UA123765C2 - ПОЛІПЕПТИД Ms1 ПШЕНИЦІ, ЩО МОДУЛЮЄ ЧОЛОВІЧУ ФЕРТИЛЬНІСТЬ, ТА СПОСІБ ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ - Google Patents

Abstract

Винахід стосується касети експресії, що містить перший полінуклеотид, функціонально пов’язаний із гетерологічним, переважним для чоловічої тканини промотором, де вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, який модулює чоловічу фертильність. Винахід також стосується виділеного поліпептиду; вектора; рослинної клітини, яка містить касету експресії; рослини, яка має модульовану чоловічу фертильність; насінини рослини, способу підвищення чоловічої фертильності та способу ідентифікації й/або відбору рослин пшениці, які є гомозиготними або гетерозиготними за мутацією в гені Ms1, де вказана мутація індукує ядерну рецесивну чоловічу стерильність.

Description

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ ВІДНОСИТЬСЯ ВИНАХІД

Даний винахід стосується галузі молекулярної біології рослин, більш конкретно впливу на чоловічу фертильність.

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, ЩО ВІДПРАВЛЕНИЙ В ЕЛЕКТРОННОМУ

ВИГЛЯДІ

Офіційна копія даного переліку послідовностей відправлена в електронному вигляді за допомогою ЕЕ5-УУер як файл переліку послідовностей із назвою КТ5202500-РСТ 51254ХІ у форматі АЗСІЇ, що змінений останній раз 21 вересня 2015 року і має розмір 79 кБ, і подана одночасно з описом. Перелік послідовностей, що міститься у даному документі у форматі АЗСІЇ, є частиною опису та включений у даний документ за допомогою посилання у своєму повному обсязі.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Розвиток селекції гібридних рослин зробив можливим значний прогрес у тому, що пов'язано із якісними і кількісними властивостями одержуваних культур. Збільшення урожайності й комбінація необхідних характеристик, таких як стійкість до захворювань і комах, толерантність до високих температур і засухи, разом із варіаціями складу рослин, є можливими завдяки методикам гібридизації. Ці методики часто значною мірою основані на забезпеченні батьківської особини, яка передає пилок материнській особині з одержанням у результаті гібрида.

Селекцію польових культур здійснюють за допомогою методик, у яких використовується спосіб запилення рослин. Рослина є самозапильною, якщо пилок з однієї квітки переноситься на ту саму або іншу квітку тієї самої рослини або генетично ідентичної рослини. Рослина є перехресно запилюваною, якщо пилок походить від квітки генетично відмінної рослини.

У певних видів, таких як Вгаззіса сатрезвігі5, рослина, як правило, є самостерильною і може бути тільки перехресно запилюваною. У переважно самозапильних видів, таких як соя, пшениця і бавовник, чоловічі й жіночі рослини анатомічно розташовані поруч так, щоб під час природного запилення чоловічі репродуктивні органи даної квітки запилювали жіночі репродуктивні органи тієї ж квітки.

Пшениця м'яка (Тгйісцт аевіїмит) являє собою гексаплоїдну рослину, що має три пари гомологічних хромосом, які визначають геноми А, В і Ю. Ендосперм зерна пшениці включає два гаплоїдних хромосомних набори від материнської клітини й один від батьківської клітини.

Зародок зерна пшениці містить один гаплоїдний хромосомний набір із кожної з материнської та батьківської клітин. Гексаплоїдія вважалася суттєвою перешкодою для дослідження й розробки корисних різновидів пшениці. Фактично, дуже мало відомо про те, як гомологічні гени пшениці взаємодіють, як регулюється їх експресія та як різні білки, що експресуються гомологічними генами, виконують свої функції, окремо або разом. Для стратегій керування експресією полінуклеотидів чоловічої фертильності, у пшениці необхідно буде брати до уваги рівень плоїдності окремого різновиду пшениці. ТгйЙісит аевіїмит є гексаплоїдом, що містить три геноми, позначені як А, В ї ОО (М-21); при цьому кожний геном містить сім пар негомологічних хромосом. Сорти пшениці однозернянки є диплоїдними (М-7), а сорти пшениці двозернянки є тетраплоїдними (М-14).

Важливим аспектом великої частини роботи, яка проводиться щодо генетичних систем чоловічої стерильності, є ідентифікація генів, які впливають на чоловічу фертильність. Такий ген можна застосовувати у різних системах для контролю чоловічої фертильності, у тому числі в тих, які описані у даному документі.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Представлені композиції та способи модулювання чоловічої фертильності у рослини.

Композиції включають касети експресії, що містять один або декілька полінуклеотидів чоловічої фертильності або їх фрагменти або варіанти, функціонально пов'язаних із промотором, причому експресія полінуклеотиду модулює чоловічу фертильність рослини. Представлені різні способи, за допомогою яких у рослини або частини рослини модулюють рівень і/або активність полінуклеотиду або поліпептиду, які впливають на чоловічу фертильність. Також представлені способи ідентифікації та/або відбору рослин пшениці, які є гомозиготними або гетерозиготними за мутацією, що індукує ядерну рецесивну чоловічу стерильність.

ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

На фігурі 1 представлені результати вирівнювання амінокислотних послідовностей М51 ячменю (5ЕО ІЮО МО: 3) і пшениці (ЗЕО ІО МО: 5).

На фігурі 2 представлені результати схрещування для послідовностей серій алелей Іп514, тет1е і т51ї. Координаційні числа відповідають положенням у 5ЕО ІЮ МО: 7.

Фігура З являє собою графічне зображення структури М51 пшениці (що також називається (510) Та! ТРОС).

На фігурі 4 представлені результати вирівнювання гомологів М51 у Ногдеит миїЇдаге (5ЕО ІО МО: 3), Тиййсит аевімит (ЗЕО І МО: 5), Вгаспуродіит аїівіаспуоп (ЗЕО ІО МО: 39) і

Огуга заїїма (5ЕО І МО: 40).

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Далі даний винахід буде описано детальніше у наступних розділах, будуть продемонстровані деякі, але не всі варіанти здійснення даного винаходу. Дійсно, даний винахід можна здійснювати у багатьох різних формах, і його не слід розглядати як обмежений варіантами здійснення, викладеними у даному документі; скоріше дані варіанти здійснення представлені для того, щоб це розкриття задовольняло вимогам чинного законодавства.

Однакові числа відносяться до однакових елементів у всьому документі.

Фахівцю у даній галузі, до якої відноситься даний винахід, буде зрозуміло багато модифікацій та інших варіантів здійснення даного винаходу, викладеного у даному документі, під час використання ідей, представлених у вищенаведеному описі та пов'язаних графічних матеріалах. Таким чином, слід розуміти, що даний винахід не має бути обмежений конкретними розкритими варіантами здійснення, і мається на увазі, що до обсягу доданої формули винаходу включені модифікації й інші варіанти здійснення. Хоча у даному документі використовуються конкретні терміни, вони використовуються лише у загальному й описовому сенсі, а не з метою обмеження.

Ї. Полінуклеотиди чоловічої фертильності

Композиції, розкриті у даному документі, містять полінуклеотиди і поліпептиди, які впливають на чоловічу фертильність. Зокрема, представлені виділені полінуклеотиди, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотну послідовність, наведену під 5Е0

ІЮО МО: 3, 5, 39 або 40, або їх активні фрагменти або варіанти. Додатково представлені поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка кодується описаним у даному документі полінуклеотидом, наприклад, наведені під 5ЕО ІЮО МО: 3, 5, 39 або 40, або їх активні фрагменти або варіанти.

У рослин, що розмножуються статевим шляхом, розвиваються спеціалізовані тканини для вироблення чоловічих і жіночих гамет. Успішне вироблення чоловічих гамет залежить від правильного утворення чоловічих репродуктивних тканин. Тичинка, що являє собою чоловічий

Зо репродуктивний орган рослин, містить клітини різних типів, у тому числі, наприклад, тичинкову нитку, пиляк, тапетум і пилок. Застосовуваний у даному документі вираз «чоловіча тканина» стосується спеціалізованої тканини рослини, що розмножується статевим шляхом, яка відповідає за вироблення чоловічої гамети. Чоловічі тканини включають без обмеження тичинку, тичинкову нитку, пиляк, тапетум і пилок.

Процес утворення зрілого пилкового зерна починається із мікроспорогенезу, під час якого у спорогенній тканині пиляка утворюються мейоцити. Потім відбувається мікрогаметогенез, під час якого ядра мікроспор піддаються асиметричному мітотичному поділу до розвитку мікрогаметофіта або пилкового зерна. Стан «чоловічої фертильності» або «із чоловічою фертильністю» стосується таких рослин, які виробляють зріле пилкове зерно, здатне запліднити жіночу гамету з утворенням наступного покоління нащадків. Застосовуваний у даному документі вираз «впливає на чоловічу фертильність» або «модулює чоловічу фертильність» стосується будь-якого підвищення або зниження здатності рослини виробляти зріле пилкове зерно порівняно із відповідним контролем. «Зріле пилкове зерно» або «зрілий пилок» стосуються будь-якого пилкового зерна, здатного запліднити жіночу гамету з утворенням наступного покоління нащадків. Аналогічно, термін «полінуклеотид чоловічої фертильності» або «поліпептид чоловічої фертильності» стосується полінуклеотиду або поліпептиду, який модулює чоловічу фертильність. Полінуклеотид чоловічої фертильності може, наприклад, кодувати поліпептид, який бере участь у процесі мікроспорогенезу або мікрогаметогенезу.

Певні гени чоловічої стерильності, такі як МАСІ, ЕМ51 або СМЕ2 (Богепзеп еї аї. (2002)

Ріапі у. 29:581-594), перешкоджають росту клітин на стадії тетради. Мутації у гені

ЗРОКОСУТЕЇ ЕЗ5Б/МО22І| Е проявляються на ранній стадії розвитку, але чинять вплив на утворення як пиляка, так і насінного зачатка таким чином, що рослини характеризуються чоловічою й жіночою стерильністю. Ген БРОКОСУТЕЇ Е5З5 Агабрідорзі5 необхідний для ініціації спорогенезу та кодує новий ядерний білок (Сепез5 Юеу. 1999 Аца 15;13(16):2108-17).

Розкриті у даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності включають гомологи та ортологи полінуклеотидів, які, як показано, чинять вплив на чоловічу фертильність. Наприклад, розкриті у даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності та їх активні фрагменти і варіанти включають гомологи й ортологи М51. Рослини без функціонального М51 характеризуються фізіологічними змінами у розвитку репродуктивної тканини й чоловічою бо стерильністю. Для фенотипування мутантів т51 застосовують методики, добре відомі з рівня техніки. Наприклад, скринінг щодо фенотипу із чоловічою стерильністю у пшениці СіІадій5 здійснюють наступним чином. Для попередження утворення насіння, одержаного у результаті перехресного запилення, колоси перед цвітінням накривають паперовими пакетами, закріпленими за допомогою скріпки для паперу. Накривають щонайменше три колоси на рослину та застосовують їх для кількісного оцінювання фертильності. Для визначення кількісного показника фертильності рахують кількість квіток на колос і кількість насінин на колос та виражають у вигляді числа утворених насінин на квітку.

Як розкрито в інших розділах даного документа, ЗЕО ІЮО МО: 4 являє собою послідовність, що кодує М51 пшениці. ЗЕО ІЮ МО: 7 являє собою нативну геномну послідовність М51 пшениці.

ЗЕО ІО МО: 9 являє собою варіантну геномну послідовність М51. ЗЕО ІЮО МО: 39 являє собою гомолог М51 із Вгаспуродішт. ЗЕО ІЮ МО: 40 являє собою гомолог М51 рису.

Мутанти Тгййсит аевзіїмут ГІ... за локусом Іт51 на хромосомному плечі 485 включають: - Ридзіеу (тва); див., о Ридзіву, А.Т. апа В.М. Огат (1959) Сепіс таїє вієтпійу іп м/Неєаї. А!йві. РІ. Вгеєд. Сепвеї.

Мемуві. Мо. 14:10-11; о Зипезоп, С.А. (1962) Ове ої Риавієу 5 вієпе жмпеаї іп сто55 Бгеєдіпд. Стор 5сі. 2:534-535; і о Мапіпде, у. апа 7емеп, А.С. (1968) Спготозоте питрбегз іп Ридіеу' 5 (в5іс) таїє 5іепе мпеаї.

Еирпуїса 17:378-380. - Ргори5 (іт51р); див., Еоззаїї, А. апа М. ІпдоїЯй (1970) А таїе 5іегіє тшапі іп Т/(йсит аевіїмит. М/Ннеаї Іптогтаїоп 5егмісе (Куою) 30:3-10. - Согпегеіопе (т51с); див., ЮОгізсоїЇ, С.У. апа К.К. Вагіом/ (1976) Маїе «Тегіїку іп ріапіє: Іпаисфіоп, івоїайоп апа шйцігайоп. рр. 123-131 у Іпдисеа Мшїайоп іп Сто55-Вгеєдаіпо, ІАЕА, Відень, Австрія.

Мутації у Ргоби5 і Согтпегеїопе були індуковані опроміненням і, можливо, є результатом кінцевої делеції хромосомного плеча 485. Мутант Ридзієу був виділений як спонтанний мутант.

Розташування гена т51 було фізично піддане картуванню у ділянці, що становить дистальні 1695 хромосомного плеча 485 (Епао еї а. (1991) Тне дарапезе доштпаї ої Сепеїїсв 66(3):291-295;

Кііпажонн еї а!. (2002) Стор 5сі. 42:1447-1450; Сепсі єї а!. (2003) Тнеог. Аррі. Сепеї 107(5):931-9.

У даному документі представлені каузальні варіанти мутацій М51: т51й, т51е, т51ї і т510, що являють собою маркери, тісно зчеплені з геном Ме51 на хромосомі 485. Маркери включають

Коо) ЕТО487, ЕТО488, ЕТО489, ЕТО490, ЕТО491, ЕЄТО495, 007-0033.1 ії 007-0046.1; див., послідовності під 5БЕО ІЮО МО: 24-29 та 32-33. Такі маркери можна застосовувати для відстеження тв514, т516, т5ії або т51й під час наступного самозапилення і схрещування ліній пшениці, що містять мутації твій, тв51іе, тве1ї або те5і1й , щоб переконатися у тому, що ознака чоловічої стерильності переважно успадковується у програмі селекції пшениці.

Мутації М51: т51йа, т51е і т51ї7 є рецесивними мутаціями гена М51, які були індуковані у різновиді пшениці Спгі5 за допомогою етилметансульфонату (Кіїпажогій еї аІ. 2002. Стор 5061. 42:1447-1450). Мутація т51й в екзоні 1 була створена за допомогою ТІ ІМС (Тагдеїіпд Іпдисєй

Ї оса! І евіоп5 ІМ Сепотез - індукованих спрямованим впливом місцевих пошкоджень у геномах;

МссСаїшт еїа!. (2000) Маї. Віотесппої. 18:455-457).

Селекціонер може переважно застосовувати молекулярні маркери для ідентифікації особин, що містять мутацію М51, шляхом ідентифікації маркерних алелів, які демонструють статично значущу ймовірність сумісної сегрегації з чоловічою стерильністю, що проявляється у вигляді нерівноважного зчеплення. Таку методику називають відбором за допомогою маркерів (МА5).

Таким чином, представлені способи відбору мутантних рослин пшениці, які є гомозиготними або гетерозиготними за мутацією в гені М51, такою як без обмеження Іт514й, т51е і т517.

Для здійснення МАЗ нуклеїнову кислоту, що відповідає маркерному алелю нуклеїнової кислоти, виявляють у біологічному зразку із рослини, що підлягає відбору. Це виявлення може приймати форму гібридизації нуклеїнової кислоти-зонда із маркерним алелем або його ампліконом, наприклад, із використанням алель-специфічної гібридизації, саузерн-блотингу, нозерн-блотингу, гібридизації іп 5йи, гібридизації праймерів із наступною ПЛР-ампліфікацією ділянки маркера, ДНК-секвенування продукту ПЛР-ампліфікації тощо. Для будь-яких описаних у даному документі маркерних послідовностей будь-який фахівець у даній галузі зможе зрозуміти, як одержати алель у маркерному локусі в конкретній лінії або різновиді пшениці за допомогою відомих методик ампліфікації та секвенування ДНК. У контексті описаних у даному документі цілей лінії та сорти, які були використані, були загальнодоступними. Отже, можна одержати

ДНК, а будь-який фахівець у даній галузі зможе або застосовувати запропоновані праймери, або розробити праймери із запропонованої еталонної послідовності для ампліфікації й одержання послідовності у кожному маркерному локусі із кожної лінії або різновиду.

Після перевірки наявності (або відсутності) конкретного маркерного алеля у біологічному бо зразку відбирають рослину та схрещують її з другою рослиною, необов'язково рослиною пшениці з елітної лінії. Рослини-нащадки, одержані шляхом схрещування, можуть бути оцінені за цим специфічним маркерним алелем, і будуть відібрані лише ті рослини-нащадки, які мають необхідний маркерний алель.

Шляхом відбору за допомогою маркерів селекціонер може відстежувати наявність ознаки чоловічої стерильності в контрольованих схрещуваннях для одержання, за необхідності, нової рослини, що містить мутацію М51 або у гомозиготному, або у гетерозиготному стані, таким чином зберігаючи мутації М51. На додаток до цього відбір за допомогою маркерів можна застосовувати для одержання мутантних насіннєвих батьків, які мають чоловічу стерильність та які можна застосовувати як жіночі, тобто рослин, для яких необхідним є запилення пилком донорної рослини для одержання насіння, що становить комерційний інтерес. Як альтернатива, відбір за допомогою маркерів можна застосовувати для одержання гібридів ЕТ, що містять мутацію М51 у гетерозиготному стані.

Для відбору за допомогою маркерів ознаки чоловічої стерильності можна застосовувати будь-які представлені у даному документі маркери, а також будь-який маркер, зчеплений і асоційований з будь-яким з таких маркерів.

Термін «зчеплення» використовують для опису ступеня, в якому один маркерний локус «асоційований 3» іншим маркерним локусом або з будь-яким іншим локусом (наприклад, з локусом чоловічої стерильності). Звичайним показником зчеплення є частота, з якою ознаки сумісно сегрегують. Вона може бути виражена як відсоткова частка сумісної сегрегації (частота рекомбінації) або у сантиморганідах (СМ). СМ являє собою одиницю вимірювання частоти генетичної рекомбінації Одна СМ дорівнює 195 ймовірності того, що ознака в одному генетичному локусі буде відокремлена від ознаки в іншому локусі внаслідок кросинговера в одному поколінні (що означає, що ознаки сегрегують разом у 9995 випадків).

Зчеплення можна виражати у вигляді необхідної межі або діапазону. Наприклад, у деяких варіантах здійснення будь-який маркер зчеплений (генетично і фізично) з будь-яким іншим маркером (або локусом, таким як М51), якщо маркери розділені менш ніж 50, 40, 30, 25, 20 або 15 одиницями картування (або СМ). Додатково зчеплення може бути описано розділенням, що становить 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 одиниць картування (або СМ). У деяких аспектах переважним є визначення обмежувального діапазону зчеплення, наприклад від 10 до 20 СМ, від 10 до 30 сМ або від 10 до 40 сМ.

Чим ближчою є відстань, на якій маркер зчеплений з другим локусом, тим кращим індикатором для другого локусу стає цей маркер. Таким чином, «зчеплені локуси», такі як маркерний локус і другий локус, характеризуються частотою міжлокусної рекомбінації 1095 або менше, або приблизно 995 або менше, або приблизно 895 або менше, або приблизно 795 або менше, або приблизно 695 або менше, або приблизно 595 або менше, або приблизно 495 або менше, або приблизно 395 або менше і/або приблизно 295 або менше. В інших варіантах здійснення відповідні локуси характеризуються частотою рекомбінації приблизно 195 або менше, наприклад, приблизно 0,7595 або менше, або приблизно 0,595 або менше, або приблизно 0,2595 або менше. Про два локуси, які локалізуються на одній хромосомі та на такій відстані, що рекомбінація між двома локусами відбувається з частотою менше 1095 (наприклад, приблизно 995, 895, 795, бо, 595, 495, 395, 295, 195, 0,7595, 0,595, 0,2595 або менше), також говорять, що вони «розташовані близько» один до одного. Оскільки одна СМ являє собою відстань між двома генетичними маркерами, для якої показана частота рекомбінації 195, будь- який маркер є зчепленим (генетично і фізично) з будь-яким іншим маркером, що знаходиться у безпосередній близькості, наприклад, на відстані 10 СМ або менше. Два зчеплених маркери на одній хромосомі можуть бути розташовані на відстані, що дорівнює 9, 8, 7,6, 5, 4, 3, 2,1, 0,75, 0,5,0,25,0,1, 0,075, 0,05, 0,025 або 0,01 сМ або менше один від одного.

Незважаючи на те, що конкретні маркерні алелі можуть демонструвати сумісну сегрегацію з фенотипом із чоловічою стерильністю, важливо відзначити, що маркери не обов'язково є частиною локусу, що відповідає за експресію чоловічої стерильності. Наприклад, нема необхідності у тому, щоб маркерна полінуклеотидна послідовність була частиною гена М51.

Асоціація між специфічним маркерним алелем і фенотипом із чоловічою стерильністю зумовлена початковим зчепленням у конфігурації «сполучення» маркерного алеля і мутації М51 у лінії пшениці, із якої походить дана мутація М51. Оскільки Ітт514, те1е і т51ї з'явились у сорту

Спгіз, маркерні алелі у Спгіз на ділянці М5ї можна застосовувати для відстеження мутацій тета, те1е і т51їГ у наступних поколіннях.

У даному документі розкриті композиції на основі виділених або практично очищених молекул нуклеїнової кислоти або білків. «Виділена» або «очищена» молекула нуклеїнової кислоти, полінуклеотид, поліпептид, або білок, або його біологічно активна частина практично 60 або головним чином не містять компоненти, що зазвичай супроводжують або взаємодіють з полінуклеотидом або білком, які зустрічаються в його природному оточенні. Таким чином, виділений або очищений полінуклеотид, або поліпептид, або білок практично не містить інший клітинний матеріал або культуральне середовище під час одержання за допомогою методик рекомбінантних молекул або практично не містить хімічних речовин-попередників або інших хімічних речовин під час хімічного синтезу. В оптимальному випадку «виділений» полінуклеотид не містить послідовностей (в оптимальному випадку послідовностей, що кодують білок), які в природних умовах фланкують полінуклеотид (тобто послідовностей, розташованих на 5'- і 3- кінцях полінуклеотиду) у геномній ДНК організму, із якого одержаний полінуклеотид. Наприклад, у різних варіантах здійснення виділений полінуклеотид може містити нуклеотидну послідовність розміром менше ніж приблизно 5 т.п.о., 4 т.п.о., З т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. або 0,1 т.п.о., яка у природних умовах фланкує полінуклеотид у геномній ДНК клітини, із якої одержаний полінуклеотид. Білок, який практично не містить клітинний матеріал, включає препарати білка, що містять менше ніж приблизно 3095, 2095, 1095, 595 або 195 (за сухою вагою) забруднювального білка. Якщо поліпептиди, розкриті у даному документі, або їх біологічно активна частина одержані рекомбінантним шляхом, то, в оптимальному випадку, в культуральному середовищі представлено менш ніж приблизно 3095, 2095, 1095, 595 або 195 (за сухою вагою) хімічних речовин-попередників або хімічних речовин, що не відносяться до білків, що становлять інтерес. «Досліджувана рослина» або «досліджувана рослинна клітина» являють собою такі, в яких генетична зміна, така як трансформація, вплинула на ген, що становить інтерес, або являють собою рослину або рослинну клітину, які походять із рослини або клітини, змінених таким чином, і які передбачають таку зміну. «Контроль», або «контрольна рослина», або «контрольна рослинна клітина» забезпечують точку відліку для вимірювання змін фенотипу досліджуваної рослини або рослинної клітини.

Контрольна рослина або рослинна клітина можуть являти собою, наприклад: (а) рослину або рослинну клітину дикого типу, тобто з тим же генотипом, що й у вихідного матеріалу для генетичної зміни, за допомогою якої була одержана досліджувана рослина або клітина; (Б) рослину або рослинну клітину з тим же генотипом, що й у вихідного матеріалу, але які були трансформовані нуль-конструкцією (тобто конструкцією, яка не має відомий вплив на ознаку, що

Зо становить інтерес, наприклад, конструкцією, що містить маркерний ген); (с) рослину або рослинну клітину, які є нетрансформованими сегрегантами серед потомства досліджуваної рослини або рослинної клітини; (4) рослину або рослинну клітину, генетично ідентичні досліджуваній рослині або рослинній клітині, але які не були піддані впливу умов або стимулів, що будуть індукувати експресію гена, що становить інтерес; або (є) досліджувану рослину або рослинну клітину як такі в умовах, за яких ген, що становить інтерес, не експресується.

Також представлені фрагменти і варіанти розкритих полінуклеотидів і білків, що ними кодуються. Під «фрагментом» мають на увазі частину полінуклеотиду або частину амінокислотної послідовності й, отже, білка, що кодується даним полінуклеотидом. Фрагменти полінуклеотиду можуть кодувати фрагменти білка, які зберігають біологічну активність нативного білка й, отже, впливають на чоловічу фертильність; такі фрагменти можуть називатися у даному документі «активними фрагментами». Як альтернатива, фрагменти полінуклеотиду, придатні як зонди для гібридизації або придатні у конструкціях і стратегіях для знижувальної регуляції або модифікації цільової послідовності, зазвичай не кодують фрагменти білка, що зберігають біологічну активність але все ще можуть впливати на чоловічу фертильність. Таким чином, фрагменти нуклеотидної послідовності можуть становити щонайменше від приблизно 20 нуклеотидів, приблизно 50 нуклеотидів, приблизно 100 нуклеотидів і до полінуклеотиду повної довжини, що кодує розкритий у даному документі поліпептид.

Фрагмент полінуклеотиду, який кодує біологічно активну частину поліпептиду, який впливає на чоловічу фертильність, буде кодувати щонайменше 15, 25, 30, 50, 100, 150 або 200 суміжних амінокислот або аж до загальної кількості амінокислот, що присутні в поліпептиді повної довжини, який впливає на чоловічу фертильність (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 3, 5, 39 або 40).

Фрагменти полінуклеотиду чоловічої фертильності, придатні як зонди для гібридизації або праймери для ПЛР, або у способі з використанням конструкції для знижувальної регуляції або цільової модифікації, зазвичай не обов'язково повинні кодувати біологічно активну частину поліпептиду, але можуть впливати на чоловічу фертильність.

Таким чином, фрагмент розкритого в даному документі полінуклеотиду чоловічої фертильності може кодувати біологічно активну частину поліпептиду чоловічої фертильності, або він може являти собою фрагмент, який можна застосовувати як зонд для гібридизації або бо праймер для ПЛР, або у способі з використанням конструкції для знижувальної регуляції або цільової модифікації з використанням способів, відомих з рівня техніки або розкритих нижче.

Біологічно активну частину поліпептиду чоловічої фертильності можна одержати шляхом виділення частини одного із розкритих у даному документі полінуклеотидів чоловічої фертильності, експресії кодованої частини білка чоловічої фертильності (наприклад, шляхом рекомбінантної експресії іп мійго) та оцінювання активності кодованої частини поліпептиду чоловічої фертильності. Полінуклеотиди, які є фрагментами полінуклеотиду чоловічої фертильності, містять щонайменше 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800 або 4000 нуклеотидів або аж до числа нуклеотидів, що присутні в розкритому в даному документі полінуклеотиді чоловічої фертильності повної довжини (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45 або полінуклеотиді, що кодує ЗЕО ІЮО МО: 39 або 40).

Мається на увазі, що «варіанти» означають по суті подібні послідовності. У випадку полінуклеотидів варіант передбачає делецію й/або додавання одного або декількох нуклеотидів в одному або декількох сайтах у межах нативного полінуклеотиду й/або заміну одного або декількох нуклеотидів в одному або декількох сайтах у нативному полінуклеотиді.

Застосовуваний у даному документі вираз «нативний» або «дикого типу» полінуклеотид або поліпептид передбачає, відповідно, нуклеотидну послідовність або амінокислотну послідовність, що зустрічається у природі. У випадку полінуклеотидів консервативні варіанти включають такі послідовності, які через виродженість генетичного коду кодують амінокислотну послідовність розкритого у даному документі поліпептиду чоловічої фертильності. Алельні варіанти, що зустрічаються у природі, такі як ці, можна ідентифікувати із застосуванням добре відомих методик молекулярної біології, як, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) їі методик гібридизації, зазначених нижче. Варіантні полінуклеотиди також включають одержані синтетичним шляхом полінуклеотиди, такі як одержані, наприклад, за допомогою сайт- спрямованого мутагенезу, і які можуть кодувати поліпептид чоловічої фертильності. Як правило, варіанти конкретного розкритого в даному документі полінуклеотиду будуть щонайменше на приблизно 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9090, 9195, 9295, 9395, 94905, 9595, 96905, 9795, 98905, 9995 або більше ідентичні послідовності конкретного

Ко) полінуклеотиду (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45), причому ідентичність визначають за допомогою програм і параметрів вирівнювання послідовностей, що описуються в інших розділах даного документа або відомих із рівня техніки.

Варіанти конкретного розкритого у даному документі полінуклеотиду (тобто еталонного полінуклеотиду) також можна оцінити шляхом порівняння відсоткової ідентичності послідовностей поліпептиду, що кодується варіантним полінуклеотидом, і поліпептиду, що кодується еталонним полінуклеотидом. Таким чином, наприклад, виділений полінуклеотид може кодувати поліпептид із заданою відсотковою ідентичністю послідовності щодо поліпептиду під

ЗЕО ІО МО: 3, 5, 39 або 40. Відсоткову ідентичність послідовностей будь-яких двох поліпептидів можна розрахувати за допомогою програм і параметрів вирівнювання послідовностей, описаних в інших розділах даного документа. Якщо будь-яку задану пару полінуклеотидів, розкритих у даному документі, оцінюють шляхом порівняння відсоткової ідентичності послідовностей двох поліпептидів, які вони кодують, відсоткова ідентичність послідовностей двох кодованих поліпептидів характеризується щонайменше приблизно 4095, 4595, 5095, 5590, 6095, 65905, 7095, 7590, 8095, 8595, 8695, 8790, 8890, 8995, 9095, 9190, 9290, 9390, 9490, 9590, 9690, 9790, 9895, 9995 або більшою ідентичністю послідовностей.

Мається на увазі, що «варіантний» білок означає білок, одержаний із нативного білка шляхом делеції або додавання однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах у нативному білку й/або заміни однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах у нативному білку. Розкриті в даному документі варіантні білки є біологічно активними, тобто вони все ще мають біологічну активність нативного білка, тобто характеризуються активністю, що визначає чоловічу фертильність, яка описується в даному документі. Такі варіанти можуть бути результатом, наприклад, генетичного поліморфізму або маніпуляції, що здійснюється людиною. Біологічно активні варіанти розкритого в даному документі білка чоловічої фертильності будуть характеризуватися щонайменше приблизно 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, ббов, 7090, 7595, 8095, 8590, 869Ую, 8795, 8895, 8995, 909ю, 9195, За, 9395, 9495, 9595, 9695, 9790, 9895, 99965 або більшою ідентичністю послідовностей порівняно з амінокислотною послідовністю нативного білка (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5, 39 або 40), яку визначають за допомогою програм і параметрів вирівнювання послідовностей, що описуються в інших розділах даного документа або відомих з рівня техніки. Біологічно активний варіант розкритого в даному документі білка 60 може відрізнятися від цього білка всього лише 1-15 амінокислотними залишками, всього лише

1-10, як, наприклад, 6-10, всього лише 5, всього лише 4, 3, 2 або навіть 1 амінокислотним залишком.

Розкриті в даному документі білки можуть бути змінені різними способами, що включають амінокислотні заміни, делеції, усічення й вставки. Способи здійснення таких маніпуляцій, як правило, відомі з рівня техніки. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності та фрагменти поліпептидів чоловічої фертильності можна одержати за допомогою мутацій у ДНК. Способи мутагенезу та змін полінуклеотидів добре відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Кипкеї (1985)

Ргос. Май. Асад. осі. ОБА 82:488-492; КипкКеї! еї аї. (1987) Меїйоав іп Епгутої. 154:367-382; патент США Мо 4873192; УуаїКег апа Саазіга, єд5. (1983) Тесппіднез іп Моїіесшіаг Віоіоду (Масмійап Рибіїзпіпу Сотрапу, Нью-Йорк) та посилання, процитовані в них. Інструкції щодо придатних амінокислотних замін, які не впливають на біологічну активність білка, що становить інтерес, можна знайти у моделі Баупйоїї еї аї. (1978) Айазх ої Ргоївіп Зедиепсе апа 5ігисіиге (Ма).

Віотейд. Ке5. Рошпа., Вашингтон, О0.С.), включеній у даний документ за допомогою посилання.

Оптимальними можуть бути консервативні заміни, такі як заміщення однієї амінокислоти іншою, яка має подібні властивості.

Таким чином, розкриті в даному документі гени і полінуклеотиди включають як послідовності, що зустрічаються в природі, так і варіанти послідовностей ДНК. Подібним чином, поліпептиди і білки чоловічої фертильності охоплюють як поліпептиди, що зустрічаються у природі, так і їх варіації та модифіковані форми. Такі полінуклеотидні і поліпептидні варіанти можуть все ще мати необхідну активність, що визначає чоловічу фертильність, у випадку чого мутації, які будуть одержані в ДНК, що кодує такий варіант, не повинні виносити послідовність за межі рамки зчитування й в оптимальному випадку не будуть утворювати комплементарні ділянки, які можуть давати мРНК із вторинною структурою. Див. публікацію заявки на європейський патент Мо75444.

Очікується, що певні делеції, вставки і заміни в білкових послідовностях, охоплюваних даним документом, не спричинять радикальних змін у характеристиках білка. Однак, якщо важливо передбачити точний ефект заміни, делеції або вставки перед її здійсненням, фахівець у даній галузі техніки зрозуміє, що даний ефект буде оцінений шляхом звичайних скринінгових аналізів. Тобто активність можна оцінювати шляхом аналізу активності, що визначає чоловічу

Зо фертильність.

Підвищення або зниження чоловічої фертильності можна аналізувати різними способами.

Будь-який фахівець у даній галузі може легко оцінювати активність варіанта або фрагмента шляхом введення полінуклеотиду в рослину, гомозиготну за стабільним алелем чоловічої стерильності полінуклеотиду, та спостереження за розвитком чоловічої тканини у рослини.

Наприклад, для оцінювання активності, що визначає чоловічу фертильність, яка надається фрагментами або варіантами під ЗЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45, фахівець у даній галузі може почати з ідентифікації рослини, яка експресує фенотип т51, або зі створення рослини, гомозиготної за мутацією в нативному гені М51, яка приводить у результаті до чоловічої стерильності. Потім він може комплементувати мутацію шляхом внесення полінуклеотиду М51 або його фрагмента або варіанта і спостереження, чи нормально розвиваються чоловічі тканини рослини та чи здатні вони виробляти зрілий пилок.

Варіанти функціональних полінуклеотидів і білків також охоплюють послідовності й білки, одержані за допомогою мутагенної або рекомбіногенної методики, такої як ДНК-шафлінг. За допомогою такої методики одну або декілька різних послідовностей чоловічої фертильності можна піддати маніпуляції для створення нового поліпептиду чоловічої фертильності, що має необхідні властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють із популяції споріднених за послідовностями полінуклеотидів, що містять ділянки послідовностей, які характеризуються значною ідентичністю послідовності та можуть піддаватися гомологічній рекомбінації іп міго або іп ммо. Наприклад, за допомогою даного підходу мотиви послідовності, яка кодує домен, що становить інтерес, можуть бути піддані шафлінгу між розкритими у даному документі полінуклеотидами чоловічої фертильності та іншими полінуклеотидами чоловічої фертильності з одержанням нового гена, який кодує білок із покращеною властивістю, що становить інтерес, наприклад, підвищеною Кт у випадку ферменту. Стратегії для такого ДНК- шафлінгу відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Зіеттег (1994) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 91:10747-10751; Теттег (1994) Маїшге 370:389-391; Статеті єї а!. (1997) Майшге Віоїесн. 15:436- 438; Мооге еї аї. (1997) 9. Мої. Вісі. 272:336-347; 7папд еї аї. (1997) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 94:4504-4509; Статеті єї а. (1998) Майте 391:288-291; і патенти США МоМо 5605793 і 5837458.

І. Аналіз послідовностей

Застосовуваний у даному документі вираз «ідентичність послідовностей» або «ідентичність» 60 у контексті двох полінуклеотидних або поліпептидних послідовностей відноситься до залишків двох послідовностей, які є однаковими при вирівнюванні для максимальної відповідності в указаному вікні порівняння. Якщо відсоткову ідентичність послідовностей застосовують щодо білків, то враховують, що положення залишків, які не є ідентичними, часто відрізняються за консервативними амінокислотними замінами, де амінокислотні залишки заміщені іншими амінокислотними залишками із подібними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю) і, отже, не змінюють функціональні властивості молекули. Якщо послідовності відрізняються консервативними замінами, то відсоткову ідентичність послідовностей можна підвищити з тим, щоб коригувати консервативну природу заміни. Вважають, що послідовності, які відрізняються такими консервативними замінами, характеризуються «подібністю послідовностей» або «подібністю». Засоби для здійснення такого коригування добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Як правило, вона передбачає оцінку в балах консервативної заміни як часткового, а не повного незбігу, що, таким чином, збільшує відсоткову ідентичність послідовностей. Таким чином, наприклад, якщо ідентичній амінокислоті присвоюється бал 1, а неконсервативній заміні присвоюється бал нуль, то консервативній заміні присвоюється бал від нуля до 1. Оцінку консервативних замін у балах розраховують, наприклад, як реалізовано у програмі РС/ЗЕМЕ (ІпіеПідепеїйіс5, Маунтін-В'ю, Каліфорнія).

Застосовуваний у даному документі вираз «відсоткова ідентичність послідовностей» означає значення, що визначається шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності у вікні порівняння може передбачати додавання або делеції (тобто гепи) порівняно з еталонною послідовністю (яка не передбачає додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток розраховують шляхом визначення числа положень, в яких ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок зустрічаються в обох послідовностях, з одержанням числа положень, що збігаються, шляхом ділення кількості положень, що збігаються, на загальну кількість положень в інтервалі порівняння та множення результату на 100 з одержанням відсоткової ідентичності послідовності.

Якщо не зазначено інше, значення ідентичності/подібності послідовностей, наведені у даному документі, відносяться до значення, одержаного за допомогою САР версії 10 із застосуванням наступних параметрів: 95 ідентичності і 90 подібності для нуклеотидної

Зо послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа 50, і штрафу за продовження гепа 3, і матриці замін пуухдарапа.стр; 95 ідентичності та 95 подібності для амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за відкриття гепа 8, і штрафу за продовження гепа 2, і матриці замін

ВГОБИМб2; або будь-якої еквівалентної до неї програми. Під "еквівалентною програмою" мають на увазі будь-яку програму для порівняння послідовностей, в якій для будь-яких двох послідовностей, що розглядаються, здійснюють вирівнювання з ідентичними збігами нуклеотидних або амінокислотних залишків та ідентичною відсотковою ідентичністю послідовності порівняно з відповідним вирівнюванням, яке здійснюється за допомогою сАР версії 10.

Застосування виразу «полінуклеотид» не передбачає обмеження даного розкриття до полінуклеотидів, що містять ДНК. Фахівці у даній галузі техніки зрозуміють, що полінуклеотиди можуть містити рибонуклеотиди і комбінації рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів. Такі дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди передбачають як молекули, що зустрічаються в природі, так і синтетичні аналоги. Розкриті у даному документі полінуклеотиди також охоплюють усі форми послідовностей, у тому числі без обмеження однониткові форми, двониткові форми, шпильки, структури «стебло-та-петля» тощо.

ІП. Касети експресії

Полінуклеотид чоловічої фертильності, розкритий у даному документі, може бути представлений у касеті експресії для експресії в організмі, що становить інтерес. Касета може містити 5'- і З'-регуляторні послідовності, функціонально пов'язані з полінуклеотидом чоловічої фертильності, який розкрито в даному документі. Мається на увазі, що вираз «функціонально пов'язаний» означає функціональний зв'язок між двома або більше елементами. Наприклад, функціональний зв'язок між полінуклеотидом, що становить інтерес, і регуляторною послідовністю (наприклад, промотором) являє собою функціональний зв'язок, що забезпечує можливість експресії полінуклеотиду, що становить інтерес. Функціонально пов'язані елементи можуть бути суміжними або несуміжними. При використанні для позначення з'єднання двох ділянок, що кодують білок, під функціонально пов'язаним мається на увазі, що кодувальні ділянки знаходяться в одній і тій же рамці зчитування.

У 5-3'--напрямку транскрипції розкриті в даному документі касети експресії можуть містити ділянку ініціації транскрипції й трансляції (тобто промотор), полінуклеотид, що становить бо інтерес, і ділянку термінації транскрипції й трансляції (тобто ділянку термінації), які є функціональними у клітині-хазяїні (наприклад, рослинній клітині). Касети експресії також забезпечені великою кількістю сайтів рестрикції й/або сайтів рекомбінації для того, щоб вставка полінуклеотиду чоловічої фертильності була під контролем регуляторних ділянок під час регуляції транскрипції, які описуються в іншому розділі даного документа. Регуляторні ділянки (тобто промотори, ділянки регуляції транскрипції та ділянки термінації трансляції) й/або полінуклеотид, що становить інтерес, можуть бути нативними/аналогічними щодо клітини- хазяїна або одне до одного. Як альтернатива, регуляторні ділянки й/або полінуклеотид, що становить інтерес, можуть бути гетерологічними щодо клітини-хазяїна або одне до одного.

Застосовуваний у даному документі вираз «гетерологічна» щодо полінуклеотидної або поліпептидної послідовності являє собою послідовність, яка походить із чужорідного виду або, якщо вона походить із того ж виду, суттєво модифікована за її складом й/або геномним локусом порівняно з її нативною формою в результаті навмисного втручання людини. Наприклад, промотор, функціонально пов'язаний із гетерологічним полінуклеотидом, походить від виду, що відрізняється від виду, з якого одержаний полінуклеотид, або, якщо він походить 3 того ж/аналогічного виду, то один або обидва з них є суттєво модифікованими порівняно з їхньою початковою формою й/або геномним локусом, або промотор не є нативним промотором для функціонально пов'язаного полінуклеотиду. У контексті даного документа, якщо не зазначено інше, химерний полінуклеотид містить кодувальну послідовність, функціонально пов'язану з ділянкою ініціації транскрипції, яка є гетерологічною щодо кодувальної послідовності.

В певних варіантах здійснення розкриті в даному документі полінуклеотиди можуть бути пакетовані з будь-якою комбінацією полінуклеотидних послідовностей, що становлять інтерес, або касет експресії, які розкриті в іншому розділі даного документа або відомі з рівня техніки.

Наприклад, розкриті у даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності можуть бути пакетовані з будь-якими іншими полінуклеотидами, які кодують полінуклеотиди, що руйнують чоловічу гамету, поліпептидам, цитотоксинам, маркерам або іншим послідовностям чоловічої фертильності, які розкриті в іншому розділі даного документа або відомі з рівня техніки.

Пакетовані полінуклеотиди можуть бути функціонально пов'язаними 3 таким самим промотором, що і полінуклеотид чоловічої фертильності, або можуть бути функціонально пов'язаними з окремим промоторним полінуклеотидом.

Зо Як описано в інших частинах даного документа, касети експресії можуть містити промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, що становить інтерес, а також відповідну ділянку термінації. Ділянка термінації може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною щодо функціонально пов'язаного полінуклеотиду чоловічої фертильності, що становить інтерес, або щодо промоторних послідовностей чоловічої фертильності, може бути нативною щодо рослини-хазяїна або може бути одержана з іншого джерела (тобто чужорідного або гетерологічного). Придатні ділянки термінації доступні з Ті-плазміди А. ішптегїасієп5, такі як ділянки термінації генів октопінсинтази і нопалінсинтази. Див. також Сиегіпеаи еї аї!. (1991) Мої.

Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп єї аї. (1991) Сепез5 Оеєм. 5:141-149; Модеп вї а!. (1990) Ріапі СеїІ 2:1261-1272; Мипговеє вї а. (1990) Сепе 91:151-158; ВаЇІІав еї а. (1989) Мисієїс Асіа5 Нев. 17:7891-7903; і дозі еї аї. (1987) Мисівїс Асіаз Кез. 15:9627-9639.

За необхідності полінуклеотиди, що становлять інтерес, можна оптимізувати для підвищення рівня експресії у трансформованій рослині. Тобто полінуклеотиди можна синтезувати або змінювати для використання переважних для рослин кодонів для покращення експресії. Див., наприклад, СатрреїЇ апа Соумі, (1990) Ріапі РпузіоїЇ. 92:1-11; для розгляду використання кодонів, переважних для хазяїна. З рівня техніки доступні способи синтезу генів, переважних для рослин. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831 і 5436391 та Мигтау еї аї. (1989) Мисієїс Асіа5 Нев.17:477-498, включені у даний документ за допомогою посилання.

Відомі додаткові модифікації послідовності для посилення експресії гена у клітини-хазяїні.

Вони включають вилучення послідовностей, що кодують хибні сигнали поліаденілювання, сигнали сайта сплайсингу екзонів та інтронів, транспозоноподібні повтори й інші подібні добре вивчені послідовності, які можуть чинити шкідливий вплив на експресію гена. Вміст 5-С у послідовності можна відкоригувати до рівнів, середніх для даного клітинного хазяїна, розрахованих з урахуванням відомих генів, що експресуються у клітині-хазяїні. Якщо можливо, послідовність модифікують, аби запобігти утворенню прогнозованих шпилькових вторинних структур мРНК.

Касети експресії можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності. Такі лідерні послідовності можуть сприяти посиленню трансляції. Лідерні послідовності трансляції відомі з рівня техніки й включають: лідерні послідовності пікорнавірусів, наприклад, лідерну послідовність ЕМСМ (5'-нсекодуюча ділянка вірусу енцефаломіокардиту) (ЕіІгоу-5івїп єї аї. (1989) 60 Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 86:6126-6130); лідерні послідовності потівірусів, наприклад, лідерну послідовність ТЕМ (вірус гравірування тютюну) (Саїе еї аї. (1995) Сепе 165(2):233-238), лідерну послідовність МОММ (вірус карликової мозаїки кукурудзи), (оПппзоп еї аї. (1986) Мітоіоду 154:9- 20) і білок, що зв'язує важкий ланцюг імуноглобуліну людини (ВІіР) (Масеак еї аї. (1991) Маїиге 353:90-94); нетрансльовану лідерну послідовність із мРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (АММ КМА 4) (Чобіїпуд еї аіІ. (1987) Маїиге 325:622-625); лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки (ТММ) (Саїйе еї аІ. (1989) у МоІесшаг Віоіоду ої КМА, ей. Сесп (155, Мем/

Уогк), рр. 237-256) і лідерну послідовність вірусу хлоротичної мозаїчності маїсу (МСММ) (Готтеї еї а. (1991) Мігоіоду 81:382-385). Див. також ОеПа-Сіорра еї аї. (1987) Ріапі Рнузіої. 84:965-968.

Можуть бути також використані інші відомі способи посилення трансляції, наприклад, застосування інтронів тощо.

У випадку одержання касети експресії з різними фрагментами ДНК можна проводити маніпуляції так, щоб одержати послідовності ДНК у належній орієнтації та, за необхідності, у належній рамці зчитування. З цією метою для з'єднання фрагментів ДНК можна використовувати адаптери або лінкери, або можна залучати інші маніпуляції для внесення прийнятних сайтів рестрикції, видалення надлишкової ДНК, видалення сайтів рестрикції тощо.

Для цього можна залучати мутагенез іп міго, репарацію за допомогою праймерів, рестрикцію, гібридизацію, повторні заміни, наприклад, транзиції та трансверсії.

У конкретних варіантах здійснення розкриті у даному документі касети експресії містять промотор, функціонально пов'язаний із полінуклеотидом чоловічої фертильності або його фрагментом чи варіантом, які розкриті у даному документі. У певних варіантах здійснення промотор чоловічої фертильності є функціонально пов'язаним із розкритим у даному документі полінуклеотидом чоловічої фертильності, таким як полінуклеотид чоловічої фертильності, наведений під 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45, або його активним фрагментом або варіантом.

У певних варіантах здійснення промотори рослин можуть переважно ініціювати транскрипцію у певних тканинах, таких як тичинка, пиляк, тичинкова нитка і пилок, або на певних стадіях росту і розвитку, таких як стадії спорогенної тканини, мікроспор і мікрогаметофіту. Такі промотори рослин також називаються «переважними для тканини», «переважними для типу клітин» або «переважними для стадії росту». Промотори, які ініціюють транскрипцію лише у

Зо певній тканині, називають «специфічними для тканини». Аналогічним чином, промотори, що ініціюють транскрипцію лише на певних стадіях росту, називають «специфічними для стадії росту». «Специфічний для типу клітин» промотор керує експресією лише у певних типах клітин в одному або декількох органах, наприклад, клітинах тичинок або окремих типах клітин, таких як клітини пиляка, тичинкової нитки або пилку. «Промотор чоловічої фертильності» може ініціювати транскрипцію лише або переважно у клітині або тканині, яка залучена у процес мікроспорогенезу або мікрогаметогенезу. Розкриті у даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності та їх активні фрагменти і варіанти можуть бути функціонально пов'язані зі специфічними для чоловічих тканин промоторами або промоторами, активними переважно у чоловічих тканинах, у тому числі, наприклад, специфічними для тичинок промоторами або промоторами, активними переважно у тичинках, специфічними для пиляків промоторами або промоторами, активними переважно в пиляках, специфічними для пилку промоторами або промоторами, активними переважно у пилку, специфічними для тапетуму промоторами або промоторами, активними переважно у тапетумі тощо. Промотори можна вибирати з урахуванням бажаного результату. Наприклад, полінуклеотиди, що становлять інтерес, можуть бути функціонально пов'язані з конститутивними, переважними для тканини, переважними для стадії росту або іншими промоторами для експресії у рослинах.

В одному варіанті здійснення промотори можуть являти собою промотори, які сприяють експресії функціонально пов'язаного полінуклеотиду, що становить інтерес, лише або переважно в чоловічих тканинах рослини. У процесі не є необхідним застосовування конкретного переважного для тканин або специфічного для тканин промотора чоловічої фертильності; і можна використовувати будь-який з багатьох таких промоторів, відомих фахівцю у даній галузі. Одним з таких промоторів є промотор 5126, який переважно запускає експресію полінуклеотиду, з яким він пов'язаний, у чоловічій тканині рослин, як описано у патентах США МоМо 5837851 і 5689051. Інші приклади передбачають промотор М545 маїсу, описаний у патенті США Мо 6037523; промотор 5ЕЗ, описаний у патенті США Мо 6452069; промотор В592-7, описаний у УМО 02/063021; регуляторний елемент 5086, описаний у патенті

США Мо 5470359; промотор ТА29 (КоПипомуу, еї аї., (1990) Ріапі Сеї!І 2:1201-1224; Маїшге 347:737 (1990); Соідьего, сеї аї., (1993) Ріапі СеїІЇ 5:1217-1229 і патенті США Мо 6399856); промотор гена 60 зВ200 (МО 2002/26789), промотор гена РО47 (патент США Мо 5412085; патент США Мо

5545546; Ріапі У 3(2):261-271 (1993)), промотор гена 59 (патенти США Мо 5837850; 5589610); промотор гена металотіонеїн-подібного фактора 2 типу (СпагроппеІ-Сатраа, єї а!., сепе (2000) 254:199-208); промотор Вса9 Вгаззіса (І еє, еї аї., (2003) Ріапі СеїІ Кер. 22:268-273); промотор 42М13З (Натійоп, сеї аїЇ.,, (1998) Ріапі Мої. Віої. 38:663-669); промотори гена актин- деполімеризуючого фактора (такі як Атарр1ї, тарбррг; див., наприклад, Горе, еї а!., (1996) Ргос.

Майї. Асад. сі. ОБА 93:7415-7420); промотор гена фактора, подібного до метилестерази пектину маїсу, 2тС5 (УМакеїеу, єї аї., (1998) Ріапі Мої. Вісі. 37:187-192); промотор гена профіліну трго1 (Комаг, єї аї., (2000) Те Ріапі СеїЇ 12:583-598); промотор гена 2тР5ОКІ сульфатованого пентапептидфітосульфокіну (І огріеске, еї аї., (2005) доигпа! ої Ехрегітепаї! Воїапу 56(417):1805- 1819); промотор гена кальмодулін-зв'язувального білка, Мробр (Кеаду, еї аї., (2000) 9. Віої.

Спет. 275(45):35457-70).

Розкриті у даному документі конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор промотора Кзуп?7 та інші конститутивні промотори, розкриті у УМО 99/43838 і в патенті

США Мо 6072050; коровий промотор 355 Саму (савеї! еї аІ. (1985) Машге 313:810-812); промотор актину рису (МеЕїЇгоу еї аї. (1990) Ріапі Сеї! 2:163-171); убіквітиновий промотор (Спгізіепзеп еї аї. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12:619-632 і Спгізіепзеп еї аї. (1992) Ріапі Мої. ВіоІ. 18:675-689); РЕМО (Гаві єї аї. (1991) Тнеог.Сепеї. 81:581-588); МА5 (МецЦеп єї аІ. (1984) ЕМВО 3. 3:2723-2730); промотор АЇ 5 (патент США Мо 5659026) тощо. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, описані у патентах США МоМо 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 і 6177611. «Активні переважно у насінині» промотори включають як промотори, що є активними під час розвитку насінини, такі як промотори генів запасних білків насінини, так і промотори, які є активними під час проростання насінини. Див. Тпотрзоп еї аїЇ. (1989) ВіоЕвзау5 10:108, включений у даний документ за допомогою посилання. Такі промотори, активні переважно у насінині, включають без обмеження Сіті (гена цитокінін-індукованого транскрипту); с21981 (гена зеїну маїсу розміром 19 кДа); тіїр5 (гена міоінозитол-1-фосфат-интази) (див. МО 00/11177 і патент США Мо 6225529; включені у даний документ за допомогою посилання). Промотор гена гамма-зеїну є промотором, специфічним для ендосперму. Промотор гена глобуліну-1 (С1обр-1) є типовим промотором, специфічним для зародка. Для дводольних рослин промотори, специфічні

Зо для насінини, включають без обмеження промотори генів В-фазеоліну квасолі, напіну, Д- конгліциніну, лектину сої, круциферину тощо. Для однодольних рослин специфічні для насінини промотори включають без обмеження промотори із генів 15 кДа зеїну маїсу, 22 кДа зеїну, 27 кДа зеїну, гамма-зеїну, у/аху, зпгипКеп 1, 5ПгипкКеп 2, глобуліну 1 тощо. Див. також УМО 00/12733, де розкриті активні переважно у насінині промотори із генів епа! і епа2. Додаткові промотори, специфічні для зародка, розкриті у За еї аї. (1996) Ргос. Маї!. Асад. сі. 93:8117-8122; МаКазе еї аї. (1997) Ріапі у) 12:235-46; і Розіта-Нааг: та еї аї. (1999) Ріапі Мої. Віої. 39:257-71. Додаткові промотори, специфічні для ендосперму, розкриті у АїІбапі еї аІ. (1984) ЕМВО 3:1405-15; АіІрапі єї а!. (1999) Тнеєог. Аррі. Сеп. 98:1253-62; Аїірапі єї а!. (1993) Ріапі 9. 4:343-55; Мепа в! а). (1998) Те

Ріапі дотпаї 116:53-62 і УМи еї аї. (1998) Ріапі Сеї! Рнузіоїоду 39:885-889.

Промотори, активні переважно у клітинах, що діляться, або в меристематичній тканині, були розкриті у МО еї аї. (1994) Ріапі Мої. Віо!. 24:863-878; Веуаай еї аї. (1995) Мо. Сеп. Сепеї. 248:703- 711; паці еї аї. (1996) Ргос. Маї). Асад. 5сі. 93:4868-4872; По еї а. (1997) Ріапі 9. 11:983-992; апа

Тгепіп еї а. (1997) Ріапі Мо). Віої. 35:667-672.

Промотори, що індукуються стресом, включають у себе промотори, що індукуються сольовим/водним стресом, такі як РУС (7апо еї аї. (1997) Ріапі бсіепсез 129:81-89); промотори, що індукуються холодом, такі як сог1і5а (На)цеїа єї аї. (1990) Ріапі Рпузіої. 9371 246-1252), сот15р (М/ПНеїт сеї аї. (1993) Ріапі Мої! Віої 23:1073-1077), м5с120 (Опцеїеї єї а. (1998) РЕВЗ5 І ей. 423- 324-328), сі (Кігсп еї аї. (1997) Ріапі Мої Віої. 33:897-909), сі21А (Зесппеїдег єї аї. (1997) Ріапі

РНузіо!. 113:335-45); промотори, що індукуються засухою, такі як Тгд-31 (Снацанагу єї а! (1996)

Ріапі Мої. Віої. 30:1247-57), га29 (Казида еї а. (1999) Маїшге Віоїесппоіоду 18:287-291); промотори, що індукуються осмотичним стресом, такі як Каб117 (мііагаеєї! еї аї. (1991) Ріапі Мо).

Вії. 17:985-93) і промотор гена осмотину (Кадпоїйпата еї аї. (1993) Ріапі Мої Віої 23:1117-28); і промотори, що індукуються теплом, такі як промотори генів білків теплового шоку (Ваггоз 6ї аї. (1992) Ріапі Мої. 19:665-75; Маїтз єї аї. (1993) ЮОєм. Сепеї. 1427-41), і 5тНЗР (Умаїегз вї аї. (1996)

У. Ехрегітепіа! Воїапу 47:325-338). Інші промотори, що індукуються стресом, включають у себе гір2 (патент США Мо 5332808 і публікація заявки на патент США Мо 2003/0217393) і та?29А (УМатадиснпі-5Ніпогакі, єї а!. (1993) Мої. Сеп. Сепеїйсв 236:331-340).

Розглянуті в будь-якому розділі даного документа касети експресії, що містять полінуклеотиди чоловічої фертильності, можуть бути пакетовані з іншими полінуклеотидами, що бо становлять інтерес. Будь-який полінуклеотид, що становить інтерес, може бути пакетований із полінуклеотидом чоловічої фертильності, у тому числі, наприклад, полінуклеотидами, що руйнують чоловічу гамету, і маркерними полінуклеотидами.

Розкриті у даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності можуть бути пакетовані в або з касетами експресії, що містять промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, що руйнує чоловічу гамету; тобто полінуклеотидом, який перешкоджає функціонуванню, утворенню або поширенню чоловічих гамет. Полінуклеотид, що руйнує чоловічу гамету, може діяти із перешкоджанням функціонуванню, утворенню або поширенню чоловічих гамет будь- яким із ряду способів. Як приклад, але без обмеження, це може передбачати застосування полінуклеотидів, які кодують продукт гена, такий як ЮАМ-метилаза або барназа (див., наприклад, патент США Мо 5792853 або 5689049; РСТ/ЕР89/00495); кодують продукт гена, який перешкоджає накопиченню крохмалю, розщепленню крохмалю або негативно впливає на осмотичний баланс у пилку, такий як альфа-амілаза (див., наприклад, патенти США МоМо 7875764, 8013218, 7696405, 8614367); інгібують утворення продукту гена, важливого для функціонування, утворення або поширення чоловічих гамет (див., наприклад, патенти США

МоМо 5859341, 6297426); кодують продукт гена, який об'єднується з продуктом іншого гена для попередження утворення або функціонування чоловічих гамет (див., наприклад, патенти США

МоМо 6162964, 6013859, 6281348, 6399856, 6248935, 6750868, 5792853); є антисенсовими або спричиняють сумісну супресію гена, важливого для функціонування, утворення або поширення чоловічих гамет (див., наприклад, патенти США МоМо 6184439, 5728926, 6191343, 5728558, 5741684); перешкоджають експресії полінуклеотиду чоловічої фертильності шляхом утворення «шпильок» (див., наприклад, Зтійй еї аї. (2000) Маїиге 407:319-320; М/О 99/53050 ії УМО 98/53083) тощо.

Полінуклеотиди, що руйнують чоловічу гамету, включають гени, що мають домінантно- негативний ефект, такі як гени метилази і гени, що інгібують ріст. Див. патент США Мо 6399856.

Гени, що мають домінантно-негативний ефект, включають ген А-ланцюга дифтерійного токсину (Слако апа Ап (1991) Ріапі РНузіо!ї. 95 687-692; СтеепгієїЇй еї аІ. (1983) РМАБЗ 80:6853); мутанти, пов'язані з циклом клітинного ділення, такі як СОС у маїсу (Соїазапії еї а. (1991) РМАЗ 88: 3377- 3381); ген У/Т (Рагтег еї аІ.(1994) Мо1ї.3:723-728) і РбБ8 (Спеп еї а. (1991) РМАЗ 88:315-319).

Додаткові приклади полінуклеотидів, що руйнують чоловічу гамету, включають без

Зо обмеження ген реїЕ пектатліази із Егу/іпіа спгузапіпегті (Кепп еї а! (1986) 9. ВасіегіоІ. 168:595); ген СУА токсину із Васійи5 ІпПигіпдіепві5 ІсгаеїЇїепві5 (Месії еап еї а! (1987) 9. Васіегіо!. 169:1017 (1987), патент США Мо 4918006); ДНКази, РНКази, протеази або полінуклеотиди, що експресують антисенсову РНК. Полінуклеотид, що руйнує чоловічу гамету, може кодувати білок, залучений у інгібування взаємодій пилку та приймочки, росту пилкових трубок, запліднення або їх комбінації.

Розкриті у даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності можуть бути пакетовані з розкритими у даному документі касетами експресії, що містять промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, що становить інтерес, який кодує репортер або маркерний продукт. Приклади придатних полінуклеотидів-репортерів, відомих з рівня техніки, можна знайти, наприклад, у УеПегзоп еї аІ. (1991) в Ріапі МоїІесшціаг Віоїюсду Мапиаї, ед. СеМіп еї аї. (Кіммег Асадетіс Рибіївпегв), рр. 1-33; Оемуеї еї аї. Мої. Сеї!. Вісі. 7:725-737 (1987); СОЇ еї а).

ЕМВО 3. 9:2517-2522 (1990); Каїп еї а). ВіоТеснпіднез 19:650-655 (1995); і Спім еї аїЇ. Сигепі

Віоїоду 6:325-330 (1996). У певних варіантах здійснення полінуклеотид, що становить інтерес, кодує селективний репортер. Він може включати полінуклеотиди, які забезпечують стійкість до антибіотика або стійкість до гербіцидів. Приклади придатних селективних маркерних полінуклеотидів включають без обмеження гени, що відповідають за стійкість до хлорамфеніколу, метотрексату, гігроміцину, стрептоміцину, спектиноміцину, блеоміцину, сульфонаміду, бромоксинілу, гліфосату і фосфінотрицину.

У деяких варіантах здійснення касети експресії, розкриті у даному документі, містять полінуклеотид, що становить інтерес, який кодує маркери, які підлягають оцінюванню або скринінгу, якщо наявність полінуклеотиду забезпечує утворення продукту, що піддається вимірюванню. Приклади включають ген Д-глюкуронідази або цідА (505), що кодує фермент, для якого відомо багато хромогенних субстратів (наприклад, патенти США Мо 5268463 і

Мо 5599670); гени хлорамфеніколацетилтрансферази і лужної фосфатази. Інші маркери, що піддаються скринінгу, включають у себе полінуклеотиди, які відповідають за біосинтез антоціанів/флавоноїдів, у тому числі, наприклад, полінуклеотид К-локусу, який кодує продукт, що регулює утворення антоціанових пігментів (червоного кольору) у тканинах рослин, гени, що контролюють біосинтез флавоноїдних пігментів, такі як С1 і С2 маїсу, ген В, ген рі! і гени локусу

Бгоп7е, серед іншого. Додаткові приклади придатних маркерів, які кодуються полінуклеотидами, бо що становлять інтерес, включають ген блакитного флуоресцентного білка (СУР), ген жовтого флуоресцентного білка, ген их, який кодує люциферазу, наявність якої можна виявляти за допомогою, наприклад, рентгеноплівки, сцинтиляційних вимірювань, флуоресцентної спектрофотометрії, високочутливих відеокамер, камер із пристроєм рахування фотонів або багатолункової люмінометрії, зеленого флуоресцентного білка (СЕР) і О5Кеа2 (СіІопіесп

І арогасогієз, Іпс., Маунтін-В'ю, Каліфорнія), де рослинні клітини, трансформовані маркерним геном, флуоресціюють червоним кольором і, таким чином, можуть бути піддані візуальному відбору. Додаткові приклади включають ген р-лактамази, що кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні речовини (наприклад, РАВБАС, хромогенний цефалоспорин), ген хуІЕ, що кодує катехолдіоксигеназу, яка може перетворювати хромогенні катехіни, і ген тирозинази, що кодує фермент, здатний окиснювати тирозин до СОРА і допахінону, які, у свою чергу, конденсуються з утворенням сполуки меланіну, яку можна легко виявити.

Касета експресії також може містити ген селективного маркера для відбору трансформованих клітин. Гени селективних маркерів використовують для відбору трансформованих клітин або тканин. Гени маркерів включають у себе гени, що відповідають за стійкість до антибіотика, такі як гени, що кодують неоміцин-фосфотрансферазу І (МЕО) і гігроміцин-фосфотрансферазу (НРТ), а також гени, що забезпечують стійкість до гербіцидних сполук, таких як глуфосинат амонію, бромоксиніл, імідазолінони та 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-0). Додаткові селективні маркери включають фенотипові маркери, такі як Д-галактозидаза і флуоресцентні білки, такі як зелений флуоресцентний білок (СЕР) (Зи еї аї. (2004) Віоїеснпо).

Віоєпа 85:610-9 і РейЦег єї аї. (2004) Ріапі СеїІ 16:215-28), блакитний флуоресцентний білок (СУР) (Вої(е евї аї. (2004) 9. СеїЇ Зсіепсе 117:943-54 і Кай евї а!. (2002) Ріапі Рнузіо! 129:913-42) і жовтий флуоресцентний білок (РПЇМЕР'М із Емгодеп; див. ВоМе єї аї. (2004) У. СеїЇ бсієпсе 117:943-54). Що стосується додаткових селективних маркерів, див., в цілому, Уагтгапіоп (1992)

Ситт. Оріп. Віоїесн. 3:506-511; Спгіворнегзоп еї аї. (1992) Ргос. Маї!. Асай. сі. ОБА 89:6314- 6318; Мао єї аї. (1992) Сеїї 71:63-72; Негпікоїй (1992) Мої. Місгобіо!ї. 6:2419-2422; Ватківу еї а). (1980) у Тне Орегоп, рр. 177-220; Ни єї а!. (1987) Сеї! 48:555-566; Вгомуп єї а!. (1987) Сеї! 49:603- 612; Рідде еї аї. (1988) СеїІ 52:713-722; ЮОеизспіе еї а. (1989) Ргос. Маї). Асад. Асі. ОБА 86:5400- 5404; Рцегві єї а!. (1989) Ргос. Май). Асайд. Зсі. ОБА 86:2549-2553; ЮОеизспіе єї аї. (1990) Зсівєпсе 248:480-483; Сх:о556п (1993) РН.О. Тневзів, Опімегейу ої НеїдеІбего; Веїпез єї аї. (1993) Ргос. Маї).

Зо Асад. сі. ОБА 90:1917-1921; І арому єї аї. (1990) Мої. СеїІ. Віої. 10:3343-3356; 7атргенці еї а). (1992) Ргос. Маї. Асад. осі. ОБА 89:3952-3956; Ваїіт єї аІ. (1991) Ргос. Май). Асайд. 5сі. ОБА 88:5072-5076; УМуброгзкі єї аї. (1991) Мисівїс Асід5 Невз. 19:4647-4653; НіПепапа-Мізвтап (1989)

Торісв Мої. бігис. Віо!. 10:143-162; Оєдепко!їь сеї аї. (1991) Апійтістор. Адепів СпетоїНег. 35:1591- 1595; Ківіп5сНпіаї єї а. (1988) Віоспетівгу 27:1094-1104; Вопіп (1993) РИ.О. Тневів, Опіметейу ої

НеїдеІрегу; Совзеп єї а. (1992) Ргос. Маї. Асай. бсі. ОБА 89:5547-5551; Оїїма єї аї. (1992)

Апіійтістор. Адепіз СПетоїйег. 36:913-919; Ніаука єї а). (1985) НапароокК ої Ехрегітепіаї

Рпагтасоїіоду, Мої. 78 (Зргіпдег-Мепад, Вепіп); СИ! єї а). (1988) Майшге 334:721-724. Такі розкриття включені у даний документ за допомогою посилання. Вищенаведений перелік генів селективних маркерів не призначений для обмеження. Будь-який селективний маркерний ген можна застосовувати у композиціях і способах, розкритих у даному документі.

У деяких варіантах здійснення розкриті в даному документі касети експресії містять перший полінуклеотид, що становить інтерес, який кодує полінуклеотид чоловічої фертильності, функціонально пов'язаний з першим промоторним полінуклеотидом, пакетовані з другим полінуклеотидом, що становить інтерес, який кодує продукт гена, що руйнує чоловічу гамету, функціонально пов'язаним із промоторним полінуклеотидом, активним переважно у чоловічих тканинах. У певних варіантах здійснення касети експресії, описані в даному документі, також можуть бути пакетовані з третім полінуклеотидом, що становить інтерес, який кодує маркерний полінуклеотид, функціонально пов'язаний із промоторним полінуклеотидом.

У певних варіантах здійснення касети експресії, розкриті в даному документі, містять перший полінуклеотид, що становить інтерес, який кодує продукт гена чоловічої фертильності, розкритий в даному документі, такий як М51 пшениці або ячменю, функціонально пов'язаний із конститутивним промотором, таким як промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Ссамм).

Касети експресії можуть додатково містити другий полінуклеотид, що становить інтерес, який кодує продукт гена, що руйнує чоловічу гамету, функціонально пов'язаний з промотором, активним переважно у чоловічих тканинах. У певних варіантах здійснення касети експресії, розкриті в даному документі, можуть додатково містити третій полінуклеотид, що становить інтерес, який кодує маркерний ген, такий як ген фосфінотрицинацетилтрансферази (РАТ) із зігеріотусев мігідоспготадепе5, функціонально пов'язаний із конститутивним промотором, таким як промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм). бо ЇМ. Рослини

А. Рослини зі зміненими рівнями/активністю поліпептиду чоловічої фертильності

Додатково представлені рослини зі зміненими рівнями й/або видами активності поліпептиду чоловічої фертильності й/або зміненими рівнями чоловічої фертильності. У деяких варіантах здійснення розкриті в даному документі рослини мають стабільно вбудований в їх геноми розкритий у даному документі гетерологічний полінуклеотид чоловічої фертильності або його активний фрагмент або варіант. Таким чином, представлені рослини, рослинні клітини, частини рослин і насіння, що містить щонайменше один гетерологічний полінуклеотид чоловічої фертильності, викладений у будь-якій з ЗЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45, або будь-які його активні фрагменти або варіанти.

Додатково представлені рослини, що містять розкриті в даному документі касети експресії, які містять полінуклеотид чоловічої фертильності, функціонально пов'язаний з промотором, активним у рослині. У деяких варіантах здійснення експресія полінуклеотиду чоловічої фертильності модулює чоловічу фертильність рослини. У певних варіантах здійснення експресія полінуклеотиду чоловічої фертильності підвищує чоловічу фертильність рослини.

Наприклад, представлені рослини, що містять касету експресії, яка містить полінуклеотид М51, наведений під 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45, або його активний фрагмент або варіант, функціонально пов'язаний із конститутивним промотором, таким як промотор 355 Самум. В результаті експресії полінуклеотиду М51 підвищується чоловіча фертильність рослини.

У певних варіантах здійснення представлені касети експресії, що містять розкритий у даному документі гетерологічний полінуклеотид чоловічої фертильності або його активний фрагмент або варіант, функціонально пов'язаний із промотором, активним у рослині, для рослини, що характеризується чоловічою стерильністю. В результаті експресії гетерологічного полінуклеотиду чоловічої фертильності надається чоловіча фертильність; це можна назвати відновленням чоловічої фертильності у рослини. У конкретних варіантах здійснення розкриті в даному документі рослини містять касету експресії, яка містить розкритий у даному документі гетерологічний полінуклеотид чоловічої фертильності або його активний фрагмент або варіант, функціонально пов'язаний з промотором, пакетовану з однією або декількома касетами експресії що містять полінуклеотид, що становить інтерес, функціонально пов'язаний із промотором, активним у рослині. Наприклад, пакетований полінуклеотид, що становить інтерес,

Зо може містити полінуклеотид, що руйнує чоловічу гамету, й/або маркерний полінуклеотид.

Розкриті в даному документі рослини можуть також містити описані в даному документі пакетовані касети експресії, що містять щонайменше два полінуклеотиди, так щоб щонайменше два полінуклеотиди успадковувалися разом у більше ніж 5095 випадків мейозу, тобто невипадковим чином. Відповідно, якщо рослина або рослинна клітина, що містять пакетовані касети експресії з двома полінуклеотидами, зазнають мейозу, два полінуклеотиди сегрегують в одну й ту саму клітину-нащадка (дочірню). Таким чином, пакетовані полінуклеотиди, очевидно, будуть експресуватися разом у будь-якій клітині, в якій вони присутні. Наприклад, рослина може містити касету експресії, яка містить полінуклеотид чоловічої фертильності, пакетовану з касетою експресії, що містить полінуклеотид, що руйнує чоловічу гамету, так щоб полінуклеотид чоловічої фертильності і полінуклеотид, що руйнує чоловічу гамету, успадковувалися разом.

Зокрема, рослина з чоловічою стерильністю може містити касету експресії, яка містить розкритий у даному документі полінуклеотид чоловічої фертильності, функціонально пов'язаний із конститутивним промотором, пакетовану з касетою експресії, яка містить полінуклеотид, що руйнує чоловічу гамету, функціонально пов'язаний із промотором, активним переважно у чоловічих тканинах, так щоб рослина виробляла зрілі пилкові зерна. Однак у такої рослини розвиток пилку, що містить полінуклеотид чоловічої фертильності, буде інгібуватися експресією полінуклеотиду, що руйнує чоловічу гамету.

В. Рослини та способи введення

Застосовуваний у даному документі термін «рослина» включає рослинні клітини, протопласти рослинних клітин, тканинні культури рослинних клітин, з яких можна регенерувати рослину, рослинні калюси, скупчення рослинних клітин і рослинні клітини, які Є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, насіннєві зачатки, насіння, листя, квітки, гілки, плоди, зернівки, початки, качани початків, листові обгортки, стебла, коріння, кінчики коренів, пиляки, зерно тощо. Під застосовуваним у даному документі виразом «зерно» мається на увазі зріла насінина, одержана комерційними виробниками з метою, яка відрізняється від вирощування або відновлення виду. Потомство, варіанти та мутанти регенерованих рослин також включені в обсяг даного розкриття за умови, що ці частини містять введені послідовності нуклеїнової кислоти.

Способи, розкриті в даному документі, включають введення поліпептиду або полінуклеотиду 60 в рослинну клітину. Мається на увазі що «введення» означає включення в рослину полінуклеотиду або поліпептиду таким чином, щоб послідовність потрапила всередину клітини.

Розкриті в даному документі способи не залежать від конкретного способу введення послідовності у клітину-хазяїна, за винятком того, що полінуклеотид або поліпептиди повинні потрапити всередину щонайменше однієї клітини-хазяїна. Способи введення полінуклеотиду або поліпептидів у клітини-хазяїни (тобто в рослини) відомі з рівня техніки та включають без обмеження способи стабільної трансформації, способи тимчасової трансформації та способи, опосередковані вірусами.

Мається на увазі, що «стабільна трансформація» означає, що нуклеотидна конструкція, введена у хазяїна (тобто в рослину), інтегрується в геном рослини і здатна успадковуватися його потомством. Мається на увазі, що «тимчасова трансформація» означає, що полінуклеотид або поліпептид введений у хазяїна (тобто в рослину) і експресується тимчасово.

Протоколи трансформації, а також протоколи введення поліпептидів або полінуклеотидних послідовностей у рослини можуть змінюватися залежно від типу рослини або рослинної клітини, наприклад, однодольної або дводольної рослини, яку цілеспрямовано трансформують.

Придатні способи введення поліпептидів і полінуклеотидів у рослинні клітини включають мікроін'єкцію (Стоззугау єї а!. (1986) Віотесппіднев 4:320-334), електропорацію (Кідоз еї а!. (1986)

Ргос. Майї. Асад. сі. БА 83:5602-5606, опосередковану Адгобасіегішт трансформацію (Томпзепа еї аІ., патент США Мо 5563055; 2пао еї аі),, патент США Мо 5981840), пряме перенесення генів (Раз2Кому/5Кі еї аІ. (1984) ЕМВО 3. 3:2717-2722) і балістичне прискорення частинок (див., наприклад, запога еї аІ., патент США Мо 4945050; Тотез еї аїЇ., патент США Мо 5879918; Тотез еї аІ., патент США Мо 5886244; Відпеу еї аІ., патент США Мо 5932782; Тотез єї аІ. (1995) "Сігесї ОМА Тгапвтег іпо Іпіасі Ріапі СеїІ5 ма Місгоргодїесше Вотбрагатенпі," у Ріапі Сеїї,

Тіввиє, апа Огдап Сийште: Еппдатепіа! Меїподз», са. Сатброга апа РнНіїрз, (Зргіпдег-Мепад,

Вепіп); МеСарБе, еї а!. (1988) Віоїесппоіоду 6:923-926) і трансформацію гена Гес1 (МУО 00/28058).

Див. також Умеі55іпдег еї аїЇ. (1988) Апп. Кеу. Сепеї. 22:421-477; Запітога, еї а!. (1987) Рапісціате

Зсіепсе апа Тесппоіоду 5:27-37 (цибуля); Спгівзіои, еї аї., (1988) Ріапі Рпузіої!. 87:671-674 (соя);

МесСанре, еї а!., (1988) Віо/Тесппоіоду 6:923-926 (соя); Ріпег апа МеМиїеп, (1991) Іп Міго Сеї! ЮОем.

Вісі. 27Р:175-182 (соя); 5іпой, еї аїІ., (1998) Тпеог. Аррі. Сепеї. 96:319-324 (соя); Оаца еї аї. (1990) Віоїесппоіоду 8:736-740 (рис); КіІеїп еї а. (1988) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 85:4305-4309

Зо (маїс); Кієїп єї аї. (1988) ВіотесппоЇІоду 6:559-563 (маїс); Тоте5, патент США Мо 5240855; Виїзіпд еї аІ,, патенти США МоМо 5322783 і 5324646; Тотез еї аї. (1995) "бігесї ОМА Ттгапвгег іп Іпасі

Ріапі СеїІ5 міа МісторгоїесшШе Вотрагатепі," у Ріапі СеїІ, Тівие, апа Огдап Сийиге: Рипдатепіа!

Меїпод, єд. Сатього (Зрііпдег-Мегіад, Вегіїп) (маїс); Ківїп еї аї. (1988) Ріапі Рпузіої. 91:440-444 (маїс); Еготт еї аї. (1990) ВіоїесппоІоду 8:833-839 (маїс); Нооукааз-Мап 5іодієтеп еї аї. (1984)

Маїштге (Гопаоп) 311:763-764; Вомеп еї аІ., патент США Мо 5736369 (зернові злаки); Вутебієг евї аї. (1987) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 84:5345-5349 (І Іасеає); Ое УМеї єї а. (1985) в Те Ехрегітепгіа!

Мапіршіайоп ої Омціе Тіб5це5, ва. Спартап еї аї. (Гопдтап, Мем/ мок), рр. 197-209 (пилок);

Каеррієг єї аї. (1990) Ріапі СеїЇ Верогів 9:415-418 і Каеррієг еї аІ. (1992) Тпеог. Аррі. Сепеї. 84:560-566 (опосередкована ниткоподібними кристалами трансформація); О'Наїїчіп еї аї. (1992)

Ріапі Сеї! 4:1495-1505 (електропорація); І і еї аї. (1993) Ріапі СеїІ Керогі5 12:250-255 та Спгібїои апа Рога (1995) Аппаїб5 ої Воїапу 75:407-413 (рис); О5|ода еї аІ. (1996) Маїиге ВіоїесппоІоду 14:745-750 (маїс за участі Адгобасіегійт їштегїасієп5); усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання.

У конкретних варіантах здійснення розкриті в даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності або касети експресії можна доставляти в рослину із застосуванням різних способів тимчасової трансформації. Такі способи тимчасової трансформації включають без обмеження введення поліпептиду чоловічої фертильності або його варіантів і фрагментів безпосередньо в рослину або введення транскрипту чоловічої фертильності в рослину. Такі способи включають, наприклад, мікроіїн'єкцію або бомбардування частинками. Див., наприклад,

Стгов5мау еї аї. (1986) Мої Сеп. Сепеї. 202:179-185; Мотига єї аІ. (1986) Ріапі 5сі. 4453-58;

Нерівг єї аї. (1994) Ргос. Маї). Асад. бсі. 91: 2176-2180, і Низхп еї аї. (1994) Тне дошгпаї ої Сеї

Зсієпсе 107:775-784, усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання. Як альтернатива, рослину можна тимчасово трансформувати за допомогою розкритих у даному документі полінуклеотиду чоловічої фертильності або касети експресії із застосуванням методик, відомих з рівня техніки. Такі методики включають застосування вірусної векторної системи та осадження полінуклеотиду в такий спосіб, який виключає подальше вивільнення

ДНК. Таким чином, може відбуватися транскрипція зв'язаної з частинками ДНК, але частота, з якою вона вивільнюється із інтеграцією в геном, значно знижена. Такі способи включають в себе застосування частинок, вкритих поліетиленіміном (РЕЇ; Мо за кат. ЗБідта РЗ3143). бо В інших варіантах здійснення розкриті в даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності або касети експресії можна вводити в рослини шляхом приведення в контакт рослин з вірусом або вірусними нуклеїновими кислотами. Як правило, такі способи включають вбудовування розкритої в даному документі нуклеотидної конструкції в молекулу вірусної ДНК або РНК. Зрозуміло, що розкрита в даному документі послідовність, що визначає чоловічу фертильність, може спочатку синтезуватися як частина вірусного поліпротеїну, яка потім може піддаватися процесингу шляхом протеолізу іп мімо або іп міго з одержанням необхідного рекомбінантного білка. Способи введення в рослини полінуклеотидів, у тому числі молекул вірусної ДНК або РНК, і способи експресії білка, що кодується ними, відомі з рівня техніки. Див., наприклад, патенти США МоМо 5889191, 5889190, 5866785, 5589367, 5316931; і Рогіа єї а!. (1996)

Моїесшіаг ВіотесппоЇоду 5:209-221; включені в даний документ за допомогою посилання.

З рівня техніки відомі способи цілеспрямованої вставки полінуклеотиду в конкретне місцеположення в геномі рослини. В одному варіанті здійснення вставку полінуклеотиду в необхідне місцеположення в геномі виконують із використанням системи сайт-специфічної рекомбінації. Див., наприклад, УМО 99/25821, УМО 99/25854, УМО 99/25840, МО 99/25855 і

МО 99/25853, усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання. Коротко, розкритий у даному документі полінуклеотид може міститися в касеті для перенесення, фланкованій двома неідентичними сайтами рекомбінації. Касету для перенесення вводять у рослину, що має у своєму геномі стабільно вбудований цільовий сайт, що фланкований двома неідентичними сайтами рекомбінації, які відповідають сайтам касети для перенесення.

Забезпечують придатну рекомбіназу, та касета для перенесення інтегрується в цільовий сайт.

Полінуклеотид, який становить інтерес, таким чином, інтегрується у конкретне хромосомне положення в геномі рослини.

З клітин, які були трансформовані, можна виростити рослини відповідно до традиційних способів. Див., наприклад, МеСоптіск, еї аї., (1986) Ріапі Сеї! Керогів 5:81-84. Ці рослини можна потім запилювати за допомогою або тієї ж самої трансформованої лінії, або іншої лінії та ідентифікувати одержане в результаті потомство, яке характеризується необхідною експресією бажаної фенотипової характеристики. Можна вирощувати два або більше поколінь, щоб переконатися у тому, що експресія бажаної фенотипової характеристики стабільно підтримується та успадковується, а потім збирати насіння, щоб переконатися у тому, що була

Зо досягнута експресія бажаної фенотипової характеристики. Таким чином, дане розкриття передбачає трансформовану насінину (що також називають «трансгенною насіниною»), яка має розкритий у даному документі полінуклеотид чоловічої фертильності, наприклад, розкриту в даному документі касету експресії, стабільно вбудовану в її геном.

Терміни «цільовий сайт», «цільова послідовність», «цільова ДНК», «цільовий локус», «цільовий сайт геному», «цільова послідовність геному» і «цільовий локус геному» у даному документі застосовуються взаємозамінно та відносяться до полінуклеотидної послідовності в геномі (у тому числі ДНК хлоропласту і мітохондріальної ДНК) клітини, в якій індукується двонитковий розрив у геномі клітини. Цільовий сайт може бути ендогенним сайтом у геномі клітини або організму, або, альтернативно, цільовий сайт може бути гетерологічним щодо клітини або організму і, таким чином, не зустрічатися в природі в геномі, або цільовий сайт може знаходитися в гетерологічному місцеположенні в геномі порівняно з тим, у якому він зустрічається в природі. Застосовувані в даному документі терміни «ендогенна цільова послідовність» і «нативна цільова послідовність» використовуються в даному документі взаємозамінно для позначення цільової послідовності, яка є ендогенною або нативною щодо генома клітини або організму та знаходиться в ендогенному або нативному положенні цієї цільової послідовності в геномі клітини або організму. Клітини включають рослинні клітини, а також рослини та насіння, одержані за допомогою описаних у даному документі способів.

В одному варіанті здійснення цільовий сайт у поєднанні з конкретною використовуваною системою редагування структури гена може бути подібним до сайта розпізнавання ДНК або цільовим сайтом, який специфічно розпізнається й/або зв'язується засобом, що індукує двонитковий розрив, таким як без обмеження ендонуклеаза з «цинковими пальцями», мегануклеаза, ендонуклеаза ТАЇЕМ, диїйденвкмМА СтКІ5ЗРА-Саб5 або інший реагент, який направляється полінуклеотидом та спричиняє двонитковий розрив.

Терміни «штучний цільовий сайт» і «штучна цільова послідовність» застосовуються в даному документі взаємозамінно та відносяться до цільової послідовності, яка була введена в геном клітини або організму. Така штучна цільова послідовність може бути ідентичною за послідовністю щодо ендогенної або нативної цільової послідовності в геномі клітини, але локалізована в іншому положенні (тобто неендогенному або ненативному положенні) у геномі клітини або організму. 60 Терміни «змінений цільовий сайт», «змінена цільова послідовність», «модифікований цільовий сайт» і «модифікована цільова послідовність» застосовуються в даному документі взаємозамінно та відносяться до цільової послідовності, розкритої в даному документі, яка містить щонайменше одну зміну порівняно з незміненою цільовою послідовністю. Такі «зміни» включають, наприклад: (ії) заміщення щонайменше одного нуклеотиду, (ії) делецію щонайменше одного нуклеотиду, (ії) вставку щонайменше одного нуклеотиду або (ім) будь-яку комбінацію із (І)- (ії). Наприклад, було показано, що точкові мутації т514, т51е, т51ї або т51й обумовлюють чоловічу стерильність; подібні мутації можуть бути внесені в екзони М51 для одержання альтернативних алелей, що обумовлюють чоловічу стерильність. Також множинні мутації можна застосовувати в комбінації.

Певні варіанти здійснення включають розкриті в даному документі полінуклеотиди, які модифікуються за допомогою ендонуклеаз. Ендонуклеази являють собою ферменти, які розщеплюють фосфодіефірний зв'язок у полінуклеотидному ланцюгу, і включають рестрикційні ендонуклеази, які розщеплюють ДНК у специфічних сайтах без пошкодження основ.

Рестрикційні ендонуклеази включають ендонуклеази І типу, ІІ типу, Ш типу і ЇМ типу, які додатково включають підтипи. У системах І типу і Ш типу ферментативні активності як метилази, так і рестриктази містяться в одному комплексі.

Ендонуклеази також включають мегануклеази, також відомі як хоумінг-ендонуклеази (НЕази). Аналогічно до рестрикційних ендонуклеаз, НЕази зв'язують і розрізують специфічні сайти розпізнавання. Однак сайти розпізнавання для мегануклеаз зазвичай є довшими приблизно на 18 п.о. або більше. (Див. патентну публікацію УМО 2012/129373, подану 22 березня 2012 року). Мегануклеази були класифіковані на чотири родини на основі консервативних мотивів послідовностей (ВеМогі М, апа Регітап Р 5 9. Віої. Спет. 1995;270:30237-30240). Ці мотиви беруть участь у координації іонів металів і гідролізі фосфодіефірних зв'язків. НЕази відрізняються своїми довгими сайтами розпізнавання і тим, що допускають деякі поліморфізми послідовностей в їх ДНК-субстратах.

Правила номенклатури мегануклеаз подібні до правил для інших рестрикційних ендонуклеаз. Мегануклеази також характеризують за префіксом БЕ-, І- або РІ- для ферментів, що кодуються відповідно автономними ОКЕ, інтронами й інтеїнами. Одна стадія у процесі рекомбінації включає розщеплення полінуклеотиду в сайті розпізнавання або поруч з ним. Цю

Зо розщеплювальну активність можна використовувати для одержання двониткового розриву. Для огляду сайт-специфічних рекомбіназ та їх сайтів розпізнавання див. Зацег (1994) Сигт. Ор.

Віоїеснпої. 5:521-7; і Задом5Кі (1993) ЕБАБЕВ 7:760-7. У деяких прикладах рекомбіназа відноситься до родин інтеграз або резольваз.

ТАЇ -ефекторні нуклеази є класом нуклеаз, специфічних для конкретних послідовностей, які можна застосовувати для одержання двониткових розривів у конкретних цільових послідовностях у геномі рослини або іншого організму. (МіПег еї аї. (2011) Майте ВіотесппоЇоду 29:143-148). Нуклеази з «цинковими пальцями» (2ЕМ) являють собою сконструйовані засоби, що індукують двонитковий розрив, які містять ДНК-зв'язувальний домен 3 «цинковими пальцями» і домен засобу, що індукує двонитковий розрив. Специфічність сайта розпізнавання надається доменом з «цинковими пальцями», який зазвичай включає два, три або чотири «цинкових пальці», наприклад такі, що мають структуру С2Н2; однак відомі та сконструйовані інші структури з «цинковими пальцями». Домени з «цинковими пальцями» є придатними для конструювання поліпептидів, які специфічно зв'язують вибрану полінуклеотидну послідовність розпізнавання. 2ЕМ включають сконструйований ДНК-зв'язувальний домен з «цинковими пальцями», зв'язаний із неспецифічним ендонуклеазним доменом, наприклад, нуклеазним доменом ендонуклеази ІІ типу, таким як РОКІ. Додаткові функціональні засоби можуть бути злиті з доменом, що зв'язує «цинковий палець», у тому числі домени активаторів транскрипції, домени репресорів транскрипції та метилази. У деяких прикладах для розщеплювальної активності необхідна димеризація нуклеазного домену. Кожний «цинковий палець» розпізнає три послідовні пари основ у цільовій ДНК. Наприклад, З-пальцевий домен розпізнає послідовність із 9 суміжних нуклеотидів; за необхідності димеризації нуклеази використовують два набори триплетів «цинкових пальців» для зв'язування 18-нуклеотидної послідовності розпізнавання.

СВІ5РА-локуси (короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами) (також відомі як ЗРІОК - прямі повтори, розділені спейсерами) становлять родину нещодавно описаних локусів ДНК. СКІЗРЕК-локуси складаються з коротких і висококонсервативних повторів ДНК (зазвичай від 24 до 40 п.о., повторюваних від 1 до 140 разів, які також називають СКІЗРЕ- повторами), які є частково паліндромними. Повторювані послідовності (зазвичай специфічні для виду) відокремлені варіабельними послідовностями постійної довжини (зазвичай від 20 до 58, бо залежно від СКІЗРА-локусу (ММО 2007/025097, опублікована 1 березня 2007 року).

СВІЗРА-локуси вперше були ідентифіковані у Е. соїї (І5піпо еї аї. (1987) 9. Васіегіаї. 169:5429-5433; МаКаїа єї аІ. (1989) 9. Васіегла). 171:3553-3556). Подібні розкидані короткі повторювані послідовності були ідентифіковані у НаіІоїтегах теаіетапеї, Зігеріососси5 руодепев,

Апабваєпа і Мусобрасіегішт їибегсціовіз (сгоепеп еї аї. (1993) Мої. Місгобіої. 10:1057-1065; Ноє єї аї. (1999) ЕЄтегу. Іптесі. бів. 5:254-263; Мазеропйі еї а!. (1996) Віоспіт. Віорпу5. Асіа 1307:26-30;

Моїїса єї аІ. (1995) Мої. МістобіоІ. 17:85-93). СВІЗРА-локуси відрізняються від інших 55К структурою повторів, які були названі короткими рівномірно розділеними повторами (ЗК5К) (Чапвзеп еї аї. (2002) ОМІСЗ5 У. Іпієд. Віої. 6:23-33; Моїіса еї аї. (2000) Мої. Містобіо!. 36:244-246).

Повтори являють собою короткі елементи, які зустрічаються у кластерах, що завжди рівномірно розділені варіабельними послідовностями постійної довжини (Моїіса еї аї. (2000) Мої. Місгобіої. 36:244-246).

Ген Са5 відноситься до гена, що, як правило, з'єднаний, зв'язаний або розташований поблизу або поруч із фланкуючими СЕКІ5РЕ-локусами. Терміни "ген Сав5", "СКІ5РЕ- асоційований (Са5) ген" використовуються в даному документі взаємозамінно. Повний огляд родини білків Са5 представлений у Наїй еї аї. (2005) Сотршаїййопа! Віооду, РГо5 Сотриї Віої 1(6): ебо. аоі:10.1371/ЛоигпаїІ.рері.0010060. Як описано в даному документі, описано 41 родина

СВІБ5БРВА-асоційованих (Сав) генів, додатково до чотирьох раніше відомих родин генів. Показано, що СКІЗРЕ-системи належать до різних класів із різними патернами повторів, наборами генів і сукупностями видів. Число генів Са5 у певному СКІЗРЕ-локусі може відрізнятися між видами.

Ендонуклеаза Са5 відноситься до білка Са5, що кодується геном Саз5, причому вказаний білок Саб5 здатний до введення двониткового розриву в цільову послідовність ДНК.

Ендонуклеаза Са5 спрямовується направляючим полінуклеотидом для розпізнавання й необов'язково введення двониткового розриву в специфічний цільовий сайт у геномі клітини (попередня заявка на патент США Мо 62/023239, подана 11 липня 2014 року). Система направляючий полінуклеотид/ендонуклеаза Саб5 включає комплекс ендонуклеази Саз і направляючого полінуклеотиду, який здатний вводити двонитковий розрив у цільову послідовність ДНК. Ендонуклеаза Са5 розкручує ДНК-дуплекс поблизу цільового сайта у геномі та розщеплює обидві нитки ДНК після розпізнавання цільової послідовності за допомогою направляючої РНК, якщо правильний мотив, суміжний з протоспейсером (РАМ), приблизно

Зо розташований на 3'-кінці цільової послідовності.

Ген ендонуклеази Са5 може являти собою ген ендонуклеази Са59 або його функціональний фрагмент, такий як без обмеження гени Са59, перераховані в ЗЕО ІЮО МО: 462, 474, 489, 494, 499, 505 і 518 із МО 2007/025097, опублікованої 1 березня 2007 року. Ген ендонуклеази Са може являти собою ген ендонуклеази Са59, оптимізований для рослини, маїсу або сої, такий як без обмеження кодон-оптимізований для рослини ген Са59 Зігеріососси5 руодепев5, який може розпізнавати будь-яку геномну послідовність типу М(12-30)МО0с. Ендонуклеазу Са5 можна вводити безпосередньо в клітину за допомогою будь-якого способу, відомого з рівня техніки, наприклад, без обмеження за допомогою способів тимчасового введення, трансфекції й/або місцевого застосування.

Використовуваний у даному документі термін «направляюча РНК» відноситься до синтетичного злиття двох молекул РНК, сгЕМА (РНК СКІБРЕ), що містить варіабельний націлювальний домен, і їгастеМА. В одному варіанті здійснення направляюча РНК містить варіабельний направляючий домен із послідовностей довжиною від 12 до 30 нуклеотидів і фрагмент РНК, який може взаємодіяти з ендонуклеазою Сав.

Використовуваний у даному документі термін «направляючий полінуклеотид» відноситься до полінуклеотидної послідовності, яка може утворювати комплекс з ендонуклеазою Саз і надавати можливість ендонуклеазі Са5 розпізнавати і необов'язково розщеплювати цільовий сайт ДНК (попередня заявка на патент США Мо 62/023239, подана 11 липня 2014 року).

Направляючий полінуклеотид може являти собою одиночну молекулу або димерну молекулу.

Направляюча полінуклеотидна послідовність може являти собою послідовність РНК, послідовність ДНК або їх комбінацію (послідовність комбінації ДНК-РНК). Необов'язково направляючий полінуклеотид може містити щонайменше один нуклеотид, фосфодіефірний зв'язок або модифікацію зв'язку, таку як без обмеження закрита нуклеїнова кислота (І МА), 5- метил-йаС, 2,6-діамінопурин, 2-фтор-А, 2-фтор-О, 2-О-метил-РНК, тіофосфатний зв'язок, зв'язок з молекулою холестерину, зв'язок з молекулою полієтиленгліколю, зв'язок з молекулою спейсера 18 (ланцюг гексаетиленгліколю) або 5'-3-ковалентний зв'язок, що приводить до циркуляризації. Направляючий полінуклеотид, який містить лише рибонуклеїнові кислоти, також називають «направляючою РНК».

Направляючий полінуклеотид може являти собою димерну молекулу (що також називається бо дуплексним направляючим полінуклеотидом), яка містить перший домен нуклеотидної послідовності (що називається варіабельним націлювальним доменом або МТ-доменом), який є комплементарним до нуклеотидної послідовності в цільовій ДНК, і другий домен нуклеотидної послідовності (що називається доменом розпізнавання ендонуклеази Са5 або СЕК-доменом), який взаємодіє з поліпептидом ендонуклеази Саз. СЕК-домен направляючого полінуклеотиду у вигляді димерної молекули містить дві окремі молекули, які гібридизуються уздовж ділянки комплементарності. Дві окремі молекули можуть являти собою послідовності РНК, ДНК і/або комбінації РНК-ДНК. У деяких варіантах здійснення першу молекулу дуплексного направляючого полінуклеотиду, яка включає МТ-домен, з'єднаний із СЕК-доменом, називають «СПОМА» (коли вона складається з неперервного відрізка із ДНК-нуклеотидів), або «сгеМА» (коли вона складається з неперервного відрізка із РНК-нуклеотидів), або «сСгОМА-ЕМА» (коли вона складається із комбінації ДНК- і РНК-нуклеотидів). Ст--чуклеотид може містити фрагмент

СКМА, що зустрічається в природі у Васієгіа та Агспаєа. В одному варіанті здійснення розмір фрагмента СКМА, що зустрічається в природі у Васієгіа і Агоспаєа, який присутній у сг- нуклеотиді, розкритому в даному документі, може варіювати без обмеження в діапазоні 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення другу молекулу дуплексного направляючого полінуклеотиду, що містить СЕК-домен, називають "ЧгасгтеМА" (коли вона складається із неперервного відрізка з РНК-нуклеотидів), або "гасгтМА" (коли вона складається з неперервного відрізка з ДНК-нуклеотидів), або ЧгасгтомА-

ЕМА" (коли вона складається з комбінації ДНК- і РНК-нуклеотидів). В одному варіанті здійснення

РНК, яка спрямовує комплекс РНК/ендонуклеаза Са59, являє собою дуплексну РНК, що містить дуплекс сгЕМА-тгастАМА.

Направляючий полінуклеотид також може являти собою одиночну молекулу, що містить перший домен нуклеотидної послідовності (що називається варіабельним націлювальним доменом або МТ-доменом), який є комплементарним до нуклеотидної послідовності в цільовій

ДНК, і другий домен нуклеотидної послідовності (що називається доменом розпізнавання ендонуклеази Са5 або СЕК-доменом), який взаємодіє з поліпептидом ендонуклеази Са5. Під «доменом» мають на увазі неперервний відрізок із нуклеотидів, який може являти собою послідовність РНК, ДНК й/або комбінації РНК-ДНК. МТ-домен і/або СЕК-домен одиночного направляючого полінуклеотиду може включати послідовність РНК, послідовність ДНК або послідовність комбінації РНК-ДНК. У деяких варіантах здійснення одиночний направляючий полінуклеотид містить сг-нуклеотид (що містить МТ-домен, з'єднаний із СЕК-доменом), з'єднаний із ігасг--чтуклеотидом (що містить СЕК-домен), де зв'язок являє собою нуклеотидну послідовність, що включає послідовність РНК, послідовність ДНК або послідовність комбінації

РНК-ДНК. Одиночну направляючий полінуклеотид, що складається з послідовностей сг- нуклеотиду та ігасг-нуклеотиду, може називатися «одиночною направляючою РНК» (коли він складається з неперервного відрізка з РНК-нуклеотидів) або «одиночною направляючою ДНК» (коли він складається з неперервного відрізка з ДНК-нуклеотидів) або «одиночною направляючою РНК-ДНК» (коли він складається з комбінації РНК- і ДНК-нуклеотидів). В одному варіанті здійснення даного розкриття одиночна направляюча РНК містить СКМА, або фрагмент

СЕМА і їгасгтеМА, або фрагмент ігастеМА системи Саз ІЇ типу, які можуть утворювати комплекс з ендонуклеазою Саз ІІ типу, де вказаний комплекс направляючої РНК/ендонуклеази Са5 може спрямовувати ендонуклеазу Са5 до цільового сайта в геномі рослини, надаючи можливість ендонуклеазі Са5 вводити двонитковий розрив у цільовий сайт в геномі. Один аспект застосування одиночного направляючого полінуклеотиду порівняно з дуплексним направляючим полінуклеотидом полягає у тому, що для експресії одиночного направляючого полінуклеотиду необхідно створити лише одну касету експресії.

Терміни «варіабельний націлюючий домен» або «МТ-домен» використовуються в даному документі взаємозамінно та включають нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною до однієї нитки (нуклеотидної послідовності) цільового сайта двониткової ДНК. 95 комплементації першого домену нуклеотидної послідовності (МІ-домену) і цільової послідовності може становити щонайменше 5095, 5195, 5295, 5395, 5495, 5595, 5696, 5795, 5895, 5995, 6095, 6195, 6290, 639, 6395, 6590, 6бос, 6790, 6895, бю, 70905, 71905, 72ю, ЗУ, 7490, 790, 7690, 7790, 7890, 7990, 8096, 8195, 8295, 8395, 8490, 8590, 8695, 8795, 8895, 8990, 9095, 9195, 9295, 9390, 9495, 9595, 969, 9795, 9895, 9995 або 10095. Варіабельний цільовий домен може мати довжину щонайменше 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення варіабельний націлювальний домен містить неперервний відрізок із 12-30 нуклеотидів. Варіабельний націлювальний домен може складатися з послідовності ДНК, послідовності РНК, модифікованої послідовності ДНК, модифікованої послідовності РНК або будь-якої їх комбінації. бо Терміни «домен розпізнавання ендонуклеази Саб5» або «СЕК-домен» направляючого полінуклеотиду використовуються в даному документі взаємозамінно та включають нуклеотидну послідовність (таку як другий домен нуклеотидної послідовності направляючого полінуклеотиду), яка взаємодіє з поліпептидом ендонуклеази Са5. СЕК-домен може складатися з послідовності ДНК, послідовності РНК, модифікованої послідовності ДНК, модифікованої послідовності РНК (див., наприклад, описані в даному документі модифікації) або будь-якої їх комбінації.

Нуклеотидна послідовність, яка з'єднує сг-нуклеотид і ігасг-нуклеотид одиночного направляючого полінуклеотиду, може включати послідовність РНК, послідовність ДНК або послідовність комбінації РНК-ДНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність, яка з'єднує сг-нуклеотид і ігасг-нуклеотид одиночного направляючого полінуклеотиду, може мати довжину щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 нуклеотидів.

В іншому варіанті здійснення нуклеотидна послідовність, яка з'єднує сг-нуклеотид і ігасг- нуклеотид одиночного направляючого полінуклеотиду, може включати послідовність тетрапетлі, таку як без обмеження послідовність тетрапетлі СААА.

Модифікація нуклеотидної послідовності направляючого полінуклеотиду, МТ-домену й/або

СЕН-домену без обмеження може бути вибрана із групи, що складається з 5'-кепа, 3- поліаденільованого хвоста, послідовності рибосвітчу, послідовності контролю стабільності, послідовності, яка утворює дуплекс азеЕМА, модифікації або послідовності, яка націлює направляючий полінуклеотид у внутрішньоклітинне місцеположення, модифікації або послідовності, яка забезпечує відстеження, модифікації або послідовності, яка забезпечує сайт зв'язування для білків, закритої нуклеїнової кислоти (І МА), нуклеотиду 5-метил-асС, нуклеотиду 2,6-діамінопурину, нуклеотиду 2'-фтор-А, нуклеотиду 2'-фтор-О; нуклеотиду 2'-О-метил-РНК, тіофосфатного зв'язку, зв'язку із молекулою холестерину, зв'язку із молекулою поліетиленгліколю, зв'язку із молекулою спейсера 18, 5'-3'і-ковалентного зв'язку або будь-якої їх комбінації. Ці модифікації можуть забезпечувати щонайменше одну додаткову корисну ознаку, де додаткова корисна ознака вибрана із групи модифікованої або регульованої стабільності,

Зо внутрішньоклітинного націлювання, відстеження, флуоресцентної мітки, сайта зв'язування для білка або білкового комплексу, модифікованої афінності зв'язування з комплементарною цільовою послідовністю, модифікованої стійкості до деградації в клітині та підвищеної проникності в клітину.

У конкретних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність, що підлягає модифікації, може являти собою регуляторну послідовність, таку як промотор, де редагування структури промотора включає заміну промотора (що також називається «промоторним обміном» або «промоторною заміною») або промоторного фрагмента іншим промотором (також відомим як замінювальний промотор) або промоторним фрагментом (також відомим як замінювальний промоторний фрагмент), при цьому заміна промотора приводить у результаті до будь-якої однієї з наступних будь-яких комбінацій: підвищеної промоторної активності, підвищеної промоторної тканиноспецифічності, зниженої промоторної активності, зниженої промоторної тканиноспецифічності, нової промоторної активності, індукованої промоторної активності, збільшеного інтервалу експресії гена, модифікації прогресу експресії гена за тривалістю або стадією розвитку в одному шарі клітин або іншому шарі клітин (такої як без обмеження збільшення тривалості експресії гена в тапетумі пиляків маїсу; див., наприклад, патент США 5837850, виданий 17 листопада 1998 року), мутації ДНК-зв'язувальних елементів й/або делеції або додавання ДНК-зв'язувальних елементів. Промотор (або промоторний фрагмент), що підлягає модифікації може являти собою промотор (або промоторний фрагмент), який є ендогенним, штучним, початково присутнім або трансгенним щодо клітини, яку піддають редагуванню. Замінювальний промотор (або замінювальний промоторний фрагмент) може являти собою промотор (або промоторний фрагмент), який є ендогенним, штучним, початково присутнім або трансгенним щодо клітини, яку піддають редагуванню.

Промоторні елементи для вставки можуть являти собою без обмеження промоторні корові елементи (такі як без обмеження СААТ-бокс, ССААТ-бокс, Прибнов-бокс й/або ТАТА-бокс), послідовності регуляції трансляції й/або репресорну систему для індукованої експресії (такі як репресорні/операторні/ндукторні елементи оператора ТЕТ або сульфонілсечовинні (и) репресорні/операторні/ндукторні елементи). Чутливий до дегідратації елемент (ОКЕ) спочатку був ідентифікований як цис-діючий промоторний елемент у промоторі чутливого до засухи гена га29А, який містить консервативну корову послідовність із 9 п.о., ТАССОАСАТ (Уатадисні- 60 ЗПіпогакі, К., апа 5Піпогакі, К. (1994) Ріапі Се! 6, 251-264). Вставка ОКЕ в ендогенний промотор може забезпечувати індуковану засухою експресію гена, що розташований нижче.

Інший приклад являє собою АВА-чутливі елементи (АВКЕ), які містять консенсусну послідовність (СЛУАСОТОСС, що зустрічається у численних АВА- і/або регульованих стресом генах (Ви5К Р. К., Раде5 М.(1998) Ріапі Мої. Віої. 37:425-435). Вставка енхансера 355 або енхансера ММУ в ендогенну промоторну ділянку буде підвищувати рівень експресії гена (патент

США Мо 5196525). Промотор (або промоторний елемент) для вставки може являти собою промотор (або промоторний елемент), який є ендогенним, штучним, початково присутнім або трансгенним щодо клітини, яку піддають редагуванню.

Розкриті в даному документі полінуклеотиди чоловічої фертильності та касети експресії можна застосовувати для трансформації будь-якого виду рослин, у тому числі без обмеження однодольних і дводольних. Приклади видів рослин, що становлять інтерес, включають без обмеження кукурудзу/маїс (7еа таух), Вгазвзіса 5р. (наприклад, В. парих, В. гара, В. |ипсеа), люцерну (Медісадо заїїма), рис (Огуа заїїма), жито (ЗесаїЇе сегеаїє), сорго (Зогуопйит бБісоїог,

Зогупит уцідаге), просо (наприклад, пеннісетум сизий (Реппізеїшт діаисит), просо культурне (Рапісит піїйасецт), мишій італійський (5еїагіа йаїїса), просо пальчасте (ЕІвизіпе согасапа)), соняшник (Неїїапіпи5 аппии5), сафлор (Сапвпатиз (псіогіи5), пшеницю (для видів див. нижче), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місоїйапа гарасит), картоплю (Зоїапит їшбрегозит), арахіс (Агаспів пуродаєа), бавовник (Совззурішт Баградеп5е, Соз5зурішт ПВігзшит), батат (Іротоеа бБаїашв5), маніок (Мапіпйої езсціепіа), кавове дерево (СоПеа 5рр.), кокосову пальму (Сосо5 писітега), ананас (Апапа5 сотозив5), цитрусові дерева (Сіїги5 зрр.), шоколадне дерево (Тпеобгота сасао), чайний кущ (Сатеїа 5іпепві5), банан (Миза 5рр.), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 сазіса), гуаву (Рзідішт диазама), манго (Мапоїіїега іпаіїса), маслину (ОІева еигораєа), папайю (Сагіса рарауа), кеш'ю (Апасагаіїшт оссідепіаієе), макадамію (Масадатіа іпіедгітоїйіа), мигдаль (Ргипих атудааІйв5), цукровий буряк (Веїа миїЇдагіє), цукрову тростину (Засспагит 5рр.), різновиди вівса (Амепа заїїма), ячмінь (Ногдеит мцідаге), овочі, декоративні рослини, злакові й хвойні рослини.

У конкретних варіантах здійснення у розкритих в даному документі способах і композиціях застосовують рослини пшениці. Використовуваний у даному документі термін "пшениця" відноситься до будь-якого виду роду Тгйісцт, у тому числі його предків, а також його нащадків,

Зо одержаного шляхом схрещування з іншим видом. Пшениця включає "гексаплоїдну пшеницю" з організацією геному ААВВОЮ, що містить 42 хромосоми, і "тетраплоїдну пшеницю" з организацією геному ААВВ, що містить 28 хромосом. Гексаплоїдна пшениця включає Т. аевіїмит, Т. 5рена, Т. тосвпа, Т. сотрасіит, Т. 5рпаегососсип, Т. маміїомії та їх міжвидові гібриди.

Тетраплоїдна пшениця включає Т. дигит (що також називається твердою пшеницею або

Тийісицт Тигуідит підвиду Яигит), Т. аісоссоїде5, Т. аісоссут, Т. роіопісит та їх міжвидові гібриди. Крім того, термін «пшениця» включає можливих предків гексаплоїдних або тетраплоїдних Тгйісцт 5р., таких як Т. игаги, Т. топососсит або Т. роеоїїсит для геному А,

Аедіор5 5рейоїде5 для геному В і Т. Тїаи5спії (також відомий як Аедііор5 здиагоза або Аедіоре5

Іаи5спії) для геному ОЮ. Культурний сорт пшениці для застосування в даному розкритті може належати без обмеження до будь-якого із перерахованих вище видів. Також даний винахід охоплює рослини, одержані за допомогою традиційних методик із використанням Тийісит 5р. як батьківської рослини в результаті статевого схрещування із видом, відмінним від Т/йісут, таким як жито (бЗесаІе сегеаіє), включаючи без обмеження тритикале (Тгййсаіє). У деяких варіантах здійснення рослина пшениці, як, наприклад, комерційні сорти гексаплоїдної пшениці або твердої пшениці, що мають придатні агрономічні характеристики, відомі фахівцям у даній галузі, є придатною для комерційного одержання зерна.

Овочі включають томати (Гусорегвзісоп езсцепішт), латук (наприклад, І асіиса заїїма), зелену квасолю (РПазеоїй5 миїЇдагіє), лімську квасолю (Ріазеоїй5 ІШпепбів), горох (ГаїШйуги5 5рр.) і представників роду Сиситів, таких як огірок (С. Заїїми5),, канталупа (С. сапіаІшрепбвів) і диня мускусна (С. тео). Декоративні рослини включають азалію (Кпододепагоп 5рр.), гортензію (Масгорпуїїа пуагаподеа), гібіскус (Ніріхси5 гозазапепвів), троянди (Коза 5рр.), тюльпани (Тиїїра 5рр.), нарциси (Магсіз5и5 5рр.), петунії (Рейшпіа Пубгіда), гвоздику (Оіапіпи5 сагуорпуїи5), пуансетію (Енйрпогбіа риЇІспеїтіта) і хризантему.

Хвойні, які можна використовувати при практичному здійсненні способів і композицій даного винаходу, включають, наприклад, сосни, такі як сосна ладанна (Ріпи5 (аеда), сосна Еліота (Ріпих еїоїйї), сосна жовта (Ріпи5 ропаегоза), сосна скручена (Ріпих5 сопіогіа) і сосна промениста (Ріпих гадіага); псевдотсугу Мензіса (Рзецйдоїзида теп?ліевії); тсугу канадську (Т5уда сападепвів); ялину сизу (Рісеа діаийса); секвою вічнозелену (Зедиоїіа зетрегмігеп5); справжні ялини, такі як ялиця біла (Абіе5 атарбіїї5) і ялиця бальзамічна (Абіе5 раЇзатеа); і кедри, такі як туя (Тпціа бо ріїсаїа) і кипарисовик нутканський (СПпатаесурагі5 пооїКаїеп5і5). У конкретних варіантах здійснення рослини, розкриті в даному документі, є сільськогосподарськими культурами (наприклад, кукурудза, люцерна, соняшник, Вгавхвзіса, соя, бавовник, сафлор, арахіс, сорго, пшениця, просо, тютюн тощо). Інші рослини, що становлять інтерес, включають зернові рослини, які дають насіння, що становить інтерес, олійні рослини та бобові рослини. Насіння, що становить інтерес, включає насіння зернових культур, таких як кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, жито тощо. Олійні рослини включають бавовник, сою, сафлор, соняшник, Вгазвіса, маїс, люцерну, пальму, кокосову пальму тощо. Бобові рослини включають різновиди бобів та різновиди гороху. Боби включають гуаровий біб, ріжкюове дерево, пажитник, сою, різновиди звичайної квасолі, вигну китайську, золотисту квасолю, лімську квасолю, стручкову квасолю, різновиди сочевиці, турецький горох тощо.

Як правило, будуть застосовувати проміжну клітину-хазяїна в ході практичного здійснення способів і композицій, розкритих у даному документі, для збільшення числа копій клонувального вектора. Завдяки збільшеному числу копій вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що становить інтерес, можна виділити в достатніх кількостях для введення в бажані рослинні клітини. В одному варіанті здійснення використовують промотори рослин, які не викликають експресію поліпептиду у бактерій.

Прокаріоти найчастіше представлені різними штамами ЕЕ. соїї; проте також можна застосовувати інші штами мікроорганізмів. Широко використовувані регуляторні послідовності прокаріот, які визначені в даному документі та включають промотори для ініціації транскрипції, необов'язково з оператором, разом із послідовностями зв'язування рибосом, включають такі широко використовувані промотори, як бета-лактамазна (пеніциліназна) і лактозна (ас) промоторні системи (Спапод, еї аїЇ. (1977) Маїшге 198:1056), система триптофанового (ігр) промотора (Соедаеєї, еї а). (1980) Мисіеїс Асід5 Ке5.8:4057) і одержаний із фага лямбда промотор Рі і сайт зв'язування рибосом гена М (Зпітаєгаке еї аїЇ. (1981) Маїшге 292:128).

Включення маркерів відбору в ДНК-вектори, трансфіковані в Е. соїї шляхом трансфекції, також є доцільним. Приклади таких маркерів включають гени, що визначають стійкість до ампіциліну, тетрацикліну або хлорамфеніколу.

Вибирають вектор із можливістю введення у відповідну клітину-хазяїн. Бактеріальні вектори, як правило, мають плазмідне або фагове походження. Відповідні бактеріальні клітини інфікують

Зо частинками фагового вектора або трансфікують «голою» ДНК фагового вектора. Бактеріальні клітини трансфікують ДНК плазмідного вектора у випадку застосування плазмідного вектора.

Системи експресії для експресії розкритого в даному документі білка доступні при використанні

Васійи5 зр. і ЗаІтопейПа (Раїма еї а. (1983) Сепе 22:229-235); Мо5брасі еї аї. (1983) Машге 302:543-545).

У деяких варіантах здійснення розкриті у даному документі касета експресії або полінуклеотиди чоловічої фертильності зберігаються у рослини в гемізиготному стані.

Гемізиготність являє собою генетичний стан, наявний у випадку присутності лише однієї копії гена (або набору генів), за відсутності відповідного алельного еквівалента. У конкретних варіантах здійснення розкрита в даному документі касета експресії включає перший промотор, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом чоловічої фертильності, який пакетований з полінуклеотидом, що руйнує чоловічу гамету, функціонально пов'язаним із промотором, активним переважно в чоловічій тканині, і таку касету експресії вводять у рослину, що характеризується чоловічою стерильністю, у гемізиготному стані. В результаті експресії полінуклеотиду чоловічої фертильності рослина здатна успішно виробляти зрілі пилкові зерна, оскільки полінуклеотид чоловічої фертильності відновлює фертильний стан у рослини.

Враховуючи гемізиготний стан касети експресії лише деякі дочірні клітини успадкують касету експресії у процесі утворення пилкового зерна. Дочірні клітини, які успадковують касету експресії, що містить полінуклеотид чоловічої фертильності, не будуть розвиватися у зрілі пилкові зерна через переважну для чоловічої тканини експресію пакетованого кодованого генного продукту, що руйнує чоловічу гамету. Ті пилкові зерна, які не успадковують касету експресії, будуть далі розвиватися у зрілі пилкові зерна і будуть функціональними, але не будуть містити полінуклеотид чоловічої фертильності касети експресії і, отже, не будуть передавати полінуклеотид чоловічої фертильності потомству через пилок.

М. Модулювання концентрації й/або активності поліпептидів чоловічої фертильності

Представлений спосіб модулювання у рослини концентрації й/або активності розкритих у даному документі поліпептидів чоловічої фертильності. Термін «впливає» або «модулює», застосовуваний у даному документі щодо концентрації й/або активності поліпептидів чоловічої фертильності, відноситься до будь-якого підвищення або зниження концентрації й/або активності поліпептидів чоловічої фертильності порівняно з відповідним контролем. В цілому, бо концентрація й/або активність розкритого в даному документі поліпептиду чоловічої фертильності підвищується або знижується щонайменше на 1 95, 5 95, 10 95, 20 Ус, 30 95, 40 Ор,

БО Зо, 60 в, 70 Зо, 80 96 або 90 95 порівняно з контрольною рослиною, частиною рослини або клітиною. Розкрита в даному документі модуляція може відбуватися до, під час і/або після росту рослини до конкретної стадії розвитку. У конкретних варіантах здійснення розкриті в даному документі поліпептиди чоловічої фертильності модулюються у однодольних, зокрема у пшениці.

Для оцінювання модуляції концентрації й/або активності поліпептиду чоловічої фертильності можна використовувати ряд способів. Наприклад, рівень експресії поліпептиду чоловічої фертильності можна виміряти безпосередньо, наприклад, шляхом оцінювання у рослини рівня поліпептиду або РНК чоловічої фертильності (тобто за допомогою вестерн- або нозерн- блотингу), або опосередковано, наприклад, шляхом оцінювання активності щодо чоловічої фертильності поліпептида чоловічої фертильності у рослини. Способи вимірювання активності, що визначає чоловічу фертильность, описані в розділах даного документа або відомі з рівня техніки. У конкретних варіантах здійснення модуляція концентрації й/або активності поліпептиду чоловічої фертильності включає модуляцію (тобто підвищення або зниження) рівня поліпептиду чоловічої фертильності у рослини. Способи вимірювання рівня й/або активності поліпептидів чоловічої фертильності відомі з рівня техніки і розкриті в розділах даного документа. В ще одних варіантах здійснення рівень і/або активність поліпептиду чоловічої фертильності модулюється у вегетативній тканині, у репродуктивній тканині або як у вегетативній, так і в репродуктивній тканині.

В одному варіанті здійснення активність й/або концентрація поліпептиду чоловічої фертильності підвищується шляхом введення поліпептиду або відповідного полінуклеотиду чоловічої фертильності в рослину. Після цього рослину із введеною послідовністю, що визначає чоловічу фертильність, відбирають за допомогою способів, відомих фахівцям у даній галузі, таких як без обмеження саузерн-блот-аналіз, секвенування ДНК, ПЛР-аналіз або фенотиповий аналіз. У конкретних варіантах здійснення маркерні полінуклеотиди вводять із полінуклеотидом чоловічої фертильності для полегшення відбору рослини з розкритим у даному документі полінуклеотидом чоловічої фертильності або без нього. Рослина або частина рослини, змінені або модифіковані за допомогою вищенаведених варіантів здійснення, вирощують в умовах, що сприяють формуванню рослини, протягом часу, достатнього для модуляції концентрації й/або

Зо активності поліпептиду чоловічої фертильності у рослини. Умови, що сприяють формуванню рослини, добре відомі з рівня техніки.

Як обговорюється в будь-яких розділах даного документа, із рівня техніки відома більша кількість способів забезпечення рослини поліпептидом, включаючи без обмеження пряме введення поліпептиду в рослину або введення в рослину (тимчасово або постійно) полінуклеотидної конструкції, що кодує поліпептид чоловічої фертильності. Також зрозуміло, що в розкритих у даному документі способах можна використовувати полінуклеотид, який не здатний керувати експресією білка або РНК у трансформованій рослині. Рівень і/або активність поліпептиду чоловічої фертильності можна підвищити, наприклад, шляхом зміни гена, що кодує поліпептид чоловічої фертильності, або його промотора. Див., наприклад, Ктіес, патент США

Мо 5565350; 7апіпо еї аі., РСТ/О5 93/03868. Враховуючи зазначене вище, представлені мутовані рослини, які несуть мутації в генах чоловічої фертильності, де мутації модулюють експресію гена чоловічої фертильності або модулюють активність кодованого поліпептиду чоловічої фертильності.

У конкретних варіантах здійснення концентрація й/або активність поліпептиду чоловічої фертильності підвищується шляхом введення в рослину касети експресії, що містить полінуклеотид чоловічої фертильності (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 1, 2, 4, 7, 42, 43, 44 або 45 або її активний фрагмент або варіант), які розкриті в розділах даного документа. Полінуклеотид чоловічої фертильності може бути функціонально пов'язаний із промотором, який є гетерологічним щодо рослини або нативним щодо рослини. При підвищенні концентрації й/або активності поліпептиду чоловічої фертильності у рослини аналогічно підвищується чоловіча фертильність рослини. Таким чином, чоловічу фертильність рослини можна підвищувати шляхом підвищення концентрації й/або активності поліпептиду чоловічої фертильності.

Наприклад, чоловічу фертильність можна відновлювати у рослини, що характеризується чоловічою стерильністю, шляхом підвищення концентрації й/або активності поліпептиду чоловічої фертильності.

Також зрозуміло, що рівень і/або активність поліпептиду можна модулювати шляхом використання полінуклеотиду, який не здатний керувати експресією білка або РНК у трансформованій рослині. Наприклад, полінуклеотиди, розкриті в даному документі, можна застосовувати для конструювання полінуклеотидних конструкцій, які можна використовувати в бо способах зміни або мутації геномної нуклеотидної послідовності в організмі. Такі полінуклеотидні конструкції включають без обмеження вектори РНК:ДНК, мутаційні вектори

РНЕ:ДНК, репараційні вектори РНЕ:ДНК, змішані дуплексні олігонуклеотиди, самокомплементарні олігонуклеотиди РНК:ДНК їі рекомбіногенні олігонуклеотидні основи. Такі нуклеотидні конструкції й способи застосування відомі з рівня техніки. Див. патенти США

МоМо 5565350; 5731181; 5756325; 5760012; 5795972 і 5871984; усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання. Див. також УМО 98/49350, УМО 99/07865, УМО 99/25821 і

Веєїнат сеї аї. (1999) Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОБА 96:8774-8778, включені в даний документ за допомогою посилання. У деяких варіантах здійснення можна використовувати індукований вірусом сайленсинг гена, див., наприклад, Каїсійї еї аї. (2001) Ріапі 9. 25:237-245; біпезп-Китаг еї а). (2003) Меїнодз Мої. Віо!І. 236:287-294; І и єї а. (2003) Меїнодз 30:296-303; Витсп-Зтій еї аї. (2006) Ріапі РПузіої. 142:21-27. Таким чином, слід розуміти, що розкриті в даному документі способи не залежать від вбудовування повного полінуклеотиду в геном, а лише від того, що рослина або його клітина змінюються в результаті введення полінуклеотиду в клітину.

В інших варіантах здійснення рівень і/або активність поліпептиду можна модулювати за допомогою способів, які не потребують введення полінуклеотиду в рослину, як наприклад, за допомогою екзогенного нанесення а5КМА на поверхню рослини; див., наприклад,

МО 2013/025670.

В одному варіанті здійснення геном може бути змінений після введення полінуклеотиду в клітину. Наприклад, в геном рослини можна вбудувати полінуклеотид або будь-яку його частину. Зміни в геномі, розкриті в даному документі, включають у себе без обмеження додавання, делеції та заміни нуклеотидів у геномі. Незважаючи на те, що розкриті в даному документі способи не залежать від додавань, делецій і замін будь-якого конкретного числа нуклеотидів, зрозуміло, що такі додавання, делеції або заміни включають щонайменше один нуклеотид.

МІ. Визначення

Термін "алель" відноситься до однієї з двох або більше різних нуклеотидних послідовностей, які знаходяться в певному локусі.

Термін «проведення ампліфікації» у контексті ампліфікації нуклеїнової кислоти являє собою будь-який процес, за допомогою якого одержують додаткові копії вибраної нуклеїнової кислоти

Зо (або її транскрибованої форми). Типові способи ампліфікації включають способи реплікації на основі різних полімераз, у тому числі полімеразну ланцюгову реакцію (РСК), лігаза- опосередковані способи, такі як лігазна ланцюгова реакція (СЕ), і способи ампліфікації на основі РНК-полімерази (наприклад, за допомогою транскрипції). «ВАС», або штучна бактеріальна хромосома, являє собою вектор клонування, одержаний з природного Е-фактора Езспегіснпіа соїї, який сам по собі є елементом ДНК, що може існувати у вигляді кільцевої плазміди або може бути інтегрований у бактеріальну хромосому. У ВАС можна вводити крупні вставки із послідовності ДНК. «Сантиморганіда» («СМ») являє собою одиницю вимірювання частоти рекомбінації. Одна см дорівнює 195 ймовірності того, що маркер в одному генетичному локусі буде відокремлений від маркера в іншому локусі внаслідок кросинговера в одному поколінні. «Хромосома» являє собою окрему частину спіральної ДНК, що містить велику кількість генів, які виконують свою функцію та переміщуються як одне ціле під час клітинного ділення й, таким чином, можна сказати, є зчепленими. Її також можна назвати «групою зчеплення». «Генетична карта» являє собою опис взаємозв'язків генетичного зчеплення локусів на одній або декількох хромосомах (або групах зчеплення) у межах даного виду, як правило, представлена у вигляді діаграми або таблиці. Для кожної генетичної карти відстань між локусами вимірюють за тим, наскільки часто їх алелі з'являються разом у популяції (тобто за їхніми частотами рекомбінації). Алелі можна виявити із використанням ДНК- або білкових маркерів або спостережуваних фенотипів. Генетична карта є відображенням популяції для картування, типів застосовуваних маркерів та потенціалу поліморфізму кожного маркера у різних популяцій. Генетичні відстані між локусами можуть відрізнятися від однієї генетичної карти до іншої. Однак, інформація може бути співвіднесена від однієї карти до іншої з використанням загальних маркерів. Фахівець у даній галузі техніки може використовувати положення загальних маркерів для ідентифікації положень маркерів та інших локусів, що становлять інтерес, на кожній окремій генетичній карті. Порядок локусів не повинен змінюватися між картами, хоча часто присутні невеликі зміни у порядках маркерів, зумовлені, наприклад, маркерами, які виявляють поперемінні дуплікатні локуси у різних популяціях, відмінностями в статистичних підходах, застосовуваних для визначення порядку маркерів, новою мутацією або помилкою під час лабораторних досліджень. бо «Місцеположення на генетичній карті» являє собою місцеположення на генетичній карті щодо оточуючих генетичних маркерів в одній і тій же групі зчеплення, де певний маркер можна виявити в межах даного виду. «Генетичне картування» являє собою спосіб визначення взаємозв'язків зчеплення локусів за допомогою генетичних маркерів, популяцій, сегрегуючих за маркерами, і стандартних генетичних принципів частоти рекомбінації. «Генетичні маркери» являють собою нуклеїнові кислоти, які Є поліморфними в популяції, і при цьому алелі яких можна виявляти і розрізняти за допомогою одного або декількох аналітичних способів, наприклад, аналізів РІ Р, АРІ Р, ізоферментів, ЗМР, 55К, НЕКМ тощо.

Даний термін також відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, комплементарних до геномних послідовностей, таких як використовувані як зонди нуклеїнові кислоти. Маркери, що відповідають генетичним поліморфізмам серед представників популяції, можна виявляти за допомогою способів, загальноприйнятих у даній галузі. Вони включають, наприклад, способи специфічної щодо послідовності ампліфікації на основі ПЛР, виявлення поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (КЕР), виявлення ізоферментних маркерів, виявлення полінуклеотидних поліморфізмів за допомогою алель-специфічної гібридизації (АН), виявлення ампліфікованих варіабельних послідовностей генома рослини, виявлення самопідтримувальної реплікації послідовностей, виявлення простих повторів послідовності (З5К), виявлення однонуклеотидних поліморфізмів (ЗМР) або виявлення поліморфізмів довжини ампліфікованих фрагментів (АРІ Р). Також відомі загальноприйняті способи виявлення міток експресованих послідовностей (Е5Т) і маркерів 55К, одержаних із послідовностей Е5Т, і довільно ампліфікованих поліморфних ДНК (КАРОЮ). «Геном» відноситься до загальної ДНК або до повного набору генів, які несе хромосома або набір хромосом.

Термін «генотип» відноситься до генетичного складу особини (або групи особин), що визначається алелем(алелями) одного або декількох відомих локусів, які особина успадкувала від її батьків. У більш загальному сенсі, термін генотип можна застосовувати для позначення генетичного складу особини щодо всіх генів в її геномі. «Локус» являє собою положення на хромосомі, наприклад, де локалізований нуклеотид, ген, послідовність або маркер.

Зо «Маркер» являє собою засіб для встановлення положення на генетичній або фізичній карті або інших зв'язків маркерів або локусів ознак (локусів, що впливають на ознаки). Положення, яке виявляється за допомогою маркера, можна узнати шляхом виявлення поліморфних алелей та їх генетичного картування, або ж шляхом гібридизації, пошуку збігу послідовностей або ампліфікації послідовності, яка була піддана фізичному картуванню. Маркером може бути ДНК- маркер (за допомогою якого виявляють ДНК-поліморфізми), білок (за допомогою якого виявляють варіацію в кодованому поліпептиді) або фенотип, що успадковується за моногенною системою (такий як фенотип уаху). ДНК-маркер також можна розробити на основі геномної нуклеотидної послідовності або на основі експресованих нуклеотидних послідовностей (наприклад, сплайсованої РНК або кДНК). Залежно від технології ДНК-маркера, маркер буде складатися з комплементарних праймерів, що фланкують локус, і/або комплементарних зондів, які гібридизуються з поліморфними алелями в локусі. ДНК-маркер, або генетичний маркер, також можна використовувати для опису гена, послідовності ДНК або нуклеотиду в хромосомі як таких (а не компонентів, що використовуються для виявлення гена або послідовності ДНК), і це часто використовується, коли ДНК-маркер пов'язаний із певною ознакою в генетиці людини (наприклад, маркер раку молочної залози). Термін «маркерний локус» відноситься до локусу (гена, послідовності або нуклеотиду), які виявляють за допомогою маркера.

Маркери, за допомогою яких виявляють генетичні поліморфізми у представників популяції, Є загальноприйнятими у даній галузі. Маркери можна розділити за типом поліморфізму, який вони дозволяють виявити, а також за технологією маркера, використаною для виявлення поліморфізму. Типи маркерів включають без обмеження, наприклад, виявлення поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (КЕР), виявлення ізоферментних маркерів, випадково ампліфіковані поліморфні ДНК (КАРБО), поліморфізми довжини ампліфікованих фрагментів (АРІ/Р), виявлення простих повторів послідовностей (595К), виявлення ампліфікованих варіабельних послідовностей генома рослини, виявлення самопідтримувальної реплікації послідовностей або виявлення однонуклеотидних поліморфізмів (ЗМР). 5МР можна виявити, наприклад, за допомогою секвенування ДНК, способів специфічної щодо послідовності ампліфікації на основі ПЛР, виявлення полінуклеотидних поліморфізмів за допомогою алель- специфічної гібридизації (АБН), динамічної алель-специфічної гібридизації (САЗН), конкурентної алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції (КА5Раїг), молекулярних 60 маяків, гібридизації на мікрочипах, олігонуклеотид-лігазних аналізів, флеп-ендонуклеаз, 5'-

ендонуклеаз, подовження праймера, однониткового конформаційного поліморфізму (55СР) або гель-електрофорезу із температурним градієнтом (ТОСЕ). Секвенування ДНК, таке як технологія піросеквенування, має перевагу у тому, що за допомогою нього можна виявляти серії зчеплених алелей 5МР, які складають гаплотип. Гаплотипи, як правило, більш інформативні (дозволяють виявляти вищий рівень поліморфізму), ніж ЗМР. «Маркерний алель», в альтернативному випадку «алель, що виявляється за допомогою маркера», «алель у маркерному локусі», може відноситися до однієї або декількох поліморфних нуклеотидних послідовностей, виявлених у маркерному локусі в популяції. «Маркерний локус» являє собою специфічне місцеположення в хромосомі генома виду, що виявляється за допомогою специфічного маркера. Маркерний локус можна використовувати для відстеження присутності другого зчепленого локусу, наприклад, такого, який впливає на експресію фенотипової ознаки. Наприклад, маркерний локус можна використовувати для спостереження сегрегації алелей у генетично або фізично зчепленому локусі, такому як ОТГ. «Маркерний зонд» являє собою послідовність або молекулу нуклеїнової кислоти, яку можна використовувати для ідентифікації наявності алеля у маркерному локусі, наприклад, зонд- нуклеїнову кислоту, який є комплементарним до послідовності маркерного локусу, за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот. Маркерні зонди, що містять 30 або більше суміжних нуклеотидів маркерного локусу («усієї або частини» послідовності маркерного локусу), можна використовувати для гібридизації нуклеїнових кислот. Як альтернатива, у деяких аспектах маркерний зонд відноситься до зонда будь-якого типу, здатного розпізнати (тобто визначити генотип) конкретний алель, який знаходиться у маркерному локусі. Нуклеїнові кислоти є «комплементарними», коли вони специфічно «гібридизуються» або утворюють пару у розчині, наприклад, згідно з правилами спарювання основ Уотсона-Крика.

Термін «молекулярний маркер» можна використовувати для позначення генетичного маркера, як визначено вище, або кодованого ним продукту (наприклад, білка), що використовуються як контрольна точка при ідентифікації зчепленого локусу. Маркер також може походити із геномних нуклеотидних послідовностей, або із експресованих нуклеотидних послідовностей (наприклад, із сплайсованої РНК, кКДНК тощо), або із кодованого поліпептиду.

Цей термін також відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, комплементарних

Зо маркерним послідовностям, таким як нуклеїнові кислоти, що використовуються як зонди або пари праймерів, здатні до ампліфікації маркерної послідовності, або що фланкують їх. «Молекулярний маркерний зонд» являє собою послідовність або молекулу нуклеїнової кислоти, яку можна використовувати для ідентифікації наявності маркерного локусу, наприклад, зонд- нуклеїнову кислоту, який є комплементарним до послідовності маркерного локусу. Як альтернатива, у деяких аспектах маркерний зонд відноситься до зонда будь-якого типу, здатного розпізнати (тобто визначити генотип) конкретний алель, який знаходиться у маркерному локусі. Нуклеїнові кислоти є "кюмплементарними", коли вони специфічним чином гібридизуються в розчині, наприклад, згідно з правилами спарювання основ Уотсона-Крика.

Деякі описані в даному документі маркери також називають гібридизаційними маркерами, якщо вони розташовані на ділянці вставки/делеції. Це пов'язано з тим, що ділянка вставки являє собою, за визначенням, поліморфізм щодо рослини без вставки. Таким чином, маркер повинен тільки показати, присутня чи відсутня ділянка вставки/делеції. Для ідентифікації такого гібридизаційного маркера можна застосовувати будь-яку придатну технологію ідентифікації маркера, наприклад, у прикладах, представлених у даному документі, застосовують технологію

ЗМР. «Фізична карта» геному являє собою карту, на якій показаний лінійний порядок орієнтирів, що можна ідентифікувати, (у тому числі генів, маркерів тощо) на хромосомній ДНК. Однак, на відміну від генетичних карт, відстані між орієнтирами є абсолютними (наприклад, виміряними в парах основ або виділених і суміжних генетичних фрагментів, що перекриваються) та не основані на генетичній рекомбінації (яка може відрізнятися в різних популяціях). «Рослина» може бути цілою рослиною, будь-якою її частиною або клітинною або тканинною культурою, одержаною із рослини. Таким чином, термін «рослина» може стосуватися будь-чого з наступного: цілі рослини, рослинні компоненти або органи (наприклад, листя, стебла, корені тощо), рослинні тканини, насіння, рослинні клітини й/або потомство, одержані з них. Рослинна клітина є клітиною рослини, взятою із рослини або одержаною шляхом культивування із клітини, взятої з рослини. «Поліморфізм» являє собою варіацію в ДНК між 2 або більше особинами в межах популяції.

Поліморфізм у популяції переважно має частоту щонайменше 195. Придатний поліморфізм може включати однонуклеотидний поліморфізм (ЗМР), простий повтор послідовності (55К) або бо поліморфізм по типу вставки/делеції що також називається в даному документі

«вставка/делеція». «Еталонна послідовність» або «консенсусна послідовність» являє собою визначену послідовність, що використовується як основа для порівняння послідовностей.

Таблиця 1

Стислий опис ЗЕО ІЮ МО 902 6 |ПромоторнапослідовністьМеіпшениції /-/://::::1111 8 |Варіантнапромоторнапослідовність Мі пшениційдГ /-/://:: С: /:/:С О 9 |Варіантнагеномнапослідовність Меї пшениційд /-/:/1 мзпр Ех с18318 27140346

Форма однини застосовується в даному документі для позначення одного або декількох (тобто щонайменше одного) граматичних об'єктів предмета. Наприклад, «елемент» означає один елемент або декілька елементів.

Усі публікації та патентні заявки, зазначені в даному описі, спрямовані на рівень компетентності фахівців у даній галузі техніки, якої стосується розкриття, і всі такі публікації та патентні заявки включені в даний документ за допомогою посилання тією ж мірою, як якщо б кожна окрема публікація або заявка на патент були конкретно й окремо зазначені як включені за допомогою посилання.

Хоча для ясності розуміння вищенаведений винахід був досить детально описаний шляхом ілюстрації та прикладу, очевидно, що на практиці можна здійснювати певні зміни та модифікації у межах обсягу доданої формули винаходу.

ПРИКЛАДИ

Наступні приклади передбачені для ілюстрації а не для обмеження доданої формули винаходу. Зрозуміло, що приклади й варіанти здійснення, описані в даному документі, призначені лише для ілюстративних цілей, і що фахівці в даній галузі техніки визначать різні реагенти або параметри, які можуть бути змінені без відступу від суті даного винаходу або обсягу доданої формули винаходу.

Приклад 1. Генетичне картування М51

Даний приклад демонструє, що за допомогою рекомбінантних популяцій для картування пшениці дикого типу та пшениці із чоловічою стерильністю каузативний локус для фенотипу, що визначає чоловічу стерильність, у т51 пшениці можна піддавати картуванню до ділянки 1 СМ на короткому плечі хромосоми 4 геному В.

Алоплазматичну пшеницю із чоловічою стерильністю (т5тв5), різновиду СпПгі5, що несе мутантний ген Е52 (який також називається т514), схрещували з рослиною сорту Сіадіи5 для створення популяції для картування Ег. Послідовності в ділянці М51 на хромосомі 485 ідентифікували або на основі синтенії з хромосомою 4АЇ. пшениці (Негпапае? еї аї. 2011. Ріапі доитаї! 69(3):37 7-386), хромосомою 4Н5 ячменю (Мауєг еї аї. 2011. Ріапі Сеї! 23(4):1249-1263), хромосомою 1 Вгаспуродішт і хромосомою 3 рису, або за допомогою Е5Т пшениці, локалізованих на делеційних бінах (ЗоїтеїЇ5 еї аіІ., 2003 Сепоте Незеагсі 13:1818-1827; Га Воїа а Боїтеїї5, 2004 Рипсі Іпівдг Сепотісв 4: 34-46). Відповідні контиги послідовностей пшениці з еталонних синтетичних послідовностей (наприклад, ЗМР-маркер ячменю 11 21056, для якого

ЗЕО ІЮ МО:10 являє собою еталонну послідовність) або Е5Т, локалізовані на делеційних бінах (наприклад, ВЕ292015, для якої 5БО ІЮ МО:14 являє собою еталонну послідовність), ідентифікували за допомогою аналізу ВІ А5Т для набору аналітичних послідовностей ІМУСЗ5С

Зо (Іпегпайопа! УУпеаї Сепоте Зедиепсіпд Сопзогпішт), одержаних із хромосоми 485 (Мауєеєг, 2014

Зсіепсе 345 (6194): 1251788). Контиги ІМС були використані з метою розробки маркерів для методу аналізу кривих плавлення із високою роздільною здатністю (НЕМ) або розробки маркерів для аналізу поліморфізмів на основі сайтів вставки (І5ВР-НЕМ). Праймери ІЗВР-НАМ конструювали за допомогою дослідницького інструмента ІЗВР Ріпаєг (Райх еї а!., 2010 Ріапі

Віотесппоіоду Чоштпаї 8:196-210).

Ампліфікацію за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) здійснювали із застосуванням ДНК наступних рослин: батьківських рослин із популяції для картування, нулісомних ліній 4В8 і рослин Ргоби5 і Согпегбіопе з індукованими опроміненням делеціями.

Оскільки результати дослідження із застосуванням генетичного і фізичного картування свідчать про те, що Согпеге(опе і Ргобиз, ймовірно, відрізняються розміром кінцевих делецій та ступенем відновлення теломер, їх порівняльний аналіз використовували для ідентифікації фланкуючих маркерів М51 (Вагіом/ 5 Огізсої! (1981) Сепеїйсз. 98(4):791-799; 7попд-ап є Оагуєу (1999) Асіа

Адгісийигає Вогеаїї-Оссідепіа|йв біпіса. спКгІЗ55М:1004-1389.0.1999-04-006). Праймери, що фланкують М51, експериментально визначали за відсутністю ПЛР-продуктів ДНК, нулісомної за хромосомою 48 і гомозиготної за індукованою опроміненням делеції мутанта Согпеге(опе, але які присутні у гомозиготного за індукованою опроміненням делецією мутанта Ргори5. Для картування застосовували НКМ-маркери, які відповідають перерахованим вище критеріям.

Фенотипування за генетичною чоловічою стерильністю здійснювали шляхом надійного покриття перед цвітінням щонайменше трьох колосів на рослину за допомогою герметичних пакетів з білого паперу, а потім виконували кількісне оцінювання фертильності шляхом підрахунку числа квіток на колос і числа насінин на колос і шляхом вираження оцінки у вигляді числа утворених насінин на квітку. 509 особин Е2 спочатку піддавали скринінгу за допомогою маркерів, визначених як такі, що фланкують ділянку Ме51 на хромосомі 485 та є поліморфними для Спгі5 і Сіадіи5. Особин Е2 фенотипово оцінювали щодо генетичної чоловічої стерильності за допомогою описаної вище процедури. Був ідентифікований 21 рекомбінант і було виявлено, що локус М51 розташований між НЕМ-маркерами 21056 (5ЕО ІЮ МО: 11 є еталонною послідовністю) та ВЕ292015 (5ЕО ІЮ

МО:15 є еталонною послідовністю). НЕМ-маркери 21056 і ВЕ292015 були сконструйовані для контигів послідовностей ІММУО5С, одержаних з 485, відповідно Іс|485 4947956 і Іс|4в5 4925422 бо (Мауег, 2014 5сієпсе 345 (6194): 1251788). Було визначено, що ця ділянка охоплює генетичну відстань 14 СМ на консенсусній карті розміром 90 т.о.

Потім були розроблені маркери у ділянці між маркерами 21056 і ВЕ292015 та були протестовані щодо їх асоціації з фенотипом, у якому проявляється генетична чоловіча стерильність. Карту на основі однонуклеотидних поліморфізмів (ЗМР) пшениці консенсусної послідовності розміром 9 т.о. (Самападі еї а. 2013 РМАБ5 110:8057-8062) застосовували для ідентифікації послідовностей, що містять ЗМР, і відповідних контигів М/С, які генетично були розташовані у ділянці М51 на короткому плечі хромосоми 485 у пшениці (Мауег 2014. Зсіепсе 345(6194):1251788). Або послідовності, що містять ЗМР, або контиги ІММУС5С, одержані з хромосоми 4В5, були використані як мішені для розробки НКМ-маркерів або розробки маркера поліморфізму (ІЗВР-НЕМ) на основі сайтів вставки. Сумарно було піддано скринінгу 3000 особин Рг і було ідентифіковано 54 рекомбінанти, що звужувало ділянку, яка містить М51, до ділянки, що обмежується маркерами мхпр Ех с18318 27140346 (5ЕО ІО МО:18 є еталонною послідовністю) і пр Ки с7153 12360198 (5ЕО ІЮ МО:21 є еталонною послідовністю). Маркери мізпр Ех с18318 27140346 і м5пр Ки с7153 12360198 відповідають контигам послідовностей

М/С, одержаним із 485, відповідно Іс|4в5 4920499 і ІсцЦ4в5 4954867 (Мауег, 2014 бсіепсе 345 (6194): 1251788). Ця ділянка охоплює генетичний інтервал 0,5 СМ, виходячи з карти на основі БМР пшениці консенсусної послідовності величиною 9 т.о.

Приклад 2. Ідентифікація ВАС у 485 для секвенування М51

Конструювали вісімнадцять зондів у межах ділянки 0,5 СМ, що обмежується маркерами мвпр Ех с1і8318 27140346 (5ЕО І МО:18) і мхпр Ки с7/153 12360198 (ЗЕО ІЮ МО:21), за допомогою синтенії з Вгаспуродішт їі рисом. Зонди конструювали як неповторювані на основі аналізу ВГАБТ цільових послідовностей. Потім зонди ампліфікували за допомогою ПЛР і розділяли за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, при цьому фрагменти необхідного розміру елюювали з гелю за допомогою набору для екстракції з гелю Оіадиціск Се! Ехігасіоп (Оіадеп, Джермантаун, Меріленд, США). ПЛР-фрагменти об'єднували до еквімолярної концентрації, потім мітили радіоактивною міткою 32Р-адАТР за допомогою набору МЕВІОоЇї (Мем/

Епоіапа Віоіар5), із застосуванням протоколу виробника. Мічений зонд очищали на колонці

Зерпадех (550 (ЗЕ Неайсаге) і денатурували за 100 С протягом 1Охв. Для гібридизації застосовували двадцять вісім фільтрів із високою щільністю для фільтрації колоній із клонами

Зо ВАС, розміщених на предметній сітці з нейлонових мембран Нуропіа Ма (ЗЕ Неайсаге,

Піскатауей, Нью-Джерсі, США). Це відобразило охоплення 5,1-геномних еквівалентів із різновиду Гапдаоп твердої пшениці (Сепсі еї аі. 2003. Тпеог Аррі Сепеї 107(5):931-9). Для попередньої гібридизації здійснювали інкубацію протягом ночі фільтрів з колоніями в розчині для гібридизації (2х ЗОРЕ, 0,5 95 505, 5х розчин Денхардта (Затбргоок 5 Виззеї (2001) Моїесшаг

Сіопіпа: А І абогаютгу Мапиаї, Сода бргіпу Нагтбог І арогаїюгу Ргез5, Мем МоїКк, МУ, О5А), 40 мкг/мл

ДНК молоки лосося) у ротаційних скляних пробірках за 65 "С. Мічений зонд змішували з 5 мл розчину для гібридизації та фільтри з колоніями інкубували за 65 "С протягом ночі. Для видалення зонда, що не зв'язався, фільтри промивали двічі у розчині для промивання, що містить 2х 5ЗРЕ і 0,595 505 та споліскували за допомогою їх 55С. Промиті фільтри експонували на рентгеноплівку протягом одного-трьох днів, виходячи з інтенсивності сигналу, для ідентифікації позитивних клонів. Зіткома (2011) Чоигпа! ої Віотедісіпе апа Віоїесппо!іоду. пор//ах.аоі.огд/10.1155/2011/302543. За допомогою таких зондів ідентифікували загальнодоступні ВАС, що включають ділянку М51.

ВАС, які давали позитивний сигнал, виділяли з планшетів. Рестрикційне картування, ПЛР- експерименти із праймерами, що відповідають раніше використаним маркерам, Фі послідовностями, одержаними з кінців кожної ВАС, використовували для визначення порядку

ВАС, які охоплюють ділянку, що становить інтерес. Для секвенування відбирали три ВАС з бібліотеки І апддоп, які охоплювали ділянку М51, що становить 251 т.о. На додаток до цього, для охоплення такої важливої ділянки секвенували запатентовану ВАС. Ці ВАС секвенували за допомогою стандартних методик шотган-секвенування, а послідовності збирали за допомогою пакета програмного забезпечення Рігед/Рпигар/Сопзей (Еуліпд єї аІ. (1998) Сепоте Везеагси, 8:175-185). Після збірки послідовності, які, як вважається, знаходяться в ділянці, найближчій до локусу на основі даних картування, були анотовані, маючи на увазі, що можливі ділянки, що кодують ген, і ділянки, що представляють повторні елементи, були виведені. Кодувальні (генні) ділянки гена шукали за допомогою пакета програмного забезпечення їбепезН (Зойбегу, Маунт

Кіско, Нью-Йорк, США).

Приклад 3. Ідентифікація кандидатного гена М51

Десять потенційних кодувальних ділянок виявляли у послідовності довжиною 251 т.о. шляхом картування кКДНК, одержаної із тканин кореня, листа і пиляка пшениці. У таблиці 2 бо наведено фізичне положення 10 ймовірно кодувальних послідовностей плюс передбачувана функція їх пептидів.

Таблиця 2 послідовностей Вгаспуродіит 6 |Вгадїмої4760.1 | 30649 | 32207 )|антисенсова |Убіквітин-білковаліаза. -:// 8 |Вгаййсоізо3о | 181034 | 181291 |сенсова. | ІТРІЄЯЄ сс 9 |Вгаді2гд05445.1 | 210365 | 218154 |антисенсова )|605рибосомальнийбілок. /-:"

Серед 10 відкритих рамок зчитування ідентифікували три, які кодували поліпептиди із подібністю з неспецифічними білками перенесення ліпідів (п5іІ ТР) (Едвзіат еї аї., 2014

Рпузіоїодіа Ріапіагит адоїі:10.1111/ррі.12156). При дослідженні транскриптів з пиляків чоловічих стерильних гомозиготних рослин Согпегв5іопе т51 не спостерігали кКДНК, яка відповідала 5ЕО ІЮ

МО:4. Відсутність транскриптів від 5ЕО ОО МО: 4 свідчить про сильну кореляцію фенотипу стерильності т51 з даною кДНК. Ця конкретна послідовність по прогнозам кодує глікозилфосфатидилінозитол (СРІ)-заякорений поліпептид п5Ї/ТР (ГТРО) (5БО ІЮО МО:5 є амінокислотною послідовністю кодованого білка) і був названий Та ТРОЇ, також відомий як

М51.

Аналіз поліпептиду М51 (5ЕБО ІЮ МО: 5) показував сигнальний пептид, розташований у положеннях 1-23; домен ТР у положеннях 24-108 і якірний домен ОРІ у положеннях 195-220.

Структурне моделювання за допомогою первинної поліпептидної послідовності показувало, що гідрофобна кишеня, сформована в домені ТР за допомогою дисульфідних містків (Су5--Сув), ймовірно, зв'язує жирні кислоти, у той час як якірний домен ОРІ по прогнозам закріплює

ТагтТРОЇ1 на поверхні клітини.

Кодовану первинну поліпептидну послідовність, яка на С-кінці безпосередньо з'єднується з сигнальним пептидом через 12 амінокислот після домену ТР (тобто від положення 24 до положення 120), застосовували у пошуку за допомогою алгоритму Ргоїеіп Ноптоіоду/ападу

Весодпйоп Епдіпе М 2.0 (РНуге?; Кеїєу єї аї. (2015) Маїште Ргоїосоіїв 10: 845-858) придатної матриці кристалічної структури. За допомогою цього пошуку ідентифікували білок аїг1 з 29 95 ідентичністю при 96,2 95 достовірності (рар: с2гКпА). Частина із 48 залишків використаної поліпептидної послідовності М51 моделювали із 96,2 95 достовірністю щодо матриці сС2/КпА.

Гідрофобну кишеню, сформовану в домені ТР за допомогою дисульфідних містків, виявляли за допомогою комбінації програми їросКеї2 (ЗсПтіаіКе еї аї., (2011) Віоіпіоптаїйісв5 27(23):3276-3285) і ЗО! їідапазйце (ЗО ідапазне: прогнозування ліганд-зв'язувальних сайтів за допомогою подібних структур. (М/аз5 еї аїЇ. (2010) Мисівїс Асід5 Ке5. 38:М/469-73). Структурні

Зо моделі для М51, т511 і тей візуалізували та анотували із застосуванням стандартної програми перегляду раю з поверхневою гідрофобністю та візуалізацією, розрахованою за допомогою методу Соіопу. Структури домену ТР у мутантів т51йа, т51е, т511 ї т51йп аналізували за допомогою тих же методик, що і для визначення гідрофобної кишені, та відомостей про важливість дисульфідних містків у третинній конформації. (Див., наприклад, ЧУо52-Евіапуо! еї аї. (2004) Ріапі Рпузіоіоду апа Віоспетівігу 42:355-365.

Якірний домен ОРІ і прогнозування закріплення на поверхні клітини встановлювали із застосуванням пристрою для прогнозування ВІС-РІ Ріапі Ргедісіог. (Еізеппабег" єї а!. (2003) Ріапі

Рпузіоіоду 133(4):1691-701)

Приклад 4. Виділення та послідовності мутантних алелей Іт51 пшениці

Кодувальні послідовності ТагтРОї повної довжини із хромосоми 485 піддавали ПЛР- ампліфікації із застосуванням ферменту з високою точністю зчитування з геномних ДНК, виділених із гомозиготних індукованих етилметансульфонатом (ЕМ5) мутантів тей ,т51е і те17 із чоловічою стерильністю (Кіїпамогй еї аі. 2002. Стор 5бсі. 42:1447-1450), а також чоловічих фертильних (М51) генотипів дикого типу (сорт Спгіх). Обидва ланцюги ПЛР-ампліконів секвенували за допомогою стандартних методик секвенування за Сенгером для С -збагачених продуктів. Порівняння хроматограм т51 із М51, одержаних у результаті секвенування за

Сенгером, виявило 5МР в кожному із мутантних алелей т51, у тому числі т51й, одержаного із

Зо

ТІССІМО, та послідовності дикого типу (фігура 2, фігура 3). За допомогою аналізу послідовностей прогнозували, що функція білка порушена у всіх таких мутантів. тет1а характеризується наявністю ЗМР у положенні 1856 (51856А) порівняно з геномною послідовністю ДНК М51 дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:7). Згідно з прогнозом цей ЗМР усуває першу точку сплайсингу між екзоном та інтроном, що в результаті приводить до прочитування до передчасного стоп-кодону в першому інтроні і, таким чином, усунення консервативного С- кінцевого домену ОРІ, що заякорює, у кодованому поліпептиді. тете характеризується наявністю ЗМР у положенні 2962 і делецією 1 п.о. в положенні 2963 (62962А, С2963аеї) порівняно з геномною послідовністю ДНК М51 дикого типу (ЗЕО ІО МО:7).

Згідно з прогнозом делеція 1 п.о. у т51е викликає зсув рамки зчитування та усунення консервативного С-кінцевого домену ОРІ, що заякорює, у кодованому поліпептиді. тое17 характеризується наявністю 5МР у положенні 1682 (51682А) порівняно з геномною послідовністю ДНК М51 дикого типу (5ЕО ІО МО:7). Згідно з прогнозом даний 5МР перетворює консервативний цистеїн на тирозин (С52У) у кодованому поліпептиді М51 дикого типу (ЗЕО ІЮ

МО:5). Згідно з прогнозом така амінокислотна заміна порушує третинну конформацію зрілого білка за участі дисульфідного містка. т51п характеризується наявністю ЗМР у положенні 1705 ((31705А) порівняно з геномною послідовністю ДНК М51 дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 7). Згідно з прогнозом даний 5МР перетворює аспарагінову кислоту на аспарагін у кодованому поліпептиді М51 дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 5).

Згідно з прогнозом ця амінокислотна заміна порушує функцію або активність кодованого поліпептиду М51.

ПРИКЛАД 5. Цитологічний аналіз і аналіз метаболітів у пилку М51 і т51

Цитологічне дослідження пиляків те! виявило порушення орбікул, що локалізуються на поверхні тапетальних клітин, і деформований пилок із дефектною структурою та малюнком екзини. Визначення профілю метаболітів фертильних пиляків порівняно зі стерильними виявило накопичення С16-С22-жирних кислот, що узгоджується з роллю М51 у біосинтезі й/або транспортуванні спорополеніну в мікроспору, що розвивається.

Цитологічне дослідження

Стерильні (т514) і фертильні (М51) зрілі пиляки з етапів від пізнього мейозу до

Зо двоклітинного пилку фіксували або для просвічувальної електронної мікроскопії (ТЕМ), або для сканувальної електронної мікроскопії (ЗЕМ). Зразки для ТЕМ просочували З 95 глутаральдегідом у фосфатно-сольовому буферному розчині (РВ5), рН 7,4, протягом 16 год за 4 "С, у той час як зразки для 5ЕМ просочували параформальдегідом, 495, глутаральдегідом, 1,25 95, і сахарозою, 495, у фосфатно-сольовому буферному розчині (РВ5), рН 7,4, протягом 16 год за 4 "С. Зразки для ТЕМ повільно просочували смолою ІК УуУпйе і завантажували в желатинові капсули. Зразки для 5ЕМ двічі промивали РВ5, рН 7,4, протягом 5 хв., потім дегідратували за допомогою серії ступінчастих розчинів етанолу (30, 50, 70, 85, 90 ї 95 95), кожний по 60 хвилин. Потім зразки для ЗЕМ просочували З рази, кожний по 60 хв., у 10095 етанолі. Ультратонкі зрізи товщиною 70 нм готовили на ультрамікротомі (ЕМ ИСб, І еїса,

Німеччина), встановлювали на мідну сітку та фарбували 495 уранілацетатом у воді із наступним фарбуванням лимонокислим свинцем згідно з Во770Їа 5: КиззеїЇ 1999, (5ресітеп в5іаіпіпд апа сопігабії теШой5 То іШапотівбвіоп еєїЇестоп о тістозсору. ЕІесіоп тістозсору: Рііпсіріеєє5 апа тТесппіднев Тог Біоіодібі5. Те допез апа Вапіей 5етгіез іп Віоіоду, рр. 120-147. допез апа Вапіей

Рибіїєпеге, Во5іоп, МА). Вивчали ультратонкі зрізи, а зображення фіксували за допомогою ТЕМ (Рпйр5 СМ100, Центр мікроскопії університету Аделаїди) при напрузі 80 кВ, що прискорюється.

Розрізали зразки для 5ЕМ, потім сушили за критичної температури та покривали платиною методом напилення (пристрій для висушування у критичній точці ВаІГес СРООЗО). Вивчення за допомогою 5ЕМ і фіксацію зображень здійснювали при напрузі 10 кВ, що прискорюється (РПїїр5

ХІ 20 БЕМ м ЕВАХ ЕО5, Центр мікроскопії університету Аделаїди).

Заякорені за допомогою глікозилфосфатидилінозитолу (ОРІ) білки, що переносять ліпіди, як правило, необхідні для накопичення кутикулярного воску або його експорту на поверхні стовбура й стручка. (Вогпег еї аї. (2003) Ріапі Рпузіоіоду 132:568-577; Кіт еї аї. (2012) Ріапі апа

Сеї! Рпузіоїоду 53:1391-1403). Епікутикулярний віск містить попередники ліпідів, властиві для спорополеніну, основної складової частини екзини пилку, який виробляється у спорофітних тканинах пиляків і транспортується у мікроспору, що розвивається, у структурах, що називаються орбікулами. Аналіз стерильних пиляків т514 за допомогою як ТЕМ, так і ЗЕМ виявив руйнування орбікул, які локалізуються на поверхні тапетальних клітин, і деформований пилок з дефектною структурою і малюнком екзини порівняно з фертильними пиляками М51.

Визначення профілю метаболітів бо Пиляки виділяли із 2 стерильних (т51алтв1а) і 1 фертильної (М51/М51) рослини на З стадіях розвитку (від раннього мейозу до пізньої одноядерної стадії) з З біологічними повторностями та піддавали швидкому заморожуванню на сухому льоді За допомогою методу газової хроматографії-мас-спектрометрії (з0-М5) аналізували композицію та кількість екстрагованих хлороформом зразків воску. (Чипод еї а. (2006) Ріапі Сеї! 18:3015-3032). Жирні кислоти дериватизували шляхом екстракційної обробки реагентом для переетерифікації Мер-Ргер І! і порівнювали із введеним у вигляді зразка стандартом жирних кислот.

Аналіз стерильних пиляків т514 щодо фертильних пиляків М51 на трьох стадіях розвитку виявив більше ніж 2-кратне підвищення рівня пальмітинової (С16:0), пальмітолеїнової (С16:1), олеїнової (С18:1п9с), елаїдинової (С18:1п9О), лінолевої (С18:2пбс), гамма-лінолевої (С18:Зпб), альфа-лінолевої (С18:3пб), арахідинової (С20:0), паулінової (С20:1), ейкозадієнової (С20:2) і бегенової (С22:0) кислот. Підвищення рівня довголанцюгових (С16-С22) жирних кислот в мутантних пиляках було типовим для порушення біосинтезу спорополеніну й/або його транспортування у мікроспору, що розвивається.

ПРИКЛАД 6. Маркери в ділянці М51 та їх застосування при виявленні та відборі рослин пшениці, що містять мутації М51

Було виявлено, що ген М51 тісно зчеплений із маркерами ЕТ0О487, ЕТО488, ЕТО489, ЕТО490,

ЕТО491, ЕТО495, 007-0033.1 і 007-0046.1, що локалізуються в ділянці Ме51. Див. БЕО ІЮ МО: 24- 29, 32 і 33. Оскільки ознака чоловічої стерильності контролюється одним рецесивним ядерним геном, усі схрещування між мутантами із чоловічою стерильністю та запильниками дикого типу будуть давати в результаті 100 95 нащадків із чоловічою стерильністю Е: (М51т51), у той час як нащадки Ег і ВСі будуть сегрегувати за даною ознакою. Бажано було визначити генотипи нащадків, і, у зв'язку з цим, рослини можна було оцінити на наявність власне мутації або, як альтернатива, щодо одного або декількох алелей, які зчеплені та асоційовані з мутацією в гені

М51 (тобто знаходяться у нерівноважному зчепленні з мутацією). Наприклад, можна виявляти один або декілька алелей у маркері ЕТ0О487, ЕТО488, ЕТО489, ЕТО490, ЕТО491, ЕТО495, 007- 0033.1 або 007-0046.1 для визначення, чи має рослина мутацію те! у гомозиготному або гетерозиготному стані. Що стосується т51йд, твіє або тв, мутації виникають у сорту СпНгів; тому алелі у СпПгі5, що локалізуються поблизу гена М51, знаходяться у нерівноважному зчепленні із казуальною мутацією та, внаслідок цього, можуть бути оцінені щодо наявності або відсутності для визначення того, чи присутній т51й, т5іє або твії. Шляхом відбору за допомогою маркера селекціонер зможе відстежити наявність ознаки чоловічої стерильності за допомогою контрольованих схрещувань для одержання, за необхідності, нової рослини, що містить мутацію те1!, або в гомозиготному, або в гетерозиготному стані, таким чином зберігаючи мутації те51. Селекціонер також може використовувати маркери у ділянці Ме для одержання мутантних насінин із чоловічою стерильністю батьків, які можна використовувати як жіночі рослини, тобто рослини, для яких необхідне запилення донорним запильником, для одержання насіння, що становить комерційний інтерес, або для одержання гібридів Е., які містять мутацію т51 у гетерозиготному стані.

Приклад 7. Трансформація пшениці

Протоколи трансформації пшениці доступні для фахівця у даній галузі техніки. Див., наприклад, Не, еї аї., (2010) У. Ехр. Воїапу 61(6):1567-1581; Ми, єї а!., (2008) Ткапздепіс Нев. 17:425-436; Менга, евї аї., (1994) Ріапі 9. 5(2):285-297; Вазсо-Сашцйпі, еї аї!., (2001) У. Ехр. Воїапу 52(357):865-874; Вагавд, еї аї., (2011) Айісап У. Віоїєсп. 10(5):740-750; Татав-Муйнаї, еї аї., (2012) Ріапі Се Сийигте РгоїосоЇїє, МеїШойв іп Моїесшіаг Віооду 877:357-384; і патентну публікацію США Мо 2014/0173781.

Приклад 8. Відновлення чоловічої фертильності у гомозиготних за рецесивним Іт51 рослин пшениці за допомогою експресії трансформованої копії гена або ортолога М51.

У попередньому прикладі відмінності нуклеотидних послідовностей виявляли у ділянках

ДНК, які відповідали кандидатному гену М51 із т514, т51е і т51ї7 рослин. У даному прикладі описані різні стратегії для відновлення чоловічої фертильності у гомозиготних за рецесивним тета рослин. У рослин пшениці із чоловічою стерильністю, що містять мутацію те, відновлювали чоловічу фертильність при трансформації ДНК-вектором, що містить функціональну копію гена М51. Це демонструє, що кандидатний ген М51 ефективний при комплементуванні мутацій те1, які обумовлюють фенотип із чоловічою стерильністю.

Незважаючи на те, що пшениця є алогексаплоїдом, що містить три споріднених геноми (АВО) із подібним генним вмістом, під час мейозу вона поводиться як диплоїд. Часто споріднені геноми пшениці містять гомеологічні гени із подібною генною структурою та функцією, які необхідні для того, щоб потрійні мутанти в результаті давали фенотип із втратою функції. Однак фенотип із чоловічою стерильністю у пшениці, що спостерігається у мутанта т514, сегрегує у бо співвідношенні 3:11 фертильних і стерильних рослин. Це свідчить про те, що у даного мутанта один рецесивний локус у гомозиготному стані індукує фенотип чоловічої стерильності і що даний локус сегрегує згідно з законами менделівського успадкування. Відсутність функціональної надлишковості з іншими гомеологами Ме51 свідчить про те, що відбулася дивергенція функції копій даного гена у геномах А і 0.

Розробка маркерів та оцінювання з їх застосуванням показали, що гетерозиготний локус т51 сегрегує у співвідношенні 1:2:1 гомозиготного дикого типу до гетерозиготного мутанта і до гомозиготного мутанта. Кореляція фенотипових і сгенотипових даних підтверджувала менделівське успадкування мутації тв1.

Менделівська природа мутації те! буде полегшувати інтрогресію ознаки чоловічої стерильності у різні генетичні оточення.

Одна стратегія відновлення чоловічої фертильності у рослин Іп51 полягала в експресії гена або генів, які можуть подолати втрату функції або активності в результаті мутації або делеції

М51. Для відновлення генної активності у трансформованих рослин пшениці використовували ген із пшениці, або із іншого виду рослини, з ідентичною або подібною функцією з Ме51.

Наприклад, як показано на фігурі 1, ген із ячменю кодує білок із високою подібністю амінокислотної послідовності з продуктом гена М51 пшениці, з приблизно 79 95 ідентичності послідовностей. Ген ячменю, представлений під 5ЕО ІЮ МО: 1, вводили у мутантні за Іт51 рослини пшениці для відновлення чоловічої фертильності. Даний ген ячменю можна експресувати із застосуванням його нативного промотора (див. 5ЕО ІО МО: 1, нуклеотиди 1-902,

ЗЕО І МО:41) або промотора, який не є нативним, такого як переважний для тканини, конститутивний або умовний промотор, для відновлення чоловічої фертильності. Інші однодольні або дводольні рослини також можуть служити як джерела комплементуючого гена і промотора для відновлення чоловічої фертильності у мутантних за т51 рослин пшениці із чоловічою стерильністю. Ген і промотор можуть походити з одного джерела або із комбінації видів-джерел, наприклад, із одного або декількох із пшениці, ячменю, риса і Вгаспуроаічт.

Згідно з іншою стратегією, ген М51 пшениці дикого типу або його варіант (див., наприклад,

ЗЕОІО МО: 1, 2, 4, 7, 9, 42, 43, 44 або 45) використовують для відновлення чоловічої фертильності у гомозиготних за рецесивним Іп51 рослин. Варіант гена М51 містить зміну одного або декількох сайтів рестрикції ДНК для забезпечення сумісності з ДНК-векторами, що

Зо використовуються для трансформації рослин. Див., наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 9, яка містить нуклеотидні зміни, введені у положення 2, 3, 1209 і 1301 для полегшення побудови вектора. Ген

М51 вводили у рослини т51 за допомогою відомих способів трансформації рослин з одержанням рослин, що містять стабільно інтегровані версії гена М51 для комплементації фертильності. Як альтернатива використанню нативного промотора М51 (5ЕО ІЮ МО: 6) використовували варіант промотора (наприклад, див. БЗЕО ІЮ МО: 8, який містить нуклеотидні зміни, внесені для полегшення побудови вектора) або інший рослинний, такий як під ЗЕО ІЮ

МО:41, або конститутивний умовний або переважний для тканини промотор не рослинного походження для експресії версії дикого типу або варіантної версії гена М51 або кДНК з метою відновлення чоловічої фертильності у гомозиготних за рецесивним Іт51 рослин пшениці. Ген і промотор можуть походити із одного виду-джерела або із комбінації видів- джерел. У деяких прикладах промотор являє собою промотор М51 із пшениці, рису, ячменю або брахіподії.

Геномна послідовність М51, з З3'-кінця щодо стоп-кодону трансляції, містить функціональну термінаторну ділянку; див. «ЕО ІЮО МО: 7 у положеннях 3384-4335 (5ЕБЕО ІЮ МО:46). Див. також

ОТАК під БЕО ІО МО: 1 у положеннях 2838-3838 (5ЕО 10 МО:А7).

Конструкції та трансформація

Для відновлення фертильності у гомозиготних мутантів т51талт51а ген М51 пшениці під контролем нативного промотора і термінатора М51 пшениці з'єднували з геном О5Кед2, що знаходиться під контролем промотора І ТР2 ячменю (див., наприклад, патент США Мо 5525716) і який також несе послідовність термінатора РІМИ (Там51-О5КЕЮБ). Цю конструкцію трансформували безпосередньо в зародки пшениці, зібрані від гетерозиготних рослин

М51/т51а за допомогою Адгобасіегійшт-опосередкованих способів трансформації, як зазначено в інших розділах даного документа. Були одержані декілька незалежних трансгенних об'єктів зі вставкою Т-ДНК, що містять Там51-О5НЕ0О, для оцінювання конструкцій у т51а-рослин.

Утворення й аналіз рослин покоління ТО

Рослини ТО пшениці, що містять одну копію касети Там51-О5КЕО, ідентифікували та генотипували як гомозиготні або гетерозиготні за мутацією т5149. Одержане в результаті самозапилення насіння від таких окремих рослин рахували як якісний показник чоловічої фертильності. Як показано в таблиці 4, не спостерігали утворення насіння у гомозиготних рослин т51а/т514 без касети Там51-О5КЕО. І навпаки, спостерігали утворення насіння, якщо бо гомозиготні рослини т51алтз14 містили трансформовану копію касети Там51-О5КЕО. Ці результати демонструють, що трансформована копія Там51 була функціональною та була здатна відновлювати фертильність у рослин із чоловічою стерильністю т51ал/т514.

Таблиця З

Утворення насіння у рослин ТО пшениці, що містять Т-ДНК-вставку, комплементарну Там51.

Без'ДНК 77717111 твід/вНаЇГ// | 77777771717017171717171717171111 171111 Стерильна.7//З

Без ДНК 77701711 твій/теввлТаЇГ// | 77771710 | Стерильна7//З

Аналіз рослин Т1; молекулярний і фенотиповий

Успадковування комплементації шляхом вставки Т-ДНК Там51 було показано за допомогою аналізу рослин Т1, одержаних від двох окремих рослин ТО з незалежними вставками Т-ДНК (трансгенний об'єкт 1 і трансгенний об'єкт 7). Один набір потомства Т1 був одержаний із рослин

ТО, гомозиготних за мутацією те1й (те1Та/т514), з касетою Там51-О5РЕО (трансгенний об'єкт 1). Другий набір потомства Т1 був одержаний із рослин ТО, гетерозиготних за мутацією т51а (М51/т514), з касетою Там51-0О5КЕЮО (трансгенний об'єкт 7). Рослини з обох наборів генотипували щодо т514 і вставки Т-ДНК. В обох наборах потомства Т1 усі рослини з генотипом т51алт51 і вставкою Т-ДНК (трансгенний об'єкт 1 або трансгенний об'єкт 7) були фертильними, що було визначено за утворенням насінини (таблиця 5). Усе потомство із генотипом п5ід/т514 без вставки Т-ДНК характеризувалось чоловічою стерильністю і не утворювало насінину. З цього явно видно, що вставка Т-ДНК, комплементарна Там51, здатна відновлювати фертильність у мутантних рослин т51ійа/лт51йа і ця здатність передається потомству.

Таблиця 4

Фертильність у рослин Т1 із вставкою Т-ДНК, комплементарною Тамб51, або без неї об'єкт ТО т-ДнНК стерильністю (Трансгтеннийоб'єкт! (|Рослина8 |Гомозиготна | 0 |Стерильна.:.:/./:/:;«://С:/ / оТрансгеннийоб'єкт! |Рослина9 |Гомозистна | 0 2 |Стерильна.:.:;//;/? ЗЕ (Трансгеннийоб'єкт7 |Рослина7 |Гомозиютна | 0 2 |Стерильна.:С:(ФБ/;КВ ПІІ (Трансгеннийоб'єкт7 |Рослина8 |Гомозиютна | 0 2 |Стерильна.:.:(ФКб;/:/ З

Як висновок необхідно відзначити, що аналіз рослин ТО і Т1 зі вставкою Т-ДНК, що містить нативний ген М51 пшениці, показав, що даний ген здатний відновлювати фертильність щодо гомозиготної рецесивної мутації т51а/те1а. Даний приклад є додатковим доказом, що мутація тета знаходиться в гені М51 пшениці.

Приклад 9. Підтримування та підвищення інбредності у рослин пшениці т51 із чоловічою стерильністю за допомогою гемізиготної підтримувальної лінії.

Даний приклад демонструє, що рослини пшениці, гомозиготно-рецесивні за т51, можна підтримувати як рослини із чоловічою стерильністю за допомогою функціональної копії М51, зчепленої із маркерним геном насінини і геном інгібування розвитку пилку.

Було б зручно одержати чисту лінію рослин із чоловічою стерильністю для забезпечення перехресного запилення з іншим інбредним різновидом пшениці для одержання гібридної насінини. У цілому, стратегії які передбачають забезпечення рецесивної чоловічої стерильності, дають у результаті рослини, які не можуть самозапилюватися. Для здійснення самозапилення й одержання чистої лінії рослин із чоловічою стерильністю для перехресного запилення була сконструйована касета експресії (М51-АА-Кей), яка містила функціональну копію М51, зчепленого із промотором РО47 маїсу, що експресує функціональний ген альфа- амілази (див., наприклад, ЗЕО ІО МО: 30), і додатково зчепленого з маркерним геном забарвлення (наприклад, тим, що кодує червоний флуоресцентний білок) під контролем промотора ГТР2 ячменю (див., наприклад, патент США Мо 5525716), і який також несе послідовність термінатора РІМІІ. За допомогою біолістичної або Адгорасіегіит-опосередкованої трансформації цю конструкцію трансформували безпосередньо в зародки, одержані з самозапилених рослин пшениці М51/тп51. Забезпечували регенерацію трансформованих зародків в рослини. Рослини пшениці (іт51/т51), що містять одну копію касети М51-АА-Кеай, яку можна ідентифікувати за допомогою маркерів, що фланкують локус т51, як описано вище, характеризувалися чоловічою стерильністю і могли самозапилюватися. Завдяки дії РО47:АА, що інгібує функцію пилку і таким чином запобігає передачі касети експресії М51-АА-Кей пилком, насіння цього покоління потомства буде сегрегувати з частотою 1:1 на насінину із червоною флуоресценцією і без флуоресценції. Потомство, вирощене із насінини з червоною флуоресценцією, було гемізиготним за М51-АА-Кед, гомозиготним за Іп51 і характеризувалось чоловічою стерильністю; його використовували для розмноження (тобто «підтримування»)

Зо інбредної лінії із чоловічою стерильністю. Потомство насінини без флуоресценції не містило трансформованої копії комплементуючого гена Ме51, було осгомозиготним за те1 і характеризувалось чоловічою стерильністю. Такі інбредні рослини із чоловічою стерильністю були використані як жіноча інбредна рослина для одержання гібридного насіння під час висівання поруч із чоловічими інбредними рослинами пшениці, які були дикого типу за геном

М51.

Приклад 10. Цільова регуляція або мутагенез гена

Для застосувань рослин, пов'язаних із чоловічою фертильністю, може бути переважним піддати мутації ендогенний ген М51 або змінити його експресію, наприклад, за допомогою способів, описаних у даному прикладі.

Було показано, що введення РНК у живу клітину інгібувало експресію цільового гена у такої клітини. (Ває еї аї. (2010) Ріапі Вгеедіпд 129 (6):647-651; Веєїпат еї а!. (1999) Ргосеєдіпд5 ої Ше

Маїйопа! Асадету ої бсіепсе5 96 (15):8774-8778, доі:10.1073/рпаз5.96.15.8774; Сідап єї аї. (2010)

И.5. Раїепі 7696405; Сідап єї аї!. (2005) Тне Ріапі доштаї 43 (6):929-940; баіакоцгаз еї аї. (2009)

Те Ріапі УуЧоштаї 60 (5):840-851, доі:10.1111/.1365-313Х.2009.04003.х; Ріге єї аї. (1998) Маїшге 391 (6669):806-811; Ріге єї а. (1999) МО 1999032619 Ат; Мейе евї аї. (2000) ЕМВО / 19 (19):5194- 5201; ОКигакі апа Топуата (2004) Ріапі СеїЇ Верогів 22 (7):509-512. доі:10.1007/500299-003- 0698-2; Тапа (2013) МО 2013025670 АТ; Тіттопзв апа Ріге (1998) Маїшге 395:854; Ми єї а!. (2002)

РМАБ5 99 (9):6047-6052. Фахівець у даній галузі зрозуміє, що РНК можна експресувати у клітині або застосовувати екзогенно (Тапд УМО 2013025670 АТ1)).

Інтерферуюча РНК може цілеспрямовано впливати на транскрипцію, трансляцію або стабільність мРНК, таким чином змінюючи експресію цільового гена. У даному прикладі експресію гена М51 знижували або піддавали сайленсингу шляхом експресії іп ріапіа або РНК, які цілеспрямовано діють на промоторну ділянку, як було раніше показано на однодольних (Сідап еї аІ. 2010), у тому числі пшениці (патентна заявка США Мо 14/203698), або РНК, які цілеспрямовано діють на експресовану мРНК, або окремо, або у комбінації. Для підходу з інвертованими повторами промотора частину промоторної ділянки М51 можна дуплікувати, розмістити їх поруч одне з одним, і орієнтувати у тандемі у протилежних напрямках, та помістити під контроль конститутивного переважного для тканини або умовного промотора у векторі для трансформації рослин з метою експресії РНК інвертованих повторів промотора в бо рослинних клітинах для сайленсингу гена, функціонально пов'язаного з цільовим промотором.

Також фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що зміни можна вводити шляхом внесення мутацій у послідовності нуклеїнової кислоти, що веде до змін або експресії кодованих мРНК, або амінокислотної послідовності кодованого поліпептиду М51, що в результаті приводить до зміни біологічної активності відповідно мРНК або білка або і того, й іншого. Див., наприклад, способи, описані в заявці на патент США Мо 14/463687, поданій 20 серпня 2014 року, включеній у даний документ за допомогою посилання у своєму повному обсязі. Таким чином, варіантні молекули нуклеїнової кислоти можна створити шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, додавань й/або делецій у відповідну послідовність нуклеїнової кислоти або оточувальні послідовності, розкриті в даному документі. Такі варіантні послідовності нуклеїнової кислоти також охоплюються даним розкриттям.

Варіантні послідовності нуклеїнової кислоти можна одержати шляхом введення змін у послідовність випадково уздовж всієї або частини генної ділянки М51, у тому числі без обмеження шляхом хімічного або опосередкованого опроміненням мутагенезу та олігонуклеотид-опосередкованого мутагенезу (ОММ) (ВеешШат еї аї. 1999; ОКигакі апа Тогпуата 2004). Альтернативно або додатково, зміни у послідовність можна внести у конкретних вибраних сайтах за допомогою методик двониткового розриву, таких як без обмеження 2МЕ, розроблені під певну задачу хомінг-ендонуклеази, ТАГЕМ, СКІЗРЕ/САЗ (що також називаються системами направляючої РНК/ендонуклеази Саз (патентна заявка США Мо 14/463687, подана серпня 2014 року)), або інших методик білкового, або полінуклеотидного, або комбінованого 20 полінуклеотид-білюювого мутагенезу. Одержані варіанти можна піддавати скринінгу щодо зміненої активності М51. Буде зрозуміло, що такі методики часто не є взаємовиключними. Більш того, різні способи можна застосовувати окремо або в комбінації, одночасно або послідовно, для створення або одержання доступу до різних варіантів послідовностей.

Приклад 11. Індукція чоловічої стерильності за допомогою посттранскрипційного сайленсингу гена Та-гтРо1

Полінуклеотидний фрагмент (ЗЕО ІЮ МО: 38) виділяли із З'ЮТК Та! ТРОЇ і субклонували в касеті для ЕМАЇї (2тИШБі:Таі ТрО1-ІК:5БАсіп їепт) у вектор для конститутивної експресії РНРІ1.

Рослини для трансформаційного донорного матеріалу висівали у кількості 5-6 рослин на горщик об'ємом 6 л (8 дюймів у діаметрі), що містив грунтову суміш. Грунтова суміш складалася

Зо з 75 965 (об'єм/об'єм) кокосового торфу, 25 95 (об'єм/об'єм) фракціонованого піску для теплиць (гострокутний), 750 мг/л Са5О4.2Н20 (гіпс), 750 мг/л Са(Н2гРО4)2.Н2гО (суперфосфат), 1,9 г/л

Ее504, 125 мг/л РеЕєОЮТА, 1,9 г/л Са(МОЗ3)2, 750 мг/л мікроелементів 5сой5 Місготах і 2,5 г/л добрива із повільним вивільненням О5Ітосоїе Ріих5 (16:3:9) (Зсон5 Айвігаїйа Ріу. Ца.). Доводили рН до діапазону від 6,0 до 6,5 за допомогою 2 частин вапняного добрива на 1 частину гашеного вапна. Висаджені у горщик рослини вирощували в теплицях із контрольованим середовищем за 23 "С (день) і 16 "С (ніч) із фотоперіодом, що подовжувався за допомогою натрієвих ламп високого тиску на 400 Вт у комбінації з метало-галогеновими лампами до 12 годин протягом зимових місяців.

Сумісне бомбардування касети для КМАЇ із конститутивно експресованою послідовністю селективного маркерного гена Прі проводили згідно з опублікованими способами. І5тадниі еї аї. іп Стор Вгеєдіпа Мої. 1145 Меїйод3вз іп МоїІесшіаг Віоіоду (єдз 0. РІвигу в В. М/пінога) Сі 14, 239- 252 (Зргіпдег, 2014). Регенерантів ТО виділяли за допомогою відбору на М5 середовищі, що містить 100 мг/л гігроміцину В.

Тести на життєздатність пилкових зерен проводили на зрілих пиляках, зібраних від різних колосів окремих рослин безпосередньо перед розкриванням. Пиляки поміщали на зволожений фільтрувальний папір у чашках Петрі для перенесення в лабораторію, де їх подрібнювали на прозорому предметному склі у краплині 295 розчину йодиду калію. Пилкові зерна, розташовані між предметним і покривним склом, захищали від висихання шляхом обведення краю покривного скла прозорим лаком для нігтів. Зразки досліджували та результати документували за допомогою мікроскопу Ахіо Ітадег М2, з'єднаного з камерою АхіоСат МКт3З 5/М 5669.

Окремі рослини оцінювали щодо самозапилення шляхом розміщення перед цвітінням целофанового ізоляційного мішечка над кожною верхівкою. Для підрахунку насіння збирали від

З до 10 верхівок на рослину. Два базальних і два апікальних колоси на верхівку виключали з аналізу через їх неповний розвиток. Для верхівки рахували загальну кількість утворених насінин і кількості квіток. Відсоток фертильності для кожного колоса або рослини розраховували наступним чином:

Фо - Загальна кількість утворених насінин на колос або рослину х 100

Загальна кількість квіток на колос або рослину

Екстракції ДНК із усіх трансгенних регенерантів виконували за допомогою або протоколу бо фенол-хлороформної екстракції або за допомогою протоколу екстракції-ліофілізації.

(Комаїспик, М. в Стор Вгеєдіпу Мої. 1145 Меїпоаз іп МоїІесшіаг Віоіоду (едз 0. РіІєшгу 4 А. М/пШОГга) 239-252 (5ргіпдег, 2014). Шматочок листа 15 см від 2-тижневої рослини заморожували у рідкому азоті і тканину подрібнювали до дрібного порошку за допомогою 1 великого (9 мм) і З маленьких (З мм) шарикопідшипника і вортексу. 700 мкл буфера для екстракції (195 саркозил, 100 мМ Ттгів-

НСІ, рН 8,5, 100 мМ Масі, 10 мМ ЕОТА, 295 РМРР) додавали до кожного зразка та зразки перемішували протягом 20 хв. на ротаційному шейкері Додавали 700 мкл фенолу/хлороформу/ізоамілового спирту (25:24:11) і екстракт переносили у пробірку з силікагелевою матрицею та центрифугували за 4000 об./хв. протягом 10 хв. ДНК осаджували шляхом додавання 60 мкл ЗМ ацетату натрію, рН 4,8, і 600 мкл ізопропанолу та центрифугували за 13000 об./хв. протягом 10 хв. Осад ДНК промивали 1 мл 7095 етанолу, центрифугували протягом 2 хв. за 13000 об./хв. і сушили на повітрі протягом 20 хв. Очищену

ДНК ресуспендували в 50 мкл К40 (1 х ТЕ, 40 мкг/мл РНКази А). Наявність касети для КМАЇ у ростків регенерантів ТО оцінювали за допомогою ПЛР із трансген-специфічними праймерами.

Дев'яносто дев'ять ростків регенерантів ТО були ідентифіковані як стійкі до гігроміцину, із яких 73 були визнані як ті, що містять касету для КМАЇї. Із 73 ПЛР-позитивних трансгенних рослин ТО у 26 (приблизно 36 95) спостерігали або повну стерильність, або експресію часткової стерильності при оцінюванні самозапилення. Ці результати свідчать про те, що Та Тро1- специфічний посттрансляційний сайленсинг гена може індукувати стерильність.

Приклад 12. Відновлення фертильності у гомозигот за т5їа за допомогою геномного

Та тРСІ1

Геномний фрагмент Та! ТРОЇ у векторі РНРО2 вводили у генотип Ітп51а х Сіадіи5 (покоління

Е2/ЕЗ) за допомогою біолістичної трансформації.

Трансформацію здійснювали, як описано у прикладі 11. Ростки регенерантів ТО генотипували за допомогою аналізу КА5Раг із застосуванням М51-зчеплених маркерів ЕТО292 (ЗЕО І МО: 34), ЕТО294 (5ЕО ІО МО: 35), 007-0042.1 (5ЕО 10 МО: 36), 007-0046.1 (5ЕО ІЮ МО: 33), а також 007-0182.1 (5ЕО ІО МО: 37), націлених на варіантний (штучний) промотор М51 485 із ЗЕО ІЮ МО: 8. Рослини, які були ідентифіковані як гомозиготи за Іп514 та містять варіантний промотор М51 4В5, оцінювали щодо самозапилення згідно з методологією прикладу 11.

Вісімдесят ростків регенерантів ТО були ідентифіковані як стійкі до гігроміцину, із яких 69

Зо були визнані як такі, що містять трансгенний варіантний промотор М51 485, за допомогою аналізу КА5Р з 007-0182.1. З цих 69 трансгенних рослин ТО 4 ідентифікували як гомозиготні за гаплотипом Спгіб5 (т5та/лт514) за допомогою аналізу КАР із застосуванням маркерів 007- 0009.1, 007-0011.1, 007-0042.1 і 007-0046.1. Колоси, накриті перед цвітінням мішком, показали, що три лінії могли самозапилюватися. Ці результати свідчать про те, що геномний фрагмент

ТастРО1 може відновлювати фертильність у гомозигот за те14.

Приклад 13. Експресія інвертованих повторів промотора М51 впливає на фертильність у пшениці

Даний приклад демонструє, що фертильність рослин може бути змінена за допомогою експресії молекул з інвертованими повторами, специфічними для промотора М51 (інвертованими повторами промотора, рік). Це забезпечує додатковий доказ, що експресія гена

М51 необхідна для чоловічої фертильності у пшениці.

Конструкцію рік створювали шляхом з'єднання убіквітинового промотора з інвертованими повторами, які були націлені на частину промотора М51 пшениці (ЗЕО ІЮО МО: 6), у тому числі сегмент спейсера МО5 між послідовностями інвертованих повторів. Молекули нуклеїнових кислот і способи одержання вектора були описані раніше (Сідап еї а! Ріапі доигпа! (2005) 43, 929-940). Конструкцію вводили у пшеницю різновиду БРієїдег за допомогою Адгобасіегішт- опосередкованої трансформації згідно зі способами, відомими з рівня техніки та зазначеними в інших розділах даного документа.

Рослини вирощували в теплиці. Число копій трансгенів визначали за допомогою кількісної полімеразної ланцюгової реакції (ОРСК). Рослини вирощували до стану зрілості та реєстрували фенотип із чоловічою фертильністю.

Супресія була достатньою для того, щоб викликати чоловічу стерильність у 100 95 трансгенних об'єктів. Обидва трансгенних об'єкти з однією копією та великою кількістю копій вставки Т-ДНК характеризувалися чоловічою стерильністю, що свідчить про те, що обидва трансгенних об'єкти з однією копією та великою кількістю копій вставки були ефективними.

Даний приклад додатково демонструє, що ген М51 є геном чоловічої фертильності у пшениці, і його супресія приводить до чоловічої стерильності.

ЗМІНЕНИЙ ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 ПІОНІР ХАЙ-БРЕД ІНТЕРНЕШНЛ, ІНК. «1205 Полінуклеотиди, поліпептиди М51і пшениці та способи застосування «1305 вЕтТ5202500-05-МР «1405 00514866078 «1415 2015-09-25 «1505 05 62/056365 «1515 2014-09-26 «1505 05 62/187591 «1515 2015-07-01 «1605 Сф51 «1705 РагепесІпПп версія 3.5 «2105 1 «211» 3838 «2125 ДНК «2135 Ногдецт упідаге 2205

Зо «2215 промотор «2225 (1)..:1902) «4005 1 сдсасаєсаа сасааассса ссадаєсєддда асааєсєсддає ссасдаадда сасаааасес бо

ЕсЕааєссса Єдасаасусс адаададсаа дадеааакає ареєсеЕсаєаа аааасааєда 120 асасрадаєд асдасудаада асасаадаєс сеЕєсааддад ааарєсдсддс адсодачаєсд 180 дсадссуддад дсдадддддас сааааасеєсеЕ дЕєЄдсддсда, садсуддеадс сЕєддеЕдааа 240 сссасасдеєс Єдсасассає асаадссдеЕс сдсаадддасс асаєсдддсесс сдсєсєссс9аєсд 3З0о аааггадаадуд Єсагасаєдуд дЕСЕЕддЕСсСЕ судЕдсаааас даааддесад садеЕссаєдуу 3З6о дссддаддаа ааассудддса асаасасдудсс аЕєдеЕдеЕдеЕЕЕ Есдсдддаас ссааєессда 420 ааєсасссас сддсассесуд Есссдаєдсс Єсссадаасуд ЕЄСТтасудаєдс ЄЕссасад9дад 480 ссадсссадс сдсдддаєса даєсєсаддаєс адсасдааса сЄсдаадссад сдсддсдаєса

ЄЕС ЕсСссад ссессудссесС дсссудасчдас Єдсасєєєсає Ессудааааса ааааааачЧад бо сСЕсЕсСеЕсссс сесаєсссда дсдссададд адсассадаа аддссассса сссасссеса бе сдеассдссс ссдсасссдс дсддссасає ссдддссдсс сасссдддса дседдссдее 720 ссаєссссда ассдасдддс аддаєсдадс дадсддсдсд сссасддсесс сеЕссддстає 780 асаасссдсс асссасасса сеЕссссЕссу дсдЕєссасс ададссьєсс ЕсссеЕссасс 840 дсассассас сассассудсд ссаааааассс гадддадсда дсдадсссас сЕСсдссссдас 900 ссаєддадад ассссдссдс седссдссса сддсддддсЕ ссесдссдсда седссссс9д 960 сддсддссдс сасссссддуа седсадсадд дддсдсадсд сдассссасд Єссссддсда 1020 сдсаддссдс дсЕсЕссрдс дсссссдаса бдсссасддс ссадесдссдс дадсссдессд

Зо 1080

ЕсдссдссвсЄ судассесуддда ддсддсудесс ссеЕдссеЕсед ссудсдеЕсдесс дссддадссдс 1140

З5 адсЕддЕсає доадсддддсЕс аасдссассс ассЕсСЕЕсдс дсЕдтасасс ЕссгЕдсддасд 1200 дсаєссудеЕсс суддаєддсдсес сассесудссу ссудсседсса аддеасдеЕєс асдеєсассд 1260 ссЕссссссс ЄссссЕсссс ссЕссдсасс сдсассадсс дасссддсдс Єсдсссссде 1320

ЧФЕЕсСсСсСсудеЕ адзуеЕеесеЕвасд вдеЕвесеЕсдад и єсодссадедс Ессдаєтесдд даЕЕсСодеЕЕс 1380 сЕсдсЯдссдЕ ассддаєссд сседсасддс дсдсддсдес ддоддеЕссссЯа ссдЕссссс 1440

Еддсдадсає ссссдсдсдс ссасуддсеста дсрадсеЕвас ссссадаєбас дсодадсдає 1500

Есаддаєсад саєдчаддадеЕ ЕєСдЕСЧдвада адааєдсаєд сддаасдсдс даєєдеЕевде 1560

Ессаєсччавєсє єгдчаєстєдеЕ давгадудсстд свЕєдеЕесссу адеЕЕвеЕеЕвдса сдеєадаадаа

Есаєдедсад аасссседдеє ссаєтавєеєвд євгаєдеаває асасдаєвтас єЕЕдеЕЧДсатає 1680 дсадаадеЕсеє садеЕсаєссдд срассстеєсс адааєтртарєеєс ууєдудуеєуееЕеЕ вЕДЕЕССЕСЄєЯ 1740 дЕсааасеЕєс адаєсдаєсєє ЕєЕсСдЕЕСдаде Есаєєєєссє дсстдсаасе дачаєсаєса 1800

Бассраєсас судєдассдесд адададасад ададеЕсЕдеесд ссдЕєєаасе дсвеаєаєаєа 1860

ЕдвасуєсеЕс сеЕдссаседеЕ Еєааєсдасе дсеЕссаєссс дЕЕєСЯСТОага ддасеЕвдеее 1920 сааваассдсса сдсадссссд сЕссссдсад СЄДЕСЕСЕссдЕ сЕссєсс9дФд ссаааассда 1980 ааасудсеЕєсєдс баєсдаддсс ададдсаддд саааадсесс ссурастьсєве сдсЕєЕдсад 2040

Еддсассєсс ЕсЕСсССЕсЕсСЄ Есдссдаааа, ЕЄДЕСЄЕСсССсас деЕссаєссссс доадЕдЕсоаєва 2100 стасеєсавааєєс асссдсаєдс адззесссасд сссЕсссссс деЕсдеєдаааа аааддссдад 2160

Зо

Есаааєдаає саассудєдса єдсадддсад садсаасада дагададеад сЕддсеЕдеЕс 2220 садсєссаас аааадсадсс єдеЕддсссдс сасадеЕсссс ссдасєссссд сссааєссо9 2280 сСсССдДУЧдсЕсс ЕСЕЕССЕсдЕсЄ дсдсасудєсуд Єсудесссссюс сЕсссссссс вассссссода 2340 єсЕСсСЕссесЧда дасааддаса сдаасуддстуд дЕаасєцчасс ЕєЕСсссЕСУЧЄСУ ЄЕЕЕссаст 2400 гд9дЕсеЕсду асодсаддасс ддсЕсссссу дссудссудесу Есадсадссс сссдссасса 2460

Есдссадсас сЕсудссудсаа асаддсадсуд судбасудаасс ЕСсСЕСУДСЕСЕС ЕСсСЕСЕСЕССС 2520

ЕгЕСсСЕСУДССЄДСсС аЕсЕСУ4СЕСЕ десасаєаасс гаєтдддеЕєс аєаєдседає садсдеєдас 2580 асасеаасеЕсє деЕссавєсвеєда єссеЕСадасу асдсдссесс ассдссдссу Ессадсддада 2640 адссаєсссс дссдссссад дадсаєдасу дсдссдсаса сдссаададс дсссссдссс 2700

Есдсуддсесс бассссудсес дсудсссусвд ссудсеаседс сссудссудссс даддсдссас асЕссдссдс дЕСдЕєСУдєЄСсСсС даєсєсддсесо Єсаєсєєсає сдссдсддесс агдсссдсса 2820

ЕсвасаєсдеЕ ссессЧдааєсєд дссдассссс ааддсадсад адртасеЕвєдеЕс аєсеЕдавєесс 2880

ЧЕєссарвдсес єдЕсСуссуєЄє єЕ9ФЕЄЧадддвЕ сдеЕеєседса дЕССЧЧаасаа дасодавеЕдоадао 2940

ЄсЕєЄЧДЧаєсудд деасссадає єссваєдесу аєсдсдсудеєа сеадтасвад бадеЕєдсьева 3000 дсадаєдаас даасаєєсуддд єЄЕєдоодавье ссеЕСЕадсвед аєдаассасе дсваєвеесс 3060 асдЕЧчаєсча Єддаєаєдає ссдааєсдчає одддаєдаадачсс єЕСсо4дЕСЄСТУЯ аєдсеєдаєда 3120

ЕЧ9ФЕД9ДСЕДСЕЄ сессавреєвєдс аєдсеЕсудаєс баєєссьєса аєєєвЕдедда дсаасадеее 3180

ЧФЕЕсадсесеЕС ЄДЕЕСЕДСсСса Едааєааєдс судсеЕєдсаєс єЕЕєДдЕСАЕЄЄДДЧСсС, Едаєааєсед 3240 сЕсааєдсад асасєсдсесс сдесЕсссааас аасссдессдс ссассаддса асдсаєсаєаа

Зо 3300

ЕсСЕДЯДвассес ассеЕссодсас аасаасадаа дссбасссрдс гаааааааса сасасасаса 3360

З5 сасааааааа асадаадсвд дЕСсСссасасу даадссдсЕс соддодадасеує ЕЕДдсадссее 3420

Есасведссасє єЄЕЄДДФЕЕсеЕЄСсС аєдсаддеас аааєсчаддд ЄЧФЕЄдЧдсСЕеЕєЧа єеЕєДдаєсаєд 3480 чаєдаєсасе сададсааса Е9ФЕЧДЕЧЕСЄЕЄ 9ФЕСЕЧЧЕЧЧЕЄЕ вБавєсдеєдс єСЯДЕССВЕСС 3540 ааєсвааасє Єдаааєддає сдЕдЕдЕдда Єаааадаада сдєдсдеЕсад єЕєдааєсда 3600 сдсдЕсддаєЄ басассссдеЕ дЕссдсЕдасу ассдааасда адасааааса сассдесссдад 3З66о

Есадаасьдс Ессааєдсса дсссЕсЕссЕсС стассаєсдс ассссуаєсдуає аддааааадес 3720 асрадаасса саддааасєуд даасудсаада ааадсавбаєс гассудеЕєддс сдеєдарсье 3780

А дЕЕссасавєс соуддргаєддсеЕ ссуддеЕсаєає єдеЕєддадає єсасаєєсає дсасдсаа «2105 2 «2115 642 «2125 ДНК «2135 Ногдецт упідаге «4005 ю2 асддададає сссудссудссЕ дсЕдсЕсСЧдЕЧд дсодддадсеЕсс ЕсСдссудсусЕ дсЕСССсСдсС бо дсддссдсса ссЕЕСсСуддудсЕ дсадсаддудд дсодсадедсуд ассссасдеє ссеЕддсдасд 120 саддссдсдс ЄсЕсссдсдес ссссдасаєд сссасддесс адесдссдсда дсссдесдес 180 дссодсссссд ассссоддддад сддсдєсссс ЄдссеЕсСЕдсс дсдеЕсдссудс сдадссодсад 240 сЕддссаєсєдд сддддсссаа сдссасссас сЕсСЕссдсдс Єдсасассеєс седсддсдддас 3З0о асссудссссуд дЕддсдссса ссеЕсдссудсесс дсседссаад дассуддсесс сссуддссдсс 3З6о дЕСсдЕСсСадса дссссссудсс ассаєсдсса дсассесдсс дсааасаддс адсдсасдас

Зо 420 дсдссЕссас сдссдссуєс садсдадаад ссаєссссдс сдссссадда дсаєдасддс 480

З5 дссдсасасуд ссаададсдс ссссудсссіс дсудсеЕссста ссссудсессдудс дсссдседсс 540 дсрЕасеєдссс судссдсссда ддсдссасас Ессудссусує сдеЕсдеЕсСсда ЄЕСУДДдСсСТЕсС бо асссесаєсу ссдсддссає дсеЕсдссавєс сасассдесс єс 642 2105 З «2115 214 «212» Білок «2135 Ногдецт упідаге «4005 з

Меєсє біп Акуд бБег Агу Агуд Те Тїец Іїецп Уаі Аїа сіу Гей Гей Аза Аза 1 9) 10 15

Тецп Гей Рго Аза Аза Аїа Аза ТПг Рпе сіу Гей сбіп сбіп с1у Аїа сіп

20 25 Зо

Сув Авр Рго ТПг Рпе тей Аїа ТПг біп Аїа Аза Гей Рпе Сув Аїа Рго 35 40 45

Авр Меє Рго ТПтІ Аза сіп Сув Сув бій Рго Уаі! Уаі Аїа Аїа Рпе Азр 50 55 бо

Те сі1у с1у с1у Уаї Рго Сув ІТецп Сув Акуд Уаі Аза Аза сбіц Рго сіп 65 70 75 80

Тецп Уаї Месє Атїа сі1у Геп Азп АТа ТПг Ні Ггец Рпе АТа Іец Тук ТПг 85 90 95

Бек Сув с1у сС1у І1їе Агуд Рго сСі1у с1у Аза Нів гей Аза Аїа Аїа Сув 100 105 110 сіп с1у Рго Аза Рго Рго Аіїа Аїа Уаі! Уаії бек Бек Рго Рго Рго Рго 115 120 125

Зек Рго Аїа Рго Агуд Агу Туз сіп Аза АТа Нів Авр АТа Рго Рго Рго 130 135 140

Зо

Рго Рго бек бек б1іш Ппув Рго бек Рго Рго Рго біп сіц Ніз Ар С01У 145 150 155 160

Аїа Аза Нів АТа гпув Бек АТїа Рго Аїа їец АТїа АТїа Рго ТПг Рго Іецй 165 170 175

Аїа Рго Аїа АТїа АзТа ТПг АТа Рго Рго Рго СсСі1ц АТа Рго Нів бек Аїа 180 185 190

Аза бек бек бБетг Авр Бек Аза Рпе Іїе Рпе Іїе Аїа Аїа Аза Меє Іец 195 200 205

Аза Іїе Тук І1е Уаї1ї Іевц 210 «2105 мМ4 «2115» 660 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт

«4005 4 асддададає сссудсуддудсЕ дсЕдсЕдЧава дсодддадсеЕдс ЕддсуддсодсЕ дсЕдссоадс бо дсдасддсоадс адссддодддс дссдєдсдад сссодсдседс гддсдасодса ддЕддсоасес 120

Есссдсудсудс ссдасаєдсс дасддсссад ЄдсЕдсдадс ссудЕсСдеЕсСдс судссдеєсдас 180 сЕсддсддсуд дддеЕдсссд ссеЕссдссдс дЕСсСдссдссуд адссдсадсо сдссаєсддасд 240 дадссЕсаасуд ссасссассе ссесасудсес басадсеЕссеЕ дсуддсддсессЕ ссдссссуддес 3З0о дадасдсссасс Есдссудссудс седсудаадда сссудсесссс суддссудссудЕє сдеЕсадсадс 3З6о сссссудсссс соудссЕссасс деЕссдссодса ссесдссдса адсадссадс дсасддасдса 420 ссассдссдс сассдссдес дадсдадаад ссдеЕсудЕссс сдссдессудєс ссаддассас 480 часддсдссуд ссссссудсудс сааддссудсуд сссдсссадд сддссассес сасдсєсдасд 540 сссдссдссуд ссдссассудс сссдссудссс саддсдссдс асеЕссдссудс дсссасддсд

Зо бо ссдЕссаадд сддсссЕссЕс сЕссдєсдес асддссаєдс Єсддассессса саєсаєссяс бе «2105 15 «2115 220 «212» Білок «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 ююКМ5

Меєсє біп Акуд Бек Акуд с1іу Тешп їец Іец Уаі Аїа сіу Гей Гей Аза Аза 1 9) 10 15

Тецп Гей Рго Аза Аза Аїа Аза сСіп Рго сіу Аза Рго Сув біц Рго Аза 20 25 Зо

ТГецп Геп Аза ТПпг осіп Уаі! Аїа їецп Рпе Сув Аза Рго Азр Меє Рго ТПг 35 40 45

Аза біп Сув Сув бій Рго Уаі Уаі Аза Аїа Уаії Авр тей с1у с1у ШУ 50 55 бо

А

Уаї Рго Сув Іецп Сув Акуд Уаі Аїа Аза бій Рго СсСіп Тецй Уаї Меє Аїа 65 7о 75 80 сіу еп Авп АТїа ТПг Ні Гец Тецп ТПг Іецп Тук Бек бек Сув С1у С1У 85 90 95 теп Агуд Рго с1у сС1у АТїа Нів теп Аїа Аза АтТа Сув сій сС1у Рго А1а 100 105 110

Рго Рго Аза Аїа Уаії Уаії бек бек Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго 5ег 115 120 125

Аза Аза Рго Агуд Агуд Туз С1іп Рго АТа Нів Авр АТїа Рго Рго Рго Рго 130 135 140

Рго Рго бек бек сб1іп Ппув Рго бек Бек Рго Рго Рго бек Сбіп Авр Ніз 145 150 155 160

АБр б1у Аїа Аїа Рго Агуд Аза туз Аїа Аза Рго Аїа сіп Аїа Аза ТПг 165 170 175

Зо зек ТПпг Те Аїа Рго Аїа Аза Аїа Аїа ТПг Аза Рго Рго Рго сСіп Аза 180 185 190

З5 Рго Нів Бек Аза АТїа Рго ТПг АТїа Рго бек їув Аїа Аза Рпе Рпе Ріє 195 200 205

Уаі1ї Аза ТПйг Аїа Меє Гїец сіу Гей Ту Іїе Іїе Іецй 210 215 220 «2105 6 «2115 1527 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 6 адасеЕсааас саєєсадеса саааваєсуда Єдсасассеє суддЕддддсЯ єЕЕдЕЧааааа бо дсаєсдеЕвЕсеЕс єдадеЕСсСЧдаса адусссстЕсвЕ дсаасураєс сЕСЕЕСтаає ссвеаєєсада 120

Есаєєаасає сасаадсєдс аасєсдасаєд сЕСЕсЄСсСЕЧдад даєсєсаддеЕєс абдсааєтаа 180 асаєсавааа сеЕдсаєстЕєе даєдесаєсс єЄЕЄЕССТтава ЕЕ ЕеєССяУ арваєвдасе

ЄДФСЕЕСЯЄЕЄ Єсааєсаєсад ЧдЕсстаєдас Єсудасєєсс ЕсдЕєдссад Єааєваєєс 3З0о гадесеЕдссдс ддаасаєдаа сеєЕСсаадддада дсеєЧдавєдудаєд сеаєдаадеє даєвєеєдаєд 3З6о чадздаЕсєдеЕеЕс сасасседса сЕгдсеєдсеЕСсС дасеЕєаааєа сардссеєдуа арсєєсьессс 420 адсєЕссадва саєаававєсєеє єссаааєєсаа єЄДдЕеЕЕССсСасда саєбааааєве аааєссасаа 480 асасасєсєеЕсє адсасаєдаа сааЕєсєеєста агагадддса аасавреєвєеєес агагасаавас 540 счаєсаєсєсє аасаєаєсддеЕ дааааєсаді деааєгасаєд сєдаааєдес єЕСааасаса бо гаєсдаасає агсвтаєааса аагддеЕдаас аЕгєстЕєеЕеєеЕвса аєвгаєєдавруд ассаєвтевва бе аааєсєдсаєсає єЄдаасаєвєеєе аєааєраєаса сеЕдвасадееє єєаєааєаає сдасдаасає 720

СсЕсЕссддадсі єссдаасаєсс ссссссаааа асасаадсса ЄССссссадда адаасасаава

Зо 780

Єдсаавадаа асдадасаєс савааадсаа аааадааааа саааасаааа сададааасс 840

З5 Басаддаааа ссааасада аааддсааад ааадаасссуд аассдддсса ддсаасдЕсе 900 ссаасддсесс сдсссЕссссо даасаадаад дссадссадс ссаєсдддсєд сеЕсссадсас 960

Есдддссссуд сЕдЕддсадс асудссаєдна авгадеЕвесу судддааєсса асдссддааатє 1020 сдсссдсадс дддаасссда сдЕсддЕссд деЕдсдЕсссд дсдессссса даасесссьсса 1080 саддсєсссд садссдессд ассадаєсад сасдаадсас даасаєсддс дсдсддасдає 1140 ассєвсЕСЕЕеЕсС сЕСДСсСссдас дасддсесодса стдсасєтєєса ЕсСсесЧдааєєє сааааєтєсод 1200 ааасудаааа дсЕЕссЕсСдс аєсссддаддс даддсуддеєа сдддсдссад аддддссасс 1260 ссасссассс асссссудссс Есасдєдссс сдсдсддссу саєссддасс дЕССсСдс9дс9д асадсєддсс дсдсссадсс сдаассдасуд сссаддаєсд адсдадддсд дсдсдсссдад 1380 дасСЕгЕддсЕс адсудеЕссасу ссассеєссууд страваєаадс сдссссасас ссдсЕссссс 1440

Ессддсарес саєсссудсса ссдсассасс ассассасса аассссадсуд адсддадсдад 1500 чддадададад ассдссссдс сдсдасд 1527 «2105 1/7 «211» 4335 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт 2205 «2215 екзон «2225 (1528)..(1855) 2205 «2215 екзон «2225 (2925)..(3008)

Зо 2205 «2215 екзон «2225 (3133)..(3380) «4005 1/7 адасеЕсааас саєєсадеса саааваєсуда Єдсасассеє суддЕддддсЯ єЕЕдЕЧааааа бо дсаєсдеЕвЕсеЕс єдадеЕСсСЧдаса адусссстЕсвЕ дсаасураєс сЕСЕЕСтаає ссвеаєєсада 120

Есаєвєаасає саєаадседс ааєєдасавьд сЕСЕєЄСєЧдад даєсаддеЕеєс аєдсааєтаа 180 асаєсаєбааа стедсассеЕєє даєсєдеЕсаєсс ЕЄЕЕЕЕеєССтаса єссеЕессссадуд аєтаєєсддсе 240

Г9дССЕСУЧЄЕЄ Єсаасаєсад ЧЕЕЄСТтТаєдає єсдасьсєсед єЕЕДдДЕєДссад Єааєааєтед 3З0о гадесеЕдссдс ддаасаєдаа сеєЕСсаадддада дсеєЧдавєдудаєд сеаєдаадеє даєвєеєдаєд 3З6о чадздаЕсєдеЕеЕс сасасседса сЕгдсеєдсеЕСсС дасеЕєаааєа сардссеєдуа арсєєсьессс 420 адсєЕссадва саєаававєсєеє єссаааєєсаа єЄДдЕеЕЕССсСасда саєбааааєве аааєссасаа асасасєсєеЕсє адсасаєдаа сааЕєсєеєста агагадддса аасавреєвєеєес агагасаавас 540 сдаєсаєссс аасасаєсддасє дааааєсєсадс дсаасасаєсд ссдаааєдес сссаваєсаса бо

Баєєдаасає асссаєааса аасддсдаас асєєсесЕєеєса асааєсдаєд ассасєвеса бе аааєсєдсаєсає єЄдаасаєвєеєе аєааєраєаса сеЕдвасадееє єєаєааєаає сдасдаасає 720

СсЕсЕссддадсі єссдаасаєсс ссссссаааа асасаадсса ЄССссссадда адаасасаава 780

Єдсаавадаа асдадасаєс савааадсаа аааадааааа саааасаааа сададааасс 840

Басаддаааа Єссааасада аааддсааад ааадаасссу аасеєдддсса ддсаавєдеве 900 ссаасддсесЕ судсЕсЕсссЕ даасаадаад дссадеЕсадс ссаєдддсед сЕсссадсас 960

Есдддссссуд сЕдЕддсадс асудссаєдна авгадеЕвесу судддааєсса асдссддааатє 1020

Зо сдсссдсадс дддаасссда сдЕсддЕссд деЕдсдЕсссд дсдессссса даасесссьсса 1080 саддсєсссд садссдессд ассадаєсад сасдаадсас даасаєсддс дсдсддасдає 1140 асЕсЕСЕсЕеЕСсС сЕСЯСсССсСсСдас дасуддссдса сьдсавєеєєеєса єЕЕєДдаавєве сааааєєсоад 1200 авасоуддаааа дсЕсЕсСЕСЯДсС ассссдаддс даддсддЕса сдддсдссад аддддссасс 1260 ссасссассс асссссудссс Есасдєдссс сдсдсддссу саєссддасс дЕССсСдс9дс9д 1320 асадсєддсс дсдсссадсс сдаассдасуд сссаддаєсд адсдадддсд дсдсдсссдад 1380 дасСЕгЕддсЕс адсудеЕссасу ссассеєссууд страваєаадс сдссссасас ссдсЕссссс 1440

Ессддсаєеєс саєеЕссдсса ссудсассасс ассассасса аассстрадсуд адсддадсддад 1500 чддачадачад ассдссссдс сдсудасуд асд дадоада сс судс дод сед сед сед 1554

Меєсє біп Акуд бБег Агкуд с1Уу Іец Іец Іецй 1 9) 99 дсд 999 сс суд дсу дсу ссу сс ссу дсу 9дсуд дсу дсуд сад ссд 1602

Уаї Аза с1у Іецп Іїецп Аїа Аїа Гей Гей Рго Аїа Аїа Аїа Аза сіп Рго

Чдад дсу ссуд бдс дадосссс о дсу сед суд дсу асуд сад Ч9дЕЧд десд сс Ес 10 1650 сіу Аїа Рго Сув бі Рго Аїа Іїецп Гец Аїа ТПпг о сіп Уаії Аїа Іеч РПе

Зо 35 40

Бдс дсуд ссс одас аєдссуд ас дсс сад бдс бдс дадд ссс дес дес дес 15 1698

Сув Аїа Рго Азр Меє Рго ТПг Аза біп Сув Сув бі. Рго Уаї Уаї Аза 45 50 55 дсс о дЕС дас сеЕсС ддс дос дод дЕдссс дес сс дес судс дЕС дсс дос 20 1746

А1їа Уаії АвБр Гей сіу сі1у сі1у Маї Рго Сув Гецп Сув Агуд Уаі Аза Аза бо 65 7о чад ссуд сад сес дес аєдодсудодас сс аас дсс о асс сас сеЕс сес асду 25 1794 бі Рго біп Гец Уаї Меє АтТїа сі1у Гец Авп АТїа ТПг Нів тей Гей ТПг 75 80 85 сЕС бас адс сс бдс ддс ддс о сос судс ссс ддс ддс дсс осас сс дсс

Зо 1842

Тецп Тук Бек бек Сув с1у сі1у теп Агуд Рго с1у бі1у АТа Нів Іец А1а 90 95 100 105 дсс о дсс о гдс даа уд дсасуєЄєвдес судессессьсс ссЕсссессс ЄсссЕсссЕсС 1895

Аза Аїа Сув с1ц

ЕСЕСЕСТасСу ЄДФСЕСУДСЕСЕ ссЕСЕвасс єадеадесасу гадеЕреЕссса єдсесеЕЕсЕєд 1955 асЕСсдстада адзусдсеЕссуд ЕЄЕЧЯУЧдЕСЕ Єєааєвєессе сдсеЕдваста ссудадаєсьтдие 2015 сдЕСддсасуд дсдсодсддсд ЄсодддеЕссеЕсС дсссЕссссс дЕддсдассуд ассесдсдсад 2075 сдсдсдсдсд дссбадссад сессасассуд сєдсассссд асасасасда адсдаєстсає 2135 даЕСтасеєсес даднавєсеєсс єСЯєСЧдгада асдсаєдсудс сдсЕСдсЧдає ЄдеЕЕЕсЧаЕс 2195 асєстадаєс суєЄєдсЕєдеЕеЕ сссоудсддадеЕє адесаєдсаєс гдсдеЕдсава ЕєдссдеЕасдас 2255 асдсадаєдс ададеЕсЕдсЕ дсеЕСЧЧадеЕва єсгасеЕдесу єЕСдДСЕСЯДас саваєведсс гЕдЕеЕсВ8авсеєс сЕДЕєЄСАаАєСУ ЕдсаєдсадеЕ адеадеадсс аєдеЕссасус сСсЕЕСЕЕЧЕЕЕ 2375

Едаддсдаєс аєсдЕсЕсдада єссарьЕдддсее єдсеЕсЕСЕДЧС асвтарстЕєссяе дссеЕеЕдеЕеее 2435 дЕєСсСЕССсСЯдса діасудбрасудеЕ сеЕсдсессдудЕ саааасеєдаа ааасуассєссу сЕдеЕсесавєе 2495 чаєсддсаад аддсЕддссуеє дсьЕЕеЕсддса ссдсадеусу ЕєсурссеЕседс сус дсу 2555 ааасаєвєесс аєдесєдаєсс ЕСЕЧддсуддаа стасеЕєЕесеес дсуєдсУудеЕЕ ЕДСДЕДЧДДССЕ 2615

Ессссссссу Єдаааададд ЕсудддЕсааа ссаааєддає сдссЕСсСЕєда сададсадсд 2675 дсадсадава дсЕддссудеЕс ЕсдсадсеЕвЕ ддсадаассу ЧЕСЕДЕДддсс аЕсЕДдЕСс'хісо 2735 дссЕДдссасс ДдЕссСссседа гєдеЕскУЧєєєс ЕСсСЕСЕСУЧСсССЄ дссассуєеєє сеЕееЕссСЕв Є 2795

Едсдсасдра судеЕсдеЕСасс ЕссЕССТасє ЄЕЕСЄЕЄДДЇссад ЕєЕЕеЕЕЕДЕЕЄвас ЄєЕЕЄЕЧЄаєдаа 2855

Зо асасасуддає дааєсуддсед деЕдаєєаасеє ЄЕудудсЕддсед сЕДЕєааєта сЕдЕЧДаєте 2915

Еддаєдсад да ссс о дсЕ ссс оссуд дсс о дсс дес дес адс адс ссс о ссд сесс 2965 сіу Рго Аї1а Рго Рго Аїа Аїа Уаі! Уаї бек Бек Рго Рго Рго 110 115 120 ссд сс сса ссуд сс дсс о дса сс сус судс аад сад сса дс9д с

Зоо

Рго Рго Рго Рго бег Аїа Аза Рго Агу Агуд туз біп Рго Аза 125 130 135 деаадаассє сЕсссЕсесс сЕсСЕсСЕсСеЕсСеЕ сссЕСЕСДСсСсС ЕдсаєсеЕСсдс баєдевваєс зЗо68 саєдесЕссаба ЄДдеЕсдаєсад ссЕсдЕссад ссассаасає дседсассдда Єсдддеесес 3128 дсад ас дас дса сса ссд ссд сса ссуд ссу суд адс дад аад сс єсСд 3176

Нів Авр Аза Рго Рго Рго Рго Рго Рго бБег бек сі Ппув Рго 5Бег 140 145 150

Бсс оссуд о ссуд ссу сс сад дас сас дас ддс о дсс о дсс о ссс сус десс аад 3224

Зек Рго Рго Рго бек сіп Авр Нів Авр сС1у Аза АТїа Рго Агуд Аїа Гуз 155 160 165 дсс о дсд ссс о дсс сад дсуд дсс оасс о бсс о асу сс дсуд ссс дос десс дес 3272

Аза Аза Рго Аїа сбіп Аіїа Аїа ТПг бек ТПг гейш Аза Рго Аїа Аза Аза 170 175 180 дсс оасс дсс оссуд сс ссс осад дсуд ссуд сас сс дсс дсу ссс асдуд дсд 3320

А1їа ТтПпг АтТа Рго Рго Рго сіп Аза Рго Ні бег Аїа Аїа Рго ТПг Аї1а 185 190 195 200 ссд сс аад дсд дсс бсс ссс сс дес дсс асуд дсс асд сос ддс сес 3368

Рго Бек ув Аїа Аїа Рпе Рпе Рпе Уаі Аза ТПг Аїа Меє Іец сС1Уу ГІецй 205 210 215

Бас аєс аєс сс ЕдадеЕсдсдс дссдудассссу судададассу ЄддЕсСсдеЕсс 3420

Тут І1е І1е Іевцй 220 адеЕсдсадеа дадеададсу сЕсСуєсуєЄєсе сусеЕссуєееЕ суєдссвеЕдЕС дссдєєсСдад 3480

ЧФЕЕСУЧЄЕЕсСсСЕ дсдЕдсадеЕс суддЕСЧОаада адссудеЕдддсеЕвєеєдадеас гєадеЕддеаде 3540

Зо адсадсадса дссассуєсє седеЕссдсеЕсС дгасдЕдесс одсдєддєсодс ддаадаасаає 3600

ЕаасєддаЧчвд ЄЕєдсдадес сЕСЕдЕєЄаа даєдаассас єдаєдставдд єдаєсдаєс 3З66о асєсддсєаєда єсєЧдааєдда аагддаєсаа ЧФЕСЄЕЄДДСсСУЧЄЕ сЕДСЕЧЯЧаєда ЕДдЕеЕЧчаєссає 3720

ЕєсддаєсєдеЕ дЕЧ9ДДДДСВаас адЕесЕсусьє дусЕЕеЕвЕдсЕС Едсдаєдаас даардсеЕесь 3780

Едсаєдсаєс ЄЕФЕСЕЄЕдсС ЕєЗаєєсєєдаа сЕдгадаасу даєдсадеас єдавреЕсьдес 3840

Есаєчаєдед асчасєсуєс дсасодсастає саєсєЕсьєса аасєсдесдвса дсадсеЕдвеее 3900 деадсеЕеЕсса ЄЕСЕЯДСсСсаєсд дасдаагдсс ЄДдЕЕЕЕеЕєсас ддадаассудс дсодсооддадас 3960 счаєдсддсєс ЕсдЕдЕсдсесс асдеЕсдеЕссс ссасдссадд асаааасада Єддасдсоадес 4020

ЕсЄдаєсссса аєсссассає сассаєдееєс суддададсса саєддаасес асдеЕсаадсд дово деЕсасЕвсес дсадааєсас ЕСсСЕєсассаре єрасссЕвеЕеЕ дЕєЧдааассе сЕСЕССЕСВЕ ссссаааадс Єдаєдсааса деЕдссаєсдсд сдсссассса ЄдсЕссссса сасдаєсдса 4200 ааасєєсддає счареєеєвсаєс єеЕЕєЧдаассс єаадеЕСсСуддеД| Еєасааєсьтьу ЕеЕєДдсавєдее 4260

БаєдеЕсссеЕс дсддсдадда ссаєтаааса адасстастає єддасасаєє Єсдасаддасе 4320

ЕЄдаааєссдд аасес 4335 2105 8 «2115 1527 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 2205 «2235» синтезовано «4005 8 аадсеЕсааас саєєсадеса сааавсаєсуда Єдсасассеє суддЕддддсЯ єЕЕдЕДЧааааа бо дсаєсдеЕвЕсеЕс єдадеЕСсСЧдаса адусссстЕсвЕ дсаасураєс сЕСЕЕСтаає ссвеаєєсада

Зо 120

Есаєвєаасає саєаадседс ааєєдасавьд сЕСЕєЄСєЧдад даєсаддеЕеєс аєдсааєтаа 180

З5 асаєсаєбааа стедсассеЕєє даєсєдеЕсаєсс ЕЄЕЕЕЕеєССтаса єссеЕессссадуд аєтаєєсддсе 240

Г9дССЕСУЧЄЕЄ Єсаасаєсад ЧЕЕЄСТтТаєдає єсдасьсєсед єЕЕДдДЕєДссад Єааєааєтед 3З0о гадесеЕдссдс ддаасаєдаа сеєЕСсаадддада дсеєЧдавєдудаєд сеаєдаадеє даєвєеєдаєд 3З6о чадздаЕсєдеЕеЕс сасасседса сЕгдсеєдсеЕСсС дасеЕєаааєа сардссеєдуа арсєєсьессс 420 адсєЕссадва саєаававєсєеє єссаааєєсаа єЄДдЕеЕЕССсСасда саєбааааєве аааєссасаа 480 асавгасєсєєс адсасаєдаа саасреєссста агсаєсаддодса аасарссєєс агбаєасаавас 540 сдаєсаєссс аасасаєсддасє дааааєсєсадс дсаасасаєсд ссдаааєдес сссаваєсаса бо гаєсдаасає агсвтаєааса аагддеЕдаас аЕгєстЕєеЕеєеЕвса аєвгаєєдавруд ассаєвтевва бе аааєсєдсаєсає єЄдаасаєвєеєе аєааєраєаса сеЕдвасадееє єєаєааєаає сдасдаасає 720

СсЕсЕссддадсі єссдаасаєсс ссссссаааа асасаадсса ЄССссссадда адаасасаава 780

Бдсааавдаа асдадаєаєс сааааадсаа аааадааааа саааасаааа сададааасс 840

Басаддаааа Єссааасада аааддсааад ааадаасссу аасеєдддсса ддсаавєдеве 900 ссаасддсесс сдсссЕссссо даасаадаад дссадссадс ссаєсдддсєд сеЕсссадсас 960

Есдддссссуд сЕдЕддсадс асудссаєдна авгадеЕвесу судддааєсса асдссддааатє 1020 сдсссдсадс дддаасссда сдЕсддЕссд деЕдсдЕсссд дсдессссса даасесссьсса 1080 саддсЕсссуд садссуєссу ассадаєсад сасдаадсас даасаєєдоас дсдсоадсдає 1140 асЕсЕСЕсЕеЕСсС сЕСЯСсССсСсСдас дасуддссдса сьдсавєеєєеєса єЕЕєДдаавєве сааааєєсоад 1200

Зо ааасудаака дясЕвЕссЕсдс аєсссддаддс даддсуддеєа сдддсдссад аддддссасс 1260 ссасссассс асссссудссс Есасдєдссс сдсдсддссуд ааєссдддсс дЕССсСдс9адс9д 1320 асадсєддсс дсдсссадсс сдаассдасуд сссаддаєсд адсдадддсд дсдсдсссдад 1380 даЯсЕгддсЕсЄ адсудЕссасуд ссасссссудд стаєсаєсаадс сдссссасас ссодсессссс 1440

Ессддсаєеєс саєеЕссдсса ссудсассасс ассассасса аассстрадсуд адсддадсддад 1500 чддадададад ассдссссдс сдсдасд 1527 2105 9 «211» 4335 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 2205 «2235» синтезовано

«4005 ющ.Б57З аадсеЕсааас саєєсадеса сааавсаєсуда Єдсасассеє суддЕддддсЯ єЕЕдЕДЧааааа бо дсаєсдеЕвЕсеЕс єдадеЕСсСЧдаса адусссстЕсвЕ дсаасураєс сЕСЕЕСтаає ссвеаєєсада 120

Есаєвєаасає саєаадседс ааєєдасавьд сЕСЕєЄСєЧдад даєсаддеЕеєс аєдсааєтаа 180 асаєсавааа сеЕдсаєстЕєе даєдесаєсс єЄЕЄЕССТтава ЕЕ ЕеєССяУ арваєвдасе 240

ЄДФСЕЕСЯЄЕЄ Єсааєсаєсад ЧдЕсстаєдас Єсудасєєсс ЕсдЕєдссад Єааєваєєс 3З0о гадесеЕдссдс ддаасаєдаа сеєЕСсаадддада дсеєЧдавєдудаєд сеаєдаадеє даєвєеєдаєд 3З6о чадздаЕсєдеЕеЕс сасасседса сЕгдсеєдсеЕСсС дасеЕєаааєа сардссеєдуа арсєєсьессс 420 адсєЕссадва саєаававєсєеє єссаааєєсаа єЄДдЕеЕЕССсСасда саєбааааєве аааєссасаа 480 асасасєсєеЕсє адсасаєдаа сааЕєсєеєста агагадддса аасавреєвєеєес агагасаавас 540

Зо счаєсаєсєсє аасаєаєсддеЕ дааааєсаді деааєгасаєд сєдаааєдес єЕСааасаса бо гаєсдаасає агсвтаєааса аагддеЕдаас аЕгєстЕєеЕеєеЕвса аєвгаєєдавруд ассаєвтевва бе аааєсєдсаєсає єЄдаасаєвєеєе аєааєраєаса сеЕдвасадееє єєаєааєаає сдасдаасає 720

СсЕсЕссддадсі єссдаасаєсс ссссссаааа асасаадсса ЄССссссадда адаасасаава 780

Єдсаавадаа асдадасаєс савааадсаа аааадааааа саааасаааа сададааасс 840

Басаддаааа ссааасада аааддсааад ааадаасссуд аассдддсса ддсаасдЕсе 900 ссаасддсесс сдсссЕссссо даасаадаад дссадссадс ссаєсдддсєд сеЕсссадсас 960

Есдддссссуд сЕдЕддсадс асудссаєдна авгадеЕвесу судддааєсса асдссддааатє 1020 сдсссдсадс дддаасссда сдЕсддЕссд деЕдсдЕсссд дсдессссса даасесссьсса 1080 саддсєсссд садссдессд ассадаєсад сасдаадсас даасаєсддс дсдсддасдає асЕсЕСЕсЕеЕСсС сЕСЯСсССсСсСдас дасуддссдса сьдсавєеєєеєса єЕЕєДдаавєве сааааєєсоад 1200 ааасудаака дясЕвЕссЕсдс аєсссддаддс даддсуддеєа сдддсдссад аддддссасс 1260 ссасссассс асссссдсесс Єсасудєдссс содсдсоуддссу аасссдддсс дЕССсСЯдсдоасдад 1320 асадсєддсс дсдсссадсс сдаассдасуд сссаддаєсд адсдадддсд дсдсдсссдад 1380 дасСЕгЕддсЕс адсудеЕссасу ссассеєссууд страваєаадс сдссссасас ссдсЕссссс 1440

Ессддсаєеєс саєеЕссдсса ссудсассасс ассассасса аассстрадсуд адсддадсддад 1500 ддадададад ассдссссдс сдсдасуаєд дададаєссс дсудддсЕдсЕ дсЕддеЕдоасд 1560 чЧадсЕДдсЕЯд соддсудсЕдсЕ дссоддсддасуд дсоддсдсадс сддадддсдсс дЕдсдадссс 1620 дсдсЕдссдуа судасдсаддає ддсдсЕєсЕЕс єдсдсдсссуд асаєдссудас ддсссадедс 1680

Зо

Едсдадсссуд ЄсдЕСсСдссудс сдеЕсСдассес ддсуддасудад єдссседссЕ сЕДСсССсССсСЕсС 1740 дссдссдудадс содсадсеєсудє саєддсуддудс сеЕсаасдсса сссассессе сасудсеЕстас 1800 адсєссрдсуд дсддссессуд ссссуддсуддс дсссассьсу ссудссудссвуд сааддеєасду 1860

ЕЕДдЕССДссСЄ сссссссесс сссссссссЄ сссесСЕсСЕСсСеЄ ссасусдсес дсЕЕсссвдс 1920

Есасссадва деасдрадееЕ єсссасєдссеЕ ЄсСЕеЕєЧдасесу сеадаадедс ЄссудеЕев9 1980

ЧдЕСЕЄДЕваає ЄЕССЕСУдСсСЄДД Басеассуда єсСЕдЕСдЕСсСУ дсасуддсдсуд суддсдеЕсо9д 2040

ЕссЕсудссвЕЄ сЕСССсСУдсДсС дассудассвд сдсадсдсдс дсдсуддсста дсеадсеєса 2100

БассдсеЕдна ссєсдасаєса сасудадсуда ЄссаєддаєсеЕ асЕСЕдадвна євЕЕССсСЕСсаєс 2160

Чдсадаасдса ЄдсдссусЕсС дсдаєсдєєс содєсдавєеєсе адаєссуєдсес ЕЕЧдЕссссде 2220 чадесвадсає дсаєсеЕдсдЕ дсаєаєдссу басдсасудса даєдсададеє сЕдеєеєдсес адеЕваєстас єдЕсСдЕЕєсСЯдс Есдассатає ЄсууссЕЧдЕСа ассссстдеЕє саєсдеЕдсає 2340 дсадеадсад садссаєдес сасусстьєсЕ ЕДЕЕЄеЧдаду сдаєсаєсдЕ судадаєссає 2400

ЧЯОСсСЕЕСсУЧСсСЕЄ ЄСЕдсасвтає сЕсеЕСЕЧдСсССсСТЬЕ ФЕСЄЕЄДЕЕСЕ ссдсадеасу басєсеЕвдас 2460

ЕсддеЕСаааа сЕдааааасу сЕЕсудсЕЧчеЕ ЄДЕЕєЧЯаєсуд дсаададсьдд уссддиЕедсееЕве 2520

Еддсассдса дЕдсдЕСУдсс ЕСЕДДССсСУДСЕЕЄ Єгдсдаааса ЕЕеЕЕССарЧЕЕ даєссеЕсть9у 2580 сддаастасє єЕсЕСоосдвЧа содЕеЕседсуєЄ додссЕЕєсСсеЕсС ссЕСУОЄддааа ачдчадаєсооад 2640

Есааассааа ЄддаєсдссеЕ сЕгддсадад садсддсадс адаєадсеєдда ссдЕСЕСсСдса 2700 дсЕсЕдддсад аассудЕссд Еддссаєсьд єсдссудсесведд ссассурееєс сседаєдеее 2760

ЧФЕЕССЕСЕСсСЕ судссеєдссас ЕФЕСЕСЕСЕЕЕЄ сСЕЄДЕєдсдс асдбєасудесу Єсассессьс

Зо 2820 стасеЕссссс дссадеЕсссу сєссасссссдд асдаааєсаса сддаєдааєс ддоассддаєдає 2880

З5 ЕаасЕссдуас ЄодссдусЕДЧЕЄ аастассддсуд даєєссдддає ддсаддасссу сЕСсСссссодсес 2940 сдссдЕсдесс адсадссссс сдсссссудсес сссассдесс дссдсассеєс дссдсаадса 3000 дссадсудсує аадаассьстЕ сссЕсЕсссЕ сЕСсСЕСЕСсСЕсСсС сЕСЕСДСсССвУД саєсЕСдсква 3060 гдЕсваєсса ЄдесССсСасаєд ЕєЄЧдаєсадсс ЄЕДдФЕЄєвадее асеаасаєде дсассддаєс 3120 дадЕЕСсСЕСУдс адасдасдса ссассдссудс сассудссуєс дадсудадаад ссудеЕсдЕссс 3180 сдссдссусєс ссаддассас дасддсдссдуд ссссссдсудс сааддссодсд сссдсссадд 3240 сддссассес сасдсєссдсд сссдссудссуд ссдссассдс сссдссудсессс саддсдессдс 3300 асЕссдссудс дсссасуддсуд ссудеЕссаауд| судссьессЕе СсЕЕСДЕСЬСсССсС асддссаврдс

ЕсддссеЕСсСва саєсаєссеєс ЕдадеЕсдсдс дссудассссу судададассу ЄддЕсСсдеЕсс 3420 адеЕсдсадеа дадеададсу сЕсСуєсуєЄєсе сусеЕссуєееЕ суєдссвеЕдЕС дссдєєсСдад 3480 чдЕссСУУЄсЕсСеЕ дсудєдсадес сддеЕсдаада адссоддеЕд9дд ЕЄсЕЧадсас ЄадеЕддеадес 3540 адеЕадсадса дсксассуресеЕ сеЕдессудсеЕсС дргасуєдеЕеє дсдЕддеЕсдс ддадаасаатс- 3600

ЕаасєддаЧчвд ЄЕєдсдадес сЕСЕдЕєЄаа даєдаассас єдаєдставдд єдаєсдаєс 3З66о асєсддсєаєда єсєЧдааєдда аагддаєсаа ЧФЕСЄЕЄДДСсСУЧЄЕ сЕДСЕЧЯЧаєда ЕДдЕеЕЧчаєссає 3720

ЕєсддаєсєдеЕ дЕЧ9ДДДДСВаас адЕесЕсусьє дусЕЕеЕвЕдсЕС Едсдаєдаас даардсеЕесь 3780

Едсаєдсаєс ЄЕсудссЕєєдс Есааєссддаа сЕдсадаасу даєсдсадсас Єдаєєсесьдс 3840

Есаєдаєдед асчдасєєсууєс деасдсаєає саєсеєЕсьеєса аарєвєдедта дсадсЕдеее 3900

Зо деадсеЕеЕсса ЄЕСЕЯДСсСсаєсд дасдаагдсс ЄДдЕЕЕЕеЕєсас ддадаассудс дсодсооддадас 3960 счаєдсддсєс ЕсдЕдЕсдсесс асдеЕсдеЕссс ссасдссадд асаааасада Єддасдсоадес 4020

ЕсЄдаєсссса аєсссассає сассаєдееєс суддададсса саєддаасес асдеЕсаадсд дово дЕсасЕсеєеєс дсадааєсас ЕСЕсассаує гсасссЕвсс дссддаваасся сЕСЕССЕСаЄ 4140 ссссаааадс Єдаєдсааса деЕдссаєсдсд сдсссассса ЄдсЕссссса сасдаєсдса 4200 ааасєєсддає счареєеєвсаєс єеЕЕєЧдаассс єаадеЕСсСуддеД| Еєасааєсьтьу ЕеЕєДдсавєдее 4260 гаєгєдеЕсєссес дсддсудадда ссаєтаааса адасвєастає єддавававьеє єсдасададсье 4320

ЕЄдаааєссдд аасес 4335 «2105 10

«2115» 241 «2125 ДНК «2135 Ногдецт упідаге 2205 «221» варіація «2225 (121)..(121) «223» аабос «4005 10

БсЕсасадса дсаасаасаа саасаааасс саадесасса деЕаададсеє асасдсадсс бо

Едадоддсдодд сасдасасаа асддудаєбаєсаа ддЕєдасасуд басаєссаас асадддсааа 120 шаадеЕєссдє єЕСяЗадудудудЕ сдсдадсссу дадеЕєссасс дседдааєсу деЕсааєссод 180

Бсссдсасас асасадссуде гасасеєдссеЕ асааасааде Еєаадддаєа саєасасасье 240 9 241 «2105 11 «2115 274

Зо «2125 ДНК «213» Тгібсїсцт аевсіхмит 2205 «221» варіація «2225 (34)..(34) «223» с (Спгів) або Є (сі1іадіцв) 2205 «221» варіація «2225 (54)..(54) «223» 9 (СпПгів) або Є (с1і1адіцв) 2205 «221» варіація «2225 (83)..(83) «2235 Б (Спгів) або с (сі1адіцв) 2205 «221» варіація «2225 (130)..(130) «223» 9 (Спгів) або а (с1і1адіцв) 2205 «221» варіація «2225 (165)..(165)

«223» а (Спгів) або дар (с1адіцв) «221» варіація «2225 (174)..(174) «223» а (Спгів) або Є (сіадіцв а 173) 2205 «221» варіація «2225 (186)..(186) «223» Є (Спгів) або уд (сіадіцв аг 185) 2205 «221» варіація «2225 (253)..(253) «2235 Б (Спгів) або с (сіадіцв а 252) «4005 11 асєдаєддаєд дасддаєдає усєстЕдеЕдуає дсесуєднаєсє гасаьЕссдеЕє даукссьсд бо асасадддаєд агаєдеЕСЕсс ааудеаєста ЄвМвавєеєеєесеЕсд еЕЄЕДЕеЕЄССВЕУЧ ЕЕЧДЕєатави 120 ассаєссєче асдесеЕсвсаса ассаєєсєсстаєс ааєсаєєсста гассассєєє єЄдеЕсасеаась 180 стаєєскасає адеЕдссааде дстадуЕеЕєЕуєс луеЕссЕеЕСЕДЧСЕ ЄДЕЄЕЕевас аєсдсаддаа 240

Зо аєссаасасса аауддадесс ааасудсадса ааас 274 «2105 12 «2115 273 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 12 аєчаєддаєд дасоддаєдає сЕСЕдкодЕ ДссСЕєЄДЧраєє гавгавЕєвдее дадееЕсеЕввд бо асасаддаєд агаєдеЕСЕСсс аасдраєста ЄвМвавєеєвесеЕсд єєДДЕеЕЄССВЕУЧ ЕЕЧДЕєатави 120 ассавЕєсеЕєсєдда аєгєдеЕсеЕсаса аєсавреєеєсає аассареєста рас дЕєасваасс 180

Баєєдасава дЕдссаадед сстадчЕеЕСУЧєсу ЄсЕеЕЄСсСЕуЧсСЕЄ дЕсЕеЕсСсаса Есодсаддааа 240

Есаагассаа асддадессса аасдсадсаа аас 273

«2105 13 «2115 274 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 13 аєчаєддаєд дасддаєдає сЕСЕдеоудЕ десссЕДваєє гавгавЕєвдее дадуудеЕсеЕвдчи бо асасаддаєд агсасдЕсеєсс аасдраєста Єаасєсєтєєс9 єсдЯєєссаєу ЄЄЧЕсСатваєс 120 ассарєсеєсдуда аєгєдеЕсеЕсаса аєсавреєеєсає ааєссареєста гарсавєтєєЕвєЕ вєдеЕаасеаас 180 стаєссасає адсдссааде дссаддессдсес ддЕссссстдсесе сдЕсссссас ассдсаддаа 240 аєссаасасса ааєддадесс ааасудсадса ааас 274 «2105 14 «211» 415 «2125 ДНК «213» Аеді1орвз 5ре1гоїіде5з «4005 14 ассаддссес ссдассссас судєдадсаєд сдсЕєсдсудЕ дсасуддсуддс ассасеЕссдс

Зо бо басудссссу дссссеЕсеесс ЕссСсСЕссСЕССсС дасаасуссу ссЕссеЕсує ЕЕДЕЕСЕЕсСЕ 120

З5 ЕсдЕСЄСсСодода ЕсСсСсаєсвас ааддадстад стадссадсуд сдаєєссастуд ассеЕСТтадсе 180 чдадаваддддє асаассудрас аадсаєддад сссудадсЕеє гадсдасдєд соддддасоадЕд 240 дсссЕСЕССсСЕ доддадсадда дссудддадаєЯа єссааддада дсссуддсддс сдаддсдад 3З0о аадсссессуд деЕддааддас дссуддасадс ассаддаадд ЄддаддеЕдса дасддасадада 3З6о сЕдсЕсдеЕдс ссссессасс дддадддессс ддадсдссдеє сЕСЕДдДЕсСдсс доаєда 415 «2105 15 «2115» 281 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт

«221» варіація «2225 (224)..(224) «2235 Б (Спгів) або а (сі1іадіцв) 2205 «221» варіація «2225 (229)..(229) «223» с (Спгів) або а (сі1іадіцв) 2205 «221» варіація «2225 (253)..(253) «223» а (Спгів) або с (сі1адіцв) «4005 15

Есаагадеде єссдсссвдс дЕддсасада ссудраасуаа єдаєєдеасуд аасдєсеЕвес бо асєтааєсаєсє асасаддєдЕ оддЕсЕаадаа аааабсаасс асстгаасудс сдеЕааєссссс 120

Есвгасадаає аассасасаа деЕсаєдаааа ддаастаєса асаааааєад аєдаєаааатє- 180 аааєсєсааа Єссаааєєса гааадсассеє стадеЕсвєаєа аасчисудаста аєстадстає 240 дЕЕсадвасе єЄстЕССЯВЕС саааарасьє дссууєЄєдєвеьв

Зо 281 «2105 16 «2115» 281 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 16

Есаагадеде єссдсссвдс дЕддсасада ссудраасуаа єдаєєдеасуд аасдєсеЕвес бо асеааєсаєсє асагаддєдЕ ддаЕсваадаа ааааєсаасс ассеЕкраасудс сдеаарсссс 120

Есгасадаасє аассасасаа дссаєдаааа ддаастаєса асааавгаєад аєчаєсаааає 180 аааєсєсааа Єссаааєєса гааадсассеє стадеЕсваєа аасасудасаа аєстадстає 240 дЕЕсадвасе єссЕССЯБЕС саааарасьє дссууєЄєдєвеьв1 281 «2105 17 «2115» 281

«2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 17

Есааєгадедс Ессдсссвдс дсддсасада ссуєаасудаа Едасєєдсасу аасуєєствесс бо асеааєсаєсє асагаддєдЕ ддаЕсваадаа ааааєсаасс ассеЕкраасудс сдеаарсссс 120

Есвгасадаає аассасасаа деЕсаєдаааа ддаастаєса асаааааєад аєдаєаааатє- 180 аааєсєсааа Єссаааєєса гааадсассеє стадеЕсвєаєа аасеЕсдасса аєстадстає 240 дЕЕсадвасе єсаєссуреєс саааарасьє дссууєЄдууєве сх 281 2105 18 «2115 199 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт 2205 «221» варіація «2225 (101)..(«101) «223» Б (с1адіцв) або с (СпПгів) «4005 18 асдсесаєдд Єдсасудсдудас дадаадеддс сададасаає ссеЕєдассає даєсддаатєаа бо гаєддсеЕсудд дчдаєсеЕдаає гассуддасад судасеЕсеЕСсСста усудсеєСстЧдеу ааддсеЕввдад 120

ЕсЄдадаєдса сааєсддааа сааєєдеЕєдуда ааааадаєса дсЕєСсСдтава дадсаааддає 180

ЕєсддЕСОДдДЧ є аєссоасо9яу 199 «2105 19 «2115 199 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 19 асдсесаєдд Єдсасудсдудас дадаадеддс сададасаає ссеЕєдассає даєсддаатєаа бо

Баєдодсссод дчасєєсєддаає гассодасад судсеєсєЕсста ЕСдсеЕСЄОЯЮтУЧд ааадсесевдд 120

ЕсЄдадаєдса сааєсддааа сааєєдеЕєдуда ааааадаєса дсЕєСсСдтава дадсаааддає

ЕєдЯдЕСЯОЯЧЧЯЄ асєсдадсооад 199 «2105 20 «2115 199 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 щ 20 асдсЕсаєдд Єдсасдсдас дадаадсдудс сададасаає ссеЕсдассає даєсдааєаа бо гаєддсеЕсудд дчдаєсеЕдаає гассуддасад суусеЕсєеЕсста ссудсеЕСЕЧвУЧ ааудсеЕевад 120

ЕсЄдадаєдса сааєсддааа сааєєдеЕєдуда ааааадаєса дсЕєСсСдтава дадсаааддає 180

ЕєсддЕСОДдДЧ є аєссоасо9яу 199 «2105 21 «2115» 198

Зо «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт 2205 «221» варіація «2225 (101)..(«101) «223» а (сі1іадіцв) або уд (Спгів) 2205 «221» варіація «2225 (165)..(165) «223» с (с01адіцв) або Є (Спгів) «4005 чРЯ21

Баєаєдааєс аддсЕсвдсд дассоддаадс асаасдссаа сЕсдсссоддЕ дДдЕЕССЕЄДдсас бо гдссдсеЕсЄда дассеєеєдаєд єдсааадева Єдаасаєаєс гудсдеааста додааадеда 120 асаєдсаєаа сбасрадсааа саадеЕсадає єаддсврааає сдсдукаєвеЕ єссддеЕдадсес 180

Едддаєвеєсс єддссадие 198

«2105 Д .722 «2115» 198 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 Дщ 222 гагаєдааєс аддасеЕеЕсдсуд дассудааде асаасудссаа СЕБДСЕБУЧЧЕ ДЕЄєССЕДсСас бо гдссдсеЕсЄда дассеєеєдаєд єдсааадева Єдаасаєаєс адсдеааста додааадеда 120 асаєдсаєаа сбасрадсааа саадеЕсадає єаддсрааає сдсдстаєвеЕ єССсддеЕдадсес 180

Едддаєвеєсс єддссадие 198 «2105 223 «2115» 198 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 Б2Е23 гагаєдааєс аддасеЕеЕсдсуд дассудааде асаасудссаа СЕБДСЕБУЧЧЕ ДЕЄєССЕДсСас бо

Зо гдсЕЧдссєЧа дассеЕєсєдаєд єдсааадеса Єдаасаваєс ддсдсааста додчааадеда 120 асаєдсаєаа сбасрадсааа саадеЕсадає єаддсрааає сдсдеєваєвеЕ єСсСсддеЕДдадс 180

Едддаєвеєсс єддссадие 198 «2105 24 «2115 58 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт 2205 «221» варіація «2225 (22)..(22) «2235 Б (Спгів) або с (сі1адіцв) «4005 4 аєсдесддассе Єддсаадаєє гуаєаєдсає єеЕєЄЧдададаа аєадаадеєаа ЄДЧЕЧЗсЗаєвд 58 «2105 25

«2115 56 «2125 ДНК «213» Тгібсїсцт аевсіхмит 2205 «221» варіація «2225 (27)..(27) «223» 9 (Спгів) або а (с1і1адіцв) «4005 .25 чЧчЕСЕЄєЧдддЕ Євасеєеєєдад єсаєадгада адссагаста гааададдудд ДЯЕБДсСЕ 56 «2105 26 «2115 53 «2125 ДНК «213» Тгібсїсцт аевсіхмит 2205 «221» варіація «2225 (31)..(31) «223» Є (Спгів) або д (с1і1адіцв) «4005 26 асЕеЕЧдаєвєдиу асЕсЕсЕеддс єадсаасаає КдосааєдасеЕ Едасааддда аад 53

Зо «2105 27 «2115 50 «2125 ДНК «213» Тгібсїсцт аевсіхмит 2205 «221» варіація «2225 (30)..(30) «223» 9 (Спгів) або с (с1і1адіцв) «4005 27 сЕсдссєсдуа ссасадддеЕс сЕСсдЕдадв ааддаааадда ссдаддаддас «2105 28 «2115 1:59 50 «2125 ДНК «213» Тгібсїсцт аевсіхмит 2205 «221» варіація «2225 (38)..(38)

«223» а (Спгів) або д (с1і1адіцв) «4005 28 саасдссаєс ссеЕсаааасуд дасасасстає ссаєссдгда адсаєдеЕєсєсу дасєдЕдсс 59 «2105 29 «2115 39 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт 2205 «221» варіація «2225 (20)..(20) «223» а (Спгів) або с (с1і1адіцв) «4005 29 сЕСсдссдссуд ссгдсудаадг басусєдесс десессосс 39 «2105 30 «211» 1618 «2125 ДНК «2135 йеа шаувз

Зо 2205 «2215 СсОр5 «2225 (108)..(1430) «4005 30

З5 дддсасдадсс додсдадссса сссддсадсс ддсасаасса сасасассіс сасссасеЕсе бо сЕдадаєсаад Єдаадсаєсс сдсдсассдс сдсадссдса дасддад асд асд аад 116

Меє Меє Гуз 1 сас ссд адс адс СЄСд бдс сс ссс сс сесс ссд дсд сс сбдс асс асс 164

Нів бек бек Бек Тец Сув Гей тей Рпе Гей тей АтТа Гей Сув ТПг тТаг 9) 10 15 срд сбд дсс бдс ддс ссд дос сад дса саа дос ссс ссс сад дод се 212

Тїецп Гецп Аїа Сув с1у Гецш Уаі сбіп Аїа сіп Уаії тей Рпе сіп сб1у РПе 20 25 Зо 35 аас ду дад су Едс аад сад сад ода дас да бас аас адда сеЕс аад 260

Авп о Тгр бій Бек Сув Гув біп сбіп сіу б1у Тер Туг Авп Агу Геч Гув 40 45 50 6б дсс осад дес дас дас аєс дсс аад дсс ддс дес асуд сас деЕС ду сеЕд 308

Аїа сбіп Уаї Авр Авр І1е АТа туз Аїа сіу Уаї ТПг Нівз Уаї Тер ей 55 бо 65 сс сса ссс оссд сас ссс дес о ссуд сса саа ддс бас асд сса ддс сдс 356

Рго Рго Рго Бек Нів бек Уаі1ї бек Рго сіп с1у Тук Меє Рго с1у Агд 7о 75 80 ста бас дас ссд дас дсд сс аад бас ддс асуд дсуд дсуд дад сесс аад 404

Тецп Тут Авр теп Авр Аїа бег Куб Тук сіу ТПпг Аза АзТа сіц Іецч Гув 85 90 95

Есс сєбуд аса дсуд дсу БЕсС сас ддс адда ддс деЕд сад єдс деЕд о дсу дас 452 зек Ттец І1ї1е Атїа АтТа Рпе Ні сіу Акуд сіу Уаї сбіп Сув Уаї Атїа Авр 100 105 110 115 асс дес аєс аас сас суд єдс дсу даа аад аад дас дсуд сс дос дЕд 500

І1е Уаї І1ї1е Авп Ні Агуд Сув АТа сіц Гуз пув Авр Аїа Агуд с1у Уаї 120 125 130

Бас гдс аєс сс дад ддс доадоасеЕ ссс одас дас сдс сед дас ду дос 548

Тук Сув І1е Рпе сбіц сіу сіу ТПг Рго АвБр Авр Агуд ТІецй Авр Тер о1У

Зо 135 140 145 ссс ддд аєд асєс сбдс адс дас дас асд сад бас ссд дас дд9 асд 999 596

Рго сіу Меє Іїе Сув бБег АвБр АвБр ТПг о біп Ту бег АвБр с1у ТПгЕ с1У 150 155 160 сас судс дас асуд ддс дад дод сс о дсуд дсу дсу ссс о дас ас дас сас 644

Нів Агд Ар ТК сіу бі с1у Рбе АТїа АТа АТа Рго Авр І1е Авр Нівз 165 170 175 сЕсС аас ссд сдс десд сад сдуд дад сс сс о дсс бдуа сс аас сда сес 692

Тецп Авп Рго Агуд Уаї біп Агуд бі Гец бек Аїа Тгр тей Авп Тгр Іей 180 185 190 195 адд сс дас дсс дЕуд дод вес дас ддс ду сус сеЕс дас БЕС дсс аад 740

Агуд бег АвБр Аїа Уаі сі1іу Рпе Авр сіу Тгр Агд Гей Авр Рпе Аза Гуз 200 205 210 дас Бас су ссуд дсс дес дсс ада аєд бас деЕд дадоадс ас доад ссд 788 сіу Тук Бек Рго Аза Уаі! Аза Акуд Меє Тут Уаії сі бек ТПг с1у Рго 215 220 225 ссд адс ССС дес дес дсуд дад аса сду аас сс ссд адс бас адс 9д9ад

Рго Бек Рпе Уа! Уаі Аїа сіп І1ї1е Тгр Азп бек Іецй бег Туг бек с01У 230 235 240

Час ддс аад ссуд дсу ссс оаас сад дас сад Єдс суду сад дад ссд ст 884

Авр сб1у пув Рго Аїа Рго Авп о біп Авр о сбіп Сув Акуд сіп сій Гей Іец 245 250 255 час ду асуд судуд дсс дес ддс додад оссс одсс о аєддсовесдас вес сесес 932

Авр ТЕр ТПг Агу Азїа Уаі1і с1у сб1іу Рго Аїа Меєсє Аїа Рпе Авр Рпе Рго 260 265 270 275 асс аад ддс суд суд сад дсуд додс до сад д99 дад со 99 сод сед 980

ТПпЕ пув с1у Ге їец сіп Аїа сіу Уаі сіп сі1у сі тей Тгр Аг Іецй 280 285 290 сдс дас адс сс ддс аас дсуд дсс о ддс ссрд ас ддд сда дсд ссс дад 1028

Агуд Авр о бБег бек сіу АвБп Аза Аза сіу Іецп Іїе сС1у Тгр Аїа Рго сі1ц 295 3З0о 305 аад дсс дес асс Ес дЕС дас аас сає дас асс ддд суд асуд сад аад 1076 ув Ата Уаї ТпПг Рре Уаї Авр Авп Нів Авр ТПг біу бек ТК с1іп Гув 310 315 320

Зо сЕС бдд сс ССС о сса сс дас аад дес асд сад ддс бас дсс бас аєсс 1124

ТГецп Тер Рго Рпе Рго бек Авр ув Уа! Меє сіп с1у Ту Аїа Туг Ше 325 330 335 сс асс о сає сса дда дсс ссс бдс ас ссс осас дас сас асд ССС дас 1172 теп ТПг Нів Рго сіу Уа1ї Рго Сув Іїе Рпе Тук Авр Нів Меє Рпе Авр 340 345 350 355 ду аас ссуд аад осаддадоавса вссасу сед СЕ дсс аєс адда дсуд с9д 1220

ТЕр Авп Гецп пув сіп бі Іїе бег ТПг Гей б5Бег Аза Іїе Агуд Аїа Аг4д 3З6о 365 370 аас ддс аєс сдс дсс дод оадс аад суд судд аєс сеЕс дЕеЕд дсу дас дсд 1268

АБп о біу І1ї1е Агу Азїа сіу бек Ггув Іец Агуд Іїе Гей Уаі Аза Азр Аза 375 380 385 час дсуд Бас деуд дсс дес дЕС дас дад аад дес аєдав едааддоаєс о 4ад 1316

Авр Аїа Тук Уаії Аїа Уа1ї Уа1ї Авр сіцп ув Уаї Меє Уаі уз ІШе щу 390 395 до аса адд бас ддс деЕд адс адс дЕеЕд деЕСсС ссуд су дає вес сас сс дсд

ТК Агуд Тук с1у Уаї бек Бек Уаї Уаї Рко бек Авр Рпе Нів Рго А1а 405 410 415 дсуд сас ддс аад дас бас гдс дЕС ду дадоааа дсуд адс сес сдс дес 1412

Аїа Нівз сі1у ув Авр Тук Сув Уа1ії Тер сіцп пув АТа бек Гей Агуд Уа1ї 420 425 430 435 ссд дсд ддд сдс сас сс бадсадссса дасєсдсссад ЄСсСЕсдеЕдсд 1460

Рго Аїа С1у Агу Ні Іец 440 саєсдсааас асадсадсас дасассдсає аасусссссс ссеЕсвасєсєсєс ссдааєссса 1520 сСсСЕссессста деЕссаасєєсс асасаєсдсає сєсссасаєсдс асасассаєс асааєссадає 1580 ааасааасаа дсЕгддЕСсСаа аааааааааа аааааааа 1618 «2105 31 «2115» 441 «212» Білок «2135 йеа шаувз

Зо «4005 31

Меє Меє пув Нів бек бек бек Іец Сув Гецп ІТецп РпПе Іецй Гей А1Та Гей 1 9) 10 15

Сув ТПпЕ ТПпг Іецп тїец Аїа Сув сіу Гец Уаі сіп Аїа сіп Уаї Іеч РПе 20 25 Зо сіп с1у Рпе Азп Тер біц бек Сув Гув біп сіп с1у с1у Тер Тук Авп 35 40 45

Агд теп їув Аїа сСіп Уаії Авр Авр І1е АТа Гуз Аїа с1у Уаї ТПг Ні бо уа1ї Тер гецп Рго Рго Рго Бек Нів Бек Уа1 бек Рго сіп сС1у Туг Меє 50 65 7о 75 80

Рго с1у Агуд Те Туг Авр Гей Авр Аза бек туз Туг с1у ТПг Аїа Аїа 85 90 95 55 сі гец їув бек Тец І1ї1е Атїа АТа Рпе Ні сіу Акд с1іу Уаї с1іп Сув 100 105 110

УуУаї Аїа Авр І1е Уаї І1їе Авп Нів Агуд Сув Аїа сій пув Тув Авр А1а 115 120 125

Агуд сб1і1у Уаії Тук Сув І1е Рпе сбіц сіу сіу ТПг Рго АБр Авр Агу Іецй 130 135 140

Авр ТЕр біу Рго сіу Меє Іїе Сув Бек АвБр АвБр ТПг сіп Тук бБег Авр 145 150 155 160 сіу ТП сі1у Ніз Агуд Авр Тпг с1у сіц с1у Рпе Аза АТа А1Та Рго Авр 165 170 175

І1е Авр Нів Гей Авп Рго Агуд Уаї сіп Акд сій Іец бек АТа Тгр Іец 180 185 190

Авп о Тгр Гей Агуд бек Авр Аїа Уаї сіу Рпе Авр сі1у Тгр Аг Гецп Авр 195 200 205

Рпе Аза гув сіу Туг бек Рго Аїа Уаі Аза Агуд Меє Туг Уаї сіц б5ег 0) 210 215 220

ТПпЕ с1у Рго Рго бек Рпе Уа! Уаії Аїа сіп І1е Тгр Авзп бБег Іец бег 225 230 235 240

Тук Бек с1у Авр с1у Гув Рго Аза Рго АБп о сіп Авр біп Сув Агд сіп 245 250 255 сі Гецп Гей Азр Тер ТПйг Агуд Аза Уаї сіу с1у Рго Аїа Меє Аїа РПе 260 265 270

Авр Рпе Рго ТПг туз с1у Гецп Те біп Аїа сіу Уаі Сіп с1іу січ Іей 275 280 285

ТЕр Акуд Гей Агуд Авр о бег бег С1у АБп Аїа Аза с1у теп Іїе сС1іу Тгр 290 295 300

Аїа Рго сіц ув АТа Уа1ї ТПг Рре Уаї Авр Авп Нів Авр ТПг сСі1у бег 305 310 315 320

ТПпЕ сіп пув Гей Тер Рго РпПе Рго бБег АвБр Пувз Уаі1і Меє сіп с1у Туг 325 330 335

АТїТа Тук І1їе їец ТПг Ні Ркго сСіу Уаї Рго Сув І1їе Рпе Туг Авр Ні 340 345 350

Меєсє Рпе АвБр Тгр Азп Гецп туз біп сбіц Іїе бек ТПг Гей бек Аза Ше 355 З6о 365

Агуд Аза Агуд Ап осіу І1е Агуд Аза сіу бек Кпув Гей Агу І1е Гей Уаї 370 375 380

Аза АБр Аїа АвБр Аїа Тук Уаї Аїа Уаї Уаі АвБр біцп пувз Уаі1 Меє Уаї 385 390 395 400 пув І1е с1у ТПпг Агуд Тугк сбіу Уаї бек бБет Уаії Уаі1і Рго Бек Авр РПе 405 410 415

Нів Рго Аїа АТа Нів сС1у Ппув Авр Тук Сув Уа1і Тер с1п ув АтТа б5Бег 420 425 430 теп Акуд Уаї Рго Аїа С1у Агу Нівз Іец

Зо 435 440 «2105 32 «2115 55 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «2205 «221» варіація «222» (30)..(30) «223» с (с01адіцв) або а (СпПгів) «4005 32 ассасаєєсдс асаадеєЕєаає адсссддбат Єдоддєааєса ссЕссуддасяе сЕсса 55 «2105 33 «2115 651 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «2205 «221» варіація

«2225 (27)..(27) «223» а (сі1адіцв) або Є (Спгів) «4005 33

ЕдФЕЕЕССЧЧСЕ дсЕсдсЕСЄ сЕсаєамтаає даєааєчаса єдсдсдааєу дЕСЕДдЕєсає бо 9 61 «2105 34 «2115 45 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 2205 «223» Амплікон фланкуючого маркера «4005 34 чЧФЯаЕСсЕЄсСссЕ адсадедеЕда ддгдаасдсс Есаєсссась сдсеЕс 45 «2105 35 «2115» 6561 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність

Зо 2205 «223» Амплікон фланкуючого маркера 007-0011.1 «4005 35 чдеасасасва деаааєсаає ааддесудаєс сгааадаєадд ааагаєассе даадеЕддедс бо с 61 «2105 36 «2115 44 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність 2205 «223» амплікон «4005 36 дасстаааає Есдадсссда аддеЕєдгодсс доадсЕєдоаадс ЕсЄда 44 «2105 37 «2115 79 «2125 ДНК

«2135 Штучна послідовність «223» амплікон «4005 37

ЕсаєєсеЕдаа ЄЕссааааєє суддааасуда амчмадсЕсєеЕсеЕ содсаєсссуа ддасддаддадсдад бо

Есасоддсдс сададдадс 79 «2105 38 «2115 196 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 38

ЕдЕСЯОссУУсЄ содаддаєєсдє ЕссЕддсдєдс адеЕссддесу аадаадссод ЄдадЕсЕеЕвда бо деасврадесдда Єадеадсадс адсадстаєс дЕсЕСЕДдЕСС дсЕСЯвасУує ДЯФЕЄЕДСсЯ 99 120

Есдсуддадаа сааєєаанєсу дзчЕЧдЧеЕесвдсоу адеЕссеЕсьдоа єєаадаєдаа ссаседаєдес 180 гаєгєдедаєсу аєсдає

Зо 196 «2105 39 «2115 228 «212» Білок «213» Вгаспуродіцт дізбаспуоп «4005 39 Меєс сій Агуд бек Нів Ні Іец Іец Гей Уаї Іец сС1у Тїец Іецй АТа Аї1а 1 9) 10 15

Тецп Гей Рго Аза Аза Аїа Аза ТПг Рпе сіу ТПпг ТПпг біп Рго сбіц Рго 20 25 Зо сіу Аїа Рго Сув бі Рго ТПг Тецп Гец Аїа ТПпг о біп Уаї бек Іеч РПе 35 40 45

Сув Аїа Рго Азр Меє Рго ТПг Аза біп Сув Сув бі. Рго Уаї Уаї Аза 50 55 бо зек Уаії Авр Іецп сіу біу сіу Уаї Рго Сув Іїевц Сув Агуд Уаі Аїа Аїа

65 70 75 80 бі Рго біп Гец Уаї Меє АтТїа сі1у Гец Авп АТїа ТПг Нів тей Гей ТПг 85 90 95 теп Тук ТПг бек Сув С1у сі1у теп Агу Рго с1у бі1у АТа Нів Іец А1а 100 105 110

Аза Аїа Сув сі с1іу Рго Аза Рго Рго Аіїа Аїа Уаії Уаії бек Аза Рго 115 120 125

Рго Рго бек АТїа АТа Рго Агуд Агуд Туз сСіп Рго Аїа Нів с1п АїТа Рго 130 135 140

Рго Рго Рго Рго бек ТПг бій Ппув Рго бек Рго Рго Рго біп біп Авр 145 150 155 160

Авзп оУаї ТПг АтТа Нів сі1у Ппув АТїа І1е Рго ТПг Нів Аза Аїа ТПг 5ег 165 170 175

Рго теп АТа Рго Аїа Аїа бек Меє І1їе Нів Меє бБег Рго Рго Рго Аї1а 180 185 190

Зо

Сув Авп Рго Сув бек Ссіу бБег Аїа Аїа бБег бБег Аза сбіц с1іу Рго Іецй 195 200 205

Теп Іїе Аза Аза Іецй Іїецй Іецп Уаі! Іїе ТПпг Аза І1е Іе Уаї сС1у ТПг 210 215 220

Геч Авр Авр Гув 225 «2105 40 «2115» 228 «212» Білок «213» Огула забіуа «4005 40

Меє с1п Агу бек Нів Іец АТїа Уаї теп їец С1у Гец Іеш Аїа Рпе Аї1а 1 5 10 15

Аза сі1у Уаі Рго Аза Аїа Аїа Аза Аза ТПг Аїа Уаі бій с1у Аза сіп 20 25 Зо

Аза Аїа ТПг Аза сій Аза бек Сув бі Рго бег Іїе Гей Аїа ТПпг сіп 35 40 45

Уаї бБек теп Рпе Сув Аза Рго Авр Меє Рго ТПг Аїа сіп Сув Сув с1ц 50 55 бо

Рго Уаії Уаії Аїа бек Уаі АвБр Гей сіу сіу сіу Уаї Рго Сув Іецч Сув 65 70 75 80

Ак Уаі Аїа Аза бій Рго сіп теп Іїе Іїе Бек с1іу Гей АБп Аїа ТПг 85 90 95

Нів теп гец ТПг Гей Туг Аїа Атїа Сув сіу сС1у Гец Акд Рго б1у С0Щ1У 100 105 110

Аза Агд Тецп Аїа Азїа Аза Сув бід сіу Рго Аїа Рго Рго Аїа бек Ше 115 120 125

Уаії Тпг АТа Рго Рго Рго Рго Уаі Аза Рпе Агуд Агуд Гув Рго Рго Аїа 130 135 140

Зо

Агуд бі Аза Рго Рго Рго Рго Рго Аіїа Аїа біцп пуб Гецп бек Рго Рго 145 150 155 160

З5 Рго біп сіп Нів Авр Авр бег Авр Ні Авп о Тув Агуд Уаї С1у Рго Іец 165 170 175

Рго Агуд біу бек Рго Рго Рго Тут Аїа біп бек Уаі! Рго Уаї с1у Рго 180 185 190

Аза Аза Аза Рго Рго Рго Рго Агуд бек сіу Аїа бек бБетг бБег Ге сіп 195 200 205

Аза Рго Гей Аїа Аза ТПг ТПг ТПпг чІ1їе Уаі! Аїа Іїе ТпПг Гец І1е Аїа 210 215 220

Аза Аїа сіп Туг 225 «2105 41 «2115 902

«2125 ДНК «2135 Ногдецт упідаге «4005 41 сдсасаєсаа сасааассса ссадаєдодда аєааєсддає сграсдаадда сасаааасес бо

ЕсЕааєссса Єдасаасусс адаададсаа дадеааакає ареєсеЕсаєаа аааасааєда 120 асасрадаєд аєдасудаада асаєаадавєє сеЕссааддад аааєєдсддс адсоодадаєд 180 дсадссуддад дсдадддддас сааааасеєсеЕ дЕєЄдсддсда, садсуддеадс сЕєддеЕдааа 240 сссасасдеєс Єдсасассає асаадссдеЕс сдсаадддасс асаєсдддсесс сдсєсєссс9аєсд 3З0о ааагаадаадд Єсасасаєдд ЧдЕсСЕгддЕСС сдЕДсаааас даааддесад садеЕссаєдд 3З6о дссддаддаа ааассудддса асаасасдудсс аЕєдеЕдеЕдеЕЕЕ Есдсдддаас ссааєессда 420 ааєсасесас сдуддсассесуд Есссудардсс єЕССсСадаасу БЕСвасууєдс єЕССасад9ад 480 ссадсссадс сдсдддаєса даєсєсаддаєс адсасдааса сЄсдаадссад сдсддсдаєса

Зо 540

БЕЕсЕеЕССсСсСад ссеЕсСсудссесС дсЕСЧЬасдас єЄдсаєвесає єєсЧдааааса ааааааадад бо

З5 СсЕвЕссЕсСссЕ сесаєсссуда дсодссададд адсассадаа аддссассса сссасссеса бе сдеассдссс ссдсасссдс дсддссасає ссдддссдсс сасссдддса дседдссдее 720 ссаєссссда ассдасдддс аддаєсдадс дадсддсдсд сссасддсесс сеЕссддстає 780 асаасссдсс асссасасса сеЕссссЕссу дсдЕєссасс ададссьєсс ЕсссеЕссасс 840 дсассассас сассассудсуд ссааааассс гадддадсда дсдадсеЕсас сеЕсдссссдс 900 сс 902 «2105 42 «2115» 4504 «2125 ДНК

«213» Огула забіуа «2215 екзон «2225 (1001)..(1363) 2205 «2215 екзон «2225 (3093)..(3164) 2205 «2215 екзон «2225 (3253)..(3505) «4005 427 чЧаасадедса сеЕддеЕЕддда гаасаадаад ЄвРадаааєєд ддсаєаєава єадааддоадеа бо адасассеєсс аасддаєадда дсдчдасааєс саєсааачає дчастассєсу дсассеЕсьда 120 дассдєЕдаса адерєдсстає сеЕесдсассс єЕСасаадед асеЕСсстасеЕ ЕДдЕЧСаєддУні 180 сдЕдадаєдЕЕ дадссддеєда ссЕсссссад аєсдсаааєссс сддсессссса саадсдасес 240 сЕсаєсєсдеєд асаддесссд сссссасадс сесаєссдса асддсесесста асссааєссд

Зо 3З0о

Есасадаєвта ааєсєсаєреєсає дасаадасас ЄЕєЄЧдасссає сагаддеєуда ЄЕЧДЕєЗаєде 3З6о

З5 Едаассдадда бадсуєодеЕд дсдасеЕссеЕЄ ЄдчаєєдеЕєда осодадЕеЕсоов ЄЕсСЕссаєса 420 сЕсддсадда адсаддаасс саадааддсс адаадсссас аассаєсаса ссдессддассе 480 саєсддсааа Єдддссадаа дсссададдс аассєдаєєсс аасадесдессуа даавассс9даесд 540 чаєдддссад адасуєсдсу єсСудеЕсеЕЕєсуда сеЕСЕєЄсСЧдаде дссеЕддсста соуддаєседса бо сдааєсссад адсаадсада ааасєсдсасба ссдЕсдсдса дадсдсадса савааєссдад бе

ЕСЯДСЕССССС сСЕСЄСЕссСудса дссааасєстс асседсеЕсас десдссудєдсЕ дсссддЕдєд 720 сададсссас дсдссасддс дссадсдсбас сбасассдаає сддсассаєс сассдссаса 780 дсЕДддссуддє ссссссгаауд асуддасудсес судаєсааєс сасдеЕєддса ЕддсЕЕсссс дсаєсєсдссвьс сЕССДСд ссс ссусесстаєає аасудддасусеЕс пвссуусеьеЕсесеЕ еЕсССсССсСсавєцтес 900 дФЕСЕЕСсСсСссСЕ ЄСсСЕСсададс сЕЕссЕсСЕса сададсасас асаааассся ададеадддаа 960 дсдадсдада дадададада дадададада дассасассс ад дад сдс сс сас 1015

Меє с1п Агу бек Нівз 1 9)

СЕС дсс дес ссд сс дудс сеЕсС сЕС дес СЕС дес дсс 9дду дес сс дес 1063

Тецп Аїа Уаї тей їец сіу Іецп Іїешп Аїа Рпе Аза Аза сі1у Уаї Рго Аза 10 15 20 дса дсд дсуд дсс оасс дсс десд дад дда дсуд сад дсуд дсс ас дсд дад 1111

Аза Аїа Аїа Аїа ТПпг Аза Уаії сбіц с1іу Аїа Ссбіп Аїа Аза ТПг Аза с1ц

Зо 35 25 чЧсд ЕсСуд Ббдс дад ссс о сбсс ас сс дсс о асс сад дос о ссу сеЕс СЕС гос 1159

Аа бек Сув біп Рго Бек Іїе їец Аїа ТПг біп Уаії бек Гей РПпе Сув

Зо дсд ссс одас аєд ссс оасс дсуд сад Єдс Бдс дад ссу дЕдд де дес о ссс 1207

Аза Рго АвБр Меє Рго ТПпг Аза сіп Сув Сув біц Рго Уаії Уаії Аза бег бо 65

З5 ЧдЕсС дас ссс додс дос дос да ссс о бдс сес дес сдс дес дес о дсс дад 1255

Уаі1ї Авр теп сіу сіу біу Уаї Рго Сув ТІецп Сув Агуд Уаі Аза Аїа сі1ц 7о 75 80 85 40 ссуд сад сс ас асс сс о дудс сес аас дсс о асс сас сс ссс асдуд сед 1303

Рго сіп теп Іїе І1е бек сіу Ггец Авп Аїа ТПг Ні Тецй Те ТПг Іецй 90 95 100 45 Бас дсс о дсс о гдс дда додс сс сус сс дда ддс дсс сус сеЕс дес о десс 1351

Тут Аїа Азїа Сув сіу сіу Іецй Агуд Рго сіу сіу Аза Агуд Іецп Аїа Аза 105 110 115 50 дес БєдЕ даа дудс асудбасаєдс асаассіссе ссЕссеЕсссс соссеЕсеЕсЕсС 1403

Аїа Сув бі с1У 120 55 ЕСЕСЕСЕСЕС СЕСЕСЕСЕСЕС ЕССЕСЕСССЕС ЄСЕСЕСЕСЕС ЕСЕСЕСССЕС ЕСЕСЕСЕСЕС 1463

ЕСЕСЕСЕСЕС ССЕСЕСЕССС ЕСЕСЕСЕСЕС ССЕСЕСЕСЕС ЕСЕСУОДЧЕЄЧТОД 9ОДЕЕДДСЕДСссС

ЕСОЯСУУЄСЕЕЕС ОЧФЕСОД4ДЕЄЕЄ ЕСЯєОЧОдЧЯєЄсУд додсдадаєсс ЕЄсСЧаддесос ЄС ЄЕсУ 1583

Еддсаєдсва ддсЕєссдаас дадеЕсдссудач сдеЕєдсЕдЕд єСЧдассаасе сеЕСдвавєдсе 1643

БбаєсЕсеЕсад сасаєдадсее еєсудаєссеЕсує євсвасеєсуд ЄєеєдеЕєЧвавуд стасеЕєсвда 1703 чаєсеЕЧдадес саєссаседс гааасєдаса Єсаєгадаєда адааєадсад суддасЧавев 1763

Есчаврсєеєсдда сЕССЕЕЕЄСсСЕС гдддаєдеєсу адседаєсеЕє деЕддЕеЕваєв сЕСДаадсесь 1823 счдааасудссєс дсдсасаєдс аадасєссадс аасдєасадча Єстасадчеод Еосссарасее 1883

Есасєсоуддає ЄЕЧ9ФЕЧ9ЧЄЕеСа ДЧФЕДЕЕсасуде дсдаадесас дсудеєєсчавьд єгЕЕсСсСУсСЕєд 1943 адсєссасає срагадсаса ааєсааєсає деЕдсдЕсєдсуд сдадеєсаад сЕСЧдададаа 2003 аадаааадса Єсааддссас ддаддауздеЕсЕвЕ доадссаддадае саеєдавєеєсьс ссЕгєдаасес

Зо 2063 сдаасасасс дадеЕссаєса ссЕсссдадс ддаєсєссдаєд ссдаассддс аддасессаава 2123

З5 асссасссує додасдаєсу ЕСсЕЕссСЕСсеЕСссС СЕсЕСУСЕСЕ ОсЧЄссССсСгд ЄЕСЕССЕВЕссС 2183 дЕдаааврсеЕс ЄдсуєЄєвсссс ЕЄСЕЧЧЕдсСЕ ЕДЕБаєадає давреєсеєдчдає сдадссуаєдие 2243 асдсеЕСдєдс адесддеасда сеЕгддсудаєд аасдеЕдсьєд суддадстаде сдсадеесає 2303

СЕБЕСЕСЕСЄ ЕСЕЕСССсссССсС ДЕСССЕССЕСсСсС ссдддсуєєєссьаєссєстаса ссосессстсас 2363

Есдссаєдса ЄдееЕсСарсєс ЕСЕССУЯЕДЕЄ ддеЕсСсЕСЯАЄЄ Еддадссдає єсдаассодаду 2423 садсасадєсуд сЕсесеЕЕССсСсСЕ 9ФЕЄЕССУЄЕЄЄ одчадаєсєссс асЕсєссоаєда аааддааадд 2483 дЕсаааєсуда арсдссссс даассаюрссеЕ ЕЄЕдсададсеЕ ЕЄЕЕЕгЧдддасу єЕЕССДСссСТЕЕ 25:43

Есдєсадада ссарсеєдсас гЕдсудсдеЕсєеЕс єССсСссаасес даєсчавреЕве дсадсевева ассасЕєвЕсєесє адааааадеЕеЕ єсвааєсасе сдеєсаєсає деЕдаврсЕСьЬє дсеЕСЕЗаєвд 2663 сасєсєсєсссс деаддаєсад сасесссаєсд сЕссссуєєє сдеЕсСсдеЕсса ассадссаад 2723 авасчдадеса деіасассеєсс аадаєдсаєд садаєєстааа ассддсасту сЕСЕЄТакєсе 2783

ЕЧФЕССЕЕДЧЕЄ ЄЕЄсДСВаусЕ ЕЄУОЧЕЄЧЧУЧЕЄ саааасерає сЕСЕЕСЕса дсавєєеєдссед 2843 сЕдЕдсасад ааваадссддса ддддсаєсдс дсадсЕсссс сдсесесдсесдЕ дсдсаасдєе 2903

ЕссСсрЕсссуєЄ асуєсдсуЄеЕ ссуреєеесєсасу ЄсдсерассеЕ сЕдеЕсЕЕеЕсСЕеЕв9 доддсдсаадие 2963 гаєддсадеа садуссуєЄєвєдеЕ єєЄССсСасуєвуа дааддасуде ЄЕЕдссссвЕ судсвЕсСсада 3023 аз свЕЕссада дассеЕсеєсда 9ЕСЕЕсССсСЕваа СОЄЧЄсвоЄє ассдссдеЕаа сЕСДЄЄСваВва 3083 сдЕдсадде ссс дсс осса ссуд дсс о ссс ас дос ас десс ссдд ссд ссс ссд 3134

Зо Рго Аза Рго Рго Аїа бБегт Іїе Уа! ТПг Аза Рго Рго Рго Рго 125 130 135

ЧФЕЕ дсЕ БЕ судс судс аад сс ссуд дса сує ааддсеєдаре даресссстьк 3184

З5 уаї Азїа Рпе Агуд Агуд Гуз Рго Рго Аїа Агд 140 145 саєссасєда ЄсДдЕсааєдс дсдєдсааєс Єссдобєдаєса ссаасесдсо дссддаєсдсе 3244

Есдсаддс дад дса сс ссс о сса ссуд ссуд дсу дсс о дад аад сес ссс ссд 3294 сі Аза Рго Рго Рго Рго Рго Аїа Аїа біцп Гпув Гей бек Рго 150 155 ссуд сс сад сад сас дас дас сс дас сас аас аад сдс дЕсС ддс о сса 3342

Рго Рго біп сіп Нібз Авр Авр бек Авр Нів Авп пув Агуд Уаї с1у Рго 160 165 170 175 сЕсС ссуд ада ддс сс сс о ссс оссд бає дсс сад сс дес о ссуд дес дас 3390

Тецп Рго Акуд сіу бек Рго Рго Рго Туг Аїа сіп Бек Уаі Рго Уаі Щ1У 180 185 190 ссс дсс дсс дес ссс оссд сса сса сдс сс ддс дсс бсс сс ссдд сес

Рго Аза Аїа Аза Рго Рго Рго Рго Агуд бек сіу Аїа бег бег бек Іецй 195 200 205 сад дсд ссс сс дсс о дсс о асс асс асс асс дос дсс ас оасс ссс асс 3486 біп Аїа Рго тей Аїа Аїа ТПг ТПпг ТпПг оІїе Уаі Аза чІ1е ТПг Геп Пе 210 215 220 дсс о дсс о дсс осад бас бда д дасасдссдс сдссддсдесс судсеЕссссад 3535

Аза Аїа Аїа сіп Туг 225 адссаєдавьєєс судесеєсуусаде асвєеєресарс сЕдреЕсеЕесЕ ДдСЕЕСЕСЕСЕ сЕУДдстассс 3595 асдсасаєда яєсЕдддаада счаєчдчавєсєвд аєсвгадеадс дсдЕБассаваа ЯЧФЕЄЕДЧСсСтад 3655 асєсчадесад бадсеЕдеЕддеЕ асвтаєдседа єЄєдеЕсЕеЕсСЕеЕеуд аєсдсдеЕсде сЕСТтададс 3715

ЕссудссдЄєЕЄ ЕсЧдаєсуаєс ассадсаєдуд ссддаєдедад Ессадсаєда ааадсдаєсда 3775 аддадаасаєсє єЄєдеЕгєдсеєаад ЕСЕ дсЕЕЕСваєс ЕССсадеадсе даасаадтає 3835

Зо дЕсаасеєдаа ЄдсЕдсааєд аадеєдааєддуд аєдсадеЕсее ааваєввадсс Єр еЕсеЕдевдс 3895 саассЕссєєсс сЕСсСЕдЕсссд сасддаєєсадд асдссдсєсєсу ссседеЕссає дсдаєсддадеде 3955

ЕдсаєсєдеЕвд єдчаєдеЕдеєда адедсдссса аЕєсеЕддудеЕд аасеЕСсєдсад єаєвєддасаад 4015 сЕСЄдаєсда басаєааада ассдаааєдеЕ дссддссєєссеЕ ссдсесЕсссу ЕБгДдсатрдсес 4075

Есдсдсудсуда дсеєдсасадс дсаассудсудс ссЕСсСсСЕСвдс асаєссаєсу асасааадес 4135

ЕсаадусеЕдеЕс дсдсдЕдедс ЕСвассаддс ассудЕддсеЕс сЕдсуддудсдЕ дсасодддеса 4195 саєссасаєс дсасссаадс Єдсддасдес ссадссдадс асссассаєс сддсаасдеЕсес 4255 дсссасадсеє ЄдсЕСЧЗаєда ааєдаседдЕ єсаєдеЕсааа аддеєааааас Єдасавресьс 4315 асдсоуддбааа ЕссСссстраад ссссасадас сассдсассд Есаєссассс дасседссас 4375

Чдасасссдсс ассдсадаас дсдасасссї деЕдсссасудд ссасстассс сддсасдсас счадссдаад ссддаєаадс асссдадеєд аєссссаєда дасудєддсда сЕСддсесдсс 4495 сЕСЕсдссас 4504 «2105 43 «2115» 684 «2125 ДНК «213» Огула забіуа «4005 43 асддадсдсЕ сссассєсдс судеЕссЕдсеЕс ддссЕссесу ссЕЕСсСдссудс суддддЕсссд бо дссдсадсудуд сддссассудс сдЕддаддда дсдсаддсдд ссасддсдда ддсдЕСдедс 120 чадсссесса ЄссЕСсдссас ссаддеЕсссу сЕсСЕЕсседсуд сдсссддасає дсссассдсд 180 садсдссдсуд адссддєддеЕ ддссЕссдесс дассссддсд дсддсдебасс седссеЕсесдс 240

Зо сдсдЕсдссуд ссдадссдса дсесаєсаєс Ессддсесссса асдссассса ссесстгсасд 3З0о сЕдсасдссуд ссідсддадд ссеЕссдсссо ддаддсдессс дссссдссдс сдссесдесдаа 3З6о ддаЕСсСссудссс сассуддссес саєсдеЕсасе дссссудссус ссссудеедс ЕЕ ЕСДСссос 420 аадссдссдда сасдсдаддс ассєссссса ссдссудудсдуд ссдадаадсе сеЕссссдссд 480 ссеЕсадсадс асдасдассс сдассасаас аадсдсдесуд дсссасесссс дададдсесе 540 ссЕсссссуєЄ аєдсссадес сдссссудеЕс додссссдесу ссудсессссс дссассасддс бо

ЕссддсудссеЕ ссесудеЕсСусЕеЕ ссаддсудссс сеЕсудссудсса ссассассає сдеЕєдссаєс бе асссесаєсуд ссдссудссса дсас 684 «2105 144 «2115 5291

«2125 ДНК «213» Вгаспуродіцт дізбаспуоп 2205 «2215 екзон «2225 (2069)..(2419) 2205 «2215 екзон «2225 (3818)..(3887) 2205 «2215 екзон «2225 (4026)..(4288) «4005 44 сссЕсбаавааад ддддсааєда ЄддсеєЕсасає сдаддааєсд асаєдсассс сеЕсаааддад бо

Чдеааєдаєддуа сеЕсаєаєєда єсЕЧдаддааа сеЕссЕЕссає ааддасаєсе ссаасаадас 120 асадесадсуд деассаєсааа дсасуддсасс єддаєсадееє сЕСдЕСЧЧаддуд дЕдсадасда 180 сдаєєсдсадс даасаєдаєд ассаєсєсдсдда сдасдаддад ддддддсадс ддадддасддсе 240

Зо чаддеЕдсаєс сЕСсСсдссааа ЕсСааадсасуд сдсдсдЕдсс асдсдадесса даєсаадддас 3З0о асудсааааса даєсаасаває гаасаддаад саасдсагад аєєеєеЕсадаа єсдадеаааа 3З6о чаасадсадс адсаєвєсєеЕсЕ Еєадсдааає адсадсадса аєтадаєсаа дсдаааєдеа 420 аадздеЕсдеЕес асагассаас аадддсуддасд ЯдЕЧдЕЧдо9ддодсу ддасаєєдас сЕССддддсс 480

Есссссадудд ссеєдсуддсдс сеЕдсЕдддсс єсдасаааєд садеЕсаддсеЕ дсаадавєаєд 540 адддєааааа аасадаєдса садессуддіс аадаааааса асааасаєдс адасстасеса бо чаєсеЕдссаа дасраааєса ссраасудавеє ссаадеєссад Едаєддаеєдс аєсддсдаєда бе асеЕссадсса єЄдсЕдсдЕдс ссудссЕддеє ассуддасудсуд судддааддудд адсаадссса 720 ассададсудд дЕдсадссодуд дсуддасдвєдеЕЯа єваєєдсудає аагасеєсдас ддеаєдсьсс 780 сассдсадді асадссссад дааддсаєсс дассдассса ссадаєсаєс бассассаад деадссаєеєс єдссасссає сеааасасаа асєдададса адааадсаде єЕдассдсда 900

ЕєдсеЕсаєса сааааддсаа сасааааааа сеЕдссадсеЕє сдЕдеєсадаа ааєсаасаєд 960 саєддеЕдсдс дасадрасаа садааасаєд додадчасаса дсадааасує ссааассааа 1020 ааєссааааа аадааддада єдсасєдсудЕ аадаааасад сасудддаадс дсЕСЕЕсСасс 1080

ЧдЕдесЧдадасе дсасаадесс аададасудас аасадсадаа аадаасеєдса дааадддадад 1140 сЕдсЕссс9дуиу дддеЕсааадс ассадсасдд сЕссдаєсаа ссддаєсдаєсс аавааєссссессда 1200

Едссассдад аєссєсасад ЕдсЕСЧдадудд дасасеЕстаа дЕСУДДСЕСД Есасаєссаа 1260 сссааасаас асдсЕсссдЕ стааддеЕдсс саасааадде даєдедеЕєсуд сасдсаддса 1320 садсддааса асаавассадс деЕсдаєсдас сасдсесссос ссссадаааа деседсссссаа 1380

Зо саєдаєсдса Єсдаадсаає сдсададаса дасєсссасад аасааааааєсє ааасссааас 1440 саааддадда дЕсссдсасоі ассадаєссуд аассааадсс аддааасадс ааассаааса 1500 саавадаєсає сдаєдаааєс асасаєсєсдесс сааасдеЕссс ддаєсасасс ссссддаєссдес 1560 аасеЕсссудрд сЕсассудсдс адасадаєсс ЄсЕдсасуаєба ссеЕсддсЕсс адсссдадда 1620 чадсдадсас Єссаддааас ддсддЕСЕСсУ адсудадсаде сЕаддаааєд дсддЕСдсда 1680 гЕддаааадсс ЄЕСаададає аєсдддеєдає дссссставьве ЕСтададсес ЕддсстЕвас 1740 адеЕссассас ЄЕСассстрдс дссаєсссуда ЄЕсСссадрас сеаєдасдад сдасдасссь 1800 сасдеєдсссд дссадсаєса сдддададаа сссЕсдсссад саєсссаасс дсссааасад 1860 асадсєдЕсс ддЕсссассс аааєддасдс асаддаєсда Есдддссдсс дагддссЕде 1920 ссЕсддссаа сссЕссасдс сЕссссаєсс сссссдсесста басааєсссса ссссдсєсссд 1980 сСЕЕсСЕЕсссс сассудсудсес ЄсСЕсСссесСвд дасссасасс аасесдсста дссстадсдад 2040 гаддаадсуда аадсдадада Есссассс ад дад ада ссс осас сас сс сес 2092

Мем сіц Агуд Бек Нів Нів Гей Гей 1 9)

СЕС дЕд сс ддс сс сс дсс о дсуд сбд сс о ссуд дсуд дсс дсуд дос асс 2140

Тецп Уаії Гешп сі1у їец Гей Аїа Аза їецй Гей Рго Аза Аїа Аїа Аза ТПг 10 15 20 сс додадоасу ас садоссу дадоссе додадодсс осса бдс дад сссоасс о сес 2188

Рпе б1у ТПпг ТПг сіп Рго бій Рго сіу Аза Рго Сув сій Рго ТПг ТІецй

Зо 35 40 сЕСсС дсс о асс сад дес сс сс сс о сбдс дсуд ссуд дас асд ссд асс дсд 2236 25 теп Аїа ТПпг Сіп Уаії бек пешп Рпе Сув Аїа Рго Авзр Меє Рго ТПпг Аїа 45 50 55 сад Єдс бдс дад сс дсд десд дсс о ссс дес дас ссс дод дає ддс дес 2284

Зо Сбіп Сув Сув бій Рго Уаії Уаії Аза бек Уаії Авр теп сіу сіу с1і1Уу Уаї бо 65 7о ссс о бдс сс бдс сус дес дсс о дсс о дад ссуд сад сс дос асд десс дас 2332

З5 Рго Сув Те Сув Агуд Уаі Аза Аїа сій Рго Ссбіп їец Уаі Меє Аза щ1У 75 80 85 сс аас дсс о асс сас сс сос асуд сс бас асс сс бдс дає дда сес 2380

Тец АБп АТа ТПг Ні ІТец Іец ТПг ІТец Тук ТПг бек Сув с1у сС1у Іец 90 95 100 сдс ссс дда ддс дсс осас сс дсс о дсс дсс сбдс даа дде асдсдасдсес 2429

Агуд Рго сбі1у с1у Аза Нів гей Аза Аїа Аїа Сув бій щу 105 110 115

ГЕ9дСУ9ЕСЕСЕС ССЕСЕСЕССд суеЕсСЕСЕСЕС єСсСУДЕСсСЕСсСЕеЕСсС ссаєдасудад саасеЕсдсда 2489 гасдссеЕсас ЄдссеЕравьєсєФ єЄЕЄЕЧдаада сасдеЕдеєсед сЕєддеЕссас єдеаєведоад 2549

БЄсСсСЕсЕСЕСсЕеЕСсС дадаадееєса ЕССсСдБгаддса єссаєагаєсс дасддадеєсу даєдадаєса 2609 аасадедаса сдсдсдасас саасуЄєеЕсєеєс аасуаврсеЕсеЕ єусЕдЕеЕЕЄ9ЧО4 єЕЕЄєЧавравєвте ссЕдсеЕсссс аєдаєстасєс сссаваассеЕсс сссдсасддсес Єсссдсссса ассссдесдса 2729 чаассававєе ЄсаєсеЕєсддуд єЄваєдсеЕдеЕ єСЕєДєаадає сеадсдссає дсададдеса 2789

ЕсЕСЕДСсСЕдЄ Ессадасссс стасуаєдаса ЕЕЕУЧСЕУЧЕСС ЕСССЕСЕЄВУЧ ЕЄддссаєдддс 2849 сасдддЕєсє9дд ЕСЕЕссасдаа адасасеЕссд асаєсдессаад асссдсдадс ассссдааасєс 2909 сссаасдсає єссссасуєд Єсссдєдссд сссдаєсдас сдаєсдаєсд аддссдєдсе 2969 аднгасеєеєсда сасссудааад сарсЕсеЕссе єЕСЕЧДСара ЕСЕСЕЕЕСЕДЕ ЕСЕЕДЕСЕС 3029

ЕСЕсУУДЧУЧСсСЕЄ дЕЧдсадеЕеєса ссаєддеЕдаа дадсдсеєса гасасддаєсеЕ дссдсддаддас 3089 сададсааваа ЧсСЕссСссур сСЕсСсССсЕсСеЕвд сасадедсає сЕссссськс ЕЕСдсесСЕсЕЕ 3149

ЕСУЧЄЕсОДас ЧФЕСЕСЕДДСЕЕ судеЕСЕССССЯ ЄДЕЕЕСЕДЕЄ деаседеЕсдс дсассаєдса 3209

Зо гЕдеЕсЧавЕсєвсє сеЕЧдаєсасудаа дсрадесасьуд сеЕСЕдсадее єеЕЕдЕУ Вас СЕЕСсССЕСЕКЕ 3269 сдЕдаєааад аасдсддесса аассдсссеєс сдассссдеЕс сдеЕссаваєс ссЕссссссде 3329 аддаааасьсє єсдеЕєсдсада ЕсЕССсСЕЕрас ссЕсСудерссеЕсС сдсавєстЕувеЕ гдсеетассь 3389 дсЕдвадсед сдсєссЕєсдє ЕсЄдааєссааа ЕЕСЕСУЧЕЕСС сЕсСсЕСсстає сссаєсуссс 3449

ЧФЕЕсадеЕсас сЕсеЕссеЕЕсЕеЕ гаєєдаасеЕє єадеЕєсаєєд дЕДдДЕадеадда садеадеаєд 3509 сСЕссдсЯєсд єссдсоддадеі адсааєсдаа ЄсДдДсСЕСсСссСса дЕссссдсад адсддсссдс 3569

Едаасадава дсеєддсеЕдса дсадсееєсас садааєсуддеЕ суддЕБасдаа сЕєасдаєва 3629 рассссеЕсує сеЕсдсеЕсеєса єЕЄсвасеєддна дссеЕдстадке сЕсєсЕСЕєдЕ Едсдсасдба 3689 ассдеассса дтасєднасуд сєсадасааа асадасдддЕ седдссЕєсаа астасєесде 3749 гдсУуєсессу аасєсеЕдаає ЕсСсдддаадкге аасеЕеєрарьєє єдеЕдсЕСЕдЕфЮ ЕєДдасдсає 38о09 чЧЕдсаддеЕ сса дсЕ сс ссс дсс о дсс дес дес аде дес сс сесс ссс о єсес 38599

Рго Аїа Рго Рго Аза Аїа Уаї Уаії Бек Аза Рго Рго Рго 5Бег 120 125 130 дсс о дса сс судс сус аад сад сса дса с деасдаасаа ссЕсессасас 3907

Аза Аза Рго Агу Агуд пув сбіп Рго Аза 135 140

ЕЄєСсСоосеєєЧдасс сеааєсуссд седстасасос сЕСЕСасесу ассстаавааєс баргдеЕсевдас 3967

Есаєтаєсаа саєдеедаєс єдасеЕСсСудєдеЕ ддсасудсудсуд судрдсеЕвєеєда єгЕеСсСдсад 4025 ас дад дса сс ссуд сс ссуд ссуд су ас дадаадссуд сс оссд ссд 4072

Нів б1п АтТа Рко Рго Рго Рго Рго бек ТПг с1п пув Рго бек Рго Рго 145 150 155 сс сад сад дас аас дос асс дсс сас ддс аад дса абс о ссс асс сає 4120

Рго сбіп біп Авр Авп Уаї ТПг АТа Ні сС1іу туз АТа Іїе Рго ТПг Ніз 160 165 170

Зо дсуд дсс оаса сс оссуд сес дсуд ссуд дсЕ дсеЕ сс аєдаєс сас ад снвсс 4168

Аза Аза ТПг бек Рго Іец АТїа Рго Аїа Аїа бек Меє І1їе Нів Меє 5ег 175 180 185 сса ссд ссс о дса бдс аає сса бдс сс ддс сс дсс дес сс сса десс 4216

Рго Рго Рго Аїа Сув АвБп о Рго Сувз Бек сіу бек Аїа Аїа бег бек Аїа 190 195 200 чад додд 'оссс осес сс аєс дсс дсу сс сеЕсС сеЕсС дес аєс асс дес аєс 4264 сі с1у Рго їецп їецш Іїе Аїа Аїа Гецп Гей Гей Уаі Іе ТПг Аїа Пе 205 210 215 220 асс дес ддс о асс ссс дас дає аад єдаєсєссадда дссудсЕссудсес сссессддасе 4318

І1їе Уаї с1у ТПпг Іецй Авр АвБр Гув 225 сассаасдеЕс сдассаєдає ссадссдсад бадсддаєссс деЕсссдасссс асдЕсссссд 4378 ссаєссддеЕс ссдадасєсєсс сасаєсєсдедс ссадссддсад ссдсадсадс садсаєсдесс 4438 аєсдедеєссас аадаєдедде сдадеаєаас агєсддадеЕвеЕс аєдавреєссес єадсадаєда аасассаєдеЕ даєдедаєсеЕ дааєддаєдс адеЕеЕсеЕдстса ссЕєЕеєсвдс Едстаєдаєа 4558

Едссваєсса саєсдеЕесаєс вєееСЯЇЄєсССсСс єЕЗгаастсчсу судеЕевадс ЄЕЧДЕДЧДЕєЧСсС 4618 асдаасдссс сЕсдсеєстдс ЕСсЧосдаєє дсасєєсєсвоєс ЕсССЧЯЄсСсСтЯсС; Єдеасаєтса 4678 асєЕсеЕдаавс єдсаєдседеЕ дадеасваад баседастас ааєсеЕСтдда єЄдФаЕЕЕєдаа 4738 асєсЧдааєда єдДдеЕваєааад дададсвадс єддддаарсд ссеЕсассесе ааасессааа 4798 асасададса даадеєддсс ЕСсСаадаєсса асеЕгддеЕсас єЕЕєдсавєдеЕС ддадсавєвде 4858 адсаасеєсьуд сааєгааасудд адвтадеЕесьд євадсаєдеЕЕ яєЕсеЕсасас єдЕСАдєаса 4918 адгеадчададеєс даєдаєтєаає гасаєсссоод ЕЄЧОЕЄсоссу седдсссссс адурсссьсс 4978 аддсаддаад даассудсаєс сдддеадесад ссадесаднад ссаддаадсеЕ асеадсадаа 5038

Зо садЕсссссд дсЕдссссссс сссддадесаа сдсссссссд сддассєсессс сдадесааєссс 5098 аааєссудддЕ агассудадсс Еєдеаєсадеі дададссуає адеЕсеЕєааре аєсеЕссадса 5158 саддсасадд аасаассасу ЄСЕСЕДдДЕссссс адааєсдсаса дсаасаксєссс ссссаададс 5218 асддсасадс гассЕсеЕєсє Ю єссесеЕсСааду ааасаєддса садстасакєсє ЄЕС евада 5278 ддаасаєддс аса 5291 «2105 45 «2115» 684 «2125 ДНК «213» Вгаспуродіцт дізбаспуоп «4005 45 асддададає сссассассе ссЕссЕсСудЕд сЕСДдДдсСсСЕССсС ЕСсСДССсСдСсСЧсСЕ дсЕСССдСсСЯ бо дссдсддсва ссЕЕСсСууддас дасдсадссу дадсседдадда ссссаєдсуда дсссасссес сЕсдссассс аддесссдсс сЕсссдсдсд ссддасаєдс сдассдсдса дедссдсдад 180 ссЕдсддаєда ссеЕссдесда ссеЕсдддддє ддсдеЕссссє дсссссдссда сдеЕсдссддес 240 чадссдсадс Есдссаєддс сддесессаас дссасссасс Есстссасдудсе стасассесс 3З0о

Едсддєддас єссдссссудуа аддсдсссас сеЕсдссудссу ссеЕдеЕдаадд Ессадсессь 3З6о сссдссдссуд Єсдесадебдс сссосссссс сссдссдсас сссдссдсаа дсадссадса 420 сасдаддсас сеЕссдссЕсс дссдеЕсдассі дадаадссдЕ ссссдссдесс сСсадсаддас 480 аасдесассуд сссасуддсаа ддсааєсссс асссаєрдсуддаз ссасаєсссс дсЕСдсдссд 540 дсЕдссссса Єдаєсссасає дсссссассуд сссодсаєдса асссасдсес сддсессдсс бо дсЕсссеЕсад ссдаддддес ссеЕссЕСсаєс дссудсудсесс ЕссЕСДЕСсСає сассдссаєс бе

Зо ассдЕСуддса сссеЕсудасда гаад 684 «2105 1946 «2115 951 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 146

Есдсдсдссуд ассссусудад адассуєдде ссудессадес дсадеададе ададсдсесд бо

ЕСУДФСЕСЕСУЧЕС сСсСуБєсЕсСУуЄд ссеЕДдЕСУдссЯЯ ЄЕСУЇВУОДЕЕС ДЕЕЕСЕДсСдЕє дсадеЕссдЕ 120 сдаадаадсс даєсддадЕссс дадсассадс ддсадсадса дсадсадсса СЄсдссссвде 180 ссдсЕсдсас чячЕдЕЕЕдсЧЕ ддЕсодсоддад аасааєсаає СО9ЧУЧЄ4дЕвЧ, садессеся 240 дчаЕсаадаєд аассасеєдає дсраєдедає сдаєсдаєсу деаєдаєстьуд ааєддаааєд 3З0о чаєсаадзсеЕс сдусуєЄєєстдс Едаєдчаєдед аєссаєєвуду аєсЕдедеЕдуа ддсаасадее 3З6о

ЕСУЧФСЕСУЧСЕЄ ЄЕДСЕСЄУСсСУД аєдаасуаає сеЕеЕсеЕєдса ЕдсавєсеЕєє сЕЄЕдсСЕєаа 420 гсЕДЧДаасеєдЕ адаасудаєд садеаседає ЄєЕСЕдСсЕває дчаєдедасда ЄЕСдЕСЯтас 480 чдсаєаєсаєс єсЕссааасє єдеЕдеЕадсад сЕдеЕсєЧдвад сесссасеєся дсвеаєддасд 540 аагдссЕдЕс єЕсСсСасудад аассдсдсудс ддададассає усуддасеЕеЕеЕдеЕ ДьЕЕДдссавдье бо гдЕСсЕеЕсссас дссаддасаа аагадаєдує дсуддЕвеєеєда Ессссааєсс сассаєсасс бе аєсдесеЕссудда дадссасаєд даасесасує саадсуддеєса сЕЕЕЕєдсадд аассасеЕсьє 720 ассарсеєсас ссЕкЕсЕЧдеЕсЧд ааассеєсесе ссесаєсссс аааадеєдає дсаасадедс 780

Баєдсдсдсес сасссаєдсє Ессессасаєд асєдсаааає ЕсОЧЧассчає серассеЕсе 840 чаассстаад ЄссудеЕєтас ааєсеЕдеЕеєву саєдеЕвваєд вЕСсСЕєдсудч сдаддадассає 900

Зо

Бааасаадас састаєсддда бавгаєсеЕсуда саддсеЕседа ааєссдаацкьєс с 951 «2105 47 «2115 1000 «2125 ДНК «2135 Ногдецт упідаге «4005 47

Еддссдассс ссааддсадс ададтасеєву єсаєсєдаєє ссдеєреєсавьд сЕєдеЕСдссд бо

ЕСсЕЧДЕЄЧЯаду ЄЕСУЧЄЕЄСЄд садеЕссудаас аадасудеЕдд дЯсдЕсЕЕеЕЕеєЧдаєс дддеасссад 120 асвєссстаєде саєсдсдсуд басеєадвасеЕ адесадеЕєдсеЕ гадсадаєда асддаасавєєд 180 дадЕЕЕсдоадча ЕссСсЕСвадс Едаєдаасса стдсставєесєсє ссаєдсдаєс даєддаваєд 240 ассєдааєддоа аєгдчаєдаад ЄСЄЕСЄУЧД4дФЕЄЕС ЕєЧдЧаєдседає давЕєдеЕдседс ЄЕЕСТЕЕСАЄВЕ 3З0о дсаєдсеЕсдда ЄссасєссьеЕ сааєєєвдед дадсаасадке єЕсєдеЕєвадусеЕ дсЕдесеЕСтс 3З6о гаєдааєаає дссудсеЕєдса ЕСЕєЄДдЕеЕСЯАЕЄ дсеєЧдаєааєс єдсеЕєааєдс адасаєедесе 420

ЕссдЕСсСссаа асаассеєдееЕ дсеЕсассадда Єааєдсаває аарсеЕдвасс єсасстєс9дс 480 асаасаасад аадссасссс дссааааааа сасасасаса сасасааааа аавасадаадс 540

Еддссссаса суддаадссудс ЕєСсСЧддоадасеЕ дЕеЕЄЕдсадсеЕ ЄЕЕЕраєрдес аресеЕеЕдевеее бо

Есаєдсаддє асаааєсад дзЕЧдЧЕЄЧдсЕеЕ даєєеєдаєса єдчдаєдаєса сеЕєададсаа бе сасдЕдеЕдеЕс сєсдсседесдеЕ ЄссасссдЕс дсссдеєссає ссааєссааа ссЕсдаааєдад 720 асєсдЕдедед даєаааадаа дасдєдсудеЕс адеЕвеЕеєдааєс дасудсуєєда дЕБараєтесе 780

ЧдЕДдЕСЄдЕЧа сддассдааас даадасаааа баваєсудеєсс ддЕсадааєє дсеЕСтЄаавдс 840 гадусеЕсеЕСес єсстассаєс дсаєєссуврд деаддааааа деасрадаас сасаддааас 900

Зо гддаасудсаа даааадсасба Естассуєву дссуеєєдаєс єЕЕДдЕеЕЕеєСаса ЕЕСОЧдтав9аУа 960 сЕССЯдДдЕєсає ассдсЕсддад асссасаєссс асдсасдсаа 1000 «2105 48 «2115 54 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 148 ссгдсдаадд басдссдсад ссссссдсесс ссдсдсссад Єдссдсдадсес ссде 54 «2105 49 «2115 54 «2125 ДНК «213» Тгібісцт аевтіуцт «4005 49 ссгдсдаада басдссдсад ссссссдсесс ссдсдсссад Єдссдсдадсес ссде 54

«2105 чХБ50 «2115 53 «2125» ДНК

«2135 ТгіБісцют аевтіхмит «4005 50 ссгдсдаадд басдеЕсдсад ссссссассс сдсдсссаде дсеєдсдадсс сдае 53

«2105 51 «2115 54 «2125» ДНК

«2135 ТгіБісцют аевтіхмит «4005 51 ссгдсдаадд басдссдсад ссссссдсесс ссдсдсссад Єдссасдадс ссде

Claims (36)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Касета експресії що містить перший полінуклеотид, функціонально пов'язаний із гетерологічним, переважним для чоловічої тканини промотором, де вказаний полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається 3: (а) нуклеотидної послідовності, яка включає в себе послідовність БЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7 або 9; (Б) нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, що включає в себе послідовність ФЕО ІЮ МО: 3, 5, 39 або 40; (с) нуклеотидної послідовності, яка щонайменше на 85 95 ідентична послідовності повної довжини ЗЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7 або 9, де вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, який модулює чоловічу фертильність; (4) нуклеотидної послідовності, що містить щонайменше 500 послідовних нуклеотидів із послідовності «ЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7 або 9, де вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, який модулює чоловічу фертильність; та (є) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який щонайменше на 85 95 ідентичний послідовності повної довжини 5ЕО ІЮО МО: 3, 5, 39 або 40, де вказаний поліпептид модулює чоловічу фертильність.

2. Касета експресії за п. 1, де вказана касета експресії містить перший полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з: (а) нуклеотидної послідовності, що включає в себе послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2 або 4; (Б) нуклеотидної послідовності, яка щонайменше на 95 95 ідентична послідовності повної довжини 5ЕО ІЮО МО: 2 або 4; (с) нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, що включає в себе послідовність ФЕО ІЮ МО: 3, 5, 39 або 40; та (4) нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 до ідентична послідовності повної довжини 5ЕО ІО МО: 3, 5, 39 або 40.

3. Касета експресії за п. 1 або п. 2, що додатково містить другий полінуклеотид, функціонально пов'язаний із другим промотором, який запускає експресію у рослини.

4. Касета експресії за п. 3, де вказаний другий полінуклеотид кодує полінуклеотид або поліпептид, який перешкоджеє функціонуванню, утворенню або розповсюдженню чоловічих гамет.

5. Касета експресії за п. 4, де вказаний другий полінуклеотид кодує барназу, ОАМ-метилазу, амілазу або АЮОР-рибозилазу.

б. Касета експресії за будь-яким із пп. 3-5, що додатково містить третій полінуклеотид, функціонально пов'язаний із промотором, де вказаний третій полінуклеотид кодує продукт маркерного гена.

7. Касета експресії за п. б, де вказаний продукт маркерного гена включає в себе продукт маркерного гена, що забезпечує стійкість до антибіотика, або продукт маркерного гена, що визначається візуально.

8. Виділений поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка включає в себе послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5.

9. Вектор, який містить касету експресії за будь-яким із пп. 1-7.

10. Рослинна клітина, яка містить касету експресії за будь-яким із пп. 1-7.

11. Рослинна клітина за п. 10, де вказана рослинна клітина одержана із однодольної або дводольної рослини.

12. Рослинна клітина за п. 11, де вказаною рослиною є маїс, ячмінь, просо, пшениця, рис, сорго, жито, соя, канола, люцерна, соняшник, сафлор, цукрова тростина, тютюн, Агабрійорзіз або бавовник.

13. Рослина, яка містить рослинну клітину за будь-яким із пп. 10-12.

14. Рослина за п. 13, де чоловіча фертильність вказаної рослини зазнала модуляції, порівняно з контрольною рослиною.

15. Рослина за п. 14, де вказана рослина характеризується підвищеною чоловічою фертильністю, порівняно з контрольною рослиною.

16. Рослина за будь-яким із пп. 13-15, де експресія вказаного полінуклеотиду забезпечує чоловічу фертильність рослини з чоловічою стерильністю, в яких стерильність обумовлена мутацією в полінуклеотиді М51.

17. Рослина за будь-яким із пп. 13-16, де вказана рослина є рослиною з жіночою фертильністю.

18. Рослина за будь-яким із пп. 13-17, де утворення щонайменше однієї чоловічої тканини вказаної рослини зазнало модуляції, порівняно з контрольною рослиною.

19. Рослина за п. 18, де вказана чоловіча тканина включає в себе тичинку, пиляк, тичинкову нитку або пилок.

20. Рослина за п. 18 або п. 19, де вказане утворення щонайменше однієї чоловічої тканини, що зазнало модуляції, передбачає підвищення утворення щонайменше однієї чоловічої тканини.

21. Рослина за будь-яким із пп. 13-20, де вказаний перший полінуклеотид стабільно вбудований у геном вказаної рослини.

22. Насінина рослини за будь-яким із пп. 13-21, де вказана насінина містить вказаний гетерологічний перший полінуклеотид.

23. Спосіб підвищення чоловічої фертильності в рослині, який передбачає введення у вказану рослину полінуклеотиду, функціонально пов'язаного із переважним для чоловічої тканини промотором, активним у вказаній рослині, при цьому вказаний полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з: (а) нуклеотидної послідовності, що включає в себе послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7 або 9; (Б) нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, що включає в себе послідовність ФЕО ІЮ МО: 3, 5, 39 або 40; (с) нуклеотидної послідовності, яка щонайменше на 85 95 ідентична послідовності повної довжини ЗЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7 або 9, де вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, який модулює чоловічу фертильність; (4) нуклеотидної послідовності, що містить щонайменше 500 послідовних нуклеотидів із послідовності «ЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 7 або 9, де вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, який модулює чоловічу фертильність; та (є) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який щонайменше на 85 95 ідентичний послідовності повної довжини 5ЕО ІЮО МО: 3, 5, 39 або 40, де вказаний поліпептид модулює чоловічу фертильність.

24. Спосіб за п. 23, де вказаний полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, наведену ЗЕО ІЮ МО. 1, 2, 4, 7 або 9.

25. Спосіб за п. 23 або п. 24, де експресія вказаного полінуклеотиду модулює чоловічу фертильність у вказаної рослини, порівняно з контрольною рослиною.

26. Спосіб за п. 25, де експресія вказаного полінуклеотиду підвищує чоловічу фертильність у вказаної рослини, порівняно з контрольною рослиною.

27. Спосіб за будь-яким із пп. 23-26, де експресія вказаного полінуклеотиду забезпечує чоловічу фертильність рослини з чоловічою стерильністю.

28. Спосіб за будь-яким із пп. 23-27, де вказана рослина є рослиною з жіночою фертильністю.

29. Спосіб за будь-яким із пп. 23-28, де експресія вказаного полінуклеотиду модуля є утворення щонайменше однієї чоловічої тканини, порівняно з контрольною рослиною.

30. Спосіб за п. 29, де вказана чоловіча тканина включає в себе тичинку, пиляк, тичинкову нитку 60 або пилок.

31. Спосіб за п. 29 або п. 30, де вказане утворення щонайменше однієї чоловічої тканини, що зазнало модуляції, передбачає підвищення утворення щонайменше однієї чоловічої тканини.

32. Спосіб ідентифікації й/або відбору рослин пшениці, які Є гомозиготними або гетерозиготними за мутацією в гені М57, де вказана мутація індукує ядерну рецесивну чоловічу стерильність, при цьому вказаний спосіб передбачає: (ад виявляння щонайменше одного маркерного алеля, який зчеплений і асоційований з мутацією в М5 7; та (5) здійснення відбору рослин щонайменше з одним маркерним алелем.

33. Спосіб за п. 32, де вказаний маркерний алель зчеплений і асоційований з мутацією в гені М51 на відстані 5 СМ.

34. Спосіб за п. 32, де вказаний маркерний алель зчеплений і асоційований з мутацією в гені М51 на відстані 1 СМ.

35. Спосіб за п. 32, де вказаною мутацією є те74й, т51е або тв511ї.

36. Спосіб за п. 32, де вказаний маркерний алель, зчеплений і асоційований з мутацією в М57, є алелем у маркері ЕТ0О487 (5ЕО ІЮО МО: 24), ЕТО488 (5ЕО І МО: 25), ЕТО489 (5ЕО ІО МО: 26), ЕТО0490 (5ЕО ІЮ МО: 27), ЕТО491 (5ЕО ІО МО: 28), ЕТО495 (5ЕО ІЮ МО: 29), 007-0033.1 (ЗЕО І МО: 32) або 007-0046.1 (ЗЕО ІО МО: 33).

і, ї ї с ї ї І і о ва Її : ї ше

НШ. ї ї ї ее ве її їх . Ї т «і їв Р З Її 13 оо г в ЕЕ ЕЕ 35 : о Е 5 В Як ВВ Е - ТЕ 13 ще с: 5 5 сх д де КЕ Я

Фіг. 1 чі 535 в о ЕВ 58 Уа ав Б Б 3888 во 05 о Фо Ге) 8989955 ооо о еВ 585588 ща оо а ЕВ о о999 де я я я а еВ й яки Е В 1333: Е б з Фо ее вок ко ооо Зоо оо Кі З з» ММ ЕЕ ЕЕ вч а чу КУ Мч ЕЕ ЕЕ

Фіг. 2

- . ХМ -к ХО: Ше 5: ЩО 0 Ше МОХ іні - З сш св че Вк ше - - в 5 Ф Ж яр в- : Ф м ЕЕ м Шк; ще - в В є КЕН

8 . що ЗЕ як ен ити ЩЕ ще щ шк: Кк Я се ху ік о. - Ще ее ВН (У

Фіг. З й ка с о Фе І ЕІ Фо. че ча вовНовВ ож о-яз ОЦ ОО ОЇ Ж чає МВ «з и фі фу ж ач й и и ей вда тк х « ної . ЕЕ Ше ді паща ж ме Ж «їз є щ хів я яии СЕБЕ СБЯБИ, Б . я я з з . - « й ВІВ кі він ФЕВ . -нЯН,е «її їш Її) і З чі шк чЗпапдпа ж чинно - кн того шжх ещщоОщ не ання пав я й бу їм дек чщаядасаян мин ввоак СББЕА 78 ВЕ У КЕ я - У І ше «вАавВНЕж "0900 «ій | к пе Енея око вОодежи з Ва ба їм да ж «щи ж. Ж ОКО Ох «бі й й фах . он вмА;НАНне "ШО що сг ха . А КОВО Д сне «є т З х» «ІЛ ж . СК: У «й: ль в ж - м кб б: лі і не А що оеє сн ні ж чо уд ов ах те їв я «т ОПО х те еф ВВ ОВ Бт оз осз ща р ж рн в те «с а «її Я Комі з й "є «Ва їш їх її х кВ Ко ско жи ж знаннях "Б " "вк ог «19 015 з що що х хтуі її -« ж о "й сВвавак зх Ка фа їв б ж м ще «хист "рин «й їн їх Хх Й РФ ж Бі є Ша ша фо х я бі па бе де ж «(їі «Вис «мірі міх «їі пі хх "Лк Й ех СІ ОО два пед «- л- с ла М г меш ши ШИ ) ке Зона лат за р хан и не "«прщщ й є " коша гра вва :5 чяак "йо 3110 єаацоИих з ящім б фе щи «ів б В ф: б пік "паси "Вп зве й "вра вх ІБ «жк ОВ "є жк . 5 ії «щі щ ж «вс х с «ож «х ск А еф й . в є я ж зу юу рж ета ЯЗ Ві б їх т хр й « - хх - пок жа «г; бі ді жк 4 боїв б; йіж с Я ОГ ОГО р кі сан КЗ Ж в Я снеки ст зних ми шк о Я Я: Бах

ЯН. СЕК: спад п1488Р Ек Кк к ч- Кк ж ж Ж - З бі ка вррувох ва «ка в шли ЛЯ ОБО наж «Шіх о о» я 5 с хх «вх «їм у й: жк х кож з --ні ж з 35433 0 х «В ж: б й ох "ря - БОБа: пев: пошяяи Я ті ож «а Ж Ля р , ЧЕ х -овщок ок Кі ї- Її б» 0 оз ІД Й ІЛ Не 2355 зви ав ев «пні «ян з ж жи кожи Ж « ном кож ш ин еще "тп Ж щі о «ва "У між ст р» и « Фк ж « чі 153 » «0 щ «ВВ: й ж «М ль й хх кві їх «а й щі зві М ік «В б бе док «Оті "ДОЛ жк боро «я кн Ж хв Вих по сх деоввох Фо т Фе гг 5 і ж тя Кк. Е т. КІ - «ВИХ рова ож ков ко он й мі щі - Е Е Е Е З ів. 8 ре) 5 - - «4 - -

Ко. ч Ко; ке; Ко; о о , о о Б о Бб 5 'Х Я Б їх Б Зо Б З Об У З ах вОдяа заяв воОодооа зОоди од еш б Ом фол Гі я со Ази нн Ок б ав о бдащ м ооо тн ит оч ня я з нями Няни ня нт в онто днао. вна онто. знхщщя вк || а тк. || що || ще, Н Н ве | |шою | Їсю | Іво | істо сера не кж т тари аю тмчг

Фіг. 4