UA126798C2 - Регуляторний елемент рослини і варіанти його застосування - Google Patents
Регуляторний елемент рослини і варіанти його застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA126798C2 UA126798C2 UAA201812704A UAA201812704A UA126798C2 UA 126798 C2 UA126798 C2 UA 126798C2 UA A201812704 A UAA201812704 A UA A201812704A UA A201812704 A UAA201812704 A UA A201812704A UA 126798 C2 UA126798 C2 UA 126798C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- dna molecule
- sequence
- plant
- expression
- recombinant dna
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title description 97
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 191
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 114
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 177
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 160
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 93
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 16
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 23
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 23
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 9
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 7
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 6
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 description 1
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 1
- 108010049994 Chloroplast Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000004097 EU approved flavor enhancer Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100040618 Eosinophil cationic protein Human genes 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001077878 Neurolaena lobata Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000018242 Obba <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 229920003776 Reny® Polymers 0.000 description 1
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000007380 fibre production Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 235000013666 improved nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004069 plant analysis Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 101150041594 soti gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Description
ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНУ ЗАЯВКУ
Дана заявка претендує на пріоритет на підставі попередньої заявки на патент США
Мо 62/340656, поданої 24 травня 2016 р., зміст якої повністю включений в даний опис за допомогою посилання.
ВКЛЮЧЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Перелік послідовностей, який міститься у файлі з назвою "МОМ5419У/0- зедицепсе. Іібііпуд.є«", розмір якого становить 14,1 кБ (виміряно в Місгозоїй УМіпдом/5Ф)) й який був створений 22 травня 2017 р., поданий разом з даною заявкою в електронному вигляді та включений в даний опис за допомогою посилання.
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
Даний винахід відноситься до областей молекулярної біології рослин і генної інженерії рослин. Зокрема, винахід відноситься до молекул ДНК, що підходять для модуляції експресії генів у рослинах.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Регуляторні елементи являють собою генетичні елементи, які регулюють роботу генів шляхом модуляції транскрипції функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Такі елементи можуть включати промотори, лідерні послідовності (лідери), інтрони та 3- нетрансльовані області, та їх можна застосовувати в областях молекулярної біології рослин і генної інженерії рослин.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Згідно з винаходом запропоновані нові регуляторні елементи генів для застосування в рослинах. Згідно з винаходом також запропоновані конструкти ДНК, що містять регуляторні елементи. Згідно з даним винаходом також запропоновані трансгенні рослинні клітини, рослини та насінини, які містять регуляторні елементи. В одному варіанті реалізації регуляторні елементи функціонально пов'язані з транскрибованою молекулою ДНК. У деяких варіантах реалізації транскрибована молекула ДНК може бути гетерологічною по відношенню до регуляторної послідовності. Таким чином, запропонована згідно з винаходом послідовність регуляторних елементів у конкретних варіантах реалізації може бути визначена як функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. Згідно з даним
Зо винаходом також запропоновані способи одержання та застосування регуляторних елементів,
ДНК-конструктів, що містять регуляторні елементи, і трансгенні рослинні клітини, рослини та насінини, що містять регуляторні елементи, функціонально пов'язані з транскрибованою молекулою ДНК.
Таким чином, в одному аспекті винаходу запропонована рекомбінантна молекула ДНК, що містить послідовність ДНК, яка вибрана з групи, що складається з: (а) послідовності, що характеризується щонайменше приблизно 85-відсотковою ідентичністю послідовності з будь- якою з БЕО ІЮ МО: 1-5 або 7; (5) послідовності, що містить будь-яку з БЗЕО ІЮ МО5: 1-5 або 7; і (с) фрагмента будь-якої з ЗЕО ІЮ МО»5: 1-5 або 7, де фрагмент має регулюючу ген активність; при цьому зазначена послідовність функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. Під "гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК" мається на увазі, що транскрибована молекула ДНК є гетерологічною по відношенню до полінуклеотидної послідовності, з якою вона функціонально пов'язана. У певних варіантах реалізації рекомбінантна молекула ДНК містить послідовність ДНК, що має щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895 або щонайменше 99 95 ідентичності послідовності з послідовністю ДНК будь-якої з 5ЕО І МО5:1-5. В окремих варіантах реалізації послідовність ДНК містить регуляторний елемент. У деяких варіантах реалізації регуляторний елемент містить промотор. В інших варіантах реалізації гетерологічна транскрибована молекула ДНК містить ген, що представляє інтерес із погляду агрономії, як, наприклад, ген, що має здатність забезпечувати стійкість рослин до гербіцидів, або ген, що має здатність забезпечувати стійкість рослин до шкідників рослин. В інших варіантах реалізації винаходу запропонований конструкт, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, запропоновану в даному документі.
В іншому аспекті, у даному документі запропоновані трансгенні рослинні клітини, які містять рекомбінантну молекулу ДНК, що містить послідовність ДНК, яка вибрана з групи, що складається 3: (а) послідовності що характеризується щонайменше 85-відсотковою ідентичністю послідовності з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 1-5 або 7; (Б) послідовності, що містить будь-яку з БЕО ІЮО МО: 1-5 або 7; і (с) фрагмента будь-якої із БЕО ІЮ МО5: 1-5 або 7, де фрагмент має регулюючу ген активність; при цьому послідовність ДНК функціонально пов'язана бо з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. У певних варіантах реалізації трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини. В інших варіантах реалізації трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини або клітину дводольної рослини.
В ще одному аспекті у даному документі додатково запропонована трансгенна рослина або її частина, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, що містить послідовність ДНК, яка вибрана з групи, що складається з: (а) послідовності, що характеризується щонайменше 85-відсотковою ідентичністю послідовності з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 1-5 або 7; (Б) послідовності, що містить будь-яку з БЕО ІЮ МО5: 1-5 або 7; і (с) фрагмента будь-якої з БЕО ІЮ МО5: 1-5 або 7, де фрагмент має регулюючу ген активність; при цьому послідовність ДНК функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. У конкретних варіантах реалізації трансгенна рослина являє собою рослину-нащадок будь-якого покоління, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК. У даному документі також запропоноване трансгенне насіння, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, з якого виростає така трансгенна рослина.
Згідно з іншим аспектом винаходу запропонований спосіб одержання товарного продукту, який включає одержання трансгенної рослини або її частини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом, й одержання з неї зазначеного товарного продукту.
Відповідно до одного варіанта реалізації товарний продукт являє собою оброблене насіння, зерна, частини рослин, олії та шрот.
Згідно з ще одним аспектом винаходу запропонований спосіб одержання трансгенної рослини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом, який включає трансформацію рослинної клітини молекулою рекомбінантної ДНК згідно з даним винаходом з одержанням трансформованої рослинної клітини та регенерацію трансгенної рослини з цієї трансформованої рослинної клітини.
Згідно з деякими аспектами винаходу запропоновані способи одержання клітини трансгенної рослини, які включають введення в рослинну клітину рекомбінантної молекули ДНК, запропонованої у даному документі У певних варіантах реалізації введення зазначеної рекомбінантної молекули ДНК в зазначену рослинну клітину включає трансформацію або регенерацію трансгенної рослини із зазначеної рослинної клітини. У додаткових варіантах реалізації введення зазначеної рекомбінантної молекули ДНК в зазначену рослинну клітину
Зо включає схрещування запропонованої у даному документі трансгенної рослини з іншою рослиною з одержанням рослини-нащадка, що містить зазначену рослинну клітину.
У додатковому аспекті винаходу запропоновані способи одержання трансгенної рослини, які включають трансформацію рослинної клітини рекомбінантною молекулою ДНК, запропонованою у даному документі. У певних варіантах реалізації способи згідно з винаходом додатково включають регенерацію трансгенної рослини з рослинної клітини, яка трансформована молекулою ДНК, запропонованою у даному документі.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІЮ МО:1 являє собою послідовність ДНК групи регулюючих експресію елементів (ЕХР), яка містить промотор, отриманий з передбачуваного гена убіквітину з бутелуа витонченої (Вошеїоца агасіїї5), функціонально пов'язаного на 5 кінці зі своїм лідером, який функціонально пов'язаний на 5 кінці зі своїм нативним першим інтроном.
ЗЕО ІЮ МО:2 являє собою промоторну послідовність, отриману з передбачуваного гена убіквітину з бутелуа витонченої (Вошеїопа агасіїв).
ЗЕО ІЮО МО:З3 являє собою лідер, отриманий з передбачуваного гена убіквітину з бутелуа витонченої (ВошіеІоца дгасіїв).
ЗЕБЕО ІЮ МО:4 являє собою інтронну послідовність, отриману з передбачуваного гена убіквітину з бутелуа витонченої (Вошеїопа агасіїв).
ЗЕО ІЮО МО:5 являє собою 3" нетрансльовану область (НТО), отриману з передбачуваного гена убіквітину з бутелуа витонченої (ВоцівЇопца дгасіїїв).
ЗЕО ІЮ МО:б являє собою синтетичну кодуючу послідовність, що кодує бБ-глюкуронідазу, призначену для експресії в рослинній клітині.
ЗЕБЕО ІЮО МО:7 являє собою енхансер промотору, отриманий з передбачуваного гена убіквітину Вошціевоца дгасіїв.
ЗБЕО ІЮ МО:8 являє собою 3 нетрансльовану область (НТО), отриману з гена білка, подібного білку-переноснику ліпідів (БПЛ) Огулга заїїма.
ЗБО ІЮ МО:9 являє собою посилений енхансером промотор і лідерну послідовність, отримані з вірусу мозаїки цвітної капусти.
ЗБО ІЮО МО 10 являє собою 3 нетрансльовану область (НТО), отриману з гена нопалінсинтази Адгобасіелит їтеїасієпв. 60 ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Згідно з винаходом запропоновані молекули ДНК, що мають регулюючу гени активність в рослинах. Нуклеотидні послідовності таких молекул ДНК запропоновані у вигляді БЕО ІЮ МО5:1- або 7. Ці молекули ДНК мають здатність впливати на експресію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК у тканинах рослин і, отже, регулювати експресію функціонально 5 пов'язаного трансгена в трансгенних рослинах. Згідно з винаходом також запропоновані способи модифікації, одержання та застосування таких молекул. Згідно з винаходом також запропоновані композиції, які містять трансгенні рослинні клітини, рослини, частини рослин і насіння, що містять рекомбінантні молекули ДНК згідно з даним винаходом, а також способи їх одержання та застосування.
Наступні визначення та способи наведені для того, щоб краще визначити даний винахід і дати керівництво для середніх фахівців у даній галузі техніки з реалізації даного винаходу.
Якщо не зазначено інше, терміни слід розуміти відповідно до їх стандартного застосування середніми фахівцями у відповідній галузі техніки.
Молекули ДНК
У даному документі термін "ДНК" або молекула "ДНК" відноситься до дволанцюгової молекули ДНК геномного або синтетичного походження, тобто, до полімеру дезоксирибозних основ або молекули ДНК, що читається від 5' кінця (зворотній напрямок) до З3' кінця (прямий напрямок). У даному документі термін "послідовність ДНК" відноситься до нуклеотидної послідовності молекули ДНК. Використовувана у даному документі номенклатура відповідає номенклатурі розділу 37 Зводу нормативних актів федеральних органів виконавчої влади
Сполучених Штатів 5 1.822 і наведена в таблицях Стандарту ВОЇВ 57.25 (1998), додаток 2, таблиці 1 і 3.
У даному документі термін "рекомбінантна молекула ДНК" означає молекулу ДНК, що містить комбінацію молекул ДНК, які не зустрічаються у природніх умовах спільно без втручання людини. Наприклад, рекомбінантна молекула ДНК може являти собою молекулу ДНК, яка містить щонайменше дві молекули ДНК, гетерологічні одна одній, молекулу ДНК, яка містить послідовність ДНК, відмінну від послідовностей ДНК, які існують у природніх умовах, або молекулу ДНК, яку вмонтували в ДНК клітини-хазяїна за допомогою генетичної трансформації або редагування геному.
Зо Якщо у даній заявці наведена вказівка на "виділену молекулу ДНК" або відповідний термін або фразу, це повинно означати, що молекула ДНК присутня окремо або в комбінації з іншими композиціями, але у своєму природньому оточенні. Наприклад, елементи нуклеїнової кислоти, такі як кодуюча послідовність, інтронна послідовність, нетрансльована лідерна послідовність, промоторна послідовність, послідовність термінації транскрипції та тому подібні, які у природніх умовах перебувають в ДНК геному організму, не вважаються "виділеними", поки елемент перебуває в геномі організму й у тій ділянці геному, в якій він зустрічається у природніх умовах.
Однак кожний з таких елементів і складові частини таких елементів будуть "виділеними" в обсязі даного опису, якщо зазначений елемент не перебуває в геномі організму й у тій ділянці геному, в якій він зустрічається у природніх умовах. Аналогічно, нуклеотидна послідовність, що кодує інсектицидний білок або будь-який, що зустрічається у природніх умовах варіант такого білка, буде виділеною нуклеотидною послідовністю за умови, що нуклеотидна послідовність не перебуває в ДНК бактерії, в якій послідовність, що кодує білок, зустрічається у природніх умовах. З метою даного опису синтетична нуклеотидна послідовність, що кодує амінокислотну послідовність інсектицидного білка, що зустрічається у природніх умовах, буде вважатися виділеною. З метою даного опису будь-яка трансгенна нуклеотидна послідовність, тобто, нуклеотидна послідовність ДНК, вбудована в геном рослинних або бактеріальних клітин, або присутня в екстрахромосомному векторі, буде вважатися виділеною нуклеотидною послідовністю незалежно від того, чи присутня вона у плазміді або подібній структурі, що застосовується для трансформації клітин, в геномі рослини або бактерії, або ж є присутньою в кількостях, що виявляються, в тканинах, потомстві, біологічних зразках або товарних продуктах, отриманих з рослини або бактерії.
У даному документі термін "ідентичність послідовності" відноситься до ступеня, в якому дві оптимально вирівняні полінуклеотидні послідовності або дві оптимально вирівняні поліпептидні послідовності ідентичні. Оптимальне вирівнювання послідовностей виробляють за допомогою ручного вирівнювання двох послідовностей, наприклад, референсної послідовності й іншої послідовності, з метою максимізації кількості збігів нуклеотидів у вирівняній послідовності з відповідними внутрішніми нуклеотидними вставками, делеціями або розривами. У даному документі термін "референсна послідовність" відноситься до послідовності ДНК, запропонованої як ЗЕО ІЮ МО5:1-5 або 7. 60 У даному документі термін "відсоток ідентичності послідовності" або "відсоток ідентичності"
або "95 ідентичності" являє собою частку ідентичності, помножену на 100. "Частка ідентичності" послідовності, оптимально вирівняної з референсною послідовністю, являє собою кількість збігів нуклеотидів при оптимальному вирівнюванні, поділену на загальну кількість нуклеотидів у референсній послідовності, наприклад, загальна кількість нуклеотидів у повнорозмірній референсній послідовності. Так, відповідно до одного варіанта реалізації винаходу запропонована молекула ДНК, що містить послідовність, яка при оптимальному вирівнюванні з референсною послідовністю, описаною у даному документі як 5ЕО ІЮ МО5:1-5 і 7, має щонайменше приблизно 85-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 86-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 87-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 88- відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 89-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 90-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 91 відсоток ідентичності, щонайменше приблизно 92 відсотка ідентичності, щонайменше 93 відсотка ідентичності, щонайменше приблизно 94 відсотка ідентичності, щонайменше приблизно 95-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 96-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 97- відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 98-відсоткову ідентичність, щонайменше приблизно 99-відсоткову ідентичність або щонайменше приблизно 100-відсоткову ідентичність з референсною послідовністю. У певних варіантах реалізації у даному документі запропоновані послідовності, що мають деяку відсоткову ідентичність з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО: 1-5 або 7, і мають активність повнорозмірної послідовності.
Регуляторні елементи
Регуляторні елементи, такі як промотори, лідери (також відомі як 5" НТО), енхансери, інтрони та ділянки термінації транскрипції (також відомі як З'НТО) відіграють невід'ємну роль в загальній експресії генів у живих клітинах. У даному документі термін "регуляторний елемент" відноситься до молекули ДНК, що має активність регуляції генів. У даному документі термін "активність регуляції генів" відноситься до здатності впливати на експресію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК, наприклад, за рахунок впливу на транскрипцію та/або трансляцію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Таким чином, регуляторні елементи, такі як промотори, лідери, енхансери, інтрони та 3 НТО, які функціонують в рослинах, підходять для модифікації фенотипів рослин за допомогою генної
Зо інженерії.
У даному документі термін послідовність "групи регуляторних елементів експресії" або "ЕХР" може відноситися до групи функціонально пов'язаних регуляторних елементів, таких як енхансери, промотори, лідери й інтрони. Таким чином, група регуляторних елементів експресії може містити, наприклад, промотор, функціонально пов'язаний з 5-кінцем лідерної послідовності. ЕХР, які можна застосовувати для реалізації даного винаходу представлені у вигляді з5ЕО ІЮ Мо: 1.
Регуляторні елементи можна охарактеризувати за їх паттерном експресії гена, наприклад, за позитивними і/або негативними ефектами, такими як постійна або тимчасова експресія, просторовий, фізіологічний, патологічний ефект, ефект відносно розвитку, тканини, оточення, клітинного циклу, і/або хімічно чутлива експресія, і будь-яка їх комбінація, а також за кількісними або якісними показниками. У даному документі термін "паттерн експресії гена" являє собою будь-який паттерн транскрипції функціонально пов'язаної молекули ДНК у транскрибовану молекулу РНК. Транскрибовану молекулу РНК можна транслювати з одержанням молекули білка або можна одержати антисмислову або іншу молекулу РНК з регуляторною функцією, таку як дволанцюгова РНК (длРНК), транспортна РНК (тРНК), рибосомальна РНК (рРНК), мікроРНК (міРНК) і подібні до них.
У даному документі термін "експресія білка" означає будь-який паттерн трансляції транскрибованої молекули РНК у молекулу білка. Експресію білка можна описувати її тимчасовими, просторовими, якостями, що відносяться до розвитку або морфології, а також кількісними або якісними показниками.
Промотор можна застосовувати в якості регуляторного елемента для модуляції експресії функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. У даному документі термін "промотор" в цілому відноситься до молекули ДНК, яка бере участь в розпізнаванні та зв'язуванні РНК-полімерази І й інших білків, таких як діючі у транс-положенні фактори транскрипції, при ініціації транскрипції Промотор можна початково виділити 3 5'- нетрансльованої області (5'-НТО) геномної копії гена. В якості альтернативи, промотори можуть являти собою синтетично отримані або оброблені молекули ДНК. Промотори також можуть бути химерними. Химерні промотори одержують в результаті гібридизації двох або більше гетерологічних молекул ДНК. Промотор, який можна застосовувати для реалізації даного 60 винаходу, включає промоторні елементи, які містяться у 5ЕО ІЮ МО:2, або її фрагментах або варіантах. У конкретних варіантах реалізації винаходу зазначені у формулі винаходу молекули
ДНК і будь-які їх варіанти або похідні, описані у даному документі, додатково визначені, як ті, що мають промоторну активність, тобто здатні діяти в якості промотору в клітині-хазяїні, наприклад, в трансгенній рослині. В інших визначених варіантах реалізації фрагмент можна визначити, як такий, що проявляє промоторну активність, яку має вихідна промоторна молекула, з якої він був отриманий, або фрагмент може містити "мінімальний промотор", який забезпечує базовий рівень транскрипції та складається з ТАТА-боксу, іншого відомого мотиву сайту зв'язування транскрипційних факторів, або еквівалентної послідовності ДНК для розпізнавання та зв'язування комплексу РНК-полімерази ІІ для ініціації транскрипції.
В одному варіанті реалізації запропоновані фрагменти промоторної послідовності, описаної у даному документі. Фрагменти промоторів можуть мати промоторну активність, як описано вище, і можуть застосовуватися окремо або в комбінації з іншими промоторами та фрагментами промоторів, як, наприклад, при створенні химерних промоторів, або в комбінації з іншими елементами експресії та фрагментами елементів експресії. У певних варіантах реалізації запропоновані фрагменти промотору, що містять щонайменше приблизно 50, щонайменше приблизно 75, щонайменше приблизно 95, щонайменше приблизно 100, щонайменше приблизно 125, щонайменше приблизно 150, щонайменше приблизно 175, щонайменше приблизно 200, щонайменше приблизно 225, щонайменше приблизно 250, щонайменше приблизно 275, щонайменше приблизно 300, щонайменше приблизно 500, щонайменше приблизно 600, щонайменше приблизно 700, щонайменше приблизно 750, щонайменше приблизно 800, щонайменше приблизно 900 або щонайменше приблизно 1000 або більше суміжних нуклеотидів молекули ДНК, що має промоторну активність, яка описана у даному документі. У певних варіантах реалізації у даному документі запропоновані фрагменти будь-якої з ЗЕО ІЮ МО»: 1-5 і 7, що мають активність повнорозмірної послідовності. Способи одержання таких фрагментів з вихідної промоторної молекули загальновідомі в даній області техніки.
Композиції, отримані з будь-якого з промоторних елементів, що містяться у ЗЕО ІЮ МО:2, такі як внутрішні або 5' делеції, наприклад, можна одержати за допомогою відомих в даній області техніки способів поліпшення або зміни експресії, включаючи видалення елементів, які виявляють позитивний або негативний вплив на експресію; дублювання елементів, що
Зо виявляють позитивний або негативний вплив на експресію; та/або дублювання або видалення елементів, які виявляють тканиноспецифічний або клітиноспецифічний вплив на експресію.
Композиції, які отримані з будь-якого з промоторних елементів, що містяться у 5БЕО ІЮ МО: 2, що містять 3'-делеції, в яких вилучений елемент ТАТА-боксу або еквівалентна йому послідовність та розташована у прямому напрямку зчитування послідовність, можна застосовувати, наприклад, для створення енхансерних елементів. Можна ввести додаткові делеції для видалення будь-яких елементів, які виявляють позитивний або негативний; тканиноспецифічний; клітиноспецифічний; або часоспецифічний (що включає циркадний ритм, але не обмежений ним) вплив на експресію. Будь-які з промоторних елементів, що містяться у
ЗЕО ІЮ МО:2, й отримані з них фрагменти або енхансери можна застосовувати для створення композицій химерних регуляторних елементів транскрипції.
Відповідно до даного винаходу можна провести аналіз промотору або фрагмента промотору, щоб установити присутність відомих промоторних елементів, тобто характеристик послідовності ДНК, такі як ТАТА-бокс й інші відомі мотиви сайту зв'язування транскрипційних факторів. Фахівець в даній області техніки може застосовувати ідентифікацію таких відомих промоторних елементів для розробки варіантів промотору, що мають аналогічний вихідному промотору паттерн експресії.
У даному документі термін "лідер" відноситься до молекули ДНК, виділеної з нетрансльованої 5'-області (5'НТО) гена, і в цілому його визначають як нуклеотидний сегмент між сайтом початку транскрипції (55) та сайтом початку кодуючої послідовності білка. В альтернативному варіанті лідери можуть являти собою синтетично отримані або оброблені елементи ДНК. Лідери можна застосовувати в якості 5 регуляторного елемента для модуляції експресії функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Лідери можна застосовувати з гетерологічним промотором або з їх нативним промотором. Лідери, які можна застосовувати для реалізації даного винаходу, представлені як ЗЕО ІЮ МО5:3 або будь-які з лідерних елементів, що містяться у ЗЕО ІЮ МО5:3, або їх фрагментах і варіантах. У певних варіантах реалізації такі послідовності ДНК можна визначити, як такі, що мають здатність діяти в якості лідера в хазяйській клітині, включаючи, наприклад, трансгенну рослинну клітину. В одному варіанті реалізації такі послідовності розшифровані, як такі, що мають лідерну активність. 60 Лідерні послідовності (також позначувані як 5" НТО), представлені як 5ЕО ІЮО МО5:3, або будь-які з лідерних елементів, що входять до складу ЗЕО ІЮ МО5:3, можуть мати в своєму складі регуляторні елементи або можуть приймати вторинні структури, які можуть впливати на транскрипцію або трансляцію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК.
Лідерну послідовність, представлену як ЗЕО ІЮО МО5:3, або будь-який з лідерних елементів, що входять до складу ЗЕО ІЮ МО5:3, можна застосовувати згідно з винаходом для створення химерних регуляторних елементів, які впливають на транскрипцію або трансляцію функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК.
У даному документі термін "інтрон" відноситься до молекули ДНК, яку можна виділити з гена або ідентифікувати в ньому, і в цілому його можна визначити як область, що зазнає сплайсингу під час процесингу матричної РНК (мРНК) перед трансляцією. В якості альтернативи, інтрон може являти собою синтетично отриманий або оброблений елемент ДНК. Інтрон може містити енхансерні елементи, які впливають на транскрипцію функціонально пов'язаних генів. Інтрон можна застосовувати в якості регуляторного елемента для модуляції експресії функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК. Конструкт може містити інтрон, і цей інтрон може бути або може не бути гетерологічним по відношенню до транскрибованої молекули ДНК.
Приклади інтронів у даній області техніки включають інтрон актину рису й інтрон кукурудзи
Н5Р7О.
У рослин включення деяких інтронів у генетичні конструкти призводить до збільшення накопичення мРНК і білка у порівнянні з конструкціями без інтрона. Цей ефект був названий "Інтрон-опосередковане посилення" (ІМЕ) експресії гена. Інтрони, встановлено стимулюючі експресію в рослин, ідентифіковані в генах маїсу (наприклад, їшБАт, Аант, 5п1 ї ОБіт1), в генах рису (наприклад, ірі) та в генах дводольних рослин, таких як гени петунії (наприклад, гро), картоплі (наприклад, 51-І51), й Агабідорвів ІТайіапа (наприклад, раз і рай). Показано, що делеції або мутації в сайтах сплайсингу інтрона знижують експресію гена, що свідчить про те, що для
ІЇМЕ може бути необхідний сплайсинг. Однак в дводольних рослинах продемонстрований ІМЕ при точкових мутаціях в сайтах сплайсингу гена рай з А. ІНаійапа. Показано, що багаторазове використання одного і того самого інтрона в одній рослині має недоліки. У таких випадках необхідно мати колекцію основних контролюючих елементів, щоб сконструювати підходящі елементи рекомбінантної ДНК.
Інтрон, який можна застосовувати для реалізації даного винаходу, представлений у вигляді
ЗЕО ІЮ МО:4. Отримані з інтрона композиції, представлені у вигляді ЗЕО ІЮ МО:4, можуть мати в своєму складі внутрішні делеції або дуплікації цис регуляторних елементів. Крім того, зміни 5 'їі
З'послідовностей, що містять границі сплайсингу інтрон/екзон, можна застосовувати для посилення експресії або специфічності експресії якщо вони функціонально пов'язані з промотором т лідером або химерним промотором ж лідером і кодуючою послідовністю. При модифікації послідовностей границь інтрон/екзон може виявитися корисним уникати застосування нуклеотидної послідовності АТ або нуклеотиду А безпосередньо перед 5'-кінцем сайту сплайсингу (СТ) та нуклеотиду С або нуклеотидної послідовності ТО відразу після З кінця сайту сплайсингу (АС), щоб виключити можливість появи небажаних стартових кодонів під час процесингу матричної РНК в кінцевий транскрипт. У такий спосіб можна модифікувати послідовності ДНК поруч із 5' або 3' кінцями сайтів границь сплайсингу. Інтрон і варіанти інтронів, змінені, як описано у даній заявці, та відповідні способи, відомі в даній області техніки, можна перевірити емпірично, як описано у робочих прикладах, щоб визначити вплив інтрона на експресію функціонально пов'язаної молекули ДНК. Зміни 5 і З ділянок, які містять границю сплайсингу інтрон/«екзон, можна також зробити, щоб зменшити потенційне введення неправильних стартових кодонів і стоп-кодонів, що утворювалися в ході процесингу транскрипту та сплайсингу матричної РНК. Інтрони можна перевірити емпірично, як описано у робочих прикладах, щоб визначити вплив інтрона на експресію трансгена.
В одному варіанті реалізації запропоновані фрагменти інтронної послідовності, описаної у даному документі. Фрагменти інтрона можуть мати активність повнорозмірної інтронної послідовності, та їх можна застосовувати окремо або в комбінації з іншими інтронами або регуляторними елементами, або фрагментами елементів експресії. У певних варіантах реалізації запропоновані фрагменти інтрона, що містять щонайменше приблизно 50, щонайменше приблизно 75, щонайменше приблизно 95, щонайменше приблизно 100, щонайменше приблизно 125, щонайменше приблизно 150, щонайменше приблизно 175, щонайменше приблизно 200, щонайменше приблизно 225, щонайменше приблизно 250, щонайменше приблизно 275, щонайменше приблизно 300, щонайменше приблизно 500, щонайменше приблизно 600, щонайменше приблизно 700, щонайменше приблизно 750, щонайменше приблизно 800, щонайменше приблизно 900 або щонайменше приблизно 1000 бо або більше суміжних нуклеотидів молекули ДНК, що має активність інтрона, яка описана у б даному документі. У певних варіантах реалізації у даному документі запропоновані фрагменти будь-якої з БЕО ІЮ МО: 4, що має активність повнорозмірної послідовності. Способи одержання таких фрагментів із вихідної молекули інтрона загальновідомі в даній області техніки.
У даному документі терміни "3 молекула термінації транскрипції", "3 нетрансльована область" або "3'-НТО" відносяться до молекули ДНК, яка використовується під час транскрипції до нетрансльованої області 3' ділянки молекули мРНК. 3'-нетрансльовану область молекули
МРНК можна створити шляхом специфічного розщеплення та 3'-поліаденілювання, також відомого як полі(А)-хвіст. 3-НТО може бути функціонально пов'язана з транскрибованою молекулою ДНК і розташовуватися у прямому напрямку зчитування від неї та може мати сигнал поліаденілювання й інші регуляторні сигнали, що мають здатність впливати на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію гена. Вважають, що полі(А)-хвости задіяні в стабільності мРНК й ініціації трансляції. Приклади відомих в даній області техніки 3' молекул термінації транскрипції 3-область нопалінсинтази, З'область п5р17 пшениці, 3'-область малої субчастинки рибулозо- 1,5-біфосфаткарбоксилази/ оксигенази гороху, 3'-область Еб бавовни та 3-НТО коіксину. 3-НТО зазвичай знаходять корисне застосування для рекомбінантної експресії певних молекул ДНК. Слабка 3-НТО має потенціал для створення наскрізного прочитання, що може впливати на експресію молекули ДНК, розташованої в сусідніх експресійних касетах.
Відповідний контроль за термінацією транскрипції може запобігати наскрізному прочитанню у послідовностях ДНК (наприклад, в інших експресійних касетах), розташованих у прямому напрямку зчитування, і може також сприяти ефективному поновленню циклу РНК-полімерази, підсилюючи тим самим експресію гена. Ефективна термінація транскрипції (вивільнення РНК- полімерази ІІ з ДНК) є попередньою умовою для повторної ініціації транскрипції та, тим самим, безпосередньо впливає на загальний рівень транскрипту. Після термінації транскрипції зріла
МРНК виходить з сайту синтезу та транспортується в цитоплазму. Еукаріотичні мРНК накопичуються іп мімо у формі полі(А), що затрудняє визначення сайтів термінації транскрипції стандартними способами. Крім того, прогнозування функціональних й ефективних 3'-НТО за допомогою біоінформаційних методів утруднене внаслідок відсутності консервативних послідовностей ДНК, які дозволили би легко прогнозувати ефективну 3'-НТО.
З практичної точки зору зазвичай корисно, щоб 3'-НТО, застосовувана в експресійній касеті,
Зо мала наступні характеристики. По-перше, 3-НТО повинна бути здатна швидко й ефективно термінувати транскрипцію трансгена та запобігати наскрізному прочитанню транскрипту у будь- яку сусідню послідовність ДНК, яка може містити іншу експресійну касету, як у випадку декількох експресійних касет, розташованих в одній транспортній ДНК (Т-ДНК), або в сусідній хромосомній ДНК, в яку вбудована Т-ДНК. По-друге, 3-НТО не повинна викликати зниження траскрипційної активності, обумовленої промотором, лідером, енхансерами й інтронами, які застосовують для стимулювання експресії молекули ДНК. Нарешті, в області біотехнології рослин 3-НТО часто використовують для праймінгу реакцій ампліфікації назад транскрибованої
РНК, виділеної з трансформованої рослини, що застосовують для: (1) оцінки транскрипційної активності або експресії експресійної касети, вбудованої в хромосому рослини; (2) оцінки кількості копій інсерцій в ДНК рослини; й (3) оцінки зиготності насінин, що утворювалися після розмноження. 3-НТО також застосовують в реакціях ампліфікації ДНК, виділеної з трансформованої рослини, щоб охарактеризувати збереженість вбудованої касети. Приклад 3'-
НТО, застосованої у практиці даного винаходу, представлений у вигляді ЗЕО ІЮО МО: 5.
В одному варіанті реалізації запропоновані фрагменти 3-НТО, розкритої у даному документі. Фрагменти 3-НТО можуть мати активність повнорозмірної 3'-НТО послідовності, та їх можна застосовувати окремо або в комбінації з іншими регуляторними елементами або фрагментами елементів експресії. У певних варіантах реалізації запропоновані фрагменти 3"
НТО, що містять щонайменше приблизно 50, щонайменше приблизно 75, щонайменше приблизно 95, щонайменше приблизно 100, щонайменше приблизно 125, щонайменше приблизно 150, щонайменше приблизно 175, щонайменше приблизно 200, щонайменше приблизно 225, щонайменше приблизно 250, щонайменше приблизно 275, щонайменше приблизно 300, щонайменше приблизно 500, щонайменше приблизно 600, щонайменше приблизно 700, щонайменше приблизно 750, щонайменше приблизно 800, щонайменше приблизно 900 або щонайменше приблизно 1000 або більше суміжних нуклеотидів молекули
ДНК, що має 3' НТО активність, яка описана у даному документі. У певних варіантах реалізації у даному документі запропоновані фрагменти будь-якої з БЕО ІЮО МО: 5, що мають активність повнорозмірної послідовності. Способи одержання таких фрагментів з вихідної 3' НТО молекули загальновідомі в даній області техніки.
У даному документі термін "енхансер" або "енхансерний елемент" відноситься до цис- бо активного регуляторного елемента функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК,
також відомого як цис-елемент, який забезпечує один із аспектів загального паттерна експресії, але зазвичай його одного недостатньо для стимулювання транскрипції. На відміну від промоторів, енхансерні елементи зазвичай не містять сайт початку транскрипції (155), ТАТА- боксу або еквівалентної послідовності ДНК. Промотор або фрагмент промотору у природніх умовах може містити один або більше енхансерних елементів, які впливають на транскрипцію функціонально пов'язаної послідовності ДНК. Енхансерний елемент також можна з'єднати з промотором для одержання химерного промотору з цис-елементом, який забезпечує один аспект загальної модуляції експресії гена. Застосовуваний для реалізації винаходу приклад енхансерного елемента, отриманого з передбачуваного промотору гена убіквітину ВошціеЇоца дгасіїз, представлений у вигляді 5ЕО 10 МО7.
Вважають, що багато з промоторних енхансерних елементів зв'язують ДНК- зв'язуючі білки та/або впливають на топологію ДНК, даючи локальні конформації, які вибірково дозволяють або обмежують доступ РНК-полімерази до ДНК-матриці, або сприяють виборчому розкриттю подвійної спіралі на сайті ініціації транскрипції. Функцією енхансерного елемента може бути зв'язування транскрипційних факторів, які регулюють транскрипцію. Деякі енхансерні елементи зв'язують більше одного транскрипційного фактора, і транскрипційні фактори можуть взаємодіяти з різними афінностями з більше ніж одним енхансерним доменом. Енхансерні елементи можна ідентифікувати різними методиками, включаючи делеційний аналіз, тобто, видалення одного або більше нуклеотидів із 5' кінця або з боку промотору, аналіз ДНК- зв'язуючого білка з використанням футпринтингу ДНК-азою І, інтерференцію метилювання, аналіз зміни рухливості при електрофорезі, іп мімо геномний футпринтинг за допомогою опосередкованої легуванням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) й інші стандартні аналізи, або за допомогою аналізу подібності послідовностей ДНК з використанням відомих мотивів цис- елементів як цільової послідовності або енхансерних елементів як цільового мотиву за допомогою стандартних методів порівняння послідовностей ДНК, таких як ВГА5Т. Тонку структуру енхансерного домену можна додатково досліджувати за допомогою мутагенезу (або заміни) одного або більше нуклеотидів або іншими стандартними методами, відомими в даній області техніки. Енхансерні елементи можна одержати шляхом хімічного синтезу або виділення з регуляторних елементів, які містять такі елементи, та їх можна синтезувати з додатковими
Зо фланкуючими нуклеотидами, які містять корисні сайти ферментів рестрикції для полегшення наступної роботи. Дизайн, конструкція та застосування енхансерних елементів для модуляції експресії функціонально пов'язаних транскрибованих молекул ДНК включені в обсяг даного винаходу.
У даному документі термін "химерний" відноситься до окремої молекули ДНК, отриманої шляхом гібридизації першої молекули ДНК з другою молекулою ДНК, при цьому ні перша, ні друга молекула ДНК зазвичай не зустрічаються в такій конфігурації, тобто не злиті одна з одною. Таким чином, молекула химерної ДНК являє собою нову молекулу ДНК, яка зазвичай не зустрічається у природніх умовах. У даному документі термін "химерний промотор" відноситься до промотору, отриманого в результаті такої маніпуляції з молекулами ДНК. Химерний промотор може поєднувати два або більше фрагментів ДНК; наприклад, промотор може бути гібридизований з енхансерним елементом. Дизайн, конструкція та застосування химерних промоторів для модуляції експресії функціонально пов'язаних транскрибованих молекул ДНК включені в обсяг даного винаходу.
Химерні регуляторні елементи можна сконструювати так, щоб вони містили різні складові елементи, які можуть бути функціонально пов'язані за допомогою різних відомих в даній області техніки способів, таких як розщеплення ферментами рестрикції та легування, безлігазне клонування, модульне складання продуктів ПЛР під час ампліфікації або прямий хімічний синтез регуляторного елемента, а також інших способів, відомих в даній області техніки. Одержані різні химерні регуляторні елементи можуть складатися з тих самих або варіантів тих самих складових елементів, але відрізняються послідовністю ДНК або ДНК-послідовностями, що містять послідовність зв'язуючої ДНК або послідовності, які можуть бути функціонально пов'язані. Згідно з винаходом послідовності ДНК, запропоновані у вигляді ЗЕО ІЮ МО5:1-5 або 7, можуть забезпечувати референсні послідовності регуляторних елементів, де складові елементи, які містять референсну послідовність, можуть бути приєднані способами, відомими в даній області, та можуть містити заміни, делеції й/або інсерції одного або більше нуклеотидів або мутації, які природним чином виникають при бактеріально-рослинній трансформації клітини.
У даному документі термін "варіант" відноситься до другої молекули ДНК, такої як регуляторний елемент, яка за своїм складом аналогічна, але не ідентична першій молекулі ДНК, і при цьому друга молекула ДНК все ще зберігає загальну функціональність, тобто той самий 60 або близький профіль експресії, наприклад, в результаті більшої або меншої еквівалентності транскрипційної активності, першої молекули ДНК. Варіант може являти собою вкорочену або усічену версію зазначеної першої молекули ДНК або змінену версію послідовності першої молекули ДНК, наприклад, з різними сайтами ферментів рестрикції, або внутрішніми делеціями, замінами або інсерціями. "Варіант" може також включати регуляторний елемент, що має нуклеотидну послідовність, яка містить заміну, делецію або інсерцію одного або більше нуклеотидів референсної послідовності, де похідний регуляторний елемент має більшу або меншу, або еквівалентну транскрипційну активність, ніж відповідна батьківська регуляторна молекула. "Варіанти" регуляторного елемента також охоплюють варіанти, що виникли через мутації, які природно відбуваються при бактеріально-рослинній трансформації клітини. Згідно з даним винаходом полінуклеотидні послідовності, запропоновані у вигляді ФЕО ІЮ МО5: 1-5 або 7 можна застосовувати для створення варіантів, які аналогічні, але не ідентичні за композицією послідовності ДНК вихідного регуляторного елемента, при збереженні загальної функціональності, тобто, такого самого або аналогічного паттерна експресії, як у вихідного регуляторного елемента. Одержання таких варіантів згідно з винаходом загальновідоме фахівцям в даній області техніки в світлі опису даного винаходу та входить в обсяг винаходу.
Вплив модифікацій, дуплікацій або делецій, описаних у даному документі, відносно бажаних аспектів експресії конкретного трансгена, можна досліджувати емпірично в аналізах стабільної та транзієнтної експресії в рослин, як, наприклад, тих, які описані у робочих прикладах даного документа, для підтвердження результатів, які можуть варіюватися залежно від зроблених змін і мети зміни у вихідній молекулі ДНК.
Конструкти
У даному документі термін "конструкт" означає будь-яку рекомбінантну молекулу ДНК, таку як плазміда, косміда, вірус, фаг, або лінійна, або кільцева молекула ДНК або РНК, отриману з будь-якого джерела, здатну до інтеграції в геном або автономної реплікації, яка містить молекулу ДНК, при цьому щонайменше одна молекула ДНК зв'язана з іншою молекулою ДНК функціональним чином, тобто функціонально пов'язана. У даному документі термін "вектор" означає будь-який конструкт, який можна застосовувати з метою трансформації, тобто вбудовування в хазяйську клітину гетерогенної ДНК або РНК. Конструкт зазвичай містить щонайменше одну або більше експресійну касету. У даному документі "експресійна касета"
Зо відноситься до молекули ДНК, що містить щонайменше одну транскрибовану молекулу ДНК, функціонально пов'язану з одним або більше регуляторними елементами, зазвичай щонайменше промотором і 3-НТО.
У даному документі термін "функціонально пов'язана" відноситься до першої молекули ДНК, приєднаної до другої молекули ДНК, при цьому ці перша та друга молекули ДНК розташовані так, що перша молекула ДНК впливає на функцію другої молекули ДНК. Дві молекули ДНК можуть бути або можуть не бути частиною єдиної безперервної молекули ДНК, ї можуть розташовуватися або не розташовуватися поруч. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК у випадку, якщо промотор модулює транскрипцію, що представляє інтерес транскрибованої молекули ДНК в клітині. Лідер, наприклад, функціонально пов'язана з послідовністю ДНК у випадку, якщо вона має здатність впливати на транскрипцію або трансляцію послідовності ДНК.
Конструкти згідно з винаходом можуть бути запропоновані, в одному варіанті реалізації, як конструкти пухлино-індукуючої (Ті) плазміди з подвійною межою, які мають праву межу (ПМ або
АС Ш.КВ) та ліву межу (ЛМ або АОКИи.І В) ділянок Ті-плазміди, виділеної з Адгобасієгійт
Іштеїасіеп5, що містять Т-ДНК, яка, поруч із транспортними молекулами з клітин А. Штеїгасіепв5, дозволяє інтегрувати Т-ДНК в геном рослинної клітини (див., наприклад, патент США 6603061).
Конструкти також можуть містити сегменти кістяка ДНК плазміди, які забезпечують функцію реплікації й антибіотичну селекцію у бактеріальних клітинах, початок реплікації наприклад,
ЕвсПетіснпіа сої, такі як огіз22, початок реплікації з широким діапазоном хазяїнів, такий як огім або огікі, та кодуючу ділянку селективного маркера, таку як Зрес/5ігр, який кодує Тп7 селективний маркерний ген аміноглікозид-аденілтрансферази (аадА), що забезпечує стійкість до спектиноміцину або стрептоміцину, або гентаміцину (Ст, сепі). При трансформації рослин штам бактерії-хазяїна часто являє собою А. іштеїасієп5 АВІ, С58 або І ВА4404; однак інші штами, відомі фахівцям в даній області, можуть функціонувати згідно з винаходом.
Способи складання та введення конструктів у клітину таким чином, щоб транскрибована молекула ДНК транскрибувалася у функціональну молекулу мРНК, яка транслюється й експресується як білок, відомі в даній області техніки. Стандартні композиції та способи одержання та застосування конструктів і хазяйських клітин у практиці згідно з винаходом загальновідомі фахівцям в даній області техніки. Типові вектори, застосовувані для експресії бо нуклеїнових кислот у вищих рослин, загальновідомі в даній області техніки та включають вектори, отримані з Ті-плазміди Адгобрасієгцт їштеїасієпо, і рСаммусмМ транспортний контрольний вектор.
Конструкт може містити різні регуляторні елементи, включаючи всі, запропоновані у даному документі. Будь-які такі регуляторні елементи можуть бути запропоновані в комбінації з іншими регуляторними елементами. Такі комбінації можна конструювати або модифікувати для одержання бажаних регуляторних властивостей. В одному варіанті реалізації конструкти згідно з винаходом містять щонайменше один регуляторний елемент, функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК, функціонально пов'язаною з 3-НТО.
Конструкти згідно з винаходом можуть містити будь-який промотор або лідер, що запропоновані у даному документі або відомі в даній області техніки. Наприклад, промотор згідно з винаходом може бути функціонально пов'язаний з гетерологічним нетрансльованим 5' лідером, таким як лідер, отриманий з гена білка теплового шоку. В якості альтернативи, лідер згідно з винаходом може бути функціонально пов'язаний з гетерологічним промотором, таким як промотор транскрипту 355 вірусу мозаїки цвітної капусти.
Експресійні касети також можуть містити послідовність, що кодує транзитний пептид, яка кодує пептид, який можна застосовувати для націлювання функціонально пов'язаного білка на субклітинну одиницю, зокрема, на хлоропласт, лейкопласт або іншу пластидну органелу; мітохондрії; пероксисому; вакуоль або позаклітинний простір. Багато локалізованих у хлоропластах білків експресуються з ядерних генів як прекурсори, і транзитний білок хлоропласту (СТР) допомагає їм зв'язатися з хлоропластом. Приклади таких виділених білків хлоропластів включають, але не обмежуються ними, ті білки, які зв'язані з малою субодиницею (55) рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази, фередоксином, фередоксиноксидоредуктазою, білком І і білком ІЇ світлопоглинаючого комплексу, тіоредоксином Е Й енолпірувілшикіматфосфатсинтазою (ЕРБР5Б). Транзитні білки хлоропластів описані, наприклад, у патенті США Мо 7193133. Продемонстровано, що хлоропласт може ставати мішенню білків, що не відносяться до хлоропластів, завдяки експресії гетерологічного СТР, функціонально пов'язаного з трансгеном, що кодує білки, які не відносяться до хлоропластів.
Транскрибовані молекули ДНК
У даному документі термін "тгранскрибована молекула ДНК" відноситься до будь-якої
Зо молекули ДНК, яка може бути транскрибована в молекулу РНК, включаючи, але не обмежуючись ними, ті молекули, які містять послідовності, що кодують білок, і ті молекули, на яких синтезуються молекули РНК, що містять послідовності, які підходять для супресії гена. Тип молекули ДНК може включати, але не обмежуватися ними, молекулу ДНК, отриману з тієї самої рослини, молекулу ДНК, отриману з іншої рослини, молекулу ДНК, отриману з іншого організму, або синтетичну молекулу ДНК, таку як молекулу ДНК, що містить антисмисловий код гена, або молекулу ДНК, що кодує штучну, синтетичну або іншим способом модифіковану версію трансгена. Приклади транскрибованих молекул ДНК для вбудовування в конструкт згідно з даним винаходом включають, наприклад, молекули ДНК або гени виду, відмінного від виду, в який вбудована дана молекула ДНК, або гени, які присутні у тому самому виді або походять від нього, але які вбудовані в клітини-реципієнти за допомогою способів генної інженерії, а не класичними методами селекції. "Трансген" відноситься до транскрибованої молекули ДНК, гетерологічної клітині-хазяїну, щонайменше, відносно її положення в геномі зазначеної клітини-хазяїна, або транскрибованої молекули ДНК, штучно вбудованої в геном клітини-хазяїна у поточному або будь-якому попередньому поколінні клітини.
Регуляторний елемент, такий як промотор згідно з винаходом, може бути функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК, яка гетерологічна по відношенню до регуляторного елемента. У даному документі термін "гетерологічний" відноситься до комбінації двох або більше молекул ДНК, якщо такої комбінації зазвичай немає у природніх умовах.
Наприклад, дві молекули ДНК можуть бути отримані від різних видів або дві молекули ДНК можуть бути отримані з різних генів, наприклад, різних генів від одного виду або однакових генів із різних видів. Регуляторний елемент у такий спосіб гетерологічний по відношенню до функціонально пов'язаної транскрибованої молекули ДНК, якщо такої комбінації зазвичай немає у природніх умовах, тобто, транскрибована молекула ДНК зазвичай не пов'язана функціонально з регуляторним елементом.
Транскрибована молекула ДНК в цілому може являти собою будь-яку молекулу ДНК, для якої бажана експресія транскрипту. Така експресія транскрипту може призводити до трансляції отриманої молекули мРНК і, таким чином, до експресії білка. В якості альтернативи, наприклад, транскрибовану молекулу ДНК можна розробити таким чином, щоб в остаточному підсумку 60 забезпечувати зниження експресії конкретного гена або білка. В одному варіанті реалізації цього можна досягти, застосувавши транскрибовану молекулу ДНК, яка орієнтована в антисмисловому напрямку. Звичайний фахівець в даній області техніки добре знайомий із застосуванням такої антисмислової технології. Будь-який ген можна негативно регулювати таким чином, і в одному варіанті реалізації транскрибовану молекулу ДНК можна розробити для супресії певного гена за допомогою експресії молекули ддРНК, малої РНК або мікроРНК.
Таким чином, один варіант реалізації винаходу являє собою рекомбінантну молекулу ДНК, що містить регуляторний елемент згідно з винаходом, такий як регуляторні елементи, запропоновані у вигляді ЗЕО ІЮ МО5:1-5 або 7, функціонально пов'язані з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК для того, щоб модулювати транскрипцію молекули ДНК на бажаному рівні або у бажаному паттерні, коли конструкт інтегрований в геном клітини трансгенних рослин. В одному варіанті реалізації транскрибована молекула ДНК містить ділянку гена, що кодує білок, а в іншому варіанті реалізації транскрибована молекула ДНК містить антисмислову ділянку гена.
Гени, що представляють інтерес з точки зору агрономії
Транскрибована молекула ДНК може бути геном, що представляє інтерес з точки зору агрономії. У даному документі термін "ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії" відноситься до транскрибованої молекули ДНК, яка при експресії у певній тканині рослини, клітині або типі клітин забезпечує бажану характеристику. Продукт гена, що представляє інтерес з точки зору агрономії, може діяти всередині рослини, виявляючи вплив на морфологію, фізіологію, зростання, розвиток, урожайність, склад зерна, харчові характеристики, стійкість до захворювань або шкідників, несприйнятливість до впливу навколишнього середовища або хімічних речовин даної рослини, або може діяти як пестицид при харчуванні шкідника, який поїдає дану рослину. В одному варіанті реалізації винаходу регуляторний елемент згідно з винаходом вбудований в конструкт таким чином, що регуляторний елемент функціонально пов'язаний з транскрибованою молекулою ДНК, яка є геном, що представляє інтерес з точки зору агрономії. В трансгенній рослині, що містить такий конструкт, експресія гена, що представляє інтерес з точки зору агрономії, може надавати корисну з точки зору агрономії властивість. Корисна з точки зору агрономії ознака може включати, наприклад, але не обмежуватися ними, стійкість до гербіцидів, боротьбу з комахами-шкідниками, модифіковану врожайність, стійкість до захворювань, стійкість до патогенів, зростання та розвиток модифікованих рослин, вміст модифікованого крохмалю, вміст модифікованої олії, вміст модифікованих жирних кислот, вміст модифікованого білка, дозрівання модифікованих плодів, поліпшену поживність для тварин і людини, продукцію біополімерів, стійкість до екологічного стресу, фармацевтичні пептиди, поліпшені характеристики обробки, поліпшений смак, технологію одержання гібридних насінин, поліпшену продукцію волокна та продукцію бажаного біопалива.
Відомі в даній області техніки приклади генів, що представляють інтерес з точки зору агрономії, включають гени стійкості до гербіцидів (наприклад, Патенти США МоМо. 6803501, 6448476, 6248876, 6225114, 6107549, 5866775, 5804425, 5633435, і 5463175), підвищеної врожайності (наприклад, Патенти США МоМо. О5БКЕЗ38446, 6716474, 6663906, 6476295, 6441277, 6423828, 6399330, 6372211, 6235971, 6222098, і 5716837), боротьби з комахами-шкідниками (наприклад, Патенти США МоМо. 6809078, 6713063, 6686452, 6657046, 6645497, 6642030, 6639054, 6620988, 6593293, 6555655, 6538109, 6537756, 6521442, 6501009, 6468523, 6326351, 6313378, 6284949, 6281016, 6248536, 6242241, 6221649, 6177615, 6156573, 6153814, 6110464, 6093695, 6063756, 6063597, 6023013, 5959091, 5942664, 5942658 5880275, 5763245, і 5763241), стійкості до грибкових захворювань (наприклад, Патенти США МоМо. 6653280, 6573361, 6506962, 6316407, 6215048, 5516671, 5773696, 6121436, 6316407, і 6506962), стійкості до вірусів (наприклад, Патенти США МоМо. 6617496, 6608241, 6015940, 6013864, 5850023, і 5304730), стійкості до нематодів (наприклад, патент США Мо 6228992), стійкості до бактеріальних захворювань (наприклад, патент США Мо 5516671), росту та розвитку рослини (наприклад,
Патенти США МоМо. 6723897 і 6518488), продукції крохмалю (наприклад, Патенти США МоМо. 6538181, 6538179, 6538178, 5750876, 6476295), продукції модифікованих олій (наприклад,
Патенти США МоМо. 6444876, 6426447, і 6380462), високої продукції олій (наприклад, Патенти
США МоМо. 6495739, 5608149, 6483008, і 6476295), вмісту модифікованих жирних кислот (наприклад, Патенти США МоМо. 6828475, 6822141, 6770465, 6706950, 6660849, 6596538, 6589767, 6537750, 6489461, і 6459018), високої продукції білка (наприклад, патент США Мо 6380466), дозрівання плодів (Патент США Мо 5512466), підвищеної поживності для тварин і людей (наприклад, Патенти США МоМо. 6723837, 6653530, 6541259, 5985605, і 6171640), біополімерів (наприклад, Патенти США МоМо. ОЗКЕЗ37543, 6228623, і 5958745 і 6946588), бо стійкості до екологічних стресів (наприклад, патент США Ме 6072103), фармацевтичних пептидів і секретованих пептидів (наприклад, Патенти США МоеоМо. 6812379, 6774283, 6140075, і 6080560), поліпшених характеристик обробки (наприклад, патент США Мо 6476295), поліпшеної перетравлюваності (наприклад, патент США Мо 6531648), низької рафінози (наприклад, патент
США Мо 6166292), промислової продукції ферментів (наприклад, патент США Мо 5543576), поліпшеного смаку (наприклад, патент США Мо 6011199), фіксації азоту (наприклад, патент
США Мо 5229114), продукції гібридних насінин (наприклад, патент США Мо 5689041), продукції волокон (наприклад, Патенти США МоМо 6576818, 6271443, 5981834, і 5869720) і продукції біопалива (наприклад, патент США Мо 5998700).
В якості альтернативи, ген, що представляє інтерес з точки зору агрономії, може впливати на вищезгадані характеристики рослин або фенотипів шляхом кодування молекули РНК, яка викликає цілеспрямовану модуляцію експресії ендогенного гена, наприклад, за допомогою антисмислової (див., наприклад, патент США 5107065); інгібіторну РНК ("РНКІ", включаючи модуляцію експресії гена за допомогою механізмів, опосередкованих міРНК, малою РНК, транс- діючими малими РНК і фазованими малими РНК, наприклад, як описано в опублікованих заявках США 2006/0200878 і 2008/0066206 і в заявці на патент США 11/974 469); або за допомогою опосередкованих косупресією механізмів. РНК також може являти собою каталітичну молекулу РНК (наприклад, рибозим або рибоперемикач; див., наприклад, США 2006/0200878), сконструйований для розщеплення бажаного ендогенного продукту мРНК.
Способи конструювання та введення конструктів у клітину таким чином, щоб транскрибована молекула ДНК транскрибувалася в молекулу, яка здатна викликати супресію гена, відомі в даній області техніки.
Селективні маркери
З регуляторними елементами згідно з винаходом можна також застосовувати селективний маркер трансгенів. У даному документі термін "селективний маркер трансгена" відноситься до будь-якої транскрибованої молекули ДНК, експресію якої або ж її відсутність в трансгенній рослині, тканині або клітині можна виявити за допомогою скринінгу або оцінити яким-небудь чином. Селективні маркери генів і пов'язані з ними методи селекції та скринінгу, що застосовуються у практиці винаходу, відомі в даній області техніки та включають, але не обмежуються ними, транскрибовані молекули ДНК, що кодують В-глюкуронідазу (505), зелений
Зо флюоресцентний білок (СЕР), білки, які обумовлюють стійкість до антибіотиків, і білки, які обумовлюють стійкість до гербіцидів. Приклад селективного маркера трансгена запропонований у вигляді зЕО ІЮ МО:6.
Клітинна трансформація
Даний винахід також відноситься до способу одержання трансформованих клітин і рослин, які містять щонайменше один або більше регуляторний(х) елементі(ів), функціонально пов'язаний(х) з транскрибованою молекулою ДНК.
Термін "трансформація" відноситься до введення молекули ДНК у реципієнта-хазяїна.
У даному документі термін "хазяїн" відноситься до бактерій, грибів або рослин, включаючи будь-які клітини, тканини, органи або потомство бактерій, грибів або рослин. Рослинні клітини та тканини рослин, що представляють особливий інтерес, включають протопласти, калуси, коріння, бульби, насіння, стебла, листя, саджанці, ембріони та пилок.
У даному документі термін ""трансформований" відноситься до клітини, тканини, органу або організму, в який була введена чужорідна молекула ДНК, як, наприклад, конструкт. Введена молекула ДНК може бути інтегрована в геномну ДНК клітини-реципієнта, тканини, органу або організму, так що введена молекула ДНК успадковується наступним потомством. "Трансгенна" або "трансформована" клітина або організм може також включати потомство даної клітини або організму та потомство, отримане в результаті програм розведення з використанням такого трансгенного організму в якості батька при схрещуванні, та проявляє змінений фенотип, що виникає в результаті присутності чужорідної молекули ДНК. Введена молекула ДНК також може бути тимчасово інтегрована в клітину-реципієнт, так що введена молекула ДНК не успадковується наступним потомством. Термін "трансгенний" відноситься до бактерії, гриба або рослини, що містить щонайменше одну або більше гетерологічну(ї) молекулу(и) ДНК.
Існує багато способів введення молекул ДНК в рослинні клітини, загальновідомих фахівцям.
Зазвичай цей процес включає стадії відбору підходящої клітини-хазяїна, трансформації клітини- хазяїна вектором й одержання трансформованої клітини-хазяїна. Способи та матеріали для трансформації рослинних клітин шляхом введення рослинного конструкта в геном рослини у практиці даного винаходу можуть включати будь-який із загальновідомих і продемонстрованих способів. Підходящі способи включають, але не обмежуються ними, бактеріальну інфекцію (наприклад, Адгорасіегішт), бінарні вектори ВАС, пряму доставку ДНК (наприклад, за бо допомогою ПЕГ-опосередкованої трансформації, поглинання ДНК, опосередковане сушінням/
інгібуванням, електропорацію, збудження карбідокремнієвими волокнами та прискорення покритих ДНК частинок), редагування генів (наприклад, систем СКІБРЕ-Сав), серед інших.
Клітини-хазяїни можуть являти собою будь-яку клітину або організм, як, наприклад, рослинну клітину, клітину водорості, водорость, клітину гриба, гриб, бактеріальну клітину або клітину комах. У конкретних варіантах реалізації клітини-хазяїни та трансформовані клітини можуть включати клітини, отримані з культурних рослин.
Трансгенну рослину потім можна регенерувати з трансгенної рослинної клітини згідно з даним винаходом. Використовуючи традиційні методи розведення або самозапилення, можна одержати насіння з такої трансгенної рослини. Такі насіння й отримана рослина-нащадок, вирощена з таких насінин, будуть містити рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом і, отже, будуть трансгенними.
Трансгенні рослини згідно з даним винаходом можуть самозапилюватися, забезпечуючи насіння для гомозиготних трансгенних рослин згідно з даним винаходом (гомозиготні за рекомбінантною молекулою ДНК), або можуть схрещуватися з рослинами, що не є трансгенними, або різними трансгенними рослинами, забезпечуючи насіння для гетерозиготних трансгенних рослин згідно з даним винаходом (гетерозиготні за рекомбінантною молекулою
ДНК). Як гомозиготні, так і гетерозиготні трансгенні рослини згадуються у даному документі як "рослини-нащадки". Рослини-нащадки являють собою трансгенні рослини, що походять від вихідної трансгенної рослини та містять рекомбінантну молекулу ДНК згідно з винаходом.
Насіння, одержувані із застосуванням трансгенної рослини згідно з винаходом, можна зібрати та застосувати для вирощування поколінь трансгенних рослин, тобто, рослинного потомства згідно з винаходом, включаючи конструкт згідно з даним винаходом й експресію гена, що представляє інтерес з точки зору агрономії. Описи способів розмноження, які зазвичай застосовують для різних культур, можна знайти в одному з декількох довідників: див., наприклад, АїПага, Ргіпсірієз ої Ріапі Вгеєдіпд, Чопп Уміеу в Зопв, МУ, О. ої СА, Оамі5, СА, 50-98 (1960); біттопав, Ргіпсіріє5 ої Стор Ітргометепі, І опдтап, Іпс., ММ, 369-399 (1979); Зпеер і
Непагікзеп, Ріапі Бгеєедіпуд Регересіїмез, Мадепіпдеп (єд), Сепіег їог Адгісийига! Рибіївпіпа апа
Боситепіайоп (1979); Рені, Боубеапе: Ітргометепі, Ргодисіоп апа Овбев5, 2-е видання, монографія, 16:249 (1987); ЕРенг, Ргіпсіріє5 ої Мапеїу ЮОемеіортенпі, ГПнеогу апа ТесНпідне, (Мої. 1) і Стор 5ресієз б5оуреап (Мої. 2), Іожа іаїє Опім., Мастійап Риб. Со., ММ, 360-376 (1987).
Трансформовані рослини можна досліджувати на присутність гена, що представляє інтерес, або генів і рівня та профілю експресії, забезпечуваного регуляторними елементами згідно з даним винаходом. Фахівцям в даній області техніки відомі численні способи, доступні для дослідження трансформованих рослин. Наприклад, способи аналізу рослин включають, але не обмежуються ними, саузерн-блоти або нозерн-блоти, аналізи на основі ПЛР, біохімічні аналізи, способи скринінгу за фенотипом, польові оцінки й імунодіагностичні аналізи. Експресію транскрибованої молекули ДНК можна виміряти із застосуванням ТадМапФф (Арріїед Віозузіетв5,
Фостер Сіті, Каліфорнія), реактиви та способи описані виробником, і за допомогою визначення часу ПЛР-циклів із застосуванням ТадМапт ТезііпуМаїгіх. В якості альтернативи, для оцінки експресії трансгена можна застосовувати Іпмадемкю (Тріга УМмаме Тесппоіодіе5, Мааізоп, УМ), реактиви та способи описані виробником.
Згідно з даним винаходом також запропоновані частини рослини згідно з винаходом.
Частини рослин включають, але не обмежуються ними, листя, стебла, коріння, бульби, насіння, ендосперм, насіння зачаток і пилок. Частини рослин згідно з винаходом можуть бути життєздатними, нежиттєздатними, здатними до регенерації та нездатними до регенерації.
Згідно з винаходом також включені та запропоновані трансформовані рослинні клітини, що містять молекулу ДНК згідно з винаходом. Трансформовані або трансгенні рослинні клітини згідно з винаходом включають здатні до регенерації та нездатні до регенерації рослинні клітини.
Згідно з винаходом також запропонований товарний продукт, який отриманий з трансгенної рослини або її частини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом.
Товарні продукти згідно з винаходом містять детектовану кількість ДНК, що містить послідовність ДНК, яка вибрана з групи, що складається з БЕО ІЮ МО:1-5 або 7. У даному документі "товарний продукт" відноситься до будь-якої композиції або продукту, якас(ий) складається з матеріалу, отриманого з трансгенної рослини, насіння, рослинної клітини або частини рослини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно з даним винаходом. Товарні продукти включають, але не обмежуються ними, оброблені насінини, зерна, частини рослин і шрот. Товарний продукт згідно з винаходом буде містити детектовану кількість ДНК, що відповідає рекомбінантній молекулі ДНК згідно з винаходом. Детекцію однієї або більше з таких
ДНК в зразку можна застосовувати для визначення вмісту товарного продукту або його бо джерела. Можна застосовувати будь-який стандартний спосіб детекції молекул ДНК, включаючи способи детекції, описані у даному документі.
Винахід можна краще зрозуміти, звернувшись до наступних прикладів, які наведені в якості ілюстрації та не призначені для обмеження обсягу даного винаходу, якщо не зазначено інше.
Фахівцям в даній області техніки повинно бути зрозуміло, що методики, описані у наступних прикладах, являють собою методики, які, як виявили автори винаходу, добре працюють при реалізації винаходу. Однак фахівцям в даній області техніки в світлі даного опису повинно бути зрозуміло, що у конкретні варіанти реалізації, описані у даному документі, можна внести багато змін і, проте, одержати аналогічні або подібні результати без відступу від сутності й обсягу винаходу, тому всю інформацію, викладену або показану тут, слід інтерпретувати як ілюстративну, а не як обмежуючу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
Ідентифікація та клонування регуляторних елементів
Нові регуляторні елементи транскрипції та група регуляторних елементів експресії (ЕХР) були ідентифіковані та клоновані з геномної ДНК однодольних рослин ВоцівЇоца дгасіїів.
Застосовуючи ідентифіковані послідовності, проводили біоінформаційний аналіз для ідентифікації регуляторних елементів в ампліфікованій ДНК. Наприклад, проводили біоїінформаційний аналіз для ідентифікації сайту початку транскрипції (Т55) та будь-якої двонаправленої, інтронної або розташованої вище кодуючої послідовності, що присутня у даній послідовності. Використовуючи результати даного аналізу, у послідовності ДНК визначили регуляторні елементи та розробили праймери для ампліфікації регуляторних елементів.
Відповідні молекули ДНК для регуляторних елементів ампліфікували з використанням стандартних умов полімеразної ланцюгової реакції з праймерами, що містять унікальні сайти ферментів рестрикції, та геномної ДНК, виділеної з Вошеїоца дгасіїб5. Отримані фрагменти ДНК лігували у базові рослинні вектори експресії із застосуванням стандартних способів розщеплення ферментом рестрикції сумісного сайту рестрикції та лігування ДНК.
Аналіз регуляторного елемента Т55 і меж сплайсингу інтрон/'екзон можна провести із застосуванням тканини трансформованої рослини. Коротко, рослини трансформують рослинними векторами експресії, що містять клоновані фрагменти ДНК, функціонально
Зо пов'язані з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК. Потім застосовують 5-ВНАСЕ систему для швидкої ампліфікації кКДНК-кінців, версія 2.0 (Іпмігодеп, Карлобад, Каліфорнія, 92008) для підтвердження регуляторного елемента Т55 і межі сплайсингу інтрон/екзон шляхом аналізу послідовності ДНК за отриманими транскриптами мРНК.
Послідовність ДНК, що кодує групу транскрипційних регуляторних елементів експресії або послідовність ЕХР, отриману з передбачуваного гена убіквітину ВоціеЇоца агасіїв, яка містить промоторний елемент, функціонально пов'язаний з інтронним елементом, представлена в таблиці 1, разом зі своїм відповідним промотором, лідером й інтроном. 3'-НТО, що відповідає передбачуваному гену убіквітину Воціеопа дгасіїв, також представлена в таблиці 1.
Таблиця 1
Транскрипційна група регуляторних елементів експресії, промотор, лідер, інтрон і 3'-НТО, виділені з Вошеїйоца одгасіїї5.
Опис і/або регуляторні елементи ЕХР, зв'язані в 5"-- 3" напрямку , ЕХР: Р-ВООдг.ОБа:2 (ЗЕО 10 МО:2); І -ВООдго ОБат (ЗЕО І
Приклад 2
Аналіз регуляторних елементів, що стимулюють експресію ЗОЗ ов стабільно трансформованих рослинах кукурудзи
Рослини кукурудзи трансформували вектором, а саме рослинним вектором експресії, що містить досліджуваний регуляторний елемент, який стимулює експресію трансгена б глюкуронідази (55). В отриманих рослинах аналізували експресію білка 505, щоб оцінити вплив вибраних регуляторних елементів на експресію.
Рослини кукурудзи трансформували за допомогою рослинного експресійного конструкта
Ии5. Регуляторні елементи клонували у базовий рослинний вектор експресії із застосуванням стандартних способів, відомих в даній області техніки. Отриманий вектор експресії рослин містив ліву примежову область з Адгобрасієгйт іШтеїасієпе (ліва межа В-АСКІи), першу трансгенну селективну касету, використовувану для відбору трансформованих рослинних клітин, яка надає стійкість до гербіциду гліфосату; другу трансгенну касету для оцінки активності регуляторного елемента, яка містила ЕХР-ВОЦОдг.Ора:2 (5БО ІО МО:1), функціонально пов'язаний 5' із синтетичною кодуючою послідовністю, розробленою для експресії в рослинній клітині, що кодує бБ-глюкуронідазу (505, (ЗО1І-Ес.ціаАе. І 51.ппо:1, БЕО ІЮ МО:6) й яка містить процесований інтрон, отриманий зі світлоїндукованого тканиноспецифічного гена картоплі 51-
Ї51 (Сепрапк Ассеззіоп: ХО4753), функціонально пов'язаного 5 з 3' ділянкою термінації, Т-
ВОШЦаг.ОБра (5ЕО І МО:5); і правою примежовою областю з Адгобрасієгійт Шштегасієпв (права межа В-АС ВИ).
Рослинні клітини кукурудзи трансформували із застосуванням бінарного векторного конструкта, описаного вище, за допомогою опосередкованої Адгобасієгішт трансформації, як загальновідомо в даній області техніки. З отриманих трансформованих клітин стимулювали утворення цілої рослини кукурудзи.
Гістохімічний аналіз (ЗИ05 застосовували для якісного та кількісного аналізу експресії трансформованих рослин. Цільні тканинні зрізи інкубували з розчином Х-Сійс (5-бром-4-хлор-3- індоліл-р-глюкуронід) (1 міліграм/мілілітр)у, що забарвлює 5И5, протягом підходящого відрізка часу, промивали та візуально перевіряли на наявність синього забарвлення. Активність СО5 якісно визначали за допомогою прямого візуального огляду або огляду під мікроскопом із застосуванням відібраних органів і тканин рослини.
Для кількісного аналізу експресії 5И5 з відібраних тканин трансформованих рослин кукурудзи екстрагували загальний білок. Один мікрограм загального білка використовували з флюорогенним субстратом 4-метилумбеліферил-В-О-глюкуронідом (МОСС) в загальному реакційному об'ємі 50 мікролітрів. Продукт реакції, 4-метилумбеліферон (4-МО), проявляє максимальний рівень флюоресценції при високому рН, коли іонізована гідроксильна група.
Додавання основного розчину карбонату натрію одночасно зупиняє аналіз і регулює рН для
Зо кількісного визначення продукту флюоресценції. Флуоресценцію вимірювали за допомогою випромінювання при 365 нм, емісії при 445 нм з використанням РіІпоготах-3 з рідером Місготах
Кеадег, з шириною щілини, встановленої при випромінюванні 2 нм і при емісії З нм. Значення наведені в одиницях нмоль бИ5Б/година/мг загального білка.
Для експресії (005 у поколінні Ко відібрали наступні тканини: стадія М4 листків і коріння; стадія М7 листків і коріння; стадія МТ квітки/пильовиків, листків і коріння; К1 стадія качана та ниткоподібних рилець; стадія КЗ зародків насінин й ендосперму через 21 день після запилення (ОСАР). У таблиці 2 нижче показана середня кількісна експресія 55 для всіх відібраних тканин, стимульованих трансгенною касетою з регуляторним елементом, що містить ЕХР-ВОШдг.Оба:2 (ЗЕО І МО: 1) і Т-ВОаг.Обат (5ЕО ІО МО: 5).
Таблиця 2
Середня кількісна експресія (ЗИ5 в стабільно трансформованій кукурудзі, стимульованій регуляторними елементами, отриманими з Вошеїйоца дгасіїї5.
УТ
Як можна бачити з таблиці 2, найбільше високий рівень експресії, пов'язаний з регуляторними елементами, спостерігали в зародках насінин й ендоспермі на стадіях КЗ, 21
БАР. Високу експресію спостерігали також на стадії МТ квіток, пильовиків і листків. Експресія в листках, очевидно, зростала в листках від стадії МА до стадії М7. Експресія в корінні, очевидно, знижувалася від стадії МА до стадії У7, а потім залишалася однаковою від стадії М7 до стадії МТ.
Приклад З
Енхансерні елементи, отримані з регуляторних елементів
Енхансери, отримані з промоторного елемента, представлені у вигляді 5ЕО ІЮ МО:2.
Енхансерний елемент може містити один або більше сі5 регуляторний елемент, який, будучи функціонально пов'язаний 5" або 3" з промоторним елементом або функціонально пов'язаний 5" або 3" з додатковими енхансерними елементами, які функціонально пов'язані з промотором, може підсилювати або модулювати рівні експресії транскрибованої молекули ДНК або забезпечувати експресію транскрибованої молекули ДНК у певному типі клітин або органі рослини, або на певній тимчасовій точці розвитку або циркадного ритму. Енхансери створюють шляхом видалення з промоторів ТАТА-боксу або функціонально подібних елементів і будь-якої послідовності у прямому напрямку зчитування, що дозволяє ініціювати транскрипцію від промотору, представленого у вигляді 5ЕО ІО МО: 2 або її фрагментів.
ТАТА-бокс у промоторах рослин не є настільки висококонсервативним, як в деяких інших еукаріотичних організмах. Отже, для визначення фрагмента в якості енхансера для початку необхідно ідентифікувати сайт початку транскрипції (Т55) гена, при цьому спочатку транскрибують 5-НТО. Наприклад, транскрипційний регуляторний елемент, ЕХР-ВОШадг.Оба2 (ЗЕО ІЮ МО:1), містить промоторний елемент, Р-ВОШдг.Оба:2 (ЗЕО ІЮ МО:2), функціонально пов'язаний з 5-НТО або лідерним елементом, І-ВОШОдгОра:ї (ЗЕБО І МО:3), який функціонально пов'язаний з інтронним елементом, І-ВООдг.Ора: (ЗЕО ІО МО:4). У межах 1095 пар основ промоторного елемента, Р-ВОШдг.ОБба:2 (5ЕО ІЮ МО:2), передбачуваний основний
ТАТА-подібний елемент виявлений в межах нуклеотидів від 1046 до 1053. Енхансерний фрагмент, отриманий з Р-ВООдг.ОБа:2, може містити нуклеотиди від 1 до 1045 з БЕО ІЮО МО2, що дає послідовність, представлену у вигляді ЗЕО ІЮ МО:7 (Е-«ВОШдг.Ора). Енхансери, отримані з промотору, Р-ВОШОдг.ОБра:2 (ЗЕО І МО:2), можуть додатково містити менше великі фрагменти
Е-ВООдг.ОВа (ЗЕО ІО МО:7). Ефективність енхансерних елементів, отриманих із промотору, Р-
ВООдг.ОБа:2, емпірично визначають, конструюючи химерний транскрипційний регуляторний елемент, що містить енхансер, отриманий з промотору, Р-ВОШОдг.Ора:2, який функціонально
Зо пов'язаний з промотором і лідером послідовністю та використовується для стимуляції експресії транскрибованої молекули ДНК, такої як СБ, в аналізі стабільних або транзієнтних рослин.
Може бути необхідне додаткове вдосконалення енхансерного елемента, що перевіряється емпірично. Крім того, положення енхансерного елемента відносно інших елементів у химерному транскрипційному регуляторному елементі також визначають емпірично, оскільки порядок кожного елемента у химерному транскрипційному регуляторному елементі може здійснювати різний вплив залежно від відносного положення кожного елемента. Деякі промоторні елементи будуть містити багато ТАТА-боксів або подібних до ТАТА-боксу елементів і, можливо, багато сайтів початку транскрипції. В таких обставинах може виявитися необхідним спочатку ідентифікувати місце розташування першого Т55, а потім почати конструювання енхансерів із застосуванням першого Т55 для запобігання можливої ініціації транскрипції у передбачуваному енхансерному елементі.
Енхансерні елементи, отримані з промоторного елемента, представленого у вигляді 5ЕО І
МО: 2, клонують із застосуванням відомих в даній області техніки способів так, щоб вони були функціонально пов'язані 5" або 3" із промоторним елементом або функціонально пов'язані 5" або 3" з додатковими енхансерними елементами, які функціонально пов'язані з промотором. В якості альтернативи, енхансерні елементи можна клонувати із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для забезпечення більшого за розміром енхансерного елемента, який містить дві або більше копії енхансера та клонований із застосуванням способів, відомих в даній області техніки так, щоб бути функціонально пов'язаним 5" або 3" із промоторним елементом, або функціонально пов'язаним 5" або 3" із додатковими енхансерними елементами, які функціонально пов'язані з промотором, що призводить до одержання химерного транскрипційного регуляторного елемента. Енхансерні елементи також можна клонувати із застосуванням відомих в даній області техніки способів так, щоб вони були функціонально пов'язані 5" із промоторним елементом, отриманим з організму іншого роду, або функціонально пов'язані 5" або 3" з додатковими енхансерними елементами, отриманими з організмів іншого роду, які функціонально пов'язані з промотором, отриманим або з організму того самого роду, або з організму іншого роду, що призводить до одержання химерного транскрипційного регуляторного елемента. Рослинний трансформаційний вектор експресії 5И05 можна сконструювати із застосуванням відомих в даній області техніки способів подібно конструкту, бо описаному у Прикладі 2, в якому отримані рослинні вектори експресії містять ліву примежову ділянку з Адгобасієгит їштегасієпо (В-АСКИ. ліва межа), першу трансгенну селективну касету, використовувану для відбору трансформованих рослинних клітин, яка надає стійкість до гербіциду гліфосату; і другу трансгенну касету для оцінки активності регуляторного елемента, що містить енхансерний елемент, функціонально пов'язаний 5 або 3 із промоторним елементом або функціонально пов'язаний 5 або 3' з додатковими енхансерними елементами, які в свою чергу функціонально пов'язані з промотором, який функціонально пов'язаний 5 з лідерним елементом, функціонально пов'язаним 5 з інтронним елементом, функціонально пов'язаним з послідовністю, що кодує б-глюкуронідазу (ЗО1І-Ес.цідАне І 51.ппо7, ЗЕО ІЮ МО:б), що містить процесований інтрон, отриманий зі світлоіндукованого тканиноспецифічного гена картоплі 51-51 (Сепрапк Ассезвіоп: Х04753), функціонально пов'язаний З з ділянкою термінації з гена білка, подібного білку-переноснику ліпідів Огуга займа (Т-О5.1 ТР, 5ЕО І0
МО:8); і правою примежовою ділянкою з А. Штеїасієпе (В-АСЕЧи. права межа). Отримані плазміди застосовують для трансформації рослин кукурудзи або інших родів рослин способами, описаними вище. В якості альтернативи, клітини протопласту, отримані з рослини сої або інших родів рослин, трансформують із застосуванням способів, відомих в даній області техніки, для проведення аналізів транзієнтності експресії.
Експресію 55, опосередковану регуляторним елементом, що містить щонайменше один енхансер, оцінюють в аналізах на визначення стабільності або транзієнтності експресії в рослин для визначення впливу енхансерного елемента на експресію транскрибованої молекули ДНК.
Модифікації одного або більше енхансерних елементів, або дуплікації одного або більше енхансерного елемента можна здійснити на основі емпіричного експерименту й отриманої регуляції експресії генів, яку спостерігають при застосуванні кожної композиції регуляторних елементів. Зміна відносного положення одного або більше енхансера в отриманих регуляторних або химерних регуляторних елементах може впливати на транскрипційну активність або специфічність регуляторного або химерного регуляторного елемента, і це визначають емпірично, щоб ідентифікувати найкращі енхансери для бажаного профілю експресії трансгена в рослині кукурудзи або рослині іншого роду.
Приклад 4
Аналіз інтронного посилення активності ЗИ5 із застосуванням отриманих із рослин
Зо протопластів.
Інтрон вибирають на основі експериментів і порівняння з позбавленим інтрона контрольним вектором експресії, щоб емпірично вибрати інтрон і конфігурацію розташування елемента всередині транспортного вектора ДНК (Т-ДНК) для оптимальної експресії трансгена. Наприклад, при експресії гена стійкості до гербіцидів, наприклад СР4, який забезпечує переносимість гліросфату, бажано одержати трансгенну експресію в репродуктивних тканинах, а також вегетативних тканинах, для запобігання втрати врожайності при застосуванні гербіцидів. Інтрон у цьому випадку відбирають за його здатністю при функціональному зв'язуванні з конститутивним промотором підсилювати експресію трансгена, що забезпечує стійкість до гербіцидів, зокрема в репродуктивних клітинах і тканинах трансгенної рослини, тим самим забезпечуючи як вегетативну, так і репродуктивну переносимість обробки гербіцидом у трансгенної рослини. У більшості генів убіквітину 5'НТО містить лідер, який має всередині інтронну послідовність. Тому регуляторні елементи, отримані з таких генів, досліджують з використанням повної 5'НТО, що містить промотор, лідер й інтрон. Щоб добитися різних профілів експресії або модулювати рівень експресії трансгена, інтрон з такого регуляторного елемента можна вилучити або замінити на гетерологічний інтрон.
Інтрон І-ВОШдг.Ора:1, представлений у даному документі у вигляді ЗЕО ІЮО МО4, ідентифікують з використанням контигів геномної ДНК у порівнянні з кластерами експресованих послідовностей з мітками або контигами кДНК, щоб ідентифікувати екзонні й інтронні послідовності в геномній ДНК. Крім того, 5НТО або лідер також використовують для визначення межі сплайсингу інтрон/«екзон одного або більше інтронів в умовах, коли послідовність гена кодує лідерну послідовність, яку перериває один або більше інтронів. Інтрони клонують із застосуванням відомих в даній області техніки способів у рослинний трансформаційний вектор так, щоб вони були функціонально пов'язані 3' з регуляторним елементом і фрагментом лідера та функціонально пов'язані 5 або з другим фрагментом лідера, або з кодуючими послідовностями.
Як обговорювали вище, може бути переважно уникати використання нуклеотидної послідовності АТ або нуклеотиду А безпосередньо перед 5'-кінцем сайту сплайсингу (СТ), і нуклеотиду б або нуклеотидної послідовності ТО, відповідно, відразу після З кінця сайту сплайсингу (АС), щоб виключити можливість появи небажаних стартових кодонів під час бо процесингу матричної РНК в кінцевий транскрипт. Таким чином, можна модифікувати послідовності ДНК поруч із 5 або 3' кінцями сайтів меж сплайсингу.
Посилюючий вплив інтронів оцінюють за їх здатністю підсилювати експресію в аналізі стабільно трансформованих рослин. Для транзієнтного аналізу посилюючого впливу інтронів конструюють базовий рослинний вектор із застосуванням відомих в даній області техніки способів, інтрон клонують у базовий рослинний вектор, аналогічний описаному у Прикладі 2, який має експресійну касету, що містить конститутивний промотор, такий як енхансерний промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, і лідер Р-ї-Сбамму.355-епи (5ЕО І МО:9), функціонально пов'язаний 5 з досліджуваним інтронним елементом (наприклад., ЗЕО І МО:4), функціонально пов'язаним із послідовністю, що кодує (35, яка має процесований інтрон (01І- ес.підАже І 51.ппо:1, ЗБ ІЮ МО:б6), функціонально пов'язаний з З'НТО нопалінсинтази з А. їмтеїасієпв (Т-АСІВТИ.по5-1:1:13, ЗЕО ІЮ МО:10); і другу експресійну касету для селекції трансформованих рослинних клітин. Рослинні клітини кукурудзи трансформують (із застосуванням бінарного векторного конструкта, описаного вище, за допомогою опосередкованої Аагобрасієйт трансформації, як загальновідомо в даній області техніки. З отриманих трансформованих клітин стимулювали утворення цілої рослини кукурудзи.
Трансформанти з однією копією або малою кількістю копій відбирають для порівняння з рослинами з однією копією або малою кількістю копій, трансформованими рослинним трансформаційним вектором, ідентичним досліджуваному вектору, але без досліджуваного інтрона, щоб визначити, чи забезпечує інтрон ефект посилення, опосередкований інтроном.
Інтрон І-«ВОШдг.Ора:1, представлений у даному документі у вигляді БЕО ІЮО МО: 4, можна змінити різними способами, такими як видалення фрагментів в інтронній послідовності, які можуть знизити експресію або дуплікацію фрагментів з інтроном, які можуть підсилювати експресію. Крім того, послідовності ДНК всередині інтрона, які можуть впливати на специфічність експресії у певних типах клітин або тканин й органів, можна дуплікувати або змінити, або вилучити, щоб вплинути на експресію та паттерни експресії трансгена. Крім того, запропонований у даному документі інтрон можна модифікувати, щоб вилучити будь-які потенційні стартові кодони (АТО), які можуть призвести до виникнення незапланованих транскриптів при їх експресії зі сплансованих не належним чином інтронів, як те до відмінних, більше довгих або усічених білків. Після того як інтрон емпірично досліджували або змінили на
Зо основі експериментів, інтрон застосовують для посилення експресії трансгена в стабільно трансформованих рослинах, які можуть відноситися як до родів однодольних, так і до родів дводольних рослин до тих пір, поки інтрон забезпечує посилення трансгена. Інтрон можна також застосовувати для посилення експресії в інших організмах, таких як водорості, гриби або клітини тварин до тих пір, поки інтрон забезпечує посилення або ослаблення або специфічність експресії трансгена, з яким він функціонально пов'язаний.
На підставі ілюстрації й опису принципів даного винаходу фахівцям в даній області техніки повинно бути зрозуміло, що даний винахід можна модифікувати в структурі та деталях без відступу від його принципів. Ми заявляємо права на всі модифікації, в межах сутності й обсягу формули винаходу. Всі цитовані у даному документі публікації й опубліковані патентні документи включені в нього за допомогою посилання тією самою мірою, як якби кожна окрема публікація або заявка на патент була особливо й окремо зазначена як включена за допомогою посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Мопзапто тесппоіоду, ї1С «1205 РОСЛИННІ РЕГУЛЯТОРНІ ЕЛЕМЕНТИ ТА ВАРІАНТИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «1305 МмоМм5:419що «1505 ци 52/340,6556 «1515 2016-05-24 «1602 10 «1705 Раїепіти, версія 3.5 «2105 1 «2115 72066 «2125 ДНК с. «2135 Вотеїсра огастії5 «290» «22їх п тншва ознака «2222 (1У..(2066) , , «223» Послідовність ДНК групи регуляторних елементів експресії, що містить промотор, лідер й інтрон, функціонально пов'язані й отримані з передбачуваного гана убіквітину бутелуа витонченої. «4005 3 їзсозодсаза сдсасадссо додатасазаї стасоадіаса даздттасієї ссаасоззаз 60 адсісссфс сстстаосос аадсазазсо асосададаїє досдассааа засоаттстї 120 тастттасст сохсасбааса ссассодата сддатазоза ддазазссод адсатскста 180 сааїачада аатсоасуїє осстсстада одазозааос дасодсстає стих 240
Істотсдату астссастода вста стс састеКессс остососаах УСС га 300 саазкоаттса тссаатсато саасттасва дазіазвазаї аазазатата атстсадасо 360 тссватсаїо одсІтсставаа азааїаазаз ддасодадаава стасесвоаа аадатазата 420 затасасаас їдтадозасс заадсазаотє сдасазудаз ссазвачсазо дсаватссас 480 ахотостосо азсавоатасо ссжсстссіс соїткстіса ссттостват сасатсоста 540 засасазадо ссоасттазд затудссодаса тодсаастії одстаЗзататт гЕСОСЕТссСЕ 600 тасвасасса засадаадаа тастсзасота ддачзтасасз зтавесктст Єтсассаті 656о0 тІстттадтс асостІттат Ісаассваас асаастсївзо всутастаді астссастаї 720 тіЕсттатттї актіжстсст асадтасієї єдаааавазо даатсттатс аїосатазвії 780 дзаассасов таасозсговс їсасассоєс дсвсоаоотаа соддссассаа ссаавазіад 840 савасоасат свасстостс засатстссо сотсастсЕк стетттстсс асадазавта 900 адтоЗсодоз здадасссса сдасясвасс ссасозсоса ассосттатс осадссодої 9260 ссасассоса ссустуссої адсассатод дастсоддссс асодсссосс стссзассосо 1020 чЧасссасікЕ ссктессстс ссоусоїатаа атассодсссс сестасксує сесстсссга 1050 атссатссода тссссазаїсс заїсссясда дсовавїісує созсодассуз тсдазоасдаз 1140 осадсстесс сесаїсстсї саадотатує одзаєтстісца жсстсстстїс статухтсде 1200 тосодассто стоЗстаода ссдЗаїттаоає тоссотасса косе статтсотує 1250 тТестсававаєс татадісов тосасаоозє азадоастаа тстстазіса аїстасодоє 1320 зяадісЯсто аатксаїтатос тусстісааіт тсСасоїзакт баватссота стостсосто 1380 сддксатото гЕсасасаасє асотасадст сстоссецс асодаєтадс сосастовоЗ 1450 стстзасатт дісдакукув дсосоатсос Ясоддстуєс тадосттоєє ассостдаат 1500 їзадсттаЯаае сао тоттістактї сасоодаїтоадї сессдаєчує ссатоатосає 1550 дебати астауетзоцч тодосоатасс оттсдаттто татттзатсї сістадаатї 1620 ссттазатстї дзааттстеє азхЗтстаса тссзастЯст тастоєкоза таскттсазси 1680 аївїтаасст дссасадЕст їсФгацдіктс сатосасєзаа дссатасаза тасттутає 1740 зкЕтастакЕ Зстосавссє втстсвоаатї стаяттїЗсї асоатастатє зодсстсоага 1800 заїзсттуєх зазатодіта тазатєтосаїє їсасозієся дхасстотта адтсатсата 1860 тЕтаттстст достватосії аїстотзазї здавіттаса садоасттсаа сстастоаст 1920 статоспосао датссоатоата осастосаїє айаасасдоса здкоссктвак дскиксасас 1980 звазтотада астотттата статтаттаї охтастосато тжстаЯкаос стазстстос 2040 сестостасІ зазтткасад чї9с3а 2066 «210» 2 «213» Воштеіїоца дгасіїї5 «220» «221» інша ознака «дв 13, .4К1095) «023» Промоторна послідовність, Отримана з передбачуваного гена убіквітину бутелуа витонченої. «4002 2 тасуадсаза сосасвассо дозтасадає стасуастаса дадстастє ссзасодздаа 50 оастсссоєс сстстадсас азосаадасо асусадзавоаат досдассава аасоаттст 120 тастттасст одЗїсакдаса ссассоцдата содзатааоза дозавассоу азсатстста 180 шфсаатадаза аатсзасосє одссєсстада оддаадаазос засадестат Чек 240 тІтоїсозто атсссастоа астасттстс тастсетс аттотосаає заксстаа 300 сазвасвтїса сссааєсато саасттосава дазїаавааї азававтата атстсавдаса 360 їссазісаїо одстітсстаза зазаїзаааа зоасоадааа стастсазбдаз ззазтавата 420 заїзсасаає соїадоаавасс ззаосаааоє їдасаадода ссазадсазу дсаддієсас 480 асоатостосо арсазатосо ссссстсстс састксттсо сстсосезат сасессоста 540 азхсасзудадо ссодасттаза затоассозса гоосзатттт сстодатаст стос 6о0 тосаясатса засадзацчай таїтаасуко оддадчтатаса зтазстктст тттассаїтту 650 хКсСттставтс соті Тої їсаассаазс асзасттїзо асосаствах астссастат 720 кт ттаттт ат зсваЯквек тазаззазацч ззаксекс агтеасасззатії 7вО чдадаєсасод сазсодсдас тсасассосс асасоддодєаа соддссассва ссазавоїтад 840 сазасєдодсудє савсстсстс авсаїстссу сосастКе сет ЕТскКос дсвдзоавід 960 засдоасодаЯ адодасссса ссасосаасс ссасозсаса ассосттатс дсазссвоаа 960 ссасассоса ссоскцксоає восатсатова дастсосссс ссодсссосс стссодасесо 1020 азсссасткт ссттссеске седтотатаа атассЯасссс ссстостсос стсстесеса 1080 ахссаїссда тоссс 1095 «210» З «211» 59 «212» ДНК шо «213» Воште1оца дгасіі1ї15 «2202 «221» інша ознака «аа (13..(69) ; , гг «223» лідарна послідовність, отримана з передбачуваного гена убіквітнну бутелуа витонченої, «4005 З заїтссвоаїсс сосочадсдаз ассоссдасу ассдассоява дсозадсавас стксесскає бо сстстсзад 59 «210» 4 «?1ї» 907 к2122 ДНК й «213» Воистеїона дгасіїїі« «й2О» «221» інша ознака «022 (1)..(902У , шк «23» Інтронна послідовність, отримана з передбачуваного гена убіквітину бутелуа витонченої. «3005 4 отаїтодсодаат тстісцаксст сстсісстаї дсксоїттої9 даїстостод ссадоавесоа бо їсадаскасс дівсєсвктоєс сттКтсссат тсатаєтсст садаістата одгсадЕКас 120 асадагтадаа дастаатстс тайссозвіст дсодоастадац сівстоаасс ататоастсс 15о тссазессах діаосктада сссотеєтаос ттастосоЗз сатоастоатсвз сасавсасої 240 асадісссту ссотососод астадссоса стузодстсю дасоєтотсо ооо 300 затсососза дстасствад скоїв ссозактадзоа сттоассоах ходасстос 360 тстаїсєсасо здасозкстис захват тсат дгосасастоа ттодїсосто чстадасаді 420 затассатсс дасттссок їтзасстоксї адааєстсстс здасстдаза ссстоасаа 450 їстасзісса дстоскКоск зссуааїтатє ттадсєтатстує їтазістасса бСодІстсаЄ 540 адтітссаїто саїазадсса тосаазтасу ттотатаїтї астзстуста саасссатсу 600 садастстад їссостотот астаттадос сттодтааасоа стутоттлаза таоссасзай бо шакасЕсаї з9стауує стутсзачіс отсакоєтта кт стадст датастатся 728 діпдотадза тттосастазда стссааіста стдастстат додотаддатс тосотазсої 780 тасатсаавс атоодсацічї сттазтостї їсасатвааз тотозавсто стсСаєсаттаєї 840 таїстататас госататтстї додсодсстза сектоссїст дстостаааї гтосазаєує 900 ад 02 «2310» 5 «211» 498 «212» ДНК й «213» Воцтеїоца дгасііїє «20» «221» інша ознака «ай (13,.(498) с. «223» 3 нетрансльована область, отримана з передбачуваного гена убіквЕтину бутелуз витанченої. «41005 5
Ягтсдоксау дадстасіст гЯссестоцЕ їгсасаадта садіакстсї одотататус 80 здсаїссадісє ссостасоді ссоастоато їскстзксої дітаїдадес статотсоїс 120 тадїсоссаЯ тотдавасат сгостосатає асадстаатт сотоатаааас аітоастосає 180 чзідсазскдя стодЯстїат9 заїзаогдаз асстузастє соїгЗзтазаєе стастєсстс 24 тхзатасассаз атохсттоасє сотзатсттс татстастса садтстоастоа дасдасавоя 300 стазатсазт утададстаа даттістстсяЯ сазактоаттта тастааатас сттотоутзвахт 360 тодсдазтаса ааїсдасзоє аветсаацеї соді сткІ зстсатссау аадуссзазда 420 тсосзааттс адатттстто дсадтозазо азїїдаасоаса тасааатттс стктастсЕ 480 тсдатсасав ааттцатс 498 -210» 656 «211» 2001 «122 днк «213» штучна «220х . «223» Синтетична кодуюча послідовність, що кодує бета-глюкуронідазу, сконструйовану для експресії в рослинній клітині. «300» 6 атддсдадас ссоссозоас сссдассаду оаоаїсаада адстодасод сстстаоусс 6о ттстесстса ассасдараа СсСтосодсаєс дассаЯдсосу озосзЗавесс сессстссаво 120 чзадхстадод ссатсяссоє дсссоадсесс сісвасдасс воахтсоссоа соссоасате 180 сосаастасо соддодсаасоє стодтаєсад сосдадататї ссатсссдая адаставосо 250 дассацсаса їсуїасіссаЯа сттсЗзасоєс Яакдасссаст асодсазчдає стазатоаас з00 затсадзадо тазоткестЯ стестасстї тозтасатат атазтазтта їсастазтта 360 отадізатаї ватаїтїсва атаїєтітїї саааатєзааа дааїтоїзоата табвосаатт 420 осссттстоаї зосттаїсзад тотогтатаке Стазссстата астсстствза сабатдасса 43850 азаттіцітЗ агохтосзоз дасздзосас садоосоосу асассссотї созодоссдас 540 осоасоассоє асосоавссос соддавоаїсс дїссдсаїса ссотстосЯє дзасватдад 600 стдвастодс авовссаєссс одсстудсаєа оссатсассо асоздзасод саздаадазо 650 саджсстастї їссасдастї сттсзастас остодсвтсс ассостссоє даїзстстас 720 ассастосса асасссоддаї доасоасаїс вссосодіса сссасуєудс ссаддаєтдє 780 азссаєсцест ссоатудаєто осаватсату дссзасоуасЯ асоїтсацдсдї созЯастасас 840 сасоссдаєс авдсаадєсої тдссассоЗс сазадсасса дсуадсассст ссааатсотс 990 зассстсасс тстдасавуєс тоазсуадуас тасстстасу зоастоатосає сассоссава зво адссаздастя адсосодасаї стассстстс сосотсдоса єсадовосоє состоєсвад 31020 оодсазозсвої тссжсаїсав ссасависст тестасттса стос ссоссасдад 10850 зпасастовес гдадодосаа ддакттсоасє васоїсстда Содіссасуа ссасасіста 1140 аходастодда їсодсоссаа садстасвод ассадтсаст асссотасас саузадата 1200 стдцастоасо стдасуадса сдвгзесосс огоатсзасу здастостоає зісавс 1260 засстакстс тодасаєтоад стїсозодст одозасадос соазадозост дтастстодад 1320 азадсстоєсз асоадсоздає їсадсаваст сатстссада совттзадоз аставітоєс 1350 адоддасзада ассаїссотєс тотсоєдато тодестаєто созаєувосс доасассзаа 1440 сксусазодоз сосоїодата стксосассо стоофсодадчуо сврасксосаа астусвассса 1500 асссотссаа хсасоатосат саатотсату кістосдасо сссатасоада тасачатстся 1550 сзсстаієсо астаїсстто тгстсавтсод бастатадоє зотатоастса дадсодазахт 1620 сЕкоачаєсоо содаазадуї їстіовозад дзастсстод сотодсавда даадстссає 16850 саедссдатса стассасода атасодуаеє дасасастту сопдсстсса садтаєосає 1740 асадататає адісудадодза атассадтої осатодітод зсататаєса тсотасстсс 1800 чассочаєтї сассудстоає сдодсоавасава дістодааст ксосацдактї соссасавос 1550 саззаодатасє сосоздоуса9до адодаасаад азодоаатсі ссасасудда ссоуавуссс 1920 задссазасад сстссстотх асадзадсда тодасавдаа тдазстєсоз адазавасса 1980 садсавоцуєоя озааусауєу а 2001
ПІ 3045 «212» ДНК «21ї» воите1їоиа дгасіїїє «220» к?2ї» інша ознака
«вда» (13..,10453 ше «223» Енхансер, отриманий з промотора передбачуваного гена убікнітину бутелуа витонченої. «40025 7 тасодосава сосасаассо дазтасадат стасодтаса озодоствс ссавсооЗав 60 дакІсссасс ссістаосос азосвацасо асосачадає зотоассада засзаттстї 120 тастттассії доїсаєдаса ссассоцзата содзїзадза ддзааассод адсаїстста 180 дсзасарача аассоасатт оссссстада дозадазазс дасодсстат асттистсх 240 пгт свакоа зігссазстЗза астосттсяс татттттттс яктатосзат дассстадса 300 савасоттса сссавтсато саасттусаз дааїаазааї вааааатата аєстсадаєд 360 тссазісато асттсстааа зааатавааа доасозодаза стастсзавза зазатааата 420 заатасасзас тутадазасс зааосавазі тЯдасаацаза ссазаазсаво асадаєссас 480 атастостос3 зоасачатосоа сстсстсстс састістксЯа сестостзає сасяссоєта 540 затасацадя ссдасттаво аатоассоаса тоадсватттт астодЗататт тктасттсси 500 хдіадсатса аасадаадаа тТатстїзасато одадтатаса одтаажттжст сттассатієї БО тКстссСзакс асЯКТсттог гсзассвавс асзастісзо асетастадіїі астссастає 720 ттттсатттт ветстстсост асвоатасттх гозазааазо даатєсттотс атосасозтї 780 чаазісасод таасозсдає ссасодссуєс дсасудуїтаа судссассава ссазвацад 840 сазасдасуєЄ саасстсстс пдасатстссо саксускктт сттІсссс одсадаадаваат9 00 адсадсодоад аоддасссса сдасосвасс ссасчасоса зссосттатс дсвоссоЧає 9650 ссасаєсоса ссастоассУї восдісатєуо дастсддссс дсддасссосс сіссоассса 1020 часссзсєктк ссттсссссс ссота 1045 «210» 8 «211» 300 «212» ДНК , «213» Огуха «аїзуа «220» «221ї» інша ознака «вд СТУ... (300) Ще . «223» 3" нетрансльована область, отримана з рисового гена білка, подібного білку-переноснику ліпідів. «4002: 5 зтїзатсову сстіссзатсс сттазттасс атассаттас ассатусатс азтаєссата бо
Татататаза сссжтсоса сакасттата статуса сатбасавтає зіатокоссо 120 засдатсодаї стаїсастца їаїсататда стоаїссатс адсстдаїст стасасстка 180 ттгатессостах ассоссазат аваадтттст тссасттоїто хтаатавтта астастстса 240 тстсасаоавас сстататата астівотттаа КІтостуїса дітуаасато атовтсдата 300 «210» 9
«21їх 531 «212» ДНК «215» Штучна кг» з т - м я Ой «223» Енхансерний промотор і наївна лідерна послідовність, отримані з вірусу мозаїки цвітної капусти. «4005 9 чаїссвахзє дадасттїткс азсазаздає засаїссяда засстсстсо дастссаїтта 50 сесавстатс тотссасітта скосозадає зосо9д33339 ЗазодсЯост сстасааато 120 ссаїсаїттас часзаацоза зодссассак сазадвкасс сстассозся абодеесссав 180 абатоадассс ссасссасоа дозоосатсої пдааавадаа дасопстссад ссасутстіс 240 заадсаавато датедатако атодіссораї чІЗадасттт їсазсазадо одтазтатссо з00
Чавасстсстї сдоаттссат сосссадста кстідісвстї тТаттакдазо зізудіозЗаза 360 заодазодсад стсстасадаа тоссаїсатт осоатааадо ааадоассаєс дессзаавта 420 ссжтстассода садтодіссс заадатодас єсссасссас задозесвіс Чт9даазаад во звацпасоттсс зассасотсї Тсзазосзад точаєтазітд тдататстес астдасоїза 540
Чдазатвасос асаатсссас тзиссттсосЄ звадасссткс стстататаа дозаоттсаї 500 - Жжсаткттода дздозсасоас тдавсавсусе 9 631 «210» 10 «2115 253 «2125 ДНК. й , «13» даеагорастегіцт советасівпе «ва «2йїі» інша ознака «вед (135,.(253) - «2232 3" нетрансльована область, отримана з гена нопалінсинтази дагобастесіот ситетбасівп5, «400» 30 й заєсуєтсаа асатстодсв асазачткїс їсазвоатїтоа атсстоктос содіІсттоса 0 акдаттатса татаатттст ус:сЗадїтас дтїсааосато тазїзаттаз сасосавтос 129 агаасоєтає ствтдзоаса да таєо аїсарадісс сусааєтата састіїавтас 1850 зсдатадава асааазтаста одсусосавас твабатазає татсдсоусос дасвісатсх 240 асуттастазд ас 253
Claims (19)
1. Рекомбінантна молекула ДНК для експресії гетерологічної транскрибованої полінуклеотидної молекули, яка містить послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з: а) послідовності, що має щонайменше 95-відсоткову ідентичність послідовності з будь-якою з ЗЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 5 або 7; р) послідовності, що містить будь-яку з БЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 5 або 7; і с) фрагмента, який містить щонайменше 150 суміжних нуклеотидів будь-якої з БЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 5 або 7, де фрагмент має активність регуляції гена; при цьому зазначена послідовність функціонально пов'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК.
2. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка характеризується тим, що зазначена послідовність має щонайменше 97-відсоткову ідентичність послідовності з послідовністю ДНК будь-якої з ФЕО ІО МО: 1, 2, 4, 5 або 7.
3. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка характеризується тим, що зазначена послідовність має щонайменше 99-відсоткову ідентичність послідовності з послідовністю ДНК будь-якої з ФЕО ІО МО: 1, 2, 4, 5 або 7.
4. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка характеризується тим, що зазначена послідовність містить послідовність ДНК будь-якої з ЗЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 5 або 7.
5. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка характеризується тим, що послідовність ДНК має активність регуляції гена.
6. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, яка характеризується тим, що гетерологічна транскрибована молекула ДНК містить ген, що становить інтерес з точки зору агрономії.
7. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 6, яка характеризується тим, що ген, який становить інтерес з точки зору агрономії, обумовлює стійкість рослин до гербіцидів.
8. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 6, яка характеризується тим, що ген, який становить інтерес з точки зору агрономії, обумовлює стійкість рослин до шкідників.
9. Трансгенна рослинна клітина, яка містить рекомбінанту молекулу ДНК для експресії гетерологічної транскрибованої полінуклеотидної молекули, яка включає послідовність, вибрану з групи, що складається з: а) послідовності, що має щонайменше 95-відсоткову ідентичність послідовності з будь-якою з ЗЕО ІЮ МО. 1, 2, 4, 5 або 7; р) послідовності, яка містить будь-яку з БЕЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 5 або 7; і с) фрагмента, який містить щонайменше 150 суміжних нуклеотидів будь-якої з БЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 5 або 7, де фрагмент має активність регуляції гена; при цьому зазначена послідовність функціонально зв'язана з гетерологічною транскрибованою молекулою ДНК.
10. Трансгенна рослинна клітина за п. 9, яка характеризується тим, що зазначена трансгенна рослинна клітина являє собою клітину однодольної рослини.
11. Трансгенна рослинна клітина за п. 9, яка характеризується тим, що зазначена трансгенна рослинна клітина являє собою клітину дводольної рослини.
12. Трансгенна рослина або її частина, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК за п. 1.
13. Рослина-нащадок трансгенної рослини за п. 12 або її частина, причому зазначена рослина- нащадок або її частина містить зазначену рекомбінантну молекулу ДНК.
14. Трансгенна насінина, яка характеризується тим, що насінина містить рекомбінантну молекулу ДНК за п. 1. Зо
15. Спосіб експресії транскрибованої молекули ДНК, який включає отримання трансгенної рослини за п. 12 і культивування рослини, який характеризується тим, що транскрибована ДНК експресується.
16. Спосіб отримання клітини трансгенної рослини, який включає введення в рослинну клітину рекомбінантної молекули ДНК за п. 1.
17. Спосіб за п. 16, який характеризується тим, що введення зазначеної рекомбінантної молекули ДНК в зазначену рослинну клітину включає трансформацію.
18. Спосіб за п. 17, який додатково включає регенерацію трансгенної рослини із зазначеної рослинної клітини.
19. Спосіб отримання клітини трансгенної рослини, який включає: а) отримання трансгенної рослини, яка містить рекомбінанту молекулу ДНК зап.1, і р) схрещування трансгенної рослини з іншою рослиною для отримання рослинного потомства, яке містить зазначену трансгенну рослинну клітину.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662340656P | 2016-05-24 | 2016-05-24 | |
| PCT/US2017/033832 WO2017205287A1 (en) | 2016-05-24 | 2017-05-22 | Plant regulatory elements and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126798C2 true UA126798C2 (uk) | 2023-02-08 |
Family
ID=60412669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201812704A UA126798C2 (uk) | 2016-05-24 | 2017-05-22 | Регуляторний елемент рослини і варіанти його застосування |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10351866B2 (uk) |
| EP (1) | EP3462844A4 (uk) |
| JP (3) | JP7078551B2 (uk) |
| KR (1) | KR102374017B1 (uk) |
| CN (1) | CN109310062B (uk) |
| AR (1) | AR108570A1 (uk) |
| AU (1) | AU2017269292B2 (uk) |
| BR (1) | BR112018073946A2 (uk) |
| CA (1) | CA3024452A1 (uk) |
| CL (1) | CL2018003356A1 (uk) |
| CO (1) | CO2018013885A2 (uk) |
| CR (1) | CR20180607A (uk) |
| MX (1) | MX2018014470A (uk) |
| NI (1) | NI201800123A (uk) |
| NZ (1) | NZ748198A (uk) |
| PE (1) | PE20190224A1 (uk) |
| PH (1) | PH12018502447A1 (uk) |
| SG (1) | SG11201810022XA (uk) |
| UA (1) | UA126798C2 (uk) |
| UY (1) | UY37254A (uk) |
| WO (1) | WO2017205287A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201807540B (uk) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2020314461A1 (en) * | 2019-07-18 | 2022-02-10 | Monsanto Technology Llc | Novel intergenic sequence regions and uses thereof |
Family Cites Families (110)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US37543A (en) | 1863-01-27 | Improvement in machinery for cutting corks and bungs | ||
| US38446A (en) | 1863-05-05 | Improvement in the manufacture of sheet-iron hollow ware | ||
| US5352605A (en) * | 1983-01-17 | 1994-10-04 | Monsanto Company | Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters |
| ZA859400B (en) | 1984-12-10 | 1986-10-29 | Monsanto Co | Insertion of the bacillus thuringiensis crystal protein gene into plant-colonizing microorganisms and their use |
| US6774283B1 (en) | 1985-07-29 | 2004-08-10 | Calgene Llc | Molecular farming |
| US6617496B1 (en) | 1985-10-16 | 2003-09-09 | Monsanto Company | Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs |
| US6608241B1 (en) | 1985-10-29 | 2003-08-19 | Monsanto Technology Llc | Protection of plants against viral infection |
| US5107065A (en) | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
| TR27832A (tr) | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
| US5229114A (en) | 1987-08-20 | 1993-07-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants |
| US5597718A (en) | 1988-10-04 | 1997-01-28 | Agracetus | Genetically engineering cotton plants for altered fiber |
| ATE206462T1 (de) | 1989-02-24 | 2001-10-15 | Monsanto Technology Llc | Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung |
| US5550318A (en) * | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5689041A (en) | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| US6426447B1 (en) | 1990-11-14 | 2002-07-30 | Monsanto Technology Llc | Plant seed oils |
| US5543576A (en) | 1990-03-23 | 1996-08-06 | Mogen International | Production of enzymes in seeds and their use |
| US5969214A (en) | 1990-06-11 | 1999-10-19 | Calgene, Inc. | Glycogen biosynthetic enzymes in plants |
| US5498830A (en) | 1990-06-18 | 1996-03-12 | Monsanto Company | Decreased oil content in plant seeds |
| JP3325022B2 (ja) | 1990-06-18 | 2002-09-17 | モンサント カンパニー | 植物中の増加された澱粉含量 |
| EP0536330B1 (en) | 1990-06-25 | 2002-02-27 | Monsanto Technology LLC | Glyphosate tolerant plants |
| US6483008B1 (en) | 1990-08-15 | 2002-11-19 | Calgene Llc | Methods for producing plants with elevated oleic acid content |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US5866775A (en) | 1990-09-28 | 1999-02-02 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases |
| US5512466A (en) | 1990-12-26 | 1996-04-30 | Monsanto Company | Control of fruit ripening and senescence in plants |
| IL101508A0 (en) * | 1991-04-08 | 1992-12-30 | Rhone Poulenc Agrochimie | Chimeric plant genes based on upstream regulatory elements of helianthinin |
| US5304730A (en) | 1991-09-03 | 1994-04-19 | Monsanto Company | Virus resistant plants and method therefore |
| US5763245A (en) | 1991-09-23 | 1998-06-09 | Monsanto Company | Method of controlling insects |
| US6015940A (en) | 1992-04-07 | 2000-01-18 | Monsanto Company | Virus resistant potato plants |
| US5850023A (en) | 1992-11-30 | 1998-12-15 | Monsanto Company | Modified plant viral replicase genes |
| US6011199A (en) | 1992-12-15 | 2000-01-04 | Commonwealth Scientific | Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour |
| US6013864A (en) | 1993-02-03 | 2000-01-11 | Monsanto Company | Plants resistant to infection by luteoviruses |
| US5322687A (en) | 1993-07-29 | 1994-06-21 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects |
| JPH08509871A (ja) | 1993-09-30 | 1996-10-22 | アグラシータス インコーポレイテッド | 異種ペルオキシダーゼを生産するトランスジェニック綿植物 |
| PL178652B1 (pl) | 1993-11-24 | 2000-05-31 | Monsanto Co | Zrekombinowana cząsteczka dwuniciowego DNA, sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych, odpornych na choroby roślin, oraz genetycznie stransformowana komórka roślinna ziemniaka lub pszenicy |
| US6828475B1 (en) | 1994-06-23 | 2004-12-07 | Calgene Llc | Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism |
| US6080560A (en) | 1994-07-25 | 2000-06-27 | Monsanto Company | Method for producing antibodies in plant cells |
| US6140075A (en) | 1994-07-25 | 2000-10-31 | Monsanto Company | Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells |
| US5750876A (en) | 1994-07-28 | 1998-05-12 | Monsanto Company | Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases |
| US5716837A (en) | 1995-02-10 | 1998-02-10 | Monsanto Company | Expression of sucrose phosphorylase in plants |
| FR2736929B1 (fr) * | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes |
| US6091002A (en) | 1996-03-13 | 2000-07-18 | Monsanto Company | Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants |
| US6946588B2 (en) | 1996-03-13 | 2005-09-20 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use |
| US5958745A (en) | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants |
| US5773696A (en) | 1996-03-29 | 1998-06-30 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6166292A (en) | 1996-04-26 | 2000-12-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant |
| US5985605A (en) | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms |
| US5998700A (en) | 1996-07-02 | 1999-12-07 | The Board Of Trustees Of Southern Illinois University | Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof |
| US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
| US6093695A (en) | 1996-09-26 | 2000-07-25 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP |
| AU741197B2 (en) | 1996-10-29 | 2001-11-22 | Monsanto Company | Plant cellulose synthase and promoter sequences |
| US6713063B1 (en) | 1996-11-20 | 2004-03-30 | Monsanto Technology, Llc | Broad-spectrum δ-endotoxins |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| AP9901541A0 (en) | 1996-11-20 | 1999-06-30 | Ecogen Inc | Broad-spectrum delta-endotoxins. |
| US5942664A (en) | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6171640B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-01-09 | Monsanto Company | High beta-conglycinin products and their use |
| US5972664A (en) | 1997-04-11 | 1999-10-26 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| AR013633A1 (es) | 1997-04-11 | 2001-01-10 | Calgene Llc | METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA. |
| US6372211B1 (en) | 1997-04-21 | 2002-04-16 | Monsanto Technolgy Llc | Methods and compositions for controlling insects |
| US6380466B1 (en) | 1997-05-08 | 2002-04-30 | Calgene Llc | Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat |
| DE69834246T2 (de) | 1997-06-05 | 2007-02-01 | Calgene Llc, Davis | Fett acyl-coa: fettalkohol o-acyltransferasen |
| US6716474B2 (en) | 1997-06-17 | 2004-04-06 | Monsanto Technology Llc | Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants |
| US6441277B1 (en) | 1997-06-17 | 2002-08-27 | Monsanto Technology Llc | Expression of fructose 1,6 bisphosphate aldolase in transgenic plants |
| US6072103A (en) | 1997-11-21 | 2000-06-06 | Calgene Llc | Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression |
| US6063597A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
| US6060594A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
| US6023013A (en) | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| US6653530B1 (en) | 1998-02-13 | 2003-11-25 | Calgene Llc | Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds |
| US6107549A (en) | 1998-03-10 | 2000-08-22 | Monsanto Company | Genetically engineered plant resistance to thiazopyr and other pyridine herbicides |
| US6686513B1 (en) * | 1998-03-19 | 2004-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Sugarcane ubi9 gene promoter sequence and methods of use thereof |
| US6284948B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-09-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes and methods for control of nematodes in plants |
| CA2330180A1 (en) | 1998-06-05 | 1999-12-09 | Calgene Llc | Acyl coa:cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences |
| DK1086236T3 (da) | 1998-06-12 | 2007-12-03 | Calgene Llc | Polyumættede fedtsyrer i planter |
| DE69941390D1 (de) | 1998-07-02 | 2009-10-22 | Calgene Llc | Diacylglyzerin-acyltransferase proteine |
| ES2286886T3 (es) | 1998-07-10 | 2007-12-01 | Calgene Llc | Expresion de peptidos eucarioticos en plastidos de plantas. |
| US6476294B1 (en) | 1998-07-24 | 2002-11-05 | Calgene Llc | Plant phosphatidic acid phosphatases |
| CN1219064C (zh) | 1998-08-04 | 2005-09-14 | 嘉吉有限公司 | 植物脂肪酸去饱和酶启动子 |
| US6723897B2 (en) | 1998-08-10 | 2004-04-20 | Monsanto Technology, Llc | Methods for controlling gibberellin levels |
| US6365802B2 (en) | 1998-08-14 | 2002-04-02 | Calgene Llc | Methods for increasing stearate content in soybean oil |
| US6468523B1 (en) | 1998-11-02 | 2002-10-22 | Monsanto Technology Llc | Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use |
| DE69941009D1 (de) | 1998-11-17 | 2009-07-30 | Monsanto Technology Llc | Phosphonat metabolisierende pflanzen |
| US6531648B1 (en) | 1998-12-17 | 2003-03-11 | Syngenta Participations Ag | Grain processing method and transgenic plants useful therein |
| US6528701B1 (en) | 1999-03-02 | 2003-03-04 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Rice ubiquitin-derived promoters |
| EP1173578A2 (en) | 1999-05-04 | 2002-01-23 | Monsanto Company | Coleopteran-toxic polypeptide compositions and insect-resistant transgenic plants |
| EP1171620A1 (en) | 1999-05-13 | 2002-01-16 | Monsanto Technology LLC | Acquired resistance genes in plants |
| JP2003501065A (ja) | 1999-06-08 | 2003-01-14 | カルジーン エルエルシー | 脂肪酸のβ酸化に関わる蛋白質をコードする核酸配列とその使用法 |
| US6770465B1 (en) | 1999-06-09 | 2004-08-03 | Calgene Llc | Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity |
| US7105730B1 (en) | 1999-07-12 | 2006-09-12 | Monsanto Technology L.L.C. | Nucleic acid molecules and other molecules associated with sterol synthesis and metabolism |
| US6603061B1 (en) | 1999-07-29 | 2003-08-05 | Monsanto Company | Agrobacterium-mediated plant transformation method |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| US6593293B1 (en) | 1999-09-15 | 2003-07-15 | Monsanto Technology, Llc | Lepidopteran-active Bacillus thuringiensis δ-endotoxin compositions and methods of use |
| US6573361B1 (en) | 1999-12-06 | 2003-06-03 | Monsanto Technology Llc | Antifungal proteins and methods for their use |
| JP5111706B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2013-01-09 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物 |
| MXPA02006752A (es) | 2000-01-06 | 2004-09-10 | Monsanto Technology Llc | Preparacion de proteinas y permutenias desalergenizadas. |
| US6657046B1 (en) | 2000-01-06 | 2003-12-02 | Monsanto Technology Llc | Insect inhibitory lipid acyl hydrolases |
| AU2001242005B2 (en) | 2000-03-09 | 2006-04-27 | Monsanto Technology Llc | Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof |
| US6518488B1 (en) | 2000-07-21 | 2003-02-11 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid molecules and other molecules associated with the β-oxidation pathway |
| US6706950B2 (en) | 2000-07-25 | 2004-03-16 | Calgene Llc | Nucleic acid sequences encoding β-ketoacyl-ACP synthase and uses thereof |
| CN101001957B (zh) | 2004-06-09 | 2012-07-04 | 先锋高级育种国际公司 | 质体转运肽 |
| US20060200878A1 (en) | 2004-12-21 | 2006-09-07 | Linda Lutfiyya | Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression |
| DE602006016756D1 (de) | 2005-03-16 | 2010-10-21 | Athenix Corp | Auf cis einwirkende regulierende elemente aus tripsacum-dactyloiden |
| WO2007098042A2 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-30 | Monsanto Technology Llc | Chimeric regulatory sequences comprising introns from dicotyledons for plant gene expression |
| EP3287524A1 (en) | 2006-08-31 | 2018-02-28 | Monsanto Technology LLC | Phased small rnas |
| US7393948B1 (en) | 2007-04-03 | 2008-07-01 | Ms Technologies, Inc. | Ubiquitin regulatory nucleic acids, vectors, and methods of using same |
| US8168859B2 (en) | 2008-08-27 | 2012-05-01 | Pioneer Hi Bred International Inc | Ubiquitin regulatory elements |
| KR102003176B1 (ko) * | 2011-03-25 | 2019-07-24 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 식물 조절 요소 및 그의 용도 |
| EA031636B1 (ru) * | 2011-05-13 | 2019-01-31 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Регуляторные элементы растений и их применение |
| AU2013362921B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-03-01 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| BR102014021330A2 (pt) * | 2013-08-30 | 2015-09-22 | Dow Agrosciences Llc | construtos para expressão de transgenes usando elementos reguladores de genes de ubiquitina de panicum |
| CN106574274B (zh) * | 2014-08-08 | 2020-10-30 | 先锋国际良种公司 | 植物调控元件及其使用方法 |
-
2017
- 2017-05-22 CA CA3024452A patent/CA3024452A1/en active Pending
- 2017-05-22 US US15/602,069 patent/US10351866B2/en active Active
- 2017-05-22 MX MX2018014470A patent/MX2018014470A/es unknown
- 2017-05-22 BR BR112018073946-4A patent/BR112018073946A2/pt unknown
- 2017-05-22 PE PE2018003101A patent/PE20190224A1/es unknown
- 2017-05-22 KR KR1020187036826A patent/KR102374017B1/ko active IP Right Grant
- 2017-05-22 JP JP2018561728A patent/JP7078551B2/ja active Active
- 2017-05-22 CR CR20180607A patent/CR20180607A/es unknown
- 2017-05-22 AU AU2017269292A patent/AU2017269292B2/en active Active
- 2017-05-22 EP EP17803368.4A patent/EP3462844A4/en active Pending
- 2017-05-22 UA UAA201812704A patent/UA126798C2/uk unknown
- 2017-05-22 SG SG11201810022XA patent/SG11201810022XA/en unknown
- 2017-05-22 WO PCT/US2017/033832 patent/WO2017205287A1/en unknown
- 2017-05-22 CN CN201780034744.7A patent/CN109310062B/zh active Active
- 2017-05-22 NZ NZ748198A patent/NZ748198A/en unknown
- 2017-05-23 UY UY0001037254A patent/UY37254A/es active IP Right Grant
- 2017-05-23 AR ARP170101391A patent/AR108570A1/es unknown
-
2018
- 2018-11-09 ZA ZA2018/07540A patent/ZA201807540B/en unknown
- 2018-11-20 PH PH12018502447A patent/PH12018502447A1/en unknown
- 2018-11-22 NI NI201800123A patent/NI201800123A/es unknown
- 2018-11-23 CL CL2018003356A patent/CL2018003356A1/es unknown
- 2018-12-20 CO CONC2018/0013885A patent/CO2018013885A2/es unknown
-
2022
- 2022-03-18 JP JP2022043966A patent/JP2022075843A/ja active Pending
- 2022-03-18 JP JP2022043965A patent/JP7335383B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7335383B2 (ja) | 2023-08-29 |
| JP2022081655A (ja) | 2022-05-31 |
| CO2018013885A2 (es) | 2019-01-18 |
| CR20180607A (es) | 2019-03-26 |
| KR102374017B1 (ko) | 2022-03-14 |
| AU2017269292B2 (en) | 2021-07-22 |
| AU2017269292A1 (en) | 2018-12-06 |
| WO2017205287A1 (en) | 2017-11-30 |
| EP3462844A1 (en) | 2019-04-10 |
| KR20190008933A (ko) | 2019-01-25 |
| US10351866B2 (en) | 2019-07-16 |
| CN109310062B (zh) | 2023-05-16 |
| PH12018502447A1 (en) | 2019-09-09 |
| SG11201810022XA (en) | 2018-12-28 |
| BR112018073946A2 (pt) | 2019-02-26 |
| CA3024452A1 (en) | 2017-11-30 |
| JP2019516388A (ja) | 2019-06-20 |
| RU2018145548A3 (uk) | 2020-10-15 |
| CN109310062A (zh) | 2019-02-05 |
| NZ748198A (en) | 2023-05-26 |
| CL2018003356A1 (es) | 2019-01-11 |
| RU2018145548A (ru) | 2020-06-25 |
| UY37254A (es) | 2018-01-02 |
| NI201800123A (es) | 2019-03-05 |
| JP7078551B2 (ja) | 2022-05-31 |
| AR108570A1 (es) | 2018-09-05 |
| PE20190224A1 (es) | 2019-02-13 |
| JP2022075843A (ja) | 2022-05-18 |
| ZA201807540B (en) | 2019-07-31 |
| MX2018014470A (es) | 2019-02-21 |
| EP3462844A4 (en) | 2019-11-20 |
| US20170342428A1 (en) | 2017-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA119965C2 (uk) | Регуляторний елемент рослин та його застосування | |
| US11851667B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| EA039606B1 (ru) | Регуляторные элементы растений и их использование | |
| JP7335383B2 (ja) | 植物調節エレメント及びその使用 | |
| US11932863B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
| RU2774709C2 (ru) | Регуляторные элементы растений и варианты их применения | |
| JP7422140B2 (ja) | 植物の調節エレメント及びその使用 | |
| OA19276A (en) | Plant regulatory elements and uses thereof. |