конструкти, що включають білки. Типові білюи включають, але не обмежуються гранулоцитарним колонієсєтимулюючим фактором (05-С5Е), гранулоцитарномакрофагальним колонієстимулюючим фактором (ЗМ-С5БЕ), інтерфероном (наприклад, інтерфероном а, В, у), інтерлейкіном (наприклад, інтерлейкін ІІ), білками сироватки (наприклад, фактори МІІ, МПа, МІЇ, ІХ ї Х), людським хоріонічним гонадотропіном (НСО), фолікулостимулюючим гормоном (ЕЗН) і лютеїнізуючим гормоном (ІН), а також білками, злитими з антитілами (наприклад, рецептор фактора некрозу пухлини (ТМЕК), злитий з доменом Ес).
При використанні в даній заявці, термін "Ффармацевтично прийнятний носій" включає будь-який матеріал, при комбінації з яким кон'югат зберігає активність і не реагує з імунною системою суб'єкта.
Приклади включають, але не обмежуються будь-якими загальноприйнятими фармацевтичними носіями, такими, як фізіологічний розчин, забуферений фосфатом, вода, емульсії, такі як водно- масляна емульсія, і різні типи змочувальних засобів. Інші носії можуть також включати стерильні розчини, таблетки, включаючи таблетки, покриті оболонкою, і капсули. Звичайно такі носії містять ексципієнти, такі як крохмаль, молоко, цукор, деякі типи глин, желатин, стеарова кислота або її солі, стеарат магнію або кальцію, тальк, рослинні жири або олії, камеді, гліколі або інші відомі ексципієнти.
Такі носії можуть також включати смакові добавки або барвники й інші інгредієнти. Композиції, що містять такі носії, можуть бути складені за допомогою широко відомих загальноприйнятих методів.
При використанні в даній заявці термін "введення" означає пероральне введення, введення у вигляді супозиторіїв, місцевий контакт, внутрішньовенне, внутрішньоочеревинне, внутрішньом'язове введення, введення усередину уражених тканин, інтраназальне або підшкірне введення або імплантація суб'єкту пристрою повільного вивільнення, наприклад, міні-осмотичного насоса. Введення може здійснюватися будь-яким шляхом, включаючи парентеральний і трансмукозальний (тобто пероральний, назальний, вагінальний, ректальний або трансдермальний). Парентеральне введення включає, наприклад, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, внутрішньоартеріальне, інтрадермальне, підшкірне, внутрішньоочеревинне, внутрішньошлункове і інтракраніальне введення. Далі, коли ін'єкція проводиться з метою терапії пухлини, тобто здатна викликати апоптоз, введення може проводитися безпосередньо в пухлину і/або в тканини, що оточують пухлину. Інші способи доставки включають, але не обмежуються використанням ліпосомальних препаратів, внутрішньовенної інфузії, трансдермальних пластирів і т. д.
При використанні в даній заявці термін "зменшити інтенсивність" або "зменшення інтенсивності" означає будь-які ознаки успіху лікування патології або захворювання, включаючи будь-які об'єктивні або суб'єктивні параметри, такі як ослаблення, зниження або зменшення симптомів або поліпшення фізичного або психічного здоров'я пацієнта.
Термін "терапія" означає "лікування" захворювання або стану, включаючи попередження виникнення захворювання або стану у тварини, яка може бути схильна до даного захворювання, але поки не має або не демонструє симптоми захворювання (профілактичне лікування), пригнічення захворювання (уповільнення або зупинення його розвитку), полегшення симптомів або побічних ефектів захворювання (включаючи паліативну терапію) і лікування захворювання (регресія захворювання).
Термін "ефективна кількість" або "кількість, ефективна для", або "терапевтично ефективна кількість" або будь-який граматичний еквівалент означає кількість, яка при введенні тварині для лікування захворювання, виявляється достатньою для ефективного лікування захворювання.
Термін "виділений" стосується матеріалу, достатньо або повністю вільного від компонентів, використовуваних для виробництва цього матеріалу. Для пептидних кон'югатів відповідно до винаходу, термін "виділений" стосується матеріалу, достатньо або повністю вільного від компонентів, що звичайно сусідять з матеріалом у суміші, використовуваній для одержання пептидного кон'югата.
Терміни "виділений" і "чистий" застосовуються взаємозаміно. Звичайно виділені пептидні кон'югати відповідно до винаходу мають рівень чистоти, який виражається переважно у вигляді інтервалу.
Звичайно, нижнє значення інтервалу чистоти пептидних кон'югатів дорівнює приблизно 60 95, приблизно 70 95 або приблизно 80 95 і верхнє значення інтервалу чистоти дорівнює приблизно 70 95, приблизно 80 95 або більше ніж приблизно 90 95.
Якщо чистота пептидних кон'югатів складає більше ніж приблизно 90 95, їх чистота також переважно виражається інтервалом. Звичайно, нижнє значення інтервалу дорівнює приблизно 90 95, приблизно 92 95, приблизно 94 95, приблизно 96 956 або приблизно 98 95. Верхнє значення інтервалу чистоти дорівнює приблизно 92 95, приблизно 94 95, приблизно 96 95, приблизно 98 95 або приблизно 100 Фо.
Чистоту визначають за допомогою аналітичних методів, відомих з рівня техніки (наприклад, інтенсивність смуги на гелі, забарвленому сріблом, електрофорез у поліакриламідному гелі, ВЕРХ або подібні методи).
При використанні в даній заявці "практично кожен представник популяції" описує характеристику популяції пептидних кон'югатів відповідно до винаходу, у якій визначений відсоток модифікованих цукрів, приєднуваних до пептиду, приєднується до множинних ідентичних акцепторних сайтів у складі пептиду. "Практично кожен представник популяції" стосується "гомогенності" сайтів у складі пептиду, кон'югованого з модифікованим цукром, і означає кон'югати відповідно до винаходу, гомогенні на щонайменше приблизно 80 95, переважно на щонайменше приблизно 90 95 і більш переважно на щонайменше приблизно 95 95. "Гомогенність" означає постійність структури в популяції акцепторних груп, з якими кон'югуються модифіковані цукри. Таким чином, якщо в пептидному кон'югаті відповідно до винаходу кожен модифікований цукор кон'югований з акцепторним сайтом, що має ту ж структуру, що й акцепторні сайти, з якими кон'юговані всі інші модифіковані цукри, говорять, що такий кон'югат гомогенний на 100 95. Гомогенність звичайно виражається у вигляді інтервалу. Нижнє значення інтервалу гомогенності пептидних кон'югатів дорівнює приблизно 6095, приблизно 7095 або приблизно 80 95 і верхнє значення інтервалу гомогенності дорівнює приблизно 70 95, приблизно 80 95 або більше ніж приблизно 90 95.
Якщо гомогенність пептидних кон'югатів складає не менше приблизно 90 95, їх чистота також переважно виражається інтервалом. Звичайно, нижнє значення інтервалу дорівнює приблизно 90 95, приблизно 92 95, приблизно 94 95, приблизно 96 956 або приблизно 98 95. Верхнє значення інтервалу чистоти дорівнює приблизно 92 95, приблизно 94 95, приблизно 96 95, приблизно 98 95 або приблизно 100 95. Чистоту пептидних кон'югатів звичайно визначають за допомогою одного або більше методів, відомих фахівцям у рівні техніки (наприклад, рідинна хроматографія -мас-спектрометрія (ІС-М5) або матрична лазерна десорбційна іонізаційна часопрогінна мас-спектрометрія (таїйгіх азв5івівй Іазег дезогріп таз5 те ої Підні зресіготеїгу, МАГОІТОРЕ), капілярний електрофорез і т. д.). "Достатньо однорідна глікоформа" або "достатньо однорідний патерн глікозилування" при описі глікопептиду означає відсоток акцепторних груп, глікозилованих глікозилтрансферазою, що розглядається (наприклад фукозилтрансферазою). Наприклад, у випадку (1,2-фукозилтрансферази, спостерігається достатньо однорідний патерн фукозилування, якщо в пептидному кон'югаті відповідно до винаходу практично всі (як визначено нижче) молекули СЗаїІр1,4-сісМАс-К і їх сіалізовані аналоги фукозиловані. У фукозилованих структурах, описаних нижче, зв'язок ЕБис-СІСМАс звичайно являє собою зв'язок а1,6 або а1,3, причому в загальному випадку переважним є зв'язок «1,6. Фахівцю в галузі техніки варто розуміти, що вихідний матеріал може містити глікозиловані акцепторні групи (наприклад, фукозиловані групи СаїЇВр1,4-СісМАс-К). Це означає, що обчислений відсоток глікозилування буде включати як акцепторні групи, глікозиловані способами згідно із даним винаходом, так і акцепторні групи, що знаходяться в глікозилованому стані у вихідному матеріалі.
Термін "достатньо" у вищенаведених визначеннях "достатньо однорідного" у загальному випадку означає, що глікозиловані щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 8095 або більш переважно щонайменше приблизно 9095 і ще більш переважно щонайменше приблизно 95 95 акцепторних груп даної глікозилтрансферази.
При описі заміщувальних груп за допомогою загальноприйнятих хімічних формул, формули, записані зліва направо, також поширюються на хімічно ідентичні заміщувальні групи, одержані при написанні формули справа наліво, тобто, наприклад, -СНгО- може бути також записане як -ОСН»-.
Якщо не зазначено інакше, термін "алкіл" окремо або в складі іншої заміщувальної групи означає прямий або розгалужений ланцюг, або циклічний вуглеводневий радикал, або їх комбінацію, який може бути повністю насиченим, моно- або поліненасиченим і може включати ди- і мультивалентні радикали, що містять зазначене число атомів вуглецю (тобто С1і-Сіо означає від одного до десяти атомів вуглецю). Приклади насичених вуглеводневих радикалів включають, але не обмежуються такими групами, як метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, трет-бутил, ізобутил, втор-бутил, циклогексил, циклогексилметил, циклопропілметил, гомологи й ізомери, наприклад, н-пентилу, н- гексилу, н-гептилу, н-октилу і т. д. Ненасиченою алкільною групою називається група, яка містить один або більше подвійних або потрійних зв'язків. Приклади ненасичених алкільних груп включають, але не обмежуються вінілом, 2-пропенілом, кротилом, 2-ізопентенілом, 2-бутадієнілом, 2,4-пентадієнілом, 3- (1,4-пентадієнілом), етинілом, 1- і З-пропінілом, З-бутинілом і вищими гомологами й ізомерами. Якщо не зазначено інакше, термін "алкіл" також включає алкільні похідні, більш детально описані нижче, такі як "гетероалкіли". Алкільні групи, що обмежується вуглеводневими групами, називаються "гомоалкіли".
Термін "алкілен" окремо або в складі іншої заміщувальної групи означає бівалентний радикал, одержаний з алкану, як видно з необмежуючого прикладу -СНаСН».СНоСН»о-, і далі включає "гетероалкіленові" групи, описані нижче. У загальному випадку алкільна (або алкіленова) група містить від 1 до 24 атомів вуглецю, при цьому для даного винаходу переважними є групи, що містять 10 або менше атомів вуглецю. "Нижчий алкіл" або "нижчий алкілен" означає алкільну або алкіленову групу з більш коротким ланцюгом, що звичайно містить 8 або менше атомів вуглецю.
Терміни "алкокси", "алкіламіно" і "алкілтіо" (або тіоалкокси) застосовуються у своєму загальноприйнятому розумінні й означають алкільні групи, приєднані до іншої частини молекули через атом кисню, аміногрупу або атом сірки, відповідно.
Термін "гетероалкіл" окремо або в комбінації з іншим терміном означає, якщо не зазначено інакше, стабільний лінійний або розгалужений ланцюг, або циклічний вуглеводневий радикал, або їх комбінацію, який містить зазначене число атомів вуглецю і щонайменше один гетероатом, вибраний із групи, що складає з 0, М, 5і і 5, де атоми азоту і сірки можуть необов'язково знаходитися в окисленій формі, і гетероатом азоту може необов'язково знаходитися в четвертинній формі. Гетероатом (гетероатоми) О, М, 5 і 5і можуть знаходитися в будь-якому внутрішньому положенні гетероалкільної групи або в положенні, у якому алкільна група приєднується до іншої частини молекули. Приклади включають, але не обмежуються -СН2»-СН2-О-СНз, -СН»-СНо-МН-СНз, -СН»-СНо-М(СНз)-СНз, -СНе-5-
Сно-СНз, -СН»-СНо-5(0)-СНз, -СН.-СНо-5(0)2-СНз, -СН-СН-О-СНз, -5(СНз)з, -СН-АСН-М-ОСН: і -
СнН-СнН-М(СНз)-СН»з. До двох гетероатомів можуть розташовуватися послідовно, наприклад, -СН2-МН-
ОСНз ії -СНо-0-54(СНз)з. Подібним чином, термін "гетероалкілен" окремо або в складі іншої заміщувальної групи означає бівалентний радикал, одержаний з гетероалкілу, як видно з необмежуючого прикладу -СН2-СНг-5-СН»-СНе- і -СН2-5-СН»-СНо-СНе-. У гетероалкіленових групах гетероатоми також можуть займати одне або обидва крайніх положення (наприклад, алкіленокси,
алкілендіокси, алкіленаміно, алкілендіаміно і т. д.). Далі, для алкіленових і гетероалкіленових зв'язувальних груп, напрямок запису формули зв'язувальної групи не визначає орієнтації зв'язувальної групи. Наприклад, формула -С(О)2В"- означає як -С(О)2НА-, так і -А'Є(О) 2-.
Термін "циклоалкіл" і "гетероциклоалкіл" окремо або в комбінації з іншими термінами означають, якщо не зазначено інакше, циклічні форми "алкілу" і "гетероалкілу" відповідно. Крім того, у циклоалкілі гетероатом може займати положення, у якому гетероцикл приєднаний до іншої частини молекули.
Приклади циклоалкілів включають, але не обмежуються циклопентилом, циклогексилом, 1- циклогексенілом, З-циклогексенілом, циклогептилом і т. д. Приклади гетероциклоалкілів включають, але не обмежуються /-1-(1,2,5,6-тетрагідропіридилом), 1-піперидинілом, 2-піперидинілом, 3- піперидинілом, 4-морфолінілом, З-морфолінілом, тетрагідрофуран-2-ілом, тетрагідрофуран-3-ілом, тетрагідротієн-2-ілом, тетрагідротієн-3-ілом, 1-піперазинілом, 2-піперазинілом і т.д.
Термін "гало" або "галоген" окремо або в складі іншої заміщувальної групи означає, якщо не зазначено інакше, атом фтору, хлору, брому або йоду. Крім того, терміни, такі як "галогеналкіл", включають моногалогеналкіл і полігалогеналкіл. Наприклад, термін "галоген(С1-Сл)алкіл" включає, але не обмежується трифторметилом, 2,2,2-трифторетилом, 4-хлорбутилом, З-бромопропілом і т. д.
Термін "арил" означає, якщо не зазначено інакше, поліненасичену ароматичну заміщувальну групу, яка може складатися з одного або декількох кілець (переважно від 1 до З кілець), конденсованих або ковалентно зв'язаних. Термін "гетероарил" означає арильні групи (або кільця), що містять від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з М, О і 5, де атоми азоту і сірки необов'язково знаходяться в окисленому стані, і атом (атоми) азоту необов'язково знаходяться в четвертинному стані.
Гетероарильна група може приєднуватися до іншої частини молекули через гетероатом. Необмежуючі приклади арильних і гетероарильних груп включають феніл, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-біфеніл, 1-піроліл, 2-піроліл, З-піроліл, З-піразоліл, 2-імідазоліл, 4-імідазоліл, піразиніл, 2-оксазоліл, 4-оксазоліл, 2-феніл- 4-оксазоліл, 5-оксазоліл, 3-ізоксазоліл, 4-ізоксазоліл, 5-ізоксазоліл, 2-тіазоліл, 4-тіазоліл, 5-тіазоліл, 2- фурил, З3-фурил, 2-тієніл, З-тієніл, 2-піридил, З-піридил, 4-піридил, 2-піримідил, 4-піримідил, 5- бензотіазоліл, пуриніл, 2-бензімідазоліл, 5-індоліл, 1-ізохіноліл, 5-ізохіноліл, 2-хіноксалініл, 5- хіноксалініл, З-хіноліл, тетразоліл, бензоГб|фураніл, бензої|бі|гієніл, 2,3-дигідробензо|1,4|діоксин-6-іл, бензо|1,З|діоксол-5-іл і б-хіноліл. Заміщувальні групи для кожної з зазначених кільцевих систем вибираються з групи прийнятних заміщувальних груп, описаних нижче.
Для стислості, при застосуванні терміна "арил" у комбінації з іншими термінами (наприклад, арилокси, арилтіокси, арилалкіл) термін включає як арильні, так і гетероарильні кільця, як визначено вище. Таким чином, термін "арилалкіл" включає радикали, де арильна група приєднана до алкільної групи (тобто бензил, фенетил, піридилметил і т. д.), включаючи алкільні групи, в яких атом вуглецю (наприклад, метиленова група) заміщений, наприклад, атомом кисню (наприклад, феноксиметил, 2- піридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропіл і т. д.).
Усі терміни, наведені вище (тобто "алкіл", "гетероалкіл", "арил" і "гетероарил"), включають як заміщену, так і незаміщену форму зазначеного радикала. Переважні заміщувальні групи для кожного з радикалів наведені нижче.
Заміщувальні групи для арильних і гетероарильних радикалів (включаючи групи, часто позначувані як алкілен, алкеніл, гетероалкілен, гетероалкеніл, алкініл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, циклоалкеніл і гетероциклоалкеніл) мають узагальнюючу назву "алкільні заміщувальні групи" і можуть являти собою одну або більше різних груп, вибраних з необмежуючого переліку: -ОВ', -0, -МВ" -М-ОВ', -МВА'В", - галоген, -5ІВ'В'В", -ОС(О)В', -С(О)В -СО2Н8, -СОМА'В", -ОС(О)МА В" -МА'Є(О)В -МА-С(О)МА В, -
МА'Є(О)28", -МА-С(МА'В'Я")-МА"" -МА-С(МА'В")-МА", -5(О)В -5(0)28, -5(0)2МА В", -«МАЗО»В", -СМ і -
МО», у кількості, що варіює від нуля до (2!т'-1), де т - сумарне число атомів вуглецю в кожному радикалі. Б, К", КК" її К"", кожен незалежно переважно означає водень, заміщений або незаміщений гетероалкіл, заміщений або незаміщений арил, наприклад, арил, заміщений 1-3 галогенами, заміщені або незаміщені алкільні, алкоксильні або тіоалкоксигрупи, або арилалкільні групи. Коли речовина відповідно до винаходу включає більше однієї К-групи, наприклад, кожна з К-груп вибирається незалежно, також як і кожна група з ЕК, К", Кі А", якщо присутньо більше однієї такої групи. Якщо К. і
Е" зв'язані з одним і тим самим атомом азоту, вони можуть комбінуватися з атомом азоту в 5-, 6- або 7--ленне кільце. Наприклад, -МАЕ'К" означає, але не обмежується 1-піролідинілом і 4-морфолінілом. З вищенаведеного обговорення заміщувальних груп фахівцю в галузі техніки ясно, що термін "алкіл" включає групи, які містять атоми вуглецю, зв'язані з групами, що відрізняються від атомів водню, такими, як галогеналкільні (наприклад, -СЕз і -СНоСЕз) і ацильні (наприклад, -С(О)СНз, -С(О)СЕ», -
С(О)СНоОС НН: і т. д.).
Так само, як заміщувальні групи, описані для алкільного радикала, заміщувальні групи для арильних і гетероарильних груп мають узагальнюючу назву "арильні заміщувальні групи".
Заміщувальні групи вибираються з, наприклад, галогену, -ОВ, -0, -МА, -М-ОВ, -МА'В", -58", - галогену, -5ІВ'В'В", -ОС(О)В -С(О)В -СО2Н8 -«СОМА' В", -ОС(О)МА' В", -МА'Є(О)В", -МААС(О)МА В, -
МА'Є(О)28", -«МА-С(МА'В'Я")-МА" -МА-С(МА'В") МА", -5(О)8", -5(0)28", -5(О)2МА В", -«МАЗО»В", -СМ і -
МО», -В", -Мз, -СН(РН)2, фтор(Сі-Са)алкокси і фтор(С:і-Са)алкіл, у кількості, що варіює від нуля до сумарного числа вільних валентностей ароматичного кільця, і де КК, К", К" ії К" кожен незалежно переважно означає водень, заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл, заміщений або незаміщений арил або заміщений або незаміщений гетероарил. Коли речовина відповідно до винаходу включає більше однієї К-групи, наприклад, кожна з К-груп вибирається незалежно, також як і кожна група з КК, К", "її КЕ", якщо присутньо більше однієї такої групи. У схемах, наведених нижче, символ Х означає "К", як описано вище.
Дві заміщувальні групи на сусідніх атомах арильного або гетероарильного кільця можуть бути необов'язково замінені заміщувальною групою вигляду -Т-С(О)-(САА)-О-, де Т ії О незалежно являють собою -МВ-, -О-, -СВВ'- або одинарний зв'язок, і и являє собою ціле число від 0 до 3. Як альтернатива, дві заміщувальні групи на сусідніх атомах арильного або гетероарильного кільця можуть необов'язково замінюватися заміщувальними групами вигляду -А-(СНег)-В-, де А і В незалежно являють собою -СВВ'-, -О-, -МВ-, -5-, -5(0)-, -5(0)2-, -50)2МА'- або одинарний зв'язок, а г означає ціле число від 1 до 4. Один з одинарних зв'язків знов утвореного кільця може необов'язково замінюватися подвійним зв'язком. Як альтернатива, дві заміщувальні групи на сусідніх атомах арильного або гетероарильного кільця можуть необов'язково замінюватися заміщувальними групами вигляду - (САВА) -Х-(СВ'В)а-, де 7 і й незалежно означають цілі числа від 0 до 3, а Х означає -О-, -МА", -5-, -
З(0)-, -50)2- або -5(0)2МА"-. Заміщувальні групи К, КК, К" ії К" переважно вибираються незалежно з водню або заміщеного або незаміщеного (С1-Св)алкілу.
При використанні в даній заявці термін "гетероатом" включає кисень (0), азот (М), сірку (5) і кремній (51). "Стовбурові клітини" означає "мультипотентні" або недиференційовані клітини, здатні до необмеженого самокопіювання і диференціювання в різні тканини тіла. Стовбурові клітини можуть диференціюватися в нормальні компоненти крові, включаючи червоні кров'яні клітини, білі кров'яні клітини і тромбоцити. Стовбурові клітини, як правило, локалізуються в кістковому мозку й у крові їі можуть бути витягнуті для трансплантації.
Термін "кровотворна клітина" означає клітину, пов'язану з утворенням клітин крові. Термін може застосовуватися взаємозаміно з визначеним вище терміном "стовбурові клітини".
При використанні в даній заявці термін "стимуляція продукції стовбурових клітин" включає всі процеси, які збільшують число стовбурових клітин іп мімо або іп міго. Більше число стовбурових клітин може бути обумовлене збільшенням числа клітин-попередників. Термін також включає процеси транспорту стовбурових клітин у кістковий мозок і з кісткового мозку.
Подібним чином, термін "стимуляція продукції кровотворних стовбурових клітин" включає всі процеси, які збільшують число кровотворних клітин іп мімо або іп міго. Більше число кровотворних клітин може бути обумовлене великою кількістю клітин-попередників, прискоренням дозрівання плюрипотентних стовбурових клітин у кровотворні клітини або їх комбінацією. Термін також включає процеси транспорту кровотворних клітин у кістковий мозок і з кісткового мозку.
Термін "гранулоцити" означає білі кров'яні клітини, для яких характерна присутність гранул у цитоплазмі.
Введення
Даний винахід охоплює способи введення глікопегильованого 5-С5Е з метою попередження, полегшення симптомів або лікування захворювань і станів, пов'язаних з дефіцитом кровотворення, часто обумовленим хіміотерапією, радіаційною терапією і тромбоцитопенією. 5-С5Е в основному діє на кістковий мозок, стимулюючи продукцію запальних лейкоцитів, і далі діє як ендокринний гормон, що ініціює заміщення нейтрофілів, вироблених у ході запальних функцій. 5-С5Е також знаходить застосування в клініці при заміні кісткового мозку після хіміотерапії.
У даному винаході представлений кон'югат, що містить гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (5-С5Е). Даний винахід також поширюється на кон'югати, що містять глікозиловані і неглікозиловані пептиди, які мають стимулюючу активність гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора. Кон'югати можуть бути додатково модифіковані подальшою кон'югацією з різними молекулами, такими як лікарські речовини, діагностичні речовини, спрямовуючі речовини і т.д. У кон'югатах 5-С5Е, описаних у даній заявці, до глікозильного або амінокислотного залишку в складі пептиду 5-СЗЕ може бути ковалентно приєднана полімерна модифікуюча група переважно за допомогою глікозильної зв'язувальної групи. У зразковому втіленні полімерна модифікуюча група являє собою водорозчинний полімер. В подальшому переважному втіленні водорозчинний полімер являє собою полієтиленгліколь.
У зразкових втіленнях пептид 5-С5Е відповідно до винаходу може вводитися пацієнту з метою попередження інфекції у онкологічних хворих, які проходять радіаційну терапію, хіміотерапію і пересадження кісткового мозку, з метою мобілізації клітин-попередників для збирання при трансплантації клітин-попередників з периферичної крові, для лікування важкої хронічної або відносної лейкопенії незалежно від її причини, і для підтримуючої терапії пацієнтів з гострою мієлоїдною лейкемією. Крім того, поліпептидні кон'югати або композиції відповідно до винаходу можуть використовуватися для терапії СНІДу або інших імунодефіцитних захворювань, а також бактеріальних інфекцій, захворювання серця і гепатитів А, В і С.
В одному втіленні пептидний кон'югат з-С5Е відповідно до винаходу може вводитися суб'єкту для підвищення гематопоезу. Гематопоезом називається процес, у ході якого клітини-попередники розвиваються в зрілі клітини крові, включаючи червоні кров'яні клітини, білі кров'яні клітини і тромбоцити. Нормальний гематопоез координується дією різних регуляторів, включаючи глікопротеїни, такі як колонієстимулюючі фактори. Ці регулятори модулюють виживання, проліферацію і диференціювання стовбурових клітин і клітин-попередників і стан активації зрілих клітин. Порушення гематопоезу приводить до зниження продукції клітин крові і тромбоцитів, що веде до зниження імунітету і неможливості загоєння ран і боротьби з інфекціями.
У даному винаході представлені способи і композиції для стимуляції гематопоезу у суб'єкта.
Способи відповідно до винаходу включають стадію введення суб'єкту ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи.
В одному аспекті стимуляція гематопоезу включає збільшення числа кровотворних клітин- попередників у суб'єкта, що приводить також до підвищення зрілих кровотворних клітин (клітин крові).
Кровотворні клітини-попередники переміщаються і затримуються в кістковому мозку, де вони дозрівають і перетворюються в червоні і білі кров'яні клітини. Способи стимулювання числа кровотворних клітин-попередників відповідно до винаходу включають стадію введення суб'єкту ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В одному втіленні застосування пептиду збільшує число кровотворних клітин- попередників, які являють собою СОЗ4-- клітини.
Мієлосупресія
Мієлосупресія являє собою зменшення продукції клітин крові. Нормальна кров містить велику кількість клітин, включаючи червоні кров'яні клітини, що переносять кисень, і білі кров'яні клітини, що борються з інфекціями. Нормальна кров також містить тромбоцити, крихітні фрагменти клітин, які запускають процес зсідання крові. Ці клітини і фрагменти клітин походять з кісткового мозку, речовини, що знаходиться усередині деяких кісток. Здоровий кістковий мозок щодня продукує велику кількість червоних кров'яних клітин, білих кров'яних клітин і тромбоцитів. При мієлосупресії кістковий мозок продукує занадто мало таких клітин. У даному винаході представлені способи і композиції для лікування, полегшення симптомів і попередження мієлосупресії.
Однією з характерних рис мієлосупресії є пригнічення продукції білих кров'яних клітин у суб'єкта.
Це пригнічення продукції білих кров'яних клітин може бути обумовлене деякими видами терапії, особливо протипухлинної терапії, такими як хіміотерапія і радіаційна терапія. Пригнічення продукції білих кров'яних клітин також може бути обумовлене захворюваннями, такими як ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура. В одному аспекті кон'югати відповідно до винаходу використовуються для лікування і полегшення захворювань, які характеризуються порушенням продукції білих кров'яних клітин.
Захворювання, обумовлені мієлосупресією, включають нейтропенію (включаючи фебрильну нейтропенію) і тромбоцитопенію. Нейтропенія являє собою захворювання, яке характеризується ненормальним зниженням числа нейтрофілів у крові (найбільш поширеного типу білих кров'яних клітин). Зниження може бути відносним або абсолютним. В одному аспекті, у даному винаході представлені способи лікування нейтропенії у ссавця. Ці способи включають стадії введення фармацевтично ефективної кількості кон'югатів (3-С5Е відповідно до винаходу. Було показано, що о-
С5Е впливає на фебрильну нейтропенію і смертність серед дорослих онкологічних хворих (Киадегег еї аї., У. СіІїй. Опе. (2007), 25(21):3158-67).
Тромбоцитопенія являє собою захворювання, при якому число тромбоцитів у крові ненормально низьке; для цього захворювання часто характерні ненормальні кровотечі. Способи відповідно до винаходу включають терапії тромбоцитопенії у ссавців. Ці способи включають стадії введення фармацевтично ефективної кількості кон'югатів 5-С5Е відповідно до винаходу. При використанні в даній заявці термін "тромбоцитопенія" охоплює як захворювання відомої етіології, так і ідіопатичну тромбоцитопенію. Тромбоцитопенія і ідіопатична тромбоцитопенія також називаються в даній заявці "тгромбоцитопенічна пурпура" і "ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура".
Стимуляція стовбурових клітин
Один спосіб подолання мієлосупресії полягає в стимуляції продукції стовбурових клітин.
Стимуляція продукції стовбурових клітин включає збільшення числа стовбурових клітин, включаючи число кровотворних клітин-попередників, і числа гранулоцитів, включаючи нейтрофіли і еозинофіли.
Стимуляція продукції стовбурових клітин також включає посилений транспорт стовбурових клітин з кісткового мозку в периферичну кров. Така стимуляція полегшує забір стовбурових клітин у донора, оскільки периферична кров більш легкодоступна, ніж кістковий мозок. В одному аспекті, у даному винаході представлені способи стимуляції продукції стовбурових клітин у суб'єкта.
В іншому аспекті попередження, полегшення симптомів і лікування мієлосупресії досягається за рахунок використання способів і композицій відповідно до винаходу шляхом стимуляції кровотворних клітин-попередників у суб'єкта. Стимуляція кровотворних клітин-попередників включає як збільшення числа кровотворних клітин-попередників, так і посилений транспорт кровотворних клітин-попередників у кістковий мозок і з кісткового мозку.
Кровотворні клітини-попередники, такі як клітини СОЗ4ж-, дозрівають і диференціюються в компоненти крові, а саме у червоні і білі кров'яні клітини. У даному винаході представлені способи стимуляції кровотворних клітин-попередників у суб'єкта, які включають стадію введення суб'єкту: (1) першої композиції, що містить компонент, який має формулу 1,1-П1,4-феніленбіс-(метилен)-біс- 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан (АМОЗ100), і (2) другої композиції, що містить пептид, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду 5-С5Е і полімерної модифікуючої групи. В одному втіленні першу і другу композиції вводять суб'єкту послідовно в будь-якому порядку. В іншому втіленні першу і другу композиції вводять суб'єкту одночасно. В одному втіленні обидві композиції вводять суб'єкту підшкірно.
АМОЗ3100 являє собою біцикламове похідне, здатне мобілізувати велике число клітин СОЗ4ж у кровотік як у здорових суб'єктів, так і у онкологічних хворих, як було показано в роботах І ев еї аї.,
Віоса, (2003), 102:2728-30; Оеміпе єї аї., у. СіІйп. Опсої, (2004), 22:1095-1102. Також дослідження показали, що комбінація АМОЗ3100 і неглікозилованої форми 5-С5Е здатна мобілізувати більше число клітин СОЗ4-- у кровотік, ніж один 5-С5Е (Ріотепбего евї аї., Віосад, (2005), 106(5): 1867-1874).
В одному втіленні продукція стовбурових клітин стимулюється у суб'єкта, який служить донором кісткового мозку або кровотворних клітин. Донор одержує пептидний кон'югат, описаний вище.
Кількість стовбурових клітин у донора підвищується, і ці стовбурові клітини виходять з кісткового мозку в периферичну кров. Такі клітини потім легко виділяються з крові донора за допомогою методів, відомих з рівня техніки. У таких втіленнях донор і реципієнт кісткового мозку або кровотворних клітин можуть бути однією і тією самою особою (аутологічний донор) або донором може бути суб'єкт, який не є реципієнтом (алогенний донор).
В іншому аспекті пептидні кон'югати відповідно до винаходу комбінуються з щонайменше одним хіміотерапевтичним агентом.
Трансплантати кісткового мозку
У деяких аспектах у даному винаході представлені способи і композиції для стимуляції продукції стовбурових клітин у реципієнта трансплантата кісткового мозку. Ці способи включають стадію введення реципієнту деякої кількості пептиду, який являє собою кон'югат пептиду 5-С5БЕ і полімерної модифікуючої групи. В одному втіленні полімерна модифікуюча група являє собою водорозчинний полімер, який може бути ковалентно зв'язаний з пептидом С-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду (-С5Е, переважно за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи. Пептид може вводитися реципієнту перед трансплантацією кісткового мозку, після трансплантації або одночасно з трансплантацією.
Успіх трансплантації визначає тривале приживлення трансплантата. Термін "приживлення" означає процес, у ході якого інфузовані або пересаджені донорські стовбурові клітини направляються в кістковий мозок реципієнта і продукують клітини крові всіх типів. Першою ознакою приживлення є поява в крові реципієнта нових білих клітин, червоних клітин і тромбоцитів після пересадження стовбурових клітин. Тривале приживлення трансплантата означає процес, у ході якого інфузовані або пересаджені донорські стовбурові клітини залишаються в кістковому мозку реципієнта і продукують клітини крові протягом тривалого періоду часу без відторгнення імунною системою реципієнта. При включенні в трансплантат середніх і пізніх клітин- попередників прискорюється продукція зрілих клітин донорського походження і підтримується процес приживлення.
Відповідно до вищесказаного, у даному винаході представлені способи і композиції, які підвищують тривале приживлення трансплантата кісткового мозку, одержаного реципієнтом. В одному зразковому втіленні пептид відповідно до винаходу вводять донору до трансплантації кісткового мозку. Пептид стимулює гематопоез у донора зокрема за рахунок збільшення кількості клітин- попередників, які збільшує імовірність успішного і тривалого приживлення при пересадженні кісткового мозку і/або кровотворних клітин реципієнту. Пересаджений кістковий мозок може належати самому реципієнту (аутологічний трансплантат) або кістковий мозок може бути пересаджений від донора того ж біологічного виду (алогенний трансплантат).
В іншому втіленні пептид відповідно до винаходу вводять реципієнту кісткового мозку з метою підвищення тривалого приживлення трансплантата донорського кісткового мозку, одержаного від самого реципієнта або іншого суб'єкта. Одержання пептиду реципієнтом може стимулювати гематопоез у реципієнта, що підвищує імовірність приживлення трансплантата шляхом стимуляції продукції кровотворних клітин-попередників донорським кістковим мозком.
Трансплантати кровотворних клітин
Трансплантація кровотворних клітин є загальноприйнятим способом лікування різних спадкових або злоякісних захворювань. У той час, як при деяких процедурах трансплантації використовують усю популяцію клітин кісткового мозку, при інших процедурах використовують більш вузькі популяції, збагачені стовбуровими клітинами. Крім кісткового мозку, такі клітини можуть бути одержані з інших джерел, таких як периферична кров і пуповинна кров немовлят. Одна з переваг використання стовбурових клітин з периферичної крові полягає в тому, що такі клітини значно легше витягти з периферичної крові, ніж з кісткового мозку. Однак, мала кількість плюрипотентних клітин/клітин- попередників у кровотоці є лімітуючим фактором для трансплантації стовбурових клітин з периферичної крові. Таким чином, для використання в трансплантації необхідно збільшити число стовбурових клітин ех мімо.
Згідно зі сказаним, у даному винаході представлені способи збільшення числа стовбурових клітин у культурі. У зразковому втіленні такі способи включають додавання ефективної кількості пептиду відповідно до винаходу в культуру кровотворних клітин. У зразковому втіленні такий пептид являє собою кон'югат пептиду 5-С5ЗЕ і полімерної модифікуючої групи. В одному втіленні полімерна модифікуюча група являє собою водорозчинний полімер, який може бути ковалентно приєднаний до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е, переважно за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи. В одному втіленні, у даному винаході представлені способи одержання збільшених популяцій стовбурових клітин і клітин-попередників, які можуть використовуватися для трансплантації. Ці способи включають стадію додавання до культури стовбурових клітин ефективної кількості пептиду відповідно до винаходу.
Трансплантати органів
Так само, як і трансплантати кісткового мозку, транспланти солідних органів, таких як печінка, нирка, серце і легеня можуть викликати різні імунні реакції у реципієнта. Такі імунні реакції можуть приводити до гострого відторгнення цих трансплантатів. 5-С5Е і інші гематопоетичні фактори росту можуть використовуватися для терапії таких відповідей (дивіться патент США Мо 5718893). Відповідно, способи і композиції згідно із даним винаходом можуть використовуватися для попередження або зменшення імовірності розвитку гострого відторгнення трансплантатів органів у пацієнта.
Серцеве захворювання
В одному втіленні способи і композиції згідно із даним винаходом можуть використовуватися для полегшення перебігу серцевого захворювання і поліпшення функціонування серця. В одному втіленні способи і композиції відповідно до винаходу використовуються для стимуляції вивільнення стовбурових клітин, що формують судини. Терапія 5-С5Е може послабляти стенокардію у пацієнтів із серцевим захворюванням, включаючи пацієнтів після численних операцій і пацієнтів, що приймають максимальні дози стандартних лікарських препаратів (дивіться, наприклад, Медіса! Мемуз Тодау, Уипе 4, 2007, "Бемеге Неагі Оізеазе Раїйєпіз ОПйегей Мем Норе"). Інші дослідження показали, що 5-С5Е здатний захистити серцеві м'язи, що попереджує їх смерть, навіть якщо м'язи були пошкоджені серцевим захворюванням (дивіться, наприклад, Зипаау ТеІедгарпй Мем/5, АчЧдиві 5, 2007, "ОСиг УМопа-
Тігвї Неапіз Ійаї Рераїг Тнетвзе/мев"). (4-С5ЗЕ окремо або в комбінації зі зрілими стовбуровими клітинами пацієнтів може використовуватися в ході лікування для заміщення мертвих серцевих тканин і утворення нових кровоносних судин.
Неврологічні захворювання
В одному втіленні способи і композиції відповідно до винаходу можуть використовуватися для лікування неврологічних захворювань, включаючи без обмеження хворобу Альцгеймера й інші дегенеративні захворювання мозку. Дослідження хвороби Альцгеймера на мишачих моделях показали, що в цих моделях 5-С5Е може обернути симптоми, подібні до хвороби Альцгеймера (дивіться Тзаї еї аї., (2007), 9. Ехр. Меа. 204(6): 1273-80). Ці дослідження показали, що ін'єкція 5-С5Е у кровотік стимулює вихід кровотворних клітин з кісткового мозку. Ці стовбурові клітини надходять із кровотоку в мозок, де вони прикріплюються до місць пошкоджень і диференціюються в нові клітини.
Застосування 5-С5Е приводить до росту нових клітин у місцях найбільших пошкоджень нейронів.
Кон'югати С-СО5Е
Згідно зі способами, згаданими вище, пептид являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і полімерної модифікуючої групи. Полімерна модифікуюча група може ковалентно приєднуватися до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е, переважно за допомогою глікозильної зв'язувальної групи. В одному втіленні глікозильна зв'язувальна група являє собою інтактну глікозильну зв'язувальну групу. У переважних втіленнях полімерна модифікуюча група і глікозильна зв'язувальна група ковалентно приєднані за допомогою лінкера. У зразковому втіленні полімерна модифікуюча група являє собою водорозчинний полімер, такий як поліетиленгліколь. а-С5Е був клонований і секвенований. У зразковому втіленні амінокислотна послідовність 5-С5Е відповідає ЗЕО ІЮО МО:1. Фахівцю в галузі техніки очевидно, що даний винахід не обмежується послідовностями, наведеними в даній заявці.
Даний винахід також поширюється на варіанти 5-С5БЕ, відомі з рівня техніки. Як приклад, ніяким чином не обмежуючий даний винахід, можна навести варіант 5-С5Е, описаний у патенті США Мо 6166183, де описується 5-С5Е, який складається з природної сукупності лізинових залишків, далі зв'язаний з однієї або двома молекулами полієтиленгліколю. Крім того, у патентах США МоМо 6004548, 5580755, 5582823 і 5676941 описується варіант 5-С5Е, у якому один або більше цистеїнових залишків у положеннях 17, 36, 42, 64 і 74 замінені на аланін або серин. У патенті США Мо 5416195 описана молекула О-С5БЕ, в якій цистеїн у положенні 17, аспартат у положенні 27 і серини в положеннях 565 і 66 замінені на серин, серин, пролін і пролін відповідно. З рівня техніки відомі й інші варіанти, описані, наприклад, у патенті США Мо 5399345. Додаткові варіанти мають амінокислотну послідовність, вибирану з ЗЕО ІЮ МО:3-11.
Експресія й активність модифікованої молекули 5-С5Е згідно із даним винаходом може бути визначена за допомогою способів, добре відомих з рівня техніки, як описано, наприклад, у патенті
США Мо 4810643. Наприклад, активність можна виміряти за допомогою аналізу включення тимідину, позначеного радіоактивною міткою. Коротко, кістковий мозок від здорових донорів розділяють по густині в РісоП-Нурадце (1,077 г/мл, Рпаппасіа, Різсаїажау, МУ), ії клітини з низькою густиною суспендують у середовищі Ізсоме (СІВСО, І а ХдоПа, СА), яке містить 10 956 фетальної сироватки теляти, глутамін і антибіотики. Приблизно 2х1027 клітин кісткового мозку людини інкубують у контрольному середовищі або з додаванням О-С5БЕ згідно із даним винаходом в 96-ямкових планшетах із плоским дном при приблизно 37 "С, 5 95 СО» у повітрі протягом приблизно 2 діб. Культурам дають імпульсну мітку у вигляді 0,5 мкККюрі на ямку ЗН-тимідину протягом приблизно 4 годин (Мем/ Епдіапа Мисієаг,
Во5іоп, Ма55.) і вимірюють включення мітки, як описано, наприклад, у роботі Мепіца, єї а!. (1983, Віоса 61:781). Більш сильне включення ЗН-тимідину клітинами кісткового мозку людини в порівнянні з клітинами кісткового мозку в присутності контрольної речовини є показником активності і життєздатності речовини 5-С5Е.
Кон'югати відповідно до винаходу утворюються шляхом ферментативного приєднання модифікованого цукру до глікозилованого або неглікозилованого пептиду 5-С5Е. Модифікований цукор, розташований між пептидом 5-С5Е і модифікуючою групою на цукрі в даній заявці може називатися, наприклад, "інтактною глікозильною зв'язувальною групою". Використовуючи виняткову селективність ферментів, таких як глікозилтрансферази, даний винахід дозволяє одержати пептиди, які несуть бажану групу в одному або більше визначених положеннях. Таким чином, відповідно до даного винаходу модифікований цукор приєднується прямо до вибраного локусу на пептидному ланцюгу С-С5Е або, як альтернатива, модифікований цукор додається до вуглеводної групи поліпептиду. Пептиди, у яких модифіковані цукри приєднуються як до вуглеводу в складі глікопептиду, так і прямо до амінокислотного залишку, що входить до складу поліпептидного ланцюга 5-С5Е, також охоплюються даним винаходом.
На відміну від відомих хімічних і ферментативних стратегій удосконалювання пептиду, способи відповідно до винаходу можливо використовувати для збирання пептидів і глікопептидів, що мають практично гомогенний патерн дериватизації; ферменти, використовувані відповідно до даного винаходу, загалом селективні відносно визначеного амінокислотного залишку або комбінації амінокислотних залишків у складі пептиду 5-С5Е. Такі методи також можуть застосовуватися до великомасштабного виробництва модифікованих пептидів і глікопептидів. Таким чином, способи відповідно до винаходу надають практичний засіб для великомасштабного виробництва глікопептидів з попередньо вибраними патернами дериватизації. Ці способи особливо добре застосовні для модифікації лікарських пептидів, включаючи, але не обмежуючись глікопептидами, глікозилованими не повністю у ході їх продукції в клітинній системі (наприклад, клітини ссавців, комах, рослин, грибів, дріжджів або прокаріотичні клітини) або в трансгенних рослинах або тваринах.
У даному винаході також представлені кон'югати глікозилованих або неглікозилованих пептидів с-
С5Е зі збільшеним терапевтичним часом напівжиття завдяки, наприклад, зниженій швидкості кліренсу або зниженій швидкості поглинання імунною або ретикулоендотеліальною системою (КЕ5). Крім того, способи відповідно до винаходу надають можливість маскування антигенних детермінант на пептидах, що послабляє або відміняє імунну реакцію хазяїна на пептид. Селективне приєднання спрямовуючих агентів також може використовуватися для спрямування пептиду у визначену тканину або до визначеного рецептора на поверхні клітини, специфічного для даного спрямовуючого агента.
В одному втіленні, у даному винаході представлений кон'югат вибраної модифікуючої групи і пептиду 5-С5Е. Місток між пептидом і модифікуючою групою включає глікозильну зв'язувальну групу, розташовану між пептидом і вибраною групою. Як обговорюється в даній заявці, вибрана модифікуюча група загалом являє собою будь-яку групу, яка може приєднуватися до сахаридної одиниці, з утворенням "модифікованого цукру", упізнаваного відповідним ферментом-трансферазою, що приєднує модифікований цукор до пептиду або глікозильного залишку на пептиді. При вставленні між пептидом і вибраною групою сахаридний компонент модифікованого цукру стає "глікозильною зв'язувальною групою", наприклад, "інтактною глікозильною зв'язувальною групою". Глікозильна зв'язувальна група утворюється з будь-якого моно- або олігосахариду, який після модифікації модифікуючою групою являє собою субстрат для ферменту, що додає модифікований цукор до амінокислотного або глікозильного залишку в складі пептиду.
Глікозидна зв'язувальна група може являти собою або включати сахаридну групу, що модифікується з порушенням структури до або під час додавання модифікуючої групи. Наприклад, глікозильна зв'язувальна група може бути одержана із сахаридного залишку, одержуваного шляхом окислювальної деградації інтактного сахариду до відповідного альдегіду, наприклад, за допомогою метаперйодату, і далі перетворюваного в основу Шиффа з відповідним аміном, яка потім відновлюється до відповідного аміну.
Кон'югати відповідно до винаходу звичайно мають наступну загальну структуру: / х ц х
Х ; ть иа де символи а, Б, с, й і 5 означають позитивні цілі числа, відмінні від нуля; а ї означає нуль або позитивне ціле число. "Агент" звичайно являє собою водорозчинну групу, наприклад, РЕО-групу.
Лінкер може являти собою будь-яку з множини зв'язувальних груп (дивіться нижче). Як альтернатива, лінкер може являти собою одинарний зв'язок або "лінкер нульового порядку".
Модифікуючі групи можуть являти собою, як обговорюється далі в даній заявці, будь-яку групу, приєднувану до сахаридної одиниці. Такі групи включають полімери, включаючи водорозчинні і водонерозчинні полімери, а також можуть включати лікарські речовини, діагностичні речовини, спрямовуючі речовини, токсичні речовини і т. д. У зразковому втіленні модифікуюча група являє собою водорозчинний полімер, наприклад, т-РЕС. Водорозчинний полімер ковалентно приєднується до пептиду С-С5Е за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, ковалентно зв'язаної з амінокислотним або глікозильним залишком у складі пептиду С-С5Е. У даному винаході також представлені кон'югати, у яких амінокислотний залишок і глікозильний залишок модифіковані глікозильною зв'язувальною групою.
Пептиди згідно із даним винаходом містять щонайменше один М- або О-зв'язаний сайт глікозилування. На доповнення до представлення кон'югатів, утворених за допомогою ферментативного приєднання глікозильної зв'язувальної групи, у даному винаході представлені кон'югати з високогомогенним патерном замін. Використовуючи способи відповідно до винаходу, можливо утворювати пептидні кон'югати, в яких практично всі модифіковані цукри в популяції кон'югатів відповідно до винаходу приєднані до множинних копій амінокислотного або глікозильного залишку з ідентичною структурою. Таким чином, в одному аспекті, у даному винаході представлений пептидний кон'югат, що містить популяцію водорозчинних полімерних молекул, ковалентно зв'язаних з пептидом 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи. У зразковому втіленні кон'югата відповідно до винаходу практично кожен представник популяції водорозчинних полімерних молекул зв'язаний за допомогою глікозильної зв'язувальної групи з глікозильним залишком у складі пептиду 5-С9РЕ, а всі глікозильні залишки в складі пептиду 5-С5Е, до яких приєднані глікозильні зв'язувальні групи, мають однакові структури.
Також представлений пептидний кон'югат, у якому популяція водорозчинних полімерних молекул зв'язана з ним за допомогою глікозидної зв'язувальної групи. В одному втіленні практично кожен представник популяції водорозчинних полімерних молекул зв'язаний за допомогою глікозильної зв'язувальної групи з амінокислотним залишком у складі пептиду О-С5БЕ, а всі амінокислотні залишки в складі пептиду С-С5Е, до яких приєднані глікозильні зв'язувальні групи, мають однакові структури.
У даному винаході також представлені кон'югати, аналогічні описаним вище, у яких пептид 5-С5Е кон'югований з лікарським фрагментом, діагностичним фрагментом, націлювальним фрагментом, фрагментом токсину і т. д. через інтактну глікозильну зв'язувальну групу. Кожний з перерахованих вище фрагментів може бути малою молекулою, природним полімером (наприклад, поліпептидом) або синтетичним полімером.
Модифіковані цукри
У даному винаході представлені модифіковані цукри, модифіковані нуклеотидні цукри, і кон'югати модифікованих цукрів. У модифікованих цурках відповідно до винаходу цукрова група переважно являє собою сахарид, дезоксисахарид, аміносахарид або М-ацилсахарид. Термін "сахарид" і еквівалентні йому терміни "сахарил", "цукор" ії "глікозил" означає мономери, димери, олігомери і полімери. Цукрову групу також функціоналізують модифікуючою групою. Модифікуючу групу кон'югують з цукровою групою, звичайно шляхом кон'югування з аміно-, сульфгідрильною або гідроксильною, наприклад, первинною гідроксильною, групою на вуглеводному залишку. У зразковому втіленні модифікуюча група приєднується за допомогою аміногрупи в складі цукру, наприклад, через амід, уретан або сечовину, що утворюються в результаті реакції аміну з реактивним похідним модифікуючої групи.
Як цукровий кістяк кон'югатів відповідно до винаходу може використовуватися будь-який цукор.
Типові цукрові кістяки, застосовні для одержання композицій відповідно до винаходу, включають, але не обмежуються глюкозою, галактозою, манозою, фукозою і сіаловою кислотою. Інші застосовні цукри включають аміноцукри, такі як глюкозамін, галактозамін, манозамін, 5-амінний аналог сіалової кислоти й інші. Цукровий кістяк може являти собою структуру, яка зустрічається в природі, або він може бути модифікований і містити сайт для кон'югування з модифікуючою групою. Наприклад, в одному втіленні в даному винаході представлений пептидний кон'югат, який містить похідне сіалової кислоти, у якому 9-гідроксильна група замінена на амін. Амін легко дериватизується активованим аналогом вибраної модифікуючої групи.
Глікозильні зв'язувальні групи
Відповідно до пептидних кон'югатів відповідно до кожного з вищеописаних способів, деякі втілення пептидних кон'югатів включають глікозильну зв'язувальну групу, яка являє собою залишок сіалової кислоти.
Місток між пептидом 5-С5Е і вибраною речовиною, такою як водорозчинний полімер, включає інтактну глікозильну зв'язувальну групу, розташовану між пептидом і вибраною речовиною. Як обговорюється в даній заявці, вибрана речовина являє собою практично будь-яку молекулу, яка приєднується до сахаридної одиниці, що приводить до одержання "модифікованого цукру", який розпізнається відповідним ферментом-трансферазою, що приєднує модифікований цукор до пептиду а-С5Б. Сахаридний компонент модифікованого цукру, що розташовується між пептидом О-С5БЕ і вибраною речовиною, називається "інтактною глікозильною зв'язувальною групою". Глікозильна зв'язувальна група може бути утворена будь-яким моно- або олігосахаридом, який після модифікації вибраною речовиною являє собою субстрат відповідної трансферази.
В одному втіленні глікозильна зв'язувальна група являє собою залишок сіалової кислоти, структура якого наведена на формулі: со
НО чі он о в--нми ОН де К означає водорозчинний полімер, і водорозчинний полімер приєднаний до залишку сіалової кислоти за допомогою вищезгаданого лінкера.
В іншому втіленні глікозильна зв'язувальна група являє собою залишок сіалової кислоти, структура якого наведена на формулі:
СОУ но он 9 пед нн ; ! "он ! яко я о : р нн н. как Зо х ну п (6: де п означає ціле число від 1 до 2000.
Ще в одному втіленні глікозильна зв'язувальна група являє собою модифікований залишок сіалової кислоти, структура якого наведена на формулі:
Он ще
ОН. ще я. Бо в'я-х | о в А х що "МН "да ді!ї-х4 ді де Кг? являє собою Н, СНгОВ", СООВ" або ОБ", де
В" означає Н, заміщений або незаміщений алкіл або заміщений або незаміщений гетероалкіл;
ВЗ ї Е" незалежно вибрані з Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, ОБ8, МНОС(О) РУ, де
ВВ ї Е? незалежно вибрані з Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, заміщеного або незаміщеного гетероалкілу або сіалової кислоти;
Іа означає лінкер, вибраний зі зв'язку, заміщеного або незаміщеного алкілу і заміщеного або незаміщеного гетероалкілу;
В'бї К"7 означають незалежно вибрані полімерні "плечі";
Хг і Х" означають незалежно вибрані зв'язувальні фрагменти, які з'єднують полімерні групи К' ї
В" ізс;і
Х? являє собою нереактивну групу.
В подальшому втіленні амінокислотний залишок вибирається із серину або треоніну. У ще одному подальшому втіленні амінокислотний залишок являє собою треонін у положенні 133 ЗЕО ІО МО:1.
В одному втіленні глікозильна зв'язувальна група містить субструктуру, вибрану з: 2----бамдо--- баня баню бадуввнви і . де КЕ"? означає модифікований залишок сіалової кислоти; і р означає ціле число від 1 до 10.
В подальшому втіленні глікозильна зв'язувальна група має формулу, вибрану з: т (Боєх уп вісмлс ваду пек ттвюваєтт
ДЯ май .
У Її їкису ї"
МтчемАЄТТВНАєТТ ля Мап-ня (бісмМАєнтоайютт, т (Енв), г (бісмАєттоав ит У пон
А Мапенн (ФіОМАс--Оайдуть
Мап-т (СіоМАєттоВуВ т (ЕБвсх
ГО. ! пан «пли | . до
Майн (ЗіюмАЄ- Зайти тя
Маг (ВіСМАс-Оайу ВУ
ГТ (гнс),
АА---СісмАс--ЗібмАЄ--Мап-(СіЄМАс вай? ля | ШИ 7 (СМАстт байт (ОісмАст байт? де
АА означає амінокислотний залишок зазначеного пептиду;
Ї означає ціле число, яке дорівнює 0 або 1; р означає ціле число від 1 до 10; і
В'» вибирається з Н, ОН, сіалової кислоти, зазначеного модифікованого сіалільного залишку і 5іа- зіає, де біар означає зазначений сіалільний залишок, де щонайменше один К"" вибирається з зазначеного модифікованого сіалільного залишку і Зіа-
Зіар. В одному втіленні амінокислотний залишок являє собою аспарагіновий залишок.
В іншому втіленні зазначений пептид 5-С5Е має структуру, представлену на формулі: й 2-тва рено памАст (рануттяаРЕв де 4 дорівнює 0 або 1; і Зіа-РЕС має структуру, наведену на формулі:
СО
НО : он 7 то... нн 8. о І оофорит нт п ! ів; з де п означає ціле число від 1 до 2000. В подальшому втіленні п означає ціле число від 400 до 500.
У ще одному подальшому втіленні пептид 5-С5Е має амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ
МО:1.
В обговоренні, наведеному нижче, винахід проілюстрований за допомогою посилання на застосування вибраних похідних сіалової кислоти. Фахівцю в галузі техніки ясно, що метою обговорення є ясність ілюстрації, і що пропоновані структури і композиції в цілому застосовні до всього класу сахаридних груп, модифікованих сахаридних груп, активованих модифікованих сахаридних груп і кон'югатів модифікованих сахаридних груп.
У зразковому втіленні в даному винаході представлений пептидний кон'югат, що містить модифікований амін цукру, структура якого наведена на формулі: (
МнНА- НВ де С означає глікозильну групу, Ї означає зв'язок або лінкер, а КЕ! означає модифікуючу групу.
Типовими зв'язками є зв'язки між МНео-групою глікозильної групи і групою з комплементарною реактивністю на модифікуючій групі. Таким чином, зразкові зв'язки включають, але не обмежуються
МНА", ОВ", БЕ: і т. д. Наприклад, якщо К!' містить карбоксильну групу, ця група може бути активована і зв'язана з групою МН» на глікозильному залишку, що дає зв'язок зі структурою МНС(ОК'. Подібним чином, ОН- і 5Н-групи можуть перетворюватися у відповідні ефірні або тіоефірні похідні.
Зразкові лінкери включають алкільні і гетероалкільні групи. Лінкери включають зв'язувальні групи, наприклад, зв'язувальні групи на основі ацилів, наприклад, -С(О)МН-, -ОС(О)МН- і т. д. Зв'язувальні групи являють собою зв'язки між компонентами, що належать до різних груп відповідно до винаходу, наприклад, між глікозильним залишком і лінкером (І) або між лінкером і модифікуючою групою (К').
Інші зв'язувальні групи являють собою ефіри, тіоефіри й аміни. Наприклад, в одному втіленні, лінкер являє собою амінокислотний залишок, такий як залишок гліцину. Карбоксильна група гліцину перетворюється у відповідний амід у ході реакції з аміном на глікозильному залишку, а амін гліцину перетворюється у відповідний амід або уретан в результаті реакції з активованою карбоксикислотою або карбонатом модифікуючої групи.
Ще одним зразковим лінкером є РЕО-група або РЕС-група, функціоналізована амінокислотним залишком. РЕС зв'язується з глікозильною групою через амінокислотний залишок на одному кінці молекули РЕС і з ЕК" через інший кінець молекули РЕС. Як альтернатива, амінокислотний залишок може зв'язуватися з К', а кінець РЕС, не зв'язаний з амінокислотним залишком, - із глікозильною групою.
Приклад молекули МН-І -В' має формулу: -чІНС(оХонНгаамМмниусС(О ХСН ОосСНнсСНг)О(СНг)заМниВ", де індекси 5 і ї незалежно дорівнюють 0 або 1. Індекси а, бр і 4 означають незалежні цілі числа від 0 до 20, а с означає ціле число від 1 до 2500. Інші подібні лінкери основані на молекулах, в яких МН- група замінена на, наприклад, -5, -О і -СН».
Зокрема, у даному винаході представлений пептидний кон'югат, що містить сполуки, у яких МН-Ї -
А" являє собою
Нео сНнгаМнеКоснгОосСнНесСНн»г)О(СНг)аМНВ,
МНессФхсНнаОосСнНесСнН»г)О(СНг)аМНА!,
МН(СнгаМнехсзозуснагьОоснНесСнН»г)О(СНг)аМмн!,
МНеТесхснг)амне!,
МН(СНг)аМНА. і
МН.
У цих формулах індекси а, Б і а вибираються незалежно з цілих чисел від 0 до 20, переважно від 1 до 5. Індекс с означає ціле число від 1 до 2500.
У зразковому втіленні С означає сіалову кислоту, і вибрані сполуки відповідно до винаходу мають формули:
ОК. ; Де ди ЗВЮМЮЧенючОм нбоє. за. 0 ВННісічевісноВ що но ся х
ЕТ вк ЕН точи зд
Носик, де СНФНІСНЮОВСТЬОВ ж хе но Не нНеЇОТ ен нео снмО сн ую см ; "маіснлчнЕ ов ; ок ; но. Окддря СПІВНІВІДНІЧНЮН но, 0 м сНіСТЦОНІОМІСНСМ
Мі | ко і кине о оновєнсньма сво ен ; кнеоснениноєнну нев он . Он .
НО сноненоніснюв ди и М ОНІЕНЮМОСНИОНІ "Умнею кон; зону "МНСОЖНеСН МОСС. мснуюмнЕ ще . Ба .
НС НО НЮНОНІСНЬОВ
Не в: у
Ов
Фахівцю в галузі техніки очевидно, що залишок сіалової кислоти в зразкових сполуках, наведених вище, може замінюватися будь-яким іншим аміносахаридом, включаючи, але не обмежуючись глюкозаміном, галактозаміном, манозаміном, їх М-ацетилпохідними і т. д.
В іншому зразковому втіленні первинна гідроксильна група цукру функціоналізована модифікуючою групою. Наприклад, 9-гідроксил сіалової кислоти може перетворюватися у відповідний амін ії функціоналізуватися для одержання сполуки відповідно до винаходу. Формули відповідно до цього втілення включають: несмх, сен енівнюнючюьнеюксньане нена см еенрАН ої
В ех ок: : нос Кол сном онене вне носу с ічНв о Т і кнеюна
СИ . поса, с сианеновекмневьоксна ес нот и Те еноесн; он . оо я, ДиВНЮНЮНОНІсніна(окСнучНю НО еб ди СНОНІЮНОНІНУчНКН МН" нот. «г гоши ви кнегосну он . ок .
НО у ис НОВ човна ость но оши
Он : несе. б ми СНО НОЮ сни юм уч поси» ДОНЮ НЕНюНН но Г но :
Ж "Мнеюн» шк он ; Ся .
В подальшому зразковому втіленні в даному винаході представлений пептидний кон'югат, який включає модифіковані цукри, де гідроксильна група в положенні 6 перетворюється у відповідну аміногрупу, що несе касету лінкер-модифікуюча група, як описані вище. Зразкові сахарильні групи, застосовні як основа цих модифікованих цукрів включають саї, сзаїІМАс, сіс, СІСМАс, Рис, Хуї, Мап і т. д. Типовий модифікований цукор відповідно до цього втілення має формулу:
до ра її в у ів де КЗ-В? і Е" незалежно вибрані з Н, ОН, С(О)СН», МН і МНС(О)СнНз. В? означає ОВ", МНЕ" або МН-
І-В", як описано вище.
Вибрані кон'югати відповідно до винаходу основуються на манозі, галактозі або глюкозі, або на молекулах, що мають стереохімію манози, галактози або глюкози. Загальні формули цих кон'югатів представлені нижче: в в ве. й Кк шВд в ТОН вань - Он ше нини ни из. їв
В іншому зразковому втіленні в даному винаході представлені сполуки, як описано вище, які активують шляхом їх перетворення у відповідні нуклеотидні цукри. Зразкові нуклеотидні цукри, використовувані в даному винаході у своїй модифікованій формі, включають нуклеотидмоно-, ди- і трифосфати або їх аналоги. В одному втіленні модифікований нуклеотидний цукор вибирають з ШОР- глікозиду, СМР-глікозиду або ЗОР-глікозиду. Ще більш переважно нуклеотидну частину модифікованого нуклеотидного цукру вибирають з ООР-галактози, ОШОР-галактозаміну, ШОР-глюкози,
ООрР-глюкозаміну, ЗОР-манози, СОР-фукози, СМР-сіалової кислоти або СМР-МецАс. У зразковому втіленні нуклеотидфосфат зв'язаний із С-1.
Таким чином, у зразковому втіленні, у якому глікозильна група являє собою сіалову кислоту, у даному винаході представлені пептидні кон'югати, утворені сполуками, що мають формули:
Но й сноненониенив о се я -0 и ре ода х нн шк не ! в-х сн и ОЯ я не і
Не ФМОВЮНІОВЄВМНе а » май Х
У ут х т кнеєнсня
Кк - Ух он я а в де І-В! відповідає обговореному вище, і Ї7-Щ' означає лінкер, зв'язаний із модифікуючою групою.
Як і І, зразкові лінкери згідно з Г" включають зв'язок, алкільні і гетероалкільні групи.
В іншому зразковому втіленні в даному винаході представлений кон'югат, утворений модифікованим цукром відповідно до винаходу і субстратом, наприклад, пептидом, ліпідом, агліконом і т. д., зокрема модифікованим цукром і глікозильним залишком глікопептиду або гліколіпіду. У цьому втіленні цукрова група модифікованого цукру перетворюється в глікозильну зв'язувальну групу, розташовану між субстратом і модифікуючою групою. Зразкова глікозильна зв'язувальна група являє собою інтактну глікозильну зв'язувальну групу, в якій глікозильна група або групи не руйнуються в результаті хімічних (наприклад, вплив метаперйодату натрію) або ферментативних (наприклад, вплив оксидази) процесів. Вибрані кон'югати відповідно до винаходу включають модифікуючу групу, приєднану до аміногрупи аміносахариду, наприклад, манозаміну, глюкозаміну, галактозаміну, сіалової кислоти і т. д. Зразкова касета модифікуюча група-глікозильна зв'язувальна група відповідно до цього мотиву, основана на структурі сіалової кислоти, такої як наведена у формулах:
ОМ ОН но Вісн м-н о. оон ово ИОН що ; но ї ; с 0-9 а- о
Діяння и і снхсоМчн с Ї он і он , дек, ї12 аналогічні описаними вище.
Ще в одному зразковому втіленні кон'югат утворений субстратом і 1-шим положенням сахарильної групи, у якому модифікуюча група приєднується за допомогою лінкера до 6-го атома вуглецю сахарильної групи. Таким чином, зразкові кон'югати відповідно до цього втілення мають формули: м-н ! тів,
З нн ; Н. во в? Во вп в і га де радикали аналогічні описаними вище. Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що модифіковані сахарильні групи, описані вище, можуть також бути кон'юговані із субстратом у положенні 2, 3, 4 або 5 атома вуглецю.
Зразкові сполуки відповідно до цього втілення включають сполуки, що мають формули: вом 0 ибВННЕЮКСНІвНе хом сно они
АХ
В . в о сно кен всю новин ля п . о к сузніснзьнокнснУ м орниснІ юним 2
Ве и ко скине КОнуЬМУА вош і - . Ей . « по иуНою усну осв он т ку ен є Ї се со а і І;
Іху ; - і т м ан
Ж ще де Е-групи й індекси аналогічні описаними вище.
У даному винаході також представлені нуклеотидні цукри, модифіковані Ї-Щ8' по вуглецю в 6 положенні. Зразкові молекули відповідно до цього втілення включають: мн т ; з 8 4 Є о 9 Основа й | о ЇЇ | І о по |7о (ой ' ви іо
У но ОН де Р-групи і Ї являють собою групи, обговорювані вище. Індекс "у" дорівнює 0, 1 або 2.
Ще один зразковий нуклеотид цукру відповідно до винаходу оснований на молекулах, що мають стереохімію ЗОР-манози. Зразкова молекула відповідно до цього втілення має структуру:
Ї Ка ча - Мн
В що ч ; Ї г !
А і є | й де ше. о 7 Г ут Ч М а пе п а і. во ш й з ве щи ві ртатрчаит й перуть - й пов ск
Й ж х зе ни Зв і но он
Ще в одному зразковому втіленні в даному винаході представлений кон'югат, оснований на стереохімії ШОР-галактози. Зразкова сполука відповідно до цього втілення має структуру: о . еВ? з! . АЖ Мн я
НК г ; | Х а ; :
Вшинн щити то є МИ о Х Ко і я З ве ще ст т : Х у уч ень ре ач йо в ее
ГК 5 і о о ш- же но
Модифікуюча група К' являє собою будь-яку сполуку, вибрану з, але не обмежуючись водорозчинними полімерами, водонерозчинними полімерами, лікарськими речовинами, діагностичними речовинами й ін. Природа зразкових модифікуючих груп нижче обговорюється більш докладно.
Водорозчинні полімери
У деяких втіленнях полімерні модифікуючі групи кон'югатів З-С5Е відповідно до винаходу являють собою водорозчинні полімери. Ці водорозчинні полімери можуть бути лінійними або розгалуженими. В одному втіленні це водорозчинний полімер із практично гомодисперсним розподілом молекулярних мас.
У деяких втіленнях кон'югати відповідно до винаходу містять водорозчинні полімери, які являють собою полієтиленгліколь, наприклад, метоксиполієтиленгліколь. Поліетиленгліколь, використовуваний у даному винаході, не обмежений визначеною формою або визначеним інтервалом молекулярної маси. Для нерозгалужених молекул поліетиленгліколю молекулярна маса переважно знаходиться в інтервалі від 500 до 100000. Переважно використовувати молекулярну масу в інтервалі від 2000 до 60000 і більш переважно в інтервалі від приблизно 5000 до приблизно 30000.
В іншому втіленні поліетиленгліколь являє собою розгалужений РЕС з більше ніж однією прикріпленою РЕС-групою. Приклади розгалужених РЕС описані в патенті США Мо 5932462; у патенті
США Мо 5342940; у патенті США Мо 5643575; у патенті США Мо 5919455; у патенті США Мо 6113906; у патенті США Мо 5183660; у УМО 02/09766; і в роботах Кодега У., Віосопіддасге Спетівігу 5: 283-288 (1994); і Матавзакі еї аї., Адгіс. Віої. Спет., 52: 2125-2127, 1998. У даній заявці також розкриваються інші застосовні розгалужені структури РЕб.
У зразковому втіленні молекулярна маса кожного поліетиленгліколю розгалуженого РЕС дорівнює або перевищує 2000, 5000, 10000, 15000, 20000, 40000 або 60000 Дальтон.
Фахівцям в галузі техніки відомі багато які водорозчинні полімери, застосовні в даному винаході.
Термін "водорозчинний полімер" поширюється на молекули, такі як сахариди (наприклад, декстран, амілоза, гіалуронова кислота, полісіалова кислота, гепарани, гепарини і т. д.), поліамінокислоти, наприклад, поліаспартат і поліглутамат, нуклеїнові кислоти, синтетичні полімери (наприклад, поліакрилова кислота, поліефіри, наприклад, полієтиленгліколь); пептиди, білки і т. д. Даний винахід може здійснюватися за участі будь-якого водорозчинного полімеру з єдиним обмеженням, яке полягає в тому, що полімер повинен містити сайт для прикріплення іншої частини кон'югата.
Способи активації полімерів також можна знайти в УМО 94/17039, патенті США Мо 5324844, УМО 94/18247, УМО 94/04193, патенті США Мо 5219564, патенті США Мо 5122614, МО 90/13540, патенті США
Мо 5281698, і далі в М/О 93/15189, а також у роботах, де розглядається кон'югування активованих полімерів з пептидами, наприклад, фактором росту крові МІ (МО 94/15625), гемоглобіном. (М/О 94/09027), молекулою-переносником кисню (патент США Мо 4412989), рибонуклеазою (і супероксиддисмутазою (МУегопезе аї а!., Арр. Віоспет. Віоїтесп. 11: 141-45(1985)).
В одному втіленні даного винаходу використовуються водорозчинні полімери, у яких значна частина полімерних молекул у зразку полімеру має приблизно однакову молекулярну масу; такі полімери називаються "гомодисперсними".
Даний винахід далі ілюструється посиланням на кон'югат поліеєтиленгліколю. Існує декілька оглядів і монографій на тему функціоналізації і кон'югування РЕС. Дивіться, наприклад, Наїті5, Масгопо).
Спет. Ріпув. С25: 325-373 (1985); Зсоцієп, Меїйодв іп Еплутоіоду 135: 30-65 (1987); М/опа еї аї.,
Епгуте Місторб. Тесппої. 14: 866-874 (1992); Оеїдадо еї аї., Стййса! Кеміеєм5 у Тпегарешіїс Огид Сагтіег
Зузієт5 9: 249-304 (1992); 7аїїрзКу, Віосопійдаїє Спет. 6: 150-165 (1995); і Внадга, еї аї!., Рпапталіє, 57:5-29 (2002). Способи одержання реактивних молекул РЕС і утворення кон'югатів з використанням реактивних молекул відомі з рівня техніки. Наприклад, у патенті США Мо 5672662 розкривається водорозчинний і виділюваний кон'югат активного складного ефіру полімерної кислоти, вибраної з лінійних або розгалужених поліалкіленоксидів, поліоксіетилованих поліолів, поліолефінових спиртів і поліакрилморфоліну.
У патенті США Мо 6376604 описується спосіб приготування водорозчинного складного ефіру 1- бензотриазолілкарбонату і водорозчинного непептидного полімеру шляхом реакції кінцевої гідроксильної групи полімеру з ди-1-бензотриазолілкарбонатом в органічному розчиннику. Активний складний ефір використовується для утворення кон'югатів з біологічно активним агентом, таким білок або пептид.
У УМО 99/45964 описується кон'югат, який складається з біологічно активної речовини й активованого водорозчинного полімеру, що містить полімерний ланцюг, у якому щонайменше один кінець зв'язаний з полімерним ланцюгом стабільним зв'язком, де щонайменше один кінець містить розгалужену молекулу, проксимальні реактивні групи якої зв'язані з розгалуженою молекулою, в якій біологічно активна речовина зв'язана з щонайменше однією проксимальною реактивною групою. Інші розгалужені полієтиленгліколі описані в УМО 96/21469, у патенті США Мо 5932462 описується кон'югат, утворений розгалуженою молекулою РЕС, що включає розгалужений кінець, який включає реактивні функціональні групи. Вільні реактивні групи можуть реагувати з біологічно активними молекулами, такими як білок або пептид, утворюючи кон'югати між поліетиленгліколем і біологічно активною молекулою. У патенті США Мо 5446090 описується біфункціональний РЕС-лінкер і його використання в утворенні кон'югатів, що включають пептиди на обох кінцях РЕС-лінкера.
Кон'югати, що містять деградовні РЕС-зв'язки, описані в УМО 99/34833; ії УМО 99/14259, а також у патенті США Мо 6348558. Такі деградовні зв'язки застосовні в даному винаході.
Вищеописані способи активації полімеру, відомі з рівня техніки, застосовні в контексті даного винаходу при утворенні розгалужених полімерів, описаних у даній заявці, а також для кон'югування цих розгалужених полімерів з іншими молекулами, такими як цукри, нуклеотидні цукри і т. д.
Зразкові молекули поліетиленгліколю, застосовні в даному винаході, включають, але не обмежуються молекулами, що мають формулу:
ХХ
2700 т(Снаьнек(снасноь (СН) ВВ де КЗ означає Н, ОН, МН», заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений арил, заміщений або незаміщений гетероарил, заміщений або незаміщений гетероциклоалкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл, наприклад, ацетал, ОНС-, НаМ-(СНг)а-, Н5-(СНег)а або -(СНг)аС(М и.
Індекс "е" означає ціле число від 1 до 2500. Індекси б, а і д незалежно означають цілі числа від 0 до 20. Символи 7 і 77 незалежно означають ОН, МН», відхідні групи, такі як імідазол, п-нітрофеніл, НОВТ, тетразол, галід, 5-Н?, спиртова частина активованих складних ефірів; -(СНг)рС(У)М або - (СНг)рш(СНг)С(У)У. Символ У означає Н(2), 50, -5, М-ВО. Символи Х, МУ, У, А" ї У незалежно означають групи О, 5, М-В". Символ М означає ОН, МН», галоген, 5-82, спиртову частину активованих складних ефірів, амінну частину активованих амідів, нуклеотидні цукри і білки. Індекси р, 4, 5 і м незалежно вибираються з цілих чисел від 0 до 20. Символи КУ, ЩВ'Є, ДВ" ї "2 незалежно означають Н, заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл, заміщений або незаміщений арил, заміщений або незаміщений гетероциклоалкіл і заміщений або незаміщений гетероарил.
В інших зразкових втіленнях молекула поліетиленгліколю вибирається з наступних варіантів:
МетіоснаНа то дити? Меосноснато. и 0. 0. о мМе-(осносн) М 2 зни | мен Снсн тм ит чия ме-(ОСснаСнав-о и, птете но
Ме-чОсносСНг) -у . о й ) мМе-(ОСНаСНа)в. НМ
Ме-(СнаСнадтОо ; Й те їх, о
Ме-(ОСнНаСнНаздттетя ті Н ме-(СнНЬсСнаю-Мня
Поліетиленгліколь, застосовний для утворення кон'югата відповідно до винаходу, може бути лінійним або розгалуженим. Розгалужені молекули поліетиленгліколю, придатні для використання в даному винаході, включають, але не обмежуються молекулами, описуваними наступною формулою: шо на
ЯМ (ОМ де КЗ ії ЕУ вибираються незалежно з груп, позначуваних вище як КЗ. А" і А? незалежно вибираються з груп, позначуваних вище як А!'. Індекси е, ї, о і 4 відповідають описаним вище. 7 і У відповідають описаним вище. Х' ї Х' незалежно вибираються з 5, ЗС(О)МН, НМС(О)5, 5С(0О)0, 0, МН, МНСс(О), (ФОСМН і МНОЮ, "С(ОМН.
В інших зразкових втіленнях розгалужений РЕС базується на цистеїновій, сериновій або дилізиновій основі. Таким чином, подальші зразкові молекули РЕС включають: їз .
Ії
А ра нео СТЬСНОСНасН Осн о й
Мне ни рт т вюрюснснснсніюсь о ; о
Один дич МНСЮЮНИНИОСТЬСНУЮОЄНЬ ще а в ОЖИНИ хнеєья не
НМ рт ворененіоненось, о ; о «3 ни в --юненрмнь ни ве юноснохоне нНеоюСНСНЯОСНасНаюсня кНСеюстенуОєНнт юс
Ї Ї ї щи уч-вчнвон ни у естювоноюн, нНСТСНСняОСтСН юс, МиоіОюснинЯоСНУсн Ос, о 9 вбере в ут чНесОСНАСНИЮНЬ , НСС . є7ут-теноя кнечОон;
Ще в одному втіленні розгалужена молекула РЕС основується на трилізиновому пептиді. Трилізин може бути моно-, ди-, три- або тетрапегильований. Зразкові молекули відповідно до цього втілення мають формули:
о но х " й о
І о о иВнегоюсниниаснІнюєнх
Ме " " ' ня ! МН." ! т и емне(ОюЮСТЬСНЯОСНІСНо Осн 9 Ф . і
Ге) ; - и МНО(СНСН ОСИ НІОЄН но Ар
З о
А роти (вісн оснсню сн,
Мнн- : й
НЯ КК. ВН й
ХК жнеоснієнаоєсньстькОсть о я й де е, Гі ї незалежно вибираються з цілих чисел від 1 до 2500, а д, д' і д" являють собою незалежно вибрані цілі числа від 1 до 20.
У зразкових втіленнях даного винаходу РЕС являє собою т-РЕС (5, 10 або 20 кДа). Зразкова молекула розгалуженого РЕС являє собою серин- або цистеїн-(т-РЕС)», де т-РЕС являє собою т-
РЕС масою 20 кДа.
Фахівцю в галузі техніки очевидно, що розгалужені полімери, застосовні в даному винаході, включають варіації на вищеописані теми. Наприклад, кон'югат дилізину і РЕС, наведений вище, може включати три полімерні субодиниці, де третя субодиниця прикріплюється до а-аміну, показаного на вищенаведеній структурі в незміненому вигляді. Подібним чином, даний винахід поширюється на використання трилізину, функціоналізованого трьома або чотирма полімерними субодиницями.
Конкретні втілення згідно із даним винаходом включають: ше в и ма" ак 7 у
Ї в сич нок І
З й спі ок В
Мат Читоу і Ї я он
НЬМ б; о та
Ме фтор е я шк СН не чи фо З
Ї а також карбонати й активні складні ефіри цих молекул, такі як:
рема в а щи)
Ме" о) Я те
НЕ "
Ма. 5 а. ен А. о 0 ; х о в) Е г і ій
Е і метру о Е е 4 ї . ню сб
Ме м сої не А, а ; їв
Е
Інші активуючі або відхідні групи, застосовні для активації лінійного РЕС для використання для одержання сполук, описаних у даній заявці, включають, але не обмежуються молекулами:
Д ілі м. чх Мат 0000 ня х . ; і - ,/х кое ше . чик, ух . н
М о і Кз
Кола М А бр
Кри 7я- тм і: 5 вд т х 5 й о. й ек Ж п ше Ой тн і ; м ; іх Ж З ри
Е- а Ф-Я й Я енд зн
БО що
Молекули РЕбС, активовані цими й іншими молекулами, і способи одержання активованого РЕС описані в УМО 04/083259.
Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що одне або більше "плечей" розгалуженого полімеру, утворюваних т-РЕС, може замінюватися молекулою РЕС з відмінною кінцевою групою, наприклад,
ОН, СООН, МН», С2-Сиіо-алкіл і т. д. Далі, структури, наведені вище, легко модифікуються шляхом вставлення алкільних лінкерів (або видалення атомів вуглецю) між с-атомом вуглецю і функціональною групою бічного ланцюга. Таким чином, як основа для розгалужених молекул РЕС для використання в даному винаході розглядаються "гомо»-похідні, а також вищі і нижчі гомологи.
Розгалужені молекули РЕС, описані в даній заявці, легко одержати за допомогою способів, таких як наведені на схемі нижче:
МН , шо. нер - тей оз вв --ЖО Ж тиж, оц
І ї. Х й а - тет таб (Туло тайни Кеті дн ни ни не з Ше де Ха означає О або 5, а г означає ціле число від 1 до 5. Індекси є і ї незалежно означають цілі числа від 1 до 2500.
Таким чином, відповідно до цієї схеми, природна або неприродна амінокислота приводиться в контакт з активованим похідним т-РЕС, у даному випадку тозилатом, утворюючи сполуку 1 шляхом алкілування гетероатома Хе бічного ланцюга. Багатофункціоналізована т-РЕС амінокислота ацилюється по М-кінцю реактивним похідним т-РЕС у відповідних умовах, що приводить до збирання розгалуженого т-РЕС 2. Для фахівця в галузі техніки очевидно, що тозилатна відхідна група може бути замінена будь-якою застосовною відхідною групою, наприклад, галогеном, мезилатом, трифлатом і т. д. Подібним чином, реактивний карбонат, використовуваний для ацилювання аміну може замінюватися активним складним ефіром, наприклад, М-гідроксисукцинімідом, і т. д., або кислота може активуватися іп 5йи з використанням дегідратуючого агента, такого як дициклогексилкарбодіїмід, карбонілдіїмідазол і т. д.
У зразковому втіленні модифікуюча група являє собою РЕС-групу, однак будь-яка модифікуюча група, наприклад, водорозчинний полімер, водонерозчинний полімер, лікарська речовина й інші можуть включатися в глікозидну групу через придатний зв'язок. Модифікований цукор утворюється ферментативним шляхом, хімічним шляхом або шляхом їх комбінації, які приводять до одержання модифікованого цукру. У зразковому втіленні цукри замінюються активним аміном у будь-якому положенні, до якого потім може приєднуватися модифікуюча молекула, однак цукор повинен залишатися субстратом ферменту, що приєднує модифікований цукор до пептиду О-С5БЕ. У зразковому втіленні, де модифікованим цукром є галактозамін, аміногрупа приєднується до атома вуглецю в 6 положенні.
Також за допомогою молекул РЕС, таких як поліетиленгліколь (РЕС), можна збільшити час напівжиття іп мімо лікарських глікопептидів. Наприклад, хімічна модифікація білків молекулою РЕО (пегилювання) збільшує розмір їх молекул і знижує доступність поверхневих і функціональних груп, яка залежить від розміру молекули РЕС, зв'язаної з білююм. Це приводить до збільшення часу напівжиття в плазмі крові і протеолітичної стабільності, а також зменшує імуногенність речовини і швидкість її засвоєння печінкою (Спапее еї аї. у). Сіїіп. Іпме5і. 89: 1643-1651 (1992); Руаїак еї а. Незв.
Соттип. Спет. Раїно! Рпаптасої. 29: 113-127 (1980)). Було показано, що пегилювання інтерлейкіну-2 підсилює його протипухлинну дію іп мімо (Каїге еї аІ. Ргос. Маї!. Асад. зЗсі. ОА. 84: 1487-1491 (1987)) і що пегилювання фрагмента Е(аб)», одержаного з моноклонального антитіла А7, підвищує його локалізацію в пухлині (Кпатига еї аІ. Віоспет. Віорпу5. Ке5. Соттип. 28: 1387-1394 (1990)). Таким чином, в іншому втіленні час напівжиття іп мімо пептиду, дериватизованого молекулою РЕС за способом відповідно до винаходу, підвищується в порівнянні з часом життя іп оомімо не дериватизованого пептиду.
Збільшення часу напівжиття пептиду іп мімо найкраще виражається за допомогою процентного інтервалу збільшення цього показника. Нижня границя процентного інтервалу збільшення дорівнює приблизно 40 95, приблизно 60 95, приблизно 80 95, приблизно 100 95, приблизно 150 95 або більше ніж приблизно 200 95. Верхня межа інтервалу дорівнює приблизно 60 95, приблизно 80 95, приблизно 100 95, приблизно 150 95 або більше ніж приблизно 250 95.
Пептид Б-С5Е
Практично будь-який пептид або речовина, що є гранулоцитарним колонієстимулюючим фактором, яка має будь-яку послідовність, може бути використана як пептидний компонент кон'югатів згідно із даним винаходом. Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор клонований і секвенований.
У зразковому втіленні пептид 5-С5Е має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:1:
МІР СРАБЕСРОЗБЕТ ЕКСТЕОУККОЮСОСААГОБКОСАТУК
ГСНРЕВБСУТІСНЗСОІР'УДРГСВБСРВОАГОГАССЬВОГ НВО,
ЕГО ОАІ ВИЗ РЕСЯРТОТЬОСОМАДРАТТРАИООМЕЕ
ГОМАРАГОРТОЧЛАМРАКАВАВОКВАСОМЕУАВНСОВЕ ЕМ
ЗКУ ЕНІАОР (БЕОТО МО: В.
В іншому зразковому втіленні пептид 5-С5Е має послідовність, наведену на ЗЕО ІЮ МО:2:
ТРЬОРАЗВБСРОБЕКСЬВОУВКСОСАЛСОВКЬСАТУКІ
СНРЕБІУІЛ.ОНЯСОТРЖМАРІ 58СРЗОДІ ОГС АОСІ ЗО НВО Е
ГОСТ ОАБЕСІВРЕСОРТОТОСОУАОЕАТИУООМЕЕЇ,
ОМАРАГОРТОСАМРАБАЗАБОВ ВАСУ ІМАБНГОБЕСЕУ5
УКУТЕНІАОР (5ЕО 10 МО: 2).
В інших зразкових втіленнях пептид 5-С5Е має послідовність, наведену на ЗЕО ІЮ МО:3-11 нижче.
МІРСОВАБОСРОВА КСО УККОСОСААГОВКСМБЕСА,
ТУКЕСНРЕБІ УСІ ОН ОР ЖАРІЗВСРЕОАТОГСАССІ ВО,
ВОГКОСТІ. ОАТЕСІЗРЕСОЯ РТ ОТ ОБОМАВЕАТТГУЮ
ОМЕБК СМАРАГОРТОСАМВАБАВАРОККАСИСУСМАХНГО
ФРІГЕУВтУВМУТЕНІАОР(ВЕО 9 МО:3);
МАСРАТОВЕМКОМА ТЛ ЛК НВЗАЛУТУОВАТРЕСРАБ,
РОБІТ. КССЕОУККОСОСААСОВКІСАТУКОСНЕЕВСМУ, аКНОСТПРКМАРГЗБСРЯУСА ГОБАССТВОСНЗОТЕ КОСІ ОА
ГСЕОІБРЕГОРТ ОТ ОГСБВБУАОЕАТТ УООМЕЕСИМАРАГОР
ТОСАМРАБАБАЕОКВА СОУ СУА ОБЕГ ВЕУ УСЕНЬА
ОКО МОЯ);
МАОРАТОБРМЕСМА ГОМ ЛУНВАІЛУТУОВАТРІЖІРА ВВ
РОБИ КС ВОУККІОЮСОСАЛАГОВК УЗЕСАТУКОСНРЕВІ,
МЕ.ОНЗСОТРЖАРЕВ5ОР БОАГОГА осо СНО СЕ ОСИ,
ГОАГСЕОІБРЕСОР ТТ ОТ ОГОУАЛКАТТ У ООМЕБ ОМАРА
ГОРТОСАМРАБАЗАБОКВАСОУ МАНІ ОВЕГЕУВУВУСЕ нНрАОо(ЗЕОТ МОВУ;
МУТРІСРАББЦРОЗЕ С КСОПЕОМВКОСОСЛАСОККІСАТУ
КГСНРЕЕСУ ТИСНИ АХИПРУАРІЯБСРІВАСОБАСОСТЬВОСНЬ
СПРЕКОСІЛ.ОАСЕВІЗРЕСОР ТО Т ОБО АОБАТЕКООМ
ЕЕСОСМАРАГОРТОВБАМРАКАЗВАРОККАСОУСМАВНЬОВНЇ,
ЕУЗУКУТ ВНІ ЛОРІЗЕО 10 МО),
МІР СРАБУЕРОБЛТА КСО ЕОУККЧОСОВААСОВКЕСАТеК
ГОСНРЕЕСМСТСОНТС ОЕМ АРІ З5СРЕОАГОГАССТВОСНВИЇ,
ВЕЛО ОВІЕСІЗРЕСОРТ ОТ ОГОКАБЕАТТУООМЕЕ
ГОМАРАТОРТОСАМРАБАЗАКОККАССУСМАВНІОБЕЕУ
УК ВНІ.АОРІЧВО ІВ МО:
МУТРІСРАБЗІ РОБЕІЛКСТЕОУВКІООПОААТОВКГСАТУ
КІСНРЕВЕСУГТ.О5БССОСТРУАРІ.ЗБСРХОАСОГАССТЬВОГ НВО
ОСІ ОАГЕСОРЕСОР ТТ ОТО АПРАТТ МСОМЕ
ЕСОМАРАСОРТОБАМЕАБГАЗАБОККАССУСУАЗНІГОБЕСЕ
УБХКЕУБКНСАОРІЗЕО ТОЮ МОВ);
МОТВІСРАВВІРОБЕЛ КСТЕОУАКІОСВОААТОВКГСАТУ
КОСНЕЕЕСЛУ ТИ НЯ СОТ МАРСА ГО АСОСТ ОН аБЕСХОСТ ОА ЕОІТ5РЕСОРТОТОСОУАОРАТТКУСОМ,
БЕЕСОМАРАТОРТОСАМРАВАБАРОККАСОСУММАВНСОБЕ
ЕУБУВУТКНІАОРІВЕО 10 МО:9);
МТРІОРАБЕТРОЗЕІ КС КОУВКОСОСААТОВКІСАТУК
ССНРЕЕСУ ТЛ СНОМ АРІЗВСРЗОАГОБАССЬВОБНВИОЇ,
ЕЛОСТГОАГЕСІЗРЕГО РТ ОТ ОГОМАОРАТПУСОМЕЕ
ГОМАРАТСОРТОСАМРАРАБАВОВКАСОСУГМАВНСОВЕЦЕУ
ЗУКУТГАНІЛОРТОСАМР(ЗЕО Ю МО:10) і
МІРЕІЄРАБАГРОБЕТ КС ГОУККІОСВСААТОВКТСАТУК.
ІЄНРЕЕСУ ТЛ ОБ ХПРМАРІЗСРБОАГОБАОСТВОБНВСЇ.
ЕГОСТГОАТЕСІВЕЕ ОРТОТОСОУАОВАТТРУООМЕБ
ІОМАРТТТРІОТАМРАБАВАК ОБКАСОУБУАЗНЬОВЗЕСЕУ сУВУСЕНІАОРІЗКО ТО МО,
Даний винахід ніяким чином не обмежений вищенаведеними послідовностями.
У зразковому втіленні пептиди 5-С5Е відповідно до винаходу містять щонайменше один сайт О- зв'язаного глікозилування, який глікозилується глікозильним залишком, що включає РЕС-групу. РЕО ковалентно приєднується до пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи.
Глікозильна зв'язувальна група ковалентно зв'язується з амінокислотним або глікозильним залишком у складі пептиду С-С5Р. Як альтернатива, глікозильна зв'язувальна група приєднується до однієї або більше глікозильних одиниць у складі глікопептиду. У даному винаході також представлені кон'югати, у складі яких глікозильна зв'язувальна група приєднується як до амінокислотного, так і до глікозильного залишків.
Молекула РЕС приєднується до інтактного глікозильного лінкера прямо або через неглікозильний лінкер, наприклад, заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл.
У зразковому втіленні пептид 5-С5Е містить групу, що має формулу, наведену на формулі І
Формула Її , он ї о. оон но ; ів с, -М м й
Со де О вибирається з -ОН і В'-І -МН; С вибирається з К-1І - і -С(О)Х(С:-Св)алкілу; В' означає групу, що містить залишок лінійного або розгалуженого поліетиленгліколю; і Ї. означає лінкер, який являє собою зв'язок, заміщений або незаміщений алкіл або заміщений або незаміщений гетероалкіл, так, якщо Ю означає ОН, о означає К'-І-, і якщо с означає -С(О)(С1-Св)алкіл, О означає К'-І-МН-. У структурах з модифікованої сіалової кислоти, описаних у даній заявці, СООН також означає СОО і/або її сіль.
В одному втіленні К'-І. має формулу:
І; де а означає ціле число від 0 до 20.
У зразковому втіленні К' має структуру, вибирану з: 2 о
І
| в--(бненомн; 5 Я в--існеномсн,
Я 5 чною ениоснинюсН,. кнеюєнсниоснсндюсн о о
М. о-ви ровно
МНФфіОсННЯоСНИсНАюСН» | Мнегюєнсностсндюєн» де е і ї означають незалежні цілі числа від 1 до 2500; і д означає ціле число від 1 до 20. В інших втіленнях Е! має структуру, вибирану з: о о
У о-тнечноя У е-внечолх ча чмнсипснсн(ОосН.снюсН,, чнсспоснинИОСсНН Осн, о в!
АХ А І е пд он СНАВЬСН,; 7 ЗК о-ененоксв кнеосненаОснеНСН,. | чищоюсниениосненаОсн,; де е і ї означають незалежні цілі числа від 1 до 2500; і д означає ціле число від 1 до 20. В інших втіленнях Е! має структуру, вибирану з:
Ї с і очи «МНО(ОЮСНЬСсНОСН,СНоВОСН. ; й
Мн»
НМ «арки - " недюсненноснтьснеюєн» о шо ; о
ДУ ит инеюістьснюсниснво сн»
М;
МН чнесІснснХоснІснаюсн»У їй 0 . а
Ц щ Дроитя МнесуснсноєтьонвОСВ мит
Я
Мнегтєнаснаоснсно ють ; : : !
НМ. і в
ЗИ тнодісніснносньснькаснь в: й і
З і ра у що ли Мне юєсььснОСтІсНІО СН,
І я чисіюстсниаснун є нк ; і те т "неюснниоснинлосна
Ц 1. де е і ї означають незалежні цілі числа від 1 до 2500; а д і д' означають незалежні цілі числа від 1 до 20.
Ще в одному втіленні в даному винаході представлений кон'югат пептиду 5-С5Е, де К' має структуру, вибирану з: о вити ; МмиегюєнеснооснньвОСсНя з т а ще О0ВнщОоюсНнесндоснІснУюЮєЄНХ мб В
НМ ян о тий ежне(вІюсНоВОсВсненОСН, я і о
І ; : ; нНе(оснсняєєнснУвОСсьнВ і о
А Я ти ит івістснаюсніснаосн»
Мн і ха ; "ще МН і ""Уенеібісніенцоснісносн»
Г5 я де е, Ті 7 означають незалежні цілі числа від 1 до 2500; а д, д' і д" означають незалежні цілі числа від 1 до 20.
В інших втіленнях Е! має структуру, вибирану з: 8--С(О)СНаСНОСНоСно Осн і 8-7 С(Ф)ЮСНасНиОСНеСно юн де е ії означають незалежні цілі числа від 1 до 2500.
В іншому зразковому втіленні в даному винаході представлений пептид, який містить групу, що має формулу: : СН
Ше і о сом но ; о--ван-5 дяк я
От са! може приєднуватися до амінокислоти або глікозильного залишку, який приєднаний прямо або не прямо (наприклад, через глікозильний залишок) до амінокислоти.
В інших втіленнях група має формулу: ден і а Сон но | :
О--баін-нОВІМАан-5 бат НЯ й
Он саіМмАс може приєднуватися до амінокислоти або глікозильного залишку, який приєднаний прямо або не прямо (наприклад, через глікозильний залишок) до амінокислоти.
Ще в одному зразковому втіленні пептид містить групу, що має формулу: де ОН в б. жЖОюН чи наб ! по--оа-онМААА, а--НМ Ве лі дян де АА означає амінокислотний залишок зазначеного пептиду, і в обох вищенаведених структурах р ії С аналогічні наведеним вище.
Зразковий амінокислотний залишок пептиду С-С5Е, за допомогою якого одна або більше вищенаведених молекул можуть утворювати кон'югат, включає серин і треонін, наприклад, треонін у положенні 133 5ЕО ІО МО:1.
В іншому зразковому втіленні в даному винаході представлений кон'югат 5-С5Е, що включає глікозильний залишок, наведений на формулі: / їх
Й пек Ас Ка. і силяс Ко); реж як ви к ; і ще | поема ВО а (В 8-Ак кбіснас-сієМАс-Май а с й І (ві ЩІ тої
ЩЕ: | ЦеПеЕМАсчО а (КІ "ЦоемАлооаймк (Вів)и (ВХ) хо що Я деа, Б, с, й, і, г, 5,1 ї и означають незалежні цілі числа, вибирані з 0 і 1. Індекс д означає 1. Індекси е, Її, д і й незалежно вибираються з цілих чисел від 0 до 6. Індекси і, К, 1 і т незалежно вибираються з цілих чисел від 0 до 100. Індекси м, му, х і у незалежно вибираються з 0 і 1, і щонайменше один з індексів м, му, х і у означає 1. Символ АА означає амінокислотний залишок пептиду 5-С5Е.
Символ 5іа-(К) означає групу, що має формулу:
НО. в й
НЄ и, ; й ОН 8-9
Ше МмНнед ан , де О вибирається з -ОН їі К'-І-МН-. Символ С означає К'-І- або -С(0)(С1-Св)алкіл. К! означає групу, що містить залишок лінійного або розгалуженого полієтиленгліколю. І. означає лінкер, що являє собою зв'язок, заміщений або незаміщений алкіл або заміщений або незаміщений гетероалкіл.
Звичайно, якщо О означає ОН, с означає К'-І-, і якщо С означає -С(О)(Сі-Св)алкіл, О означає К-І -
МН-.
В іншому зразковому втіленні модифікована РЕС група сіалової кислоти в складі кон'югата відповідно до винаходу має формулу: (та зе ті но (0 г в дит» ук «Ше де індекс "5" означає ціле число від 0 до 20, а п означає ціле число від 1 до 2500. В одному втіленні 5 дорівнює 1; і група т-РЕС має молекулярну масу приблизно 20 кДа.
Ще в одному зразковому втіленні сіалова кислота, модифікована РЕС, має формулу:
он чик садн ні у ОЙ нин т Я й Ще
Ге й
Е
Я те» я , де І означає заміщену або незаміщену алкільну або заміщену або незаміщену гетероалкільну зв'язувальну групу, яка з'єднує молекулу сіалової кислоти і молекулу РЕО.
В одному втіленні щонайменше два, більш переважно три, більш переважно чотири вищезгаданих аспарагінових залишки функціоналізуються М-зв'язаним глікановим ланцюгом, наведеним вище.
Кон'югати відповідно до винаходу включають інтактні глікозильні зв'язувальні групи, які можуть бути моно- або мультивалентними (наприклад, антенальні структури). Таким чином, кон'югати відповідно до винаходу включають молекули, у яких вибрана група приєднується до пептиду за допомогою як моновалентної глікозильної зв'язувальної групи, так і мультивалентної зв'язувальної групи. Даний винахід також поширюється на кон'югати, в яких більше однієї вибраної групи приєднується до пептиду за допомогою мультивалентної зв'язувальної групи.
Водонерозчинні полімери
В іншому втіленні, аналогічному описаним вище, модифіковані цукри включають водонерозчинний полімер, на відміну від водорозчинного полімеру. Кон'югати відповідно до винаходу можуть також включати один або більше водонерозчинних полімерів. Це втілення даного винаходу ілюструється за допомогою використання кон'югата як переносника, який забезпечує контрольовану доставку лікарського пептиду. Полімерні системи доставки ліків відомі з рівня техніки. Дивіться, наприклад,
Бипп еї аї., ред. РОЇГММЕКІС ОКОС5 АМО ОКО СЕГІМЕКУ 5УЗТЕМ5, АС5 Зутрозішт зЗегіє5 т. 469,
Атегісап Спетіса! босієїу, ММазпіпдіоп, 0. С. 1991. Фахівцю в галузі техніки ясно, що практично будь- яка відома система доставки ліків застосовна до кон'югатів згідно із даним винаходом.
Вищенаведені варіанти ЕК", 1-8", ІВ», В"» ї інших радикалів в однаковій мірі застосовні відносно водонерозчинних полімерів, які можуть бути вбудовані без обмежень у лінійні і розгалужені структури з використанням хімічних методів, доступних для фахівців в галузі техніки.
Типові водонерозчинні полімери включають, але не обмежуються поліфосфазинами, полівініллолвими спиртами, поліамідами, полікарбонатами, поліалкіленами, поліакриламідами, поліалкіленгліколями, поліалкіленоксидами, поліалкілентерефталатами, полівініловими ефірами, полівініллвими складними ефірами, полівінілгалідами, полівінілпіролідоном, полігліколідами, полісилоксанами, поліуретанами, поліметилметакрилатом, поліетилметакрилатом, полібутилметакрилатом, поліззобутилметакрилатом, полігексетилметакрилатом, полііззодецилметакрилатом, полілаурилметакрилатом, поліфенілметакрилатом, поліметилакрилатом, поліїізопропілакрилатом, полізобутилакрилатом, поліоктадецилакрилатом, поліетиленом, поліпропіленом, поліетиленгліколем, поліетиленоксидом, поліетилентерефталатом, полівінілацетатом, полівінілхлоридом, полістиреном, полівінілліролідоном, плюроніками (рІ|і полівінілфенолом і їх співполімерами.
Синтетично модифіковані природні полімери, застосовні для використання в кон'югатах згідно із даним винаходом, включають, але не обмежуються алкілцелюлозами, гідроксіалкілделюлозами, ефірами целюлози, складними ефірами целюлози і нітроцелюлозами. Особливо переважні представники великих класів синтетично модифікованих природних полімерів включають, але не обмежуються метилцелюлозою, етилцелюлозою, гідроксипропілцмелюлозою, гідроксипропілметилцелюлозою, гідроксибутилметилцелюлозою, ацетатом целюлози, пропіонатом целюлози, ацетатом бутиратом целюлози, ацетатом фталатом целюлози, карбоксиметилцелюлозою, триацетатом целюлози, натрієвою сіллю сульфату целюлози і полімерами акрилових і метакрилових ефірів альгінової кислоти.
Ці й інші полімери, обговорювані в даній заявці, можуть бути легко одержані з комерційних джерел, таких як 5ідта Спетісаї! Со. (51. І оці5, МО.), Роїузсіепсе5 (УМагтепіоп, РА.), Аїдгіспй (Мім"аиКеє, УМ,
Ріка (КопкопКота, МУ) і Віокай (Кісптопа, СА), або синтезовані з мономерів, придбаних у цих постачальників з використанням загальноприйнятих технік.
Типові біоруйновані полімери для використання в кон'югатах відповідно до винаходу включають, але не обмежуються полілактидами, полігліколідами і їх співполімерами, поліетилентерефталатом, полібутиратом, полівалеріанатом, полі(лактид-ко-капролактон)ом, полі(лактид-ко-гліколід)ом, поліангідридами, поліортоефірами, а також їх сумішами і співполімерами. Композиції, що утворюють гелі, такі як ті, що включають колаген, плюроніки і т. д., Є особливо застосовними.
Полімери, застосовні в даному винаході, включають "гібридні" полімери, що включають водонерозчинні матеріали, які містять щонайменше в частині своєї структури біорозсмоктувану молекулу. Прикладом такого полімеру може служити полімер, що включає водонерозчинний співполімер, який містить біорозсмоктувану область, гідрофільну область і множину функціональних груп, які утворюють поперечні зв'язки, у складі полімерного ланцюга.
Для цілей даного винаходу, термін "водонерозчинні матеріали" включає матеріали, достатньо нерозчинні у воді або у водовмісних середовищах. Таким чином, незважаючи на те, що деякі області або сегменти співполімеру можуть бути гідрофільними або навіть водорозчинними, полімерна молекула в цілому не розчиняється у воді в достатній мірі.
Для цілей даного винаходу, термін "біорозсмоктувана молекула" включає область, яка може метаболізуватися, піддаватися розпаду, усмоктуванню і/або виведенню через нормальні вивідні шляхи тіла. Такі продукти метаболізму або розпаду також переважно достатньо нетоксичні для тіла.
Біорозсмоктувана область може бути гідрофобною або гідрофільною, якщо співполімерна композиція в цілому не стає водорозсмоктуваною. Таким чином, біорозсмоктувану область вибирають, основуючись на перевазі того, щоб полімер у цілому залишався водонерозчинним. Відповідно, відносні властивості, тобто вміст різних типів функціональних груп і відносні пропорції біорозсмоктуваної області і гідрофобної області вибираються таким чином, щоб застосовні біорозсмоктувані композиції залишалися водонерозчинними.
Типові розсмоктуванні полімери включають, наприклад, синтетичні розсмоктуванні блок- співполімери полі-а-гідроксикарбоксокислоти/поліоксіалкілену (дивіться Сопп, еї аІ.,, патент США Мо 4826945). Ці співполімери не з'єднані поперечними зв'язками і є водорозчинними, що дозволяє тілу виводити деградовані блок-співполімерні композиції. Дивіться Уоцпез еї аї.,.) Віотей. Маїег. Кев. 21: 1301-1316 (1987); і Сопп еї аї., У Віотей. Маїег. Кев5. 22: 993-1009 (1988).
Переважні у даний час біорозсмоктувані полімери включають один або більше компонентів, вибираних з поліефірів, полігідроксикислот, полілактонів, поліамідів, поліефірамідів, поліамінокислот, поліангідридів, поліортоефірів, полікарбонатів, поліфосфазинів, поліфосфоефірів, політіоефірів, полісахаридів і їх сумішей. Ще більш переважно, біорозсмоктуваний полімер включає полігідроксикислотний компонент. З полігідроксикислот, переважні полілактат, полігліколят, полікапронат, полібутират, полівалеріанат і їх співполімери і суміші.
На доповнення до утворювальних фрагментів, абсорбованих іп мімо ("біорозсмоктуваних"), переважні полімерні покриття для використання в способах відповідно до винаходу можуть також утворювати фрагмент, що виводиться і/або метаболізується.
У даному винаході також можуть використовуватися співполімери вищого порядку. Наприклад, у роботі Сазеу еї аіІ., патент США Мо 4438253, виданий 20 березня 1984 року, розкриваються триблок- співполімери, одержувані в результаті трансетерифікації полігліколевої кислоти і поліалкіленгліколю з гідроксильним кінцем. Такі композиції розкриваються як розсмоктуваний монофіламентний шовний матеріал. Гнучкість таких композицій регулюється шляхом включення ароматичного ортокарбонату, такого як тетра-п-толіл ортокарбонат, у структуру співполімеру.
Також можуть використовуватися інші співполімери, які основуються на молочній і/або гліколевій кислоті. Наприклад, у роботі Зріпи еї аіЇ., патент США Мо 5202413, виданий 13 квітня 1993 року, розкриваються біорозкладані мультиблок-співполімери, що містять послідовно блоки полілактиду і/або полігліколіду, одержані шляхом полімеризації, що розкриває кільце, лактиду і/або гліколіду на олігомерний діоловий або діамінний залишок, з наступним подовженням ланцюга за допомогою біфункціональної сполуки, такої як діізоціанат, діацилхлорид або дихлоросилан.
Біорозсмоктувані області покриттів, застосовні в даному винаході, можуть розроблятися так, щоб вони могли розщеплюватися гідролітичним і/або ферментативним шляхом. Для цілей даного винаходу "розщеплюваний гідролітичним шляхом" означає схильність співполімеру, особливо біорозсмоктуваної області, до гідролізу у воді або у водовмісному середовищі. Подібним чином, при застосуванні в даній заявці "розщеплюваний ферментативним шляхом" означає схильність співполімеру, особливо біорозсмоктуваної області, до розщеплення ендогенними або екзогенними ферментами.
При поміщенні усередину тіла гідрофільна область може розщеплюватися на фрагменти, що виводяться і/або метаболізуються. Таким чином, гідрофільна область може включати, наприклад, поліефіри, поліалкіленоксиди, поліоли, полівінілпіролідин, полівініловий спирт, поліалкілоксазоліни, полісахариди, вуглеводи, пептиди, білки і їх співполімери і суміші. Далі, гідрофільна область може також являти собою, наприклад, поліалкіленоксид. Такі поліалкіленоксиди можуть включати, наприклад, поліетиленоксид, поліпропіленоксид і їх суміші і співполімери.
Також у даному винаході можуть застосовуватися полімери, які є компонентами гідрогелів.
Гідрогелі являють собою полімерні матеріали, здатні поглинати відносно великі кількості води.
Приклади речовин, що утворюють гідрогелі, включають, але не обмежуються поліакриловими кислотами, натрійкарбоксиметилцелюлозою, полівініловим спиртом, полівінілпіролідином, желатином, карагенаном і іншими полісахаридами, гідроксіетиленметакриловою кислотою (НЕМА), а також їх похідними і т. д. Одержувані гідрогелі можуть бути стабільними, біоруйнованими (« біорозсмоктуваними. Крім того, гідрогелеві композиції можуть включати субодиниці, які мають одну або більше з цих властивостей.
З рівня техніки відомі біосумісні гідрогелеві композиції, цілісність яких можна контролювати за допомогою поперечних зшивок, і які в даний час є переважними для використання в способах відповідно до винаходу. Наприклад, у роботах Ниббеї! еї аіІ., патенти США Мо 5410016, виданий 25 квітня 1995 року, і 5529914, виданий 25 червня 1996 року, розкриваються водорозчинні системи, які являють собою поперечнозшиті блок-співполімери, водорозчинний центральний сегмент блока яких міститься між двома гідролітично лабільними периферичними сегментами. Кінці таких співполімерів далі кеповані фотополімеризовними акрилатними функціональними групами. Після утворення поперечних зшивок, такі системи перетворюються в гідрогелі. Водорозчинний центральний блок таких співполімерів може містити поліетиленгліколь; тоді як гідролітично лабільні периферичні сегменти можуть являти собою полі-а-гідроксикислоту, таку як полігліколят або полілактат. Дивіться Зау/ппеу єї аІ., Мастотоїесшіез 26: 581-587 (1993).
В іншім переважному втіленні, гель являє собою термореверсивний гель. В даний час переважними є термореверсивні гелі, які включають компоненти, такі як плюроніки, колаген, желатин, гіалуронова кислота, полісахариди, поліуретановий гідрогель, поліуретансечовинний гідрогель і їх комбінації.
Ще в одному зразковому втіленні, кон'югат відповідно до винаходу включає ліпосомний компонент.
Ліпосоми можуть бути одержані за допомогою способів, відомих фахівцю в рівні техніки, наприклад, як описано в роботі Еррзієїп еї аі)., патент США Мо 4522811. Наприклад, ліпосомні препарати можна одержувати шляхом розчинення відповідного ліпіду (ліпідів) (такого як стеароїл фосфатидил етанол амін, стеароїл фосфатидилхолін, арахідоїл фосфатидилхолін і холестерин) у неорганічному розчиннику, який потім випарюють, одержуючи тонку плівку сухого ліпіду на поверхні контейнера. Далі в контейнер вводять водний розчин активної речовини або її фармацевтично прийнятної солі. Потім контейнер крутять вручну, щоб змити ліпідний матеріал зі стінок контейнера і розбити ліпідні агрегати, що і приводить до одержання суспензії ліпосом.
Описані вище мікрочастинки і способи одержання мікрочастинок наводяться як приклад і не охоплюють весь спектр мікрочастинок, застосовних у даному винаході. Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що в даному винаході застосовна множина мікрочастинок, одержуваних різними способами.
Формати структур, обговорювані вище в контексті водорозчинних полімерів, як лінійних, так і розгалужених, загалом застосовні й відносно водонерозчинних полімерів. Так, наприклад, цистеїнові, серинові, дилізинові і трилізинові розгалужені основи можуть функціоналізуватися двома водонерозчинними полімерними групами. Способи одержання таких речовин аналогічні способам одержання водорозчинних полімерів.
Способи одержання кон'югатів 5-С5Е
Крім кон'югатів, обговорюваних вище, у даному винаході представлені способи одержання цих і інших кон'югатів. Таким чином, в одному аспекті в даному винаході представлений спосіб утворення ковалентного кон'югата між вибраною групою і пептидом 5-С5Р. Крім того, у винаході представлені способи націлювання кон'югатів відповідно до винаходу у визначену тканину або відділ тіла.
У зразкових втіленнях кон'югат утворюється між молекулою РЕС (або глікозильною молекулою, що переноситься ферментативним шляхом, яка містить молекулу РЕС) і глікозилованим або неглікозилованим пептидом. РЕС кон'югується з пептидом С-С5Е через інтактну глікозильну зв'язувальну групу, розташовану між і ковалентно зв'язану з пептидом 5-С5БЕ і з молекулою РЕС, або з неглікозильним лінкерним конструктом РЕС (наприклад, заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений гетероалкіл). Спосіб включає приведення пептиду 5-С5Е у контакт із сумішшю, яка містить модифікований цукор і глікозилтранферазу, субстратом якої є модифікований цукор. Реакцію проводять в умовах, придатних для утворення ковалентного зв'язку між модифікованим цукром і пептидом С-С5Е. Цукрова група модифікованого цукру вибирається з нуклеотидних цукрів, активованих цукрів і цукрів, які не є нуклеотидними і не активовані.
Акцепторний пептид (глікозилований або неглікозилований) звичайно синтезують де помо або рекомбінантно експресують у прокаріотичних клітинах (наприклад, бактеріальних клітинах, таких як Е. соїї) або в еукаріотичних клітинах, таких як клітини ссавців, дріжджів, комах, грибів або рослин. Пептид 2-С5Е може являти собою як повнорозмірний пептид, так і його фрагмент. Далі, пептид С-С5Е може бути дикого типу або мутантним. У зразковому втіленні (3-С5Е несе мутацію, яка додає один або більше сайтів М- або О-зв'язаного глікозилування в послідовність пептиду.
У зразковому втіленні фактор ІХ піддається О-глікозилуванню і функціоналізується наступним чином. Одержують пептид з відкритим амінокислотним сайтом глікозилування, або, якщо пептид глікозилований, глікозильну групу видаляють, щоб відкрити амінокислоту. Наприклад, серин або треонін піддають 4-1 М-ацетиламіногалактозилуванню ((самМАс), і МАс-галактозилований пептид сіалізують касетою сіалова кислота-модифікуюча група з використанням ЗтбсамтмМАс1. Як альтернатива, МАс-галактозилований пептид галактозилують з використанням Соге-1-саїТ-1, і одержаний продукт сіалізують касетою сіалова кислота-модифікуюча група з використанням зтЗоаїТ1. Зразковий кон'югат відповідно до цього способу містить наступні зв'язки: Тпг-а-1-саІМАс-р- 1,3-СаІ-42,3-5іа", де іа" означає касету сіалова кислота-модифікуюча група.
У способах відповідно до винаходу, подібних з вищеописаними, які використовують множинні ферменти і сахарильні донори, індивідуальні стадії глікозилування можуть проводитися окремо або поєднані в т.н. "зіпдіє рої" реакції. Наприклад, у реакції з трьома ферментами, наведеній вище,
СаіМАс-трансфераза, саїт і з5іат і їх донори можна комбінувати в одній посудині. Як альтернатива, реакція з («за!мМмАс може проводитися окремо, а баїї і 5іатї і придатні донори сахарилу можуть додаватися в ході однієї стадії. Інший спосіб проведення реакцій включає послідовне додавання кожного ферменту і відповідних донорів і проведення реакції способом "зіпдіє рої". Комбінації кожного з вищенаведених способів застосовні для одержання сполук відповідно до винаходу.
У кон'югатах відповідно до винаходу особливо в глікопегильованих М-зв'язаних гліканах, касета
Зіа-модифікуюча група, може зв'язуватися з Заї а-2,6 або а-2,3 зв'язком.
Способи відповідно до винаходу також надають модифікацію не повністю глікозилованих пептидів, одержаних у рекомбінантній системі. При використанні в способі відповідно до винаходу модифікованого цукру пептид 5-С5Е може бути одночасно глікозилований далі і дериватизований, наприклад, молекулою РЕС, лікарською речовиною і т. д. Цукрова група модифікованого цукру може являти собою залишок, який був би кон'югований з акцептором у повністю глікозилованому пептиді, або іншу вуглеводну групу з бажаними властивостями.
Пептиди 0-С5Е, модифіковані способами згідно із даним винаходом, можуть являти собою синтетичні пептиди, пептиди дикого типу або мутантні пептиди, одержані за допомогою способів, відомих з рівня техніки, таких як спрямований мутагенез. Глікозилування пептидів звичайно М-зв'язане або О-зв'язане. Зразкове М-зв'язування являє собою приєднання модифікованого цукру до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х означає будь-яку амінокислоту крім проліну, є послідовностями упізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної групи до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність кожної з цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилування. О-зв'язане глікозилування стосується приєднання одного цукру (наприклад, М-ацетилгалактозаміну, галактози, манози, сісСМАс, глюкози, фукози або ксилози) до гідроксидного бічного ланцюга гідроксіамінокислоти, переважно серину або треоніну, хоча також може використовуватися 5-гідроксипролін або 5- гідроксилізин.
В одному зразковому втіленні (3-С5Е експресують у системі клітин ссавців і модифікують шляхом обробки сіалідазою для відщеплення термінальних залишків сіалової кислоти і наступним петлюванням з використанням 57305аїЗ і донора РЕС-сіалової кислоти.
В іншому зразковому втіленні 5-С5Е, експресований у клітинах ссавців, спочатку обробляють сіалідазою для відщеплення термінальних залишків сіалової кислоти, а потім пегилюють з використанням 5т732заїЗ і донора РЕС-сіалової кислоти, і далі сіалізують з використанням 51735аїЇЗ і донора сіалової кислоти.
С2-С5Е, експресований у системі клітин ссавців, також можливо обробити сіалідазою і галактгозидазою для відщеплення термінальних залишків сіалової кислоти і галактози, а потім галактозилувати з використанням донора галактози і галактозилтрансферази і далі пегилювати з використанням 5735аїЗ і донора РЕС-сіалової кислоти.
Ще в одному зразковому втіленні -С5Е не обробляють спочатку сіалідазою, але глікопегилюють шляхом реакції перенесення сіалової кислоти з касетою модифікуючої групи-сіалової кислоти і ферменту, такого як 5ТЗОаїЗз.
В подальшому зразковому втіленні 5-С5Е експресують у клітинах комах і модифікують за допомогою наступної процедури: спочатку до 5-С5Е додають М-ацетилглюкозамін з використанням відповідного донора М-ацетилглюкозаміну й однієї або більше спт-Ї, ІЇ, ЇМ і М; потім 5-С5Е пегилюють з використанням донора РЕС-галактози і галактозилтрансферази. с2-С5Е, одержаний із дріжджів, також може бути глікопегильований. Наприклад, 5-С5Е спочатку обробляють ендогліканазою для відщеплення глікозильних груп, галактозилують з використанням донора галактози і галактозилтрансферази, і потім пегилюють за допомогою ЗТЗсаїЗ і донора РЕС- сіалової кислоти.
Додавання сайтів глікозилування до пептиду або іншої структури легко досягається шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, що вона містить один або більше сайтів глікозилування.
Додавання сайтів глікозилування може також здійснюватися шляхом введення одного або більше залишків, презентуючих ОН-групу, переважно залишків серину або треоніну, у послідовність пептиду а-СЗЕ (для сайтів О-зв'язаного глікозилування). Додавання сайтів глікозилування може здійснюватися шляхом мутації або повного хімічного синтезу пептиду 5-С5Е. Амінокислотну послідовність пептиду а-С5Е переважно змінюють шляхом змін на рівні ДНК, особливо мутацій попередньо вибраних основ
ДНК, що кодує пептид, таким чином, що одержані кодони транслюються в бажані амінокислоти.
Мутація (мутації) ДНК переважно здійснюють за допомогою способів, відомих з рівня техніки.
У зразковому втіленні сайт глікозилування додається за допомогою перетасування полінуклеотидів. Полінуклетиди, що кодують пептид-кандидат, можна модулювати за допомогою протоколів перетасування ДНК. Перетасування ДНК являє собою процес рекурсивної рекомбінації і мутації, виконуваної за допомогою випадкової фрагментації сукупності споріднених генів і наступного повторного збирання фрагментів за допомогою процесу, подібного з полімеразною ланцюговою реакцією. Дивіться, наприклад, Зіетітег, Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 91:10747-10751 (1994); Сїеттег,
Маїшиге 370:389-391 (1994); і патенти США МоМо 5605793, 5837458, 5830721 і 5811238.
У даному винаході також представлений спосіб приєднання до пептиду (або видалення з пептиду) одного або більше вибраних глікозильних залишків, після чого з щонайменше одним вибраним глікозильним залишком у складі пептиду кон'югують модифікований цукор. Дане втілення застосовне, наприклад, якщо потрібно кон'югувати модифікований цукор з вибраним глікозильним залишком, відсутнім у складі пептиду або присутнім у недостатній кількості. Таким чином, перед приєднанням модифікованого цукру до пептиду вибраний глікозильний залишок кон'югують з пептидом 5-С5Е шляхом ферментативного або хімічного зв'язування. В іншому втіленні змінюють патерн глікозилування глікопептиду перед кон'югуванням модифікованого цукру шляхом видалення вуглеводного залишку з глікопептиду. Дивіться, наприклад, УМО 98/31826.
Приєднання або видалення вуглеводних груп із глікопептиду проводиться хімічним або ферментативним шляхом. Хімічне деглікозилування переважно проводиться шляхом впливу на варіант поліпептиду речовини-трифторметансульфонової кислоти або еквівалентної речовини. Цей вплив приводить до відщеплення більшості або всіх цукрів крім зв'язувального цукру (М- ацетилглюкозамін або М-ацетилгалактозамін), у той час як пептид залишається інтактним. Хімічне деглікозилування описується в роботах НакКітиааіп еї аї., Агсп. Віоспет. Віорпувз. 259:52 (1987) і Едде еї аї,, Апаї. Віоспет. 118: 131 (1981). Ферментативне відщеплення вуглеводних груп від варіантів поліпептиду може проводитися з використанням різних ендо- і екзоглікозилаз, як описано в ТпоїаКига егап, Мей. Епгутої. 138: 350 (1987).
Хімічне приєднання глікозильних груп проводиться будь-яким методом, прийнятим у рівні техніки.
Ферментативне приєднання вуглеводних груп переважно проводиться з використанням модифікацій способів, описаних у даній заявці, із заміною нативних глікозильних одиниць на модифіковані цукри, використовувані в даному винаході. Інші способи приєднання цукрових груп описані в патентах США
МоМо 5876980, 6030815, 5728554 і 5922577.
Зразкові точки прикріплення вибраного глікозильного залишку включають, але не обмежуються: (а) консенсусними сайтами М- і О-глікозилування; (б) термінальними глікозильними групами, що являють собою акцептори для глікозилтрансферази; (с) аргініном, аспарагіном і гістидином; (4) вільними карбоксильними групами; (е) вільними сульфгідрильними групами, такими як сульфгідрильна група цистеїну; () вільними гідроксильними групами, такими як гідроксильні групи серину, треоніну або гідроксипроліну; (4) ароматичними залишками, такими як залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану; або (п) амідною групою глутаміну. Зразкові способи, застосовні в даному винаході, описані в УМО 87/05330, опублікованій 11 вересня 1987 року й у роботі Аріїп апа М/гієтоп, СКС СВІТ.
ВЕХМ. ВІОСНЕМ,., рр. 259-306 (1981).
У зразковому втіленні в даному винаході представлений спосіб одержання пегильованого (-С5БЕ, що містить групу: но ; : В нос Ще ц он " МНН
Я де О означає -ОН або В-Ї -НМ-; символ С означає В-І - або -С(О)(С:-Св)алкіл. В' означає групу, що містить залишок лінійного або розгалуженого поліетиленгліколю. Символ Ї. означає лінкер, вибираний зі зв'язку, заміщеного або незаміщеного алкілу або заміщеного або незаміщеного гетероалкілу. У загальному випадку, якщо Ю означає ОН, б означає К'-І-, і якщо б означає -С(О)(С1-Св)алкіл, Ю означає В'-І -МН-. Спосіб відповідно до винаходу включає, (а) приведення субстрату - пептиду С-С5БЕ - у контакт із донором РЕО-сіалової кислоти і ферментом, що переносить групу РЕС-сіалової кислоти на субстрат-пептид 5-С5Е.
Зразковий донор РЕО-сіалової кислоти являє собою нуклеотидний цукор, що має формулу:
и о
Ж с СООН ду і роб--- МА в-НМ " ї су 9) он ів; ; А
Мне і фермент, що переносить РЕОС-сіалову кислоту на амінокислотний або глікозильний залишок пептиду 5-С5БЕ, в умовах, придатних для перенесення.
В одному втіленні перед утворенням кон'югата відповідно до винаходу субстрат - пептид С-С5Е експресують у клітині-хазяїні. Зразкова клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця. В інших втіленнях клітина-хазяїн являє собою клітину комахи, рослини, гриба або бактеріальну клітину.
Спосіб, представлений у даній заявці, застосовний до кожного з кон'югатів 5-С5Е, описаних у розділах вище.
Пептиди 5-С5Е, модифіковані способами згідно із даним винаходом, можуть бути синтетичними пептидами або пептидами дикого типу або вони можуть бути мутантними пептидами, одержаними способами, відомими з рівня техніки, таким як сайтспрямований мутагенез. Глікозилування пептидів звичайно М-зв'язане або О-зв'язане. Зразкове М-зв'язування являє собою приєднання модифікованого цукру до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидна послідовність аспарагін-Х-серин або аспарагін-Х-треонін, де Х означає будь-яку амінокислоту крім проліну, є послідовностями упізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної групи до бічного ланцюга аспагарагіну. Таким чином, присутність кожної з цих трипептидних послідовностей у складі поліпептиду позначає потенційний сайт глікозилування. О-зв'язане глікозилування стосується приєднання одного цукру (наприклад, М- ацетилгалактозамін, галактоза, маноза, СІСМАс, глюкоза, фукоза або ксилоза) до гідроксильного бічного ланцюга гідроксіамінокислоти, переважно серину або треоніну, хоча також можуть використовуватися незвичайні або неприродні амінокислоти, наприклад, 5-гідроксипролін або 5- гідроксилізин.
Додавання сайтів глікозилування до пептиду або іншої структури може здійснюватися відповідно до даного винаходу шляхом зміни амінокислотної послідовності таким чином, що вона містить один або більше сайтів глікозилування. Додавання сайтів глікозилування може також здійснюватися шляхом введення одного або більше залишків, презентуючих ОН-групу, переважно залишків серину або треоніну, у послідовність пептиду (для сайтів О-зв'язаного глікозилування). Додавання сайтів глікозилування може здійснюватися шляхом мутації або повного хімічного синтезу пептиду.
Амінокислотну послідовність пептиду в деяких втіленнях змінюють шляхом змін на рівні ДНК, особливо мутацій попередньо вибраних основ ДНК, що кодує пептид таким чином, що одержані кодони транслюються в бажані амінокислоти. Мутація (мутації) ДНК здійснюються за допомогою способів, відомих з рівня техніки.
У зразковому втіленні сайт глікозилування додається за допомогою перетасування полінуклеотидів. Полінуклеотиди, що кодують пептид-кандидат, можна модулювати за допомогою протоколів перетасування ДНК. Перетасування ДНК являє собою процес рекурсивної рекомбінації і мутації, виконуваної за допомогою випадкової фрагментації сукупності споріднених генів і наступного повторного збирання фрагментів за допомогою процесу, подібного з полімеразною ланцюговою реакцією. Дивіться, наприклад, Зіетітег, Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 91:10747-10751 (1994); Сїеттег,
Маїшиге 370:389-391 (1994); і патенти США МоМо 5605793, 5837458, 5830721 і 5811238.
Зразкові способи додавання або видалення сайтів глікозилування і видалення глікозильних структур або субструктур докладно описані в М/О 04/099231, УМО 03/031464 і споріднених заявках на патенти США і РСТ.
У даному винаході також використовується спосіб приєднання до пептиду 5-С5Е (або видалення з пептиду 5-С5Е) одного або більше вибраних глікозильних залишків, після чого з щонайменше одним вибраним глікозильним залишком у складі пептиду кон'югують модифікований цукор. Такі техніки застосовні, наприклад, якщо потрібно кон'югувати модифікований цукор з вибраним глікозильним залишком, відсутнім у складі пептиду або присутнім у недостатній кількості. Таким чином, перед приєднанням модифікованого цукру до пептиду вибраний глікозильний залишок кон'югують з пептидом 5-С5ЗЕ шляхом ферментативного або хімічного зв'язування. В іншому втіленні змінюють патерн глікозилування глікопептиду перед кон'югуванням модифікованого цукру шляхом видалення вуглеводного залишку з глікопептиду. Дивіться, наприклад, УМО 98/31826.
Зразкові точки прикріплення вибраного глікозильного залишку включають, але не обмежуються: (а) консенсусними сайтами М-зв'язаного глікозилування і сайтами О-зв'язаного глікозилування; (Б) термінальними глікозильними групами, що являють собою акцептори для глікозилтрансферази; (с) аргініном, аспарагіном і гістидином; (4) вільними карбоксильними групами; (е) вільними сульфгідрильними групами, такими як сульфгідрильна група цистеїну; (Її) вільними гідроксильними групами, такими як гідроксильні групи серину, треоніну або гідроксипроліну; (ду) ароматичними залишками, такими як залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану; або (й) амідною групою глутаміну. Зразкові способи, застосовні в даному винаході, описані в МО 87/05330, опублікованій 11 вересня 1987 року й у роботі Аріїп апа Умгісїоп, СКС СКІТ. КЕМ. ВІОСНЕМ,., стор. 259-306 (1981).
Відповідно до даного винаходу модифіковані РЕС цукри кон'югують із глікозилованим або неглікозилованим пептидом з використанням відповідного ферменту, що здійснює кон'югування.
Переважно концентрації модифікованого цукру-донора (донорів), ферменту (ферментів) і акцепторного пептиду (пептидів) підбирати так, щоб глікозилування здійснювалося до досягнення бажаного ступеня модифікації акцептора. Варто розуміти, що незважаючи на те, що предметом обговорення, наведеного нижче, є сіалілтрансфераза, воно загалом застосовне і до інших глікозилтрансферазних реакцій.
Відомо декілька способів застосування глікозилтрансфераз для синтезу необхідних олігосахаридних структур, які загалом застосовні до даного винаходу. Зразкові методи описані, наприклад, у УМО 96/32491, а також у роботі Мо еї аї., Риге Аррі. Спет. 65:753 (1993), патентах США
МоМо 5352670, 5374541, 5545553, і патентах США, що знаходяться в суспільній власності МоМо 6399336 і 6440703 включених у дану заявку за допомогою посилання.
У даному винаході може використовуватися одна глікозилтрансфераза або комбінація глікозилтрансфераз. Наприклад, можливо використовувати комбінацію сіалілтрансферази і галактозилтрансферази. У втіленнях, де використовується більше одного ферменту, ферменти і субстрати переважно комбінують у початковій реакційній суміші, або ферменти і реагенти для другої ферментативної реакції додають до реакційного середовища, коли перша ферментативна реакція завершена або майже завершена. При послідовному проведенні двох ферментативних реакцій в одній посудині загальний вихід продукту виявляється більшим у порівнянні з процедурами, які включають виділення проміжного продукту. Крім того, полегшується очищення і видалення зайвих розчинників і побічних продуктів.
В одному втіленні і перший, і другий ферменти являють собою глікозилтрансферази. В іншім переважному втіленні один фермент являє собою ендоглікозидазу. В іншому втіленні використовують більше двох ферментів для збирання модифікованого глікопротеїну відповідно до винаходу.
Ферменти використовують для зміни сахаридної структури на пептиді 5-С5Е у будь-який момент до або після приєднання модифікованого цукру до пептиду.
Ще в одному втіленні способи відповідно до винаходу включають використання однієї або більше екзо- або ендоглікозидаз. Глікозидаза може бути мутантною і/або варіантною, такий фермент утворює або змінений з метою утворення, а не розриву глікозильних зв'язків. Така мутантна гліканаза звичайно містить заміну амінокислотного залишку в активному центрі на кислий амінокислотний залишок.
Наприклад, якщо ендогліканаза являє собою епдо-Н, заміщенню звичайно піддаються Аб5р у положенні 130, сій у положенні 132 або їх комбінація. Амінокислотні залишки звичайно замінюються на серин, аланін, аспарагін або глутамін.
Такий мутантний фермент може каталізувати реакцію за допомогою стадії синтезу, аналогічної реакції, зворотній стадії гідролізу, каталізованої ендогліканазою. У такому втіленні молекула-донор глікозилу (наприклад, бажана оліго- або моносахаридна структура) містить відхідну групу, і реакція проходить з додаванням молекули-донора до залишку СіСМАс на білку. Наприклад, відхідна група може являти собою галоген, такий як фторид. В інших втіленнях відхідна група являє собою Ап або молекулу Азп-пептид. У подальших втіленнях залишок (ІСМАс на молекулі-донорі глікозилу є модифікованим. Наприклад, залишок СІСМАс може містити 1,2-оксазолінову групу.
В одному втіленні ферменти, використовувані для одержання кон'югата відповідно до винаходу, присутні в каталітичних кількостях. Каталітична кількість конкретного ферменту варіює залежно від концентрації субстрату ферменту, а також від умов реакції, таких як температура, час і рН. Способи визначення каталітичної кількості для даного ферменту для вибраних концентрації субстрату й умов реакції добре відомі фахівцям у рівні техніки.
Температура проведення реакцій відповідно до винаходу може варіювати від трохи вище нуля до температури денатурації самого чутливого ферменту. Переважний інтервал температури складає від приблизно 0 "С до приблизно 55 "С і більш переважно від приблизно 20 "С до приблизно 37 "С. В іншому зразковому втіленні одну або більше стадій даного способу проводять при підвищеній температурі з використанням термофільного ферменту.
В одному аспекті реакційну суміш зберігають протягом періоду часу, достатнього для глікозилування акцептора, і в такий спосіб одержання бажаного кон'югата. Деяка кількість кон'югата часто можна детектувати через кілька годин, а витягувана кількість звичайно утворюється через 24 години або раніше. Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що швидкість реакції залежить від декількох змінних факторів (наприклад, концентрація ферменту, концентрація донора, концентрація акцептора, об'єм розчинника), які можна оптимізувати для вибраної системи.
У даному винаході також представлене виробництво модифікованих пептидів у промислових масштабах. При використанні в даній заявці "у промислових масштабах" звичайно стосується виробництва щонайменше одного грама кінцевого очищеного кон'югата.
В обговоренні, наведеному нижче, для ілюстрації винаходу використовується кон'югування молекул модифікованої сіалової кислоти з глікозилованим пептидом. Зразкова модифікована сіалова кислота позначена РЕС. Нижченаведене обговорення сконцентроване на використанні сіалової кислоти, модифікованої РЕС, і глікозилованих пептидів для ясності викладу і не має на увазі, що даний винахід обмежується кон'югуванням цих двох речовин. Фахівцю в галузі техніки очевидно, що обговорення загалом застосовне до приєднання модифікованих глікозильних груп, відмінних від сіалової кислоти. Крім того, обговорення також застосовне до модифікації глікозильної одиниці агентами, відмінними від РЕС, включаючи інші сполуки РЕС, лікарські речовини і біомолекули.
Для селективного приєднання пегильованих або ппгильованих вуглеводів до пептиду або глікопептиду можна використовувати ферментативний підхід. У такому способі використовують модифіковані цукри, що містять РЕС, РРО або масковану реактивну функціональну групу, які комбінують з відповідною глікозилтрансферазою або сглікосинтазою. Шляхом вибору глікозилтрансферази, яка утворить бажаний вуглеводний зв'язок, і використання модифікованого цукру як субстрату-донора, можливо приєднати РЕС або РРО прямо до пептидного ланцюга 5-С5БЕ, до наявних вуглеводних залишків глікопептиду або до вуглеводних залишків, доданих до пептиду.
На пептиді 5-С5Е, що модифікується відповідно до способів, описаних у даному винаході, знаходиться акцептор сіалілтрансферази, у вигляді природної структури або введений до складу пептиду рекомбінантним, ферментативним або хімічним шляхом. Застосовні акцептори включають, наприклад, галактозильні акцептори, такі як ЗаІВ1,4сІсСМАс, СаїІр1 ,4саїІМАс, Са!Ір1,3саіІМАс, лакто-М- тетраоза, СаІр1,3сІСМАс, ЗаїІВ1,3Ага, Са!ІВ1,60ІСМАс, са!/р1,4ОбІс(лактоза) і інші акцептори, відомі фахівцю в галузі техніки (дивіться, наприклад, Рацізоп еї ап, у. Віої. Спет. 253: 5617-5624 (1978)).
В одному втіленні акцептор сіалілтрансферази є присутнім на глікопептиді і модифікується після синтезу глікопептиду іп мімо. Такі глікопептиди можна сіалізувати з використанням заявлених способів без попередньої зміни патерна глікозилування глікопептиду. Як альтернатива, способи відповідно до винаходу можуть застосовуватися для сіалізації пептиду, що не містить придатного акцептора; спочатку модифікують пептид з метою включення акцептора, використовуючи способи, відомі з рівня техніки. У зразковому втіленні залишок заіМмАс додають шляхом впливу саіМмАс-трансферази.
У зразковому втіленні галактозильний акцептор збирають шляхом додавання залишку галактози до придатного акцептора, зв'язаного з пептидом 5-С5Е, наприклад, СісСМАс. Цей спосіб включає інкубацію пептиду 5-С5ЗЕ, що модифікується, у реакційній суміші, яка містить достатню кількість галактозилтрансферази (наприклад, саїІр!,3 або СаВ1,) і придатного донора галактозилу (наприклад, ООР-галактози). Реакцію проводять практично до завершення або, як альтернатива, реакція термінується після додавання попередньо вибраної кількості галактозного залишку. Для фахівця в галузі техніки очевидні й інші способи збирання вибраного сахаридного акцептора.
Ще в одному втіленні олігосахариди, зв'язані з глікопептидом, спочатку "обрізуються" повністю або частково, що відкриває акцептор сіалілтрансферази або групу, до якої можуть приєднуватися один або більше придатних залишків для утворення придатного акцептора. Для реакцій приєднання й обрізання цукрів можуть використовуватися ферменти, такі як глікозилтрансферази і ендоглікозилази (дивіться, наприклад, патент США Мо 5716812).
У нижченаведеній дискусії спосіб відповідно до винаходу ілюструється використанням модифікованих цукрів, до яких приєднані групи РЕС. Цей спосіб вибраний для ясності викладу. Для фахівця в галузі техніки очевидно, що це обговорення також стосується втілень, у яких модифікований цукор несе лікарську речовину, біомолекулу і т. д.
У зразковому втіленні даного винаходу, у якому вуглеводний залишок "обрізується" перед додаванням модифікованого цукру, периферичні залишки манози обрізають до біантенальної структури першого покоління. До одного або більше вуглеводних залишків, відкритих шляхом "обрізання", кон'югують модифікований цукор, що несе групу РЕОС. В одному прикладі, група РЕС приєднується через групу СІСМАс, кон'юЮговану з групою РЕС. До одного або обох термінальних залишків манози біантенальної структури приєднують модифікований СІСМАс. Як альтернатива, немодифікований СІСМАс може приєднуватися до одного або обох кінців розгалуженої групи.
В іншому зразковому втіленні молекулу РЕС приєднують до одного або обох темінальних залишків манози біантенальної структури за допомогою модифікованого цукру, що містить залишок галактози, кон'югований із залишком СІСМАс, приєднаним до термінальних залишків манози. Як альтернатива немодифікована Саї може приєднуватися до одного або обох термінальних залишків СіІСМАс.
Ще в одному прикладі, молекула РЕСб приєднується до залишку Са! з використанням модифікованої сіалової кислоти.
В іншому зразковому втіленні структура з периферичних залишків манози "обрізується" до манози, від якої розгалужується біантенальна структура. В одному прикладі молекулу РЕС приєднують через
СІСМАс, модифікований полімером. Як альтернатива, до манози приєднують немодифікований
СІСМАс, а потім Заї із приєднаною молекулою РЕС. Ще в одному втіленні немодифіковані залишки
СІСМАс ії Са! послідовно приєднують до манози, а потім приєднують сіалову кислоту, модифіковану молекулою РЕО.
В подальшому зразковому втіленні периферичні залишки манози "обрізуються" до СІСМАс, до якого приєднана перша маноза. Цей СІСМАс кон'югують із залишком сСаї, що несе молекулу РЕ. Як альтернатива, до сісСМАс приєднують немодифіковану саї, а потім сіалову кислоту, модифіковану водорозчинним цукром. Ще в одному подальшому прикладі термінальний СІСМАс кон'югують з ваї їі далі СіасМмАс фукозилюють модифікованою фукозою, що несе молекулу РЕб.
Периферичні залишки манози також можуть бути "обрізані" до першого СіІсМАс, приєднаного до
Азп у складі пептиду. В одному прикладі СІСМАс у складі залишку СІСМАс-(Рис)а кон'югують з СІСМАс, що несе водорозчинний полімер. В іншому прикладі СІСМАс у складі залишку СІСМАс-(Рис)а модифікують (бзаі», що несе водорозчинний полімер. У ще одному подальшому втіленні сІСМАс модифікують бСаіІ з наступним кон'югуванням сСаі із залишком сіалової кислоти, модифікованим молекулою РЕО.
Інші зразкові втілення описані в публікаціях заявок на патенти, що знаходяться в суспільній власності, США МоМо 20040132640; 20040063911; 20040137557; заявках на патенти США МоМо: 10/369979; 10/410913; 10/360770; 10/410945 і РСТ/О502/32263, кожна з який включена в дану заявку за допомогою посилання.
Вищенаведені приклади ілюструють можливості способів, описаних у даній публікації.
Використовуючи способи, описані в даній публікації, можливо "обрізати" і "наростити" вуглеводний залишок, що має практично будь-яку бажану структуру. Модифікований цукор може приєднуватися до кінців вуглеводної групи, як описано вище, або він може знаходитися між пептидним ланцюгом і кінцем вуглеводу.
У зразковому втіленні існуючу сіалову кислоту відщеплюють від глікопептиду 3З-С5Е за допомогою сіалідази, відкриваючи в такий спосіб більшість підлягаючих галактозилових залишків. Як альтернатива, пептид або глікопептид позначають залишками галактози або олігосахаридним залишком, що закінчується галактозною одиницею. Після впливу або приєднання залишків галактози, для приєднання модифікованої сіалової кислоти використовують відповідну сіалілтрансферазу.
Схематичне зображення такого підходу наведене на схемі 1.
Схема 1
КН
З С о чо Глікопротеїн ей з нот ре ще в ш За!
РО або РЕ кет ОН 9 й щи но Счалінтрановераза
СМ-ВА- З МНСОСНУМН-РЕО(ВРО) 5БА-З-МНСССНьМН-РЕС
Глікопротеїн да й (са -влекнеоснинео ові
ЗА-БМНОВСНЬМНРЕС
При іншому підході, зображеному на схемі 2, на сіаловій кислоті присутня замаскована реактивна функціональна група. На цю замасковану функціональну групу переважно не здійснюють впливу умови, використовувані для приєднання модифікованої сіалової кислоти до (С-С5Е. Після ковалентного приєднання модифікованої сіалової кислоти до пептиду 5-С5Е, маскувальну групу відщеплюють і пептид С-С5Е кон'югують з агентом, таким як РЕС. Агент кон'югують з пептидом особливим чином шляхом його реакції з немаскованою реактивною групою на залишку модифікованого цукру.
Схема 2 ч Са глікопротеїн
Жн Св х Я й с Фо - ВАВ МНСОСНІЗ-ВЕ! 9 Зв ов ню са ба но ов дна С пн С пд, - . но. К-т о дн Сіалілтранефераза жи ша ЗА МНСОСНУВВЕ
БО век ун но? ія що.
БАБ-МНСОСНІОЗЕ
ФА ННСОСНов РЕ
Глікопротеїн Ше: з дііотрвітой в ; щи З вЕСалід яю РРО: голів
ДИ т а-ВА-МНСОСНУЄРЕС і а! зе
БА-В-ЧНЕОСНВРЕС
Може використовуватися будь-який модифікований цукор, описаний у даній заявці, разом з відповідною глікозилтрансферазою, залежно від термінальних цукрів олігосахаридних бічних ланцюгів глікопептиду (таблиця 1). Як обговорювалося вище, термінальний цукор глікопептиду, необхідний для введення пегильованої структури, може вводитися природним шляхом під час експресії або може приєднуватися після експресії з використанням відповідних глікозидази (глікозидаз), глікозилтрансферази (глікозилтрансфераз) або суміші глікозидази (глікозидаз) і глікозилтрансферази (глікозилтрансфераз).
Таблиця 1 о о К3-ї | х.-к.
КкУ-у | ХВ. (0)
К;-«2г Є
МН
Ки Мн кА 7 о щу о о А Р. ІІ мо
КгА| ї її м'го островом уо отутоо о. у "Ма сума а т ма но он но он о. . Ш є. Похідні ШОР-галактозаміну (якщо А-МН, Ка
Похідні ШОР;-галактози може означати ацетил) о ХК га) х.К їх вх З о На о - о ь 7 КЕ о о Се 2 о о Ло виА| й І мо
КА яп мо Ото оо то во о б'ма ем сма фа а но он но он о. . шо Похідні ШОР;-глюкозаміну (якщо А-МН, Ка
Похідні ООР-глюкози може означати ацетил) о
Ох хи ХВ й ї мн
А. ка о о о Ж ві Ії її мМ нн, 37 о М о-Р--3--Р о 2.2 їй МН 050077 2 9 о Є А Ока дома
Її остов гав ? к-Х о А-Ка но он я - о Ма сг"ма 2-Вз но он вн
Похідні ЗОР-манози Похідні ЗОР-фукози
Х-О, МН, 5, СН», МА(К.-5)5.
УК -Х АХ; ВАХ.
О - Но, О, 5, МН, М-К.
К, Кі-4- Н, лінкер-М, М.
М «РЕС;, наприклад, ти-РЕС
В подальшому зразковому втіленні ШОР-галактоза-РЕС реагує з р1,4-галактозилтрансферазою з коров'ячого молока, яка переносить модифіковану галактозу на відповідну термінальну структуру М- ацетилглюкозаміну. Термінальні залишки СІСМАс на глікопептиді можуть бути одержані під час його експресії, якщо вона відбувається в таких системах, як системи ссавців, комах, рослин або грибів, але також можуть бути одержані шляхом впливу на глікопептид необхідними сіалідазою і/або глікозидазою, і/або глікозилтрансферазою.
В іншому зразковому втіленні для перенесення пегильованого сІСМ на термінальний залишок манози на поліпептиді використовується (ІСМАс-трансфераза, така як ОМТ1-5. Ще в одному подальшому зразковому втіленні М- ії О-зв'язані гліканові структури видаляють із глікопептиду ферментативним шляхом, щоб відкрити амінокислотний або термінальний глікозильний залишок, який потім кон'югують з модифікованим цукром. Наприклад, використовують ендогліканазу для видалення
М-зв'язаних структур глікопептиду, щоб відкрити термінальний сіІСМАс, зв'язаний з Абп у складі поліпептиду. Для приєднання РЕС-галактози до відкритого сІСМАс використовують ООР-Са!-РЕС і відповідну галактозилтрансферазу.
В альтернативному втіленні модифікований цукор додають прямо до пептидного ланцюга 5-С5Е, використовуючи глікозилтрансферазу, яка переносить залишки цукрів на пептидний ланцюг. Це зразкове втілення наведене на схемі 3. Зразкові глікозилтрансферази, застосовні в даному винаході, включають, але не обмежуються СЗаІМАс-трансферазами (СаіМАс Т1-14), СісСМАс-трансферазами, фукозилтрансферазами, глюкозилтрансферазами, ксилозилтрансферазами, манозилтрансферазами і т. д. Такий підхід дозволяє прямо приєднати модифіковані цукри до пептидів, які не несуть вуглеводів, або, як альтернатива, до існуючих глікопептидів. В обох випадках приєднання модифікованого цукру має місце у визначеному положенні пептидного ланцюга, що визначається субстратною специфічністю глікозилтрансферази, а не випадковим чином, що має місце при модифікації пептидного ланцюга білка хімічними способами. У білки або глікопептиди, що не містять пептидної послідовності субстрату глікозилтрансферази, можна ввести різні речовини шляхом вбудовування відповідної амінокислотної послідовності в поліпептидний ланцюг.
Схема З на он око а Білок і енікопретеїн
Щи о й Ко С ЩО ш саїмнеасо(стнхнНЕо
У тео --- с ма ока давл й мя / ного попку В бамн-ооенУ:ннеЕй нн
РЕ
У кожному зі зразкових втілень, наведених вище, після кон'югування модифікованого цукру з пептидом можна провести одну або більше додаткових стадій хімічної або ферментативної модифікації. У зразковому втіленні фермент (наприклад, фукозилтрансфераза) використовується для приєднання глікозильної одиниці (наприклад, фукози) до термінального модифікованого цукру, приєднаного до пептиду 5-С5Е. В іншому прикладі ферментативна реакція використовується для "кепування" сайтів, з якими модифікований цукор не зміг кон'югуватися. Як альтернатива, використовується хімічна реакція з метою зміни структури кон'югованого модифікованого цукру.
Наприклад, кон'югований модифікований цукор реагує з агентами, які стабілізують або дестабілізують його зв'язок з пептидним компонентом, до якого приєднаний пептидний цукор. В іншому прикладі з компонента модифікованого цукру знімається захист після його кон'югування з пептидом. Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що існує множина ферментативних і хімічних процедур, застосовних у способах згідно із даним винаходом на стадії, що іде за кон'югуванням модифікованого цукру з пептидом 5-С5Е. Даний винахід поширюється на подальше ускладнення кон'югата модифікованого цукру з пептидом 5-С5Е.
Ферменти
Крім ферментів, обговорюваних вище в контексті утворення ацилзв'язаних кон'югатів, патерн глікозилування кон'югата і вихідних субстратів (наприклад, пептидів, ліпідів) може бути ускладнений, "обрізаний" або модифікований якимось іншим чином за допомогою способів, які використовують інші ферменти. Способи перебудови пептидів і ліпідів з використанням ферментів, що переносять донор цукру на акцептор, докладно обговорюються в роботі ОеРгеез5, УМО 03/031464 А2, опублікованій 17 квітня 2003 року. Короткий опис вибраних ферментів для використання в даному методі наведений нижче.
Глікозилтрансферази
Глікозилтрансферази каталізують покрокове приєднання активованих цукрів (донори являють собою МОР- або ММР-цукри) до білка, глікопептиду, ліпіду або гліколипиду або до невідновлювального кінця зростаючого олігосахариду. М-зв'язані глікопептиди синтезують за допомогою трансферази і ліпідзв'язаного олігосахаридного донора ЮоІ-РР-МАСі2бІсзМапо шляхом блокового перенесення і наступного обрізання стрижня. У цьому випадку природа "стрижневого" сахариду трохи відрізняється від наступних приєднуваних цукрів. З рівня техніки відома дуже велика кількість глікозилтрансфераз.
Глікозилтрансферази, застосовні в даному винаході, можуть бути будь-якими, за умови, що вони можуть використовувати модифікований цукор як донор. Приклади таких ферментів включають глікозилтрансферазу шляху Лелуара, таку як галактозилтрансферазу, М- ацетилглюкозамінілтрансферазу, М-ацетилгалактозамінілтрансферазу, фукозилтрансферазу, сіалілтрансферазу, манозилтрансферазу, ксилозилтрансферазу, глюкурононілтрансферазу і т. д.
Для ферментативних вуглеводних синтезів, які включають глікозилтрансферазні реакції, глікозилтрансфераза може бути клонована або виділена з будь-якого джерела. Відомо багато клонованих глікозилтрансфераз, а також їх полінуклеотидних послідовностей. Дивіться, наприклад, "Те М/М/МУ Скціде То Сіопей Спіусозуйгапегегазе5" (пер:/Лимли.мсі.со.иК/ГОІБІ/Чі диїде.піт).у різних публічних базах даних, таких як СепВапкК, бм/із5-Ргої, ЕМВІ і інших, можна знайти амінокислотні послідовності глікозилтрансфераз і нуклеотидні послідовності, що кодують глікозилтрансферази, з яких можна вивести їх амінокислотні послідовності.
Глікозилтрансферази, що можуть використовуватися в способах відповідно до винаходу, включають, але не обмежуються галактозилтрансферазами, фукозилтрансферазами, глюкозилтрансферазами, М-ацетилгалактозамінілтрансферазами, М- ацетилглюкозамінілтрансферазами, глюкуронілтрансферазами, сіалілтансферазами, манозилтрансферазами, трансферазами глюкуронової кислоти, трансферазами галактуронової кислоти Й олігосахарилтрансферазами. Застосовні глікозилтрансферази включають глікозилтрансферази, одержані як з еукаріот, так і з прокаріот.
ДНК, що кодує глікозилтрансферази, може бути одержана за допомогою хімічного синтезу, скринінгу зворотних транскриптів мРНК із відповідних клітин або культур клітинних ліній, скринінгу геномних бібліотек відповідних клітин або комбінацій цих процедур. Скринінг мРНК або геномної ДНК може проводитися з використанням олігонуклеотидних проб, вибудованих на основі послідовностей генів глікозилтрансфераз. Проби можна позначити детектованою групою, такою як флуоресцентна група, радіоактивний атом або хемілюмінесцентна група, відповідно до відомих процедур і використовувати в загальноприйнятих гібридизаційних тестах. Як альтернатива, послідовності генів глікозилтрансфераз можуть бути одержані шляхом полімеразної ланцюгової реакції (РСЕК), для якої олігонуклеотидні праймери РСК одержують з послідовності генів глікозилтрансфераз. Дивіться патент
США Мо 4683195 на ім'я Миїї5 еї аі. патент США Мо 4683202 на ім'я МиїЇїв.
Глікозилтрансферазу можна синтезувати в клітинах-хазяїнах, трансформованих векторами, що містять ДНК, яка кодує фермент глікозилтрансферазу. Вектори використовуються для ампліфікації
ДНК, що кодує фермент глікозилтрансферазу, і/або для експресії ДНК, що кодує фермент глікозилтрансферазу. Вектор експресії являє собою ДНК-конструкт, що реплікується, у якому послідовність ДНК, що кодує фермент глікозилтрансферазу, функціонально зв'язана з придатними регуляторними послідовностями, здатними регулювати експресію ферменту глікозилтрансферази в придатному хазяїні. Від вибору хазяїна і способу трансформації залежить, наскільки необхідними є такі регулюючі послідовності. У загальному випадку, регулюючі послідовності включають транскрипційний промотор, необов'язкову операторну послідовність, регулюючу транскрипцію, послідовність, що кодує придатні сайти зв'язування рибосомальної мРНК, їі послідовності, що регулюють термінацію транскрипції і трансляцію. Ампліфікаційні вектори не мають необхідності в експресії регулюючих доменів. Необхідною є тільки здатність реплікуватися в хазяїні, що звичайно досягається за допомогою точки початку реплікації, і ген селекції для розпізнавання трансформантів.
У зразковому втіленні в даному винаході використовується прокаріотичний фермент. Такі глікозилтрансферази включають ферменти, що беруть участь у синтезі ліпоолігосахаридів (ГО5), продукованих багатьма грамнегативними бактеріями (Ргевіоп еї аї., Стйіса! Кеміему5 іп Місгоріоіоду 23(3): 139-180 (1996)). Такі ферменти включають, але не обмежуються білками оперону па таких видів, як ЕЕ. соїї ії ЗаітопейМйа їурпітигішт, які включають В1,6-галактозилтрансферазу і рВ1,3- галактозилтрансферазу (дивіться, наприклад, номера в базі даних ЕМВІ М80599 і М86935 (Е. сої); номер у базі даних ЕМВІ. 556361 (5. турпітигішт)), глюкозилтрансферазу (номер у базі даних Бм/і55-
Ртї Р25740 (Е. сої), В1,2-глюкозилтрансферазу (пса) (номер у базі даних бЗм/із5-Ргої Р27129 (Е. соїїЇ) і номер у базі даних БЗу/із5-Ргої Р 19817 (5. їурпітигішт)), Її В1,2-М-ацетилглюкозамінілтрансферазу (Пак) (номер у базі даних ЕМВІ 0000039 (Е. соїї). Інші глікозилтрансферази з відомими амінокислотними послідовностями включають глікозилтрансферази, кодовані оперонами, такими як пав, охарактеризованими в організмах, таких як КіІерзіеПа рпештопіає, Е. соїї, заітопеїа їурпітигіш т, заітопеййа епіегіса, Мегбвіпіа епіегосоїйіса, Мусобрасіегічт Іергозит, і оперон ті Рзейдотопав5 аегидіпоза.
У даному винаході застосовні також галактозидази, що беруть участь у виробництві структур, які містять лакто-М-неотетраозу, О-галактозил-р-1,4-М-ацетил-О-глюкозамініл-Д-1,3-О-галактозил-р-1,4-0- глюкозу і трисахаридну послідовність групи крові РУ, О-галактозил-а-1,4-0О-галактозил-ВД-1,4-О-глюкозу, ідентифіковану в складі ГО5 патогенів слизових Меї55зегіа доппогпоеає і М. тепіподйаів (ЗспоКеп еї аї.,
У. Мей. МісторіоІ. 41: 236-243 (1994)) Гени М. тепіпуйідіє і М. допогппоеає, що кодують глікозилтрансферази, які беруть участь у біосинтезі цих структур, були ідентифіковані в М. тепіпдіка ів імунотипів ІЗ і 11 (Чеппіпд5 еї аїЇ., Мої. Місгобіої. 18: 729-740 (1995)) і у мутанта Еб62 М. допогпоеаеє (СоївпіїсН, У. Ехр. Мей. 180: 2181-2190 (1994)). У М. тепіпойідіє локус, що складається з трьох генів,
ІА, ІдІВ і ІЕЕ, кодує ферменти глікозилтрансфераз, необхідні для приєднання трьох останніх цукрів у ланцюзі лакто-М-неотетраози (Умакагспик еї аї., 9. Віої. Спет. 271: 19166-73 (1996)). Нещодавно була показана ферментативна активність продуктів генів ІдІВ і ІА, що є першим доказом з передбаченої глікозилтрансферазної функції (УмМакагспикК еї аї., 9. Віої. Спет. 271(45): 28271-276 (1996)). У М. допогтпоеєає існують два додаткових гени, ІД, що приєднує В-Ю-сзаіІМАс до положення З термінальної галактози лакто-М-неотетраозної структури, і ІДС, що приєднує термінальний а-Ю-заїЇ до лактозного елемента обрізаної ГО5, що приводить до утворення структури антигену групи крові Ре (Соївпсп (1994), дивіться вище). У М. тепіпойіаів окремий імунотип І 1 також експресує антиген групи крові Рк, і було показано, що цей імунотип несе ген ІдіС (деппіпд5 еї аї.,, (1995), дивіться вище).
Глікозилтрансферази Меїі5зегіа і асоційовані з ними гени також описані в публікації ОБРМ 5545553 (Сої5Ппіїсп). Також були охарактеризовані гени а1,2-фукозилтрансферази і а1,3-фукозилтрансферази
Неїїсорасієг руїогі (Мапіп еї аї., 9У. Віої. Снпет. 272: 21349-21356 (1997)). Також у даному винаході застосовні глікозилтрансферази Сатруюорасіег |е)нпі (дивіться, наприклад, пЕр:/айтр.спгв- тгв.Пп/"редго/САйМ/дії 42.пІті).
Фукозилтрансферази
У деяких втіленнях глікозилтрансфераза, використовувана в способах відповідно до винаходу, являє собою фукозилтрансферазу. Фукозилтрансферази відомі фахівцям в галузі техніки. Зразкові фукозилтрансферази включають ферменти, що переносять І -фукозу з ЗОР-фукози на гідроксильне положення акцепторного цукру. Також у даному винаході застосовні фукозилтрансферази, що переносять не нуклеотидний цукор на акцептор.
У деяких втіленнях акцепторний цукор являє собою, наприклад, ІсСМАс у групі са!Ів(1--3,4)сІСМАсВ у складі олігосахаридного глікозиду. Придатні для здійснення цієї реакції фукозилтрансферази включають фукозилтрансферазу са!р(1--3,4)сІСМАсрВ1-о(1--3,4) (ЕТ Е.С. Мо. 2.4.1.65), вперше охарактеризовану в складі людського молока (дивіться Раїсіс, еї аїЇ., Сагропуагаїте
Вез. 190: 1-11 (1989); Ріїєві!в, єї аї., у. Віої. Снет. 256: 10456-10463 (1981); і Мипеял, еї аї., Сап. У. Спет. 59: 2086-2095 (1981)), і фукозилтрансферази саїр(1--4)сІсСМАсвВ-с (ЕТІМ, ЕТМ, ЕТМІ), виявлені в людській сироватці крові. Також охарактеризована ЕТМІИІ (Е.С. Мо. 2.4.1.65), фукозилтрансфераза сіаліл о(2--3)аІв(1--3)с1сМАсв. Також охарактеризована рекомбінантна форма фукозилтрансферази Са!/рВ(1--3,4)сІСМАср-о(1--3,4) (дивіться Юшиптахв, еї аї., Віоогу. Мей. І ейЦетг5 1: 425-428 (1991) і КиКомхкач-і аїаїйо, єї аІ., Сепе5 апа Юемеіортепі 4: 1288-1303 (1990)). Інші зразкові фукозилтрансферази включають, наприклад, с 1,2-фукозилтрансферазу (Е.С. Мо 2.4.1.69).
Ферментативне фукозилування може проводитися з використанням способів, описаних у роботі
Моїїїсопе, еї аї., Еиг. У. Віоспет. 191: 169-176 (1990) або в патенті США Мо 5374655. Клітини, використовувані для продукції фукозилтрансферази, також містять ферментативну систему для синтезу СОЮР-глюкози.
Галактозилтрансферази
В іншій групі втілень глікозилтрансфераза являє собою галактозилтрансферазу. Зразкові галактозилтрансферази включають «(1,3)-галактозилтрансферази (Е.С. Мо. 2.4.1.151, дивіться, наприклад, ЮБарКомухкі еї аї., Тгапзріапі Ргос. 25:2921 (1993) і Мататоїо еї аЇ. Маїшге 345: 229-233 (1990), бичачу (СепВапк 94989, доліаззе еї аї., У. ВіоїЇ, Спет. 264: 14290-14297 (1989)), мишачу (СепВапкК т26925; І агзеп еї аї., Ргос. Маї! Асай. сі. ОБА 86:8227-8231 (1989)), свинячу (СепВапк
ЇЗ36152; Зпманап еї оаі., Іттипо оєпеїйс5 41: 101-105 (1995). Інша придатна а!1,3- галактозилтрансфераза являє собою галактозилтрансферазу, що бере участь у синтезі антигену групи крові В (Е.С. Мо. 2.4.1.37, Мататоїйо еї аї.,.У. Віо!. Спет. 265: 1146-1151 (1990) (людська)). Ще одна зразкова галактозилтрансфераза являє собою соге саї!1-Т1.
Для використання в способах відповідно до винаходу також придатні В1,4-галактозилтрансферази, що включають, наприклад, Е.С. Мо. 2.4.1.90 (І асМАс-синтетаза) і Е.С. Мо. 2.4.1.22 (лактозосинтетаза) (бичача (р'Адозіаго еї аї., Єиг. У. Віоспет. 183: 211-217 (1989)), людська (Мазвгі єї аї., Віоспет. Віорпув.
Вез. боттип. 157: 657-663 (1988)), мишача (МаКагаума еї аї!., У. Віоспет. 104: 165-168 (1988)), а також
Е.С. Мо. 2.4.1.38 і керамід галактозилтрансфераза (Е.С. Мо. 2.4.1.45, (ап еї аї., У. Мешигозсі. Кев5. 38: 234-242 (1994)). Інші застосовні галактозилтрансферази включають, наприклад, «а1,2- галактозилтрансферази (наприклад, з 5спі7озасспаготусез ротбре, СПареї!ї еї аї., Мої Віо! СеїІ 5: 519- 528 (1994)).
Сіалілтрансферази
Сіалілтрансферази являють собою інший тип глікозилтрансфераз, застосовний до рекомбінантних клітин і реакційних сумішей відповідно до винаходу. Клітини, продукуючі рекомбінантні сіалілтрансферази, також продукують СМР-сіалову кислоту, яка є донором сіалової кислоти для сіалілтрансфераз. Приклади сіалілтрансфераз, застосовних у даному винаході, включають ЗТЗоаї ПІ (наприклад, щурячу або людську ЗТЗ5аї ІІ), 5ТЗСаї ІМ, 5т3саї І, 5тЗсаї ІІ, 5т65аї І, 5тТЗсаї М, зтвоаї ІІ, 5 Тб6озаіМАс І, 5Т6саіМАс ІІ ї 5Т6саіМмАс ЇЇ (у даній заявці використовується номенклатура сіалілтрансфераз, наведена в роботі Т5ції еї аї., СіІусобБіоюоду 6: м-хім (1996)). Зразкова «(2,3)- сіалілтрансфераза, позначувана як да(2,3)-сіалілтрансфераза (Е.С. Мо. 2.4.99.6), переносить сіалову кислоту на нередукуючу термінальну Саї у складі дисахариду або глікозиду саїр1--30іІс. Дивіться Мап деп Еїпаеп еї аї!., У. Віої. Снет. 256: 31 59 (1981), Умеіпвівїп еї аї., 9. ВіоЇ. Спет. 257: 13845 (1982) і УМеп еї аї., 9. Віої. Спет. 267: 21011 (1992). Інша зразкова са2,3-сіалілтрансфераза (Е.С. Мо. 2.4.99.4) переносить сіалову кислоту на нередукуючу термінальну Са! дисахариду або глікозиду. Дивіться
Кеагіск еї аї., 9. ВіоЇ. Спет. 254: 4444 (1979) і сіШезріє еї аї., 9. Віої. Спет. 267: 21004 (1992). Подальші зразкові ферменти включають са!1І-р-1,4-1ІсМАс са-2,6-сіалілтрансферазу (дивіться Кигозама еї аї. Єиг.
У. Віоспет. 219: 375-381 (1994)).
Переважно, щоб для глікозилування вуглеводів на глікопептидах сіалілтрансфераза була здатна переносити сіалову кислоту на послідовність (аІВ1,4сІСМАс- як найбільш поширену передостанню послідовність підлягаючу термінально сіаловій кислоті на повністю сіалізованих вуглеводних структурах (дивіться таблицю 2).
Таблиця 2
Сіалілтрансферази, що використовують послідовність саї!р1,4сІсСМАс як акцепторний субстрат (послідовності) о в8твбай | Ссавці | МейАсо2бсарі4сісМА.ЇГ/-З | 47 допоїтпоєає 1) Сооснее еї аї., Віо/Тесппоіоду 9: 1347-1355 (1991). 2) Мататой еї аї!., У. Віоспет. 120: 104-110 (1996).
З) сіїБен еїа!., 9. ВіоЇ. Спет. 271: 28271-28276 (1996).
Прикладом сіалілтрансферази, застосовної в заявлених методах, є 5ТЗваї Ії, також позначувана а(2,3)-сіалілтрансфераза (Е.С. Мо. 2.4.99.6). Цей фермент каталізує перенесення сіалової кислоти на саї у складі глікозиду СаїІр1,3СІСМАс або Са!Ір1,4с1ІСсМАс (дивіться, наприклад, Умеп еї а!., у. ВіоЇ Спет. 267: 21011 (1992); Мап аеп Еїпаеп еї аї., 9. ВіоїЇ Спет. 256: 3159 (1991)) і відповідальна за сіалізацію аспарагінзв'язаних олігосахаридів у складі глікопептидів. Сіалова кислота зв'язується з саї з утворенням с-зв'язку між двома сахаридами. Зв'язування (зв'язок) сахаридів здійснюється по положенню 2 МецАс і положенню З Заї. Цей конкретний фермент може бути виділений з печінки щурів (Ууеіпеїеїп еї аї., у. ВіоїЇ Спет. 257: 13845 (1982)); відомі послідовності людської кКДНК (зазакі еї аї. (1993) 9. Віої Спет. 268: 22782-22787; Кпадажа 4 Рацібзоп (1994) У. Віої Спет. 269: 1394-1401) і геномної ДНК (Кіадама еї аї. (1996) 9. ВіоІ. Спет. 271: 931-938), що дозволяє одержати цей фермент за допомогою рекомбінантної експресії В одному втіленні в заявлених способах сіалізації використовується щуряча ЗзтТЗеаї ПІ.
Інші зразкові сіалілтрансферази, застосовні в даному винаході, включають сіалілтрансферази
Сатруїобасієг |е)ипі, включаючи С5Т-І ії С5Т-ІІ і сіалілтрансферази, що утворюють а(2,3)-зв'язки.
Дивіться, наприклад, УМО 99/49051.
Сіалілтрансферази, відмінні від наведених у таблиці 2, також застосовні в економічному і великомасштабному процесі сіалізації комерційно значимих глікопептидів. Як простий тест застосовності цих інших ферментів, різні кількості кожного ферменту (1-100 мОд/мг білка) реагують з асіало-дї АОР (у концентрації 1-10 мг/мл) і порівнюють здатність розглянутої сіалілтрансферази сіалізувати глікопептиди з бичачою 5т6сба! І, 5Т3баЇ Ш або обома сіалілтрансферазами. Як альтернатива, для цієї оцінки замість асіало-4ї АСР можуть використовуватися інші глікопептиди, або
М-зв'язані олігосахариди, відщеплюванні ферментативним шляхом від пептидного ланцюга. Для практичного великомасштабного процесу сіалізації пептидів застосовні сіалілтрансферази, що мають здатність сіалізувати М-зв'язані олігосахариди глікопептидів більш ефективно, ніж ЗзтТ6еаї І. саІМмАс трансферази
Також застосовні в даному винаході М-ацетилгалактозамінілтрансферази, особливо для зв'язування молекули (сзамМАс з амінокислотою в сайті О-глікозилування пептиду. Придатні М- ацетилгалактозамінілтрансферази включають, але не обмежуються Ф(1,3)-М- ацетилгалактозамінілтрансферазою, В(1,4)-М-ацетилгалактозамінілтрансферазами (Мадаїа еї аї., 9.
Вісі. Спет. 267: 12082-12089 (1992) і Бтійй еї аї., 9. Віої Спет. 269: 15162 (1994)) і поліпептидною М- ацетилгалактозамінілтрансферазою (Нота еї аї!., 9. Віої. Спет. 268: 12609 (1993)).
Добре відома продукція білків, таких як СаіМАс Ті-хх, з використанням клонованих генів за допомогою генної інженерії. Дивіться, наприклад, патент США Мо 4761371. Один спосіб включає збирання достатніх зразків, і далі амінокислотна послідовність визначається секвенуванням з М-кінця.
Одержана інформація потім використовується для ізолювання клону кДНК, що кодує повнорозмірну (мембранозв'язану) трансферазу, експресія якої в клітинній лінії комах 519 дозволяє синтезувати цілком активний фермент. Акцепторна специфічність ферменту далі визначається з використанням напівкількісного аналізу амінокислот, що оточують відомі сайти глікозилування в 16 різних білках, і наступного аналізу глікозилування синтетичних пептидів іп мійго. Ця робота показала, що в глікозилованих сегментах пептидів більше частка визначених амінокислотних залишків, і що амінокислотні залишки у визначених положеннях, що оточують глікозиловані залишки серину і треоніну, можуть здійснювати більш виражений вплив на ефективність акцептора, ніж інші амінокислоти.
Зв'язані з клітиною глікозилтрансферази
В іншому втіленні ферменти, використовувані в способі згідно із даним винаходом, являють собою зв'язані з клітиною глікозилтрансферази. Хоча відома велика кількість розчинних глікозилтрансфераз (дивіться, наприклад, патент США Мо 5032519), глікозилтрансферази, асоційовані з клітиною, звичайно знаходяться в мембранозв'язаній формі. Вважається, що багато вивчених раніше мембранозв'язаних ферментів являють собою білки, вбудовані в мембрану; тобто вони не відокремлюються від мембрани шляхом обробки ультразвуком і вимагають впливу детергенту для солюбілізації. Були ідентифіковані поверхневі глікозилтрансферази на поверхні клітин хребетних і безхребетних, і також було встановлено, що такі поверхневі глікозилтрансферази зберігають каталітичну активність у фізіологічних умовах. Однак більш відома роль глікозилтрансфераз на поверхні клітин полягає в розпізнаванні клітинами одна одної. (Коїй, МОГЕСЦОГ АК АРРКОАСНЕЗ 0
ЗИРААСЕЇ ЇЇ ШО АВ РНЕМОМЕМА, 1990).
Були розроблені способи зміни глікозилаз, експресованих клітинами. Наприклад, у роботі І агхеп еї аІ., Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 86: 8227-8231 (1989) описується генетичний підхід до виділення клонованих послідовностей ДНК, що визначають експресію олігосахаридних структур на поверхні клітини і відповідних ним глікозилтрансфераз. Відомо, що в бібліотеці КкКДНК, одержаній з мРНК, виділеної з мишачої клітинної лінії, експресується СОР-галактоза; В-О-галактозил-1,4-М-ацетил-О- глюкозамінід «41,3-галактозилтрансфераза була трансфекована в клітини СО5-1. В культивованих трансфекованих клітинах потім визначали активність «1,3-галактозилтрансферази.
У роботі Егапсізсо єї аЇ., Ргос. Майї). Асад. сі. ОБА 89: 2713-2717 (1992) розкривається спосіб заякорювання В-лактамази на зовнішній поверхні ЕзсПегіспіа соїї. Одержують тричастковий злитий білок, що складається з (ї) сигнальної послідовності білка зовнішньої поверхні мембрани, (ії) внутрішньомембранного домену білка зовнішньої поверхні мембрани і (ії) повної послідовності зрілої рВ-лактамази, що дає молекулу активної рД-лактамази, зв'язану з мембраною. Однак спосіб за Егапвібзсо поширюється тільки на прокаріотичні клітинні системи і, як визнають автори, вимагає наявності повного продукту тричасткового злиття для правильного функціонування.
Сульфотрансферази
У даному винаході також представлені способи одержання пептидів, що включають сульфатовані молекули, які включають, наприклад, сульфатовані полісахариди, такі як гепарин, гепарансульфат, карагенен і споріднені речовини. Застосовні сульфотрансферази включають, наприклад, хондроїтин-
б-сульфотрансферазу (кКДНК курей, описана в роботі Рикша еї аї., 9. ВіоЇ. Спет. 270: 18575-18580 (1995); номер у базі даних СепВапк 049915), глікозаміноглікан М-ацетилглюкозамін М-деацетилаза/Мм- сульфотрансфераза 1 (Оіхоп еї аіІ.,, Сепотісв 26: 239-241 (1995); 0118918) і глікозаміноглікан М- ацетилглюкозамін М-деацетилаза/М-сульфотрансфераза 2 (КкКДНК миші, описана в ОгеїЇапа еї аї.,».
ВіоЇ. Спет. 269: 2270-2276 (1994) і Егіке5оп еї аї., 9. Віої. Спет. 269: 10438-10443 (1994); КДНК людини, описана в номері бази даних СепВапк 02304).
Глікозидази
Даний винахід також поширюється на використання глікозидаз дикого типу і мутантів. Було показано, що мутантні ферменти В-галактозидази каталізують утворення дисахаридів шляхом зв'язування а-глікозилфториду з галактозильною акцепторного молекулою (М/йпег5, патент США Мо 6284494; виданий 4 вересня 2001 року). Інші глікозидази, застосовні для використання в даному винаході включають, наприклад, В-глюкозидази, В-галактозидази, В-манозидази, В- ацетилглюкозамінідази, Д-М-ацетилгалактозамінідази, В-ксилозидази, ДВ-фукозидази, целюлази, ксиланази, галактанази, мананази, геміцелюлази, амілази, глюкоамілази, со-глюкозидази, а- галактозидази, а-манозидази, ВД-М-ацетилглюкозамінідази, а-М-ацетилгалактозамінідази, а- ксилозидази, а«-фукозидази і нейрамінідази/сіалідази.
Іммобілізовані ферменти
У даному винаході також представлене використання ферментів на твердій і/або розчинній основі.
У зразковому втіленні представлена глікозилтрансфераза, кон'югована з РЕС за допомогою інтактного глікозильного лінкера згідно зі способами відповідно до винаходу. Кон'югат РЕС-лінкер-фермент необов'язково прикріплений до твердої основи. Використання ферментів на твердій основі в способах відповідно до винаходу спрощує приготування реакційної суміші й очищення продукту реакції, а також полегшує виділення ферменту із суміші. У способах відповідно до винаходу використовується кон'югат глікозилтрансферази. Фахівцю в галузі техніки очевидні інші комбінації ферментів і основ.
Злиті білки
В інших зразкових втіленнях у способах відповідно до винаходу використовуються злиті білки, які мають більше однієї ферментативної активності, що бере участь у синтезі бажаного кон'югата глікопептиду. Злиті білки можуть складатися 3, наприклад, каталітично активного домену глікозилтрансферази, з'єднаного з каталітичним доменом допоміжного ферменту. Каталітичний домен допоміжного ферменту може, наприклад, каталізувати яку-небудь стадію утворення нуклеотидного цукру, що є донором для глікозилтрансферази, або каталізувати реакцію глікозилтрансферазного циклу. Наприклад, полінуклеотид, що кодує глікозилтрансферазу, може бути злитий в одній рамці зчитування з полінуклеотидом, що кодує фермент, який бере участь у синтезі нуклеотидного цукру.
Одержаний злитий білок може каталізувати не тільки синтез нуклеотидного цукру, але і перенесення цукрової групи на акцепторну молекулу. Злитий білок може являти собою два або більше ферментів циклу, зв'язаних в одну експресовану нуклеотидну послідовність. В інших втіленнях злитий білок включає каталітично активні домени двох або більше глікозилтрансфераз. Дивіться, наприклад, патент США Мо 5641668. Різні застосовні злиті білюи полегшують дизайн і виробництво модифікованих глікопептидів відповідно до винаходу (дивіться, наприклад, заявку на патент РСТ/СА98/01180, опубліковану як УМО 99/31224 24 червня 1999 року).
Одержання модифікованих цукрів
У загальному випадку, у способах відповідно до винаходу використовуються модифіковані цукри.
В одному аспекті цукрова група або групи касети цукрова група-лінкер і РЕС або касети РЕС-лінкер зв'язуються одна з одною за допомогою реактивних груп, що звичайно перетворюються в процесі зв'язування в нову органічну функціональну групу або нереактивну групу. Реактивна функціональна група (групи) цукру може знаходитися в будь-якому положенні молекули цукру. Реактивні групи і класи реакцій, застосовні в даному винаході, звичайно являють собою групи і реакції, добре відомі з галузі техніки хімії біокон'югатів. В даний час переважні класи реакцій за участі реактивних цукрових груп, які проходять у порівняно м'яких умовах. Такі реакції включають, але не обмежуються нуклеофільними заміщеннями (тобто реакціями амінів і спиртів з ацилгалідами, активними складними ефірами), електрофільними заміщеннями (наприклад, енамінними реакціями) і приєднаннями до множинних зв'язків вуглець-вуглець і вуглець-гетероатом (наприклад, реакція Майкла, приєднання Ділса-
Альдера). Ці й інші застосовні реакції описуються, наприклад, у публікаціях Магсй, АОМАМСЕЮО
ОМКСАМІС СНЕМІЗТАКУ, З вид., доп УмМієу 5 боп5, Мем/ Моїк, 1985; Нептапзоп, ВІОСОМІОСАТЕ
ТЕСНМІОЦОЕ5, Асадетіс Рге55, Зап Оієедо, 1996; і Реєпеу еї ам, МОБІРІСАТІОМ ОЕ РАОТЕЇМ5;
Адмапсез іп Спетівігу Зегіев, Мої. 198, Атегісап Спетіса! босієїу, Мавпіпдіоп, 0.С., 1982.
Застосовні реактивні функціональні групи, підвішені на цукровому ядрі або модифікуючій групі, включають, але не обмежуються: (а) карбоксильними групами і їх різними похідними, включаючи, але не обмежуючи складними ефірами /М-гідроксисукциніміду, складними ефірами /М-гідроксибензотриазолу, ацилгалідами, ацилімідазолами, тіоефірами, складними ефірами п-нітрофенілу, алкільними, алкенільними, алкінільними й ароматичними складними ефірами;
(Б) гідроксильними групами, що можуть перетворюватися в, наприклад, ефіри, складні ефіри, альдегіди і т. д.; (с) галогеналкільними групами, де галід може пізніше замінюватися нуклеофільною групою, такою як, наприклад, амін, карбоксилат-аніон, тіоловий аніон, карбаніон або алкоксидний іон, що приводить до ковалентного приєднання нової групи замість функціональної групи атома галогену; (4) дієнофільними групами, здатними брати участь у реакціях Ділса-Альдера, такими як, наприклад, малеімідогрупами; (є) альдегідними або кетоновими групами, з наступною можливою дериватизацією шляхом утворення карбонільних похідних, таких як, наприклад, імінів, гідразонів, семікарбазонів або оксимів, або за допомогою механізмів, таких як реакції Гриньяра або реакції з алкіллітієм; () сульфонілгалоїдними групами, для подальших реакцій з амінами, наприклад, з утворенням сульфонамідів; (94) тіоловими групами, які можуть, наприклад, перетворюватися в дисульфіди або реагувати з ацилгалідами; (п) аміногрупами або сульфгідрильними групами, які можуть бути, наприклад, ацильовані, алкіловані або окислені; () алкенами, що піддаються, наприклад, циклоприєднанню, ацилюванню, які беруть участь у реакції Майкла і т, д.; (Ї) епоксидами, які можуть реагувати з, наприклад, амінними і гідроксильними сполуками.
Реактивні функціональні групи можуть вибиратися таким чином, що вони не беруть участі або не перешкоджають реакціям, необхідним для збирання реактивного цукрового ядра або модифікуючої групи. Як альтернатива, присутність захищаючої групи може захищати реактивну функціональну групу від участі в реакції. Фахівцю в галузі техніки очевидні способи захисту конкретної функціональної групи таким чином, що це не впливає на вибрані умови реакції. Приклади придатних захищаючих груп, дивіться, наприклад, у роботі сгеепе еї ам., РКОТЕСТІМЕ СОКОШРБЗ ІМ ОКСАМІС ЗУМТНЕбБІ5, допп
УМіеу в Боп5, Мем ХогКк, 1991.
У нижчеподаному обговоренні описуються деякі конкретні приклади модифікованих цукрів, застосовних у даному винаході. У зразкових втіленнях як цукрове ядро, до якого приєднується модифікуюча група, використовується похідне сіалової кислоти. Нижченаведене обговорення концентрується на похідних сіалової кислоти винятково для ясності викладу і не має на увазі обмеження обсягу даного винаходу. Фахівцям в галузі техніки очевидно, що аналогічним чином, описаним на прикладі сіалової кислоти, можна активувати і дериватизувати інші різні цукрові групи.
Наприклад, існує множина способів модифікації галактози, глюкози, М-ацетилгалактозаміну і фукози й інших вуглеводних субстратів, які легко модифікуються способами, відомими з рівня техніки. Дивіться, наприклад, ЕїПІПаїабі еї аІ. Сит. Мед. Спет. 6:93 (1999); і зспагег еї аї., У. Огд. Спет. 65:24 (2000)).
У зразковому втіленні пептид З-С5Е, який модифікується за способом відповідно до винаходу, являє собою глікопептид, продукований клітинами ссавців (наприклад, клітинами СНО) або в трансгенній тварині і, таким чином, містить не повністю сіалізовані М- і/або О-зв'язані олігосахаридні ланцюги. Олігосахаридні ланцюги глікопептиду, які не містять сіалової кислоти й містять термінальний залишок галактози, можуть бути пегильовані, ппгильовані або модифіковані яким-небудь іншим чином за допомогою модифікованої сіалової кислоти.
На схемі 4 на аміноглікозид 1 впливають активним ефіром - похідним захищеної амінокислоти (наприклад, гліцину), при цьому амінний залишок цукру перетворюється у відповідний аддукт аміду захищеної амінокислоти. Далі на аддукт впливають альдолазою з утворенням а-гідроксикарбоксилату 2. Сполука 2 перетворюється у відповідне похідне СМР шляхом впливу СМР-5А-синтетази, з наступною каталітичною гідрогенізацією похідного СМР з одержанням сполуки 3. Амін, введений під час утворення аддукту гліцину, використовується як місце приєднання РЕС шляхом реакції сполуки З з активованим похідним РЕС або РРО (наприклад, РЕС-С(О)МН5, РЕС-ОС(О)О-п-нітрофеніл), що приводить до одержання сполук 4 і 5, відповідно.
Схема 4 -н І. ЄМ БА синтетзза, СТЕ но. си і ї З МУРИЄ
МН 1 рами. й МО. он є . Я о- ! М МінсАє вільдонавя, пірувте ню В о уче на нн «ВИН ВН пи арион щу й ї чи а че і й см ї С з З ще ана у новн У т РОСИ 0ово вно Ока / ї нотою танфбно 0-го в но он
РЕ кн а нач бен ще що 4 ва З а ? :
СМРУНА-5-МНСОСНІМИ--- В свт квсосюми тео весДсоючкие СМАК СОСНеМНУ сМЕВАЧ М ИСОСВМН- СОХНЕ
У таблиці З наведені приклади типових монофосфатів цукрів, дериватизованих молекулою РЕО.
Деякі сполуки, наведені в таблиці 3, одержані способом, наведеним на схемі 4. Інші похідні одержані способами, відомими з рівня техніки. Дивіться, наприклад, Керріеєг еї аї., СІусобіоіоду 11:11К (2001); і
СНапег еї а!., Сіусобіоіоду 10: 1049 (2000)). Інші амінні реактивні аналоги РЕС і РРО є у продажу або можуть бути одержані способами, легкодоступними для фахівців в галузі техніки.
Таблиця З
Мі» Мне її мо І мо 0-6 о. о-6-0-,0 но он о ма но он У та но. Жито о "Ма но он к-о шШ-о Ома но он в-мн-йЯ вомн-днО о
СМР-БА-5-МН-В СМР-МецАс-9-0-8
МН» Мне
СЕ 2 (с
М Щ мо о-Б-о о о-к-о о но он о "Ма но он ще "Ма ооЖв обуст но он КМ шШ-е-О "Ма но он п-О он о Асчн он о
СМР-КОМ-5-0-8 СМР-МешАс-9-МН-А
МН» Мне 5 С 5 Є
І мо Й о мо т-О орто в-мн о-о он о Ма он Ома - - т- -ж но ж--9 Ома но он но 5-0 ро ма но он о б
АсМНА-«Он АеМН-- он
СМР-МецАс-8-0-8 СМР-МешАс-8-МН-А мно МН» о С о С її мо її мо о--а о. | о-в-0 о но 0-к м де, но Ммн-в ее, но ї (о) о "Ма но он но 2. с о Ма но он деМН но? демн--КЗн оо
СМР-МешАс-7-0-8 СМР-МешАс-7-МН-В
МН. мн; о С о С о--в-о оо в-в-9 оо но он с т С но он е т С
КЕ еТу "ма НО ОН но ИАКЕ А-о то "ма нО ОН
АсМН О-в Ас МН-в
Модифіковані фосфати цукрів, застосовні в даному винаході, можуть бути заміщені в інших положеннях, також як і в наведених вище. Переважні в даний час заміщення сіалової кислоти наведені на формулі нижче:
Мне з С її ї що гу уві ТОК
ВЗУУ ХА ОО) сва
Як Го
Ат де Х означає зв'язувальну групу, переважно вибирану з -О-, -М(Н)-, -5, СНе- і -М(В)», у якій кожен К незалежно вибирається з К'-Н». Кожний із символів У, 7, А і В означає групу, вибрану з групи, наведеної вище для Х. Кожний з Х, У, 7, А і В вибирається незалежно, і, таким чином, вони можуть бути ідентичними або відрізнятися. Символи В', В, ВЗ, В" і 2» означають Н, молекулу РЕС, лікарську речовину, біомолекулу або іншу речовину. Як альтернатива, ці символи означають лінкер, зв'язаний з молекулою РЕС, лікарською речовиною, біомолекулою або іншою речовиною.
Зразкові речовини, приєднані до кон'югатів, що розкривається в даній заявці, включають, але не обмежуються похідними РЕС (наприклад, ацил-РЕС, ацил-алкіл-РЕС, алкіл-ацил-РЕС, карбамоїл-
РЕС, арил-РЕС), похідними РРО (наприклад, ацил-РРО, ацил-алкіл-РРО, алкіл-ацил-РРО, карбамоїл-
РРО, арил-РРО), лікарськими речовинами, діагностичними речовинами, манозо-6-фосфатом, гепарином, гепараном, ЗІ Ех, манозою, манозо-б-фосфатом, зіау! Гемі5 Х, БОБ, МЕСОБЕ, білками, хондроїтином, кератаном, дерматаном, альбуміном, інтегринами, антенальними олігосахаридами, пептидами й іншими. Способи кон'югування різних модифікуючих груп до сахаридної групи легко доступні фахівцям в галузі техніки (РОЇМЕТНМ ЕМЕ СІ МСОЇ СНЕМІЗТКУ: ВІОТЕСНМІСАЇ АМО
ВІОМЕБВІСАГ АРРІІСАТІОМ5, під ред. у). Мійоп Нагті5, Ріепит Риб. Согр., 1992; РОЇ М (ЕТНМІ ЕМЕ
СІ УСОЇ) СНЕМІСАЇ АМО ВІОГОСІСАЇ АРРІІСАТІОМ5, під ред. У. Мійоп Нагтіх, АСЗ Зутровішт зЗепез Мо. 680, Атегісап Спетіса! босівїу, 1997; Неппапзоп, ВІОСОМІОСАТЕ ТЕСНМІООЕ5, Асадетіс
Ргез5, Зап Оіедо, 1996; і Юипп еї аіІ., Еаз. РО УМЕКІС ОКОСЗ АМО ОКО СЕ ІМЕКУ 5УЗТЕМ5, АС
Зутровзішт 5егіє5 Мої. 469, Атегісап Спетіса! Зосієїу, УМазпіпдіоп, 0. С 1991).
Лінкерні групи (групи, що утворюють поперечні зшивки) Одержання модифікованих цукрів для використання в способах згідно із даним винаходом включає приєднання молекули РЕС до залишку цукру і переважне утворення стабільного аддукту, що є субстратом для глікозилтрансферази. Таким чином, часто переважно використовувати лінкер, наприклад, лінкер, утворений шляхом реакції РЕС і цукрової групи з агентом, що утворює поперечні зшивки, для кон'югації РЕС і цукру. Зразкові біфункціональні сполуки, які можуть використовуватися для приєднання модифікуючих груп до вуглеводних груп, включають, але не обмежуються біфункціональними поліетиленгліколями, поліамідами, поліефірами, поліестерами й іншими. З літературних даних відомі загальні підходи до зв'язування вуглеводів з іншими молекулами. Дивіться, наприклад, Г ее еї аї!., Віоспетівігу 28: 1856 (1989); Впагйа еї а!., Апаї. Віоспет. 178: 408 (1989); дапаа еї аї., У. Ат. Спет. 5обс. 112: 8886 (1990) і
Веапаг»хкі еї а, М/О 92/18135. В обговоренні, наведеному нижче, вважається, що реактивні групи не погіршують властивостей цукрової групи знову утвореного модифікованого цукру. Предмет обговорення вибраний для ясності викладу. Фахівцю в галузі техніки очевидно, що обговорення також стосується реактивних груп на модифікуючій групі.
Для модифікації компонентів модифікованого цукру за допомогою внутрішньомолекулярних хімічних поперечних зшивок використовуються різні реагенти (дивіться огляди реагентів і процедур для утворення поперечних зшивок УуоЇїЯ, К, Мей. Еплутої. 25: 623-651, 1972; МеезаїІ, Н. Н, апа
Соопеу, 0. А., у: ЕМАУМЕ5 АЗ ОКИС, (під ред. НоіІсепрего і Кобрегі5) стор. 395-442, ММІеу, Мем МОїК, 1981; Її, Т. Н., Меїй. Епгутої. 91: 580-609, 1983; Майзхоп еї а!., Мої. Віої!. Нер. 17: 167-183, 1993, кожний з який включений у дану публікацію за допомогою посилання). Переважні реагенти, що утворюють поперечні зшивки, одержують з різних утворюючих поперечні зшивки реагентів нульової довжини і гомобіфункціональних і гетеробіфункціональних реагентів, що утворюють поперечні зшивки.
Утворюючі поперечні зшивки реагенти нульової довжини включають пряму кон'югацію двох присутніх хімічних груп без внесення додаткового матеріалу. До цієї категорії належать агенти, каталізуючі утворення дисульфідного зв'язку. Іншим прикладом є реагенти, індукуючі конденсацію карбоксильної групи і первинної аміногрупи з формуванням амідного зв'язку, такі як карбодіїміди, етилхлорформат,
К-реагент Вудворда (2-етил-5-фенілізоксазолій-3-сульфонат) і карбонілдіїмідазол. Крім цих хімічних реагентів, як реагент нульової довжини, що утворює поперечні зшивки, може виступати фермент трансглютаміназа (глютаміл-пептид у-глютамілтрансфераза; ЕС 2.3.2.13). Цей фермент каталізує реакцію перенесення ацилу на карбоксамідні групи глютамінільних залишків, зв'язаних з білком, звичайно використовуючи первинну аміногрупу як субстрат. Переважні гомо- і гетеробіфункціональні реагенти містять два ідентичні або відмінні сайти, відповідно, які можуть бути реактивними відносно аміно-, сульфгідрильних, гуанідинових, індольних або неспецифічних груп.
Зсідання нерозчинного С-С5Е
Багато які рекомбінантні білки, що експресуються в бактеріях, експресуються у вигляді нерозчинних агрегатів у бактеріальних тільцях включення. Тільця включення являють собою білкові відкладення, виявлювані в цитоплазмі і периплазмі бактерій (дивіться, наприклад, Сіагк, Сиг. Ор.
Віоїесн. 12:202-207 (2001)). Рекомбінантні білюи 5-С5Е експресуються в бактеріальних тільцях включення, і в даній публікації представлені способи зсідання таких білків, які дозволяють одержати активні білки 5-С5Е.
Умови для зсідання активного 5-С5Е
Щоб одержати активні білки С-С5Е з бактеріальних клітин, білки 5-С5Е експресуються в бактеріальних тільцях включення. Бактерії збирають, піддають руйнуванню, і тільця включення ізолюють і промивають. В одному втіленні проводять три промивання: перше промивання буфером з рН 6,0-9,0; що містить моновалентну сіль, наприклад, хлорид натрію; неіонний детергент, наприклад,
ТіІйоп Х-100; іонний детергент, наприклад, дезоксихолат натрію; і ЕДТА; друге промивання буфером, що не містить детергенту, і третє промивання Нео. Далі, білки, що знаходяться в тільцях включення, солюбілізують. Солюбілізація може здійснюватися з використанням денатуратів, гуанідилхлориду або сечовини; екстремальних значень рН; або детергентів, або будь-яких комбінацій вищенаведених впливів. В одному втіленні для солюбілізації (3-С5ЗЕ використовують 5-6 М гуанідин НСІ або сечовину.
В іншому втіленні додають ОТТ.
Після солюбілізації денатуранти видаляють з білкової суміші, що містить 5-С5Е. Видалення денатурантів може проводитися за допомогою різних способів, включаючи переведення у буфер для зсідання або заміну буфера. Способи заміни буфера включають діаліз, діафільтрацію, гель- фільтрацію й іммобілізацію білка на твердій основі (дивіться, наприклад, СіагК, Сиг. Ор. Віоїеси. 12:202-207 (2001)). Для видалення денатурантів можна комбінувати будь-які з перерахованих вище способів.
Утворення дисульфідних зв'язків у білках 5-С5Е стимулюється додаванням буфера для зсідання, який містить пару окисник-відновник. Пари окисник-відновник включають відновлений і окислений глютатіон (-У5Е-ІЗ550), цистеїн/цистин, цистеамін/цистамін, ЮТТ/З55О і ОТЕ/5555. (дивіться, наприклад, СіагК, Сиг. Ор. Віоїесп. 12:202-207 (2001)). В одному втіленні пари окислювач/відновник являє собою 5Н/З550 у співвідношенні 10:1.
Зсідання може проводитися в буферах з рН в інтервалі від, наприклад, 6,0 до 10,0. Буфери для зсідання можуть включати інші добавки для полегшення зсідання, наприклад, І -аргінін (0,4-1 М); РЕС; низькі концентрації денатурантів, таких як сечовина (1-2 М) і гуанідинхлорид (0,5-1,5 М); і детергенти (наприклад, Спарз, 505, СТАВ, лаурилмальтозид, Туееп 80 і Тійоп Х-100).
Після зсідання, білок 5-С5Е можна діалізувати з метою видалення пари окисник-відновник або інших небажаних компонентів буфера. В одному втіленні діаліз проводять з використанням буфера, що містить ацетат натрію, гліцерин і неіонний детергент, наприклад, Тмееп-80. Після діалізу білок с-
СЕ може піддаватися подальшому очищенню і/або концентруванню за допомогою іонообмінної хроматографії. В одному втіленні використовується катіонообмінна смола 5Р-сефароза.
Фахівцю в галузі техніки зрозуміло, що білок зсівся правильно, якщо зсілий білок має детектовану біологічну активність. Для білка С-С5Е активність може бути виміряна різними методами. Наприклад, біологічно активні білюим 5-С5Е є субстратами О-зв'язаного глікозилування, описаного в заявках на патент США 60/535284, поданої 8 січня 2004 року; 60/544411, поданої 12 лютого 2004 року; і нотаріальному реєстрі Мо 019957-01882005, поданому 2 лютого 2004 року, зміст яких включено в дану публікацію за допомогою посилання для будь-яких цілей. Активність білка 5-С5Е також може вимірюватися за допомогою аналізу проліферації клітин або аналізу білих кров'яних клітин у щурів (також описано в заявках на патент США 60/535284, поданої 8 січня 2004 року; 60/544411, поданої 12 лютого 2004 року; і нотаріальному реєстрі Ме 019957-01882005, поданому 2 лютого 2004 року, зміст яких включено в дану публікацію за допомогою посилання для будь-яких цілей). Аналіз проліферації клітин і аналіз білих кров'яних клітин може проводитися до або після О-зв'язаного глікозилування зсілих білків 5-С5Е.
Способи виділення кон'югатів відповідно до винаходу
Як альтернатива, продукти, одержані в результаті вищеописаних процесів, можуть застосовуватися без очищення. Однак, звичайно переважним є виділення продукту. Можуть використовуватися стандартні добре відомі способи виділення глікозилованих сахаридів, такі як тонкошарова або товстошарова хроматографія, колонкова хроматографія, іонообмінна хроматографія або мембранна фільтрація. Переважно для виділення використовувати мембранну фільтрацію, більш переважно із застосуванням зворотноосмотичної мембрани, або одну або більше технік колонкової хроматографії, як обговорюється нижче в даній заявці, а також у літературі, цитованій у даній заявці.
Наприклад, для видалення білків, таких як глікозилтрансферази, може використовуватися мембранна фільтрація, де мембрани мають відсікання по молекулярній масі від приблизно 3000 до приблизно 10000. Далі для видалення солей і/або очищення сахаридного продукту може використовуватися нанофільтрація або зворотний осмос (дивіться, наприклад, УМО 98/15581). Нанофільтраційні мембрани являють собою клас зворотноосмотичних мембран, які пропускають моновалентні солі, але затримують полівалентні солі і незаряджені розчинені речовини більше ніж від приблизно 100 до приблизно 2000 Дальтон, залежно від використовуваної мембрани. Таким чином, у звичайному застосуванні сахариди, одержані за допомогою способів згідно із даним винаходом, будуть затримуватися мембраною, а домішкові солі проходити через мембрану.
Якщо модифікований глікопротеїн виробляється усередині клітини, то на першій стадії видаляють дебрис, тобто клітини-хазяїни або лізовані фрагменти, наприклад, за допомогою центрифугування або ультрафільтрації; білок може бути необов'язково концентрований за допомогою наявного в продажі фільтра для концентрації білка з наступним відділенням поліпептидного варіанта від домішок протягом однієї або більше стадій, вибираних з імуноафінної хроматографії, поділу на іонообмінній колонці (наприклад, з діетиламіноетилом (ОЕАЕ) або матриксами, що містять карбоксиметильні або сульфопропільні групи), хроматографії на Віпе-Зерпагозе, СМ Вісе-зерпагозе, МОМО-О, МОМО-5,
Іепіїї Іесііп-Зерпагозе, МУСА-Зерпагозе, Соп А-Зерпагозе, ЕШег Тоуореап, Вшу! Тоуореаї!, РНепуї
Тоуореагі, або ргоївіп А Зерпагозе, 5О5З-РАСЕ-хроматографії, силіка-хроматографії, хроматофокусування, зворотнофазовою ВЕРХ (наприклад, силікагель із приєднаними аліфатични ми групами), гель-фільтрацію з використанням, наприклад, молекулярного сита берпрадех або ексклюзійної хроматографії, хроматографії на колонках, що селективно зв'язують поліпептид, і осадження етанолом або сульфатом амонію.
Модифіковані глікопептиди, продуковані в культурі, звичайно виділяють шляхом первинної екстракції з клітин, ферментів і т. д. з наступними однією або більше стадіями концентрації, висолювання, водної іонообмінної або ексклюзійної хроматографії. Модифікований глікопротеїн може бути додатково очищений за допомогою афінної хроматографії. Нарешті, на фінальних стадіях очищення може застосовуватися ВЕРХ.
На кожній з перерахованих вище стадій може додаватися інгібітор протеаз, наприклад, фенілметилсульфонілфторид (РМР) для інгібування протеолізу, а також антибіотики, для попередження росту випадкових контамінантів.
В іншому втіленні, супернатанти із систем, продукуючих модифікований глікопептид відповідно до винаходу, спочатку концентрують, використовуючи наявний у продажі фільтр для концентрації білків, наприклад, блок для ультрафільтрації Атісоп або Мійроге Реїйсоп. Після стадії концентрації, концентрат може бути нанесений на придатний матрикс для очищення. Наприклад, придатний афінний матрикс може містити ліганд пептиду, молекулу лектину або антитіла, зв'язану з придатною основою. Як альтернатива, може використовуватися аніонообмінна смола, наприклад, матрикс або субстрат з підвішеними групами ОЕАЕ. Придатні матрикси включають акриламід, агарозу, декстран, целюлозу або інші, звичайно використовувані в процесі очищення білків. Як альтернатива, може використовуватися катіонообмінна стадія. Придатні катіонообмінники включають різні нерозчинні матрикси, що містять сульфопропільні або карбоксиметильні групи. Особливо переважні сульфопропільні групи.
Нарешті, для подальшого очищення композиції, що містить поліпептидний варіант, може використовуватися одна або більше стадій ВЕРХ, що використовує гідрофобні середовища КР-НРІ С, наприклад, силікагель з підвішеними метильними або іншими аліфатичними групами. Деякі або всі перераховані вище стадії очищення, у різних комбінаціях, також можуть застосовуватися для одержання гомогенного модифікованого глікопротеїну.
Модифікований глікопротеїн відповідно до винаходу, одержаний шляхом великомасштабної ферментації, можна очищати способами, аналогічними описаним в роботі Огааї еї аї., У. Спготаїса. 296: 171 (1984). У цьому посиланні описані дві послідовних стадії КР-НРІС ж для очищення рекомбінантного людського ІЇ-2 на препаративній ВЕРХ-колонці. Як альтернатива, для очищення модифікованого глікопротеїну можуть використовуватися такі техніки, як афінна хроматографія.
Фармацевтична композиція
В іншому аспекті, у даному винаході представлена фармацевтична композиція. Фармацевтична композиція містить фармацевтично прийнятний розріджувач і ковалентний кон'югат неприродних молекули РЕЄС, лікарської речовини або біомолекули і глікозилованого або неглікозилованого пептиду.
Полімер, лікарська речовина або біомолекула кон'юговані з пептидом С-С5Е через інтактну глікозильну зв'язувальну групу, розташовану між і ковалентно зв'язану з пептидом -С5БЕ, і також з полімером, лікарською речовиною або біомолекулою.
Фармацевтичні композиції відповідно до винаходу застосовні в різних системах доставки ліків.
Препарати, застосовні в даному винаході, описані в Кептіпдіоп'є РНагтасеціїсаІ! Зсіепсе5, Масе
Рибіїєпіпд Сотрапу, РПйааеї!рпіа, РА, 171п ей. (1985). Короткий огляд способів доставки ліків дивіться в публікації І апдег, Зсіепсе 249:1527-1533 (1990).
Фармацевтичні композиції можуть складатися для будь-якого придатного способу введення, включаючи, наприклад, місцеве, пероральне, назальне, внутрішньовенне, інтракраніальне, внутрішньоочеревинне, підшкірне або внутрішньом'язове введення. Для парентерального введення, такого як підшкірна ін'єкція, носій переважно являє собою воду, фізіологічний розчин, спирт, жир, віск або буфер. Для перорального введення може використовуватися будь-який з перерахованих вище носіїв або твердий носій, такий як маніт, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, сахарин натрію, тальк, целюлоза, глюкоза, сахароза і карбонат магнію. Також як носії фармацевтичної композиції відповідно до винаходу можуть використовуватися придатні біоруйновані мікросфери (наприклад, полілактат, полігліколат). Відповідні біоруйновані мікросфери розкриваються, наприклад, у патентах США МоМо 4897268 і 5075109.
Звичайно фармацевтичні композиції вводяться парентеральним шляхом, наприклад, внутрішньовенно. Таким чином, у даному винаході представлені композиції для парентерального введення, які містять речовину, розчинену або суспендовану в придатному носії, переважно водному носії, наприклад, у воді, буфері, фізіологічному розчині, РВ5 і інших. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні додаткові речовини, необхідні для досягнення умов, близьких до фізіологічних, такі як регулятори рН і буфери, регулятори тонічності, змочувальні агенти, детергенти й інші.
Ці композиції можуть стерилізуватися за допомогою загальноприйнятих технік стерилізації або пропускатися через стерилізуючий фільтр. Одержані водні розчини можуть упаковуватися для використання як є або в ліофілізованій формі, у цьому випадку ліофілізований препарат об'єднується зі стерильним водним носієм перед введенням. рН препаратів звичайно знаходиться в інтервалі від З до 11, більш переважно від 5 до 9 і найбільш переважно від 7 до 8.
У деяких втіленнях глікопептиди відповідно до винаходу можуть включатися в ліпосоми, утворені стандартними ліпідами, які утворюють везикули. Існують різні способи одержання ліпосом, описані, наприклад, у роботі 520Ка еї аї, Апп. Кеу. Віорпух. Віоепа. 9: 467 (1980) і патентах США МоМо 4235871, 4501728 і 4837028. Націлювання ліпосом з використанням різних націлювальних агентів (наприклад, сіалілгалактозиди відповідно до винаходу) добре відоме з рівня техніки (дивіться, наприклад, патенти
США МоМо 4957773 і 4603044).
Для зв'язування націлювальних агентів з ліпосомами можуть використовуватися стандартні способи. Ці способи звичайно включають вбудовування в ліпосоми ліпідних компонентів, таких як фосфатидилетаноламін, що можуть бути активовані для приєднання націлювальних агентів або дериватизованих ліпофільних сполук, таких як глікопептиди, дериватизовані ліпідами відповідно до винаходу.
Для функціонування націлювальних механізмів звичайно необхідно, щоб націлювальні агенти знаходилися на поверхні ліпосоми таким чином, щоб націлювальні групи могли взаємодіяти зі своєю мішенню, наприклад, з рецептором на клітинній поверхні. Вуглеводи відповідно до винаходу можна приєднати до молекули ліпіду до утворення ліпосоми, використовуючи способи, відомі фахівцям в галузі техніки (наприклад, алкілування або ацилювання гідроксильної групи на вуглеводі довголанцюжковим алкілгалідом або жирною кислотою, відповідно). Як альтернатива, ліпосома може формуватися таким чином, що з'єднувальна частина вбудовується в мембрану під час формування мембрани. З'єднувальна частина повинна включати ліпофільну частину, яка вбудовується і жорстко закріплюється в мембрані. Вона також повинна включати реактивну частину, хімічно доступну на поверхні ліпосоми, що контактує з водним середовищем. Реактивна частина вибирається таким чином, що вона придатна з хімічної точки зору для утворення стабільного хімічного зв'язку з націлювальним агентом або вуглеводом, приєднуваним пізніше. У деяких випадках можливе пряме приєднання націлювального агента до з'єднувальної молекули, але в більшості випадків зручніше використовувати третю молекулу як хімічний місток, зв'язуючи таким чином з'єднувальну молекулу, що знаходиться в мембрані, з націлювальним агентом або вуглеводом у тривимірному просторі, а не на поверхні везикули.
Сполуки, одержані способами відповідно до винаходу, також можуть виявитися застосовними як діагностичні реагенти. Наприклад, можуть використовуватися мічені сполуки для локалізації місця запалення або пухлинних метастаз у пацієнта, у якого підозрюється запалення. Для такого застосування сполуки можуть бути позначені 7251, 14С або тритієм.
Активним інгредієнтом у фармацевтичних композиціях згідно із даним винаходом є глікопегильований С-С5Е і його похідні що мають біологічні властивості фолікулостимулюючого гормону, наприклад, що стимулюють овуляцію. Переважно, щоб композиція відповідно до винаходу, яка містить 5-С5Е, вводилася парентерально (наприклад, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно або внутрішньоочеревинно). Очікується, що ефективні дозування будуть сильно варіювати залежно від захворювання, яке піддається лікуванню, і шляху введення, але будуть знаходитися в інтервалі від 0,1 (приблизно 7 Од) до 1000 (приблизно 7000 Од) мкг/кг ваги тіла для активної речовини.
Переважні дозування для лікування анемічних станів складають від приблизно 50 до приблизно 300
Од/кг три рази на тиждень. Оскільки в даному винаході представлений 5-С5Е, що має підвищений час знаходження іп мімо, при введенні композиції відповідно до винаходу зазначені дозування можуть бути знижені.
Дозовані форми
У переважних аспектах, відповідно до будь-якого вищеописаного способу, пептидні кон'югати відповідно до винаходу, використовувані для лікування захворювання, яке стосується гематопоезу або мієлосупресії, надаються у вигляді дозованих форм для перорального введення. У переважних втіленнях, ці дозовані форми для перорального введення включають наступні компоненти: (а) пептид, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е і водорозчинного полімеру, де водорозчинний полімер ковалентно приєднаний до пептиду 5-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку пептиду 5-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи; (Б) одну або більше поверхнево-активних речовин; (с) одну або більше жирних кислот; і (4) кишковорозчинний матеріал. В особливо переважних втіленнях пептид, поверхнево-активні речовини і жирні кислоти змішують у рідкій фазі і ліофілізують перед об'єднанням з кишковорозчинним матеріалом.
Варто розуміти, що приклади і втілення, описані в даній публікації, наводяться винятково з метою ілюстрації і що, у світлі цього, різні модифікації і зміни, пропоновані фахівцям в галузі техніки, включаються в сутність і обсяг даної заявки й охоплюються наведеною формулою винаходу. Усі публікації, патенти і заявки на патент, цитовані в даній заявці, повністю включені в неї за допомогою посилання для будь-яких цілей.
Нижченаведені приклади наведені для ілюстрації композицій і способів згідно із даним винаходом і не обмежують заявлений винахід.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Дані фармакодинаміки на прикладі підрахунку нейтрофілів у відповідь на пептидний кон'югат 5-С5Е відповідно до винаходу
Дослідження фармакодинаміки на прикладі підрахунку нейтрофілів у відповідь на кон'югати 5-С51Е відповідно до винаходу і наявного в продажі з-С5Е нейласта показали, що композиції відповідно до винаходу мали подібний з нейластою період дії (фіг. 1) в однаковій концентрації. Кількість нейтрофілів залежала від дози - підвищуванні концентрації кон'югатів (3-С5Е відповідно до винаходу (глікоРЕС -
СЕ) приводили до підвищення кількості нейтрофілів на піку періоду дії. ГлікоРЕсС 5-С5Е індукував відповідь, приблизно на 30 95 вище у порівнянні з нейластою, що вказує на підвищену на 60 95 біодоступність глікОРЕС О-С5БЕ у порівнянні з нейластою при порівнянних дозах.
Дослідження включало 53 суб'єкти. У кожній дозовій групі було по 20 суб'єктів, з яких 15, визначених випадковим чином, одержували глікоРЕС О-С5БЕ, а п'ять - нейласту. Загалом, глікоРЕС О-
С5Е переносився добре, профіль побічних ефектів був подібний з таким для нейласти. Не було ні одного припинення дослідження з причини побічних ефектів. Також не було ні одного випадку серйозних побічних ефектів. Крім того, не було виявлено антитіл до глікоОРЕС 5-С5Е.
У таблиці 4 наведені репрезентативні дані по трьох різних концентраціях глікоОРЕС -С5Е за період часу від 24 до 168 годин після введення глікоРЕС 5-С5Е.
Таблиця 4 96 17111110 36,9222 77111111 237667, | 124625 ЩД-БЖЖ
Приклад 2: Дані фармакодинаміки на прикладі підрахунку клітин СОЗ34-- у відповідь на пептидний кон'югат 5-С5Е відповідно до винаходу
Дослідження фармакодинаміки на прикладі підрахунку клітин СОЗ4-- у відповідь на кон'югати с-
СЗЕ відповідно до винаходу (глікоОРЕС О-С5Е) і наявного в продажі з-С5Е нейласта показали, що композиції відповідно до винаходу мали подібний з нейластою період дії (фіг. 2) в однаковій концентрації. ГлікКОРЕС О-С5БЕ індукував значно більшу кількість клітин СОЗ34 -- на піку своєї активності, ніж нейласта в тій же концентрації.
Кількість клітин залежала від дози - підвищуванні концентрації глікоРЕС 5-С5Е приводили до підвищення кількості клітин СОЗ4- на піку періоду дії.
У таблиці 5 наведені репрезентативні дані по трьох різних концентраціях глікоОРЕС -С5Е за період часу від 72 до 168 годин після введення глікоРЕС 5-С5Е.
Таблиця 5 пи: С ПО Тех ПОЛЯ ПО СУ ДО ПОТ я
Приклад 3: Дані фармакодинаміки на прикладі підрахунку нейтрофілів у відповідь на пептидний кон'югат 5-С5Е відповідно до винаходу, дослідження фіксованої дози
Дослідження фармакодинаміки на прикладі підрахунку нейтрофілів у відповідь на фіксовані дози кон'югатів 5-С5Е відповідно до винаходу (глікоОРЕС (-С5Е) і наявного в продажі 5-С5Е нейласта показали, що композиції відповідно до винаходу мали подібний з нейластою період дії (фіг. 4) в однаковій концентрації. ГлікоРЕСї 4-С5Е індукував відповідь приблизно на 30 95 вище в порівнянні з нейластою, що вказує на підвищену на 60 95 біодоступність глікоРЕС О-С5Е у порівнянні з нейластою при досліджуваній дозі.
У дослідженні брали участь 36 здорових суб'єктів. Загалом, глікОРЕС 5-С5Е переносився добре, побічні ефекти були подібні з такими для нейласти. Не було ні одного припинення дослідження з причини побічних ефектів, і також не було ні одного випадку серйозних побічних ефектів. Крім того, не було виявлено антитіл до глікоРЕСс (-С5Е.
Приклад 4: Дані фармакодинаміки на прикладі підрахунку клітин СОЗ34-- у відповідь на пептидний кон'югат 5-С5Е відповідно до винаходу, дослідження фіксованої дози
Дослідження фармакодинаміки на прикладі підрахунку клітин СОЗ4-- у відповідь на фіксовані дози кон'югатів 5-С5Е відповідно до винаходу (глікоОРЕС (-С5Е) і наявного в продажі 5-С5Е нейласта показали, що композиції відповідно до винаходу мали подібний з нейластою період дії (фіг. 5).
Приклад 5: Мобілізація алогенних/аутологічних попередників клітин СОЗ34-- у периферичній крові
Донорам кісткового мозку вводили 10-20 мкг/кг глікопегильованого 5-С5Е (глікоРЕС 0-С51) протягом 5 днів для підвищення рівня клітин СОЗ34ж- зі значень, характерних для стану спокою (приблизно 2 клітини/мкл) до приблизно 10 клітин/мкл, чого достатньо для одержання 2-4х105 клітин сорз3а4ч/кг у ході однократного аферезу. Донори кісткового мозку можуть бути алогенними (відмінними від реципієнта) або аутологічними (ідентичними реципієнту).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«-110» Віосепегіх АС «120» Способи лікування з використанням глікопегильованого 5-С51Е «130» В 8829/:М -1505 05 60/909917 -151» 2007-04-03 -1505 05 60/911788 -151» 2007-04-13 -1505 05 60/986240 -151» 2007-11-07 -1505 МО2008124406 -151» 2008-04-01
«1605 11 «170» Рагепіп мегзіоп 3.3 «2115 175 «212» Білок «213» Ното 5арієеп5 «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (1)... (175) «223» дикий тип людського З-С5Е з М-кінцевим метіоніном «4005 1
Меж Тв хо Гед бі Бко вата Зех Бех без Ро бів бек оВвйє Бей без 1 В 18 15
Пув о Сув без піз сій Узі Ако Пух Т1іе Сів б1у дво пі віта Аа дей го -5 БІ бів Біо бук їй бух Аза ТВх Тук був Тем о Сув Вів Бго бій сім Без 45
Уді іч рей ку НІВ Шек о бецп о зі Те Бо Тк АТа то во бек ве
Ба во шу ГЕО бсЕ Бій ді їз ЗІ1й без Аїз Зі Суз їв Бех бій бед Кіз о ї5 ЗИ
Зек 5іуУу Пей ре гей Тук бів З1У є) ей біт Аїз Без бі Біу їїе 85 ай 85
Бек Рус бій цео сту вБко Тк оїєх Дер о Трх Пез біб оре) Авр ові Віа ї15И КОВ. 18
Аве Бе Ата тп тн Ії ТЕробпів бій Ме За ота пев обім ме Аїя її їх 175 тТко Аіва бе) біб Бгто Тв Оз сіу Аїз Меб Рко Ата вве А1їво бек Ата 130 Т35 15
Рпе Зіп Агоз Ака Ахв о біу зіу Уаі Гео Уві Аа бек Нів Ббед о бїв бек ї45 щи аа ї5О пе іїсм Зів таї век Тер Аку Уві пед втеЯ Ві85 пе АтТа сало РКО і53 170 1575 -21052 «2115 174 «212» Білок «213» Ното 5арієеп5 «220» «221» МІЗС ГЕАТОВЕ «222» (1)... (174) «223» дикий тип людського 5-СОЕ
ТВЖж о ЕсО ви бі ко іа бек бе Без бро бій бек Ре Бей Гей цу у ; : : в і 5 19 18 бе мер біш біл УВА Ахка бує 316 бів сіУ Авв бі Аїв Аїв Пер ств о 25 30
Сів був цей Сув діа Тйх Тухк був Бен оСув Вів Рта біз сію Пвз Уві ен Іей піу нів бдех цей біУ Іїє Бкб Тжб Алі ВКо рецобех Беж був во руш ошек пів Аїа Її біл опен діа біу бух Бей Явт бій Шев Ву бек
БУ то ТВ во бі ва ЕБе Бей тТук біп о сту ев гей ос Аїа Гей бій 515 Те ве 85 за Зв:
Рка біз Гео біу го ТвЕ Пец Дяр Ту беє піяй Беу Дер Узі Ді дер 15о їі їто
Вбе іа Твх ТВ оїТів Тхрошіт бів Меє біз біо без біу Меє Аїа Бо 115 150 125
Аїз пе бій о Ркхо тах пів піу Азіа Меб о Ркго Дій Бне бід бек йіа Бле 185 135 тай бів Аку Ака йтїа біу біу Уаї цер Уві Аїа бек Піз пе)» бій бе бе 145 ншек) Її ув0
Без біз Уві Зеє Ту вкЕЯ Уаї ев Ага Віш Бей Айа біт РК
Тї55 У «2105 3 «2115 178 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005» З мех тТиє вБкО їв 51 Бкб Азія бек бах Іво ро піп беж ЕБе опе Це 1. 5 1 Т- руш був Беч бід ія Маї Аа цу Ті біз бі дво сіу вій АТа ех 2 25 Зо бій біз бук без Уаї Зех бій був Авфа ТЕЖ Тує Му Бей Сув ЧЯЧівз ре о 8 45 сів піч без Уві тез Ген б1У Нія бек Тер оЗ1іу їїе Го ТгроАза Ро
ЗО | зе 5О
Без бех бек Сув Рко бег обіп від Пем пів пев дія Біу Сув їй Бех 55 Що: 5 й сСіп беб; Нів бек опію пей РБае бец Тук біпо біу Без Бей Сів Аів їв
У У у що 95 піз біу 11 Бех го зів Бе) й1у бго Тпх Бей АвроївЕ Бей обів без
І0О 1 110 дво о уВї Аїа Ач Ра о А1З1ва ТВЕ ТБж їіїє ТЕО пій бій Меб ба буз еВ
І5 125 їй біу Меб Аїа Бко д1івВ пед сій Біб Те оПіп 01Уу Аа Меб Бго від рве 130 135 145 діа Бех Аїва Еріз о бів Аку Ажо Лія О1іу бі Маї Меч Уві Аї8 бах Віз
І1Я5 150 1855 160 ївп бів Зеж Ве їеч о біо Уві бву Ту Ава Уаї бев АтгтУ Нів ей Але і1Б5О5 їі70 І175 іп рКо «21054 «2115» 204 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005» 4 мек Аїш б5іу Рсо діа Тс Св оба Рбо Меб Був Бем Мешб дя їв ЗТ ї Я 1а ї5 їжа Бен ії ТКр Кіз Бек діа Гей Теротнк уаї бів сі Аза ТАЖ вхо 25 зо цей біу кб дів бех беБ реа Бгто біп баю пе тез По Був о Сув ем 40 45 сів бій УВІ вк Був Її 216 Бі дв овіУу Атїа Аз бец біп бі пув о З БО
Іевн осСув Аів тТне Тує Був бем о СувоНів Рка бів бір їви Уві Бей Пец 7 75 50 сім Ні Бек Гео сіу їїе Ріо То Ат Рро Бо» Бех бек Су РКО Зеш 5 зо 95 біп Аза цез бів Сей Азїп біУ Су бен Бех біп ойейп ів звкобію Пед 100 165 110
Рпе мей ТУук піп бу Бе во ій Ака бе) січ бхУ дз бек Ро би
ТЕЗ 15259 1275
Бем зу РКО Щи Бе Дер ТБ ба бій їеб йЕроУа1 Ала Аве рнНе Аза 130 135 140
Тит Тв тів Ткв п)в бів Ме бів бій бео бі Меє діа ро Д18 Інн 155 158 55 50 біп рго ТНЕ бів обі Аіз Меб Рто Аїа Рае АТїа пет Аіа Ре біл До 165 179 175 лке Ага зі сіу Уві Бем Уві АТкя бек Пів Сем біп бак ББе бер й
ВО 185 130
Уазї Зек ТУук Ага Уаї Без Аку Ні без Ата зі Бо
Му Ой «21055 «2115» 207 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005 5
Меї Аза біу Бо Ат ТБо біз бек о бге Меб Був їй Меб Лія Пйем біл ї З НК її
Пец бей пецй Ткр о Вів бер Аза Пем Тер оТвЕ о Уаї біп бій Аїз Тне Бео 23 2 ЗО їви біу Бго Аїа бегобех Мем Бгто біп обех Бе бе Ти Буз був тей 45 о 15 біз бів Уві дк був ї1е ЗіБ б Авробіу АТа Аза Пех 51 ЗІБ ув 55 5О аз о Ууак бек біл Су Атїа ТлЕ Тк о Сув Бей Сув Нів Бро ста бій бец 65 7 75 во уаї пти цей 3З1у пу Бех пед зі т165 ЕЖОо Тр Азія Рхо Бей бег бек 85 зо Зо
Сук Еко Зек Бій АТа Бе: біп без АТа бБіу Су Пен бе бій Без нів 105 113 деко біу без ве пев Ту» бІп біу Гез Бей бів АТ гео спам обі ТІ1Є
КЕ 129 25 дек Бе піп їей б1іу ЕТ Тих Грей АБО Тв їв сій Себ дев Уві дів 135 135 140 дз зе Аза тнж ТБ ІТ ТЕропій бів Мебє сів 5 ви біу МеЄ Аза 145 ї50 155 ї650 хо АТя Бей біп Руб ТВх о біп БІіУ Аза Ме Бко Аза Бе Аіа беж Лів 165 175 175 гба бів Ако два Аіа о біу біу Уві пев Уві Дів бек Ніз Бев о біп бек 150 І85 150 ве цем бів лі бЗех Тук Ако Заї Беб Ака Ні Тїей Аїз сів ро
І135 20 25 «2105 6 «2115 176 «212» Білок 213» Штучна
«223» 1-С5Е варіант «4005 6
Меї Уві ТвтЕ Руо Пес сп3іу Рхо дів ЗБ бет ем ре Зме Зеє орРвпе бно
А 5 0 15 їй пуз Сув пей сів бій МВ) Акад уз Те біп сту Авросіу Атїа дів го й. зо тва піп сій пуб ем о бузх Аза ТНЕ Тук га беви СУ Ні ро о злю 1 ївч У) ей Бей о біу Ні ТБ без біу т1е Рро Жко Аза Вго еновек
ВО 55 5 бе Сув РрРхо бБег Піп діа їєц бій Беш Аза біу Суб ей дет бів Тез 3 70 ть 50
Вів бер щіу без Бе Гео Тук бів біу шо Бей бБІп Аїз без бій С1У 85 Зо 55 її дек Ро шій йо обіу Бсо ТЕ Без Авр о ТпЕ без біп ей одвр Уві. ї9а їа5 119 йїа дар Впе Аїї Тбх Тв ті ТЕр біз 5ів Меє біз ій сви бтіу Мес 115 155 125 13 вко дів Бей біб Бго Тв бів бі Аза Меб Всго пів Рбе Аза 5еЕ 130 | 135 14й
Аїз вне бів да Ася Лів йпіу біУу Уаї без Уві ліз беж Ніз їжи БіВ 145 15 155 158
Ваг збе їжа біз Уві бех Тукюк Аку маї Беб йко Ні ей Аза бів рЕо 185 179 КЕ -2105 7 «2115175 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005» 7
Ме Ти рев вм бі Вже Аза бах Бех Гей Рео сій бек ВВЕ йеч де 1 5 10 15
Буз Сув цей біб сій Заї Ак Буч Тіе сів о БіуУу двровіЖ Аза вія паю в: 25 Зо сів бі пух Пе) Сув діа ТВ Тую був бео був Нів Рго бій: Бій їеч яв ке 45
Чаї Бей Гео біу Віз Тк обец б1іу 118 Бо Тхр Аза Рго Мей бе: Бек
Суз Рко бех біп Аза Гец біп без йів б1у Сук рем бежт біп о Ббеч нів 65 ЩО 15 во дек біу їец Ра пен Тк бій 01у без Пез бів Аба еп бій Ту Тів
ЗО 95 беї Рхо щіс Без СІу Руб Тк цей Аве Таж Баец бів вих Авроуві Аа во щ05 я;
Дав о вне Аза тТвЕ Тнж о ті1є ТебоЗівз бів Меб біб с5ІЗ Тез біу Меї Віа
ТЕ5 180. щи5
Ехо Аїва Пец бій рко ТТН Біб б1їУу Аіа Меб рто віа РПе Аїда 5еЕ Аа 130 135 140
Ра сів дха Ак Аза біу Біу Маї Печ уві діа бек Нів Бем шій 8 145 150 55 ї60
Бе оце) біє Маї баг тую Ас Уві Пец Ах віях Гез АвТа Бій ехо 155 Шо 78 -2105» 8 «2115 176 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «400» 8
Мет баї Ту Ба їв 5і» Бсо Діа Бех бек база рто біб бек бе Бей
Щ 5 т т я Що Ко; Моя ви був Сув пей бі сів УЗї АкЯ пуб тії бій біу Дер о бІіу Лія лів
В : 30 вм обіп піз Був гях Су Атїа Тв Тук пув ва Суї Нів БЕо б1з 1 о 10 45
Ти Уві се рзи біу бек бек во бу 118 Рго Ткр Аїз Рго Тез бек
Мей я во
Бек Суз Вго бак бій Азія рей бій пес ВТа бі Суш їжи бек бій Це 79 75 во
Нів Базу 5ІУу Гпеи вве Гей ТОК шБіп с1іУ бео пев опій Аїя ей; ба ЗІУу 85 що з5 1 дес Рхо сія би б5іу РЕО ХХ їм Ав тах Бей бі ей Ав ув ї905 05 110
Аіз Аве рре діа Тк так їі Теб бій біп о Меб біб 515 без БІ Мех 115 ї5а 125
Віа Ро Аа йш БП о Бжхо Тв осів біу АвБа Меб ко йіа Бе дів ях 150 135 ї50
Аїа вае бін два дкЯ Аів ту БЬУу уві ем Уві Аза бек Нів Гей бів 145 159 158 тео беж КНе це) біз уві Бек Туї Аг Уві Бей Ак Нів цей Азв бій Бо 165 170 те 2105» 9 «2115 176 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005» 9
Мес біп о тТпх Ро Бей ЗЛу Бго дів Чек бек їжу то пі беїт бйе Гей 1 З 15 ї5 їеа пув Суз еф обій біп Уві Ага був 1їе Зі 51 Авр БІт1у АТае Аїа о 5 30 ей се Ся був їй Су Аза ТВ Тук пух без Су Нів то бічй Би а СН 45
Мей Мі цем їшю біУу йів деве їн бБіуУу Бі ко ЇїТхр о Аіа Рхо бе дет
ВО о
Щек Сув хо Бех Сі Аза без бій дез о Ала ві Суд пе Бех бі Пец
ГеБе: то Та Бо
Ні Зек пу пев Р Цей о Туюк бій біу цеб це) б3ійп дій івп бір сі ве 30 35
Тіе бек Рто бій Гео бБіу ро ТВх Пею Ав оТпе Меп біт Пех Аво Уаї то їа5 116 дів др о вБе дів Тпх ТБкЕ Її Ткв оз сів Меб біб бід бей біу Ме
І115 ї2й 175
Вів рго Аза без ОТ1К Ро ТІ о Біп Бі Аів мас о бко вія Бе АВ Бах 130 135 146
Віа вВпе бів Ага дхо Аіз 5і1у біж Уві бев уаї Аза бек Нів бвиа бл 145 ї5О 155 155
Зет пе рец біо Заї бехотТуїх Дко Уа1їі Пет Ато Віз бев о АЛіа б1іх Бр 165 175 175 -2105 10 «2115 181 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005 10
Має Так Рус Мей п1і1у Ро Азїв бег БбкЕ Га вхо бів бЗаж Рбе Бей реи і 5 10 15
Був Сув Сез пр сій баі Ажа уз іє б1п о біУу Ар о біу АБа Аза Цей
МВ; да о. біз сій пух їецз Сув АТа Тв оТук о цув оце Суї Нів Бео біч біз Вей
Уаі бец оїец бі Ніз бе без обі її Его Тхр Аіа Буо їеву бег Бег
БО
Сув Ро Зак піп діа без біп о бец Аіа біу Суз ву Бек бів дез Вів
Ба та 73 во
Зах бі Пес РбБе рем о Тух бів біу без Ге) бій лів Пем б1а бтіу 118
ВЕ Зо 83
Бех го бів Бей пБіу Рко ТБк о йез Дар тТБу без біб Бей Авр о Мав ід 109 105 110
Дар о Рпе Аза ТЕ ТВЕ 2118 Тер бій біп Меб січ біс бєо сі МеЄ лів її5 120 1953 жо Аіа рез біб кб ТВХх бій біу Ахя Мех Бо дів рве Дід ет Ах їза ВЗ 180 бне бів о дхч дк Азїа біу 5І1у Маї еп уві діа бек НЕБ То 51 Бех 145 ї50 ї55 15 вне рей бій Уві Беж тує Ак уві цеч Ахо нів цем Ата іп орто ТвЕ 165 то 175 сів сіу АтТа Меї РКО 185 «2105 11 «2115 175 «212» Білок 213» Штучна «220» «223» 1-С5Е варіант «4005 11
Мек тнж рРко Бе біу Бхо Афа Бех бер о пез РКо бій Бек Ре пем ву 1 З То 15
Був Сув рев Пт: бів Тді Ак обу Ті Зіп біу Авробзіу Аія Аїа Тео о З 36 піп біз руб ей Сув Аза ТБЕ о Тує Був цей був бів БКОо біз бій Бей 35 10 їв
Уа бей рей Зі йек бес бебі Тіе РЕО Ткб Аза ртга Гей бек Зв
Зо 55 50 пу РКО дек сій Аїя йеш бій ев Аїв сі» Суб їв бек бій їв Пів 55 та т 85 пет біу без Ре пео Тух біп бі цей ої біп Аза без біс бу Ті 8 ЗО 95
Же Рко 10 бем біу хо Так омею дроті Її бів цви Аво Маї лід 105 ща 115
Авровре Дія ТЕ ТВ ті тр осйіп біп Меї бі 519 іїнч бі» Ме Аза 115 120 125
Во тв Тс ТВ ро ТАК бів ТЕ Аїа Мас Бго Аза пе діа баг Аза 139 135 143
Епе ств ху Вгч АтТа сау сі УвЬ Бем Узі Аза бЗеає НІВ Без бій беж 145 150 ІЗ5 180
Ере сем зі: Маеї бек Бук Ага Узі Цец АкФ нія Сея Аза біт Ро 15 179 175 де нн нини тони піна понині нн нон нн ин ! рекет нт нт туту отв рнвпно яння 1 яку х 5 тя чек К тивних Ма МКГ МНК СЕ гей В
З за ни Ентоні Яд опт сват н конвою нені Зо МегЮ" СВО СВК , ' Шк: | сні 10 ЯЖелку пло Я (ре)
Ре | ик ШЕ ит деонттня пи і ІС мк нейиа ке 5 ! - ци й ТО денне еоткіцннетсввояннесбоннннесенннй, шва мчч ши
І жи щі ЩІ го А | кі - Ж 2-2 ЦК» слини НК ЖИ ши нн
Е Зх - сват ж ШК ; З й ож, вин ЧЕ МИ, ЕН ви вин пу 0 В в ОН НД А НН анонсів сс пр нів сзввввн і Й о Зк яв ТЕ Зб 36 лая зай жах жів деп ЗБ Б 3іЖ З Зо Зя Явя АЖ яв ай ом
Час
Фіг. 1 грі. ря ие вк ПАЛ ІА М ЖАЕАААЛЛКТ КАТААЛ ТЛІ ВАЖИВ АЛІ ХТЛМ АЛЕ із АКВА Ла: ІНВ ЖКААІААААТІ ТЕ піт тАжжкикях що 1 шен З Ме КС ТЛіНИ НКИ СНСКЕ е
Г ! нт мирно твоВ в СЯ Е і ; : 3 тей ДК мкиткр ГК ОРОК СО бе і ; ой пили шах пон ї
І : ж реве ТО) миркх нейлзсра пееЕ ЗХ З ! 1 шо ген пам
Ж в рення . Е не Ан дпа АЕН ААНААН РА А как ЖКК дя УААН КН т Кат Сддокдеттекрдетт я ГРАД кіста тів,
В ав ше сосо рань й. ай ше пшанжаааннаиа и а А а а А А и ж а А нн
Си НК а ь ЧИНИ асани и Ше я
Б зви, знан нс нн ннннодннраван І сннюкі соссвкни ИЙ ща а За Яй 05 жав ча ща лик сб аб За Ба Зх З5Ж см а зба зх аб яв я
Час(ті
Фіг. 2
І Фармакокінетичні | Пілотная З Грула | Гру отв о параметри СУСЯЕ 000 коРортй 0 (Зомкоке ХМ (ббмклює 000 боб мюлюк о (ХМ.22 або ообзмююже 22, тесті ХМ-22,тесту | нейлаєта, еталон) х КУ ік й | ; тест) : ї пегфілграстим) (Од)
АМСеюлішеітгіми)! 00 8658950 0 2679723 с і5тад9а359 Я
Данні льні Ей В МО Щ Щ кдеттвалалттваяксе тетесттовАястиістенететтстня мн й шо
АП до ЧИЛІ ' НОЮ се ютвляЯ 59057630 ТИ я ищ
ГО Гмлічко) с 2526 18,86 Ге: ШИ
Сак ЇИгЛМл о 3642495 1 6343032 | 29662665 87554
Єлпах ІЧ А ши ШЕ з42 00250 бр ІЧ) до, а ох рою | 23,4
МЕТ чі 54,55 48485 4580 35437
Фіг. З й Ї ТЯ Ан ля ТТ АААЛ Сн кКА т Ні нки нан Мт ее тт кит Кен скид ЖК Я на тя нку
Точне МЕ ТЛІЖВККЕН КСВ НІЯК : да скік сіеввчк скскедоле т й й і ї
Щі й ни що Й і нндінийх МЕ неЙЗжСТа (пе Я 1 (ок жі тут ЖЖ кт КАР МАЖКЖЖИ КАЖАНИ, кто ЗД: уколи в ; постфекнндкнк поп - - що окістя не й я !
Ше ен пк зн дес ткееескн кю дети оддтк тус сть кт туттк антнтя нмкннанананнт, жо Ш леї
Шу ша пишних зи іх саестолов ін ди НН и ї 411 о чи ї я Мн Й -з Е
Ж фік пелет алалалЛАААУАТ ЖЖ АКА ЖЕ КАЖУ ВВ А і тт ТІТКА Ж А крнвнянн Ж ктМежні фета піт з ння кіно з ооо ній я ково ЖЖ ВЕ Ж чяж ЗБК ЗУ НК Я З сжФР Ос о ЗВО З сао ах оо вою
Час
Фіг. 4 а ун пи Кекс ті КК Є НН Я В КЕКВ КАЛ нт АЛ АЛЛА ТТ ТАЛА КАТ ТК АР Манія тт тт «сні т ВА мон отче нет
Її ! і ів вів вані пп п пн и пі пи ні я --і ! і | ее мгтлікавво п СХв 32 бренннотнннч КЕ ЕЕ Те ЕРА ТАТ КНТ ер ж ж ж пр ЕЕ тт нот ЕН яння ме ей вів я Кі Я ! ! і | анна но !
НВ рлохоттнтетнняаптпададаналттттаа флак ннтттт аа АААААК стала КА с кт ненні плн АААААААА КК і АААААКАКААААААКА ІТТ КЛ КАХ пет А, форт п : щ і Й
СЗШ в кни шен моннн мн нн пото пн пн нн нн нн нин ге | Ж ї і х | ОЇ ! Е жк як з й ус Ї е т з она нин нин нн пн пи п пн
В
ШК я фонову сб бексенідрснтие птннтнннкя ше рт т ванілін наван
І У е - ПИВ ооввнднввово ДК поведе ватри си фі чнянннть ШЕ
Фо йо Я ЖЕ бе що зая жа ж й я зе сВе Зх ЗМО юЮ вай ов же я о аже о Ни
Часті
Фіг. 5
Результати фарнакодинаніки у яванських макак пн в а и п ОО І ПО
Дорн тн тт ше че ВЕ ше на ПИКОРЕСЬОНСВЕ ї у8 4 афсиинь тан НЕЙЛЖОТИ бе | дл в- Киацтрелю носій
За я рт ня пе кмироьноя ! он х Ук. шк ро" х с ви м миши спина ни ншти : Час) жона ни а нн нн в а се студент
Фіг. 6
Результати фарнакокінетики у яванських макак, 100 нкг/кг підшкірно
Дт т тет тт тенет нене нене 1 с. ї 00010000. рт пт аа ие и ї Е
Госесве і ! ї 1000. перу тт - КО СЕ що І ї Те сви шок нн Кепнаста : !
Е ТО я «М тег: діесссттих МЕДЕРЕЕ КК КК косі дон Е : ; Я в, ! ж КІ г ;: чани пар тт тт 1 : / ї. р. де в пр нн п нн х
Е. ІЗ
Її І Е ї . 0 20 40 во во 0000120 '
Час (З
Ї уникати птн нал стики нотою тити нт ее етеетев стеком жк
Фіг. 7
ГпікоР 0 0-С5Е Її його рецептор оо Ну 0 РЕО Є и: ян ав. шин
УНН і и в ля и Я анг ща: ек 0
НН т ан с
Ані її шо ь з». 6 о м/н у Ко 0 ЯК й пстьочвь, -и. и чу -ьайЙДщ -ееБ й
Фіг. 8 с пи нн нн нн нн сн нн нн нон : і вонмю ре | " пт вет нен БО мире кліка РК ССЗ в І І - З М Гаю мкг гаосеИ СК ве) ЕН: ! ге яке 1; нн и В ТТ МИТИ ТА КИ СУ Я сша !
Де квиннннннннннний й НВ ;
В : га ВИ: їв Он Ки х пан а в п п т п се
Е зам п Е у іш Петті тт «не В. - же нших
В -
Фо ве жо тж Фо о аж лвж аж де ше жа Ж ЗЕ За Зае Ба ж огХ аж аа я
Час)
Фіг. 9 вісь; нн и пн он сп нн нн пон пон пп ни пн ни пн нн нин нн о
Ї ее ми сдію в Ен КІ І! каобах - пінні піні па упало о, ЩО пк І ендені м мейлнета (ех : - і і | Я и в нн ГЕ око о
В НН ї їх Зооска 3-3 Її кі А тт
Ж рис ЕЕ п в НК ре жк тих 1 "за Я ! зюивва. «френч ре фр етннтнана пдансаснннтілнттт т тт піпетка тості бтотеіонегін ва ою сстетн, « НК аж ЖЕ оч чна тад о чхжж ЯК й па ЖЕА АЖ ж зба ЗБК обов жук а де зак ве (г
Фіг. 10

Claims (31)

1. Спосіб підвищення продукції стовбурових клітин у донора, де зазначений спосіб включає введення зазначеному донору деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е 1 полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де зазначена кількість являє собою одиничну дозовану форму, вибрану з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг м1.200 мкг/кг.
2. Спосіб за п. 1, де зазначена полімерна модифікуюча група являє собою водорозчинний полімер.
3. Спосіб за п. 2, де зазначений водорозчинний полімер являє собою поліетиленгліколь.
4. Спосіб за п. 2, де зазначений водорозчинний полімер вибирається з лінійного водорозчинного полімеру і розгалуженого водорозчинного полімеру.
5. Спосіб за п. 1, де зазначена полімерна модифікуюча група і зазначена глікозильна зв'язувальна група ковалентно з'єднані за допомогою лінкера.
б. Спосіб за п. 5, де зазначена глікозильна зв'язувальна група включає модифікований залишок сіалової кислоти, і де зазначений модифікований залишок сіалової кислоти має структуру відповідно до формули: со: но ен но В о кК-- НМ он , де К означає зазначену полімерну модифікуючу групу, і зазначена полімерна модифікуюча група приєднана до зазначеного залишку сіалової кислоти за допомогою зазначеного лінкера.
7. Спосіб за п. б, де зазначений модифікований залишок сіалової кислоти має структуру відповідно до формули: Со: но он о но : о НО Ах АХ Нм (в) п (в) СИ он , (в) де п означає ціле число від 1 до 2000.
8. Спосіб за п. 1, де зазначена полімерна модифікуюча група має по суті гомодисперсний розподіл молекулярних мас.
9. Спосіб за п. 1, де зазначена глікозильна зв'язувальна група містить модифікований залишок сіалової кислоти, що має формулу:
он он он Кб у о ра в Її и о З МН дз
Вт. да і. де ВЕ? являє собою Н, СН2ОВ, СООВ! або ОВ, де В" означає Н, заміщений або незаміщений алкіл або заміщений або незаміщений гетероалкіл; ВЕ" незалежно вибрані з Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, ОВУ, МНС(ОК", де ВЗ ї В? незалежно вибрані з Н, заміщеного або незаміщеного алкілу, заміщеного або незаміщеного гетероалкілу або сіалової кислоти; І" означає лінкер, вибраний зі зв'язку, заміщеного або незаміщеного алкілу і заміщеного або незаміщеного гетероалкілу; Вік! означають незалежно вибрані полімерні "плечі"; Хі Х" означають незалежно вибрані зв'язувальні фрагменти, що з'єднують полімерні групи ВІВ із Сі Х" являє собою нереактивну групу.
10. Спосіб за п. 1, де зазначений амінокислотний залишок вибирається із серину 1 треоніну.
11. Спосіб за п. 1, де зазначений пептид О-С5Е має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:
1.
12. Спосіб за п. 11, де зазначений амінокислотний залишок являє собою треонін у положенні 134 5ЕО Ю МО: 1.
13. Спосіб за п. б, де зазначена глікозильна зв'язувальна група містить субструктуру, вибирану з: і- (СаімАс); (ба), і- (Саімдс),--(Са),- бЗіа-- В/» де ВЕ! означає зазначений модифікований залишок сіалової кислоти; і рі 4 означають незалежні цілі числа, вибирані з 0 або 1.
14. Спосіб за п. 13, де д дорівнює 0.
15. Спосіб за п. 6, де зазначена глікозильна зв'язувальна група має формулу, вибирану 3:
ши г Мап--(СісМАс - са), - В» АА- -- 6|ІСМАс--(|СМАс-- Мап Мап т (но), Мап АА- -- СІСМАс---С|ІСМАс--- Мап Мап--А-- (сіІСМАс -- сай)р -- 85 у г Мап-(бісмАс -са),-В5.. АА- - ОІСМАС--(|ІСМАс --т- Мап Мап -- ЧД -(сІСМАс -ба), ШУ ши г Мап--(СісмАс --- ба), - Ви» АА- бІСМАС---біСМАс-- Мап-- -(СІСМАс -- ба), - 15 Мап -- --((6ІсМАс --баї),-5 і (сіСМАс --- баї)р-- В у г Мап--(СісмАс - Са); - Ви» АА- біСМАС-- бІСМАС-- Мап --- (СісМАс -ба|);-В5 Мап-- Я -(СІСМАс -- са) -- 85 (сіСМАс -- ба); -5 , де АА означає амінокислотний залишок зазначеного пептиду; є означає ціле число, яке дорівнює 0 або 1; р означає ціле число від І1 до 10; 1 ВЕ" вибирається з Н, ОН, сіалової кислоти, зазначеного модифікованого сіалільного залишку і біа-5іа", де 5іа? означає зазначений сіалільний залишок, де щонайменше один ВЕ" вибирається із зазначеного модифікованого сіалільного залишку і 5іа-5іа".
16. Спосіб за п. 15, де зазначений амінокислотний залишок являє собою залишок аспарагіну.
17. Спосіб збільшення числа гранулоцитів у суб'єкта, де зазначений суб'єкт придатний для трансплантації кісткового мозку, де зазначений спосіб включає введення зазначеному суб'єкту деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е 1 полімерної модифікуючої групи, де зазначений пептид (О-С5Е має амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І МО: 1, 1 де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду О-С5Е в області зазначеного пептиду О-С5Е, яка починається гліцином у положенні 126 і закінчується серином у положенні 143, де зазначена кількість являє собою одиничну дозовану форму, вибрану з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг і 200 мкг/кг.
18. Спосіб лікування захворювання у суб'єкта. що потребує лікування, де зазначене захворювання характеризується пригніченням продукції білих кров'яних клітин у зазначеного суб'єкта, де зазначений спосіб включає стадію введення зазначеному суб'єкту деякої кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е і полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де зазначена кількість ефективна для полегшення зазначеного захворювання у зазначеного суб'єкта, де зазначена кількість являє собою одиничну дозовану форму, вибрану з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг і 200 мкг/кг.
19. Спосіб за п. 18, де зазначене пригнічення продукції білих кров'яних клітин обумовлене хіміотерапією, радіаційною терапією або ідіопатичною тромбоцитопенічною пурпурою.
20. Спосіб лікування нейтропенії або тромбоцитопенії у ссавця, який включає введення фармацевтично ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е і полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де зазначена кількість являє собою одиничну дозовану форму, вибрану з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг і 200 мкг/кг.
21. Спосіб збільшення популяції кровотворних стовбурових клітин у культурі, де зазначений спосіб включає стадію додавання до зазначених стовбурових клітин ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е 1 полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де зазначена кількість являє собою одиничну дозовану форму, вибрану з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг 1 200 мкг/кг.
22. Спосіб підвищення гематопоезу або збільшення кількості кровотворних клітин- попередників у суб'єкта, де зазначений спосіб включає стадію введення зазначеному суб'єкту ефективної кількості пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е 1 полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де зазначена кількість являє собою одиничну дозовану форму, вибрану з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг 1 200 мкг/кг.
23. Спосіб за п. 22, де зазначені кровотворні клітини-попередники являють собою клітини сор.
24. Спосіб забезпечення тривалого приживлення трансплантата кісткового мозку, де зазначений спосіб включає: (а) введення донору зазначеного кісткового мозку пептиду, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е 1 полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де вказаний пептид вводять в одиничній дозованій формі, вибраній з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг і 200 мкг/кг; (5) виділення зазначеного кісткового мозку із зазначеного донора; 1 (с) інфузію зазначеного кісткового мозку реципієнту.
25. Спосіб за п. 24, де донор являє собою ту ж особу, що і реципієнт.
26. Спосіб за п. 25, де донор являє собою особу, відмінну від реципієнта.
27. Спосіб збільшення числа кровотворних клітин-попередників у суб'єкта, де зазначений спосіб включає введення зазначеному суб'єкту: (а) першої композиції, що містить сполуку формули (1), що представляє 1,1-01,4-фенілен-біс-(метилен)-біс- 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан (АМО3100); 1 (5) другої композиції, що містить пептид, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду О-С5Е 1 полімерної модифікуючої групи, де зазначена полімерна модифікуюча група ковалентно приєднана до зазначеного пептиду біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду за допомогою глікозильної зв'язувальної групи, де вказаний пептид вводять в одиничній дозованій формі, вибраній з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг 1 200 мкг/кг.
28. Спосіб за п. 27, де зазначена перша композиція і зазначена друга композиція вводяться послідовно й у будь-якому порядку.
29. Спосіб за п. 27, де зазначена перша композиція і зазначена друга композиція вводяться одночасно.
30. Спосіб за п. 27, де зазначені кровотворні клітини- попередники являють собою клітини сор.
31. Дозована форма для перорального введення, яка включає компоненти: (а) пептид, який являє собою ковалентний кон'югат пептиду С-С5Е 1 водорозчинного полімеру, де зазначений водорозчинний полімер ковалентно приєднаний до зазначеного пептиду О-С5Е біля глікозильного або амінокислотного залишку зазначеного пептиду О-С5Е за допомогою інтактної глікозильної зв'язувальної групи, де вказаний пептид представлений в одиничній дозованій формі, вибраній з 50 мкг/кг, 100 мкг/кг 1 200 мкг/кг;
(5) поверхнево-активну речовину (речовини);
(с) жирну кислоту (кислоти);
(4) кишковорозчинний матеріал,
де зазначені компоненти (а), (Б) 1 (с) змішують у рідкій фазі 1 ліофілізують перед об'єднанням з компонентом (4).
ТНе ргезепі іпуепцоп ргохідез а рІусореруїаіеа О-С5Е фай 15 ШегареписаЦу асиуе апіа місії Бав ррагітасоКіпейс рагатеїет5 апа ргорегцев Фа аге піргоуеєд геІайуе (0 ап і1деписаї, ог сіовеІу апаІовоив, О-С5Е рериде Шаї 15 пої гІусореруїЇа(ед.
Еишпіетгтоге, Ше іпуепцоп ргохіде5 тефодйв Тог торШліпе Петаг(ороїіевів іп а виб)есі, рагисшатпу а вибієсі мо Бав гесеїуей ог м тесеїхе тадпайоп ог сретофШегару (геайпепі.
Тре тефодв5 апі сотровйоп5 ої Ше іпуепцоп сап Тигійег бе изей Іо ргеуепі, - аПеуїа(е апа (геаї Фе тує Іовирргеввіхе еПесів висі (Пегарієв.
UAA200911131A 2007-04-03 2008-01-04 Спосіб лікування з використанням глікопегильованого g-csf (варіанти) UA99454C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90991707P 2007-04-03 2007-04-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA99454C2 true UA99454C2 (uk) 2012-08-27

Family

ID=42556797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA200911131A UA99454C2 (uk) 2007-04-03 2008-01-04 Спосіб лікування з використанням глікопегильованого g-csf (варіанти)

Country Status (3)

Country Link
SI (1) SI2144923T1 (uk)
UA (1) UA99454C2 (uk)
ZA (1) ZA200906719B (uk)

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200906719B (en) 2010-05-26
SI2144923T1 (sl) 2013-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5922065B2 (ja) グリコｐｅｇ化ｇ−ｃｓｆを用いた治療方法
KR101209111B1 (ko) 글리코페질화 인자 나인
JP4657219B2 (ja) ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された顆粒球コロニー刺激因子
JP4719686B2 (ja) ＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチン
JP4951527B2 (ja) 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
WO2005056760A2 (en) Glycopegylated follicle stimulating hormone
AU2006280932A1 (en) Glycopegylated factor VII and factor Vila
UA99454C2 (uk) Спосіб лікування з використанням глікопегильованого g-csf (варіанти)
ZA200604554B (en) Glycopegylated Factor IX
RU2400490C2 (ru) Гликопэгилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
UA89364C2 (en) Granulocyte colony stimulating factor peptide conjugate (g-csf)