UA127677C2 - Мікробна композиція - Google Patents

Мікробна композиція Download PDF

Info

Publication number
UA127677C2
UA127677C2 UAA201900724A UAA201900724A UA127677C2 UA 127677 C2 UA127677 C2 UA 127677C2 UA A201900724 A UAA201900724 A UA A201900724A UA A201900724 A UAA201900724 A UA A201900724A UA 127677 C2 UA127677 C2 UA 127677C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
rdna
microbial
nucleotide sequence
microbial species
dna
Prior art date
Application number
UAA201900724A
Other languages
English (en)
Inventor
Фредерік Кендіргі
Фредерик КЕНДИРГИ
Сін Лян Лю
Син Лян Лю
Д. Рай ВАГНЕР
Сон-Йон Х. Юн
Original Assignee
Амвак Кемікал Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амвак Кемікал Корпорейшн filed Critical Амвак Кемікал Корпорейшн
Publication of UA127677C2 publication Critical patent/UA127677C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/25—Paenibacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F1/00—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof
    • C05F1/002—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof from fish or from fish-wastes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/02—Acetobacter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/20—Fertilizers of biological origin, e.g. guano or fertilizers made from animal corpses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/141—Feedstock
    • Y02P20/145—Feedstock the feedstock being materials of biological origin

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

Винахід стосується мікробної композиції для покращення росту рослин, поліпшення стресостійкості та/або підвищення врожайності, що включають клітини визначених мікробних видів. Також розкритий спосіб використання мікробної композиції, яка включають приведення у контакт ґрунту, рослин, частин рослин або насіння із зазначеною композицією. Мікробна композиція також використовується у способі розкладання біологічного матеріалу, такого як хітиновмісний біологічний матеріал.

Description

Винахід стосується мікробної композиції для покращення росту рослин, поліпшення стресостійкості та/"або підвищення врожайності, що включають клітини визначених мікробних видів.
Також розкритий спосіб використання мікробної композиції, яка включають приведення у контакт грунту, рослин, частин рослин або насіння із зазначеною композицією.
Мікробна композиція також використовується у способі розкладання біологічного матеріалу, такого як хітиновмісний біологічний матеріал.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
Дана заявка заявляє пріоритет для попередньої заявки США Мо 62/381,441, поданої 30 серпня 2016 року, яка є включеною до цього опису шляхом посилання у повному обсязі.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Дане розкриття відноситься до мікробних композицій та способів їх застосування, особливо для сільськогосподарських процесів та застосувань.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Внаслідок зростання населення зростає і споживання продуктів харчування. З іншого боку, сільськогосподарські землі, придатні для обробки, та продуктивність значно скорочуються внаслідок глобальної індустріалізації, посухи, солоності та глобального потепління (Саіатего та інш., У Місторіа! 5ігаїедієв Тог Стор Ітргометепі, Зргіпдег Венпіп, рр. 1-22, 2009). Цю проблему можна вирішити, застосовуючи стале сільське господарство, основним принципом якого є істотне зменшення хімічних препаратів, таких як добрива, інсектициди та гербіциди, при одночасному зниженні викидів парникових газів.
Надмірне використання хімічних добрив у сільському господарстві призводить до великої кількості екологічних проблем, оскільки деякі добрива містять важкі метали (наприклад, кадмій та хром) та високі концентрації радіонуклідів. Ці добрива у агро-екосистемі є основним джерелом важких металів та радіонуклідів у рослинах, а деякі призводять до накопичення неорганічних забруднювачів (Замсі, Іпі. У. Епм. сі. Юєм. 3: 77-80, 2012; Маїакоїї, бсієпсе 281: 190-192, 1998). Теплиці та культивування водяних організмів використовують особливо великі кількості хімічних добрив під час пікового сезону, що призводить до забруднення водних ресурсів, погіршується кількість сільськогосподарської продукції та якість продуктів. З огляду на ці недоліки хімічних добрив, мікробні інокулянти, корисні для рослин, є багатообіцяючими як компоненти інтегрованих стратегій управління поживними речовинами.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Розкриті у цьому описі композиції, що включають клітини визначеного набору мікробних видів (наприклад, З мікробні види, 16 мікробних видів, 17 мікробних видів, 19 мікробних видів, 20 мікробних видів, 21 мікробний вид або 22 мікробні види). У деяких варіантах втілення, композиції включають клітини одного або декількох видів мікробів, що мають функціональні
Зо характеристики або активність (таку як метаболічна активність), включаючи, але не обмежуючись, азотний обмін, солестійкість, функцію солюбілізації фосфатної солі та/або солей кальцію та/або цинку, целюлолітичну функцію, хітинолітичну функцію, вироблення фітогормону, метаболічну активність заліза тал"або функцію дефосфорилювання органічної речовини. У деяких варіантах втілення композиції включають клітини одного або декількох (наприклад, 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше, 9 або більше 10 або більше, 11 або більше, 12 або більше, 13 або більше, 14 або більше, 15 або більше) мікробних видів, які ростуть у аеробних умовах. У інших варіантах втілення композиції включають клітини одного або декількох (наприклад, 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше) мікробних видів, які ростуть у анаеробних умовах. У одному необмежуючому прикладі композиція включає клітини 16 мікробних видів, які ростуть у аеробних умовах, та клітини 6 мікробних видів, які ростуть у анаеробних умовах. Аеробні та анаеробні умови росту включають, але не обмежуються ними, ті, що описані у Прикладі 1 у цьому документі.
У одному варіанті втілення, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіорбасійив5 аеїргиескії, Мікаїібасійив5 Наіорпішв5, Агоїобасієг міпеїаподії,
Сіовігідіит разівшіапит, Раєпірасійи5 спірепві5, зігеріотусез дгізвив5, Рзейдотопав зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р. Яногезсепв та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 рРДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮ МО: 17), Рзендотопав ршийда, Васійс5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепві5 та Васіїїи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО 10 МО: 15), Васійи5 атуїоїїдиеїтасієпо, Осеапорасійи5 опсотпупені,
Раєпібасіїи5 Іашив (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпібасіи5 Іашив5 та Раєепібасійиз5 5р. (штам
У412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО І МО: 12), Васійн5 ІсНепітоптів, Іасіобрасійнв міпі,
Раєпібасіїи5 соокії, Васійш5 виріб, І асіобасніи5 рисппегі, Васіїйш5 тедаїегшт, Асеїюбасієег разівшгіапив, Сіозійадішт бБеї|егіпсКії, Іасіобасійй5 сазеї/рагасазєї та Васійй5 Яехив. У іншому варіанті втілення, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіорасійи5 аеїргиескії, Мігдібасійив5 НаїЇорпійш5, Агоїобасієг міпеїапайїї, Сіовніайт разівигіапит, Зперіотусев агізєеи5, Реепдотопа5 5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнпіїа, Р.
ТПогезсепв та Р. ришііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 60 99965 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 17) Рвзейдотопав риїйда, Васійй5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коснпії, В. роспеопепві5 та Васіи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮО МО: 15),
Васійи5 атуїоїїдшеїасієпе, Осєапобасіїш5 опсопупеспі, Васйши5 Іспепіоптів, І асіорасійи5 міпі,
Васійив зибійв, І асторасійи5 риснпетгі, Васійи5 тедаїегпт, Асеїюбасієг равівшигіапив, Сіовілаійт
Беїепіпскії, І астобасіїи5 сазеї/рагасавзеї та Васіїш5 Пехив. У інших варіантах втілення, композиції включають клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробів з 165 РДНК послідовностями, які мають щонайменше 99 95 ідентичність послідовностей з кожною з 5ЕО 10
МО: 3-24; з кожною з БЕО ІЮ МО: 3-8, 10, 11, 13-18 та 20-24; з кожною з 5ЕО І МО: 3-7 та 9-24; з кожною з 5ЕО ІЮ МО: 3-7, 10, 11, 13-18 та 20-24; з кожною з 5БЕО ІО МО: 3-8, 10, 11, 14, 16-18, 20-22 та 24; або з кожною з 5ЕО ІО МО: 3-14, 16-22 та 24. У іншому варіанті втілення, композиція включає колекцію мікробів, поміщену у один або більше з депозитів у Американській колекції типових культур під номерами РТА-123288, РТА-123298 та/або РТА-123289.
У інших варіантах втілення, композиція включає клітини щонайменше одного мікробного виду з азотним обміном, щонайменше одного мікробного виду, стійкого до 595 Масі, щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації фосфатної солі та/або солей кальцію та/або цинку, щонайменше одного мікробного виду з целюлолітичною та/або хітинолітичною функцією, щонайменше одного мікробного виду з метаболічною активністю яблучної кислоти, щонайменше одного мікробного виду з виробленням фітогормону (такого як індол (ауксин)), щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізування заліза, щонайменше одного мікробного виду з функцією дефосфорилювання органічної речовини, або комбінацію будь-яких двох або більше з них.
У цьому описі також розкриваються способи використання розкритих композицій, які включають контактування грунту, рослин, частин рослин або насіння із зазначеною композицією. Мікробні композиції можуть застосовуватися до грунту, рослин, частин рослин та/або насіння самостійно або у поєднанні з додатковим(и) компонентом(ами) (такими як хітин, хітозан, глюкозамін, амінокислоти та/або рідке добриво).
У додаткових варіантах втілення описані мікробні композиції застосовують у способах розщеплення біологічних матеріалів, таких як хітиновмісні біологічні матеріали. У деяких прикладах хітиновмісні матеріали змішують з розкритою мікробною композицією та
Зо ферментують для утворення ферментованої суміші. Ферментована суміш необов'язково може бути розділена на тверду та рідку фракції. Ці фракції далі можуть застосовуватися у сільському господарстві у комбінації з описаними мікробними композиціями або можуть застосовуватися у процесах подальшого розщеплення.
Вищезгадані та інші особливості даного винаходу стануть більш очевидними по ознайомленню з представленим нижче детальним описом, який подано з посиланням на супровідні фігури.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР
ФІГУРА 1 схематично показує типовий процес біорозкладання хітиновмісного біологічного матеріалу (на прикладі креветкових відходів) описаною мікробною композицією.
ФІГУРА 2 представляє графік, що показує Індекс поверхні листя (І АЇ) кінцевого справжнього листка рослин огірків, оброблених як показано, у день 33.
ФІГУРА З представляє графік, що показує суху масу пагонів кукурудзи з показаними обробками у день 17.
ФІГУРА 4 представляє графік, що показує врожайність томатів (зелені та червоні томати) з показаними обробками.
ФІГУРА 5 представляє графік, що показує врожайність кукурудзи з показаними обробками.
ФІГУРА 6 представляє графік, що показує загальну врожайність капусти з показаними обробками.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Будь-які нуклеїновокислотні та амінокислотні послідовності, перелічені у цьому описі або у супровідному переліку послідовностей, показано з використанням стандартних літерних скорочень для нуклеотидних основ та амінокислот, як визначено у правилі 37 С.Р.В., 5 1.822.
Принаймні у деяких випадках показано лише один ланцюг кожної нуклеїновокислотної послідовності, але слід розуміти, що комплементарний ланцюг включено шляхом будь-якого посилання на показаний ланцюг.
ЗБО 10 МО: 1 та 2 являють собою прямий та зворотний праймери 165 рРДНК нуклеїновокислотної послідовності, відповідно.
ЗЕО ІЮО МО: З являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Васйй5 тедаїетпит.
ЗЕО ІЮО МО: 4 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як І асіобасійи5 сазеї/рагасавзеї.
ЗЕО ІЮО МО: 5 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Сіовігіаіит бБеї|епіпекії.
ЗЕО ІЮО МО: 6 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Асеїобасієг рабівшіапив.
ЗЕО ІЮО МО: 7 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як І асіюбасійив5 рисппеті.
ЗЕО ІЮО МО: 8 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Васйв зиБїв.
ЗЕО ІЮО МО: 9 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Раєпірасійи5 соокії.
ЗБЕО 10 МО: 10 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як І астіобасіПизв міпі.
ЗБО 10 МО: 11 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Васіїи5 Іспепітоптів.
ЗБО 10 МО: 12 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Раєпірасіїнв5 Іашив.
ЗБЕО 10 МО: 13 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Осеапобасійшв5 опсоппупені.
ЗБЕО 10 МО: 14 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Васіїи5 атупоїіїдиегтасієпв.
ЗБО 10 МО: 15 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Васіїи5 5р.
ЗБЕО 10 МО: 16 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Реендотопазх риїда.
ЗБО 10 МО: 17 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Роендотопазв 5р.
ЗЕБЕО 10 МО: 18 являє собою 165 рДнНК нуклеотидну послідовність з мікробу,
Зо ідентифікованого як бігеріютусез агізеийв.
ЗБЕО 10 МО: 19 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Раєпірасійнв5 спірепвів.
ЗБО 10 МО: 20 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Васійи5 Пехив.
ЗБО 10 МО: 21 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Сіозітідіит разівєшіапит.
ЗБО 10 МО: 22 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Аг2оїобасієг міпеїапоіїї.
ЗБО 10 МО: 23 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як Мігаібасіїшв Наіорпішв5.
ЗБЕО 10 МО: 24 являє собою 165 рДНК нуклеотидну послідовність з мікробу, ідентифікованого як І асіобасіїив5 аеїргиескії.
ЗЕО ІЮ МО: 25-66 та 69-136 являють собою нуклеотидні послідовності видоспецифічних олігонуклеотидних праймерів та зондів.
ЗЕО І МО: 67-68 являють собою нуклеотидні послідовності універсальних 165 рРНК прокаріотичних праймерів.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
І. Терміни
Якщо не зазначено іншого, технічні терміни вживаються згідно з традиційними значеннями.
Визначення загальноприйнятих термінів у молекулярній біології можна знайти у публікаціях
Ктер5 та інш., Іеміп 5 (зепе5 ХІ видавництва допез5 апа Вапіей Івєагтіпд, 2012 (ІЗВМ 1449659853); Кепагем/ та інш. (ред.), Пе Епсусіоредіа ої МоїІесшіаг Віоіоду видавництва
ВіасКухеї! Рибіїзнет5, 1994 (І5ВМ 0632021829); Вореп А. Меуєгз (ред.), Моієсшаг Віоіоду апа
ВіоїесппоІїоду: а Сотргепепзіме ЮОезК ВНеїегепсе видавництва М/Пеу, доп й 5оп5, Іпс., 2011 (І5ВМ 8126531789); та Сеогде Р. Ведеї, Епсусіоредіс Оісіопагу ої Сепеїїс5, Сепотісв, апа
Ргогеотісв, 2-ге видання, 2003 (ІЗВМ: 0-471-26821-6).
Представлені нижче пояснення термінів та способів мають на меті поліпшення опису даного винаходу та надання спеціалістам у даній галузі рекомендацій з практичного втілення даного винаходу. Форми однини можуть стосуватись як однини, так і множини, якщо контекстом чітко бо не вказується інше. Наприклад, термін "включаючи клітину" охоплює одну або багато клітин та вважається рівноцінним фразі "включаючи принаймні одну клітину." У контексті даного опису "включає" означає "охоплює." Таким чином, "включаючи А або В" означає "охоплює А, В або А та В", не виключаючи додаткових елементів. Усі публікації, патентні заявки, патенти та інші згадані авторами джерела є включеними до цього опису шляхом посилання у повному обсязі у будь-якому сенсі. У разі протиріччя даний опис, включаючи пояснення термінів, має переважну силу.
Хоча для практичного втілення або випробування описаної технології можуть застосовуватися способи та матеріали, подібні або рівноцінні тим, які описуються авторами, прийнятні способи та матеріали описуються нижче. Матеріали, способи та приклади є лише пояснювальними та не мають на меті обмеження обсягу винаходу.
Для полегшення ознайомлення з різними варіантами втілення цього винаходу представлено наступні пояснення конкретних термінів:
Водяна тварина: тварина, яка живе у солоній або прісній воді. У описаних авторами варіантах втілення до водяних тварин належать водяні членистоногі, такі як креветки, криль, веслоногі ракоподібні, вусоногі раки, краби, омари та лангусти. У інших варіантах втілення до водяних тварин належать риби. До побічних продуктів водяних тварин належать будь-які частини водяних тварин, зокрема, частини, одержані у результаті промислової обробки водяних тварин. Таким чином, у деяких прикладах до побічних продуктів водяних тварин належать один або більше з головогрудей або зовнішнього скелету креветок, зовнішнього скелету краба або омара або шкіри або луски риби.
Контактування: приведення у прямий фізичний зв'язок, як у твердій, так і у рідкій формі.
Наприклад, контактування може відбуватися з одним або декількома мікробами (такими як мікроби у мікробному консорціумі) та біологічним зразком у розчині. Контактування також може відбуватися з одним або декількома мікробами (такими як мікроби у мікробному консорціумі) та грунтом, рослинами та/або частинами рослин (такими як листя, стебла, сіянці, коріння та/або насіння).
Культуральне середовище: комплекс умов культивування (які у деяких прикладах є синтетичними або неприродними наборами умов), включаючи поживні речовини для підтримки життєздатності, функції та/або зростання конкретної популяції клітин, таких як один або декілька
Зо мікробних видів. Культуральні середовища зазвичай включають такі компоненти, як джерело вуглецю, джерело азоту та буфер для підтримання рН. Додаткові компоненти у культуральних середовищах також можуть включати один або більше гормонів, факторів росту, інгібіторів протеаз, білкових гідролізатів, протекторів зсувних зусиль, білків, вітамінів, мікроелементів, неорганічних солей, мінералів та/або ліпідів.
Культивування: плановане вирощування одного або декількох організмів чи клітин у присутності джерел вуглецю, азоту та мінеральних солей, які піддаються засвоєнню. Згідно з прикладом, такий ріст може відбуватись у твердому або напівтвердому поживному середовищі або у рідкому середовищі, у якому розчиняються або суспендуються поживні речовини. У іншому прикладі культивування може відбуватися на поверхні або із застосуванням зануреної культури. Поживне середовище може складатися з комплексних поживних речовин або може бути хімічно визначене.
Ферментація: процес, результатом якого є розклад складних органічних сполук на простіші сполуки, наприклад, мікробними клітинами (такими як бактерії та/або гриби). Процес ферментації може відбуватися у аеробних умовах, анаеробних умовах або і тих, і інших умовах (наприклад, у великому об'ємі, коли деякі частини є аеробними, а інші частини є анаеробними).
У деяких необмежувальних варіантах втілення ферментація включає ферментативне та/або неферментативне розщеплення сполук, присутніх у організмі водяних тварин або побічних продуктах водяних тварин, таких як хітин.
Виділений: "виділений" біологічний компонент (такий як нуклеїнова кислота, білок або організм) по суті відокремлений або очищений від інших біологічних компонентів (таких як інші клітини, клітинний дебрис або інші білки або нуклеїнові кислоти). Біологічні компоненти, які були "виділені", включають компоненти, очищені за стандартними методами очищення. Термін охоплює також рекомбінантні нуклеїнові кислоти, білки або мікроби, а також хімічно синтезовані нуклеїнові кислоти або пептиди. Термін "виділений" (або "збагачений" або "очищений") не вимагає абсолютної чистоти та може включати мікроби або молекули, які є принаймні на 50 95 виділеними, наприклад, щонайменше 75 95, 80 95, 90 95, 95 95, 98 95, 99 95 або навіть 100 95 виділеними.
Рідкі добрива: водний розчин або суспензія, що містить розчинний азот. У деяких прикладах розчинний азот у рідких добривах включає органічне джерело азоту, таке як сечовина або бо сечовина, яка є похідною безводного аміаку (наприклад, розчин сечовини та нітрату амонію
(ОАМ)). Також може застосовуватися водний розчин аміаку (20-32 95 безводний аміак). У інших прикладах розчинний азот у рідких добривах включає азотовмісні неорганічні солі, такі як гідроксид амонію, нітрат амонію, сульфат амонію, пірофосфат амонію, тіосульфат амонію або комбінації двох або більшої кількості з них. У деяких варіантах втілення рідкі добрива включають штучне джерело азоту (наприклад, пірофосфат амонію або тіосульфат амонію) та/або інші компоненти, які не зустрічаються у природі.
Зазвичай рідкі суміші штучних добрив вказуються за їхнім вмістом азоту-фосфату-калію (відсотком М-Р-К) та включають додавання інших компонентів, таких як сірка або цинк.
Прикладами штучних сумішей можуть бути 10-34-0, 10-30-0 з 295 сірки та 0,25 95 цинку (хелатні), 11-37-0, 12-30-0 з З 95 сірки, 2-4-12, 2-6-12, 4-10-10, 3-18-6, 7-22-5, 8-25-3, 15-15-3, 17- 17-0 з 2 95 сірки, 18-18-0, 18-18-0 з 2 95 сірки, 28-0-0 ОАМ, 9-27-0 з 2 95 сірки та тіосульфату калію.
Мікроб: мікроорганізм, включаючи, крім інших, бактерії, архебактерії, гриби та водорості (такі як мікроводорості). У деяких прикладах мікроби є одноклітинними організмами (такими як бактерії, ціанобактерії, деякі гриби або деякі водорості). У інших прикладах термін "мікроби" охоплює багатоклітинні організми, такі як деякі гриби або водорості (наприклад, багатоклітинні нитчасті гриби або багатоклітинні водорості).
Мікробна композиція: композиція (яка може бути твердою, рідкою або принаймні частково і твердою, і рідкою), яка включає клітини принаймні одного типу (або виду) мікробу (або популяції клітин принаймні одного типу мікробів). У деяких прикладах мікробна композиція включає клітини одного або декількох типів (видів) мікробів (або однієї або декількох популяцій мікробів) у рідкому середовищі (такому як середовище для зберігання, культивування або ферментації), наприклад, у формі суспензії у рідкому середовищі. У інших прикладах мікробна композиція включає клітини одного або декількох типів (видів) мікробів (або однієї або декількох популяцій мікробів) на поверхні або всередині твердого або желеподібного середовища (включаючи, крім інших, культуральні планшети) або суспензії або пасти.
Мікробний консорціум: суміш, асоціація або сукупність клітин двох або більшої кількості мікробних видів, які у деяких випадках перебувають у фізичному контакті один з іншим. Мікроби у консорціумі можуть впливати один на інший через прямий фізичний контакт або через
Зо біохімічну взаємодію, або і те, і інше. Наприклад, мікроби у консорціумі можуть обмінюватися між собою поживними речовинами, метаболітами або газами. Таким чином, у деяких прикладах принаймні деякі з мікробів у консорціумі можуть бути метаболічно взаємозалежними. Характер та ступінь такої взаємозалежної взаємодії може змінюватися з часом та зі зміною умов культивування.
ІІ. Мікробні композиції
Розкриті у цьому описі мікробні композиції, які включають клітини визначеного набору мікробів або мікробних видів. У деяких варіантах втілення, розкриті композиції включають клітини визначеного набору мікробів (наприклад, З мікробні види, 16 мікробних видів, 19 мікробних видів, 20 мікробних видів, 21 мікробний вид або 22 мікробні види), як викладено нижче. Будь-яка композиція, розкрита у даному описі, може також включати один або більше немікробних компонентів, включаючи, але не обмежуючись, одне або більше джерел вуглецю, джерел азоту, буфери, гормони, фактори росту, інгібітори протеаз, білкові гідролізати, протектори зсуву, білки, амінокислоти, вітаміни, мікроелементи, неорганічні солі, мінерали та/або ліпіди. У деяких прикладах до композиції може бути доданий один або більше додаткових мікробних видів, наприклад, для забезпечення або доповнення бажаної активності композиції.
А. Визначені мікробні композиції
У даному винаході розкриті композиції, що включають клітини визначеного набору мікробних видів. Наприклад, у деяких варіантах втілення, композиції включають мікробні ізоляти, які об'єднують у одну композицію, та у деяких прикладах співкультивують або співферментують.
У одному прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіорбасійив5 аеїргиескії, Мікаїібасійив5 Наіорпішв5, Агоїобасієг міпеїаподії,
Сіовігідіит разівшіапит, Раєпірасійи5 спірепві5, зігеріотусез дгізвив5, Рзейдотопав зр. (тісно пов'язаний з Р. еєпіоторпіЇа, Р. Пногезсеп5 та Р. риїйда; наприклад, мікробний вид з 165 рРДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮ МО: 17), Рзендотопав ршийда, Васійс5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепві5 та Васіїїи5 5р. (штам В-27341); наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 15), Васйи5 аптуїоїЇїдиеїасієпе, Осеапобасіїш5 опсопупсені,
Раєпібасіїи5 Іашив (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпібасіи5 Іашив5 та Раєепібасійиз5 5р. (штам 60 Уу412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО І МО: 12), Васійн5 ІсНепітоптів, Іасіобрасійнв міпі,
Раепірасійи5 соокКії, Васійи5 5иИБШі5, І асіобасійй5 БисНпегі, Васійй5 тедаїепйт, Асеюбасієвг разівшгіапив, Сіовігідіит бБеї|егіпскКії, І асіорасійй5 сазеї/рагасазеії, та Васійш5 ПЯехив. У іншому прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з Іасіобрасіїййв5 аеїБгиескії, Мігуірасійи5 Наїорпіїш5, Агоїобасієг міпеїапайїй, Сіовійаійт разівигіапит, Зперіотусев агізєеи5, Реепдотопа5 5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнпіїа, Р.
ТПогезсеп5 та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17), Рееидотопаз риїйда, Васіїйшв вр. (тісно пов'язаний з В. Коснпії, В. роспеопепві5 та Васіи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮО МО: 15),
Васійи5 атуїоїїдшеїасієпе, Осєапобасіїш5 опсопупеспі, Васйши5 Іспепіоптів, І асіорасійи5 міпі,
Васійив зибійв, І асторасійи5 риснпетгі, Васійи5 тедаїегпт, Асеїюбасієг равівшигіапив, Сіовілаійт
Беїетпіпскії, І асіобасіїи5 сазеї/рагасазеї, та Васійи5 Пехи5. У додатковому прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіобасіїшв5 деїбгиескії, Мігаїбаснив Наіорнішв, Агоіобасієг міпеїіапай, Сіовігідіит равівєшіапит, Раєпібасіїшв спірепвзіз, Змнеріотусе5 дгізєеєи5, Реецдотопаб зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р.
ТПогезсеп5 та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17), Реенидотопав риїйда, Васіїїнв5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коснпії, В. роспеопепві5 та Васіи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 15),
Васійи5 атуїоїіїдиегасієпо, Осеапобрасійш5 опсогпупспі, Раєпібасійе Іашив5 (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпірасійи5 Іашив та Раєпірасіїїйи5 вр. (штам У412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 12), Васійив5 ІсПпепітогтів, І асіобасійи5 міпі, Раєпівбасіїйив5 соокії, Іасіобасійи5 Бисппе!і, Васіїїи5 тедаїегішт, Асеїюбрасієг равівшпіапив, Сіовігідіит бБеїегіпскКії, Іасіорасійи5 сазвеї/рагасаввєї та
Васійш5 йЙехи5. У подальшому прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з Іасіобасіїйив5 аеїБгиескії, Мігаїбасійше Наїіорнішв5, Агоюобасієг міпеїапайї, Сіовігаїйт равівшіапит, 5ігеріотусез дгізеив, Рвейдотопазв зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнпійа, Р. Пногезсеп5 та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з
Зо щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 17), Реенидотопах риїіда, Васійив5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепзіз та Васійи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з
ЗЕО ІО МО: 15), Васіїнв атуїоїїднеїасіеєп5, Осеапобасійи5 опсогпупспні, Васіїив ІсНепіогтів,
І асторасійи5 міпі, Васійє 5,ирій5, Іасіюбасіши5 Бисппегі, Васійй5 тедаїегішт, Асеїобасієг разівигіапив, Сіовзітідіит Беї|егіпскії, І астобасіїи5 сазеї/рагасазеї та Васійи5 Пехив.
У інших прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіорбасійив5 аеїргиескії, Мікаїібасійив5 Наіорпішв5, Агоїобасієг міпеїаподії,
Сіовігідіит разівешіапит, Раепірбасійй5 сНірепвзіз5, Реепдотопа5 в5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р. Яногезсепв, та Р. риііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 17), Реенидотопах риїіда, Васійив5 в5р. (тісно пов'язаний з В. коспії, В. роспеопепві5, та Васіив5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з
ЗБЕО ІЮО МО: 15), Васійи5 атуйоїїдиеїасіеп5, Осеапобасіїшв5 опсогпупспі, Раеєпібасіїшв Іашивб (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпірасіи5 Іашіиє та Раепібасійшє в5р. (штам М412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 12), Васійшв ІсНепіггтів, І асіобасійи5 міпі, Раєпірасійи5 соокії,
Васіив5 зибійв, Іасюбасійш5 Бисппегі, Васійн5 тедаїепйит, Асеюбасієї равзієшіапив, та
І асюбрасійй5 сазеї/рагасазєї. У подальших прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з Іасіобасійив5 авеїрпескії, Мігаїрбасійи5
Наіорнішв, Агоїюобасіег міпеїапайї, Сіовігідіит равієшіапит, Рвейдотопазв зр. (тісно пов'язаний з
Р. епіоторнійа, Р. Яогезсепв, та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17), Рвепдотопав риїйда,
Васійи5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепвіб5, та Васій5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮ МО: 15), Васіїи5 атуіоЇїдиеїтасієпв, Осеапобасіїїив опсогппупснпі, Васіїїшв
ІПспепітогтів, І асіорасіййв5 міпі, Васійй5 в5и,ирійв, І асіобасійй5 рисппегі, Васіїйш5 тедаїегіт,
Асеїюрбасіеєг разієвшпапив, та І асіорбасійи5 сазві/рагасавзеїі.
У подальших прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіорбасіїи5 ає!ргиескії, А2оїобасієг міпеіапайї, Сіовійаіт разіешіапит, 60 зігеріотусез діізеив5, Рзепдотопазв зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р. ЯПогезсепв, та Р. б ршийда; наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17), Реепдотопа5 риїйда, Васійшв5 атуїпоїіїдцегасієпо, ВасПив5
ІПспепітогтів, І асіорасіййв5 міпі, Васійй5 в5и,ирійв, І асіобасійй5 рисппегі, Васіїйш5 тедаїегіт,
Асеїобасієг равівшпіапив, Сіозігіаіт Беї|егіпекії, асіорбасійи5 сазеї/рагасазеї, та Васійи5 Пехив.
У іншому прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асіорбасіїи5 ає!ргиескії, А2оїобасієг міпеіапайї, Сіовійаіт разіешіапит,
Раепібасійниє спірепві5, ігеріотусев дгізей5, Рвзепдотопаб5 5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р. Яногезсепв, та Р. риїіда; наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 17), Реенидотопах риїіда, Васійив5 атупоїїдиегасієпв, Осеаповрасійн5 опсопупені, Раєпірасійи5 Іашив (наприклад, тісно пов'язаний з
Раепібасійи5 Іашив та Раєпірасійи5 р. (штам У412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 РДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 12), Васйив5
ІПспепітоптів, І асюбасії 5 міпі, Раепірбасіїив5 соокії, Васійив 5,ибійїв, І асіобасіїйи5 рисппетїі, Васі тедаїенпит, Асеїобрасієг разієшпіапив, Сіовіпадіит бБеїегіпсКії, Іасіюбасійй5 сазеї/рагасавзеї, та
Васійи5 Пехив.
У іншому прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з Сіозігідійт реї|егіпскКії, Зігеріотусез агізеив та Васійив5 Пехив.
У певних прикладах, комбінації цих композицій використовують для одержання композицій, розкритих у цьому описі, наприклад, шляхом змішування та співферментування двох з композицій.
Фахівець у даній галузі техніки визнає, що ідентифікація мікробів, особливо на рівні виду або штаму, не завжди можлива. Як обговорювалося у Прикладі 1, мікроби у композиціях, розкритих у цьому описі, були проаналізовані за допомогою 165 рДНК секвенування та секвенування цілого геному з подальшим порівнянням з послідовностями у загальнодоступних базах даних.
Проте, через обмеження інформації у базах даних послідовностей (включаючи мало або повну відсутність інформації для деяких видів або штамів та/або змін у номенклатурі з часом), може бути складним завдання надання ідентифікацій для характерних видів або штамів. Таким чином, у деяких варіантах втілення, мікробні види, включені у розкриті композиції, ідентифікуються за їх ідентичністю послідовностей з послідовностями 165 рДНнК,
Зо представленими у цьому описі (ЗЕО ІО МО: 3-24).
У деяких прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробів з 165 рДНК послідовностями, які мають щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей (наприклад, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95, або навіть 100 95 ідентичність послідовностей) з кожною з 5ЕО І МО: 3-24.
У іншому прикладі, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробів з 165 рДНК послідовностями, які мають щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей (наприклад, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95, або навіть 100 95 ідентичність послідовностей) з кожною з 5ЕО 10 МО: 3-8, 10, 11, 13-18 та 20-24. У інших прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробів з 165 рДНК послідовностями, які мають щонайменше 9595 ідентичність послідовностей (наприклад, щонайменше 9695, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95, або навіть 100 95 ідентичність послідовностей) з кожною з ЗЕО ІЮ МО: 3-7 та 9-24 або включають або складаються з клітин мікробів з 165 РрДНК послідовностями, які мають щонайменше 9595 ідентичність послідовностей (наприклад, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95, або навіть 100 95 ідентичність послідовностей) з кожною з 5ЕО ІО МО: 3-7, 10, 11, 13-18 та 20-24. У інших прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробів з 165 рДНК послідовностями, які мають щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей (наприклад, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95, або
БО навіть 100 95 ідентичність послідовностей) з кожною з ЕС ІЮ МО: 3-8, 10, 11, 14, 16-18, 20-22 та 24 або включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробів з 165 РДНК послідовностями, які мають щонайменше 9595 ідентичність послідовностей (наприклад, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95, або навіть 100 95 ідентичність послідовностей) з кожною з 5ЕО ІО МО: 3-14, 16-22 та 24.
У деяких варіантах втілення, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з колекції мікробів, які депоновані у Американській колекції типових культур (АТСС, Мапаззав, МА) 1 липня 2016 року (номери депозитів РТА-123288, РТА-123289) та 8 липня 2016 року (номер депозиту РТА-123298). У деяких прикладах, композиція включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з мікробних видів у двох або декількох з бо розкритих зразків депонування у АТСС, наприклад, мікробних видів у зразку у АТСС з номерами депонування РТА-123288 та РТА-123289 або мікробних видів у зразку у АТСС з номерами депонування РТА-123298 та РТА-123289.
У додаткових варіантах втілення, композиція включає клітини комбінації мікробних видів, що забезпечують бажані метаболічні характеристики або функції (наприклад, одну або декілька функцій, які можуть прискорювати ріст рослин). Таким чином, у деяких прикладах, зазначена композиція включає клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну (наприклад, денітрифікація, фіксація азоту та/"або вироблення уреази), клітини щонайменше одного мікробного виду, що є стійким до солі (наприклад, ріст впродовж 72 годин у середовищі, що містить 1 95, 2,5 Фо, 5 Уо, 7,5 Чо або 10 95 солі), клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації фосфатної солі та/або солей кальцію та/або цинку, клітини щонайменше одного мікробного виду з целюлолітичною та/або хітинолітичною функцією (наприклад, розщеплення СісМАс, розщеплення хітину та/або розщеплення целобіози), клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізму яблучної кислоти (наприклад, асиміляція яблучної кислоти), клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією вироблення фітогормону (наприклад, індолу (ауксин)), клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізування заліза (наприклад, залізозв'язуюча функція (сидерофори)), та/або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією дефосфорилювання органічного фосфату.
Композиція може включати клітини мікробних видів з однією або декількома (наприклад, 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, або всіма) із зазначених вище характеристик або функцій, а також з іншими бажаними характеристиками або функціями. У певних прикладах, зазначена мікробна композиція включає клітини трьох або більше мікробних видів, кожен з щонайменше однією з розкритих функцій. У деяких прикладах, зазначена композиція включає клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну та клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі; або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну, клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації кальцію та/"або фосфату; або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну, клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі,
Зо клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації солей кальцію та/або фосфату та/або цинку, та клітини щонайменше одного мікробного виду з целюлолітичною/хітинолітичною функцією; або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну, клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі, клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації солей кальцію та/або фосфату та/або цинку, клітини щонайменше одного мікробного виду З целюлолітичною/хітинолітичною функцією, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізму яблучної кислоти; або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну, клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі, клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації солей кальцію та/або фосфату та/або цинку, клітини щонайменше одного мікробного виду З целюлолітичною/хітинолітичною функцією, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізму яблучної кислоти, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією продукування фітогормону; або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну, клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі, клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації солей кальцію та/або фосфату та/або цинку, клітини щонайменше одного мікробного виду З целюлолітичною/хітинолітичною функцією, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізму яблучної кислоти, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією продукування фітогормону, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізування заліза; або клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією азотного обміну, клітини щонайменше одного мікробного виду з стійкістю до солі, клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією солюбілізації кальцію та/"або фосфату та/або солі цинку, клітини щонайменше одного мікробного виду з целюлолітичною/хітинолітичною функцією, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізму яблучної кислоти, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією продукування фітогормону, клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією метаболізування заліза, та клітини щонайменше одного мікробного виду з функцією дефосфорилювання органічного фосфату. Ці комбінації мікробних видів зі специфічними функціями являють собою тільки приклади, та будь- яка факторна комбінація процитованих функцій входить у обсяг даного винаходу. Як бо обговорено у цьому описі, один мікробний вид може мати більше, ніж одну з перерахованих функцій, таким чином, у деяких прикладах композиція, що включає клітини із заданою кількістю перерахованих функцій, необов'язково буде мати клітини тієї ж кількості різних мікробних видів.
Зразкові методи визначення метаболічних характеристик або функцій мікробних клітин та ідентифікація мікробних видів з особливими характеристиками описані у Прикладі 3. Фахівець у даній галузі техніки визнає, що окремий вид мікроорганізмів може мати більш ніж одну з цих характеристик (наприклад, Таблиця 11, нижче). У наведених нижче прикладах мікробні види ідентифікуються за назвою; ці ідентифікації включають мікробні види з 165 рДНК з щонайменше 95956 (наприклад, щонайменше 96 95, 9795, 9895, 9995 або навіть 100 95) ідентичністю послідовностей з послідовностями, пов'язаними з кожним з цих названих видів, розкритих у цьому документі як БЗЕО ІЮ МО: 3-24.
Таким чином, у деяких варіантах втілення розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, або більше) мікробного виду з функцією азотного обміну, наприклад, щонайменше одного з Асеїобрасієг разієшіапив, Агоїобрасієг міпеїапаїй, Васійй5 тедаїегішт, Васійив5 вибійв, Васійив5 ІсПепітоптів,
Осеапорасіїйн5 опсотупсні, Васійй5 атуїоїіїдиеїтасієпе, Васійше Пехив, Мігаіїрасійи5 НаїІорнішв,
Сіозійаішт бБеїегіпсКії, Сіовійдішт разієшіапит, Раепірасійи5 соокКії, Раеєпібрасіїйшв ашив (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпірасіїйй5 Іашиє та Раепібасійшє в5р. (штам М412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 12), Реепдотопа5 в5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа,
Р.Япогезсепв, та Р. ришііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 17), та ігеріюотусез дгізеи5. У інших прикладах, розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, або більше) мікробного виду, стійкого до солі 5 Зо Масі, наприклад, Васійй5 тедаїегіит, ВасіПйи5 5,ибійв, Васійив ІПспепітттів, Осєапорасійи5 опсоппупсені,
Васйи5 атупоїїдиеїтасіеп5, ВасіПив 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепвів, та Васіїйи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 15), ВасйШив5 ЛПехив, І асіорасіи5 сазеї/рагасавзеїі,
Зо Раєпібасіїи5 Іашив (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпібасіи5 Іашив5 та Раєепібасійиз5 5р. (штам
Уу412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 12), Рзендотопавх риїйда, та Рзейдотопазв зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнпіЇа, Р. Погезсепв5, та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 РДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО 10 МО: 17). У інших прикладах, розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7 або більше) мікробного виду з функцією солюбілізації фосфату та/або кальцію та/або цинку, наприклад, щонайменше одного з Сіовігідіит Бреї|егіпекКії, Сіовігідіит разіешіапит, І асіораснйив сазеї/рагасазеї, І асіобасіїив5 рисппеїі, Гасюбасійшв міпі, І асіобасіїи5 аеїргиескії та Раєпірасіїїш5
Іашив (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпірбасйи5 Ііашив та Раєпірасійив5 р. (штам М412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 12). У додаткових прикладах, розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, або більше) мікробного виду з целюлолітичною та/або хітинолітичною функцією, наприклад, одного або більше з Васіїш5 тедаїегішт, Васіїйшв 5иЇибБійв, Васйшв5 атуїоїїдиєїтасіеп5, Васійив 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепві5, та Васіїйй5 в5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з
ЗЕО ІЮ МО: 15), Васійи5 ЯПЯехив, Сіовіпаійт бБеї|егіпекКії, Сіозідійт равівєшіапит, І асюбасійив5 сазеї/рагасазеї, І асіобасії5 міпі, Раеєпібасіив5 Іашиз (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпірасіїи5
ІіІашив та Раєпірасійй5 вр. (штам М412МС10), наприклад, мікробний вид з 165 рДНнК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 12), Раєпірасйив5 спірепвзіз та бігеріотусев дгізеи5. У інших прикладах, розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше б або більше) мікробного виду з функцією метаболізму яблучної кислоти, наприклад, щонайменше одного з Васійй5 тедаїегішт, Васіив5 в5ибБійв, Васійнв5 Іспепіогтів,
Васйи5 атупоїїдиеїтасіеп5, ВасіПив 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепвів, та Васіїйи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮ МО: 15), Васіїшв5 Пехив5, Раєпібасіїшв5 соокії, Раєпірасйив5 бо Іашив (наприклад, тісно пов'язаний з Раєпірбасйи5 Ііашив та Раєпірасійив5 р. (штам М412МС10),
наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮО МО: 12), Раєпірасіїш5 спірепві5, Рзендотопах риїда, Рзендотопазвз з5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторпіїа, Р. Погезсепв, та Р. ршіда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 17), та зЗігеріотусев апібзєеи5. У додаткових прикладах розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше З або більше) мікробного виду з функцією вироблення фітогормону (наприклад, індолу (ауксин)), наприклад, щонайменше одного з Сіовігідішт разівшіапит, І асіорасіїйй5 міпі та Іасіюобрасійй5 рисНпегі. У додаткових прикладах, розкриті композиції включають клітини щонайменше одного (наприклад, щонайменше 2, щонайменше 3, або більше) мікробного виду з функцією метаболізування заліза (наприклад, залізозв'язуюча функція), наприклад, щонайменше одного з Сіовіпаіт разівигіапит та Сіозігіаішт Беї|егіпеКії. Композиції, що включають клітини мікробних видів з будь-якою комбінацією цих характеристик або функцій, попадають у обсяг даного винаходу.
У додаткових варіантах втілення, будь-яка з мікробних композицій, розкритих у цьому описі, може додатково включати клітини одного або більше (наприклад, 2 або більше, З або більше, 4 або більше, або всіх) з ОезиПозроговзіпив тетгідаієї, Мігтозоритіїшв в5р., Магіпобрасієг бБгуогоогит,
І ерозрійПит Тетодіагоїорпит, та І асіорасійив5 асідорпіив5.
Описані мікробні консорціуми або композиції можуть включати один або декілька інших компонентів додатково до мікробів, включаючи, крім інших, солі, іони металів та/або буфери (наприклад, один або декілька з КНоРОх, К»НРО»х, СасСі», Мда5О», ЕесСі», МамМмоб»- та/або
Маг2?МоО».), мікроелементи (такі як сірка, сульфат, сульфіт, мідь або селен), поживні мікроелементи (наприклад, бор (В), цинк (77), марганець (Мп), залізо (Еє), мідь (Си), молібден (Мо), хлор (СІ)), вітаміни (такі як вітаміни В або вітамін К), цукри (такі як сахароза, глюкоза або фруктоза), хітин, хітозан, глюкозамін, білок та/або одну або більше амінокислот. До додаткових компонентів, які також можуть бути включені до композицій, належать НУТ В, НУТ С та/або НУТ о, одне або декілька добрив (наприклад, рідких добрив), один або декілька пестицидів, один або декілька фунгіцидів, один або декілька гербіцидів, один або декілька інсектицидів, один або декілька рослинних гормонів, один або декілька еліситорів рослин або комбінацій з двох або більшої кількості цих компонентів.
Зо У деяких варіантах втілення, розкриті композиції знаходяться у рідкому середовищі (такому як культуральне або ферментаційне середовище або середовище для зберігання) або інокулумі. У інших варіантах втілення, ці композиції є присутніми у твердому або желеподібному середовищі (наприклад, культуральна чашка), яке містить або підтримує мікроби. У інших прикладах, розкриті композиції є ліофілізованими та можуть бути відновлені шляхом додавання рідини (такої як культуральне середовище) та шляхом вирощування у рідкому середовищі або шляхом посіву штрихами на твердому середовищі.
У інших варіантах втілення композиції, розкриті у цьому описі, є присутніми у сухих складах, таких як сухий порошок, драже або гранули. Сухі склади можуть бути приготовлені шляхом додавання осмопротектора (такого як цукор, наприклад, трегалоза та/або Мальто декстрин) до мікробної композиції у розчині у потрібному співвідношенні. Цей розчин комбінують з сухим носієм або абсорбентом, таким як деревне борошно або глина, у потрібній концентрації мікробної композиції (такій як 2-30 95, наприклад, 2,5-10 95, 5-15 95, 7,5-20 95 або 15-30 Об).
Гранули можуть бути утворені шляхом включення глини або полімерних зв'язувальних речовин, які слугують для утримання гранул від розпаду або забезпечують конкретні фізичні або розщеплювальні властивості. Приклади способів утворення гранул включають роторне гранулювання, гранулювання у змішувачі або екструзію. У інших прикладах, сухі склади можуть бути одержані шляхом розбризкування або просочення рідної мікробної композиції на/у твердий носій, такий як бентоніт, або шляхом нанесення як покриття рідкої мікробної композиції безпосередньо на гранулу добрива. У додаткових способах сухі склади включають композиції, які містять клітини одного або декількох мікробних видів, розкритих у цьому описі (або будь-якої їх комбінації), які висушені ліофілізацією (ліофілізовані). Додаткові способи одержання сухих складів, які включають один або декілька мікробних видів, є відомими спеціалістам у даній галузі, наприклад, як описано у публікації ЕРоптиїайоп ої Місгобіа! Віорезіїєсіде5: Вепеїісіа!
Містоогдапізт5, Метаїйодез апа 5еєеа Тгєаїтепівх, Вигдев, ред., Зргіпдег бсієпсе, 1998.
У деяких прикладах композиції тримають при температурі, яка підтримує ріст мікробів, наприклад, при температурі приблизно 25-45 "С (наприклад, приблизно 30-35 "С, приблизно 30- 40 "С або приблизно 35-40 "С). У інших прикладах композиції зберігають при температурі, при якій мікроби не ростуть або є неактивними, наприклад, нижчій за 25 "С (наприклад, 4 "С, -20 С, -40 "С, -70 "С або нижчій). Спеціаліст у даній галузі може створювати композиції для холодного бо зберігання, наприклад, шляхом включення стабілізаторів (таких як гліцерин). У інших додаткових прикладах композиції зберігають при навколишній температурі, наприклад, приблизно 0-35 "С (наприклад, приблизно 10-30 "С або приблизно 15-25 7С).
В. Способи одержання визначених композицій
У деяких варіантах втілення, розкриті композиції одержують шляхом спів-культивування або ко-культивування клітин двох або більше з розкритих мікробних видів (наприклад, 2 або більше
З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше, 9 або більше, 10 або більше, 11 або більше, 12 або більше 13 або більше, 14 або більше, 15 або більше, 16 або більше 17 або більше 18 або більше, 19 або більше, 20 або більше, 21 або більше, або 22 або більше мікробних видів). У прикладах, у яких не всі з мікробних видів у композиції співкультивують, зазначену композицію одержують шляхом комбінування двох або більше співкультивованих субпопуляцій (суб-композицій) мікробних видів у композицію.
Додаткові компоненти (наприклад, не-мікробні компоненти) можуть бути присутні у процесі одержання суміші мікробних видів (повна популяція або субпопуляція(її)) або можуть бути додані після одержання суміші мікробних видів у композицію.
У деяких прикладах, розкриті композиції одержують шляхом спів-культивування всіх з мікробних видів у композиції. Таким чином, у одному прикладі, розкриту композицію одержують шляхом спів-кгультивування клітин кожного з Іасіобасіїййив5 аеїІргиескії, Мігдібасійи5 Наіорпісв,
А?оіобасієг міпеїапай, Сіовігідійт равієшіапит, Раєпірасіїййи5 спірепвіб5, Зігеріотусев5 дгізецйв5,
Резепдотопав вр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторпіїа, Р. Поогезсеп5 та Р. ршіда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з
ЗЕО ІЮО МО: 17), Рзендотопаз риїйда, ВасіПив 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепвів, та Васійнб5 в5р. (штам В8-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮО МО: 15), ВасйШив атупоїїдпегасієпв,
Осеапорасійн5 опсоппупспі, Раєпірасійш5 Іашив, Васійй5 Іспепіоптів, Іасіобасіїйив міпі,
Раєпібасіїи5 соокії, Васійш5 виріб, І асіобасніи5 рисппегі, Васіїйш5 тедаїегшт, Асеїюбасієег разівшгіапив, Сіозійадішт бБеї|егіпсКії, Іасіобасійй5 сазеї/рагасазєї та Васійй5 Яехив. У іншому прикладі, розкриту композицію одержують шляхом спів-культивування клітин кожного з
І асюбрасійив аєїБгиескії, Мігаїбасійив5 Наіорпійш5, Агоїобасієг міпеїапай, Сіовігідіит разівєшіапит, зігеріотусез діізеив5, Рзепдотопазв зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р. ЯПогезсепв, та Р. ршиїйда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17), Роеидотопах риїйда, Васійшизв 5р. (тісно пов'язаний з В. Коснії,
В. роспеопепзіз, та Васійй5 в5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНнкК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 15), Васйив5 атупоїїдиеїтасієпе, Осеапобасіїїй5 опсопупсні, Васійив5 ІсНепітогтів, І асіюбасійив5 міпі, Васійв
З5 5БиИБіЙв, ІасіораснШи5 БисПпегі, Васіїйи5 тедаїегішт, Асейюобасієг рабвієшгіапив, Сіовігдіит
БеїепіпскКії, Іасіорасійш5 сазеї/рагасазеї, та Васійй5 Пехиб5. У додаткових прикладах, розкриту композицію одержують шляхом спів-культивування клітин кожного з Іасіобасіїив5 аеїБбгиескії,
Мігдібасіїив Наіорпйив5, Агоїобасіевг міпеїапаїй, Сіовігдіит равівешіапит, Раепірасіїн5 спірепвів, зігеріотусез діізеив5, Рзепдотопазв зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнійа, Р. ЯПогезсепв, та Р. ршиїйда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮ МО: 17), Реєидотопах риїада, Васі» 5р. (тісно пов'язаний з В. Коснії,
В. роспеопепзіз, та Васійй5 в5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНнК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 15), Васйив5 ату!поїїдиеїтасіеєпе, Осеапобрасійи5 опсогпупспі, Раєпірасійн5 ашив, Васійи5 ІсНепіггтів,
І асторасій5 міпі, Раєпірасійнв5 соокії, І асіобасіїйи5 рисппе!їі, Васіїй5 тедаїегішт, Асеїобасієг разівшгіапив, Сіозійадішт бБеї|егіпсКії, Іасіобасіййн5 сазеї/рагасазєї та Васійй5 Яехив. У іншому прикладі, розкриту композицію одержують шляхом спів-культивування клітин кожного з
І асюбрасійив аєїБгиескії, Мігаїбасійив5 Наіорпійш5, Агоїобасієг міпеїапай, Сіовігідіит разівєшіапит, зігеріотусез дгізеи5, Рзейдотопав зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнпіїа, Р. Пиогезсепв та Р. ршиїйда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮ МО: 17), Реєидотопах риїада, Васі» 5р. (тісно пов'язаний з В. Коснії,
В. роспеопепзіз та Васійи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНнНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 15), Васйив5 атупоїїдиєїасієпох, Осеапобрасійш5 опсогпупсні, Васіййє Іспепіїогтіх, Іасіорасійи5 міпі,
І астобасійи5 рисппегі, Васіїйй5 тедаїегпит, Асеїорасієї равзіешіапив, Сіовійаішт бБеї|егіпекії,
І асіорасійи5 сазеї/рагасазеї та Васійив5 Пехив.
У іншому прикладі, розкриту композицію одержують шляхом спів-культивування клітин кожного з І асіорбасійив5 аєїгиескії, А2оїобасієг міпеїапайїї, Сіовігідіит разівшіапит, 5ігеріотусев дгізви5, Рзендотопав 5р., Рзендотопаз риїйда, Васійи5 ату/оїїдиегТасієпз5, Васійшив5 ІсПпепітогтів, 60 І асторасійи5 міпі, Васійє 5,ирій5, Іасіюбасіши5 Бисппегі, Васійй5 тедаїегішт, Асеїобасієг разівшгіапив, СіозійаіШшт бБеї|егіпсКії, Іасіобасійш5 сазеї/рагасазєї та Васійй5 Пехи5. У інших прикладах, розкриту композицію одержують шляхом спів-культивування клітин кожного з
І асюбрасійив аеїІрпиескії, А2оїобасієг міпеїапайїйї, Сіовзійайт равівєшіапит, Раєпібасіїйшв спірбепвів, зігеріотусев дгізеи5, Реецдотопаз 5р., Реецдотопа5 рийда, Васійшив5 атупо|іїдпегасієпв,
Осеапорасійн5 опсоппупспі, Раєпірасійш5 Іашив, Васійй5 Іспепіоптів, Іасіобасіїйив міпі,
Раепірасійи5 соокКії, Васійи5 5иИБШі5, І асіобасійй5 БисНпегі, Васійй5 тедаїепйт, Асеюбасієвг разівигіапив, Сіовзітідіит Беї|егіпскії, І астобасіїи5 сазеї/рагасазеї та Васійи5 Пехив.
Культуральне середовище, яке може бути використане для одержання цих композицій шляхом спів-культивування, описане у Прикладі 2, та включає, але не обмежується наведеними, середовище, що включає 2 95 меляси (мас/об.), 1Х фосфатно-буферний сольовий розчин (РВБ), 0,1 965 сироваткових білків (мас/об.), та 0,25 95 Репі-Міго Рів (мас/об.). У інших прикладах, середовище для спів-культивування мікробних клітин включає фосфатно-буферний сольовий розчин (їх), чорну тростинну патоку (2-10 95 мас/об.), сироваткові білки (0,1-0,5 95 мас/об.), Гепі-Міго Ріив Ріапі М (0,25-1,25 95 мас/об.), з додаванням або без екстракту морських водоростей (0,0067 95), сухі дріжджі (0,0033 95 мас/об.), та/або спіруліну (0,0067 95 мас/об.).
У інших прикладах, розкриті композиції одержують шляхом спів-культивування клітин щонайменше двох субпопуляцій мікробних видів та потім комбінування двох ко-культур з одержанням композиції. У одному прикладі, композицію одержують шляхом спів-кгультивування клітин Іасіорасійй5 аеїБгескії, Мігдірбасіїййив Наорийи5, Агоюбасієг міпеїапаїй, Сіовійаійт разівєшіапит, Раєпірасійи5 спірепзі5, Реендотопав 5р. (тісно пов'язаний з Р. епіоторнпійа, Р.
ТПогезсепв та Р. ришііда, наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17), Реенидотопав риїйда, Васіїїнв5 5р. (тісно пов'язаний з В. Коснпії, В. роспеопепві5 та Васіи5 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з БЕО ІЮО МО: 15),
Васійн5 атупоїїдиеїасіеп5, Осеапобасіїи5 опсоппупсепі, Раєпірасійи5 Іашив, Васіїив Іспепігогтів,
Гасюбасійшз5 міпі, Раєпірасіїїи5 соокії, Васійи5 5,иБійів5, І астобасійи5 Бисппеїі, ВасіШив5 тедаїенпит,
Асеїобасієг разієшіапив та І асіобасіїи5 сазвеї/рагасазвї (група з 19 мікробних видів) та окремо спів-культивування Сіовігідішт Беї|егіпскКії, Зіеріотусев5 дгізвиє та Васійи5 ЯПехив (група з З мікробних видів).
Зо У іншому прикладі, композицію одержують шляхом спів-культивування І асіобасішв5 деїбгиескії, Мігаїбаснив Наіорпішв, Агоїюбасівєг міпеЇапайї, Сіовігідіит разівшіапит, Рзепдотопав зр. (тісно пов'язаний з Р. епіоторпіїа, Р. Яногезсепз та Р. ршііда, наприклад, мікробний вид з 165 рРДНК послідовністю з щонайменше 9995 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 17),
Реєидотопах риїйда, Васіїйив 5р. (тісно пов'язаний з В. Коспії, В. роспеопепві5, та Васійив 5р. (штам В-27341), наприклад, мікробний вид з 165 рДНК послідовністю з щонайменше 99 95 ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІО МО: 15), Васійи5 атуїоїїднегасіеп5, Осеаповрасійи5 опсоптупсені, Васійи5 Іспепіоптів, І астобасіїи5 міпі, Васійи5 5,иБійів5, І астобасійи5 Бисппетгі, Васіи5 тедаїенпцт, Асеїобасієг разівшіапи5, та І асіорасіи5 сазеї/рагасавзєї (група з 16 мікробних видів) та окремо спів-культивування Сіовігдішт бБеї|егіпсКі, Зігеріотусев дгізеиз та Васйив
Техив. Наступні окремі спів-культивування двох сумішей за умов, достатніх для росту мікробів (наприклад, тих, що описані у Прикладі 2), окремі спів-культури змішують з одержанням композиції.
У деяких прикладах, середовище, що використовують для спів-культивування групи з 19 мікробних видів або групи з 16 мікробних видів, включає 10 95 меляси (мас/об.), 1Х РВ5, 0,5 95 сироваткових білків (мас/об.), та 1,2595 Еепі-Мійто Ріиб (мас/0об.)-У деяких прикладах, середовище, що використовують для спів-культивування групи з З мікробних видів, включає 2 95 меляси (мас/об.), 1Х РВ5, 0,1 95 сироваткових білків (мас/об.) та 0,25 95 Репі-Міго Ріи5. Однак, фахівець у даній галузі може визначити інші середовища, які придатні для спів-культивування мікробів, включаючи різні кількості перерахованих інгредієнтів, як описано у Прикладі 2. Після окремого спів-культивування двох сумішей в умовах, достатніх для росту мікробів (наприклад, тих, що описані у Прикладі 2), окремі спів-культури (наприклад, групу з 19 мікробів та групу з З мікробів, або групу з 16 мікробів та групу з З мікробів) змішують для отримання композиція. У деяких прикладах дві спів-культури змішують у співвідношенні від 10:1 до 1:0,5 (наприклад, від 8:1 до 11, від 5: 1 до 2: 1, від 3: 1 до 1:0,5) велика група (група з 19 мікробних видів або група з 16 мікробних видів): невелика група (група з З мікробних видів). У деяких прикладах співвідношення спів-культур становить близько 10:1, 9:1, 8:11, 7:11, 6:1, 5:11, 4А:1, 3:11, 2:1, 1:11 або 1:0,5. У конкретних варіантах втілення співвідношення спів-культур становить приблизно 6,5:1, 11, 2:11 або 1:0,5. Подібні середовища та суміші спів-культур можуть бути використані із спів- культурами, які є ідентичними переліченим вище, але не включають Васіїїш5 5,ибінів.
У подальших прикладах, композицію одержують шляхом окремого культивування мікробів у зразках АТСС з номерами депонування РТА-123288 та РТА-123289 та змішування цих окремих культур з одержанням композиції. У додаткових прикладах, композицію одержують шляхом окремого культивування мікробів у зразках АТСС з номерами депонування РТА-123298 та РТА- 123289 та змішування цих окремих культур з одержанням композиції.
І. Процеси біодеградації
Описані мікробні композиції застосовують для розщеплення біологічних матеріалів, таких як багаті на хітин матеріали, наприклад, водяних тварин або побічних продуктів водяних тварин, комах або грибів. Таким чином, у деяких варіантах втілення авторами описуються способи, які включають змішування одного або декількох з описаних мікробних композицій з хітиновмісним біологічним матеріалом для утворення суміші та ферментації суміші. У деяких варіантах втілення способи також включають розділення суміші на тверду, водну та, необов'язково, ліпідну фракції (ФІГУРА 1).
У деяких варіантах втілення описаний авторами процес біодеградації включає змішування мікробної композиції, розкритої у цьому описі, з одним або декількома хітиновмісними біологічними матеріалами. До хітиновмісних біологічних матеріалів, крім інших, належать водяні тварини або побічні продукти водяних тварин, комахи або гриби. У деяких прикладах хітиновмісним біологічним матеріалом є водяна тварина, така як водяна членистонога тварина (наприклад, представник класу вищих раків). До водяних членистоногих для використання згідно з описаними способами належать креветки, краби, омари, лангусти або криль. У деяких прикладах згідно з описаними авторами способами біодеградації використовують цілих водяних тварин (таких як водяні членистоногі) або побічні продукти водяних тварин. До побічних продуктів водяних тварин належать будь-які частини водяних тварин, наприклад, будь-які частини, одержані шляхом переробки водяних тварин. У деяких прикладах побічним продуктом водяної тварини є цілий зовнішній скелет або частина зовнішнього скелета водяної тварини, наприклад, панцир креветки, краба, лангуста або омара. У інших прикладах побічним продуктом водяної тварини є частина водяної тварини, наприклад, головогруди креветки.
У інших прикладах хітиновмісний біологічний матеріал включає гриби, такі як гриби РнуЇйт 7удотусоїа, Вазідіотусоїа, Азсотусоїа або ЮОеціеготусоїа. Зокрема, прикладами грибів можуть
Зо бути такі види, як Азрегодійив5 врр., Репісіїййшт 5рр., Тісподепта 5рр., Засспаготусев 5рр. та
Зспігозасспаготусев 5рр. Таким чином, потоки відходів з хлібопекарських, пивоварних та ректифікаційних підприємств можуть забезпечувати джерела хітиновмісного біологічного матеріалу. У інших прикладах хітиновмісний біологічний матеріал включає комах, які містять хітин у їхніх зовнішніх скелетах, таких як коники, цвіркуни, жуки та інші комахи. Побічні продукти переробки таких комах також розглядаються як джерела хітину.
Хітиновмісний біологічний матеріал змішують з композицією, описаною у Розділі ІЇ вище, для утворення практично гомогенної суміші. У деяких прикладах хітиновмісний біологічний матеріал розтирають, розламують, подрібнюють, перемелюють або іншим чином диспергують перед змішуванням з описаною авторами мікробною композицією. У конкретних прикладах суміш містить приблизно 10-50 95 (наприклад, приблизно 10-20 95, приблизно 20-30 95, приблизно 30- 40 95, приблизно 25-40 95, наприклад, приблизно 2595, приблизно 3095, приблизно 35 95, приблизно 40 95, приблизно 45 95, або приблизно 50 95) хітиновмісного матеріалу (такого як голови креветок) (маса/об'єм) у інокулумі, що містить приблизно 0,1-5 95 (наприклад, приблизно 0,1-1 95, приблизно 0,5-2 95, приблизно 1-2 95, приблизно 2-3 95, приблизно 0,1 95, приблизно 0,2 95, приблизно 0,3 95, приблизно 0,5 95, приблизно 0,8 95, приблизно 1 95, приблизно 1,25 95, приблизно 1,595, приблизно 1,7595, приблизно 295, приблизно 2,595, приблизно 3 95, приблизно 4 95 або приблизно 5 95) мікробної композиції (об'єм/об'єм).
У деяких прикладах інокулум, хітиновмісний біологічний матеріал та цукор (або інше джерело вуглецю) змішують, наприклад, шляхом перемішування або збовтування. У інших прикладах один або декілька мікробів у зазначеній мікробній композиції необов'язково активують перед змішуванням з хітиновмісним біологічним матеріалом та ферментацією.
Активація для описаних авторами способів не вимагається. Регулювання часу та/або температури ферментації може здійснюватися спеціалістом у даній галузі залежно від того, чи активуються мікроби перед ферментацією. Активація мікробу(ів) може здійснюватися шляхом інкубації інокулуму зазначеної мікробної композиції з джерелом вуглецю (таким як цукор, наприклад, глюкоза, сахароза, фруктоза або інші цукри) при температурі та протягом періоду часу, які є достатніми для росту мікробів. У деяких прикладах інокулум мікробів (наприклад, мікробна композиція, розкрита у цьому описі) має концентрацію приблизно 0,05-5 95 (об'єм/об'єм) (наприклад, приблизно 0,5-5595, приблизно 0,5-295, приблизно 1-295 або бо приблизно 2-3 95) у рідкому середовищі. Інокулум розводять у розчині, який містить приблизно
0,1-1 95 цукру (наприклад, приблизно 0,1-0,5 95, приблизно 0,1-0,3 96, приблизно 0,2-0,6 95 або приблизно 0,5-1 95, наприклад, приблизно 0,1 95, приблизно 0,2 95, приблизно 0,3 95, приблизно 0,4 95, приблизно 0,5 95, приблизно 0,6 95, приблизно 0,7 96, приблизно 0,8 95, приблизно 0,9 95, або приблизно 1 95) та інкубують при навколишніх температурах, наприклад, приблизно 20- 40 "С (наприклад, приблизно 20 "С, приблизно 25 "С, приблизно 30 "С, приблизно 35 "С, або приблизно 40 "С) протягом приблизно 1-5 днів (наприклад, приблизно 24 годин, приблизно 48 годин, приблизно 72 годин, приблизно 96 годин або приблизно 120 годин). У інших прикладах активація мікробу(ів) може відбуватися шляхом інкубації інокулуму зазначеної мікробної композиції при температурі та протягом періоду часу, які є достатніми для росту мікробів, наприклад, інкубації при приблизно 20-40 "С (наприклад, приблизно 25-35 "С) протягом періоду від 12 годин до 5 днів (наприклад, 1-4 днів або 2-3 днів). У деяких необмежувальних прикладах мікроби вважаються активованими, коли культура досягає оптичної густини »0,005 при 600 нм.
Після змішування хітиновмісного біологічного матеріалу та зазначеної мікробної композиції (які є необов'язково активованими), суміш піддають ферментації. У деяких прикладах перед ферментацією вимірюють рівень рН суміші. Рівень рН перед ферментацією у разі необхідності регулюють до заданого діапазону (наприклад, рН від приблизно З до приблизно 4 або приблизно від 3,5 до 4). Суміш інкубують при температурі приблизно 20-40 "С (наприклад, приблизно 30-36 "С, наприклад, приблизно 30 "С, приблизно 31 "С, приблизно 32 "С, приблизно 33 "С, приблизно 34 "С, приблизно 35 "С, приблизно 36 "С, приблизно 37 "С, приблизно 38 С, приблизно 39 "С, або приблизно 40 "С) протягом приблизно 1-30 днів (наприклад, приблизно 3- 28 днів, приблизно 7-21 днів, приблизно 3, 5, 7, 10, 14, 16, 20, 24, 28 або 30 днів). Суміш періодично збовтують (наприклад, шляхом переривчастого збовтування). У деяких прикладах суміш збовтують протягом періоду часу кожні 1-7 днів, наприклад, кожні 1, 2, 3, 4, 5, 6 або 7 днів.
У деяких необмежувальних прикладах ферментація відбувається доти, доки титрована кислотність (ТТА) не становить приблизно 3-5 95, а рівень рН - приблизно 4-5.
Після ферментації одержану у результаті ферментовану суміш розділяють принаймні на тверду та рідку фракції. У деяких прикладах, зазначену тверду фракцію називають "НУТ С" та, у деяких прикладах, рідку фракцію називають "НМТ В." У деяких прикладах ферментацію переносять з резервуара до обладнання для осадження. Після цього рідину декантують та
Зо центрифугують. У одному необмежувальному прикладі ферментовану суміш центрифугують при 1250 об./хвил. (930х9) протягом 15 хвилин при приблизно 5 "С для одержання рідинної та ліпідної (наприклад, пігментної) фракцій. Рідка (або водна) фракція, одержана у процесі біодеградації, може зберігатися при навколишній температурі. У деяких необмежувальних прикладах цукор додають до рідкої фракції, наприклад, у кількості 1-10 95 (об'єм/об'єм).
Рідка фракція може включати такі компоненти, як білок, амінокислоти, глюкозамін, мікроелементи (такі як кальцій, магній, цинк, мідь, залізо та/або марганець) та/або ферменти (такі, як молочні ферменти, протеази, ліпази та/або хітинази). У деяких необмежувальних прикладах рідка фракція містить (маса/об'єм) приблизно 1-5 95 всього амінокислот, приблизно 3-7 95 білку, приблизно 0,1-2 95 азоту, менше, ніж приблизно 0,2 95 фосфору, приблизно 0,5-1 95 калію, приблизно 4-8 95 вуглецю, приблизно 0,2-1 95 кальцію, менше, ніж приблизно 0,2 95 магнію, менше, ніж приблизно 0,2 95 натрію та/або приблизно 0,1-0,4 95 сірки. У додаткових необмежувальних прикладах рідка фракція включає приблизно 0,01-0,2 95 глюкозаміну (наприклад, приблизно 0,1 95 або менше). Рідка фракція також може містити один або декілька мікробів (наприклад, з інокулуму, який використовують для початку процесу ферментації) та/або слідову кількість хітозану або хітину. Рідка фракція у деяких прикладах вказується авторами як "НМТ В".
Тверда фракція, одержана внаслідок процесу біодеградації, містить хітин (наприклад, приблизно 50-70 956 або приблизно 50-60 95 хітину). Тверда фракція також може містити один або декілька мікроелементів (таких як кальцій, магній, цинк, мідь, залізо та/або марганець), білок або амінокислоти та/або один або декілька мікробів з інокулуму, який використовують для початку процесу ферментації. Тверда фракція у деяких прикладах вказується авторами як "НУТ
Си" НУТ С необов'язково тонко подрібнюють для утворення тонко подрібненого хітину та залишкового хітину. У деяких необмежувальних прикладах тверда фракція містить (маса/об'єм) приблизно 9-35 95 загальних амінокислот, приблизно 30-50 95 неочищеного білку, приблизно 5- 10 95 азоту, приблизно 0,3-1 95 фосфору, менше, ніж приблизно 0,3 95 калію, приблизно 35-55 95 вуглецю, приблизно 0,5-2 95 кальцію, менше, ніж приблизно 0,1 95 магнію, приблизно 0,1-0,4 95 натрію та/або приблизно 0,2-0,5 95 сірки.
У деяких прикладах ліпідну фракцію також відокремлюють від твердої та рідкої фракцій.
Ліпідна фракція є верхньою фазою рідкої фракції. Ліпідна фракція містить такі сполуки, як бо стероли, вітамін А та/або вітамін Е, жирні кислоти (такі, як ОНА та/або ЕНА) та у деяких прикладах каротиноїдні пігменти (наприклад, астаксантин). Ліпідна фракція може використовуватися з різними цілями, включаючи, крім інших, виробництво косметики або харчових продуктів.
У додаткових варіантах втілення хітин ферментують розкритою мікробною композицією. У деяких прикладах хітин (такий як НУТ С або тонко подрібнений та/"або залишковий хітин, утворений, як описано вище) змішують з мікробним консорціумом або композицією, що містить описані авторами мікроби та гідролізат білку (наприклад, НУТ В), та ферментують для утворення ферментованої суміші. Принаймні частина хітину у вихідній суміші розщеплюється у результаті ферментації. У деяких прикладах суміш інкубують при температурі приблизно 20- 40"С (наприклад, приблизно 30-35 С, наприклад, приблизно 30 "С, приблизно 31 "с, приблизно 32 "С, приблизно 33 "С, приблизно 34 "С, приблизно 35 С, приблизно 36 "с, приблизно 37 "С, приблизно 38 "С, приблизно 39 "С або приблизно 40 "С) протягом періоду приблизно від 1 дня до 30 днів (наприклад, приблизно 2-28 днів, приблизно 4-24 днів, приблизно 16-30 днів, приблизно 10-20 днів або приблизно 12-24 днів). У деяких прикладах суміш періодично збовтують (наприклад, шляхом переривчастого збовтування). У інших прикладах суміш збовтують безперервно. У одному необмежувальному прикладі суміш збовтують протягом приблизно 1-12 годин щодня (наприклад, приблизно 2-8 годин або приблизно 4-10 годин). Рівень рН ферментаційної суміші періодично контролюють. У деяких прикладах рівень рН необов'язково підтримують на рівні приблизно 4-5. У деяких прикладах ферментація триває доти, доки загальна титрована кислотність (ТТА) не досягає принаймні приблизно 1-10 95 (наприклад, приблизно 2-8 95, приблизно 4-8 95, або приблизно 5-10 95).
Після ферментації утворену ферментовану суміш розділяють принаймні на тверду та рідку фракції, наприклад, шляхом декантації, фільтрації талабо центрифугування. Рідка фракція, утворена у результаті ферментації НУТ В та хітину з мікробною композицією, у деяких прикладах вказується як "НУТ 0." У деяких необмежувальних прикладах рідка фракція містить (маса/об'єм) приблизно 0,5-2 95 загальних амінокислот, приблизно 3-7 95 білку, приблизно 0,5- 195 азоту, менше, ніж приблизно 0,1 965 фосфору, приблизно 0,4-1 95 калію, приблизно 3-7 95 вуглецю, менше, ніж приблизно 0,5 95 кальцію, менше, ніж приблизно 0,1 95 магнію, менше, ніж приблизно 0,3 95 натрію і/або менше, ніж приблизно 0,3 9о сірки. Крім того, НМТ О містить менше, ніж приблизно 5095 хітину (наприклад, менше, ніж приблизно 4595, менше, ніж приблизно 40 95, менше, ніж приблизно 35 95 або менше, ніж приблизно 30 95 хітину) та менше, ніж 2 95 глюкозаміну (наприклад, менше, ніж приблизно 1,5 95 або менше, ніж приблизно 1 95 глюкозаміну). У інших прикладах НМТ О містить приблизно 25-50 95 хітину та приблизно 0,5-2 95 глюкозаміну.
ІМ. Процеси обробки грунту, рослин та/або насіння
Описані мікробні композиції, окремо або у комбінації з продуктами, розкритими у цьому описі (наприклад, НУТ В, НУТ С та/або НУТ 0), можуть бути використані для обробки грунту, рослин або частин рослин (таких як коріння, стебла, листя, насіння або сіянці). Способи одержання НУТ
В, НУТ С та НУТ О описані у Розділі ІІЇ (вище) та також у Патенті США Мо 8.748.124 та публікації
Міжнародної Патентної Заявки Мо УУО 2012/175738, обидві з яких включені у даний опис шляхом посилання у їх повноті.
У деяких прикладах, обробка розкритими композиціями покращує ріст рослин, поліпшує стресостійкість та/"або підвищує врожайність. У деяких варіантах втілення способи включають контактування грунту, рослин (наприклад, листя, стебла, коріння, сіянці або інші частини рослин) або насіння з мікробною композицією або композицією, розкритою у цьому описі.
Способи також можуть включати вирощування попередньо оброблених рослин, частин рослин або насіння та/або культивування рослин, частин рослин або насіння у обробленому грунті.
Мікроби являють собою композицію, яку необов'язково активують перед застосуванням. У деяких прикладах активація мікробу(ів) відбувається згідно з представленим вище описом у
Розділі ІШ. У інших прикладах мікроб(и) активують шляхом змішування 100 частин води та 1 частини мікробної композиції та інкубації при приблизно 15-40 "С (наприклад, приблизно 20- 40 "С, приблизно 15-30 "С або приблизно 25-35 "С) протягом приблизно 12 годин - 14 днів (наприклад, приблизно 1-14 днів, 3-10 днів, 3-5 днів або 5-7 днів). Суміш для активації також необов'язково може включати 1 частину НУТ В, якщо мікробна композиція має застосовуватись у комбінації з НУТ В.
У інших варіантах втілення способи включають контактування грунту, рослин, частин рослин або насіння з описаною композицією та одним або більше з НМТ В, НМТ С, НМТ О (наприклад, одним, двома або всіма з НМТ В, НУТ С та НУТ 0). НУТ В, НУТ С та/або НУТ О можуть окремо застосовуватися до грунту, рослин (або частин рослин) та/або насіння, наприклад, послідовно, бо одночасно або по суті одночасно з описаними мікробними композиціями.
У деяких прикладах способи включають контактування грунту, рослин (або частин рослин) або насіння з розкритою мікробною композицією та одним або декількома додатковими компонентами, до яких, крім інших, належать хітин, хітозан, глюкозамін, білок, амінокислоти, рідкі добрива, один або декілька пестицидів, один або декілька фунгіцидів, один або декілька гербіцидів, один або декілька інсектицидів, один або декілька рослинних гормонів, один або декілька еліситорів рослин або комбінації з двох або більшої кількості цих компонентів.
Додаткові компоненти можуть включатися до композиції, яка включає мікроби, розкриті у цьому описі, або можуть окремо застосовуватися до грунту, рослин (або частин рослин) та/або насіння, наприклад, послідовно, одночасно або по суті одночасно з описаними мікробними композиціями.
У конкретних варіантах втілення зазначену мікробну композицію комбінують з рідким добривом (наприклад, водним розчином або суспензією, що містить розчинний азот). У деяких прикладах зазначене рідке добриво включає органічне джерело азоту, таке як сечовина, або азотовмісну неорганічну сіль, таку як гідроксид амонію, нітрат амонію, сульфат амонію, пірофосфат амонію, тіосульфат амонію або їх комбінації. Водний розчин аміаку (20-24,6 95 безводного аміаку) також може застосовуватись як розчинний азот. У деяких прикладах мікробний консорціум або композицію комбінують з рідким добривом (наприклад, змішують з рідким добривом) безпосередньо перед застосуванням або незадовго до застосування (наприклад, від 10 хвилин до 24 годин перед застосуванням, наприклад, приблизно за 30 хвилин, 1 годину, 2 години, З години, 4 години, 6 годин, 8 годин, 12 годин, 16 годин, 18 годин або 24 години до застосування). У інших прикладах мікробний консорціум або композицію комбінують з рідким добривом (наприклад, змішують з рідким добривом) принаймні за 24 години до застосування (наприклад, від 24 годин до б місяців, наприклад, принаймні 36 годин, принаймні 48 годин, принаймні 72 години, принаймні 96 годин, принаймні один тиждень, принаймні два тижні, принаймні чотири тижні, принаймні вісім тижнів або принаймні 12 тижнів до застосування).
У деяких прикладах розраховують кількість композиції(й) для застосування (наприклад, на акр або гектар) та композицію розводять у воді (або у деяких прикладах у рідких добривах) до кількості, достатньої для обприскування або зрошення площі, яка підлягає обробці (якщо
Зо композиція є рідкою). Зазначена композиція може застосовуватися під час посіву насіння з витратою 0,5-2 літрів на акр (наприклад, 0,5 л/акр, 1 л/акр, 1,5 л/акр, або 2 л/акр). Зазначена мікробна композиція також може застосовуватися до грунту (наприклад, біля коренів рослин) або рослини один або більше разів у процесі росту, у тих же або різних кількостях. У інших прикладах композиція може змішуватися з розведеними гербіцидами, інсектицидами, пестицидами або хімікатами, які регулюють ріст рослин. Якщо композиція для застосування є твердою (наприклад, сухою композицією), тверда композиція може бути внесена безпосередньо у грунт, нанесена на рослини або частини рослин або може бути суспендована або розчинена у воді (або іншій рідині) перед застосуванням.
Описані мікробні композиції (окремо або у комбінації з іншими описаними авторами компонентами), можуть доставлятися різними способами на різних стадіях розвитку рослин, залежно від умов вирощування та сільськогосподарської практики. У деяких прикладах описану мікробну композицію змішують з рідким добривом та вносять під час висівання насіння з витратою від 0,5 до 1-2 літрів на акр (наприклад, 0,5 л/акр, 1 л/акр, 1.5 л/акр або 2 л/акр) або, у альтернативному варіанті, застосовують окремо. Зазначена мікробна композиція та рідке добриво також можуть застосовуватися до грунту (наприклад, біля коренів рослин) або рослини один або більше разів у процесі росту, у тих же або різних кількостях. У інших прикладах, розкриту мікробну композицію та НМТ В змішують та розводять вносять під час висівання насіння з витратою 0,5-2 літрів на акр (наприклад, 0,5 л/акр, 1 л/акр, 1,5 л/акр або 2 л/акр), або, у альтернативному варіанті, застосовують окремо. Зазначена мікробна композиція та НУТ В також можуть застосовуватися до грунту (наприклад, біля коренів рослин) або рослини один або більше разів у процесі росту, у тих же або різних кількостях.
У інших додаткових прикладах описану мікробну композицію та додаткові компоненти (наприклад, рідке добриво, НМТ В або інші компоненти) розводять та доставляють разом шляхом крапельного зрошення у низькій концентрації під час формування сіянців або розсади, доставляють шляхом зрошення затопленням або розподіляють як розведену суміш з поживними речовинами при дощувальному або крапельному зрошенні у теплицях на сіянцях або укорінених рослинах або, у альтернативному варіанті, застосовують окремо. У додаткових прикладах описану мікробну композицію додають до інших засобів обробки грунту у полі, наприклад, додають до засобів інсектицидної обробки для полегшення застосування. У інших бо прикладах, наприклад, у теплицях, описану мікробну композицію та НУТ В застосовують окремо або разом, у комбінації з рідкими добривами (такими як рибні добрива) та іншими поживними речовинами та нагнітають у дощувальну зрошувальну систему або крапельні зрошувальні лінії під час росту рослин. У прикладі з тепличним вирощуванням описану мікробну композицію та
НУТ В застосовують разом, наприклад, розводять та застосовують під час дощувального зрошення або фертигації з витратою від 0,25 до 1 літра при проростанні сіянців з наступним внесенням від 0,25 до 1 літра у середньому циклі росту під час фертигації та остаточних від 0,25 до 1 літра під час фертигації протягом кінцевих 5-10 днів циклу росту.
У деяких варіантах втілення, розкриту мікробну композицію та НУТ В вносять разом або окремо (наприклад, послідовно) для стимулювання росту, життєздатності, відповідності типу, якості, розвитку коріння або стресостійкості культур.
В усіх культурах НУТ С може бути додане до грунту з витратою приблизно 0,5-2 кг/акр (наприклад, приблизно 0,5 кг/акр, приблизно 1 кг/акр, приблизно 1,5 кг/акр або приблизно 2 кг/Лакр) під час формування рослини або садіння, наприклад, у комбінації з розкритою мікробною композицією. У інших прикладах НМТ С додають до розчину для крапельного зрошення описаної мікробної композиції та НМТ В додають до добрив, які містять описану мікробну композицію та НУТ В, у теплицях, як у наведених вище прикладах.
У додаткових варіантах втілення НУТ О (окремо або у комбінації з мікробними композиціями або іншими описаними авторами компонентами) застосовують з витратою приблизно 1-20 л/га (наприклад, приблизно 1-15 л/га, приблизно 3-10 л/га або приблизно З - 5 л/га). У інших прикладах НУТ О (окремо або у комбінації з мікробними композиціями або іншими описаними авторами компонентами) застосовують як засіб обробки насіння для підвищення врожайності та продуктивності (наприклад, приблизно 1-10 л/кг насіння, наприклад, приблизно 1-3 л/кг, приблизно 3-5 л/кг або приблизно 5-10 л/кг). У альтернативному варіанті НУТ О може застосовуватися у грунті (окремо або у комбінації з мікробними композиціями або іншими описаними авторами компонентами) з витратою приблизно 1-3 л/га для збільшення росту рослин, наприклад, для сприяння збереженню продуктивності рослин в умовах стресу.
У деяких прикладах обробка грунту, насіння, рослин або частин рослин розкритою композицією збільшує ріст рослин (наприклад, загальний розмір рослини, кількість листя, кількість коренів, діаметр коріння, довжину коріння, утворення пагонів, вироблення плодів,
Зо вироблення пилку та/або вироблення насіння) принаймні приблизно на 5 95 (наприклад, принаймні приблизно на 10 95, принаймні приблизно на 30 95, принаймні приблизно на 50 95, принаймні приблизно на 75 95, принаймні приблизно на 100 95, принаймні приблизно удвічі, принаймні приблизно утричі, принаймні приблизно у 5 разів, принаймні приблизно у 10 разів або більше). У інших прикладах описані способи у результаті забезпечують підвищену врожайність приблизно на 10-75 95 (наприклад, приблизно на 20-60 95 або приблизно на 30-50 95) порівняно з необробленими культурами. Іншими мірами продуктивності культури є кількість плодів, вихід, вміст крохмалю або сухих речовин, вміст цукру або сухих речовин за шкалою Брікса, термін зберігання плодів або зібраного продукту, вихід товарного врожаю заданого розміру, якість плодів або продукту, кущіння трави та стійкість дернини до витоптування, запилення та зав'язування плодів, цвітіння, кількість квіток, тривалість цвітіння, якість квіток, укорінення та маса коріння, стійкість врожаю до полягання, абіотична стресостійкість до спеки, посухи, холоду та відновлюваність після стресу, здатність до адаптації до бідних грунтів, рівень фотосинтезу та зеленіння та здоров'я рослини. Для визначення ефективності продуктів контроль включає таку саму паралельно здійснювану агрономічну практику, але без додавання мікробів.
Описані способи та композиції можуть застосовуватись у зв'язку з будь-якою культурою (наприклад, для прямої обробки культури або для обробки грунту до або після висаджування або сівби). Типовими культурами, крім інших, є люцерна, мигдаль, банан, ячмінь, броколі, капуста, канола, морква, цитрусові та садові деревні культури, кукурудза, бавовна, огірки, квітучі та декоративні рослини, часник, злаки, хміль, плодові культури, цибуля-порей, диня, олійна
БО пальма, цибуля, арахіс та бобові, ананас, тополя, сосна та деревинні дерева, картопля, малина, рис, кунжут, сорго, соя, гарбуз, полуниця, цукрова тростина, соняшник, томат, дернові та фуражні трави, кавуни, пшениця та евкаліпт.
МУ. Приклади
Представлені нижче приклади передбачено для пояснення певних конкретних особливостей та/або варіантів втілення. Ці приклади не слід розглядати як такі, що обмежують винахід конкретними описаними особливостями або варіантами втілення.
Приклад 1 Виділення та ідентифікація мікробів
Цей приклад описує виділення, ідентифікацію та характеризацію мікробів.
Виділення мікробів: Зразки НМТ А (Адгіпоз АБ; 50 мл - 5 л) зберігали при кімнатній 60 температурі без доступу світла. Перед відбиранням зразків з вибраної НУТ А партії, відповідний контейнер енергійно перемішували для забезпечення рівномірного розподілення вмісту, тому що зазвичай з часом відбувається осадження. Як правило, 1-10 мл аліквоту відбирали з метою виділення мікробів. У випадку Азотобактеру (Агоїобасівєг), виділення проводили зі зразків грунту (отриманих у М 387 32 49,55", М/ 1217 44" 13,54").
Виділення шляхом розсіюючого посіву: з відібраних аліквот НУТ А, 0,1 мл асептично збирають та змішують з 9,9 мл стерильної води або пептонної води у культуральній пробірці (102 розведення). Потім пробірки вортексували (наприклад, 60 секунд при 2000 об./хвил.) та 10- кратні серійні розведення готували у воді або лептонній воді (до розведення 1: 109). Сто мікролітрів кожного розведення згодом наносили на напівтверде середовище у 100- міліметрових чашках Петрі, використовуючи стерильний І -подібний шпатель. Використовували планшети, що містять агар для підрахунку мікробного числа стандартним методом (5МА; ВО й 247940), поживний агар (МА; ВО Ж 213000) або інше вибране середовище для росту (Таблиця 1). Інокульовані планшети потім інкубували у камерах з контрольованою температурою, при температурі від 22"С до 35"С. Для виділення анаеробних мікробів планшети спочатку поміщали у анаеробні бокси (наприклад, ВО СазРактм Е/7 Сопіаіпег бувієтв, ВО Оіадпозіїсв) перед інкубацією при бажаній(их) температурі(ах).
Таблиця 1
Напівтверде середовище, використовуване для виділення мікробів з НМТ А 71111 РІД 17777171 Напівтвердесередовище?ї///7/://СССССССС:С:СИ1
МА (атупоїїдиеїасіепв, Пехив), ХРО (з!йбв; роспеопепвів), ЗМА
І Іспепіоптів), АМА (тедаїйетійт; Іспепіоптів), АМАС
ХРО (сазві/рагасазвї; бисппеїї), МА5 (міпі), МА (Іашив; рисппеїі), ЗМА асіорасійи5 5рр. Ь ; исппеті "МА: поживний агар (ВО 25213000); МА: агар для підрахунку мікробного числа стандартним методом (ВО 5247940); ХРО: пептон декстроза дріжджів (ВО 5242720); АМА: агарозне середовище для виділення азотобактерій (НІМЕОВІА 2М372); АМАС: агарозне середовище для виділення азотобактерій, доповнене 10 г/л глюкози (НІМЕОІА 2М371); ВСМ: середовище для клостридій покращене (ВО2Ж218081); ВМА: агарозне середовище для клубенькових бактерій роду ВПі2гобішт (НІМЕОІА ЯМ408); РА: агарозне середовище (НІМЕОІА ЯМ520);
МА: агар МРС для лактобацил (І асіобасіїї МА5 (ВОЖ 288210)).
Виділення мікробів зі зразків грунту: До 30-50 грамів грунту додавали 1 95 мас/мас маніту або сахарози, а потім 2 мл стерильної води на кожні 10 г грунту. У стерильній ступці отриману суміш розминали для одержання гомогенної пасти. Цю пасту далі переносили у чашку Петрі та інкубували при 27-30 "С у зволожуючій камері впродовж часу до 1 тижня. Зразок мулистої речовини, який утворився на поверхні груптової пасти далі переносили у свіже та стерильне напівтверде безазотне середовище (див. Приклад З для композиції середовища). Ріст отриманих мікробів робили біологічно чистим шляхом суб-культивування, як описано нижче.
Одержання біологічно чистих мікробних ізолятів: Після інкубації, планшети досліджували на мікробний ріст. Штами мікробів відбирали для подальшого дослідження на основі традиційних макроскопічних та мікроскопічних характеристик колоній, що ростуть на напівтвердому середовищі (Вегдеу "з Мапиаї ої Зувієтаїййсв5 ої Агспаєа апа Васієегіа; Еа., М/Шіат В. УУнйтап).
Зо Розглядали такі критерії, як колір, щільність або морфологія колонії (наприклад, форма, висота та край). Для того, щоб отримати добре відокремлені колонії на твердому середовищі, використовували методику "відсікання". Коротко, виділені мікробні клони наносили на свіже нове тверде середовище та дозволяли рости, поки не з'явилися добре диференційовані колонії.
За необхідності виконували декілька субкультивувань до тих пір, поки не було отримано біологічно чистий мікробний клон, який у цьому описі називають "ізолят". Додаткові тести були виконані на ізоляті для вивчення морфології клітин бактерій. Диференціальне забарвлення за методом Граму також використовувалося для початку класифікації ізоляту у відповідний найбільш ймовірний рід.
Екстракція геномної ДНК мікробів: Бактеріальні клітини різних видів вирощували та збирали з оптимізованих рідких бульйонів та умов культивування. Комплект виділення ДНК РоуегзоїїЇ (МовВіо, Саї 2 12888) використовували для приготування геномної ДНК у невеликому масштабі.
Для великомасштабних екстракцій геномної ДНК клітинний лізат готували з використанням набору бактерійної геномної ДНК СепЕїЇше (бідта, кат.Мо МА2110) або набору буферів для виділення геномної ДНК Оіадеп та Оіадеп Сепотіс-їїр 500/2 (Оіадеп, кат.Мо 19060 та 10262) згідно з методами, рекомендованими виробником. Геномну ДНК потім осаджували рівним об'ємом ізопропанолу, промивали 70 95 етанолом, сушили на повітрі та ресуспендували у ТЕ буфері.
Ампліфікація та секвенування 165 для підтвердження таксономії: Гени повної довжини 165 ампліфікували з різних бактеріальних видів, використовуючи геномну ДНК та/або колонії безпосередньо як ПЛР-матрицю. Прямий праймер (27Е, 5-АСВОТтТаАтТоМмтТаасСтоАа-3";
ЗЕО ІО МО: 1) та зворотний праймер (14928, 5-СсСсТТАССТТатТАССОСАСТТ-3; 5ЕО ІЮО МО: 2) були сконструйовані відповідно до рекомендацій 5біпдег та інш. (2016) з незначними змінами.
ПЛР-продукти секвенували безпосередньо з використанням прямих та зворотних праймерів
ПЛР. Високоякісні сліди послідовностей шукали за допомогою ВІ А5Т у базі даних Колекції нуклеотидів МСВІ (пг/п)) для підтвердження таксономії. Отримані послідовності повної довжини 165 рДНК представлені у цьому описі як ФЕО ІО МО: 3-24.
Секвенування повного геному (М/С5): Секвенування повного геному біологічно чистих ізолятів проводили, використовуючи систему РасВіо В5ЇЇ (Расіїїс Віозсієпсез Мепіо Рак, СА
ИБА), відповідно до рекомендованого виробником способу для одержання бібліотеки послідовностей та секвенування. З мікробних ізолятів генерували середнє 73000 прочитань 24 кілобаз у довжину у середньому. Ое помо зборку геному проводили за багаторівневим способом зборки геному (НОАР, Расіїйс Віозсіеєпсев5, Мепіо Рак, СА ОА).
Вирівнювання повного геному: За останні декілька років швидко зросла кількість названих видів бактерій з повністю секвенованими геномами, однак ще залишається небагато у
Зо порівнянні з кількістю 165 рДНК послідовностей. Однак, коли референсний геном є доступним, здійснення вирівнювання повного геному є одним з найбільш певних шляхів для підтвердження виду, або навіть рівня співпадіння штамів. Виходячи з цього, високоякісні мікробні геноми завантажували з Неябед та вирівнювали до послідовностей повного геному ізолятів, використовуючи систему програмного забезпечення МОМтег (ОвєіІснег та інш., Мисі. Асіав Вев. 30:2478-2483, 2002; Ки; та інш., Сбепоте Віої. 5:812, 2004), яка визначає Максимальні
Унікальні Співпадіння ("МОМ") між дуже довгими послідовностями.
Ідентифікація та класифікація 165 рРНК генів та консервативних філогенетичних маркерних генів (рМО): Гени рибосомальної РНК (рРНК) ідентифікували шляхом де помо зборки геному, використовуючи програму Ваітпар (беетапп, 2014), яка являє собою інтерфейс для МНММег інструмента (М/пееіег апа Едау, 2013), включений у НММег 3.1. Потім 165 рДНК послідовності класифікували, використовуючи Наївний баєсовський класифікатор проекту бази даних стосовно рибосом (ВОР), а також попарне вирівнювання з ВІ АЄТп (Сатасно та інш., ВМС
Віоіптоптаїййсв 10:421, 2009; Соїе та інш., Мисівїс Асіах Везєагсй 42(01):633-642, 2014).
Оскільки кількість організмів з секвенованими геномами зросла, все частіше використовують ці дані для більшої конкретної таксономічної класифікації. База даних зрей містить послідовності для 40 консервативних філогенетичних маркерних генів (рмМа), які були обрані з бази даних СОС (Консервативні ортологічні групи) (Таївиом та інш., 5сіеєпсе 278: 631-637, 1997).
Більшість з них пов'язані з обробкою генетичної інформації. Існують послідовності для декількох тисяч видів бактерій у базі даних 5ред (Мепаве та інш., Майте Меїнодз 10: 881-884, 2013). Таким чином, гени, що кодують білки, ідентифікували у геномній послідовності, де кожен мікробний ізолят зібраний з використанням Ргоаіда! (м.2.6.2) (Нуай та інш., ВМС Віоіпіоптаїййсв5 11: 119, 2010), який використовує евристичні пороги, розроблені за погодженням з фахівцями з курирування геному у 5 ЮОерапйтепі ої Епегду доїпі Сепоте Іпвзійше (92). Трансльовані кодуючі послідовності, ідентифіковані Ргодідаї, були анотовані програмою ЕвЇїсимМаО, включеною у зрей (м 1.0), яка використовує набір емпірично визначених відрізків для ідентифікації послідовностей, що належать кожному РМа босі у межах даного протеому. Кодуючі гени, чиї трансльовані послідовності ідентифікували за допомогою ЕеїспМО як такі, що належать до однієї з 40 зред рма, потім вирівнювали до нетрансльованих референсних рмМа з бази даних зреа з використанням ВІ А5Тп.
Таксономічна класифікація мікробних ізолятів: Традиційно визначення мікроорганізмів на видовому рівні часто визначається на основі єдиного універсального маркерного гену, гену 165
РРНК (див., наприклад, ЄіасКебгапайї та інш., Іпї. У. Буві. Васівтіо!. 44: 846-849, 1994; дапаа та інш., ). Сіїп. Містобіо!. 45: 2761-2764, 2007). Проте, мікробіологічне співтовариство зауважило, що ідентичність мікробів, для яких стала доступною інформація про весь геном, не завжди співвідноситься з ідентичністю, що визначається підходами, які зазвичай використовувалися до появи послідовності високої продуктивності наступного покоління. Більше того, інформація про весь геном недоступна для кожного мікроба, та велика кількість баз даних, які фіксують мікробний генетичний контингент, не валідується / курується. Тому віднесення виду / штаму до нових мікробних ізолятів є складною задачею.
Беручи до уваги обмеження таксономічної ідентифікації, описані вище, підхід, прийнятий для віднесення виду кожного ізоляту мікробів, описаного тут, був багатовимірним підходом.
Генетичну інформацію, таку як секвенування всього геному, аналіз 40 консервативних філогенетичних маркерних генів та аналіз генів 165 рРНК, генерували для кожного ізоляту. Дві сторонні лабораторії що пропонують послуги таксономічної ідентифікації, були незалежно залучені, щоб забезпечити ідентифікацію роду та виду на основі їх власних баз даних та алгоритмів. Крім того, пошуки гомології послідовності 165 рРНК гену повної довжини для кожного мікроба проводили у трьох незалежних базах даних: база даних Стеепдепез (Оезапіїв5 та інш., Аррі. Епмігоп. Місгобіої. 72:5069-5072, 2006), база даних Е/Тахоп (Кіт та інш., Ійї. у.
Бузі. Емої. Містобіої. 62:716-721, 2012), та Національний центр для інформаційної бази даних біотехнологій (0.5. Маїйопаї! І ібгагу ої Медісіпе, Веїйезаа, МО).
Вид відносили до кожного ізоляту, якщо щонайменше три або більше пошуків баз даних (включаючи бази даних третіх сторін та загальнодоступні бази даних, як зазначено вище) та засоби ідентифікації дали ідентичне віднесення виду. Для щонайменше трьох ізолятів пошуки баз даних не дали ідентичних видових віднесень у щонайменше трьох базах даних. У цих випадках стосовно віднесення було прийняте правильне рішення (Васіїсн5 5р., Рзендотопав з5р. та Раєепірасійи5 їІашив).
На основі викладеного вище, мікробні ідентифікації забезпечили наступне: - Іасіорасійш5 аеєїргиескКії. Результати всіх аналізів чітко підтримали ідентифікацію цього
Зо ізоляту як І асіобасіПи5 аеїБгиескії зирз5р. Биїдагіси МОО2. - Мігдірбасійив Наіорнпішв5. 165 ВІ АЗТп результати вказують на те, що цей ізолят міг би бути штамом Мігдібасійи5 Наіорніш5, хоча це не могло бути підтверджено будь-якими іншими методами через недостатність підходящих референсних послідовностей. 165 ВІ А5Тп результати узгоджувалися з віднесенням на генному рівні від Наївного баєсовського класифікатору (МВС), але їх самих було недостатньо для підтвердження класифікації на рівні виду. - А?7оїюобрасієг міпеїіапаійї. Цей ізолят, виявляється, є новим штамом Аг2оїобасієг міпеїапаійї. Це підтверджується аналізом 165 рРНК та іншими філогенними маркерними генами, а також вирівнювання повного геному до обох з двох найближчих штамів-кандидатів. Велика кількість як невеликих, так і великих відмінностей, що спостерігаються у вирівнюваннях повного геному, а також численні невеликі відмінності між 165 та кодуючими послідовностями, говорять про те, що це може являти собою новий штам та потенційно навіть новий вид, хоча цей ізолят був однозначно більш тісно пов'язаний з Агоїобрасієг міпеїЇапайїйї, ніж з будь-яким іншим видом, що міститься у будь-якій з баз даних. - Сіовтіаішт разієшіапит. 165 аналізи та вирівнювання повного геному підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як нового штаму Сіозігідійт разівешгіапит. 5ред база даних не містить будь-яких референсних послідовностей для С. разієшіапит, хоча 5рей результати забезпечують додаткове підтвердження на генному рівні. - Раєпірасіїїшв спірепзіз. Найбільшим доказом для позитивної ідентифікації цього ізоляту була класифікація на генному рівні від ВОР МВС, яка віднесла цей ізолят до Раєпібасійив з вірогідністю 1.0. Як 165, так і вресі ВГ АЄТп, результати підтвердили це віднесення. Близько співпадаючий референсний геном не міг бути знайдений у Веїбед, хоча стійка синтенія спостерігалась між зборкою геному та референсною послідовністю для Раєпібасіїйшвє в5р.
У412МС10. Вирівнювання послідовності 165 рРНК гену повної довжини у доступних базах даних наразі підтверджує, що цей ізолят належить до Раєпірасійнв5 спірепвів. - зперіотусез дгізеи5. Цей ізолят однозначно являв собою штам 5ігеріотусез агізеив5, який надзвичайно тісно пов'язаний з МВАС 13350. Це підтверджується аналізом 165 рРНК та іншими філогенними маркерними генами, а також вирівнювання повного геному до обох з двох найближчих штамів-кандидатів. Вирівнювання повного геному показало багато відмінностей,
розсіяних по геному, однак, підтвердило, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Ргендотопав 5р. Зрозуміло, що цей ізолят належить до роду Рзеидотопавз та що він дуже тісно пов'язаний з Рзепдотопав епіоторпіїа, але немає точного співпадіння зі штамом 148, єдиним Рзейпдотопах епіоторніа штамом з доступним референсним геномом. Цей ізолят також тісно пов'язаний з Р. риїіда та Р.Пиогезсепв. - Ргвендотопах риїйда. Результати деяких аналізів підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як Рзєецдотопаз риїйда. У той час як цей ізолят здається надзвичайно тісно пов'язаним зі штамом Р. ршіда МВАС 14164, найкращим доступним референсним геномом, аналізи повного геному виявили численні невеликі відмінності по всьому геному, підтверджуючи те, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Осеапорасій5 опсогптупсні. 165 аналізи та вирівнювання повного геному підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як нового штаму Осєапобрасійй5 опсопупспі. зред база даних не містить будь-яких референсних послідовностей для О. опсогпупснпі, хоча зрей результати забезпечують додаткове підтвердження на генному рівні. - Раепірасійн5 Іашив. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як штаму Раєпірасійш5, який тісно пов'язаний, хоча не ідентичний, з добре охарактеризованим видом У412МС10. Приймали до уваги високу щільність невеликих відмінностей при вирівнюванні всього повного геному з видом У412МС10, численні невеликі відмінності, що спостерігалися у попарних вирівнюваннях маркерних генів виду М412МС10, та спостереження подібно гарних вирівнювань з послідовностями з виду НОЕ5, та той факт, що Раєпірасійнв5 в5р.
УА12МС10 ще має бути формально названим. Вирівнювання послідовності 165 рРНК гену повної довжини у доступних базах даних наразі підтверджує, що цей ізолят належить до виду
Раєпібасіїи5 Іашив. - Васійи5 ІПопепітоптів. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як Васійив5 Іспепітоптіє О5М 13 - АТСС 14580, можливо аж до рівня штаму. Однак, цей ізолят міг би бути унікальним штамом, враховуючи скоріше велику перестановку та інші невеликі відмінності, що виявляються при вирівнюванні повного геному, а також точкові мутації, що спостерігаються у 165 та результатах зред, але нечасто можна спостерігати такий високий ступінь ідентичності послідовностей між двома геномами, навіть від того ж виду. - Іасіорасіїйше міпі. Визначник Берджи систематичної бактеріології не містив будь-якої додаткової інформації про І асіобасіїїй5 торбі, або потенційно навпаки специфічний та так само погано охарактеризований І асіобасіїїи5 міпі (Равззоїй та інш., Місторіоїоду 73:4354-4356, 2007). Вирівнювання повного геному до тільки доступних референсних послідовностей для Ї.
Міпі показало велику кількість гомологічних областей, але надмірна фрагментація референсних послідовностей ускладнила оцінку відповідності між будь-яким з них та цим ізолятом.
Вирівнювання послідовності 165 рРНК гену повної довжини у доступних базах даних наразі підтверджує, що цей ізолят належить до виду І асіобасіїїи5 міпі. - Раепірасійн5 соокКії. Найбільшим доказом для позитивної ідентифікації цього ізоляту була класифікація на генному рівні від БОР МВС, яка віднесла цей ізолят до Раепірасійй5 з вірогідністю 1.0. Як 165, так і рес! ВІ АЗТп, результати підтвердили це віднесення. Близько співпадаючий референсний геном не міг бути знайдений у Веїбед, хоча стійка синтенія спостерігалась між зборкою ізоляту та референсною послідовністю для Раєпірасійи5 5р.
У412МС10. Вирівнювання послідовності 165 рРНК гену повної довжини у доступних базах даних наразі підтверджує, що цей ізолят належить до виду Раєпібасіїив5 соокії. - Гасюрасій5 рисппегі. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як І асіорбасійй5 Бисппегі, хоча зрей результати не підтвердили 165 аналізи та вирівнювання всього геному, очевидно через недостатність необхідних референсних послідовностей у базах даних. У той час як цей зразок здається надзвичайно тісно пов'язаним зі штамом ГГ. рисйпегі С0О34, найкращим доступним референсним геномом, аналізи повного геному виявили десятки відмінностей, включаючи дві великі делеції, підтверджуючи те, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Васійн5 тедаїепит. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як Васіїйн5 тедаїйегтіит. У той час як цей ізолят здається надзвичайно тісно пов'язаний зі штамом
В. тедаїегшт О5М319, найкращим доступним референсним геномом, аналізи повного геному виявили багато невеликих відмінностей по всьому геному, підтверджуючи те, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Асеїобасієг разівшпапив5. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як Асеїобрасієг рабзієшіапибв. Цей ізолят здається надзвичайно тісно пов'язаний з А. бо разіешіапив ІРО 3283 штамами, найкращими доступними референсними геномами, але аналізи повного геному виявили багато невеликих відмінностей по всьому геному для навіть найближчого співпадіння, підтверджуючи те, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Сіовігідіит бБеї|егіпсеКії. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як Сіовігідійт бБеї|егіпсеКії. У той час як він здається надзвичайно тісно пов'язаний зі штамом С бБеї|егіпсКі МСІМВ 8052, найкращим доступним референсним геномом, аналізи повного геному виявили багато невеликих відмінностей по всьому геному, підтверджуючи те, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Іасіорасійш5 сазеїрагасазеї. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як І асіобасіїїшв5 сазеї або І асіобасійн5 рагасазвї. Найкращі співпадіння від всіх аналізів були завжди від членів цих двох видів, що перекриваються, при цьому усі аналізи виявили багато невеликих відмінностей, що охоплюють всю довжину геному, підтверджуючи те, що цей ізолят мав би бути класифікованим як окремий штам. - Васіїїшє Пехи5. Найбільшим доказом для позитивної ідентифікації цього ізоляту була класифікація на генному рівні від ВОР МВС, яка віднесла цей ізолят до Васіїїш5 з вірогідністю 1.0. Як 165, так і зрейа ВГ АЄТп, результати, а також МОМтег вирівнювання всього геному, підтвердили це віднесення на генному рівні. Вирівнювання послідовності 165 рРНК гену повної довжини у доступних базах даних наразі підтверджує, що цей ізолят належить до виду Васі
ТПехив. - Васійш5 в5р. 165 аналізи повністю підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як штаму
Васіш5, але жоден з аналізів не був у змозі позитивно віднести його до названого виду. 165
ВІ А5Тп результати підтвердили, що він може бути штамом Васійив5 Коспії, але недостатність послідовностей повного геному у доступних базах даних перешкодила підтвердженню цього. - Васійив5 зибійй5. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію цього ізоляту як
Вас зибійв. Таксономії та номенклатури для цього роду та виду є безсумнівно складними, хоча результати всіх аналізів переважно підтверджують штами, які формально класифіковані як
В. зибійв5. Незважаючи на велику кількість даних про послідовності та багато точних співпадінь з окремими генами, точне співпадіння всього геному не могло бути ідентифіковане, чітко показуючи, що цей ізолят є новим штамом В. 5!ибінів.
Зо - Васййнв5 атуїоїїдпиеїасіеєпе. Результати всіх аналізів чітко підтвердили ідентифікацію як
Васіїйн5 атуїоїїдиетасієпе підвид плантарум, хоча таксономія для цього виду є наразі дуже складною. Васіїйш5 атуйоїїдиєтасіепе підвид плантарум нещодавно був перейменований у
Васіи5 меІелепвзів (Ошпіар та інш., Іпі. У. Зубзієт. Емої. Місторіо!. 65:2104-2109, 2015; Випіар та інш., Ійї. У. Зузієт. Емої. МістобіоІ.66:1212-1217, 2015). Ці зміни привели до часткової перекласифікації та реорганізації у Беї5ед, хоча ідентифікатори послідовностей у зрей та ВОР базах даних все ще називають його Васійи5 атупоїїдиегасієпо підвид плантарум.
Приклад 2 Самостійний ріст та співкультура мікробів
Приготування середовища для росту: Випробовувані середовища для росту готували з використанням наявних у лабораторії солей та реагентів. Рідкі середовища стерилізували автоклавуванням при 121 "С, 15 псі впродовж щонайменше 30 хвилин або фільтруванням через 0,45 мкм мембранні фільтри.
Дослідження динаміки самостійного росту штаму у моно-культурах: Аналізували швидкість росту кожного біологічно чистого мікробного ізоляту. Для кожного ізоляту готували до З мл рідких культур, починаючи з вихідних чашок. Кожен ізолят вирощували протягом 1-3 днів при 30 "С з отриманням культур з достатньою щільністю у стані логарифмічного росту. Кожен ізолят потім субкультивували у 24-лункових мікротитраційних планшетах, що містили 1 мл середовища для росту (дивись нижче) при оптичній густині (ОЮОвос) 0,05. Використовуючи зчитувач планшетів для візуалізації Суїайоп 5 (ВіоТек, М/іпоо5Кі, МТ БА), профіль росту кожного ізоляту реєстрували у реальному часі (кожні 30 секунд) протягом 1 тижня у аеробних умовах при 30 "С. Стерильне середовище використовували як негативний контроль.
Співкультура мікробів у експериментах ферментації
Біореактори з безперервним переміщуванням: Ферментації зробили у 2-літрових біореакторах ЮАБСІР (Еррепдоп Мопй Атегіса Нацррацде, МУ) з 1,5-літровим робочим об'ємом. Колби стерилізували шляхом автоклавування при 121 "С, 15 псі впродовж однієї години. Середовище для росту стерилізували одночасно з колбами, за винятком РВ5, який стерилізували окремо та асептично додавали у біореактор перед інокуляцією. Поліпропілен- гліколь 2000 використовували як речовину, що регулює піноутворення. Його асептично додавали у біореактор перед інокуляцією при концентрації 0,07 об./06б. 95. Колби інокулювали безпосередньо з розморожених пробірок з робочого банку клітин з об'ємом інокуляту 0,1-0,4 бо об./06б. 96. Температуру ферментації тримали при 30 "С. В залежності від ферментації,
концентрацію розчиненого кисню іноді контролювали, а іноді ні. Коли контролювали, задана величина розчиненого кисню знаходилася у інтервалі 1-25 90 насичення повітря. Контроль розчиненого кисню здійснювали, використовуючи серію перемішувань, потім потік повітря для підтримання заданої величини. Коли контроль розчиненого кисню не здійснювали, перемішування фіксували при 200-800 об./хвил. та швидкість потоку повітря встановлювали від 0,1 до 0,5 об./об./хвил. Аналогічно, рН ферментаційного бульйону іноді контролювали, а іноді ні.
Коли контролювали, задана величина рН знаходилася у інтервалі від 6,3 до 6,9. рН титранти являли собою 20 мас/мас. 95 КОН та 13,8 мас/мас. 95 НзРОх. рН ферментаційного бульйону перевіряли щоденно за допомогою автономного рН-метру щоб зробити поправку на будь-яку зміну у детекторі рН біореактору.
Біореактор з обертовою колбою: Мікробний інокулум змішували з суспензією, яка містила 5,5 95 (маса/маса) білку молочної сироватки та 1,2 95 (маса/маса) йогурту у воді (С маї), та суспензією, яка містила 0,1 95 (маса/маса) спіруліни та 0,195 (маса/маса) екстракту бурої водорості у воді ("А маї"). Суспензії А маї та С маї окремо приготовляли за З дні до змішування з посівною культурою та інкубувати при навколишній температурі. Посівну культуру, С маї та А маї змішували у пропорції приблизно 81:9:9. Після змішування суспензію додаткових компонентів, яка містила приблизно 7095 (об'єм/об'єм) меляси, 0,595 (об'єм/об'єм) НМТ В, 0,003 95 (маса/об'єм) аравійської камеді та 0,02 95 (маса/об'єм) пивних дріжджів (5. сегемівіає), змішували з сумішшю посівної культури, С маї та А маї та додатковою водою у співвідношенні приблизно 16:34:50. Суміш піддавали ферментації протягом приблизно 7 днів при навколишній температурі (приблизно 19-35 7"С). Через 7 днів резервуари піддавали аерації протягом 30 хвилин через день. Ще додавали води (ще приблизно 10 95 (об'єм/об'єм)) та ферментацію продовжували за таких самих умов протягом ще приблизно 10 днів. Ще додавали води (приблизно ще 4 95 (об'єм/об'єм)) та ферментацію продовжували протягом ще приблизно 7 днів, та у цей час зразки збирали для аналізу.
Аналіз мікробної популяції - цифрова крапельна ПЛР: Система цифрової крапельної ПЛР (дДаРСВ) забезпечила визначення та абсолютну кількісну оцінку присутності цільового організму (Огео та інш., Апаї. ВіоапаІ. Спет. 406:6513-6528, 2014; Міп, та інш., доштаї ої Містобіоіодісаї!
Меїнподз 65:21-31, 2006). Специфічні праймери для 22 видів бактерій, визначені у Прикладі 1,
Зо розроблені, використовуючи унікальні послідовності від 165 генів та/або унікальні кодуючі гени послідовності, визначені з МуУСсюе зборок геномів (Таблиці 2 та 3) ааРСА проводили, використовуючи або Емастеєп Зирегптіх або Бирептіх для зондів (ВіОВАЮ, Негсшев СА БА), слідуючи рекомендаціям виробника системи цифрової крапельної ПЛР ОХ200 (ВіовАб,
Негсшевз СА О5А), та дані ДаРСВ потім аналізували у програмному забезпеченні Оцапіабоїй (ВіоВАб, Негсцез СА ОА).
Таблиця 2
Прямий та зворотний праймери для способу ФД0РСА Емастеєєп Зиреттіх рабівшіапив ІО МО: 25 ІО МО: 2 6
ЗЕО ІО МО: 27 ІО МО: 28 атую!їдиеїасієп5 ЗЕО ІЮ МО: 29 ІО МО: 30
Прямий праймер Зворотний праймер
Васіййв Пехив ТСТСТТаСАТААСАСААААТТОААА | СТАСОСАТТТСАССасТтАСА (5ЕО 10
ЗЕО ІЮ МО: 31 МО: 32
Васіїив5 вОдастТастоссттТАСатс (5ЕО | СТСАДаТТоСССАСТТТССА (5ЕО 10
Іспепітоттів ІО МО: 33 МО: 34
Васіїме тедаїегіит ссавАТАОСАТСТТОТОСТТО (ЗЕО СТАСОСАТТТСАСОВСТАСА (5ЕО І васійив 5 Т ТТАТАСАТАТААТ ТАСАТ Т СТАСОСАТТТСАССОСТАСА (5ЕО ІЮ р. СААДАДО АТОС (5ЕО ІО МО: 37 МО: 38
Васіййв виріз САТСТТТСТТООааСАТаСО (5ЕО | ССОДАСССААСАаТтссСААТА (5ЕО
ІЮ МО: 39 ІЮ МО: 40
Сіовігідіит САТаААаИстостТТсасаАстТ (5ЕО | ААТаСАССАСССАСаттТААИ (5ЕО
Беїегіпскії ІО МО: 41 ІО МО: 42
САДСТСИАОСОАСАААССТТ (5ЕО | ОАААТаСАСТССССАСОСТТА (5ЕО разівшіапит ІО МО: 43 ІО МО: 44
Ї асторасійив5 СОТастТОсСАСТТОАААСАТТ (5ЕО | СТСОСТТТАСОаСССААТААА (5ЕО 10 риснпеті ІО МО: 45 МО: 46
Ї асторасійив5 СОаАдасСадастаААТТСААЛИ (5ЕО | СТСОСТТТАСасСсССААТААА (5ЕО 10 де!ргиескії ІО МО: 47 МО: 48
Ї асторасійив5 СТСаттаАТОАТСОСТОасСТ (5ЕО І | ТАААТССОаСАТААСОСТТас (5ЕО 10 рагасазві (сазві МО: 49 МО: 50 т асюрасійв уіпі лосоостовттттОАТОТТА (ЗЕО САТ ТСАССОСТАСАСАТОС (5ЕОІЮ
Осеапобрасійив5 СОАДАСТСТТСООАСОСААСТ (5ЕО | САЯТТТОСААТОСАСОИТТТта (5ЕО І опсоппупені ІО МО: 53 МО: 54 щи ТаслОасСАТТОТОАААТААТОАА СТАСОСАТТТСАССОСТАСА (5ЕО ІЮ
Раєпірасіїив5 Іашив ЄЕО І МО: 55 МО: 56
Раєпірасійив5 ССОСАТААТТТАТТТТСТСТОСТа | СТАСаСАТТТСАССОСТАСА (5ЕО 10 спірепвів ЗЕО ІЮО МО: 57 МО: 58
Равпівасійцв соокії АТ ТАТобСТТООСАТОСАЄ (5ЕО СТАСОСАТТТСАСОВСТАСА (5ЕО І собслосттостосттвА (БЕО І стотлостовосАоттттов (5ЕО І
ААДИїтсОАасСОСАТОАСААСА (5ЕО | СЯСТТТАСОаССсСАСТААТТС (5ЕО 10 риїда ІО МО: 63 МО: 64
СТСОААСОАТОААСССТТТС (5ЕО | АФОААТТОСОАТСТОСССТА (5ЕО Ір дгівеи5 І МО: 65 МО: 66
Універсальні СТОССАССАОССОСОСТАА (БО | ТОСАСТАССАСССОТАТСТААТОСТО прокаріотні І МО: 67 ' Т (ЗО І МО: праймери : 67) (ЗЕО : 68) мігоібасіїи5 ССТСАТСТОАДСаатТОАТТСОСТО (5ЕО | ТССТОСАСТТТОСААТОАСС (5ЕО ІЮ
Наіорпіи5 І МО: 69 МО: 70
Таблиця З
Олігонуклеотиди для способу Ф0РСВ Зиреттіх для зондів
Прямий праймер Зворотний праймер
ТСОАССОАДАСАСААСТ | ТСТИаТОАТОААТОТОАТІ ОСТОААСТТТСАСАСа тедаїейит СА А (ЗЕО ІЮ МО: 71 аСОаСсА (5ЕО ІЮ МО: 72)! АТОС (5ЕО ІЮ МО: 73
Ї астюобасіи5 АСОСАСОСОАТТТАТСА | ТТТаСТТ ТССОсСТОасСТтІ АОСССАТАТСААССАС рагасазві (сазві ТО А (5ЕО ІЮО МО: 74 С АТ (5ЕО ІЮ МО: 75 САТСО (З5ЕО ІО МО: 76
Сіовігідіит ССТОААССАСССАСАС СО тост (ЗЕО о МО. ТСАСАТСАССОСТТТСТТ реі|егіпскії ТТ Т(5ЗЕОІЮ МО:77) 28 "Та ст (5ЕО ІЮ МО: 79)
Асеїобасівг ААСССТТААСААТСАСС ГОССССА (ЗЕМ: СОСААСАСААССАСТТ разівшіапив СС А (5ЕО І МО: 80) 81 "СА да (5ЕО ІЮ МО: 82)
Ї астюбасійи5 СААССААСТОаСАТСААО | АССТОСТИаАЛаИасласа | ААТСАТАССОАТСАСТ рисНпеті сте А (ЗЕ Ю МО: 83 АТ ТТ (ЗЕО ІО МО: 84 ас ба (5ЕОЮ МО: 85
Васіййв виріз ТастадАсООААААСсАТ | ААААТСООСТОСООААО | ТАОСААСТАСАСТТАСС
СС т (ЗЕО ІЮ МО: 86 СТ СС (5ЕО ІЮ МО: 87). | ОС АА (5ЕО І МО: 88
ТасасттТАТаААТОСАС | ААДАДЙОССССОАТСАСА | СТОТААТОСООСТОоСОИТ атупоїїдиеїтасієпої | СА С (ЗЕО ІЮ МО: 89 та са (5ЕОІЮ МО: 90) | АС АС (5ЕО ІЮ МО: 91
Равпірасіїце соокі! АГ АтостасастостАсС СОсОсСАСАСТТОААСОСТ | ТСТТОТАСАТОСААОС
АА С (ЗЕО ІЮ МО: 92 Са да (5ЕО І МО: 93) | СО Та (БО ІЮ МО: 94 асюрасійв упі | СЗАСТААССТОАТСОСА | ТадДАОСТСАСАТТТСАСІ АТТАСЕСССАТТОСТТС
СТ Т (ЗЕО ІЮ МО: 95 а аст(5ЕО О Мо: 96). | Т са (БО ІЮ МО: 97
Раепівасіїив ТОАСАТТССАТТСАТСС СТАТСА ЗЕО МО АТСССАСССАААТТТСС спірепвів сес(5ЕОІ0МО:98) |до "ТА СА (5ЕО І МО: 100)
ССАДДАСАДАСАСОСТС | АААТСАВССТСТОССТТ СТОАССОООСАТАСТТО
Іспепітптів СА А (ЗЕО ІЮ МО: 101 а СС (5ЕОІЮ МО: 102) ст ТО (5ЕОІЮ МО: 103
Раеєпівасіце Іашув СГ О9АТАТСССОСАТТТ |СТОТАТОССОСТТТОА | ОСОАССААТСАТОТАС
Са Т(5ЕОІО МО:104) | Са аА (ЗЕ І МО: 105)| СС ТТ (ЗЕО І МО: 106
Осеаповасіїшє //|АОСТТОССАТОТАСТОС пу ЗЕМ АТТТССТОСААССАСА опсоптупепі ТТ а (5ЕОЮ МО: 107) 1То8 І СС ТТ (5ЕОІЮО МО: 109)
Васійнв 5 ТОССОАДАОСТОСТОАААТ | АССТЯАССОТОСТОСА | ТТОАААСТАААТСО СО р. СТ Т (ЗБОЮ МО: 110 СА АА (ЗЕО І МО: НІ). | СО ТС (ЗЕО 0 МО: 112
Рееидотопав ААТСАТСАСАСАТОаСИС | АТТаТОаССАТССООСТ | ОТОССОАСАТОААСАА оиїіда да а (ЗБОЮ МО: 113) | АТ СО (5ЕО І МО: 114)| СТ СА (5ЕО І МО: 115
Ревудотопає єр. | ОСТОАССТАТОТОААСТ | АСАТССАТОСССТОТТ | ТаАТАААСАТОСАСОС
Р. ССС (ЗБОЮ МО:116) СС ТО (5ЕО 0 МО: 117)! СО АС (ЗЕО ІЮ МО: 118
Зпнеріотусез СТОаЙСАСТАСАТОАДАСС | ТОСАСасССОАСАТССТ | ТАЯ4ОТСТТСТааАОСО дгівеи5 да с (ЗЕОІО МО: 119) | СТ АС (5ЕО І МО: 120) | АС ТТ (5ЕО І МО: 121
Васіййв Пехив тацсвастТататАТОТО | АТаОССАСАААаИстАсСа | ОААССАТОдаССсСатА
ТТ т (ЗЕО ІЮ МО: 122 СС ТТ (5ЕО І МО: 123) | АТ СА (5ЕО ІО МО: 124
Прямий праймер Зворотний праймер
Сіовіідіит | ССАТ СТ АС АСААААТ т СС о СААСТСТ ЗВО МО САССТА ТОСТ ЗЕ оо разівигіапиті А С (ЗЕО ІЮО МО: 125) 126 й МО: 127
ССАТАТТаССТТТОСТОТа | ССССАТОССОСТААССАТІ ТССАТОСТОСОСТТОТ міпеїапсії а (ЗЕО О МО: 128 Та (5ЕО ІЮ МО: 129 ТТ То (ЗЕО ІЮ МО: 130 мігаібасіїй5. | ССТАТАТЯаСОаСТССАДАСС | АААДОССОАТОТАСТАСТ | ТТССОААААСАСАСАС паіорийив | А (ЗЕО І МО: 131 СОСТ (5ЕО ІО МО: 132 СС ТТ (ЗЕО І МО: 133
Ї астюобасійи5 | АССАСТОААСААСТОСАДО | АСОСОААСАСААСАТСТО | ТСАССОТТСАААСТОС деїбгцескії | С (ЗЕ 0 МО: 134 СС (ЗЕО ІО МО: 135 да То (5ЕО ІО МО: 136
Розробка середовища для моно-культур: Кожен з мікробів виділяли на різних середовищах.
Автори проаналізували, чи достатньо однієї композиції середовища для росту всіх 22 ізолятів.
Ріст всіх 22 ізолятів спочатку досліджували тільки на мелясі. Автори визначили, що 5 з 22 штамів показали помітний ріст. Композицію середовища потім оптимізували на включення важливих елементів, таких як фосфати, натрій, калій та хлорид (у формі комерційно доступного фосфатного буферу). Це привело до росту додаткових 6 ізолятів. Потім додавали джерело амінокислот, азоту та пептидів/білків у формі харчового сироваткового порошку та екстракту соєвих бобів без ГМО, отриманого ферментативно (Репі-Міко Рів Ріапі М; Репі-Огдапіс,
Вгом/поміШе, ТХ ОБА). Тільки сироватка не значно покращувала показник росту більшості ізолятів, за винятком Васіїй5 5р. Виявилося, що тільки Репйі-Міко Ріи5 Ріапі М стимулював ріст великої кількості мікробів. Разом сироватковий білок та Репі-Міго Ріив Ріапі М, здається, мали помірний синергетичний ефект, додатково стимулюючи ріст А. разівшіапив, О. опсогпупснпі, с. разіевшіапит, І.. де|бгиескії та М. Наіорніш5. Результати підсумовані у Таблиці 4.
Таблиця 4
Оцінка показника росту окремих мікробів у середовищі РВ5/меляса
Чорна тростинна патока (у воді) (95 мас/об.) 11110001 ЛХРВ5Г/////// | - 1175 | я | я | з (Сироваткові білки (Фбмас/об.). 77777111 111-101 -
Бепі-Міго Ріив(9емасіоб). 77777711 11-17 - | 025 | 025
Васіїмв тедайшт 77777777 1 Сн Манню ню ну асіорасіїов саве/рагасавеєї 7 13 11 ню ня
Сіовііашт редейпскій 77777771 111 ню ня
Асеорасівгравівєціапив./////сссссс111111 11 1 18 ою
Гасіорасіїив рисппей! 77777711 111 Сн ня
Чорна тростинна патока (у воді) (Уомас./об.) 11110001 ЛХРВУГ////// 117 - | ях | я | з | з (Сироваткові білки (Фбмас/об.). 77777111 1-10 1 - | о
Бепі-Міго Ріив(96маслоб). 77777711 1-17 - | 025 | 025
Раепірасіїмвсоокі 77777711 181 сЯнню Кне асіюрасіїив ми! 77777711 1 1О сю (09
Раепірасіїмвіашив 77777771 1 1О сю (09
Осеапорасіїивопсотупейїї 7777777 103 1 19 109 19
Васішєвр. 77777771 119 сн Кн
Рвеепдотопаввр. 11111113 11 сн Кну
Зперіотусевдівеиєї 77111113 ню (ню) Мачу МКаню
Раепірасіїив спірепвіїу/ 11111111 13 ню МКну
Сіовійаіштравієніалит" 77777771 13 1 19 09
Мідірасіїшв паюрнйцє 77777771 юю 109
Агоїорасівгуілеапаї 77777711) ню (сні ач Ман
Гасіорасіїив еіргескі" 7777777 103 19 019 019 19 (-): немає росту; (-): невеликий ріст; (ї-): помірний ріст; (--ж): сильний ріст. (") ІзЗолятТи, ЩО виросли у анаеробних умовах.
У інших експериментах намагались знайти середовище, яке підтримувало б ріст двох ізолятів - С. рабзівєшіапит та А?гоїобрасієї міпеїапай. Крім того, воно мало вдосконалити середовище, яке б покращило ріст деяких ізолятів, таких як О. опсогпупспі та М. Наіорнісшв, 1. деїІргиескії та Ї. міпі, які не показали сильного росту у середовищі, детально описаному вище.
Використовуючи інформацію про оптимальні умови росту для кожного ізоляту (Вегдеу5
Мапиаї ої Зузіетаїййсв ої Агспаєа апа Васієтіа; ред., М/Шіат В. МУнйтап), дані вище, публічно доступну інформацію про основну композицію бактерій (ВШтапп та МеСапу; Епмігоптепіаї!
Віотесппоіоду: Ргііпсіріез апа Арріїсайопе; 2001 ІЗВМ 0072345535), та рекомендоване середовище росту для Аоіорасієї (1713 Модифіковане середовище для азотобактерій І;
АТС), різні композиції середовищ досліджували на ріст 22 мікробних ізолятів у моно-культурах.
Результати підсумовані у Таблиці 5.
У цих експериментах, фосфат калію досліджували як джерело елементарного фосфору та калію разом з різними концентраціями хлориду натрію (щоб виконати вимоги для галофільних мікробів, таких як О. опсопупсні та М. Наіорнійш5), а також вимоги для сироватки та Репі-Міко різ Ріапі М як джерела (не обмежуючись наведеними) амінокислот та азоту. Окрім меляси, розроблену суміш солей доповнили мікроелементами, як описано нижче.
Таблиця 5
Оцінка показнику росту окремих мікробів у середовищі ААМО1/меляса
Еепі-Міго Рій (Сироватка (95 мас/лоб). | 0 |ої | 0 | 0 | 0 | 01 | 0 ої
Осеапобрасіїивопсотупсйії 10) Ме (13 3 19 19 1 Мне
Васіїмватуюйдцегасієпв (нн) ен) (ен (вн) (Маю (ан ню 10
Мідірасіїшв паюрпїшв 0103 193 19 0-9 19 19 109 099
Агоіорасіегуілеапаїй 0 (бн-я) |у (ню (нн) (Маю (ані ню 10 (73 ААМОТ (Середовище для азотобактерій Агрінос 01) складається з сульфату заліза (0,12 г/л); сульфату магнію (0,3 г/л); хлориду кальцію (0,1 г/л); хлориду марганцю (0,001 г/л), молібдату натрію (0,001 г/л); лимоннокислого сульфату калію (0,12 г/л). (У Ізоляти, що виросли у анаеробних умовах. (-): немає росту; (жк): невеликий ріст; (ї--к): помірний ріст; (ї--): сильний ріст.
У цих експериментах, Агоїобасієг міпеїапаїйї та С. рабзівшіапит показали гарні результати.
Багато інших ізолятів також успішно росли, однак, на відміну від попередньої композиції (наприклад, РВ5/меляса) не всі зі штамів стабільно росли у одному середовищі.
У інших експериментах ріст ізолятів окремих мікробів оцінювали у середовищі, яке включало сухі дріжджі (0,021 г/л; УР), аравійську камедь (0,028 г/л; АС), чорну тростинну патоку, сироватковий порошок (1,56 г/л; М/Р), спіруліну (0,029 г/л, 5Р), екстракт бурих водоростей (0,029 г/л; КЕ) та 0,8 95 мас/об. Масі (так як існує доказ того, що ізоляти, такі як О. опсоппупспі та М. паіорпйи5, ростуть краще у присутності цієї солі). Це середовище називають у цьому описі середовище "Екстракт". Мікробну композицію контролювали протягом часу, використовуючи дарРСЕ, як описано вище. Визначені мікроби оцінювали як (ж). Мікроби, які були нижче межі виявлення (ВОЇ) за методом даРСЕА, оцінювали відповідно. Результат цього експерименту підсумований у Таблиці 6.
Таблиця 6
Оцінка показнику росту окремих мікробів у середовищі Екстракт
ХР, АС, МУР, ЗР, КЕ 14 95 14 95 10 Фо 10 95 о 10 96 масі (мас/об.) ово | 0895 | - | - | - | -
Еепі Міто Рій о о о їх РВ5 7-17 - ЇЇ 1:11 - оМікроорсганзм.о ОЇ
Васіїи5 тедайтит ((я-9) | я- 9/5 19 77-61
І асторасіив5
Сіовіідішт реЦеппскії 3 199 101111 ню 0
Асеїобасіег оаєтейапив (я) (я) (я) (я) (я) (я)
Іасіорасіїив рисппей? 3) 0 19 16 89 189сС2щС
Васіїмв виб (н-3у 19 1595 1065 ню Ї0959
Раепірасіїмвсоокі |З 03 656559 0 1564 01
Іасіорасіїив міпі" ОО 165 19 16997 19 189
Васіїиз Іспепогтів
Раепірасіїмвіашив |З 377 бню 1 Ї-065у 89 ню
Осеєапобрасійв5
Васіїшввр. (ОО 19 1б96Ю бю бнню |Їс-- 4 щж С
Рееидотопаврийда (85 136 965 (ню Ї0959
Рвепдотопаввр.ї |) ЇЇ б963 бю (ню 089
З періотусевоівеив |) // Ї3 0963 (ню о (н5у (1959
Раепірасіїмв спірепвів (я) 1033 бню М (ню Ї0959
Васіїив Пехив
14 96 14 95 10 96 10 95 10 95 омасСі(маслоб) | 0895 | 0895 | щ - | - | - | -
Еепі Міто Рій о о о паб) 0000716 в ох
ХР Її 11111 Їж Їх 1 оМікроорсеанзм.о ОЇ
Сіовігідіит
Агоіорасіегуіпеіапаї |) 7 08311бння ню 09
Мідірасіїшв паюрпйшв (3 1311163 Ївю 118 "Виросли у анаеробних умовах
Проведення ферментації у невеликомасштабних біореакторах досліджували за допомогою двох композицій середовищ. Перше середовище складалося з меляси, РВ5, сироваткового білку та Репі-Міго Рів Ріапі М (Таблиця 4). На відміну від середовищ на основі хімічних речовин, що використовуються при лабораторній ферментації азотобактерій (наприклад,
ААМОТ1), немає солей з потенційними проблемами безпеки. Багато високочистих композицій оптимальних середовищ для росту мікроорганізмів рекомендують використовувати металічні мікроелементи, такі як селен та молібден (який є потужним ферментативним кофактором, особливо для нітрогеназ). Середовище Екстракт (Таблиця 6), що складається з меляси та інших природних екстрактів, дуже схоже на середовище, що наразі використовується.
Співкультура у невеликомасштабних дослідженнях ферментації: Для того, щоб оцінити умови ферментації, які будуть підтримувати співкультуру всіх 22 мікробних штамів, використовували лабораторні ферментери (біореактори). Отриманий продукт ферментації аналізували на присутність та численність кожного мікробу через 4-28 днів після інокуляції.
Використовували два типи конфігурацій ферментаційних біореакторів.
Реактор безперервної дії з механічним перемішуванням: Перша конфігурація біореактору являла собою реактор безперервної дії з механічним перемішуванням (С5ТН). Дволітрові рАБИЇІР біореактори, що містили 1,5 л середовища, інокулювали за допомогою 22 00 мікробів (1 00 для кожного окремого штаму). Середовище, що використовували цих експериментах, відповідало результатам у Таблиці З та містило наступні інгредієнти: фосфатно-сольовий буфер (їх), чорна тростинна патока (2-10 95 мас/об.), сироваткові білки (0,1-0,5 95 мас/об.), Репі-
Міїго Ріив Ріапі М (0,25-1,25 95 мас/об.), з екстрактом бурих водоростей та без (0,0067 95), сухі дріжджі (0,0033 95 мас/об.), та спіруліна (0,0067 95 мас/о6б.). У цих експериментах, змінювали композицію газу (590 - 2195 02; 95-79 95 Мг2), швидкість потоку газу (5-45 стандартних літрів/год.), рН (6,3-6,7), перемішування (200-1100 об./хвил.), та розчинений кисень (без контролю до 25 95). Температура залишалась постійною 30 "С. Кількісне оцінювання та аналіз зазначеної мікробної композиції наприкінці циклів ферментації проводили, використовуючи даРсСв зі специфічними зондами штамів, як описано вище. Визначені мікроби оцінювали як (ж).
Зо Мікроби, які були нижче межі виявлення (ВО!) за методом даРСЕ, оцінювали відповідно.
Приклади результатів підсумовані у Таблиці 7.
Таблиця 7
Короткий опис мікробного профілю у ферментації співкультури, використовуючи 1,5 л СЗТ 11111 Мікроб//// | 77/77/1111 Змінисередовида.їд//:/2/ССС:/ ши ТЕ в
Спіруліна мас/10 95 меляси
ГасюбасіПсв5.
С) ВО: нижче межі визначення
У інших експериментах мікроби, які не були виявлені у експериментах спів-культивування, що містять всі 22 штами (дивись вище), були перевірені, щоб визначити, чи можуть вони рости разом. З цією метою було досліджено вплив послідовності інокуляції зазначених мікробів (всі разом у порівнянні з аеробом спочатку проти аеробу спочатку), а також рівні розчиненого кисню під час інокуляції та під час ферментації, а також композицію середовища. Рівні розчиненого кисню контролювали за допомогою зміни масопередачі газу з використанням потоку та/або швидкості перемішування. У Таблиці 8 підсумовані результати для співкультури С. БеїЇегіпекії (строгий анаероб), 5. дгізєив та В. ПЯехив (строгі аероби). Як і у попередніх експериментах, виявлення та оцінку мікробного росту проводили за допомогою ЯдаРСВ.
Таблиця 8
Короткий опис плану дослідження та мікробного профілю у експериментах з співкультурами для
С. Беї|епіпскії, 5. дгівеиз та В. Рехи5
Перетворення, коли мікробний| Анаеробний . .
Спів-інокуляція: Послідовна Послідовна подо інокуляція: інокуляція:
Інокуляція 5 Веегіпокії З. дгівеи5 С. Беї|егтіпскії - ЧИзен5 В. Яехив 5. дгізеив5
В. Чехи пор 9
С. реї|егіпскії В. Яехив
Мікроб 77777111 (Ріст 11111111
Сіовііашторедейпскі М 77777777 18911111
Біореактор з обертовою колбою: Інокулум, що містив усі 22 мікроби, розводили у середовищі Екстракт та мелясі, ферментацію проводили у обертовій колбі, як описано вище.
Зазначену мікробну композицію контролювали протягом часу, використовуючи ааРСВ.
Визначені мікроби оцінювали як (Ж). Мікроби, які були нижче межі виявлення (ВО) за методом ааРСЕ, оцінювали відповідно. Результат експерименту підсумований у Таблиці 9.
Таблиця 9
Короткий опис мікробного профілю у експериментах з співкультурами 22 мікробів у обертових колбах впродовж періоду 28 днів смеююДеоте лет дет деко еВ
Співкультура у промислових ферментерах. Виходячи з вимог бактерій для оптимальної спільної культури та бажаної кінцевої якості мікробного консорціуму (оцінювали за допомогою даРСЕ), аеробні та/або анеробні бактерії з описаних вище груп інокулювали у ферментери до
300 л масштабу. Кінцева інокуляція ОЮвоо для кожного штаму була розрахована між 6,67Е-05 та 6,67Е-04. Ферментаційні середовища включали мелясу, сироваткові білки, екстракт бурих водоростей, сухі дріжджі, спіруліну, аравійську камедь та хлорид натрію. Гідроксид амонію та фосфорну кислоту використовували як основний та кислотний розчини для підтримання рН між рН 5,2 та 7,2. Температуру контролювали між 28 "С та 35 "С, а розчинений кисень підтримували від 0 95 до 25 95 протягом тривалості ферментації (до З днів). Усереднена мікробна композиція у продуктах ферментації зведена у Таблиці 10.
Таблиця 10
Усереднена мікробна композиція у продуктах ферментації
Мікроби | Середня кількість бактерій на штам у 1 млкінцевого ферментату п-16, анаеробний; п-10, аеробний ВОЇ - нижче межі визначення
Аналіз життєздатного мікробіологічного навантаження шляхом посіву розподіленням по поверхні у аеробних та анаеробних умовах. Аналіз мікробного числа проводили, використовуючи спосіб посіву розподіленням по поверхні для визначення колоніє-утворюючих одиниць (КУС) у зразку(ах). Усі зразки зберігали при кімнатній температурі у світло- та повітря- непроникних контейнерах. Після енергійного перемішування зазначеного зразку для забезпечення рівномірно диспергованого вмісту, відбирали 1 мл. З цієї аліквоти, 0,1 мл асептично збирали та перемішували з 9,9 мл стерильної води у культуральній пробірці (102 розведення). Зазначену пробірку потім вортексували (наприклад, 60 секунд при 2000 об./хвил.) та проводили 10-кратні серійні розведення у воді (до 1:109 розведення). Сто мікролітрів кожного розведення далі розподіляли по поверхні напівтвердого середовища у 100 мм чашки Петрі, використовуючи стерильний Г-подібний шпатель. Використовували чашки, що містили промислові стандартні середовища, такі як агар для стандартного способу (МА; ВО 5247940), поживний агар (МА; ВО 213000). Інокульовані чашки потім інкубували у камерах з контрольованою температурою при 22 "0-35 "С. Для оцінки числа анаеробних мікробів, чашки спочатку поміщали у анаеробні бокси (наприклад, ВО СазРак"м Е/ Сопіаіпег бувієтв, ВО
Ріадпозіїсв5) перед інкубуванням при бажаній(их) температурі(ах). У деяких випадках, аліквоти для дослідження спочатку інкубували у стерильній пептонній воді впродовж періоду часу до З днів при температурах до 35 "С перед проведенням серійних розведень та посівом, як описано вище.
Приклад З Визначення потенціалу метаболічної активності мікробів
Дослідження солестійкості: Усі штами у мікробному консорціумі показали прийнятний ріст у середовищі пептон декстрози дріжджів високої чистоти (МРО, ЮОйсо 242820). Тому це середовище використовували для визначення солестійкості кожного ізоляту, використовуючи різні кількості хлориду натрію (стандарт для дослідження солестійкості) до 5 95 мас/об... Кожен ізолят культивували у 2 мл середовища за ідеальних умов росту: 30 "С з перемішуванням (125- 175 об./хвил.) для аеробів та 35 "С без перемішування для анаеробів у анаеробних камерах (ВО аіадповіфсв). У 24, 48 та 72 години, ріст записували для кожної культури у перерахунку на загальну еквівалентність стандартам МакФарланда (доступні у всесвітній комп'ютерній мережі на ро-їаб. сот/іпзепів/МеРапапа.раю. Будь-який ізолят, що показував ріст при 5 95 Масі у 72 години, записували як такий, що має Масі стійкість »5 95, ріст при 2,5 95 має стійкість 22,5 9р і т. д.
Дослідження фіксації азоту (М): Без-азотне напівтверде середовище, що містило сахарозу 5,0 г/л, Моа5О» 0,2 г/л; КНгРО» 0,8 г/л; Ге5Ох4 0,04 г/л; МагМоО»; 0,005 г/л, СаСоОз 2 г/л та 15 г/л агару, готували та стерилізували шляхом автоклавування. З вихідної культуральної чашки одну колонію кожного ізоляту асептично переносили у без-азотну чашку. Використовуючи метод посіву штрихами, колонії наносять на свіжі без-азотні чашки. Умови росту змінювалися в залежності від ізоляту: анаеробні/мікроаерофільні бактерії інкубували при 35 "С у анаеробних камерах, у той час як аеробні бактерії інкубували при 30 "С. Час інкубування продовжували до 1 тижня перед оцінюванням росту. Тільки сильні азотофіксатори (наприклад, сильний ріст) оцінювали як позитивні.
Дослідження солюбілізації кальцієвої солі: Кальцієвокарбонатне напівтверде середовище, що містило Ма5О» 0,3З/л; Сасіг 0,1 г/л; Ре5О» 0,12 г/л; К»5ОХ 1 г/л; сахарози 20 г/л; Маг2МоОх 0,01 г/л; Маисі» 0,01 г/л; екстракт дріжджів 5 г/л; пептон 10 г/л; СаСОз 2 г/л; агар 15 г/л, готували та стерилізували шляхом автоклавування. З вихідної культуральної чашки одну колонію кожного ізоляту асептично переносили у карбонатну чашку. Посередині чашки наносили один штрих.
Умови росту змінювалися в залежності від ізоляту: анаеробні/мікроаерофільні бактерії інкубували при 35 "С у анаеробних камерах, у той час як аеробні бактерії інкубували при 30 "с.
Час інкубування продовжували до 1 тижня перед оцінюванням присутності знебарвленої області, суміжної з бактеріями. Тільки очевидні знебарвлені ділянки СаСОз осаду оцінювали як
Зо позитивні.
Дослідження солюбілізації фосфатної солі: Кальцієвофосфатне напівтверде середовище, що містило Ма5О» 0,3/л; Сасіг 01.г/л; Ге5Ох 0,12 г/л; К25О» 1 г/л; сахарози 20г/л; Маг2МоОх 0,01 г/л; МпсСіа 0,01 г/л; екстракт дріжджів 5 г/л; пептон 10 г/л; Саз(РОз4)» 5г/л; агар 15 г/л, готували та стерилізували шляхом автоклавування. З вихідної культуральної чашки одну колонію кожного 35 ізоляту асептично переносили у карбонатну чашку. Посередині чашки наносили один штрих.
Умови росту змінювалися в залежності від ізоляту: анаеробні/мікроаерофільні бактерії інкубували при 35 "С у анаеробних камерах, у той час як аеробні бактерії інкубували при 30 "с.
Час інкубування продовжували до 1 тижня перед оцінюванням присутності вільної області, суміжної з бактеріями. Тільки очевидні очищені ділянки кальцієвофосфатного осаду оцінювали 40 як позитивні.
Дослідження солюбілізації цинкової солі: Для того, щоб дослідити штами на здатність солюбілізувати цинк, у дослідженні використовували чотири типи цинку: 72п5(СОз3):(ОН)в (гідроксид карбонату цинку), 2п3(РОз)г6 (фосфат цинку), 2пО (оксид цинку) та 715054 (сульфат цинку). Кожен тип цинку потім додавали при 0,2 95 (мас/об.) або до серцево-мозкового екстракту 45 (ВНІ) або до МРО агарового середовища. Для кожного штаму, одну колонію потім відбирали та сіяли штрихами на обидва напівтверді середовища у чашках Петрі. Аероби інкубували при
С та анаероби інкубували при 35 "С у стаціонарному інкубаторі впродовж З днів. Чашки перевіряли у 24, 48 та 72 години на ознаки знебарвлених областей у середовищі, які інтерпретували як позитивний індикатор солюбілізації цинку.
Дослідження мобілізації заліза: Багато грунтових мікробів виробляють так звані сидерофори у природних середовищах з низькими концентраціями заліза - важливого мікроелементу. Ці сполуки утворюють водорозчинні комплекси з Рез", які можуть бути вивільнені у ситуаціях дефіциту заліза. Сидерофори бактерій є корисними як для рослин, так і для мікробів, як локалізоване джерело заліза. Аналіз послідовностей повного геному для кожного з 22 ізолятів проводили фокусуючись на визначенні генів, що кодують сидерофори, шляху(ів) біосинтезу сидерофорів, а також рецепторів та транспортерів сидерофорів, таких як Мив, УТй, Уїї, АбБ, Риг,
ТопВ, ЕХОВ, ЕХхБО, Цитрат, Десферіоксамін, Дефероксамін, Феріхром, Фузарінін, Орнібактин,
Хризобактин, Вібріобактин, Мікобактин, Піовердин, Піохелін, Ієрсиніабактин, Ентеробактин, 60 Ахромобактин, Ацинетобактин, Азотобактин, Бацилібактин та Ангуібактин. Це забезпечило визначення того, чи буде даний мікроб мати метаболічну здатність для здійснення одержання та/або транспортування сполук мобілізації заліза.
Дослідження мікробного потенціалу дефосфорилювання органічних сполук: Бактерії можуть вивільняти цілий ряд мікробних ферментів, які через їх дію на органічні речовини, можуть продукувати форми фосфатів, доступні рослинам. Ці ферменти включають неспецифічні фосфатази, які дефосфорилюють фосфоефірні та/або фосфоангідридні зв'язки у органічних речовинах, фітази, які вивільнюють фосфор з фітинової кислоти, та фосфонатази та С-Р ліази, які роз'єднують С-Р зв'язки у органофосфонатах. Аналіз послідовностей повного геному для кожного з 22 ізолятів проводили фокусуючись на визначенні генів, що кодують ці ферменти, у функціональних метаболічних шляхах. Це забезпечило визначення того, чи буде даний мікроб мати ферментативну спроможність для здійснення дефосфорилювання органічних речовин у грунті.
Дослідження хітинази: Чашкові дослідження колоїдного хітину проводили по суті, як описано
Нзи та ГосКуоой (Арріїєд Місгобіоіоду, 29:422-426, 1975). Колонії бактерій (1-3 денного віку), зібрані з вихідних чашок, наносили штрихами на чашки з колоїдним хітином (напівсухий хітин, 5 г/л; К"НРО», 0,7 г/л; КНгРО», 0,3 г/л; Ма5О4-5Н2О, 0,5 г/л; Реб5О4.-7НгО, 0,01 г/л; 71505, 0,001 г/л;
Масіг, 0,001 г/л та агар, 15 г/л). Чашки інкубували до 1 тижня при 30 "С для аеробів або при 35"С за анаєробних умов для анаеробів. Хітиназа-позитивні ізоляти ідентифікували за знебарвленням у середовищі та/або значним ростом мікробів.
Дослідження целюлози: Чашкові дослідження деоксиметил-делюлози проводили на основі способу Аїме5 та співроб. (Те Ореп Місговріоїосду доцтпа!ї, 8:25-31, 2014). Коротко, колонії бактерій (1-3 денного віку), зібрані з вихідних чашок, наносили штрихами на напівтверде середовище (деоксиметил-целюлоза, 0,5 95 мас/об.; агароза 1,5 95 мас/об.; Тріс-НСІ, 50 мМ рн 6,8; Сасі», 1 мМ). Ізоляти бактерій далі інкубували при 30 "С для аеробів, при 35" за анаеробних умов для анаеробів до 1 тижня. Кожну чашку далі обробляли розчином Конго червоного (0,25 95 мас/об, у 0,1 М Ттіз-НСЇІ рН 8,0) та знебарвлювали за допомогою Масі 0,5 95 мас/об, у 0,1 М Тріс-НСЇІ, рН 8,0. Целюлоза-позитивні ізоляти ідентифікували за знебарвленням у середовищі та/або значним ростом мікробів.
Дослідження вироблення індол-3-оцтової кислоти (ІА): ІАА дослідження проводили для
Зо кожного мікробного ізоляту, вирощеного у рідкому середовищі, доповненому 1-5 мг/мл триптофану. Через сім - чотирнадцять днів після інокуляції, культури досліджували на вироблення ІАА, використовуючи реагент Сальковського, як описано у СіїсКтапп та інш. (АрріїєЯ апа ЕЄпмігоптепіаї! Містобіоіоду, Беб. 1995, р 793-796). Коротко, очищене відпрацьоване середовище з кожної культури змішували з реагентом Сальковського у співвідношенні 1:1.
Через 30 хвилин інкубації вимірювали абсорбцію при 540 нм. Оцінку вироблення ІАА проводили, використовуючи попередньо підготовлену стандартну криву, використовуючи очищену ІАА (АїІГа-Аєзаг, Тем/кебигу, МА ОА). Крім того, аналіз послідовності повного геному для кожного з 22 ізолятів проводили, фокусуючись на визначенні шляхів біосинтезу ауксину.
Інші метаболічні дослідження: Для додаткових метаболічних функцій, включаючи дослідження денітрифікації, вироблення уреази та асиміляцію яблучної кислоти, продукти ідентифікації БіоМегієнихя АРІ4Ю використовували відповідно до рекомендацій виробника (ріоМмеїгієих, Іпс., Оитат, МО ОА).
Результати ключового профілю метаболічної активності показані у Таблиці 11.
Таблиця 11
Метаболічна активність мікробних ізолятів
Солюбі Інша
Метаболізм Соле- лізація Целюлоліт./| корисна для| Метаболізм азоту стійкість| мінеральної| хітиноліт. рослини заліза солі активність
Асеїобасіег . од. Вироблення) Мобілізація
Денітрифіаця тя й 100000 долу)
А?;0іобрасів! Денітрифікація о Мобілізація міпеїіапоії - Ме фіксація 52,5 7 ще заліза
Васі Денітрифікація Асиміляція Мобілізація тедагїегит - Ме фіксація що де яблучної заліза кислоти
Асиміляція . н Денітрифікація Розщеплен- | яблучної Мобілізація
Васінив зибнв т Ме фіксація що де ня целюлози! кислоти я заліза
ІАА
Асиміляція
Васі Денітрифікація оБ 9, Розщеплен- | яблучної Мобілізація
ІПспепітоптів я Ме фіксація | ня хітину кислоти я заліза
ІАА
Осеєапобрасійв5 . с. Мобілізація дентрифіаця є | 00011
Асиміляція
Васі Денітрифікація оБ 9, Розщеплен- | яблучної Мобілізація атупоїїдиеїтасівєпв| 4 Мо фіксація (| ня целюлози! кислоти я заліза
ІАА
Асиміляція . . 2, яблучної Мобілізація
Васійив 5р. Денітрифікація | »5 95 КИСЛОТИ задіза
НАА
Солюбілізація Інша
Метаболізм Соле- мінеральної Целюлоліт./ корисна для | Метаболізм азоту стійкість солі хітиноліт. рослини заліза активність
Асиміляція
Васійив Пехив | Ме» фіксація »5 9 Розщеплен- |яблучної Мобілізація щ ня целюлози | кислоти заліза
НАА кр, Денітрифікація шк Ж 0041 уреази
Сіознайт й . о/ |Р, Са б 7п Мобілізація ефек |(ефФксаця |в обла 00100000
Сіозідіит . . о/ |Р, Са й п ревюшіалит |Фксаця о5бе облціяї 11
Гасюбасіив5 ; . о Р, Са в п
Я я вх де реех дені 11 рисппегі те 79 | солюбілізація заліза шен фа 0110001 зві «2.5 /о :.: . міпі солюбілізація ши. 00 нн 01222100 аеїбгиескії те 79 | солюбілізація
Раєпірасійн5 | Денітрифікація яблучної Мобілізація н : : 2.5 90 ; соокії - Ме фіксація кислоти я заліза
ІАА ашив солюбілізація | хітину заліза кислоти
Асиміляція
Раєпібасіїїш5 59) яблучної Мобілізація спірепвів й кислоти я заліза
ІАА
Асиміляція
Рзеидотопав оБ і 7п яблучної Мобілізація риїйда кислоти я заліза
ІАА
Асиміляція
Рзепдотопав . код о яблучної Мобілізація вр. Денітрифікація | 55 95 п кислоти я заліза
ІАА
. до. Розщеплення Асиміляція орди зігеріотусез |Денітрифікація яблучної Мобілізація ; : : 25 Чо целюлози та : дгізейв т Ме фіксація хітину кислоти заліза
НАА
Приклад 4 Оцінка активності промотування росту рослин
Насіння огірків, які замовляли у Пе беєйд Кіпддот, попередньо пророщували впродовж 4 днів при 22-24 "С у камерах для росту з контрольованими температурою та вологістю (5пеїдоп
Мапигасішгіпо, Іпс. Согпеїїш5, ОВ). Попереднє пророщування проводили у рулонному папері для пророщування (Апспйог Рарег, Заїіпі Раці, ММ), просоченому розведеною сумішшю рідкого добрива (50 мг/кг 20-20-20 МРК (Стом/ Моге, Сагаєпа, СА) у воді) та продуктом - мікробним консорціумом Агрінос (АМС) у співвідношенні від 1:1000 до 1:2000. АМС продукт являє собою рідкий продукт, отриманий зі співкультивування 22 мікробів, перерахованих у Таблиці 10, використовуючи промислову співкультуру, описану у Прикладі 2.
Підготовлені та синхронізовані сіянці потім переносили у приготоване середовище для росту - горщиковий грунт для вирощування розсади (Зип5Піпе Міх), що попередньо обробили
Зб добривом та мікробами. Попередня обробка горщикового грунту складалася з розведених сумішей рідкого добрива (50 мг/кг МРК) та АМС продукту у співвідношенні від 1:1000 до 1:2000.
Для кожної обробки використовували 17-18 рослин. Горщики розподіляли у довільному порядку у піддони з заданими умовами росту: 16-24 "С та 12-годинний світловий день. Зазначені піддони поливали 2-3 рази на тиждень за допомогою 50 мг/кг МРК. Через 33 дні вимірювали Індекс поверхні листя (І АЇ) кінцевого справжнього листку кожної рослини (Фігура 2). Дані аналізували за допомогою однофакторного АМОМА (дисперсійний аналіз) для порівняння зразків у межах експерименту.
Приклад 5 Оцінка активності у сільськогосподарських культурах
Цей Приклад описує певні способи оцінки активності розкритих композицій у сільськогосподарських культурах, таких як кукурудза, томати та капуста. Однак, фахівець, кваліфікований у даній галузі, визнає, що способи, які відхиляються від цих специфічних способів, також можуть бути використані для оцінки активності композицій.
Дослідження кукурудзи (теплиця): Насіння кукурудзи (АІрепа І єа бевдз, АЇрепй І єа, ММ) замочували у воді на 4 години при кімнатній температурі перед посадкою у горщиковий грунт або безгрунтове середовище для росту (5йипе5Ппіпе Міх), які попередньо обробили добривом та
АМС продуктом, як описано нижче: модифікований розчин Хоагланда (Р, 30,97 мг/кг; К, 39,1 мг/кг; Са, 40,0 мг/кг; Мо, 14,59 мг/кг; 5, 20,143 мг/кг; Еє, 1,010 мг/кг; Си, 0,019 мг/кг; Со, 0,012 мг/кг; В, 2,44 мг/кг; Ми, 0,494 мг/кг; Мо, 0,001 мг/кг та 2п, 0,056 мг/кг) та 1:1000 розведення АМС продуктом. При посіві насіння до грунту додавали 100 мг композиції сечовини з уповільненим вивільненням. Лотки з 8-9 горщиками інкубували у темноті впродовж З днів при 25 "С у камерах для росту з контрольованими температурою та вологістю (5пеідоп Мапитасієигіпа, Іпс. Согпеїїшв,
ОВ). Ці рослини потім вирощували впродовж 13-16 днів в тепличних умовах: 16-24 "С та 12- годинний світловий день. Полив проводили 2-3 рази на тиждень модифікованим розчином
Хоагланда. Далі маси сухих ростків визначали через 4 дні висушування при 75 "С (Фігура 3).
Дані аналізували за допомогою однофакторного АМОМА (дисперсійний аналіз).
Польові випробування томатів: Томати сорту 5ип 6366 переносили у 6 м х 1,8 м розміру підготовлені грядки з додатковою водою при пересаджуванні. Це поле перед пересадкою обробляли добривом з 201 кг М/га та 224 кг Р2О5 та К»О/га. До томатів на кожній грядці
Зо застосовували два окремі внесення АМС. Перше внесення відбувалося після засаджування поля. АМС застосовували шляхом точкового поливу (ТТАРЕ, 20 см відстані між джерелами подачі води) з витратою 1 л/акр. Друге внесення АМС було безпосереднім та застосовувалося через 36 днів після пересадки разом з М добривом у формі ОАМ 28 з витратою 38 л/акр.
Контрольні грядки обробляли точно так само, як і експериментальні, за винятком того, що у процесі культивації не використовували АМС.
Було забезпечено, що посадки томатів мали рівну кількість рослин. Томати збирали вручну через 2 місяці після останнього застосування АМС. Загалом врожай зібрали з 6 рослин з 3,35 ме площі у центрі грядки. Реєстрували врожай та якість томатів (зелені по відношенню до червоних). Маси реєстрували та аналізували, використовуючи ХСЕЇ ЗТАТ2016.4 (Адаїпзоїй Іпс.) (Фігура 4).
Польові випробування кукурудзи: Кукурудзу сорту Мусодеп 2Н723 (Мусодеп 5евдв,
Іпаіапароїї5, ІМ) садили за схемою: 4 рядки довжиною 6,1 м з 75 см між рядками. Зазначене поле перед посадкою обробляли добривом з 201 кг М/га та 224 кг Р2О5 та КгО/га. На кожній грядці застосовували два окремі внесення АМС. Перше внесення відбувалося після засаджування поля. АМС застосовували за допомогою ранцевого обприскувача з витратою 1 л/акр та воду вносили у грунт, використовуючи крапельний полив (ТТаре, 20 см відстань між джерелами подачі води). У цьому дослідженні поливну воду обмежували до 7595 від нормальних рівнів. Обмеження води робили впродовж 5 тижнів, що привело до повного цвітіння. Друге внесення АМС було безпосереднім та застосовувалося через 35 днів після пересадки. Контрольні грядки кукурудзи отримували додаткове М добриво під час внесення у формі САМ 28 з витратою 38 л/акр, що дорівнювало витраті 33 кг М/га, загалом 234 кг М/га за весь термін дослідження. АМС грядки не отримували додаткового М та загалом отримали 201 кг
М/га. рН грунту був високим на площі поля та у середньому становив 8,1.
Насадження кукурудзи проріджували до численності посадки 34000 рослин для забезпечення однакової кількості рослин. Врожай кукурудзи збирали за допомогою кукурудзозбиральної машини через 5 місяців після посадки. З 4 рядків збирали врожай тільки з 2 рядків грядки, що мають площу 9,3 мг у центрі грядки, що забезпечило багато крайніх рослин навколо території, з якої збирали врожай. Зерна кукурудзи, висушені до 15 95 вологи впродовж декількох днів, зважували. Маси зерна записували та аналізували, використовуючи 60 ХОСЕ ЗТАТ2016.4 (Адаїпзой Іпс) (Фігура 5).
Польові випробування капусти: Капусту сорту СоЇдеп Астез садили у вигляді насіння у 4 рядкові підготовлені грядки 12 футів довжиною та 11 футів шириною. Зазначене поле перед посадкою обробляли добривом з витратою 20 галонів/акр 25-7-0-3 5 двома рядами подачі, що знаходилися на 16 дюймів убік від центру грядки. Додаткове добриво застосовували внесенням збоку рядку, використовуючи ШАМ (3295 М) з витратою 10 галонів/акр, що забезпечувало витрату 90 фунтів М, 15 фунтів Р, 0 фунтів К та 6,5 фунтів 5 на акр. АМС продукт вносили з витратою 1 л/акр у борозну при посіві та у випадку обробки 2, друге внесення АМС (витрата 1 л/акр) проводили через 42 днів після посіву. Поле поливали по борознам 4 рази у кількості поливу від 6,3 до 8,9 акр-дюйм води/полив, загалом 29,7 акр-дюймів. Атмосферні опади забезпечили додаткові 10,7 дюймів протягом періоду росту культур. Ці культури обприскували цілим рядом інсектицидів, гербіцидів та фунгіцидів для захисту капусти від біотичних факторів. рН грунту становив 8,0.
Капуста мала рівну кількість рослин на кожній грядці та врожай збирали один раз через 95 днів після посіву. Врожай усіх рослин у 2 середніх рядках грядки збирали з ефективної площі 220 футів?. Голівки капусти потім розподіляли на категорії за розміром 24 та 18 та зважували.
Ранжовані маси та загальні маси аналізували, використовуючи ХСЕЇ 5ТАТ2016.4 (Адаїнзоїй Іпс.) (Фігура 6).
Приклад 6 Дослідження коріння
Насіння товарних культур, таких як, не обмежуючись наведеними, кукурудза та томати, попередньо пророщували впродовж З днів при 22-24 "С у камерах для росту з контрольованими температурою та вологістю (5Нпеідоп Мапитасійгіпа, пс. Согпеїййш5, ОН). Попереднє пророщування проводили у рулонному папері для пророщування (Апсйог Рарег, Заїпі Раці, ММ), просоченому розведеною сумішшю рідкого добрива (25-100 мг/кг 20-20-20 МРК (Стом/ Моге,
Сагаєпа, СА) у воді) та АМС продуктом у співвідношенні від 1:1000 до 1:5000. Підготовлені та синхронізовані сіянці потім переносили у попередньо оброблене безгрунтове середовище, таке як пісок, вегетаційний кубик, вермікуліт або іншу інертну основу. Попередня обробка середовищем для росту складалася з розведених сумішей гідропонного поживного розчину, такого як Повний поживний розчин Хоагланда (Ноадіипа апа Атоп, Те У/аїен-Сийите Меїнод ог
Стоуліпуд Ріапі5 УУйпоці 5оїЇ, 1938) та АМС продукт у співвідношенні від 1:1000 до 1:5000.
Зо Щонайменше 12 рослин кожної обробки, включаючи контрольні рослини, розподіляли у довільному порядку у лотки-підставки. Рослини вирощували у стандартних тепличних умовах до 45 днів. Анатомію та морфологію коренів аналізували після закінчення експериментів.
Приклад 7 Життєздатність ліофілізованих мікробів
Висушування заморожуванням: Окремо культивовані або співкультивовані мікроби у оптимальному середовищі (Таблиця 12) піддавали висушуванню заморожуванням для оцінки життєздатності. Коротко, для монокультур, мікроби вирощували при 30-35 "С при постійному перемішуванні (200 об./хвил.) у інкубаторі з контрольованою температурою у об'ємах культури 5 мл впродовж 24 годин, або у анаеробних або у аеробних умовах. Для експериментів із співкультурами, мікроби вирощували у 2-літрових біореакторах БАБИІР (Еррепдоп Мопи
Атегіса Нашррацде, МУ), використовуючи середовище, що містить 2 95 мас/об, меляси, 0,1 95 мас/об, сироваткового порошку, 0,25 95 мас/об. Репі-Міко Рішив Ріапі М (Репі-Огодапіс, Вгом/п5м Пе,
ТХ ОСОБА), 0-4 95 мас/об. масі, 0,02 95 КОСІ, 0,115 95 мас/об. МагНРО» та 0,02 95 КНгРО»Х; рН 5,7-7,0 при 30-35 "С. Анаеробні групи вирощували за відсутності кисню.
Оптичну густину визначали для кожної культури при 600 нм. Далі кожну культуру змішували з сумішшю маніт/ліопротектор (ОРБ5 Оіадповіїсв І ерапоп, М), ОСОБА) відповідно до рекомендацій виробника та з мікробної суспензії відбирали аліквоти у ліофілізаційні пробірки (ОРЗ
Оіадпозіїс5, Іерапоп, М), ОБА), які заповнювали на 1/3-1/5 від їх об'єму та потім щільно закривали корком з прорізом. Через 60 хвилин при -80 "С, ці пробірки поміщали у систему для сушіння сублімацією Егее/опе 6 (Іарсопсо, Капзаз Су, МО), вакуумували, та воду у зразках залишали сублімуватися впродовж ночі (0,04 мбар, -50С). Після висушування заморожуванням, корки з прорізом опускали у пробірки та додатково захищали алюмінієвою плівкою, якою обжимали пробірку. Зразки зберігали при 4 "С до потреби.
Таблиця 12
Середовище, що використовують для росту окремих мікробів
УР: пептон декстроза дріжджів (ВО х242720), МРОБ: УРО-8 г/л Масі, ВСМ: посилений клостридіальний агар (ВОЖ218081), ВНІ: Більйон з серцево-мозковим екстрактом (Німесдіа, Ж 0077), ВНІ: ВНІ45 г/л Масі, ВИХ: АТОС середовище: 111 ВНі2обішт Х середовище, МА5:
І асюбасійї МА5 (ВОЖ 288210); М-НУТА: меляса, сироваткові білки, екстракт бурих водоростей, сухі дріжджі, спіруліна та Масі
Для оцінки життєздатності, кожну ліофілізовану культуру регідратували та визначали потенціал росту. Свіже середовище інокулювали регідратованою культурою при ООвоо 0,1. Ріст контролювали протягом періоду З дні. Як контроль використовували неліофілізовані культури.
Результати підсумовані у Таблиці 13.
Таблиця 13
Ріст мікробів після висушування заморожуванням та регідратації 11111111 контроль |ліофілізованийй7//-/://ЗО
11111111 РІСТ С а(я) показує ріст після висушування замороженням. » виріс анаеробно.
З огляду на багато можливих варіантів втілення, до яких можуть застосовуватися принципи винаходу, слід визнати, що наведені варіанти втілення є лише прикладами та не можуть розглядатись як такі, що обмежують обсяг винаходу. Натомість обсяг винаходу визначається представленою нижче формулою винаходу. Таким чином, ми заявляємо як винахід усе, що охоплюється обсягом та сутністю цієї формули винаходу.
Перелік послідовностей «110» Адгіпо5 А5
Кепайїкді, Егедегіс
Мадпетг, 0, Ву
Пи, Хіпда МЧапд
Мооп, Зипд-хопа Н. «120» ВИЗНАЧЕНІ МІКРОБНІ КОМПОЗИЦІЇ -130» 9223-96265-02 -1505 5 62/381,441 -1515» 2016-08-30 -160О» 136 «170» Раїепінп мегвіоп 3.5 «21051 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 1 зпущиитоЗи синок их Ж
Зо «21052 «211519 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер зщфквсоеєсЗ севозасех їз «2105 3 «2115 1549 «212» ДНК «213» Васійи5 тедаїетит «4005 З па зпаовике св ссталчо ссвазасчав сао зоєею зкоссавиа сао БО жчачЧозавкой абпвеваток попе стасо восзссазсча созвснни весело о заспоезасссо ссттінадасо поззаасвасї ссоодввасо зайззставтя сосзвіадов ї5о тохкКоссоКЕ озслзчоавозк ассозваца сСзчосозУс каїтсвогуас зов сос чо чосспошчсасЕ звополіекой савозоавася зоосвсосвазй зоаазопаеяо Зксесааоє 00 тавовосчово вбжрзосвов сітзповсїще зпавбатткичм встик аяс порах ЗМ засво паві сстоссопсвах сдасозвавае стозсачас ввссдосоєає часта ТО застосо позтззавиї сл еза Зовзазасав бкасовуВИх паси ои во жест ооспо бочгазавнис осусічота здопазоавасяа дбовозацВву азот есЗ Я восккузоох саосіавсосз зпаавзчосвоЗ зессвасбасо баоосвосвауєю сзсочзевага о сасозсоче вацзочісаке ставках зоодсзснаво пеосососв созассокка 50 ачЕстзакух деззосссво зососовассз сода ов бозаависЯ опаваосков БИ чичдовуааза сезазцсузя звісссвсозсз сгапозфісчв всозозоваао апосасваа. тихо возосазузчу созаззвозочоо Кит озесох обквассозво) соровосичос вас ТО чзапозавсву дазсбазаєзе осстззсазио сасзосЗзсва возпвтзвазсо ссавакчіта зас чвоазетос дсоссоїсква зокосваасса всоозвсващ овспсжссє осзчечас що чеіссовазає бавайсссва взопавіосчас Зашочооссос зсвавосУуцкЯ сечова з Ес клю учет щи лежу пежііу и хом медузи Ві вити со очки тт узи М др ет Зп емо м МООАШЯЮ КД і і Аоа тет ХЕ НИХ кт Ки Бе Мі іш МАМА НА КНИЖКИ т ММ мк чани сессскссщоа ЗооБововас песвоцеЧчеає совКоЧчеяЄ оповите 10 зас осзспвзва бассосозеса закссочода сдасбочовво состав вес М14о зиЕкзахкзя чЧозосшсава збореотоєсоя чЧесасвазос зчасчзачеє дещо 1255 козвахтсвкс віосссстказ засос чс квсвсводео совосввочоаВ муза сеВах іїаБи часова ссозпсазиасо вазссзассс свіававоса кКсссвоске дпа 13 скчсавосоу побвсосвсзаа зчогззаатсо стаз оссувесазовВ бос 13 звоівозЕкосс спеочоссіч ясзвовиочос сешозоаксо салат селовсескоя 3440 здисччсоов зсвассзївав сбозосіацосс поставте повстав господа АхОоВЗ зсув асва засазособав тозпавооЗпо пшччсхоапо ас иске 1548 «2105» 4 «2115 1567 «212» ДНК «213» І асіобасіїи5 сазеї/рагасазвеї «4005» 4
А сахцазачс пБовссостоеаЧче ссечоаазЄзаа соч чі своих ас чазповаеико поз леказ соч оа свтоечаавіє сзасзбчеав сода 125 зоспозсзчаче азасвсчкая сазоссічоеоо сова зсекаавсвоте одавасвувЕ що цитаазкассоа сасвзвссса взаассчоВк засос совзаздесооа сосбазцеає ав сустКссцов созассосзсоч зооасаЕсвоо ага счуквасучес сассавуцем Мю всзасоасосз пссзазскаа заоч о засо вовВусч пивсучачас возЗзсосвах Зо псоссвоооЄ воччсозосах вооовакотк ссдзозвеса собсвазсоко всзчачовао зо зоочоочкомМих сфдажнммиро спбсзазчесЗу сСваззесоїоч скло сзовов вчаазкочоЗ 380 чЧовпачсчас Осо засо Є бозасосвоаа фо автоаоЗох ЗАС сазсачоссосо здосаавувосзх вУчеопсаезч сзсЄвкосоя вівса субливнчосов Зо жсодсвдосоо СЕК ваФфх ссузсоеуаа вососкстУс сказвсозуває вадчедевтоу зо
Чавес асо о сбвоававосв сеча оспвічзгви сазчеозавя ТЖ сухзовіаса суоЗазЗавса ссбвзчсччооа воосозишсчЕ сЕзесогута воскова То ззуцскспзавна зозвкоочсео спасе чах сзоаіасеосв оба освх осо паанос ща зкоузвічств здукасзоаву пси сосозою скксоачсчос псазставсу свпвавакає я коспоуслестщчч авокаучносс псеезчсзче звоссвоавсз васбовс зЗУссотаеВ ЗО зчозЗасачаса сасусччко вайстоцавос заичоздаваов асокізссплає зксЕсчаовЕ 102 сс счасов сстововоавї оз тсоо поссозазсдас ававізчасва зЗсачіовІВ Мао чес зкозчпива зсксапоасо позов чока пчсптавосос посадова зсввосиКка 148 ззастячеко ссвоасвосса зЕспозевоВ бач зазас сапозчоаао вазоссудаце їх зва зочоа совоцосваа бовссвочос псобсвідато бобосовосво возізсбвов їЯщо зіззасосліа севсзвзЗсто сцдпасассцоо азчЗковазозсо ввссссссза зуссвссто Та азсссЗавос зсацосссосв воссосссво асзчавотсозЗз звосзствах взебодичех Каво сазосевсасоз соЗсолдавсвс зоссодачо сотстосвсвсв собоссчіса свосакоанов 344 зЗЕЕсОубашсв соспвазосо поса во сок азчзу зосозчазосах ссазазЗКсацшо 1500 чосзавозат: зп сзчазоє сосазоваза сзосодоаоЗ влайсмовои зок 125 «ІНК 157 «-21055 «2115 1510 «212» ДНК «213» Сіовігідіит бБеї|егіпекії «4005 5 басктозоаваї сезассоссчу сосазипвсай вепсотоаЧезоа соч сставас зсвеоАцЕ БО счапепасзля вусссссстсо бзавсочвЕ восоФфрзоачає пізна свое озОока їжи востзистсва сзцазоззова базоссЕтоз завлзааазчак саасвесоса сгвадасеукиа їпо чзсзсспсакЗ ссзсазчозваї садвоовІа зессзстасо зако дез оч ЗИ воисізвассза боазозсався зокосзвссваз зсосвосзакоас поеачосласо сової ЗО
У ем ВУ я З З чочасечКє КАесчя за а т віссостаса ско пов ласводеасос звовитосквс зачазусато враз БЕ вккосвоееає реа споавкіденоо васлессчооЕ заз вічес засос одаа зх пЕсСсвиваном Єеббавесгеде дпадсвіаат сдвсозчпкапсї падала сивої вх щи
МЛ КА ІІІ а муки А КУТА ОА Ха у ХИТ М пла І Ана АТХ МУ сівпзсчоса певассосяя база ва Збброзачея Стос хвостом ІС пазвзжнькв зЗсовччсоопві есссавзса свіча вавї аспоЗезчеве авсескооОу що сптпсевессоз вавастзоавзівс сововоссов повоззчавак чезпавстоо сбвчкаазио о чЧкіпавасчосс свапазвстіаз давоватнос заз озааб чсааоеКосВ паса ТЕО топасвскова зчоссрсозвавачос зола зеаоов васасовоїа свівсссмов сазессашоо ТО спусвавсово чавсзотача кесазок чосеовасе спосо зохавсозсах 555 тай ксс зоспосазчаз пзезасзсз авзасезваас ссвааззааВЕ сового з00 сехМмичмио зпсосдатове За сиавї сосоазвволайо десант: пове еачао о ксозозксо стпавоссвос стсазссоз пааосессо засос часах 19580 чсивізицесах сопссвоассоо сзчозсовла сессств воаоссляа сода іп спасти зок восс вессзокіщиа оозстутазчо зазаокасос бота восе 1140 зазвссаваеча зоспзасоавов КсаависвЕс акоспссобеа Єеопадно пев іх спізсавесчо хлЗзсвсвааа ачакоосвава особову часова вано їх ккіїсвУпіКо засеосацло КозаавоебоЗос стзсосакоуваз стуцазчссес саЗзтавусоє ї35о чЧавісчаваї зочопосзче впала оссо чадоспеша сзвисатососс Феодочнасое у 1550 зазазсконс весавсссвае зобов Зашоеоюав соошщеєсвом час амаче 1440 аззаковасо алое асссоавса азчкасоскоє восдасаасие бод еое і сароишике ЗА1п «21056 «2115 1485 «212» ДНК «213» Асеїобрасієг рабівишіапив «4005 6 жхстсзчачаз бчапососаесх Мововосмьа поетеса втзсЕсавсв саше о часов соч аосса запас поза авс чозиачча сталсовио їхО зоачозЗзата возоссосова зосхоОсса асвососабая аовслтеачуа біса окя 180 павуки зсоуразаачо се коа СЕеспохащЕс сна воцескатесв ай зоузсовозає сзасасоЗ Кола заода сзЗассВвассоя сво оВо саововсУе ЗО ссвовссооЄ зов зсв сачозЗзаоза вовсслааса зізоазЗззоасав ссстовсшсе Ме зосввідесос зі зчазо вазеосїтсш загс сваао сессеесово задача йко при жжіусочочує цих сухе ві и Іі ичезежемумЯя о млрух В фо усу их мовила КК ІВ дик шт зичу сво сомів шеноссммноує шашки славою сума сво ау вже тацч очскоскстоз авезасєстоза сесзавачо зп саоасомх пек ашВтче за сазакссезав асоссозаоо сствзсобзопо взоссопсвсх овсовозоса заобаовоо оз їдазасвсо ссотодває сссвуєуєва азосуавасе сосазвеако сфусааувасв БО ; що ; чав тозчкпеєсля азопсоссвас срозоКозКЕ восопвсоку влзсчоспава зчоспкочео т сазасеайцаву саузквоусосЄ посвзгосвс зосчоавасо вЕчизеосіа часа ТО пд прі єи кг д іч сМі пл еецадгчя кеди мвІщ о ік ем ЩвК дссІИХ ха З
ЯК КУ Сім о поки окт плжи дум ад ума мл и МОЖ ссавці їцяає азстсзвачча звібчжеоосооз зоспесиова зосччпооазе зЗЕоеКсочиКа Зоо аскгсорвацоє зододевсова сопстуасосв зок танео: вас ся зосаоееау З кткквЕксскос здосвазучаоо сссзвовсву здо зсвзо зосцістісов обоз увенх іп тазові особа сс сусазозазе позасосств стос соазео ссвакоВох ОВО пасе чзосв ссобазаова восхаоссзоасЗ зсвачесоза ззавазо засос УКло заіссоссака песо аке сосодасеас зспасчеоств свв щоЗо дао туя еко злестазчох спасассвея сов ссста завзчосоких сзоктсозоави Сесоопикяє їж аиожсчноко сековвоцо чав оао Єашбоолеюа пев зоЗчоваєа МО пестоссв собЕобапвс абссуцеочиіс восзосвсчч абсбогчеку ассбкваоею Мо пр: КіІїдтмчеєдий смів денча ср де щиІн дю сеча дес ктт мтс щл Яоозчех тай
ЗЕ М ЕОМ Мур чи у хи ку Ле Му М и У І ОД КК у ми о
Чавсввоцчся зосасаозчЗч васоссзчооає Сзсакадеок сс ТЯ «-2105 7 «2115 1571 «2125» ДНК «213» І асіобасіїїи5 рисппегі «4005» 7 апчазанесх загс сСапозасозави чопозопощео писпеаивлоапоосвао БО ааспоспасос співає песаччКоас счовоічав вата вса пово 158 тацезвассто зозвзсавов сасососзвас стососктов зЗсзоооасаї звовосїзеа 155 завспсвочсссх звкеассоквЕ заслазосзав взосасоечок сіссасЕтва звавозскЕ 40 пт ичковос Кесеоззіоо вососсзесасз сзЕсатоксго стзуззасау звасчасскво збо сваччсоаапо всаочсавли часоповцазч зов своего спдеоаовох БО зЗспсскааавокт пово вою сезони сват сксосв саятісвося вве ди чеачсввсоот почсовссза сова содсссзвав звоуссоси седповоааоя зи всачоасоууксв спеусазосех бФтзовісісч ассбубатосв всожевавоє своозставо пай пвсжсчссво свзососоух авсзсоусаче бпоосаваоч: са соозуЗЕ ак коосцх БИ вавопочачсо сао сткзЗУусстч воза аао пібозцоКов чопоодвчазу о
Сесасосова зссозззадас стозусусас звовозчаосво бореесісса безос тб сцажатосзї аззеасаоз звозвасвсов зосплозсоцваа сус зп ох то жастотоавВош соозаавиов сзозсазсое зсаззассвао асасосізас зобов касо чо чсСжазсовко васусхазт заз сососзосе сзугсостзса дставосовЕ 0 чавдовосктт зеосоаа свозассосв ваз уааас озвався спасає зо шосчовсВв ФВ ОбсеоеавВЕ созевоссво зсовачайдос ссассво що ївко
Кв х зЗвеих спеЕйпслайскх дазаплаткдщс пече сис цІв а щдс 1 Е й еще тмх миши вом щем сіра уся ї Я АК портик сур ее Уа ке ти пит у барди писок 114 чим МОм у к лама че ер оютитаи МІХ В, ї хек ККУ всоссЕсвос сІзУсссЧсовЗ досві сваїЕ Ззодсвосоа доавзавскос сої засава їх ссзовмозааз зобов сов счесазатов гсвовзососЕ Сабо а ооКасовося Ти чскзсовато зволеаасав сзвогсзозча засозозв Соааоєкаак пошжЕсавасих їх соч стсаз ксоодаїсоса ззоскусвасї сособасзвкх ваза соуосачиаах 135 счісзавеова сзозссвсоця база сс ссоасвсвосоз сссаовове 1440 сзвізасах соасавасвссс взацесооКо зошлсевоско озопормасюео сосок авао Зо кпозчосазчак чвесезУшк аз сцечеос зазесасием бечувовасо бемодопо їз
Козвостсски їх ТУ -2105» 8 «2115 1548 прічсчтеетсро те М ічщМ чив и т М ех вве сизим року сере сте оду о моху евро ОгУ зкопсааИк посассосКкот сова Вс соч сзиосотааЕ ЗВ щих спе ви нн НН в НН В хг що І о З КІВ То шо МК в СО с ча ни шкечяа ас ау М «же м ие ежимо им межу М куєтехІВ ії ом ім о гм промо У сети уєх в ому пе их тож иуєх в у ЛОБ цатвавсссоо соч авоасї чЧозасваасс пору Фоапскешнс «ик ММ кн о нн нн и НН НЕ НН АНЯ Заг сшочевосОос воза сисаай савкааадпоани епос пост осаосв паси ЕМ тенчемсаг кв сек давня сце т цу скид спір сму Бл мудк ща славі ов КК рН ця ни тАННКЯ Я СНІВ КО Кл ях мих чих Мурко туалеті и цих ух лрЕиуиВч и КУ жені лева аю поро Ів ИН ЯНА ня БУ ми ж ухичижео и дих бути ик утри ю уж о пихи кити и І УВІ Кг йо сама песо пвбтальнЯ ні сосна паімиМмІеЧчКА рами ЗА тре очижет фі овоч их УКВ цу киці Б дриів ючув кризу аг чеки сова о спос зоз дачоавсево свист осоа пауз Зам дише рдІмя Коди вдо сади кдд; Вуз іче из стече З кай воскову Сас зва посеапливК пого счоссчиаака лаку пон м а и ик а а м п и а а а п а и п и п а КК Іл шамани запо жлоуааскаое дока сш КК З Му цптуг УБІК ТУДИ еих сет вом реє уУхои Мід Во охіч і пу сх сих ве и шу зиМашхонасшу шва есеммх сус ооо соз педа сте ло НУ коза ОО ве в НН В и А НИ НИ тугу сша ачо спла іму пили питна шо не ТК КМ фетру тел Тетерів Ме ето ко ут у вір щичих уз іщовгутуєтотою щопіуетзирю етики зе атассвичсо содачооцає Соссско шк чис шШечеасчаш азам БЖ ласнзааСаи ласти Звесв ср лсс пани откавЗ вот зляка Зізвазиакид Ма пф етукілі хе тд С А я На м Ку Мити і МКК м і ни в нн нн в В СН: Мч но ин нн ин ни НН НА НН и НН и А ги жилих чоосссквас зЗстоасазсса зсоасаузно састососс соапоачио Зо пк лутих вігт Муд ее ех пІежехІвМ цих соми Уухуможум щире лижиМ аю жому м М у уж щі чисчсзвзоал спезавскьа восавастовЗе заз оссес пово ЦІ ро ВАСКО що пн Но НК НН НА з тузАх схе айпссаА восвапенІче зЗзавашоКиВиш свои спис сис М дБ ду мимо коехрувчех середи ут їз рифиу са уви туф жу аж ум ЖК их лу тудм м гущу
Маму шум Уч ІмА МНК СОЮ З еВ ен СК М ІЗ ТК хе а зок
Жохижі тов гду ух Бі туче В Вих Моз у ріг пед зужехізіІвитиИих КВ оуху как всих Мову у и лат «ЕнІКиВащКц Кп сов ЗОВ всти Кав шт в тХх шок 144 тити ще щуии ку тки ето хи ІВІВІМІх и У УХЕХ У и ех УФК ух их Чо
ММ у Бо що Вже й ВТ чом и ко ща НО Що БАН З її ві Вк о со х М Не З УК З В Не х КК здо Моз о чем их о созих м утируут іт учити сухі ук емо ром лі ух г ск ичи чи вач миши СК СО що СЕ зи ву З З Зам м МОНУ ча ік
ІІ т с и их ВМ етики злі гл семи уко уМ жоужужим о щоМ счежех сви и чоти
МЕНА СХ їх Як Ще ПЕК ТЕКУ 5 ке осшкпа Як м вд ВЕК хо АНЯ Ск ох ким а но В НН А НИ зи
МеВ КУ ії МКУ щ каша вн ВКА хЕ ЧО Бк М З КИ ЧО З ч шк З с У ч ще ща АЗК е щи М езизузут жи М ее щих пути умер де умииию Можо и ож піз уєиМмамІМ ту займ какая Ка ФК МНН СС АХВНИ сором Щи йка воза маю а п а и НН чкпя сон АЧИС ЗВИлЛОСКВоа пуд Коя кино маса чаЕцах пли уюа що Кл
Фіхуж вс щтї Уж доечиучіК і гмчгс ум чи ем учи с учи В ка
Вам ММ ММА ІМ АЗИ КІ М ЖК ДІ МОХ ХАТА МУКИ То М Ку
УК ижеківежів их Божі бум ик ку їх усіх пути єжужутутиВ еф ху Во щи В ечуе її стекло всайс готово клала ІОВ ч спшичлопавс пов пе здо ЖІ В гхічутиі щу гм и и т Жов их ум зоенніас її яки де и
Медики М. хе ДК тА уки мі моде І У А УКХ яю
М ; сих вх їх : : ек с що чат учив речі піки У ге пу схо онііиі у химери уд муч ву ож вени НУ АТМ МУ Мох УК МАЕ МІ ОА КУ ВХ ЧЕМ ке Ер хе ОД, В с М НАХ ОМОМ
ЩЕ БеччамІнідя стиках ВІДНЯ застав Фі ровІзщиМ ОО БІ ччовщ М их МНН
ХЕ я ви шар МЕ хх ще ее МАТ о БУ Ще паж Мох них Ух ях мА ш УКХ ОсУ я уч же тти ду Ж дич ки ек дим дез те дехих реретехо ее Беж орду зи
МУКУ СО КО КУДИ ЯКУ но ин и м нн в о и в ВОК ік що ди и хіх У сихих чле Же дози шоу тиж Кот где о у и Біт ереК и А ща М її «хх й шчмУе що Ц махає мое ЕМ З пе МЕ виИисмиМм Ве БУ З м м ше МАУ ще г Дух пуп М оК учехехує пущ о К ру УТ может рази схе жом Ку С
ХК ре ем ше ую ММА З мм шах З мА З ХА ре ше Кер ер ах. ою
ХІІІ Мом ужурщ кажу пра ех уж рих хів ліліехіІ зим вежу рем ВІ ом ву Божу й су ЖК часа сок саоо см ссср ох ЗМ ху ок Ж пожити ця ЄсКлрІ ХМ скІмі и дж им и да МУ я мих У схили куми и ее у У Ат
ВтонІичасчкИоЗ соч всстоав часа спо сосок очко Вес па
Ісус мето флісу р зум о св учевивоезохі В ме уМ УЖ чИиМико с ІжІмИиуиі го му ух ЕН зІвсзкасзипо ззсаасенкх сосок зе а дл асо мо пе ваше ев стеж ук ков своежитих с одфухежоху им св ж миув Візу спе В ож пух фути ке суду щі спІвазчзиспо сепсгао сво тоже свспкеаааи сао БКо слюсарі міввс паб и Веде дадтсес вд що Буаоркия трав же МІ Кука ру ко ух тА му мучек нку ХАКІ ХЕ б. и ТАЗУ У т Я Од їх м й - ях ен в НН А и НН Кн Не НН о а о, ОН нн Тр шиащомесиа ссесопвазцсч зоспесслесв кепка сну СОВИ го ; : содою гіч речи І ще М що им ви щих Мороз руч І щ туєьь Кс пух ее пат
ІЕЕ Му М т ВИ КВ ОКУ ВВ М М ОЕМ ОКХ щі Ом Де по гяж х ко г Фе - ч. го - є - н пух
Міші ММ суд дір му жу Ви ди М о сте М Крук век рекет пл там мм М пах МОУ ч хи Ах ТУ АХ У ММ Мом -ї о дя у М Б КО мм мк хоч Іди мих прості в и готи Е гетеро Кн думи І
МОМ ЕеУи КИ УМКА М МО КВКЖКХ з ях ча мм мх фест мив ОХ мега сце щіетух пото ще щіІче дит емо о стор М узи Куда злий я ЗВУ м в Не Кк пи мм висо х МК и КМ ем дІгтг І г фев М вих ре гтиїии сІДехижи ееиМ сже М и есте их ут М ух ВА ЧНІ зош ащКи шик руту мм ши ММК ММК иа фо учив Ме сут евиК К О и зи ими х зе туех тими ли уми лу М пря о ужити дм пл
МОХ паясочеача КК «ччкска восени Ва сша Ух і ЯКЕ Зх кКе зосвесаассгЄ спори еа високо соска мезо маще сор а Ак пиук дасте щеміни бак діІвуня спи ис гадки зесвибагаа тий сві зайиеоск Ксасщо сок срок слим бастеєжааює сг їж
Уж точ у УТІВ пече тичия щу гостре хи М Муз цих тк тиву Ж рих ож др в ух ЗСЩТУТЬ
ММА МАУ ро, СУК СМІХУ МО КУМИ МА КМ АЯ ОМ ЕАД МИ тА Ти Б ЧК ме Алею ситу тіки гою и мае ми кое М ду Може учижч М рез ду же гри ижих СУ вими шоста ша бешеаНиВа СК ЦО т АЛЕ гетри М фу Е зр еур М М Рук двом ут тьотя ут М узи пу сотих уч В опи рии? злам шоссе ссошосоциУує почата свовВес пого сивосдпасначи пошану АЗИ кзжти теж су мів дво ж пуєтии их пуер ее ду ск гжежий луретд фоужлре ко стря утіх заг пильно пами щоероенАтНЯ сонна со осоавВо КО вас ЧАСУ ПО О хм кити оту МІ ви УМ и у ами м лі ож ом иииек ії жим ра уж ху и ще їн. Уа часФчосоаках сеанс звана о поса ато КЕ КК ев вла итівижі й ожив вчив яти . я ту а се ще : ; : сх пюфЕф ст Код Км Ки буде вдетсіщри сехК сту чих си Відро ге суч хх Щі акочачОк БУ щокою скчоВНя ЧК цмх рома ся скоса що гедоггтдіІУд Мк вІиМУ моз ВІ ВОМ жк форту йч М срижі учити лусок ох я омІУх шажосУчссцасе ож сек пово сс Вася КЗЗ Кк
КеадтіздіукІя (т деки Іще етиці щоці ви гудуть: Бевз оре пух їх кети а СД и дн МОМ КК, її ем її тихим ЕЕ Б ФрокАф КОХ ОХ АЖ ее ще соді щем МАВ М Кора Уж М хе ж Фр ки ду жи В ро лог шоКкшОх сеАаамиУНИХ КиМУ кВ «ИИх ба о ЦК СІВ, сю
Жити сер цв овсуєвно М може Ір УкУМ Уже М прІехУхУчИиМ Ме Вер сум м суху З
З ро ІТехІх какая ки терки іду ЕЕ каса сзим дк це я ге
МД У Как. ше Мч МУ р мя ик ЕВ ФУ КСВ що З и а З У щи студ У у сте жи пуху ху см КУ льс щу ее М думи щи
З ча ДАМ рум мМ М - БУ хм асо маю и АХ За Оу я дО гІСТВЕ ЕВ щ стаз вах вед тщоє зда фот ще денс дос сросу фсчзщрї от муха сема МУ м ми крук р уко КТ я
Мудаки емо ких М еує екзо, Іти тд Іх Р ВІ й щі
УА ЕІК КОМУ ХХ що МЖК аю меш В м ХМ юю З АЙ ОН З Ка кас КХ
ІВ Музи соч учету Ух ук ужвиолУ гу пуття поч усе куту злу Ву Ма чивЕхасссв позасочаах скавссачаВ В КО ще її зво асщ мех ма З сет щи сфер руту реж жк озеру думку жов іст пресерви ЯН
МАМУ МОХ БУ Бе ех за ші вужа Мат БУ Я МД З я З сек мм : : : : ; ; : с : мох жим ди ставу тдеду фути и мМ М гзутихих М Кодексу ехо ся сего о пі
Мі с Мк ОМ Ке ще Ам З Мои ЗИ ши висо гео Мора уж с"дугр Уч хе См вІМ щу ск діІ ся схе І ЩО ц а її вм М МО о Ко хх З за З ща ще С но щу же щ ща чи я У а НЯ шк І Теми сечі еВ и пев уче зичимо бу усу ум су пром го рез и у поему сленг ЗИ їх ре Я щмаце ЗА ОТ чі са, У Мем я З т ре пос ча К ЗОМ ЩА СО І АВК С ПИЛ БУ. пеезуч кети і сут упр твих В ощМ уачи й се щи фути М ци КІ вт т пидчечччіаст саачованах пвоавовисск поса кеои сова каска вчи деч М ую сх срер М Во схов Ух гррю тім. ср муж В приревеу ІМ уш М проду ех их се чис кцчосач зиск ска часа авосазсєч сосок и ; ; ; ; : гуде селі ек цує и сові Вгорі ц щоти щцМ божу ех ому ии хі щурі Заг зЗачІізсспвсє чЗознавссЗзе засос авЕКкопасчо осот сирі счово ЕК ка нн и па и п и и и и рих су тизирих ж им в сулдьом му ЕК В Боби зттудт паеакшчиччоио аа сздавачо шавсзосзаеча виска совОо Фо т скоса Кок чт соди В ги рек в хви ирЕх Волі М вх еВ СКК дже теза ж ж Ме ехо зд сихласаче сера шоссе чаєс звазсоевсваст часов Соски КИ ензжемкс гу ад ет струк сват сої дни пиві ка Оки ди 3 4 ГК р вк щем м у щмишщиект мим КК ше КЕШ Ехо ую М СО ДАЮ МИ ЖАХ гемо в у уж езехежох му кі окІч м лу б чичечеех віщі мим их ще иУТ Ух ог ссвазсвикв чо зоЗсво соаавсзачавЄє БсесосОлас званим вача я МАН
Фоми сс СМ В сток очитих ка охі В шюмихети из уєхї пу щих сечо ічихе их Кози вечір злет щас чмМмМмаМ Соски МУКАХ ср ки В ЧІМ ОО МЯ я МО ух уми щи у туту Увиих ие зх и що и У ру угон Вивід Вч чеащ ее их спеасоадаотскУ севоазслшесо аск сосзвеасих аеКстутєоаа засо зо течак ки таза сних щитом вести Засн ватні х джу сли чем
Чцечошиеишиа аенешееосе вошвачеУчУ чахошесаее ащешмтаимК Смик КМ тзктті в М уі КУ ери се Мор щих уд уче гр ех голи що г Ве щі їй;
У « Миазасємщие шЕпшемим мх х чис со Цих З М ОМ КК а чи мМ їхзаса А трах Мини кі жим рим и М р М схужочту их Із хмие ІІ сер теж и У фу г жу жех Кт писззватссЗ пса со осоаас сздесозога асзссацасеа овЕпаККООо 505 кожен в в НН тий писнВІссМмрИ стає стору БМК КІМ УК АЛ пкт отут Коцур вижене Е В чі щі пед рих че ще шчлкчичдац Соком скоса ду сеча Вас щи сегудІТрсчІЯ щу ФСУ бору ев у стер рух ее титру ну С пр ді Мт ча часовий часове поток сус чо чЧопвоасов сеча Яке тус ужих Мем ежвоівовои о суч лаві гизеутЖІВ и ииу сечо пови фзгтеу Й ІМ Моя ще ет КІМ У ШВЕЯ СЕНИК ев а КІ СНИ В СК о зопсавле волос слав птставатапдавий база слу сазан дО
ШВУ АИ ди КЬя Бах опа СУМОМ ХІІ ЗАКОН Кол Я п Б вн и В и и А А свт сапиосамнкК Каша пса паски сис сови соч що «міф тФоуелітчетиу й гсетщрі ее дух ВВ тирі пух рт прик ше о хи рик уві тег ім Я ак ран є ку ВЕ що НЯ КРАКХЯА СЯ ЦО ЕЕ КИ пінтбасзиза жест сосЗсаа спас лаадс БОС іІдІ спаде фсдиВат З али заочно Кок мква сич боги деочче щас сома иВ ХУ дипЕеМкогн др ди ие вих гуми що еф осики що смути лим зшшииМ ма КМ роста снь ссср ро Зо сети Ід ги діди горище сере він р ЧЕМ дІт сему ка чик ччиВшсоша ша шщя соска сяю скоса ом иля ши фощізгьк дІхіюв я судову вик Бозі щи і Мо узгусєтучуєв що пт и смерти и ши сянч али чис лин чавІуа соч Зла чосчсв ес ЗОИ жд щуУВЕ ВІД нак ик ухили вам ууиЕ ІВ фсгикежежиучачи Ко сх зму щовах зи уєустіВв ВИ ЩІ сажа чи спала чо гам ср аччг ІМС спо УЄ ХО : ; 4 іч ер мете их сус ДО кіс ВІЩИВК их жи В из уУєт феифвк іземучу У ик ІІІ Іди Ме Му пив ожі УФ цих СУ чачоспосвчай звоОпацчече ЧаВо осаищ сочЗовоасттсо вес МІСВ Я овес Ті ; , вище их зе праце дтою гзгутчехмоу вих мазут су вів. сувору єтутиє ско ви ку Ішгт чачсвитавщУ сила втмокхУкІмах спро ВС муч снах НВ емо тенхдці де оцтмЕ соеуичюиреь де фуд учнів вВлиідгіждя би це, ваг щ ща п вщщек флак ЧВМ АКАКМКУСКА ММА Бо КА ЛЕВА с МКІАфУ ФІ ТА МІУ МАЯ УХА АД ОМ еле
Федр их во у теми ик ух що єруцово сусжус мив чути а сут В запа
ОА ХК Аме КОТА АКУЛА и Ох УКАЗ ММА М.Х СКД МеХА ХАТА МИ Ки Са КЕ р КИ меч итЕ ту ік дів чу щи діди В ооо щури соуси Кожух с «кита Зп сашеике паесфиаах спі носа со Чиух жо кн в НО печі ик Во сещухд вет у хіти сх ЗА чехи ащики шаг оеас далвовашКсг вести ам ки пасом їжи сука Імя Офис ко а а п нм о ни в п нн в п я С о Тит зва колесо Звоалаче засво епох сою Ам жах і счує ра фе муки сухе сеча учу щодо сети и ЦІ фо в уж у дю рухи же чат поко Ост бом пдавзсчовасл пес иАК В ЩИХ МАМИ щоб ие сх щи и ІМ кі кущсетф чу тУуМсчщуУч ці руКІдтТВО ПугТКІВ тегу ще до и
ЗК КЄ іа ники чол палав почавши ЧчЕ шОчуЧоа С ему ізо пущь узи пф гсфузичучи в ом що фуксія Ж щухщуче я увів М стр сопюгід ех ую гу о пи м БАЯНА І ПІВ МАХ КЕ МК В шими СЕМ ди уст Учити пови х фут щиті Му их сім і щощи уі г фе оз ния жом щи ик у З спмацочаВи пе виивос весбссчавгсо бавпааанеко Ктопсаечсто пого АКА
Сх і пустим чи см уми го жи же се сю уч тм оч нема гум фічуунив ие ух али пксншашотіму вишссосптевиа співав осв бовосавнкщ сова щем АВМ сх : я ям пуд дути й ви геімуситиихЯ і 0 пух ут имих сг р и до ду узи вих Ж друг хай з зі: Мем духи хи - За Меку хи й моху ХВ МОМ Аа ХУ и ТМ : : з км пуреж ухусумі ху ге дощ М ххх дутихи фу узутид же ВО іі и КМ Метр ох І у за МАУ З щ ем и М КК Ц ки Не МеМУКкУ с к М щестчашьиа ОООУ Мі ТА АХ - й Я ще кох ; сх соех . мо ; Ж ях се ги ох у сітку Біо и гг у щих Ка
У МЕЖІ кА АН А що ем мн хм мМ яю ух
«213» Раепірасійи5 Іашив «4005 12 зикссвтчасЕ созчасоскас сссвасоза зЗососзопооа сзосссваях зовеспсевх Бо соОвлзозчовск спабозовас сстосастос Бблвазоссва соззооцвсзУ чолечоваса їх пзбвзосзвое созосотсва зво ззата зсзовасссорав аозсптазоекв втвсосовий іа звЕссаскк сачовикасоЗ завкавсзва вузосозвопа воски коразові І аг писшослчасуєс взсовоскіаа собпкоечсв водесосаст авось ооо ОК аспскозувзоа зісазвсоазос авовахечсзаи Єбсовововслоа спосо баса Я засвосвсосЗ зе ссозс звісниозва ацоссковиза зоасавспосо пугевВсЕех в азс с спозосказВ зосаккзс сазосвасвае су ксквО всавокасх а вЗзч овоч сзе сосасвоссоз зпвасдлазаасе сооЗопЄсавасе воЗсоКевоас азчосспеаока зай асасзсвосцо сасазавс зкпссозавчеи З'кчоасозова весозсолчс во ихе віз тсааЗсшкаь сзстезвавсс соЗзаозоессве сосзаЗзопо сасгбззавао Бопедавоске оо чЧачктзсвіаа зезусетачиЗ свапосзвсоа сзозооозосз ззакаозсзо втвхзкодаЗ ТЕО
Чанов зЗсогамчоео високі ссспраВвсбая сповна воо спадок зва зчосдазсавас зазасквовО всостозаз соссасолозх звасзвкааа юс ва мазі чскко сбвовосоосса зесосовасу сзасовсаєїв засво сопо стос ай шкцасСшсчсаво впіолаааски йеазовасто зсозачасос зпсасавцовя сова а застава скс давпозвосЗк фФфаеавочвашесЄ зисвВачоо зЗзасатоссїо боввЕсосКо 1020 ачазестазвОа Фозпооссоточ попвововоачи зпавсоачоечц бори солоного їщо ззкссптоавоа боскосаука вобехвирюва сочаопоювас сита засос 1лас звсостсоооуїз зосзоїосву авузаскоєс зоасововаас содвадаечч са Ве ТЕО зчссззвісає сасоесостх зозчасскааУ ствсвсасої встабсавоча соізЗУусвсває ТБ заспавцєесаа сссфесазЗЕ пзазоссвито сівсватацє садбосковчк око ВО зескосваасу сусотоасвсу вачеосуав спссеаловає счодовсова сескушосса і завівся сспеучоЕ здсеовсвсео соссусосвове сасзазачек ХасавсвУсо 1440 чав озако поза асоск бадосовасс звосодосова засо бував ЩЕ ковачессіа зсзанасптайзт сеовассозова безос осез пассасскос СЕ 1553
АНІ ОС Я З ТУ шо 2105 13 «2115 1561 «212» ДНК «213» Осеапобасійи5 опсотупсні «4005 13 сквісдоаово Кз агосої зсксвозчасо засозставсч зчоазескзв Сас що пспачосоча спавзчосоввоя савасхеКсч пвзчоаЗаціс счозоаавоцв зозосоо їх чеасзаоввас аозсаасав сСсіостЗса ачассоєдов застосо уза засос 18О затассодах авозсктсої зЕсвоскзві заз ов заз е Біо а стасзвовеоа зчоссусаоз свссечЧосза ссзФфиаеоас ввасчостеаєс озапщсезапу ЗО авїізсчіачсс завис зачно паса оує сеосвслесчав сотзчезвовос даси воке 350 с«изводозачча свопсаучсача сдавосстссу оватууасов вачкосзчасоя пафоваесоюо ЧЕ зпизІзчазчсаз повзе соззієиадй ваосссеоктя Іуда веоже центи ща кваївастов бозуаоскк асодіасюеєо абсо сс сави сао 4 тТхлутхгм км сві су и сгвижея через меж смів щі ВО Жде м схечум и ІМ и В ема пт савцисчозоас завозу ссзлзосзавяс сокссачавЕ тако соче Зав сені зм сти І ВЕ щиті щоки гобенємагУукІх вислов бно ги ВЕ пацани кс КІ алза и вптзгззавко пиву чи сосни Ко им ще
Ікс б охици Міст вл двнли Бімзви М еті ср ІхК промах бозщидІсях НИ вибач аВс Косач осва шиє ас помтавеов ско восо са н Тк дІзДдОБНаКсІМУ ди ща дин ЖЕКів сви Кен КІЗ ро їди ІУдМи В
ЗІ ШИ О МИ о мА МОЯ АМІА А І М ХМК СЕ ДІ МІХ КІ ММА МОДОЮ Те спочив тки щоздтУ ци ВЖК пт еніоитичих фея ЗагЙй зла сщоасовасоа аосвашаскнО ВЕУ КСО кА шк пуге й рем ду еже се М дети Мобоухуичовоуаичую о сеча су ть ск б щовізО Моустих ща г пази ас чсснх засни спосо оссю пачсосптилва часа ач сВУЮе Мч же муру Отут и и уж ВХ призи и в езицих ІзЦУ цоЮІМ Х В Яхти Ви фури и В ому зЗдА ще ем УМ МІ пла щи» лк пд ВК ВІ МА ЗАТ КУКИ г мли
Те те их чом ово ЗичицуцУЄчИ Мих сту ЗІ М ІІІ КОБЮ ци пух г гли
М В ем у ем ет паті ХАТА МІД КА КИ ТАМ МАМ округ коштує дуеті У М М м орними о гзкргзут ле ду УМ гру цит чо су уки М гру ія тпм шишок семи щем Меса е ра МЕ КУЄ ЩА гук щирим дже зерк ет УФ М М ежужиМ опр гзезочижух пет рихучиве дрехих М М ра вух тій чиспстсовос соапоассозсцв час зця сазопсссоас засос Звоссеаяо и ом ф сизим фу В М оце чому мі у мезгу щи еких упор супи у заживе чел пишно сосок ачиК руси ка вачеасес соч ста МЖу тк есчічі Ми схе хом Кз Ім М гусхом мим ком мів сх уеУк моежсу хів Можу силу м и ті шими мета я цім апа тапсесї сани шоу сист У
ТУпезечт щи сзсхЕчУФ І НИЖ су изеусчоТІВоМіІВ СК осзІоВохец ІВ псом схе АК ут ол шен мле а яса шести мисом Кдиоозгзаваас сиг я бут М Ку уже М утік рими У гуУсІВ ох м міти ВО учи віх люди тіж ежі пи ех ех ее:
ПОС МКОВ ШИХ ее завірена лем аан че Со їх холу рез ожих учщ ихи х КУ и ів ос пуг ие мими хиу всих теку щире хг шакчяММоК НУ дмиюшнІМ КАК ЕХ Пе ожммМгаХа о али КМ пе и ще пли гом я. щ д ча х г чок еф разове тт К учетеЖ их. щур щі хости у гпзучруичече рових фото оуи тощо за мкА ЩА МЕ М ю чу М КУКИ КВ. роду М ч М УАЗ КУАКВ Ач еиюК о уєуєте і Уж ОПЕК се ори дфФІреЖІжі риє боу й зичу у ум ж мими вх у дк ке м ким ин З дох сФіатбісчосика васчпосскаво ззоспсоаосос квусзчоваа дес КМУ іЗай х зи т КОТА лік ечехучм щи Кік иуУв тех ук ие о КЕ схе утік зе о ул сту щит г висота геіоласоссоо ссозосасча зЗсвеКозЗапи сеча ашАССВВОХ У тити ил ву соми Кор ие счсзоеф у, фе ск ічучиїстох фер ичититечі о що кВ діва чих г А стОчазиослаасв паща поиск ІК лави х Краса ЕХ Я каску хх нн А Кю ох ви ж і ся уч і ди: ТУ у - ж су и ди щи се и щи мур дл збої зт діІ снаги сиза ща сих сп гдащО сома п чпспЕааснссчяо сис ЧчЧччвпваКоо поччаавсе ччОсиакмос пах МщБАи
ВІ йргММІ вісчевоаса сатгававос пес вВоОсбвоссівсв детские чай
МАМА МІКУК/ЮИ ВИД хек Ме ХО КУКА ом АКА хе ОА МУМУКУхА м МАМИ ЗА Мод ху ки лм : : : ее уза гри учи ще жу втщииті щедроти уз оз ІВаИч ре дусчзот М куми М рез ев ето З їм щі о. в спа а їі з-д м ДК М пюМУ М У М ОКУ Се УК В МА Ом МИ К ЗК ау ; сах
ТУДИ М іх кожи ух и прич я учити дя сездугрл рих цу МУ ІМ де Фе ел п ї м В АК М ВО ЕМ МА ІК ХАТА З МИТА ди м Му МИ Ум хе : ; . колом тей тре ВМ зе етуч ВВ ух УВІ и су Уїит У ду щире их Вер в Оу шлам МА зах Я УТА Ах о МУКУ щі А или ух САМО М МАСАМ мМ : с стігх
Теж ММ оюезухучіі мч це мок мМречут сте Кухем М ек ретро щи
Мед х м шк рим М БУ щем У З ЕЕ ну БУ ме Ку бом мкА че З З м зви и А феосдружю ую: ях зу им пох я пожити ас жу сли и ва ож и и аву пе и У А ЩА
ЗІЗ В оМ'хщиитихж Волю иню шому УФВ ехо у ик ср цик Ву фу вому УзежІуту КВ АТ ми о СН У ЗІ МммІхТкІ М т А Ко КУ Ії МАКИ НН ТАМ хи ї хм авг чо тт дере ут М у ижих стек В Вуж о узезух В Мо стече в судо різу тече «че Кв и оц ІН хе А чі Ум сх й хи УА ОО її В УКХ У АшТ и З ЩО її щем Мета вес не - х ; : : мок пев мощі Уж сере тичуиміе рух оду УеггдитУТУт М еучихвВ вих тхори ет ех сн МАЮ ЗЕ ПАА ККД КУА ДА И зА Ди ре ра МА ОВУ МАЛИ ММ УА АЮ М Шї ТА ЗК
Ззсзалавсмв сала паста балом иміг тах Ес Вс віп ас ТЕ щх з МАУ ККУ ТМ ТИ Кеті Мои МАТ МУ лм у ем ТА педа віх гідом Кк у и в Я ло мем им тості рили уУєхих сх ух ІМ сміх всем слави Космос шо сКчщк ша пал ЖК призи жВ ІВ у гі л В оежІ М ри сети ех ом о ги пулу сумом Й левом УК лк еч ом од ма
Часова зазипаласео ссесзчеамазикє свасозссласаа возвсооао оса зе уст уеу в В ОБору ут езичомі т лю о схе ут дик М мезихеІ ВО оц ци сі ик миши утуУ ож щи иу цип щачачмин щем ее пиМх а сли ПАК ИКОМУХ, м с Ше Мі Ім тРКІч Зв чщі БІДІ щі Іри Біди фігу и іт Ех Ве гід те це чис васс роза прати чині ласо час о ее чщ пре уУчеи Іще В прю где серии ев ета нку де пи лоту шикеашІ мч хна ол а се шомоза Он а Семак КМ звзсоазовоце соссосточоаЗз зчсезавасча свазсшчсас асчачпця безос мно ос сзазасо стос ава бососпсвасоц взвосапавовс Со озисващч поплоацових 1155 заз єчоос восссавозю застосочоас дасвазвосоаз азовзазасно зааавози 128059 завсосевовкІ сссоссівія асоссвадове свовоокосе восзвктодасве свасвавоцих 1252 пацчссеааасх жів зосвавсоссз савабєоїаїх ссваЕсотУ зкссозсвОсх М чзсвастосзам Сзсчеоавоє тоЗввосчої азваакосфео засос ссопозааа їз їдшчикосоЇ засихає аовскоосооо ксасеосвля зчавазкооочса зсвооссувая 1450 позчковашжу васскстасз давзосвоссо сосввоасоізу дасвзаслає бачок Не хозізасвасх чсвуссзає сапзайсчокис засо св сспссКиЕ за «210515 «2115 1547 «212» ДНК 213» Васіїйи5 5р. «4005 15 вухозаааЗ сови ссова сксвдеаоссте аоФогозоочУ сокасоавзЕ асакоовво о савоссавасс соузоззазсх созсоЄсоссвав зегозосачо зЗовосвиов збавосвсЗЗ 158 зпсзавиюочо скптввзаст обода сотоспаваасос спос созвіватах їі стахіквсяс зкасвассвзу асбтзавазах збої зств поаосстеаєсвоу асо а попсусассас стазссчоаго вадтавсоло ссзсосзазс засовсзочи адеосчасєнко 305 ззаазжфасас озстеоо прчеасговза озсозсосвза зстестаодо звосзосвоснає 50 паза ок Кссосвекоу ассевавусх часооаооаВ сасозсотав зсзееав щи стЕксозає Чуваавсвої ЗссоЧссаоУу вазавсваз віссчавоїва скоса а скібцасуЗса сствассзаа зазсоводоє бевосізсеко ссвосвостя сообватасо 5АВ кзсзхсзосав чозссчоосо застава зозізвачо) спозозоосв Зк сскваш 5 кскзасзєза зазсссаодо сссвасооки сепооїсяке озавасібох зчазессзаце штй зсзовазазу ззвазсаає ссавці а зозопбоваае доз азваво Кбоувзаао ти асовасузсоп азвозсноКЕ сЕччсає вастувлесс пазеоозсуая пазоЗЕозеаоа.
То чоезавоазоаз піачасвосо зва сосок ааеас пабовзаиаки запас аоза 5 застосо посуха пЧкао сзозоусвавс зовссавчов шоссе зуаоснМх ЗО сорсзаззєсо завстсовзавоз зааскавсоз допсссчовос вачоза зов псвісотецеї зво тавутїсшаез павозслпаво весспіайсе зооскіасв Кпсбестцасла єгоскачациа вч твоапалесто поспіх: засечуадеза осзообчасзо зкзаубома овцеозК у ВОаБО ктсаловозатоа іо аво осопцеаавсв ачосповносо ЕКО спосо 11455 озвастосао апіссеаЗзОї часі осо звосаваєсхку звоцеооі «паси 180 азвіІсатовВг сесороттахєбя воскзоаее сзовещизо весла воЯ зва чецоу 1883 скдкажовос зсзчасоскїа зФссзакшсся гайвасовКЕ сова зоба 1з5о чоавтсосзов сбакагозавасх сова зпсвавасосзосЗ зЗабтовосацоа сопичзоакзав пу касу оссЗ Фест аас аосвоссошесч поиасасовоу азавопібесв вової 1445 псзуесчззах ваоссстввх ачосадисєоо соавзекочо асозовкісаек зо оавих іо зоухїавсазвая сазссапаїтс созвозсчесЯ побозакови сто ї547 «2105 16 «2115 1533 «212» ДНК
«213» Рзхепдотопах риїіда «4005 16 сецаачачеї сСзабозкоацо Ксаопаусбова соасеочзсозс аочусставов сабозсаавао 5 соч ач писок Ка ак о сасмуттовуа сп зів ас ес пер 18 зксучостцеа сСазооЧеазча озавсзуЕосо ззазоазасзу сззкасоосв сасзосскаю о пучачеаваоє венах оспоцесесос зоба сововЕ запсстачУє сеча чо вч зпивУ зразки о зсСоавесооа сзчабосокав стос ози вечакімаком Зо
Чесаовоскоу ааосововсосє спасе зе пеорасмнвІа зусаасечко зезчазкакко ЗИ затсаасоудяс сааввцйсквеа Ббосазосво сосзозсасЯ пава срср ее зи звавчови вачеколозаз оавжаоаса:к васоссвавхвас зали созасухивоо 4150 папвсзавківа зчосвоспоска воспесео вче зоссис зпаатаЩасвов сечо савяо За чзссявксспча аскасіозеяе зозавосхину петадчоакіє порох са ко пвх БИ чсисоесасето сзвосссезчя зосзчосакосв вазжоскоцеава зсгазвасчтає зеазопвох и чаппиванит ссефозовос Фазова зчозпвсовоеаЗз пвадоззасво озпеазочаа ТМ часа совос бечассочвіа созасавлсче пупсзаеаао; паз заасвоецдчат ти взвутасосска зсачиосовсЗ ссокзаасча попсавскео бок оцавс спо КЕ совет вчобазвсров ссзаизас слосезооов зчзсопосзос запас тавав що стссвзазіова стзвосодчо спсодшасовау садово сзозсваа ЕЄоЗавоуєва зо ечеутхоті лю ув фіуумили роти ие фору ж і жим пт луєт поту Моя ухих вишу цик пуф ким жом я огуту шессашалое Спека сстачаЄ соска чсяКкочє ач иє ссВнадЯ Ком вом Еш косо соо куасвсачУх чесозсвгацс Соссоксвзс бозбчосоь ваза соо Мово 4 ї. їх ; м се У чча ткзазсссоосо гавсозазчопо ввссосоякс сова касс аоповсозсази песо МК ссвззазавзас осо завс ввассозпеозу звоусчодав сопзодтсвау бок свеоо їх ссххвсозос содостасзс встсорівсв збпоасоЗзаа свзоазовОа содою їеБО зпосозазої засстсвоза авсосзвекаЄ апбостчоавск зовакекаовВ воссоВщо ізо сісзазісду звісзобавь евбссровеє сазеабохсяз содссавтво Фсшесооє 1550 спека тасвосв Спсзсосзсв Євосазпа Ополе сова во ссвокесайо 1430
ХМ тд Ек ота АК Хо Кококу му мими ум ет Хе м и у у и о МКМ. сіїкєнкримІ всччрапсв сзасосчаке саівстоа плаче це ес їщ ссзстасркруа востосоеєк зЗоаабсассто се 1533
Б ах Чтв я 210517 «2115 1533 «212» ДНК «213» Рзепдотопазв зр. «4005 17 пеосчасчасих Сзассакузи Козоассзва сессооссос вофсеосааов сесоваесе БО чачессзасов сучас соска свуспосолоВ со сзазив асасокалое їхо втстасстоЗ сзЗагоадоЗсля зЗазсассссЗ взазозвсзс сзвоасеоов сао осояо 155 зеазеоавастх вчаччависЄ согесукоо Зобаговсов чадпостачче созччвиазс Я щтедемугтдня певен воза в ба дв бід дзпарлаКод Б щечУмаечшимиикУч чини ьм емо зефмимУунАМ Мем ше я чсвовссозз завссдазаса сзплессвоВво сСосссволоча зЗцоазовВока соску з6о часзабсазас завазсоскзча коссазосвез ссзопоз дазслезусі босом яко зазосвсесї ззассозазо зЗаваззсевах вавосезатео сЕсоссикЕх Таз ав чавсвоазваїсая соевссозств зстссотомо взсззоусчсо Човасасвута зоогусео 54
УЖ п; кут Б ОМ ще стучиту г що е у чиж печер живі Меч усу М вух туВіч гц що шли кр мА ММ аква тлЕ м ху ух Ба Ак Мт с чеше МУ З. мно МУ ЗУ КЕ З м
Уже Е рути голе пт ом ту не; ув ретехиху гр ож що ржІ і уч тЕу і щи шими Самка мес «ЕМ їх чЧчсзвВ зоссзавасеК пах вас леза ссавці зигзаг зптаслагакд садові свекор ечіва г ми ех я ММ У кре лим хв УТІК ВАК КІТ М Б МАЯ ше звер дезгтоввих Мі щетК віщо сквер жксгмІд ди сере уро пове тут В ча пмсоЧчасммму соч оскІмА Са Со пвсасеоа фасон ср мал Те ачагассул ша полвк Сопів оЗа арок сосзуЄазчавЕ состав пає же шиї жести ки прут УМщшоО Весь ух В вуду рми ие жеЖ УЖ екБоусзтчуєихичиуух ху возі х АТ скол вчив гато сені пп виФчеК гав ще ук В Межа Моб презеусхоєутух ж ичечіжр ди ЩУ КК ки пути Чех ож М слух Ще уки т имеет м ТЕЖ шиксазаповва соч слоспшєииет пера бепоеива шлю ес тзтхурчЗочов щи ев причи іти ж іч ее летів уєив я Ух их и Кри жу рути списоаззвцаво секассас стидасакас йчеачвамоо ссавлазчекаа песо Як кКоезежечеуму ВК І ехвку сх уМзиов ееж М оее ку у рих вичи КМ ороуу вих що хі что пот мим ВІКУ щ мо ре КК Х У КУ і МеВ КИ ї шию в Я Я ее ке - БІ І и ИиМихиУ Бах Іхитем риє слу и ми ик В ува сих уки их В М ЛУ свиек М ужитку плоту пІвватямнх пвасдаслосс засос сова своео зоасасеккає запас Ка
Ук почи Когут Зо ще уєх ужіІМ мету В мусив фо им ум ово Си ф ух М героя пкт шкала Мем овос вашому млфщеКунрІания до оо їх
УМ ЖК дути тек щи пут дюу ие им у пово узи ми ма т жи же Ву и ус ужити п тихе акищшсос хоча сас вставка апишдесочсеа стат сосазалиояоо я оветгЕМ еще пл Кущ Де кО дивізія сус іч и у щрир иуу з атут
Ме м юю ФМ КОМ Кокс АКТ Юм шуми С. щи ОМ СЕТИ яки пл «МИ до тен: цу в схсхож си зве Ж моражчкту тного ухва рух гг уж лу м УЖ М рів ких их Зої чУчеаацімну жо ваКсссвааз свавасоККе сопла сти 18
ГУК суєти фИитузЕизехЕжЕ Ми кріт ІЧ У Уж отит веж ох РЗеЖтуЖу ІМ мо не КК я Ай чисчсасала спопосспоса ствола опЗ чизчсазоаса сосзозваа спав ач т охо ичучов русі призер чуже ми ері ут т екічр ух ужив ину о перечих прихияі сх щи
Минвімниденч зЗСетекаске стуки сао сити педа Іо симіІкиасьи МКС сис пу їв вич и нн В В НЯ о
ІН МА Я Коса МИХ о хнар пеея я ХНИ тих ЕМО СЧМ ЦК І КХ во
ЩІ ІМ М А цм уже в их гі сукуп фон еУКОо Уже уФ дич ЖУК с ще зщи сЖ Віче уко Зо пзаєлоассяа Кон) чИЧчоаВхсУ запас сова восво по ЧовВКю М
Бус Музи Бу фчути щи У ДУ феииим й схує и Що єм и су ясними жее ор чу М ую ит их Км
ІСІ МКК Хе ККУ поч лі РК З а сим щшиЕ ПВХ УМОХ СУС
Теж йУ В ет еи тжехечуМ Е у у бу из гриеиї В У В Ж ду ух ежу ее иих В ДМ тири М г МК пИимакчмсо пошта вахв спорт подача чоссошцсо сао у то реч ач ери о де етики узи тури х о грехИх В ие фр сечу Ед Ех чл п
М о дан СА уми М МУХИ ях гу ем с ке Іди ЕЕ и и м ІА МИ и Мих ЯК : гол суд
УП ее уже січ руду мухи рух УК почерку ес гер ск в Все Ки:
АМКУ З Кия Б ММ АК Не ви щоку ма МАКОМ тю КАХ Зо тету очі ууиии руч УМ г вич уитихим тик звички ге вІж т х лІгх павсзчосоав авчссковеЯя Ссезсеаоепос шзичзазечи пек же ва яки шефи иа сі фтихвиу тех го Іі цу щити пенею ех УВІ щедрик В ду щих БИ шаеиМиьЕМІиІА ЗОМ ЗишеВнММм щем мМ мли мм сви фощручиї в туге чит ечіІ тів о пек щіичеже вечер ртуті БІ ненні Ка втемчереку ща часкчиписАЩ своя ч вас сор ваччЕ поессосзчапвас ЗНМ ЯЗ повіді дови соціа Ід ду сус дю щи цап пачки меми поса чечриагао спосо ЗСОошечче хау фортвм іт прути тих Ж ощерцрув ми Мотиви сел У гурти ; сивим со сацчс ач ковь сесвузаачекК сеанс пса пас ; : Я ; «муч укщо що пу що М сечу светрі ців ве риф зе где сг оф и соч ММ ім їх т чаша зоазвсасону ачЧоеесавтсо юасчачцс соч окико соц сове іш : ; ; зжуки сепія щече пузечсед туту х Жреретеівужви реве що я КМ пречеччіеМ реже пог ери ще чеасоапозчачи вола с чаВослча стае ВЧ МКУХ се Ввассстасхуу ТщС трест кМ ом схов Мехеі Мом ртечичтиді Боб ссто рез еу в и Міззтут тиви сут В щем пат чав сс Запаси ЗСУ Аия поста Ком сосок Ввоссаасмса Ме кед стіІ плин скине пісна ссання да БК «На - ШЕ мм иа ІМ ЕВ. Бе ОКУ ЕВ АКТЯ МИ МЕМ ех мі МО учи ТИВ вве мин ццг спаси гагемн дв если саВ сзпсашлавди Еталон ЗЕ сметана яна КН И с Коса сома А ОС ОН КАМЕНІ ХНА по свіду пу щрихичетет ци пр вот івит Мч ние чуми ІК ето муж МО ме еойе ужех тпм стик чзвсвиає зссоусавачо асист дол шек ше чксото ЗК и дерти і см р Бузижв щих сере г пре В озеро потр чехи дих ете са лем
Мод уми Я ие МАТИМЕ мери Ох М КІМ ЕК ЛК І ут ни КВАС А ук у ех веаквеи р 4 ; ; че гу КИ сі Мои сл Мт МІ вич етмх смздіІБ чином ЖУКИ ТА
КАН М ЗУ шими м у мом ух З МК и щ за я че серии ха ЕЕНАЕН Мед КІ отим тки х щЕки гчеч віри (мезгу мотив охо каміні ж фкиречехе ин: Уж у В мувхетум чіпа ще щЩ спас З ре Вл Кр КМУ в ще ее пий чив ЯКИХ ба кА КАС МО Нм ре Ач фосехміхм Ме к гу см освудм м ихемим безе своих со ги гуУ Вії зими ииих КІВІ еВ В ЗК послами ство х созачиатпаваа вагу чик сви МІК КАХ. АВМ сУіз ува у тіж ие у В и гриву В фосфору кді сити де вух І сша щащмиИ лю са КН ЕЕ Кр ма МН ОТ ак шо У се сини муру с уч фу М мати и ее що св им пи иа в и М и у их сих п
Не одури цих зді злу ці. з ижр М му З печі З пи т: їз и Ех ет ї х щоками ЖАЄ Я - ОЕМ чачЕаЗсм г З її Бе АК М ВУ шк МУ г. н що н - м гіуж яки сур М зом щу Ме Бу озиуозеничи ще ухичучи М ее рих зо Мер тт й
З Ви МАМА пи куки І КД КВ Я Ку пи ку с ЦЕ УК хек ЯМІ ІЗ 5 У хау : а ких поч в ук сет ув ух М Мои гц тем ді хору ичих сг мех Ки шо Моя с чем МЕ ча куме ав с ширми КАК М яма ю : с яд грек вузу пд ех мри и ги ВМ т меми ЕМ хх У
У оветупау Ба тжи УМ туту Я уз презтуо ри речей ечузгіет сект оті Кк івдую о тд мо щщеук а
Спа МА ХМК спр НЯ я пар м чо шма єс око Ма чув Беж ерщоит я гук орех о КВ ція гмчеррзУжикочгя ме с тк дих У ту ная с що мА МУ АДМ ХУ М й Ме п че й Ор мА хі их ж геежі кут М горе схе М ЖК ух сш Кк стежу М до щу ет оте Ве притч що вет гіутд У ЩІ пед о у у Ми ча А КК ХОДІ щ КОМА Є щомиті еВ М КК в Ек кУ Ам шою Вокер кчкхуі стежити щі оз вліт свгжущеететізіе му ре б очі вору уми заг акти Клімова сослвь форс воно КІСОК кю шк ОБУ рікою веж гама А ек Кор м ВІК ОюЮ дру Коста СМ грщовиеі дез гіи Бсздргрг теме меті ви ик В оригі дв ЗАГ виш асацу со ссмм віки кДж слалом ли 5о піт Кеті езури Ії ІзетІІ пек ув ехо щих дру ихих сер ю у щих ечд А медик оди АК а Мо ти и. В ТИ Щ КОДАМ Я ОМ Ах р Б и Ки м а СЕМ ММ Тк хю гудодттужЕ ух, туту у и су рук ожило мі зи их ще ми чех зи чаш с спон слодемь пло спас зачав пато дека ИЯИХ а ї м дю пика гео ее де ду рр щев ДЕМО К БАЧ зисповссза срсовсспоа зЗавозвазчосое соло весно уся жи 1: у моу де 4 5 леї и пп ще ет гг ощадні В гахензчмК о шими ДІМ НО атвстуноч писанок щосопзак ве чо жа с печемо Мих пасиву ем их фор ом лес о узори утус В оз из Мч во их ск жилої Бек уд мА
ЖК З п ок ссечцс семою ппеощчкУш шоку яс сети шх : і зсгух ет ее зх воух о пре доб жф см тт суті сего бас дтідІВої см ау сухе диня паті щфріщі ср ТЕ сао свое смак чпавпмсакм паса ют Вес тоеЗ са ся тує Я ее ї х мої их дю ххх кач у че дужу зга из усу та ех изееВ січе ден пиво моти зх си сЗМмчх ото спас іі заВшасоших сщчеоаавосНнх о МеМче пеки Миша ща з За Му уже сві лі їх пет в пух В пу чеетняКщІї Бсмощш т ЗІ цщинАа Е тущіІ те дія, щ КІ Ка х4 п шал овеацІ ше оемАЄ молю кешью дис емх о юми шжх відчув ву макс чол зЗааиЕ бадмаивВиа спис сопе В ал
КАТАТИ ЕВ КО Микита ч ВУЛ ММ дк ФК ді Куди КОМЕТИ ІА ІЙ ААУ они зечежт се ха ді хро висадці дело щтоКи ступи щи вен'яде ак З В З щи шир сих КА ОД З с МК Ма ка АХ си ТЯ ся : п : ех м о ти січ су у сумо отих тут ще прес еж и тжщу в чув Бей З зчсіпазісс ззвасаасзчое звазазееу оозаВуоу умов опссс повасксскох Аж ма сш . : . че сг лусок век у и схемі ик уіпичвихежі ур хе М тив с тв В ЕМ р хм вдача мим чУуєЄ ке «У щини соми ІСЧИЯК ше х ки їм
Меакімуксдсв КОВЕмлентккиа доизосмоусвш сода бсктосдеК висо тай
МКМ рми М ФК КУКА муки а маю мА у ее ОА шоку сг ж пек пгт фл КІдІ дае смс МЯКІ тп щен ІЧ ІК ФАТА МАУ МЕД АВ С часа сраки Клдоах зкевадтдЕ сдісчетмУвь вищення Едді вінІв водо ватсня ге пили тай
КОКО Ул. МАЄ МУмиМики М шк хі І КУ МКМ АЮ ШИ ОО ЕКОН А че схеми еВ Ак М сутуттісучіи ферит вести схе адордфеи Муха Кто ТА «Фан а вижшчкочвоаави зчадоссавос спвсстазецс СЗЗ КУ мтк вих ких ких пихи тече ик их тупу цу чи щ их що щу гзиусхухучІВ цех дм ие ижо у щі цоипсечьясо сепсстзсано ваадкоссааех пасловчиаВсу сзссцассВОа спаси С : у сл : чи жскулущ й ще чи Я ие ери Я 0 жилу щу ех ут дув и Зевс пд викх А пива пп чаиоМе че оВшласер см Соя сВИи сощде ач баса мах селі ект я гхечеК пі цухухуви зл дьчУх в лЬСТи иїсчкеогиехухВ В Фе уже мих сті Вухо ії зтзазссвча ззчаассс сеча чоес вссзссова сззсмразсвоЗ вони АаМУ фужер рик у пря те пуєти вчетверо ким МК ЗКУ спіпавчисоса йсочесокато погас пасок час ЗД ЛЬЯХ
- г з. ї КУ - г сюожю й сен М о сяк с ж У фоизуижеувІмо и Мт ук узи Вуз ттиу хдУ ц. пихи єжехууитих «Ж рути пу дю ці. У же Едіт Ії
Мосопдпасашє писк Копчена смак бчсстався ово ЧК ее - Ве - ї х м с се з ОХ уч - - - Кк щ 2 ск оту гідгечч щі ви авг о Бери вив оркгі птув Мозореуму бер І цІ дет НОЖІ асп жасо звичок щетина попки уки кре Ак зппопсаалесл сс зЗзищдщодо Косповспайс сопло слаащемл сала слона тай
Б З її ТАСАПИ Мох хо ро КЕ Ком ГЗ5 Я м Ат ОсСо З І ва щік Бо Своя аа х що І ча ВИ я ввккнееєво палала пд рда Бон Меч Макет Мщо це б сети зай
ВИМИ КККс схе сирени мМ ЧЕМ Сл ша «я зхичижи Мч Во суч ме вжи Мсрлружочіщее ктих і ие ве сіру и М БІ их злим зсечоеКк все о счаспчиао дев ец зов Ве а фо сизим жк ежожемІх ММ и вже кух ах щи ги ти Хот ехои ТК поляна восччсосВсов Са с р ану зчссо ачискотошо краєм 2 сажі мг пи ризи ехсв пу сегугу ев ди ху ем щетини ож и ех али зисаччоаа шососопсвах чок ссозасчеє аа Зк В ше ва ше чуми В в хчежемім Му иКе гул и вуж в фу тих суху щи М ву пу опручз суми тво и пу Я уч БАЯН шим еа соч спла айс зосвВ Зразок Все комх Ж пу УМ В вдів щих меми СусудЗ холери Уже ль ІМ дом Жоижезех умер хе иммиу сІВЇ ща азшсуссмн сассізасса Ччазааосвосп чобавастална зососвасазчо сне иа де
Згоди М дух чу Ду В ВО сети уУ В ут хижа ги ВОВК аг що к ау шень НК Зах че ХНН ЕХ Ка ВИС
ІК УТ ИТИ МОМ глузд ечихую Мік дув оз ВО убох о див их чут де Мч ще
ТА. хи У У з ОМА Бе А А Ку М б ААУ чо зам Уу чт ЗЕ М ЩУшІ УТ У Бо ро щи Б МІ шк сук стече ж те гтІІЗ пос гігу Фу озеро Мету хичж т чек ув дрів учи ср ше мм мч х шу ем НВ. М ши В и а п МУ призу іі ииу сухих ит МНЕ Сорт В у ук зіву уд и уроки ІІ УХ и ВМ гук пе вивч спас ох що щяо ОО А З НН ВІ п х З ЗО БО су их ІЗ М щи кг мив ириу В пф узіуттужмтутук в сіту пути ев я и сво и їх ях пасе шо пМхХ ше вІ Мо пасли салон сижочЯ сао ГЕНИ пас Кави гу ЕІ мук ух ВІК призи кі ос ВИ ту из жуту густо щук мух си
М о мозн прю хек у ДИ М КІ УЮ ХІМ МАМ и І чем и теми Ів ут це ех уж ЖеХІВ ЗУ ли учити им п Ким и Ж иа в у в тую тав осла сонне сковза БосдавзисчаМ спаси Ви їз звУсаО Ку Ве шими піміВ жчсавецстла зе са СЕ емУу їз) свассгв 8 ічЧЕКе прщоК оце М ухучуч их Вогеумує утручеч лют циКеОо гжрицизеув іжежі о кре ужив у уєуфеезлремем фути Ол
МЕМ У ре шко ср ІК сс рН ЗИ ПЕ Тсих МОЄ маки Ідова МІ уче вої дж ери сірих дих жи б ужщ В ВО су гугтузсвІч и тла еще М І чиете а ОА КК вок расою Ох и ПЕ СКДМЧА ТЕ мае рю ою озіуеж в муху ри щу и у щу ех в ижимих РМ сих лити ижиж ие на и Фут и В фл мих вач шко сс ад са ТІ спасає спасе Іі ди НН аККкаМмикас чечоссоавч чоло зона сваасо завоача чаш оОогс ми слані пт фбодІмб ни Балі Кіт Без ліц Кг ешнащусияміІ ВС иИгКиКаВ Соч паса сома Карр Ак ехо уФи цу сі ач м щире омовІуй их гом ло мем «ог орки М ех схемі ук св еит Оу питна пожхнеокс вачоесватос свзіажлавосв СОосссВсос повз оя Кк аг ик веевщ сів рі що гг В меру ее и заг ше и м спа чи поКке овен Спок сор Мак шоп руху в ж іч утивиМЕ В фо прикус риних між и пово ДАІ В вну опори ткож чат амоВвосчИтОос сапчоси зозвсвшочос ешсоловссв «моно КОо башолоссВ АК печі е узи утх са ква Коуза тім Ки Вкотре ех зн шашок сь см Соки БИК НяК Земна ис АСВ КІ але сет ев под пече пирій луечеУєкіі Ки сумом тує дк руку и чи ща иВ маш кис се спимах шим ал щодо селі оо зх ках сф узи еу ому принести иукю сти скупі В сум пек 2
Зак Бета Єссзазиоша сміху же ха ІМК х «з
Учех хе де о ще ВореутктітК ОЇ Же прижехухужи взирІоІуЕ ив:ів е В щоці о ик В пути кує кл «очи нт Зоо Оси зало шов Зола Ак
Уві хгщеі ре асист Зо иї: Де цар оз це ВІ в отче вх їщми
УХА АВ МЕ МА СА МК Кока. ему у сш ОМ Ух вВУКЕМУХЬ МІХ ТЯ ХМ. зек мА и МАХИ А "стою У М доц щи Др що ухухух ВО Овід щих деузиии жу уту УВО Воду вух ЗА сами с мав сщЕохуІ меча пек его ет сах я У жоБестеоздеие соус ечечую вих тд иіт их Фет ричні грузи фс щууУт и уч ие, З ккчсачаечи завУчеассвос савоссови З свскс Заосиаа МК М течі Метеор ичих. Мухи и вхі схе згретухит гру че ст М щем Ки З, я А КК М м АЮ ША й ами х ре) МКУ Змови ми У й «мам Ме З МУ с Б чок ОМ УКХ ММ
Умій сту ехи оче ву І где ех оо у ес гуд т Мет ух о сфер М Ку о ал сему АСОМ км юю А тв МА міх МК ММ М МАК КО печу УМ М еретту дих Кк о Боже пет езщі дет сте щих М ди дих и щі шлд м юю Б мох А я М Б З Мо мА А М ЕХ ре - МАМУ У МАМУ мм ОМ ОМ що ою желе греаф тихим «ет дв ові КК веж т й гг сус муж чут еще Во ії сут щокою цап шесацосецому щечееакано чес оч валок сцксой заз саски заслано я пвж Кг вт уиМ сел ек ов кед етТл М гр ух даси УК еоа щи" ку тиж В - щі ше ОрОхЕм см ям М ще ар и Б шк р КО ще екз ласку аку е емо КежемІвО рек ІВтЯ спр м ех Уж У обоз ие мери уж ех щі
Мои шести сз осв очасвт збила соус о весла Ви
Фоутгичиук преуївомов ОК пустив с Б соки вих сиру Во ф жуком ори двух лету счосчивсвов Среда спвбславчзос заз попка сто Сас жи тримача г Імів щі узехК темі пес ге уУєх що м чеуК свсми М ІхУж ж вик ємо пюрзивичечІ В ох М еф міІма есе ея зош сасю поса шпик шеЯсСс ках о ен АН Но в АН путі пр чик Музики ож ую тзичзежеіу юю в рим ІМ сиг «ато са ишкащия зош со еко соц ашочав па МК щур ихухтжетий у: віку учи фу щпивК М щури ртіох ло уже у их речи уривок ТаєУїї
Щек чок МІНИ пе ИмаЕей БМ а ВІ РО рН шо дові музею тво ВжМ щих гурт схуд в вив У ет МіІч ох Ух її спвзиасвтгстяя зисгакичсчак ссдшесоаа Зала час ОБОВ йщМ пом или М су о ЯіІвІтеМевьЬ хижих о пр лпрезеж і Уч щу шум и М ик приколи тжежіх ІМ жу злу акпоосстчза свлочозосвя зи зчаво спосо сСезчо;ааласа пап овт їйк сх у ик вхо су ик кв умо ефе ее КМ МО фжежух сіре ух живі щих шхохех лу див Зп иМ пасе Вп ссчик чола паса доза спади мими пе ВЕ сфе Мо си лричеміх В ОБО цекКЕ о сжугяуліх Во щргую ехсвех йУК схухутуєучивик с Вовщимиеуєтежі Аг п ОМ К СИМ хр матом хебокс роки сгрІрсо кави ач
Фчдеді тими ут ДУТИ ехо позі Б ум дути фам р жу ух Кодреустужуєя ще сим ук щих ж лила я щщеміІ мим луски спала Є иКи пилу шу КИ о ач
ДР іт ивІМиУ й дозу ик див Ки ДОВ зам жду узи кІЗІЖУХЄ злі ІЙ учи Пугеогл Ел М ухужию т Зщи
Ср меч ОВК АКТ па ОКОМ СІРІ. одяРшЬ ЗЛИМ М СНУ їі-шВ
ДФ М рути Я їх ФМ дротики і ув у що ічехуєуАюмоцих Вохжуи щи восжех о щи В сум лу У УВ фе міч ту с ЗУ
МК иа М ря часи сима емо виш чКице неси т вас зозаах ХК злет щи иа суду и КІВІ Во КВ ж чих м Ж УМ еВ о М пити их и жом ки ще аж ух етики пачки «синяк смс «мно пал п КВ мх їх ри гуру вір гг евт езия фтв жі щодо крб сжужіві фуру пк зику З й ді чисУуЧианиа соссавакшс шкаф сас пос ооворокмннуом ваших Ак жду уУВО В ем реє У и Воіхіутти шт при зу ги В им В фути же чар в ж ту ит їх З щих печити зп сВаосо Уенасаачана поса вессосицю ЕМ Вих. ім пи я ч«ї хх
СУК ТКУ
«етику си Мих щити М меж ее М ее дет ді туга ци пишучи чив Мо 3 шакищше маска зош мете ех дтп одов сопло пЗигббозпосли адм спосо а влпссапив ЗИ пшачичжсвч Чапек чемно шлам мире шефи ще Кк зе МмичвиМ Кафе езимзсмз Боня вид Кизим Коти Как ця зві вишкчсеско садкосессча сеаснасосо вадою песо секс я спина системно селен т бика дивастьУ Сало х салі ай полоевсчаавих чОасопаоКо сороки щас Мови ВК «вх сизк кс отні Зк песадлсса сзатсеазсаа сіЗабогслваз впав засса НН стек мчкчоа чав ус шОцея соч щепи попа Ме при дегомч де Бствеиг бемЗМомдІві МІК дич смс спи Ж БІ З вра уки МІУ Ух А М УМ АКТ КК дае а ЕЕ доку ху мА м Отит я го Ки мачо фбсмезщереетмй г стру ет ге дет ОБ КІ й
МАК а АВМ КАМ з МАМО У ІДЕ АД І КУ КИ А ОО М лети пет емчетих боргах дугу дво смути В БІД В дит, а В вази ар сбочазо чавчоасєсво зосссмавКаю смлочоВвуЄиХ по вищими а суч УА и жовті сви в кеВ уми гак виз изииж сн вузом уже жВ су й ее Аг звозслзаїав посмшногоачеха вот ицпещос зим моо срок З шов ЯМ
М вечер в цпручі уче туф хутрі г пресу ти В оБучфан шив Во зе Ки сх их п чула кошив ил о пкаваазооЄє ссср Сину счацче жагуче ще
Ура и ук жи им єез лугах мити т ІЗ Убити «лір ум уУЄІ ВИ єжум У пе лу пе вежу м '
Меси свое а Все савіна вагони орли Вих чеком рам пре куєх іі о узі уже у в из гріє іму КЕ пев ох мир о ежоМіхІмУТІФІ ЛИ» зх же пл щи КАМ ЦІ Бе ки ХА Микита СЕК А К аВ М кіл КУА Не сек В т сетер Кеди д сб ді Кіїй зефіру чт семсівІо вада ти
Фжчсчастако Буша Клас кена зірвано сіла Вес КМ ох 15 пера К дети туго успі ку ге дози МІ КІчУДдДиИСМТ дір їз КІМ че Іде вай
Те КІМ у Ух кх мі БУ ква МАН ОА дю у ие Мои чхх З хе Мч 5. 5. а : х як що грим боту сухоти реє В вів Бе щи ее шюу гзизичех З стор Їх ф щит ечутечи що Ко що щі тузомеесо звоксавочивВ сСсашупени «сни чноя своє звочКсзава. жо сф ківі Кос осииуих гу ии ВЕ мих сті ВК ев в що СК чер зи топа вав. кай пицпасечочаЗО сосен Со пізашее я аА КС юВ зе
Кк ие кв ат тн Я фс жа ик сю ж свити В ую вижити ки «3 ож ув и у ри Ж и и жи в ки их я огулут
Ухиричи ж пихи ти кут ОК уд ут куки щу ит чі щу цу ль ххх еже В ти ТТ скрозашнащОо Село сон емм Кеті КЕ чеачвоак кими мам
: ; кла ; : лов
Форзгритут повіти щедру схе ачек щити Мр екв судуєчуя Восхт свунеув ся пчщетжВ Ме гттї ЕН кичччеасих вача всаччс ср ес сам поши ОВК КО АМС
ФМ дуліюкй чути В цоичУч ее сх путасу ві ач фо пред в суєти пуху у ужитих СТ оку ух ит и ух лах
ВМ дере чих др ик у ї - зи М кт я ЕТО дує пити узи УМ еуртитиях у НН
КОТАМИ МК МУКАХ Пі шк її мед ме ХХ ЗК Мих В щу ЗЛО ще втллу с ше Ям до М
Магда сте хутит чо що чоготиии дусрерМ утиее свинка ци щу ре ух позна ет ме Брате щиро т Я шчачщшлю сю мк хм . ; : яосрикмох тУКоюдуухижужуєлу Бус чич і плесо чі демо Керехі схожу пух фттцьстерсие жим гзовухІм осв ехо ТО чемно сацоасваосЗ соло став СЗЗ сас зоасччКеоЗм сао жк іга тмеуст веж ом о сурімі схилу рем грек ехуетоу ую ом МУ У жим УК ехо рих вчи чинити вакспссалчава влочаенаии зе со ша сє СИС око фідер вв пре етщі піа діт чя туди доме ОВ учет там
МИ от іі ху тд КУХОМ І пу цЮі МА НУО ХАІ З АК І ТІ у Кл СХ Ми вв візу цих січе кчч ЕЕ и пути ув же боги див их гущу де віях Ве В у ом руху ам пПлематвся апуенлЕМьІММх вихов лімчяЯ Сім тЄ лекс своем гато ЧЕ
У имижетем ми ие В и фу ж М из ріку В уроки фетчих иа чий яким усе УМСВ: гі у х щих сксзшнлаше поча совс зач взропалечцср орав пови АХ вчи січі че ічузувии в т фр Кін В я щу соч СНУ КОВИХ МКХ АХ х юю утиу туту тьм Ма еуту у Ми гот Усух акме ським Іжа учи межі Ум су 0 Я зх г М жим ях сг Ух шсссчазовоа сгговісЗ зессслвазчасо вас зЗосокалоесва савсаосВа З и фази усхомія пет УВО жі ф мим в сю фе дру ву М тую оче уж уж им кити юки м Зх ахшеа сс мнІ Фев саке пази ско ао су А пре тте уиВВ пх щучичежВ сечі сусід рухи ох по че Жучу Ей іфІВІнЯ те их гц пре жечуєих заг
Уч ЯК с ще виш ко ХаачН ги щ КІОСК салом Ме с ота зу ут и рф ох щи Мо Мо буму М рим м їм жо шок я ту путі ему сус в иутуих фе Же и: сужиаміф що тд созакзссч зва СККК пиАСКОСсВКа Чодпавалесо зававастасеи опе кА пут сумо Між охуихизиитіих фх уми М фот М лу їх жа ср УЖ Ж М му ил кими кохдоу их му тету я тогіїї сзвоихеалазча гро ссоЧсо Фозозикало свое спас басовация ЯН пуху учузу В о ут уєщи им ик ФеІвуУрНаКМ МК Жири ух в у УМ ох УжУЖ Му В чу МУ Ж Ух им реж им им ик М чашу самок рос ов рам мімає часам т Я МОВУ к часам соус няя щи
Ух Ж узи Лучук Е ІМС ИЛЬІЮ ІмМ лзечсурх ую М жи мо муж лу м и рф и мо мк юю тю кит, лю хі сесосевтщчса зпадчовоаМх ачезавикх ссосзвІзча соаваачсо взочоаЗсаве ки ге ги Ківш ср ци Бичок фофогч м комету поем сх ух у пу ех пл
А ну У дош сопла ав аЗВю Кок спаси лоза Б до ож М отлгоК соотер стетух щи о М ру де ду учи кути свои их М ло лу ож порожня кт сита Мощчак звЕаслчссчово спосо Фолс плечем МмиІ пава За
ЗІЗ їзІжгі Кут Із Кофти стр в уже жу М др вижив що луги Олег, пови ея состава о З сво шчччова чЧичсКчио аа За ч Зипчсвавтиц вом ее гееутовия ев Бі г ні луги в суще уті ою сторо ую п шамиИсея поса з посла ссчав вчи сосВсЯ состава в ЯК КЕ Ве тістових сти Іл гумі х оч ще К ит Кучеренко «три лу ль ТЕГУ мая па му М па ще З ран тт ДОД ХХ вах пила щи я що МА аа Ко.
У і : сш . : : сію тувчежф соти о прі сухі свт щивк схили хучех ую Фокс свои пре рути КІ
Ока чиє вес фс сереое Демо КОКС и ша г кутку учУ ме пу УС і Му г м сі КК метр тс Я утужіх му ку реф чек о моих пах чЧасОосмаяя висо цеча фрак. зу х. са осса самих айке я тата вежі ож прхіж в УМ ще хх Мом ужехаомує ги Біо еи фсхуу и візит си о іч м їз
Чака сс зсшкассачо сан соска сзпвачесао зосзсиваЗоя ВМО ті узі и зи го пе зерете тури льоту срсу ух грилі М гугвуУєУТує гісуг жу у звик их пат
ІНОЗ сп ом попа сис зви хшвина спи опа я роко Я
Іс хоІтохухВ тиви УВУ и ОО ЯМеж Во зе овІх КУ тумтхухучуєтщт ки В гуму в ек еф ци м зач ша павич киш омммат сади чо мо чтІзссв счсЕиася І як жи слати, дихати си ис ще Десною. о - ра і ую аж джу уч та их, т ж ди С жи зм фета Може ом луив учи пмтзліжуцу бив йо яче В В уч ории кит еуітж ви тугу Віхи птицю хм пішки чо нота ца а дао МК КМАК іч сзпаЧче у мис ср ОТ
Уже гук ет ох дугу гук ем гру УМ схе М ск ух (оз гуу діви оу вжи ори В т шу о Й шессчкцеК чесне пи АВОК КО З СО у У су Я ах Мч ожухм ох ще о кукі Ех в и ее а нн не о и м и о м а п т и нн и ж цвцааСушачми зосечосакиа Всем смак поети сао Аж ухів сь ММ стетутхіх ВК ерщІзиккомоз пу щі б міх ри рхфмум фі ср ежіх ух фУК гуєжежеує Ву еМив узи ев вух зок пазвстччус на восасикхиаво вав спасзИи спосо соч ошиояов сампчеол їм пкт КІВ сети тржумІо реве вещочеВсуцщеУх мщрф очеищеиу зожец вн ч35зй аассчамик сша оса щсссо перо пе Уюнися махи М Ак умові в езектув о фіг цзтуУєє ВК ухилу е в ухили и пів й У уч У піша мус циУ Мо изиуєчуох у 5:
М щих З Мак очок азс З АХА ЧАЦУ а сх ЩОСЬ ЕС сх са Але поси люк ижуюим о джеми жу мо язик ф ух уп имиривею мм ум жур сову пів ожутуй уко пущу и ІІ ИЧИХ у тайм тсачсзмосс посаг озвся спеки мшитосКмл яму мІнеКи стос УОХ КН п ча а ач и А НН зи ща ЖЕ ча посодавао зЗопгиаслчав мисок соми спа ау ЇМ шунт мов гул В фу ушу фжІМ УЖ их ке З щи мучив у их КУ ВІХу Й ул г УТ В год ух зв киашлюгіІма и пз саашоєс зба нанксх верхи вес очам КОАТУУ ях
У жені З фоклиуввї. ЕН
КА ХК шихти учив уми ехо жІВ беру секту ЖК оручи і ту УТ ці. кт схе щи их ді астчасЗвишЕ пове щи пишна сива спина шеЧрставка ска Фо гідри дк щи Безу к учижучич сет М Ме схе вічі грузи щуки г чачицанисл ви кеащея Кс шив мопс СА ж дфукпуже віді уже чести Бери ціх пу хи рих тн ери сце ах ЗЕ час чім БК ові ДИ аа ККУ Бе
Я цричичеттти цу щі печу щі Ма щи М Мч счеерузмтизего льки кт скучив пат сс щоема сСсвзсшещак сучки я чав о ммс мл сша З еощучУт ВІЧІ Ухухтж уретриту путі Мо вт хутір мох песретухух й льоз: міфи щік ож НН сазопвисзчачсє ссопсзчоечов піч скваих чека сччасав аа вжи ме тугчечі уггі гу ух щетщ фітщ ок зріст горе фе стікери вотум І псасвилича Чопа чачас сла Кицпсша сич асК спимо занос смМух ху м ехо сет реустріВ К кехих що м жиру Му ск Кетле тхори ан зсоалашзоосВ чоло асччна вес оссвВсв Зола зона спайс У хі схоче ду гм сах (чик ех сущим уко ож сзуук ухилі у тхір хехІ дм
М зап м атеик Мом сао иавачя пис со сома са в АК сеї одер и ки их КО еВ мото си уЕ ІЕЕ у и зіЗ:ж щі Мк У пут кех В щи УК ОО ум ри уж у й пусті БУКВ чего син смакова рочок ПИКА тутсхетжржутужуч В і Коул уУ Фмге цу В їн Уух о Воизехужуєду Ов ом 0 фо Місузиуємух В пух латте: г
Моска худ мі СКИД МАЯК стае І А МО АТМ КК ок МОДУ МА КТ Коул Я хе ик ВОІВ им кі Уж соц лулрожаумимих презежучив М дрідимо учу в вики св фу ліІ я ФО си аіча капс стос емоцБемах штат сита Ех я вузів судо сви дум где стих фже цу дбає тпм
МА ММАТЬ М. Мої. ХІД Мо ІК тат ДІІТ Бак ем одер у кА ик би п де щоМ руту щу сег Крим М ее и ОМ овуич ве М гід хво М ву ри их ил шешОмуиаМ рам мк с ще за ам о ше ииаМ Удачи Не морсу їх сере сего сих іЯ ер дви ожив щу Когут ризик вс ие В гів пд кала У ча пк» я шпозухачах ЗЛИМ ЧиКкат ск ше ях задо М ЩА шяУ гас од кату ВО ріг ВОМ фзучеху В УК уд КВ чули ІТИ дів помити фхутужих сг шим Мх сові ю «(мм сспоМме ФфудосмиМмиас взасос вою ю ми тк тези хе узи жук Мч дющи ек ях еле 13 МЕ ОМ гм сізежужучУТИТИМеІх су щ ІІІ ІМ ТК хе АТАК АТ ОМ пгиаасли дачах ОЦЯ МИКХх» УМА ку ПІ я друку ТУМ ІК рута В м ух, Уже уз их щих (Имя ге Кг мих зи ема М М МАМ М М За Ах Я дача ета МНК. м ДК КИ и КУ см уж у мпутИи М щу ее щи ж шу М чих фу и ифричрк ух вжи ям и рми и їх скан зх В уми му треку
ОЧАМИ КОТ СММИА ХК М ЗКУ СОМИ а али Мих У МУМ У МЕ МІН че го учи МІВ о ких фу кеВ о дике окис сем дис и пе фік хм злак поема Кк аця Ями рова сир КК с МАУ що сх : - х до дих ях холку зт ух р ум я прі 5 ик вот (оих ем у п ххоВож щи уми ПК ІУднлд ПЕС ИЦТТ В сг засто сслявис апсоавчоиа зовишклиускиаа осмис Чо вочамао ЧК цеТУх Ко пішки В жити втчсвсвіІч уч вим уж рурхахмиУМ В о возом е гутжухеє М дтхдезцюит ку тк уми ще ту З ї й чччвксмакя пизачесчм Кошик СЕМ лк ВІ О а ня Ор вия - : : а к х м. г. і алу в ник прозові пиву: щих те тре вет т ди гр. і Вуду вм м сива ЗОЗ ва Же шеф ре ще шашки ПЕ ех ХА я МУХА фТЮ МАТ АНЯ ї ї х х 5 у і. 1 фея КЕ их пух лам сич іх стук и ковими ик вжив чив км жук дежфови іму емч дув ие а ї ї чав соачоа стдсавостов пом асавюоча есе сучок Ю супе хв ХНУ скиту М у вими сере укже и ето ще оуса ето гер із мовідо Мачоорщдевв в тд плести зво сОаопсмсх вствумссцостс сус ман є я МУ : . : :. : . я кит с пуф стихи що сут ох в ев щоки коту тосту уж уви хе оцоцрию су уд НН ставах ЕЕ чаш МК указ га поет сСоссссно т чсачовшах ему : я шлях «жопу М іти я пос еч М уче уми парео щих все ЖжІвоВІуки фс и у г ЖКрздрухи в еч НН: ща х зчсЧчї ваз Ккилквас засос осм Сапа біс ЕОМ УМ : тк х ке там и он а чан "а
Макух ел А З МИ Ку и; учи ижежові В Мих ву У Во ри М
Мем ВЧ КЕН и
«2105» 27 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 27 пак сватає себшвосеВх й «2105» 28 «211519 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 28 ставі осоас свои її «2105» 29 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 29
Каочопив візовому ви -2105» 30 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220»
Зо «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 30 шпиштасовоцм соски ати ке -2105 31 «2115 25 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 31 пох зсве аваопасазваї соава 5 «2105 32 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 32 пЕДЕЖНОМУИИК сао оебала а -2105» 33 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 33 ччешскЕаох сосЕбвуЗо жо «2105» 34
«2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 34 шесавакісе сови осв ши 2105 35 «2115 21 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 35 соеспаталзча ПИСК ох хі -2105» 36 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 36 ствсозовикк соавсоосвов а -2105 37 «2115» 29 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер
Зо «4005» 37 сказ всакта гзахкєвевий баввачекой я -2105» 38 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 38 стдоЗивіи саосписпвов ж 2105» 39 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 39 виш ЗО Ка «2105» 40 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 40
СИМ КНОсСВВ щшащЕ ІЗ М жи «2105» 41 «2115» 20
«2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 41 часзвацетс сгссчодазе о «2105» 42 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 42 вайчосацоммІ шовк 23 «210» 43 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 43 савасссцецє паоаавосшее о «210» 44 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 44 зо чавзакаювч спписачоі а КН «210» 45 «2115 21 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 45 чзчсзсЕслосе соспавачак Є І «210» 46 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 46 «сосчоигЕсво зоповацеяв а «2105» 47 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 47 сцазозаИсї звасссвававо КО «2105» 48 «2115» 20 «212» ДНК бо
213» Штучна послідовність «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 48 сао зоспавсва З о «210» 49 «211519 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 49 сксзстоаї все ох їз 2105 50 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 50 «2105 51 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 51
Зо «2105 52 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 52 -2105 53 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 53 зопзвоисоркоа зпвчоазчавоЕ 2 «210» 54 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 54 2105 55 «2115 22 «212» ДНК
213» Штучна послідовність «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 55 сгзсвзосвкв Сочава сват ва ах «2105 56 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 56 «2105» 57 «2115» 24 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 57 шидчасавих свое КиК со КЕ: -2105 58 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 58 ствсосахх сзосцета са о
Зо 2105 59 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 59 зкгкЕвЕсочої ссосесодау ку 2105» 60 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 60 митна СКК сша ге «2105 61 «211518 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 61 часа З сіпсукса їв «2105» 62 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність
«223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 62 тиставцикоч оссвУсКп ке -2105» 63 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 63 «210» 64 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 64 хемІ хо ик. СОКАХ ь; -2105 65 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 65 чкссдазвозпат зчавосскко й -2105» 66
Зо «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 66 «2105» 67 «211519 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 67 зкоссозусацз сопе 15 -2105» 68 «211527 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 68 2105» 69 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220»
«223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 69 чотсвасскоЗ Факс Кї «210» 70 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 70 «2105 71 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 71 ссдазоуава спас ова я «2105 72 «2115 22 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 72 сої оаксе звезсзакова за й «2105» 73 «2115» 20
Зо «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 73 зчиекозвВокІ саовсцаче ва шо «210» 74 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 74 «2105» 75 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005 75 текс кксс засо сковх Ко «210» 76 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер
«400» 76 -2105 77 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 77 чего спасе шо «-210» 78 «2115 22 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 78 зспазетвкова его з ко «-210» 79 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 79 -2105» 80 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 80 «-210» 81 «2115 23 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 81 «-2105» 82 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 82
БО поппЕачвова зач иоаа «и -2105» 83 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 83
«-210» 84 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 84 ассізоскова чЗсовочопаи йо -2105» 85 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 85 «-2105» 86 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 86 счскоазоза зваавсвссех т «-210» 87 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 87 ааазессоа соч еО -2105» 88 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 88 -2105» 89 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 89 пани ео взасос о -2105» 90 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 90 заавчочеса віпшвовиоЗоО в
«2105» 91 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 91 скоса сстя Чистка ово то «210» 92 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 92 -2105» 93 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005» 93 «210» 94 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020»
Зо «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 94 2105» 95 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 95 павоКааВош зегоосВиІкх о «-2105» 96 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 96 «210» 97 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 97 аківсжссчВ КкссскоКоя ки -2105» 98 «2115 20
«212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 98 каасавкісссв тові ссзОЗ Ки 2105» 99 «2115 22 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 99 «2105 100 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 100 «2105101 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 101 зо пмаащасчиаВ ШВИ: п У «2105102 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» 223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005 102 веассонирой сечо ково щи «2105103 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 103 скілчасозЗзча вче шО «2105» 104 «2115» 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 104 «2105» 105 «2115» 20 «212» ДНК
213» Штучна послідовність «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005 105 стоатасасем схе. шо «-2105 106 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 106 жожаозчаваЕст учили жи -2105 107 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 107 -2105 108 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд -4005 108
Зо «2105109 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 109 -2105 110 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 110 415 коссдзазтсо стузавеокЕ 2 «2105 111 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005 111 вообоазсенух зас онвая шу «2105112 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність
«223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 112 сїзЗчазвосва асчосооаие ЕЕ «2105 113 «2115» 20 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 113 закосвісзсва Зак озОоцаВЗЗ кО «2105 114 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 114 асешсови слечиска М «2105115 «2115» 20 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 115
Ессе зЗачеваскова ме «2105 116
Зо «2115» 20 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 116 чего вки що шк «2105117 «2115» 20 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 117 «2105 118 «2115» 20 212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 118 сов ззацає спосо с ж «2105» 119 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер
«4005 119 стулоастяс зкувадке ке 2105 120 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005» 120 тсосасчосза забссвоїає ки «2105 121 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 121 бочок завдає ши «2105 122 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005 122 шосе чив Кк «2105 123 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005 123 візоасасвав зостісутх хо «2105» 124 «2115» 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 124 чавсозпоаш сосзгвакоя У «2105» 125 «2115 21 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 125
ЧчивсЗсвовоа адачскоса є ші «2105 126 «2115 25 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «4005 126
«2105» 127 «2115 22 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «4005» 127 втуачитовЕ впсзоукат сі жи «2105» 128 «2115 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 128 «2105» 129 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклєотидний зонд «400» 129 шиссасося зав и -2105 130 «2115 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Синтетичний олігонуклєотидний праймер «400» 130 кс Кююко засо хо «2105 131 «2115 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклєотидний праймер «400» 131 зстагеочоо сросваальоя жи «2105 132 «2115 22 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклєотидний зонд «4005 132 заважав к заз ше ж «2105 133 «2115 20 «2125» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» Синтетичний олігонуклєотидний праймер «400» 133 шксоцеовавс вчасне во «2105» 134
«2115 20 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 134 влевчговао асо завях Ко «-2105 135 «2115 20 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний зонд «400» 135 звопчсспваасчво вві осо шо «-2105 136 «2115 20 -212» ДНК 213» Штучна послідовність «2020» «223» Синтетичний олігонуклеотидний праймер «400» 136 коезссоїссв зва ссвцко ЗО

Claims (13)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Композиція для покращення росту рослин, поліпшення стресостійкості та/"або підвищення врожайності, яка включає клітини мікробних видів, що включають або складаються з кожного з І асюбвасіив5 аєїбгиескКії, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить БЕО ІЮ МО: 24, Мігдірасійив Наіорнійш5, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО І МО: 23, Аг2оїюобасієг міпеіапаїйї, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 22, Сіовігідіит разівєшіапит, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 21, Раєпірасійи5 спірепзі5, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО 10 МО: 19, Зперютусез дгізей5, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 18, Рзейдотопазв 5р., що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 17, Рвепдотопах риїйда, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 16, Васіїив в5р., що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить БЕО ІО МО: 15, Васіїшв атупоїїдиеїтасієпе, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 14, Осеєапобрасіїн5 опсоппупспі, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 13, Раєпірасйи5 Іашив5, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 12, Васіїйив5 Іспепітоптів, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО І МО: 11, І асіорасійив міпі, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 10, Раєпібасії 5 соокКії, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 9, Васійи5 вирій, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 8, І асюрасійи5 рисппегі, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮО МО: 7, Васійи5 тедаїегпцт, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІО МО: 3, Асеїобасієг разіевшіапив5, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮО МО: б, Сіозітіаіт бБеї|егіпеКії, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІО МО: 5, І асіорасійи5 сазеі/рагасазеі, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО 10 БО МО: 4, і Васійи5 Яехи5, що має нуклеотидну послідовність 165 рДНК, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 20.
2. Композиція за п. 1, у якій мікроби включають мікробів з Американської колекції типових культур з номерами депонування РТА-123288 та РТА-123289.
З. Композиція за п. 1 або 2, яка додатково включає клітини одного або декількох з ОезиМов5роговзіпиє тепадієї, Микобзоритійшє 5р., Маїппорасієї Ббгуогоогит, ГГеріозріпШит Тептодіаоїгорпит та І асіобасіїйи5 асідорпіив5.
4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, яка додатково включає один або більше з хітину, хітозану, глюкозаміну, амінокислот та рідкого добрива.
5. Спосіб покращення росту рослин, поліпшення стресостійкості та/або підвищення врожайності, що включає приведення в контакт грунту, рослин, частин рослин або насіння з композицією за будь-яким з пп. 1-4.
6. Спосіб за п. 5, який додатково включає приведення в контакт грунту, рослин, частин рослин або насіння з одним або більше з хітину, хітозану, глюкозаміну та амінокислот.
7. Спосіб за п. 5 або 6, який додатково включає приведення в контакт грунту, рослин, частин рослин або насіння з рідким добривом.
8. Спосіб за будь-яким з пп. 5-7, який додатково включає приведення в контакт грунту, рослин, частин рослин або насіння з одним або декількома пестицидами, одним або декількома фунгіцидами, одним або декількома гербіцидами, одним або декількома інсектицидами, одним або декількома гормонами рослин, одним або декількома еліситорами рослин, або з комбінацією двох або більше з них.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 5-8, який додатково включає активування мікробного виду у композиції перед приведенням в контакт грунту, рослин, частин рослин або насіння з цією композицією.
10. Спосіб біодеградації хітиновмісного біологічного джерела, що включає: змішування хітиновмісного біологічного джерела з композицією за будь-яким з пп. 1-4 з утворенням суміші; ферментування суміші; та розділення ферментованої суміші на тверду, водну та ліпідну фракції.
11. Спосіб за п. 10, у якому хітиновмісне біологічне джерело включає морську тварину або побічний продукт морської тварини, комаху або гриб.
12. Спосіб за п. 11, у якому морська тварина являє собою морську членистоногу тварину.
13. Спосіб за п. 12, у якому морська членистонога тварина являє собою креветку, краба або криль. з : ва | рн | . Ех ре явна ооо ШИ УЖЕ, ГоОооєНННХ Пк | яаякння ї РОШЕН От ЖЖ нн ОшЕЕЇ 4 з ве ії нн Вековужянк кт в ЩЕ оку Вих КО ї Ї із Нео КІвнохХХ ща. я Гете міващя
ФІГ. 1
: Зндеже поверх зисяа еВ : : ма ЖЕНЕ сеуммане нових лУМУЕВа: ВООЗ Кн щяеВть, хх джь ЯЗ : : я і НЕ Год Ж сяоляння Доном ВХ з М зва з . й ММ ТрОСУ ї " т " оон с
Ж. ха з флняннннткн фанти . но -.. у 02000ї ОМ вда соня ї 50000... ІОВ І мо ї : 1 "7 перо их ЩОБ ння ; ше пон В, : ой ве. : ї . п З Зв Не р. а : Щ я шення і . ПИ. -- ВВ І : Б ве нн і соня нн що ма ї і в : до ї і я с. о. ФИф он Дно ння Зх пня фони нннннннннє сс ВИНИ ка : ; ВО т : яд : о | ММ :
ку . НН, . Вис кову АтКрОЮВн косами Ар: Ні | | іБозвелвнми ПВЕК МСУХ ве КК :
Фіг. 2 Муза нас пера: кукуружін, х земне 37 : З ше я 0. ше о . о . ши : ав І ке : шко ВИК щі -. МВюмвмммме : Є мов й шк З ков ввооо оон ш тп й Не 7 пи п «555: ВВ. п Ж оз урн п с.. : Маю 3 ї Коня В. : Ж са 3 і М. Ж дя ї І пон хо ї : МО. Не Лв І і В : ДОВ нині М. й. ин нс: ооо . - се ово ши ї. . ВМ і : М : п шо 1. . Й : Шон ОК оодонденнтчолятнников отого о ВССУ , Кантиахе МазЖЕУВОННЙ вер хаинум вві : Свою : іКозведевня ПІБ АК В хи : в а
Фіг. З : Поле вамата зр щмюкахи МВ ж Вино Кермові ГКР ЯН в і : Я Е и ще с їз МЕ КОЖ це з ОБ зх ЕЕ ЕЕ в ОВО їх ОК ХХ ЗМ КХ НИ 0 ДОС ОВО . КОМ з Том М ОО ВНІ зате їх СУМ МУ З у Мо З Б Б'ервовитоматн іа М на ОО ОХ М В ОХ СУК
Ж. Я ОК і пе гу якиу, гегтесоий коуткк х 4 і Бона БИ ЗКумІнаН нухасникм Да фіг. 4
' Пуокай кукурв леснуення а Яеебненой Кхюнобнрнія (ЕР ВЕНяМКУЕ Е Ко і і зах і каре ОО і ЕЕ ОО Еене 0 вав КН ОО і о о ОО ож ОО ОО і НО о. о :
йо . о і
Е. п. З ! ї - З МК З г я КО ХО З Ж Кене : їх МО ї в С ; Кол я НАХ З і Зав Ен і і ОКХ З ! 5 ! Ї З її. ХХ ЗОМ С й ! і Кантроже Зіікуенанйї вису: ен: 5 алі А Ек кн нний.
Фіг. 5 : дали врожай кахжетв і? : : вх неті еВічяНКу : ОО Слоркіще. Бражав пірат Те Прероєтю. Б Кок» ке : же : ЗМО Са Ж Ж: СВК во ДМС в Я: Ж : : ве і : ЖК пОтет КК кт я нях хоч нон ХОКНви ЕХ ти : Гах ЩО о. що :
: 5. о ОО ВО : я і і ОХ ЗОВ :
я о. 0 п : : КЗ ЗХ МО ї Жегяраєть СТА З Вин кимкоенум 0 СНО БНЮрОЮМИХХ ї : гкех Пре пекан кевякиуана Аушекос січ
Фіг. 5
UAA201900724A 2016-08-30 2017-08-30 Мікробна композиція UA127677C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662381441P 2016-08-30 2016-08-30
PCT/US2017/049326 WO2018045004A1 (en) 2016-08-30 2017-08-30 Defined microbial compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127677C2 true UA127677C2 (uk) 2023-11-29

Family

ID=59846685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201900724A UA127677C2 (uk) 2016-08-30 2017-08-30 Мікробна композиція

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11591274B2 (uk)
EP (1) EP3506761A1 (uk)
CN (1) CN110167350A (uk)
AR (1) AR110631A1 (uk)
AU (1) AU2017319484B2 (uk)
CA (1) CA3033072A1 (uk)
MX (1) MX2019001744A (uk)
NZ (1) NZ750627A (uk)
UA (1) UA127677C2 (uk)
WO (1) WO2018045004A1 (uk)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3010399A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Agrinos AS Microbial consortia and agriculture and biodegradation applications thereof
CN108624530B (zh) * 2018-05-15 2020-02-07 中国环境科学研究院 一种原位修复受污染沉积物的固定化菌剂及制法与应用
EP3724150A1 (en) * 2018-05-29 2020-10-21 Supersol Biyoteknoloji A.S. Efficient delivery of microorganisms produced from vermicomposting to soil
CN113166713A (zh) * 2018-06-06 2021-07-23 艾姆瓦克香港有限公司 产生吡啶二羧酸的微生物聚生体和选择与运载体共配制的微生物的方法
WO2020109474A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Evonik Operations Gmbh Preparation comprising a probiotic strain of the genus bacillus megaterium and a polyunsaturated fatty acid component
US10954173B2 (en) 2019-02-08 2021-03-23 Amvac Chemical Corporation Microbial coating of controlled-release fertilizers
EP3920704A1 (en) * 2019-02-08 2021-12-15 Aphea.bio NV Means and methods for improving plant growth and yield
EP3955739A4 (en) * 2019-04-15 2024-05-01 Pro Farm Group, Inc. MICROBES, COMPOSITIONS AND USES FOR INCREASING THE YIELD AND/OR DROUGHT TOLERANCE OF PLANTS
CN110106120B (zh) * 2019-05-29 2021-02-23 浙江省农业科学院 一种微生物除臭菌剂
CN110343638B (zh) 2019-07-01 2020-08-11 浙江大学 一株新的产达托霉素的链霉菌及其应用
CN110438044B (zh) * 2019-08-20 2020-12-18 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种贝莱斯芽孢杆菌yfi-4及在制备水产细菌抑菌剂中的应用
CN110699408A (zh) * 2019-10-21 2020-01-17 天津大学 利用混菌发酵提高表面活性素产量的方法
CA3159245A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Paleobiotica, Inc Compositions and methods for bioremediation of glyphosate containing substrates
WO2021144172A1 (en) * 2020-01-14 2021-07-22 Evonik Operations Gmbh Bacillus strains with the ability to degrade inorganic nitrogen compounds
CN111793585B (zh) * 2020-08-12 2023-06-30 杭州新原起生物科技有限公司 布氏乳杆菌及其培养法和在农业种植中的应用
CN112210509B (zh) * 2020-09-10 2021-10-22 森井生物工程(湖州)有限公司 一种郭霍氏细胞杆菌菌株及其用途
CN113249273B (zh) * 2021-06-30 2022-03-08 泸州老窖股份有限公司 一株耐盐枯草芽孢杆菌及其在高盐氨氮废水处理中的应用
US20230046446A1 (en) * 2021-07-28 2023-02-16 Quan Hong Bui Microbial composition and microorganism-based method of manufacturing and treating of animal farms using of the same
CN113980835B (zh) * 2021-09-23 2022-11-22 中化农业（临沂）研发中心有限公司 复合微生物菌剂及其在肥料中的应用
CN113801819B (zh) * 2021-09-26 2023-06-09 云南大学 一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法
US20230295669A1 (en) * 2021-10-26 2023-09-21 Biotrop Soluções Biológicas E Participações Ltda. Industrial process for obtaining an agricultural composition constituted by solubilizing and phosphorus mineralizing microorganisms, and use in the production and optimization of mineral, organomineral and organic fertilizers
WO2023088791A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Paenibacillus strains producing low amounts of dab comprising compounds.
CN114668055A (zh) * 2022-04-12 2022-06-28 广州合和昌茶业科技有限公司 一种茶叶发酵用辅料组合物及其发酵方法
WO2023233403A1 (en) * 2022-05-30 2023-12-07 Microbiome Ltd. Bacterial composition and a method of using same
WO2024020353A1 (en) * 2022-07-16 2024-01-25 Indigo Ag, Inc. Endophyte compositions and methods for improved plant health

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2853416A (en) * 1955-09-19 1958-09-23 Gen Aniline & Film Corp Method of protecting plants by applying a pesticidal amount of a polyvinylpyrrolidone-iodine adduct
BR112012015501A8 (pt) * 2009-12-23 2018-02-06 Agrinos AS Processo de biodegradação e composição
US20120084886A1 (en) 2010-06-16 2012-04-05 Agrinos AS Microbial process and composition for agricultural use
CA2839383C (en) 2011-01-12 2021-03-02 Inocucor Technologies, Inc. Microorganism-containing composition for biomediation and agricultural use
US20120329135A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Agrinos AS Process for Making Chitin Derivatives
US20120329650A1 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 Agrinos AS Agricultural Uses of HYTd
US20130255338A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Agrinos, AS Microbial Composition Comprising Liquid Fertilizer and Processes for Agricultural Use
CA2977178A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Agrinos AS Microbial consortia
BR112017018106A2 (pt) 2015-02-27 2018-04-10 Agrinos AS consórcios microbianos
NZ734550A (en) 2015-02-27 2023-06-30 Amvac Chemical Corp Microbial consortia
CA3010399A1 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Agrinos AS Microbial consortia and agriculture and biodegradation applications thereof
CN105779344A (zh) 2016-03-29 2016-07-20 江苏蓝星化工环保股份有限公司 一种复合微生物菌剂
US10954173B2 (en) * 2019-02-08 2021-03-23 Amvac Chemical Corporation Microbial coating of controlled-release fertilizers

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019109185A (ru) 2020-10-01
WO2018045004A1 (en) 2018-03-08
CA3033072A1 (en) 2018-03-08
NZ750627A (en) 2023-06-30
AU2017319484A1 (en) 2019-03-21
AR110631A1 (es) 2019-04-17
US20190183131A1 (en) 2019-06-20
AU2017319484B2 (en) 2022-04-07
EP3506761A1 (en) 2019-07-10
US11591274B2 (en) 2023-02-28
BR112019002356A2 (pt) 2019-10-01
MX2019001744A (es) 2019-07-08
CN110167350A (zh) 2019-08-23
RU2019109185A3 (uk) 2021-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127677C2 (uk) Мікробна композиція
AU2019275569B2 (en) Bacterial spore compositions for industrial uses
ES2965464T3 (es) Consorcios microbianos
ES2750612T3 (es) Consorcios microbianos
Pandey et al. Plant probiotics–endophytes pivotal to plant health
CN107849516B (zh) 微生物聚生体
CN107787360B (zh) 微生物聚生体
CN104761308A (zh) 一种土壤生态护理微生物菌肥的制备和应用
US20210032625A1 (en) Transgenic microalgae and use thereof as a feed for delivery of interfering rna molecules
RU2440413C1 (ru) Штамм бактерий bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма
CN113136352B (zh) 一种生防菌株及其在防治水稻纹枯病和促进水稻生长中的应用
Xia et al. Screening and fermentation medium optimization of a strain favorable to Rice–fish Coculture
UA127451C2 (uk) Штам streptomyces fungicidicus для продукування ендурацидину та спосіб одержання ендурацидину
Sekar et al. Strategic mining of cyanobacterial patents from the USPTO patent database and analysis of their scope and implications
KR101601833B1 (ko) 항선충 미생물 대량배양 복합체
CN113403218B (zh) 一种生防菌株及其在防治浙贝母软腐病和促进浙贝母生长中的应用
RU2788091C2 (ru) Определенные микробиологические композиции
Mathur et al. Impact of pertinent endophytic fungal communities and their secondary metabolites on crops
ELLEN CHLOE E. JAMES AND NATALIE FERRY
KR20070059503A (ko) 버크홀데리아 종 ｐｐｋ003 균주 및 이를 이용한 잔디생장및 잔디병 발생 억제 방법
RU2482174C2 (ru) ШТАММЫ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis И Bacillus amyloliquefaciens, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ПОЧВЫ И ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЖИВОТНЫХ, ОБЛАДАЮЩИЕ БАКТЕРИЦИДНОЙ, ФУНГИЦИДНОЙ И ВИРУЛИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ
BR112019002356B1 (pt) Composições microbianas definidas e métodos
ANZALONE Selection of endophytic bacterial communities, genes and secondary metabolites for the sustainable cultivation of tomatoes in greenhouse