UA143282U - Спосіб визначення імунного комплексу для діагностики інфекційних захворювань - Google Patents

Abstract

Спосіб визначення імунного комплексу для діагностики інфекційних захворювань, що включає тестування зразків з використанням імунологічно реактивного тест-набору, згідно з корисною моделлю принаймні одне тестування проводять з використанням біосенсорного пристрою, що візуалізує прямі імунні взаємодії між антигеном та антитілом з утворенням імунного комплексу. Як біосенсорний пристрій використовують біосенсорний електронний прилад, який містить аналітично-вимірювальний блок з робочими елементами та сенсорний модуль з плазмопідтримуючою поверхнею, на яку біохімічним методом наноситься мономолекулярний шар ліганду, що виконує роль рецептора і молекули якого можуть селективно з'єднуватися з органічними молекулами - аналітом, утворюючи імунний комплекс, та забезпечений можливістю взаємодії із засобами для генерування зображень і засобами реєстрації імунологічно компетентних сигналів.

Description

Корисна модель належить до галузі біотехнології, а саме: до способу діагностики інфекційних захворювань. Корисна модель може бути застосована під час роботи в аналітичній лабораторії зокрема в галузях біотехнології, мікробіології, медицині, фітоіїмунологи, ветеринарії, захисті й карантині рослин, екології та в деяких інших областях, де мають місце процеси і/або заходи з ідентифікаційно-діагностичним спрямуванням.

Корисна модель може бути ефективно використана також при проведенні наукових досліджень, пов'язаних з імунологічною ідентифікацією та імунологічною діагностикою.

Крім того, корисна модель є особливо придатною для оснащення мобільних робочих місць новітнього типу, створення динамічних лабораторних модулів і оперативних сервісів на кшталт "швидкої лабораторної допомоги", для прискореного комплектування спеціалізованих інструментально-аналітичних комплексів, випробувальних платформ, виїзних бригад, а також з метою розширеного практичного використання в польових умовах, в неоснащених приміщеннях, з можливістю організації розподілених мереж, проведення експрес-аналізу тощо.

В діагностиці інфекційних захворювань виявлення імунного комплексу "антиген-антитіло" є основою великої кількості методів, оскільки імунна взаємодія між молекулами у цьому випадку є високспецифічною, що дає можливість встановлювати причини інфекційного захворювання з високою достовірністю і точністю. Антигеном може виступати будь-яка біомолекула, яка має імуногенні і антигенні властивості. Разом з тим, сама процедура виявлення імунного комплексу "антиген-антитіло" може мати надзвичайно багато варіантів, які залежать як від специфіки антигенів, так і біологічних об'єктів. Це породжує велику різноманітність методів діагностування інфекційних захворювань людини, тварин і рослин, що мають різну чутливість. Задача корисної моделі полягає у розробці способу, який би мав високу чутливість виявлення імунного комплексу і в той же час мав просту процедуру виконання для широкого кола біологічних об'єктів.

Відомий спосіб, який включає проведення імунологічного аналізу в системі "антиген - антитіло" з використанням діагностикуму на основі реакції імунодифузії (РІД).

Особливості використання діагностикуму на основі РІД, зокрема в модифікації РІД в гелі, полягають в наступному. Реакцію ставлять на стерильному склі, яке покривають 1 95-ним розчином агарози. В застиглому агарі роблять лунки з радіальним розташуванням їх таким

Зо чином, щоб одна з них розміщувалась у центрі на незначному віддаленні від інших. Потім у центральну лунку вносять видоспецифічну противірусну сироватку, а лунки навколо заповнюють матеріалом, який містить віруси. Систему інкубують у вологій камері протягом 24- 48 год. Поява тонких малопомітних ліній преципітації свідчить про наявність вірусного антигена.

Аналогічно проводять оцінювання антитіл; в центральну лунку вносять зразок у вигляді відомого антигена, а в навколишні лунки - зразки досліджуваних антитіл |Ройт А. Основь! иммунологии. - М.: Мир, 1991. - 327 сі.

Відомий інший, принципово подібний до попереднього, але більш вдосконалений, спосіб, який включає проведення імунологічного аналізу в системі "антиген-антитіло" з використанням діагностикуму на основі реакції імунодифузії в поєднанні із електрофорезом, так званий "метод зустрічного імуноелектрофорезу" (ЗІЕФ), який забезпечує більш високу чутливість тест-системи.

Суть способу на основі ЗШФ полягає в наступному. До протилежних торців скляної пластинки попередньо підключають два електроди: катод і анод. Спочатку на скляну пластинку наносять шар розплавленої агарози, в якому після застигання роблять паралельні ряди лунок.

Далі антигеном вірусу наповнюють ті лунки, які розташовані ближче до катода, а сироваткою - лунки поблизу анода. Після цього пластини кладуть у вологі камери і пропускають постійний електричний струм. Антигени мають негативний електричний заряд і рухаються в напрямку до анода, а антитіла - позитивний електричний заряд і рухаються до катода. Як правило, через 24 год. від початку електрофорезу можна спостерігати появу ліній преципітації в агаровому гелі, які утворюються в зонах, що містять еквівалентні концентрації антигенів і антитіл.

Метод ЗІЕФ використовують, наприклад, для визначення антигенів негативно заряджених вірусів, і зокрема - при тестуванні носіїв НВ5зАд вірусу гепатиту В |Иммунологическиє методьі /

Под ред. Г. Фримеля. Пер. с нем. А.П. Тарасова. - М. Медицина, 1987. - 472 сі.

Як найближчий аналог вибрано спосіб, який включає проведення імунологічного аналізу в системі "антиген-антитіло" з використанням діагностикуму на основі імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА застосовується для діагностики інфекційних захворювань широкого кола біологічних об'єктів і мас кілька модифікацій. Проте основною його властивістю є виявлення імунного комплексу "антиген-антитіло" у ферментативній реакції. Це вимагає додаткових етапів у процедурі виконання, застосування ферментної мітки, а також спеціального обладнання для реєстрації імунної взаємодії і ін.

Особливості способу досліджень інфекційних захворювань з використанням ІФА, наприклад, рослинних вірусів, за цим способом, і зокрема, в його модифікації "подвійний сендвіч", полягають в наступному.

Спосіб здійснюється в декілька етапів, а саме: 1-й етап. Насамперед вибирають антитіло, яке є специфічним принаймні до одного з вірусів, що підлягають тестуванню. Загальну кількість антитіла розділяють на дві порції. Першу порцію антитіла відразу ж вносять в лунки полістиролової мікропланшети і проводять інкубацію протягом 4 год. при температурі 30 "С. За цих умов антитіло встигає прикріпитися на полістироловій поверхні стінок лунки, а залишки неприкріпленого антитіла вимивають з додаванням буферного розчину. 2-й етап. Листки, фрагменти стебел чи інший рослинний матеріал подрібнюють і гомогенізують з метою наступного одержання екстракту соку, який, імовірно, містить шукані віруси. 3-й етап. Екстракт соку вносять у лунки мікропланшети, на стінках яких вже присутнє адсорбоване антитіло, і далі проводять інкубацію аналогічно до попередньої, але за умов іншого режиму, а саме: при температурі 8 "С протягом 12 год., наприклад, протягом ночі, або ж при 37 "С протягом 4-5 год. - з метою забезпечення стійкого зв'язування вірусу з антитілом.

Вірус, присутній у екстракті, зв'язується з антитілом, а рештки екстракту видаляють з планшети шляхом вимивання. 4-й етап. Другу порцію антитіла спочатку мітять за допомогою відповідного ферменту- барвника, а потім додають до зв'язаного вірусу, присутнього на мікропланшеті. Далі проводять інкубацію протягом 5 год. при температурі 30 "С. Незв'язане антитіло вимивають з мікропланшети. У цьому етапі мічені антитіла зв'язуються із антигеном, що взаємодіє із першими антитілвами 5-й етап. Щоб виявити присутність вірусу візуально, активізують механізм реакції кольороутворення. Для цього у лунки мікропланшету вносять ферментоспецифічний субстрат, що діє як проявник. Хімічна формула субстрату залежить від вибраного для даної тест-системи ферменту. Такий субстрат вступає в реакцію з ферментом, що вже зв'язаний з вірусом через імунну взаємодію з міченим антитілом. Інтенсивність забарвлення в результаті такої реакції є

Зо еквівалентною до концентрації вірусу в зразку. 6-й етап. Протікання імунологічної реакції зупиняють шляхом додавання стоп-реактиву, який характеризується підвищено кислим рівнем рН, наприклад додаванням сульфатної, хлороводневої або іншої кислоти. Визначають оптичну щільність за допомогою спектрофотометричного приладу - рідера, оснащеного відповідним світлофільтром, що забезпечує монохроматичне світло з довжиною хвилі, яка відповідає оптичним характеристикам певного продукту ферментативної реакції.

З метою зниження суб'єктивної залежності аналізу і підвищення статистичної ймовірності результатів використовують також відповідні еталони у вигляді позитивного і негативного контролю. Позивний і негативний еталони наносять на ту саму планшету, де розміщуються досліджувані зразки. Завдяки такій локалізації для еталонів забезпечується суворе дотримання принципу єдиної відмінності внаслідок здійснення тих самих маніпуляцій і процедур, причому за ідентичних умов. 7-й етап. Проводять аналіз і обробку результатів інструментальних досліджень. Наявність вірусу у досліджуваному зразку констатується як "ефект з проявом забарвлення" і додатково підтверджується ферментативною реакцією у лунці з відповідним позитивним контролем.

Відсутність вірусу констатується як "ефект без прояву забарвлення" і додатково підтверджується реакції у лунці відповідного негативного контролю (Егоров А.М. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М Егоров., А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиєв, Е.М.

Гаврилова. - М.: Вьісш. шк., 1991.-288 сі.

Спосіб-найближчий аналог з використанням тест-системи на основі ІФА в сендвіч- модифікації наприклад, для виявлення імуноспецифічних антигенів рослинних вірусів, забезпечує в цілком задовільній мірі не лише альтернативну, взаємовиключну діагностику по типу або "є", або "немає", але й деякі прості кількісні імунологічні дослідження, причому його чутливість здебільшого дозволяє проводити принаймні порівняно грубі кількісні оцінювання імунологічних реакцій - як для вирішення практичних задач масової діагностики, так і при проведенні нескладних факторних експериментів.

Ї сама процедура, і матеріальні складові ІФА характеризуються досить високою константністю і стабільністю, а також значно нижчою, у порівнянні з обома вищеописаними РІД- способами, залежністю від зовнішніх чинників, що дає змогу уникнути статистичних, етіологічних 60 або інших подібних помилок.

Разом з тим, слід зауважити і щодо наявності серйозних недоліків, притаманних для способу на основі ІФА.

Першим недоліком є значний часовий проміжок до моменту одержання результуючого ефекту, придатного для подальшого оцінювання, аналізування й обробки даних. Сукупна тривалість періоду інкубації наближається до 24 год., що складає понад 80 95 часу, необхідного для проведення всього аналізу в цілому - від приготування зразків до обробки одержуваних результатів. При цьому, як випливає з вищенаведеного опису аналогу, етап найкоротшої інкубації потребує не менше 4 год., а інші інкубації тривають на 1-8 год. довше від нього.

Другим недоліком є те, що спосіб-аналог досить складний у виконанні: він потребує окремо виділеного і відповідно пристосованого приміщення, яке забезпечене комплексом комунікацій для стійкого енерго-, водо- і теплопостачання, а також наявністю необхідного устаткування і меблів, складного лабораторного обладнання, використання значної кількості приладів, у т.ч. автоматичних, електромеханічних і електронних пристроїв, та іншого необхідного допоміжного оснащення різного типу.

Третій недолік полягає в тому, що спосіб-аналог потребує також достатньо високого рівня кваліфікації та спеціальної підготовки персоналу лабораторії ІФА, причому як керівників, так і лаборантів та інших виконавців.

Четвертий, і при цьому ще далеко не останній, недолік способу-аналогу стосується так званих витратних матеріалів. Загалом, те що для здійснення аналізу необхідне використання мічених антитіл підвищує складність процедури, вимагає додаткових проміжних етапів, і значно підвищує затрати часу. Крім того для здійснення аналізу необхідні додаткові витратні матеріали - пластикові наконечники, полістирольні планшети, використання яких є ще й неекологічним.

Таким чином, незважаючи на в цілому прийнятний рівень специфічності та імунологічної чутливості, спосіб-аналог є досить складним, затратним і вимогливим до якості як щодо організаційно-ресурсного, так і щодо методично-технологічного забезпечення.

З вищенаведеного також випливає, що без попередньої суттєвої реконструкції складових, у т.ч. істотної трансформації складу і структури процедур, використовуваних пристроїв та/або умов їх застосування, спосіб-аналог не може бути самостійно використаний, наприклад для створення і тестування нового діагностикуму, з можливістю практично одночасного проведення досліджень протилежного типу, зокрема, з метою тестування аналітів, відібраних із природних середовищ, а також для оцінювання іншого типу аналітів тощо.

Крім того спосіб-аналог не забезпечує можливості для прискореного змінювання чи заміни як самого об'єкта перевірки, так і напрямку проведення аналізу. В той же час потреби подібного типу все частіше виникають не лише при плануванні та проведенні цілеспрямованих імунологічних експериментів, але й на практиці Особлива актуальність таких потреб виявляється, зокрема, при ситуаціях, що потребують негайної локалізації карантинного об'єкта, контролю критично небезпечного інфекційного процесу, створення ефективних перешкод, одержання штучних фільтрів із заданою селективністю, а також для швидкого виправлення, коригування, запобігання або прийняття інших термінових рішень.

В основу корисної моделі була поставлена багатоцільова розгалужена задача: розробити новий спосіб виявлення імунного комплексу "антиген-антитіло", що базується щонайменше на наступних перевагах і властивостях у порівнянні до способу аналогу: а) можливість менш тривалого проведення процедур, б) більш високий рівень порогової чутливості елементів імунологічної діагностики, в) придатність організації одержаної системи для виконання різноманітних імунокомпетентних тестувань, в т.ч. як прямих, так і обернених за типом спрямованості реакцій, а саме: "антиген-антитіло" та "антитіло-антиген", г) отримання уніфікованої діагностичної системи, що являє собою один і той же засіб, прийнятний як для вирішення прикладних задач із ситуацій практики, так і для різного роду експериментальних досліджень, д) забезпечити, наскільки це можливо, принаймні часткове повторне використання допоміжних засобів типу планшет, типсів чи інших високовартісних носіїв, е) зменшити обсяги витрат високовартісних реактивів та інших засобів із групи витратних матеріалів, по можливості, для кожного циклу використання діагностикуму.

Поставлена задача вирішується тим, що розроблено новий спосіб виявлення імунного комплексу "антиген-антитіло", який включає тестування зразків з використанням імунологічно реактивного тест-набору, і в якому, згідно з корисною моделлю, принаймні одне тестування проводять з використанням біосенсорного пристрою, що візуалізує прямі імунні взаємодії між атигеном та антитілом з утворенням імунного комплексу.

В окремому випадку виконання корисної моделі як біосенсорний пристрій використовують біосенсорний електронний прилад, який містить аналітично-вимірювальний блок з робочими бо елементами та сенсорний модуль з плазмопідтримуючою поверхнею, на який біохімічним методом наноситься мономолекулярний шар ліганду, що виконує роль рецептора, молекули якого можуть селективно з'єднуватися з органічними молекулами - аналітом, утворюючи імунний комплекс, та забезпечений можливістю взаємодії із засобами для генерування зображень і засобами реєстрації імунологічно компетентних сигналів.

Тестування зразків з використанням імунологічно компетентного тест-набору, яке, згідно з корисною моделлю, проводять з використанням біосенсорного пристрою, дає змогу використати принципово новий, відмінний від способу-аналогу, підхід до реалізації інструментальних і аналітичних процедур і завдяки цьому одержати новий, більш ефективний спосіб діагностики інфекційних захворювань різної природу у широкого кола важливих біологічних об'єктів. Одним із можливих виконань способу може бути застосування біосенора, реалізованого за принципом поверхнево-плазмонного резонансу, вя кому присутня плазмопідтримуюча поверхня.

Біосенсорний прилад дає можливість використовувати безміткову імунологічну реакцію для виявлення антигенів або антитіл в умовах експресного тестування та у польових умовах.

Можливе поєднання кількох тест-наборів і кількох біосенсорних пристроїв в єдину розподілену мережу. Поєднання кількох віддалених робочих місць дає змогу для проведення контролю і заходів багатоцільового моніторингу з можливістю оперативного обміну інформацією на онлайн платформі, в тому числі в режимі реального часу.

Відомості про можливість здійснення способу згідно корисної моделі.

Приклад 1 - Здійснення способу при накопиченні вірусного інокулюму

Антиген Роїаїй мігпи5 У накопичували на рослинах Місоїйапа їарасит, сорт Самсун шляхом штучного інокулювання листків рослин у віці 3-4 листків. Рослини культивували при 24 с, освітленості 18 тис.лк., вологості 7595 в умовах фітокамери. Вміст антигену в рослинах контролювали з використанням комерційних діагностичних сироваток до Роїаї міги5 У за допомогою оптичного біосенсорного пристрою, виконаного у вигляді приладу "Плазмонтест", що працює за принципом поверхневого плазмонного резонансу. Контрольним варіантом була взаємодія нанесених на поверхню антитіл до Роїаю мігпи5 М із антигенами зразка, в якому попередньо встановлювали вміст цих антигенів методом ІФА. Відхилення резонансного кута становило 0,8-1,5 кут. хв. Тестування зразків ПП;:-Мметодом приладом "Плазмонтест" проводили в лабораторному приміщенні, що знаходилося в межах фітокамери.

Зо Приклад 2 - Здійснення способу при виділенні антигенів у чисті препарати

Антиген Роїайю мігпи5 У спочатку виділяли з листків інфікованих рослин Місоїапа їарбасит, потім очищали. Очистку антигену Роїайо мхміпиє М проводили шляхом диференційного ультрацентрифугування. Вміст очищеного антигену перевіряли на відповідність морфологічним ознакам з використанням електронного мікроскопа та на відповідність оптичним характеристикам шляхом вимірювання оптичної щільності його розчину спектрометричним методом. Імунні характеристики очищеного препарату встановлювали шляхом вимірювання поверхневого плазмонного резонансу на приладі "Плазмонтест" в реакції імунної взаємодії з комерційними сироватками до Роїаїйо міги5 У. Контрольним варіантом була взаємодія нанесених на поверхню антитіл до Роїай міги5 У із антигенами зразка, в якому попередньо встановлювали вміст цих антигенів методом ІФА. Відхилення резонансного кута становило 1,2-1,6 кут. хв. Весь цикл роботи, в тому числі серійні й вибіркові тестування за допомогою приладу "Плазмонтест", проводили в лабораторії, спеціально оснащеній для проведення ІФА.

Приклад З - Здійснення способу при імунізації тварин для одержання антитіл

Очищений антиген Роїай мігпи5 М в сполученні з повним ад'ювантом Фрейнда вводили підшкірно кролику за загальноприйнятою схемою. По закінченню періоду, необхідного для інкубації та імунізації, відбирали кров, з якої одержували сироватку з вмістом антитіл до антигену Роїайо хміпиє М. Сироватку випробовували на імунологічну компетентність з використанням очищеного антигену Роїаїо мігиз М шляхом тестування зразків з допомогою біосснсорного приладу "Плазмонтест". Відхилення резонансного кута становило 1,3-1,5 кут. хв.

Залежно від концентрації сироватки. Тестування проводили в умовах неоснащеного приміщення поряд з приміщенням для утримання тварин-продуцентів.

Приклад 4 - Здійснення способу при виявленні антитіл до вірусу лейкозу ВРХ (уніфікація набору для тестування лейкозу ВРХ методом РІД)

Антиген лейкозу ВРХ, що входить у комерційний набір для визначення антитіл лейкозу в реакції імунодифузії в гелі, розводили фізіологічним розчином 1:4 і наносили на поверхню біосенсора. Сироватку крові тварин одержували за загальноприйнятою методикою і розводили фізіологічним розчином 1:8. Тестування зразків проводили з допомогою біосенсорного приладу "Плазмонтест", відмічаючи показники відповідно для нанесеного буфера (нульова точка), для сенсибілізованого на поверхні антигена та для взаємодії антиген-антитіло в реакційній комірці бо приладу. Контрольним варіантом була взаємодія нанесеного на біосенсор антигена з позитивною сироваткою із набору для визначення антитіл лейкозу в реакції імунодифузії в гелі.

Відхилення резонансного кута при взаємодії з позитивною сироваткою становило 1,3-1,8 кут.хв., що чітко реєструвалося приладом.

Таким чином, показана можливість застосування способу для різних типів об'єктів як рослинного, так і тваринного походження В усіх випадках тестувань, проведених за допомогою або з використанням приладу "Плазмонтест", загальна тривалість процедур - від початку підготовки зразків і до закінчення реєстрації і обробки остаточних результатів дослідження - складала в середньому 40-60 хв, в найбільш тривалому випадку - 140 хвилин. Компактність робочого оснащення, порівняна простота у проведенні підготовчих і основних процедур є додатковими перевагами, які забезпечують можливість виконання таких тестів у експрес- режимі, в тому числі в польових умовах в безпосередній близькості до місць необхідної локалізації. Тим самим усувається необхідність у транспортуванні і зберіганні зразків.

На підставі проведення попередніх випробувань також виявлено наявність і актуальність передумов, за яких з використанням даної корисної моделі можливо виконувати науково- дослідні розробки і прикладні експерименти, у т.ч. нові дослідження для подальшого вдосконалення запропонованого способу.

Можливість візуалізації процесів і результатів діагностики, накопичення і обміну релевантних даних, в тому числі шляхом створення бібліотек і баз даних, регламентування доступу до таких даних і інформацією, одержаною під час інструментально-аналітичних досліджень, значною мірою розширює діапазон застосувань корисної моделі. Всі ці властивості, разом узяті, не лише надають запропонованій тут корисній моделі істотні цільові технологічні переваги над способом-аналогом, але й роблять можливість її ефективного застосування значно ширшою, з виходом за межі області власне імунологічних реакцій та інфекційних захворювань.

Claims (2)

ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ

1. Спосіб визначення імунного комплексу для діагностики інфекційних захворювань, що включає тестування зразків з використанням імунологічно реактивного тест-набору, який відрізняється тим, що принаймні одне тестування проводять з використанням біосенсорного пристрою, що візуалізує прямі імунні взаємодії між антигеном та антитілом з утворенням імунного комплексу.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як біосенсорний пристрій використовують біосенсорний електронний прилад, який містить аналітично-вимірювальний блок з робочими елементами та сенсорний модуль з плазмопідтримуючою поверхнею, на яку біохімічним методом наноситься мономолекулярний шар ліганду, що виконує роль рецептора і молекули якого можуть селективно з'єднуватися з органічними молекулами - аналітом, утворюючи імунний комплекс, та забезпечений можливістю взаємодії із засобами для генерування зображень і засобами реєстрації імунологічно компетентних сигналів.