UA120088C2 - Антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югат - Google Patents

Антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югат Download PDF

Info

Publication number
UA120088C2
UA120088C2 UAA201511604A UAA201511604A UA120088C2 UA 120088 C2 UA120088 C2 UA 120088C2 UA A201511604 A UAA201511604 A UA A201511604A UA A201511604 A UAA201511604 A UA A201511604A UA 120088 C2 UA120088 C2 UA 120088C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
sequence
antibiotic
compound according
conjugate compound
Prior art date
Application number
UAA201511604A
Other languages
English (en)
Inventor
Ерік Браун
Эрик Браун
Мартін Дарвіш
Мартин Дарвиш
Джон Флігейр
Джон Флигэйр
Вутер Хазенбос
Вутэр Хазэнбос
Буйонг-Чул Лі
Буйонг-Чул Ли
Софі М. Лехар
Софи М. ЛЕХАР
Санджев Маріатхасан
Санджев Мариатхасан
Джон Хіроши Морісакі
Джон Хироши Морисаки
Томас Х. Піллоу
Томас Х. Пиллоу
Ліанна Стабен
Лианна Стабен
Річард Вандлен
Ричард ВАНДЛЕН
Клаус Коефоед
Клаус Коэфоед
Магнус Странд
Пітер С. Андерсен
Питэр С. Андэрсэн
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2014/039113 external-priority patent/WO2014193722A1/en
Priority claimed from US14/284,609 external-priority patent/US20140356375A1/en
Application filed by Дженентек, Інк., Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA120088C2 publication Critical patent/UA120088C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Винахід стосується антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югата з антибіотиком, способу їх одержання, фармацевтичної композиції, що їх містить, та способу їх застосування.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югата з антибіотиком, способу їх одержання, фармацевтичної композиції, що їх містить, та способу їх застосування.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА РОДИННІ ЗАЯВКИ
Дана заявка претендує на пріоритет за заявкою на патент США номер 14/284,609, яка подана 22 2014, що є не попередньою заявкою, яка подана відповідно до 37 СЕК 51.53 (Б), і відповідно до 35 О5С 5119(е) просить пріоритет за попередньою заявкою США номер 61/829,461 яка подана 31 травня 2013, які включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
ПРЕДСТАВЛЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ВИГЛЯДІ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛУ У
ФОРМАТІ АЗСІЇ
Зміст представленого текстового файлу у форматі АЗСІЇ включений в даний документ за допомогою посилання у всій його повноті: машиночитана форма (СКЕ) переліку послідовностей (назва файлу: Р.А9бОК2УМО РСтТзЗедиепсеї ізііпд.їхі, дата створення: 30 травня 2014, розмір: 195,240 байт).
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
Даний винахід відноситься до антитіл проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (анти-М/ТА",, кон'югованих із антибіотиками типу рифаміцину, і до застосування отриманих кон'югатів антитіло-антибіотик для лікування інфекційних захворювань.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Патогенні бактерії є істотною причиною захворювань і смерті, як у людей, так і у тварин. І головне місце серед них займає біарнуососсих ашеив (5. ашгеив; ЗА), що є провідною причиною бактеріальних інфекцій у людини в світі. 5. аштеи5 може викликати ряд захворювань, від незначних шкірних інфекцій до загрозливих життю захворювань, таких як пневмонія, менінгіт, остеомієліт, ендокардит, інфекційно-токсичний шок (ІТШ), бактеріємія і сепсис. Збудник може викликати інфекції шкіри, м'яких тканин, органів дихання, кісток, суглобів, ендоваскулярну та ранову інфекцію. б. ашеиве все ще є однією з п'яти найпоширеніших причин внутрішньолікарняних інфекцій та часто є причиною післяопераційних раневих інфекцій. Щороку приблизно 500000 пацієнтів в американських лікарнях заражаються стафілококовою інфекцією.
В останні кілька десятиліть інфекцію, викликану 5. ашгеив, стає все важче і важче лікувати, в основному, через появу стійкого до метициліну 5. ашеив (МЕ5А), резистентного до всіх відомих бета-лактамних антибіотиків (ВоисНег, Н.МУ. єї а). Вай риов5, по агиде: по Е5КАРЕ! Ап ирааїе от
Ше Іптесіїои5 Різеазе5 Босієїу ої Атегїіса. С//ліса! іптесійрив аізеазев: ап ойісіа!/ рибіїсайоп ої Ше
Іп'есійсив Різеазев5 босівїу ої Атегіса 48, 1-12 (2009)). Ситуація є настільки важкою, що до 2005, як повідомлялося, інфекція, викликана МА5А, стала провідною причиною смерті від єдиного інфекційного агента - понад 15000 смертей у Сполучених Штатах (Ов! єо, Е.В. в Спатрбегв, Н.Е.
Веетегдепсе ої апіїбіоїіс-тезівїапі Єїарнуіососсив айгеиб5 іп Ше депотісв ега. тре уоита! ої
Сіїпіса! Іпумезіїдайоп 119:2464-2474 (2009)). Ванкоміцин, лінезолід і даптоміцин стали кращими антибіотиками для лікування інвазивних інфекцій, викликаних МА5ЗА (ВоисНег, Н., Мет, І. в
Вагопабріє, В.В. бегіоив іп'есіоп5 сайзей Бу теїПісіПп-гевзівїапі ЄФарнуіососсив ацгеив. С/піса! іптесноив дізеазев: ап онісіа!/ рибіїсаноп ої Те Іп'есіїсив Ррізеазев босівеїу ої Атегіса 51 Зиррі 2, 183-197 (2010)). Проте, також повідомлялось, що клінічні штами МА5БА характеризуються зниженою сприйнятливістю до ванкоміцину й перехресною резистентністю до лінезоліду та даптоміцину (Маппіпі, Е., Митау, В.Е. б Апаз, С.А. Вевзівіапсе ог дестєазей 5изсеріїрійу ї діусореріїде5, даріотусіп, апа Іпегоїій іп теїпісйЦіп-гевівїапі 5іарнуіососсив ацйгеив5. Ситепі оріпіоп іп рнагтасооду 10, 516-521 (2010)). Згодом, доза ванкоміцину, необхідна для подолання стійкості, підвищується до рівнів, пов'язаних із нефротоксичністю. Таким чином, смертність і захворюваність від інвазивних інфекцій МАБА залишається високою незважаючи на ці антибіотики.
Незважаючи на те, що 5А зазвичай вважається позаклітинним патогеном, дослідження, проведені, щонайменше, 50 років тому, виявили його здатність інфікувати й виживати в різних типах клітин-хазяїнів, як у професійних фагоцитах, так і у нефагоцитуючих клітинах (Стезпат,
Н.О. евї аЇ. Бигмїма! ої Єтарнуіососсив ашцгеив іпзіде пешгорніїв сопітіршіев ю іпіесіоп. / /ттипої! 164, 3713-3722 (2000); Апумаг, 5., Ргіпсе, І.В., Еовівг, 5.9., М/Нуїє, М.К. 5 Забргое, І. ТНе гізе апа гіве ої еїарпуіососсив ацйгейив: Іашдпіпо іп Ше їасе ої дгапиціосуїе5. С/іпіса! апа Ехрегітепіа!
Іттипо!іоду 157, 216-224 (2009); Егашппоі2, М. « зіпна, В. ІпігасеїІміаг 5їарпуіососсив5 ашйгецйв:
Пме-іп апа Івї діє. Егопіегв /п сеПшаг апа іпіесіоп тістобріооду 2, АЗ (2012); Саггопі, б. б КеїІєу,
М.С. ВАеїштт ої Ше Тгодап Погз5е: іпігасейшШаг рпепоїуре 5уУ/іспіпуд апа іттипе емавзіоп ру еарпуїососсиз ацйгеи5. ЕМВО то/есшаг теадсісіпе 3:115-117 (2011) Таке факультативне внутрішньоклітинне персистування дозволяє вислизати від імунологічного нагляду хазяїна, тривалий час колонізувати хазяїна, підтримувати хронічно інфікований стан і, ймовірно, є причиною клінічних невдач і рецидивів після традиційної терапії антибіотиками. Більше того, бо вплив на внутрішньоклітинні бактерії неоптимальних концентрацій антибіотиків може призвести до появи штамів, стійких до антибіотиків, що загострює цю клінічну проблему. Відповідно до цих спостережень, лікування пацієнтів із інвазивними інфекціями МЕЗА, такими як бактеріємія або ендокардит, ванкоміцином або даптоміцином було невдалим у більше ніж 5095 випадків (Киїаг,
В., Оамі5, 5.І.., І еміпе, О.Р. 6. Вурак, М.). Ітрасі ої мапсотусіп ехрозиге оп оцісотевз іп раїєпів
МА теїпісіЦПи-гезівїапі еЄтарпуіососси5 ацгеив бБасієгтетіа: зиррогі ог сопзеп5зив апціаеїїпе5 зцадезієйд їагоаєїб5. С/іпіса!/ іптеснрив аїзеазев5: ап ойНісіа! рибіїсайоп ої Ше Іпесоривз Оізеазев5 босівїу ої Атегіса 52, 975-981 (2011); Еоулег, М.С, Ук. еї аї. Сарютусіп мегзи5 віапаага ІШегару
Тог Брасієгетіа апі епадосагайів сазей Бу 5іарнуіососсив ацтеив. Те Мем/ Епдіапа /сита! ої теадісіпе 355, 653-665 (2006); Мооп, У.К., Кіт, У.М., Рак, ОЛМУ., Зопп, УМ. в Кіт, М... Ргедісіогв ої регвівіепі теїПісіПп-гевзівіїапі Єбарпуіососсив ацйгеив бБасієгтаєтіа іп раїйєпів їєайвй мйн мапсотусіп. Те доитаї! ої апіїтістобіа! спетоїпегару 65:1015-1018 (2010)). Таким чином, більш успішна антистафілококова терапія повинна включати елімінацію внутрішньоклітинних бактерій.
Більшість сучасних антибактеріальних агентів за своєю хімічною природою є напівсинтетичними модифікаціями різних природних сполук. Вони включають, наприклад, бета- лактамні антибактеріальні агенти, які включають пеніциліни (продуковані грибами з роду
Репіспит), цефалоспорини та карбапенеми. Одні антимікробні сполуки, які як і раніше виділяють з живих організмів, включають аміноглікозиди, тоді як інші антибактеріальні агенти, наприклад, сульфаніламіди, хінолони й оксазолідинони, одержують винятково шляхом хімічного синтезу. Відповідно до цього, множину антибактеріальних сполук класифікують на основі їх хімічного/)біосинтетичного походження як природні, напівсинтетичні та синтетичні. Інша класифікаційна система заснована на біологічній активності; у цій класифікації антибактеріальні агенти діляться на дві більші групи відповідно до їхнього біологічного впливу на мікроорганізми: бактерицидні агенти вбивають бактерії, а бактеріостатичні агенти сповільнюють або гальмують ріст бактерій.
Ансаміцини являють собою клас антибіотиків, що включає рифаміцин, рифампін, рифампіцин, рифабутин, рифапентин, рифалазил, АВІ-1657 та їхні аналоги, які інгібують бактеріальну РНК-полімеразу та проявляють виняткову активність у відношенні грампозитивних і деяких грамнегативних бактерій (Коїйб5ієїп, О.М., еї а! (2003) Ехрегі Оріп. Іпмев5і. ЮОгиде 12(2ух255-271; 005 7342011; 005 7271165).
Зо Було описано застосування імунотерапії для запобігання та лікування інфекцій, викликаних 5. ашгеив (у тому числі МЕ5А). 052011/0262477 присвячена застосуванням бактеріальних білків адгезії Еар, Етр і Ай5БА як вакцини для стимуляції імунної відповіді проти МЕЗА. У
МО2000071585 описані виділені моноклональні антитіла, реактивні відносно певних штамів ізолятів 5. ашеивз. В Ш520110059085А1 запропонована стратегія, заснована на використанні антитіл ізотипу ДМ, специфічних до одного або декількох капсулярних антигенів 5А, хоча конкретні антитіла описані не були.
Тейхоєві кислоти (ТА) являють собою бактеріальні полісахариди, виявлені в клітинній стінці грампозитивних бактерій, у тому числі ЗА. Тейхоєві кислоти клітинної стінки (М/ТА) ковалентно зв'язані з пептидоглікановим (РОС) шаром клітинної стінки; тоді як ліпотейхоєві кислоти (ТА) ковалентно зв'язані з ліпідами цитоплазматичної мембрани. Хіа еї аІ. (2010) /пу. /. Меа.
Місгобіо!. 300:148-54. Ці глікополімери відіграють ключову роль у виживанні бактерій у несприятливих умовах і в інших базових клітинних процесах. Відомі структури М/ТА широко варіюють між видами бактерій. ТА 5 ашеив складаються з повторюваних поліол фосфатних субодиниць, таких як рибіт фосфат або гліцерин фосфат. З огляду на їхню структурну розмаїтість і мінливість, М/ТА вважаються привабливими мішенями для антитіл і в якості вакцин, див. там же.
Кон'югати антитіло-лікарський засіб (АОС), також відомі як імунокон'югати, являють собою хіміотерапевтичні молекули спрямованої дії, які поєднують ідеальні властивості як антитіл, так і цитотоксичних лікарських засобів, направляючи потужні цитотоксичні лікарські засоби до
БО пухлинних клітин, експресуючих антиген (Теїіспег, В.А. (2009) Сит. Сапсег Огид Тагдеїв 9:982- 1004), тим самим підвищуючи терапевтичний індекс за рахунок максимізації ефективності та мінімізації нецільової (побічної) токсичності (Сапег, Р.О. апа бепієг Р.О. (2008) ТРе Сапсег! .. 14(3):154-169; Са, В.М. (2008) Асс. Сет. МНез. 41:98-107). АВС включають антитіло спрямованої дії, ковалентно приєднане через лінкер до цитотоксичного фрагмента лікарського засобу. Імунокон'югати уможливлюють спрямовану доставку фрагмента лікарського засобу в пухлину та його внутрішньоклітинне накопичення, тоді як системне введення некон'югованих лікарських засобів може призводити до неприйнятних рівнів токсичності відносно нормальних клітин, а також елімінацію пухлинних клітин (Роїаків Р. (2005) Сит. Оріп. Ррагтасої!. 5:382-387).
Розробка ефективного АЮС для даного антигена-мішені (цільового антигена) залежить від бо оптимізації таких параметрів як рівні експресії антигенів-мішені, доступність пухлини (Коміцп,
У.М. апа Соідтаснег М.5. (2007) Сапсег Гей. 255:232-240), вибір антитіла (05 7964566), стабільність лінкера (Егіскзоп еї а! (2006) Сапсег Ке5. 66(8):4426-4433; Рогопіпа еї а! (2006)
Віосопіндаїе Спет. 17:114-124; АІвєу єї а! (2008) Віосопіндаїе Спет. 19:759-765), механізм дії й активність цитотоксичного лікарського засобу, навантаження лікарського засобу (Натрбіей еї аї (2004) Сіп. Сапсег Рез. 10:7063-7070) і спосіб кон'югації фрагмента лінкер-лікарський засіб з антитілом (І уоп, К. еї а! (2012) Меїйпоавз іп Еплут. 502:123-138; Хіє єї а! (2006) Ехретп. Оріп. Віо!.
ТНег. 6(3):281-291; Комішп еї а! (2006) Сапсег Вев. 66(6):3214-3121; І аму єї а! (2006) Сапсег Вез. 66(4):2328-2337; Ми еї а! (2005) Майте Віотесп. 23(9):1137-1145; І атреп 4). (2005) Сцтепі Оріп. іп Рпаптасої. 5:543-549; Натапп Р. (2005) Ехреп Оріп. Тнег. Раїепів 15(9):1087-1103; Раупе, а. (2003) Сапсег Сеї! 3:207-212; Тгаї! еї а! (2003) Сапсег Іттипої. ІттипоїНег. 52:328-337; Бугідо5 апа Ерепеїоз (1999) Апіїсапсег Нез. 19:605-614).
Концепція АОС у раковій терапії була поширена й на антибактеріальну терапію, у цьому випадку лікарська частина являє собою антибіотик, у результаті виходить кон'югат антитіло- антибіотик (ААС). В 55545721 і 056660267 описаний синтез кон'югату неспецифічний імуноглобулін-антибіотик, що зв'язується з поверхнею цільової бактерії через антибіотик, і його застосування для лікування сепсису. В 05 7569677 і родинних патентах запропоновані антитіла, кон'юговані з антибіотиком, антигенсполучна частина яких специфічна відносно бактеріального антигена (такого як капсулярний полісахарид 5А), але в яких відсутня константна область, що реагує з бактеріальним Ес-сполучним білком (наприклад, стафілококовий білок А).
СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід передбачає композиції, названі "кон'югати антитіло-антибіотик" або "ААС", що включають антитіло, кон'юговане шляхом ковалентного приєднання з одним або декількома фрагментами антибіотиків типу рифаміцину.
Один із аспектів даного винаходу являє собою виділене анти-МТА моноклональне антитіло, що включає легкий ланцюг і Н ланцюг, де Ї ланцюг включає СОВ І1, СОН І? і СОВ ІЗ, Ї Н ланцюг включає СОВ НІ, СОН Н2 і СОВ НЗ, десоп1іт, СОВКІ2іСОВІЗІСОВ НІ, СОН Но і
СОВ НЗ включають амінокислотні послідовності СОВА кожного з антитіл 4461 (5ЕО ІО МО: 1-6), 4624 (5ЕО ІЮ МО: 7-12), 4399 (5ЕО ІЮ МО: 13-18) і 6267 (5ЕО ІО МО: 19-24), відповідно, як показано в Таблицях 6А і 68.
В одному з варіантів втілення, виділене анти-М/УТА моноклональне антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною області УН, вибраної з послідовності МН з БЕО ІЮ МО:26, 5ЕО ІЮ
МО:28, 5ЕО ІЮО МО:30, 5ЕО ІО МО:32 антитіл 4461, 4624, 4399 і 6267, відповідно. В одному з варіантів втілення, це антитіло також включає варіабельну область І ланцюга (МІ), де Мі має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною Мі, вибраної з послідовності МІ. з
ЗЕО ІЮ МОс:25, 5ЕО ІЮ МО:27, 5ЕО ІЮ МОС29, 5ЕО ІЮО МО:З31 антитіл 4461, 4624, 4399 і 6267, відповідно. В іншому варіанті втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область | ланцюга (МІ), де МІ має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною Мі, вибраної з послідовності Мі з 5ЕО І МО:25, 5ЕО ІЮ МО:27, 5ЕО І МО:29,
ЗЕО ІЮ МО:31 антитіл 4461, 4624, 4399 і 6267, відповідно. У будь-яких попередніх варіантах втілення ідентичність послідовності може становити 9695, 97905, 9895, 9995 або 10095.
У більш конкретному варіанті втілення, антитіло включає: (МІ з БЕО ІО МО: 25 і МН з БЕО ІЮ МО: 26; (Ї) МІ з БЕО ІО МО: 27 і МН з БЕО ІЮ МО: 28; (її) МІ з БЕО ІО МО: 29 їі МН з БЕО ІО МО: 30; або (м) Мі з ФЕОІО МО: 31 ї МН з БЕО І МО: 32.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА (тейхоєві кислоти клітинної стінки) моноклональне антитіло включає легкий (І) ланцюг і важкий (Н) ланцюг, де: (а) Ї ланцюг включає СОВ 11, що включає послідовність КОБОБМІ БНАММММУМУМА (5ЕО 1О
БО МО:1), СОВ 12, що включає послідовність УМАЗТАЕР (ЗЕО ІЮ МО:2), і СОВ ІЗ, що включає послідовність ОСОММТЗААТ (5ЕО І МО:3); і Н ланцюг включає СОМ НІ, що включає послідовність ОМММН (5ЕБО 10 МО) СОВА Н2, що включає / послідовність
МІМРКЗИасТМУАОВРОС (5ЕО ІЮ МО:5), і СОВА НЗ, що включає послідовність ОСОБІ ВО (ЗЕО ІЮ МО:6); (б) Ї ланцюг включає СОВ І, що включає послідовність НОМОМІ І 555ММММІ А (5ЕО 1О
МО:7), СОВ 12, що включає послідовність МАБТАЕБЗ (ЗЕО ІО МО:8), ії СОВ ІЗ, що включає послідовність ОСОММАМРАТ (ЗЕБЕО ІЮ МО:9); ії Н ланцюг включає СОМ НІ, що включає послідовність ОММІН (5ЕБЕО 0 МОл0) СОВА Н2, що включає послідовність
МІМРМТаСтТУМАОКЕВО (ЗЕО ІЮ МО-11), ії СОВ НЗ, що включає послідовність ОССІВССІ ВО (510) (ЗЕО І МО: 12);
(с) Ї ланцюг включає СОВ 11, що включає послідовність КОМОММІ АБОМОКММІ А (ЗЕО 10
МО:13), СОВ 12, що включає послідовність МАБІВЕ5 (5ЕО 10 МО: 14), ії СОВ 13, що включає послідовність ООМУТМРАТ (5ЕО ІЮО МО:15); і Н ланцюг включає СОМ НІ, що включає послідовність ОММІН (5ЕБЕО 0 МО 6), СОВ Н2, що включає послідовність
МІМРМТаСТтММУАОКРеОС (5ЕО ІЮ МО:17), і СОВ НЗ, що включає послідовність ОСОМАСІ ВО (ЗЕО ІЮ МО:18); або (4) Ї ланцюг включає СОВ 11, що включає послідовність КОБОММІ М5ЗММКММІ А (ЗЕО 10
МО:19), СОВ 12, що включає послідовність МАБТАЕ5 (ЗЕО І МО 20), ії СОВ ІЗ, що включає послідовність ООМУТОРРМУТ (5ЕО ІО МО:21); і Н ланцюг включає СОВ НІ, що включає послідовність ЗУМІЄ (5ЕБЕО 0 МО22) СОВ Н2, що включає послідовність
ПНРООБКТАУБЗРОРОС (БО 10 МО23) і СОВА НУ, що включає послідовність г УбзааБСУБОВАБББІ аАлс,аУУУумМамам (5ЕО І МО:24).
У будь-якому з попередніх варіантів втілення антитіло може являти собою антигенсполучний фрагмент без області Ес. У деяких варіантах втілення, антитіло являє собою К(аб) або Е(аб)». У деяких варіантах втілення, антитіло також включає константну область важкого ланцюга й/або константну область легкого ланцюга, де константна область важкого ланцюга й/або константна область легкого ланцюга включає одну або декілька амінокислот, заміщених на залишки цистеїну. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну заміну А118С і/або 5400С, і/або константна область легкого ланцюга включає амінокислотну заміну М205С, де нумерація наведена відповідно до нумерації БО. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність
ЗЕО ІО МО:149, і/або константна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:151. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:149, і константна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:150. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:148, і константна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність «ЕО ІЮ МО:151.
В одному з аспектів, антитіло у будь-якому з попередніх варіантів втілення сполучається з
М/ТА альфа.
В іншому аспекті, даний винахід передбачає виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло, що включає легкий ланцюг і Н ланцюг, де Ї ланцюг включає СОК 11, СОК 12, ії СОК І З, і/або Н ланцюг включає СОК НІ, СОК Н2 і СОР НЗ, де СОКІ1, СОКІ2, і СОКІЗІіІ СОК НІ, СОК нг
СОК НЗ включають амінокислотні послідовності відповідних СОЄ кожного з антитіл, наведених на Фіг. 14 (ЗЕО ІЮ МО: 33-110). В іншому аспекті, даний винахід передбачає виділене анти-МТА моноклональне антитіло, що включає легкий ланцюг і Н ланцюг, де Ї ланцюг включає СОК 11,
СОК 12, ї СОК 13, і/або Н ланцюг включає СОК НІ, СОК Н2 і СОК НЗ, де СОК 11, СОК 1І2, і
СОКІЗІіСОК НІ, сок Нн2 Її СОК НЗ включають амінокислотні послідовності відповідних СОК кожного з антитіл, наведених на Фіг. 15А, 158, 16А і 16В (антитіла 6078, 6078.м2нНС-Сув, 6078.м21 Сб-Суз, 6078.хЗ3НО-Суз, 6078.43І С-Сувз, 6078.м4НО-Суз, 6078.м41 С-Сувз, 6078.м4НОЇІ С-
Сув, 4497, 4497 м8НО-Сув, 4497 м8І С-Суз і 4497 .м8НСІ С-Сувз). У певному варіанті втілення ці антитіла зв'язуються з М/ТА бета.
В іншому аспекті, даний винахід передбачає виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло, зокрема, анти-М/ТА бета моноклональне антитіло, яке включає варіабельну область І ланцюга (МІ), де МІ має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною МІ, вибраної з послідовності МІ, що відповідає кожному з антитіл 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 і 4487 відповідно, як показано на Фіг. 17А-1 - 17А-2 для положень 1-107 за нумерацією Кабаї. В інших варіантах втілення, антитіло також включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною МН, вибраної з послідовностей УН, що відповідають кожному з антитіл 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 і 4487 відповідно, як показано на фіг. 178-1 - 178-2 для положень 1-113 за нумерацією Караї. У будь-яких попередніх варіантах втілення ідентичність послідовності може становити 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095. У більш конкретному варіанті втілення, МН включає послідовність зЕО ІЮ МО: 112, і МІ включає 5ЕО ІО
МО: 111.
В іншому аспекті, даний винахід передбачає виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло, зокрема, анти-М/ТА бета моноклональне антитіло, яке включає варіабельну область І ланцюга (МІ), де МІ має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною Мі, вибраної з послідовності МІ, що відповідають кожному з антитіл, як показано на Фіг. 15А або 16А (антитіла 6078, 6078.м2НО-Суз, 6078.м2!б-Субз, 6078.х3НО-Суз, 6078.43І! С-Субз, 6078.м4НО-Сузв, 60 6078.м41 С-Сув, 6078.мА4НСІ С-Сув, 4497, 4497 м8НО-Суз, 4497 м8І С-Суз і 4497 .мвНСІ С-Сув) для положень 1-107 за нумерацією Кабраї. В інших варіантах втілення, антитіло також включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною МН, вибраної з послідовностей МН, що відповідають кожному з антитіл, як показано на Фіг. 158 і 16В (антитіла 6078, 6078.м2НС-Сув, 6078.м21 б-Сув, 6078м3НОС-Суз, 60783 С-Суз, 6078.м4НОС-Суз, 6078.м4! Сб-Субє, 6078.м4НСІ ОС-Сув5, 4497, 4497 .у8НО-Суз, 449781 С-Суз і 4497.м8НСІ С-Сувз) для положень 1-113 за нумерацією Кабаї. У будь-яких попередніх варіантах втілення ідентичність послідовності може становити 9695, 9790, 9895, 9995 або 10095.
У конкретному варіанті втілення, виділене анти-М/ТА бета антитіло являє собою антитіло, легкий ланцюг якого включає послідовність 5ЕО ІЮО МО: 115, ії Н ланцюг включає цистеїн, введений методами генної інженерії, і включає послідовність ЗЕО ІЮО МО: 116. В іншому варіанті втілення, антитіло являє собою антитіло, легкий ланцюг якого включає послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 115, ії Н ланцюг включає цистеїн, введений методами генної інженерії, і включає послідовність 5ЕОО ІЮ МО: 117, де Х являє собою М, І або М. В іншому варіанті втілення Ї. ланцюг, що включає послідовність БЕО ІЮ МО:113, спарений з Суз-гено-інженерним варіантом
Н ланцюга ЗЕО ІОЮ МО: 117; де у варіанті Н ланцюга Х являє собою М, І або М.
Інше виділене анти-М/ТА бета антитіло, передбачене даним винаходом, включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг включає УН, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО: 120. У додатковому варіанті втілення, це антитіло також включає
МІ,, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 119. У певному варіанті втілення, анти-М/ГА бета антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де Ї. ланцюг включає послідовність МІ з 5ЕО ІО МО: 119 ї Н ланцюг включає послідовність МН з 5ЕО ІЮО МО: 120. У більш конкретному варіанті втілення, виділене антитіло, що сполучається з М/ТА бета, включає
Ї ланцюг БЕО ІО МО: 121 і Н ланцюг БЕО ІЮ МО: 122.
Анти-М/ТА бета Суз-генно-інженерні варіанти Н і Ї ланцюгів можуть бути спарені у будь-якій з наступних комбінацій з утворенням повнорозмірних антитіл для кон'югування з інтермедіатами лінкер-антибіотик для одержання анти-МЖМУТА ААС згідно з даним винаходом. В одному з варіантів втілення, Її ланцюг включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:121, ії Н ланцюг включає послідовність 5ЕО ІЮО МО: 124. В іншому варіанті втілення, виділене антитіло включає Г ланцюг
Ко) ЗЕО ІЮО МО: 123, і Н ланцюг включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:124 або 5ЕО ІЮО МО:157. У конкретному варіанті втілення, анти-М/ТА бета антитіло, а також анти-М/ТА бета ААС даного винаходу включає І. ланцюг 5ЕО ІЮ МО: 123.
Ще один варіант втілення являє собою антитіло, що сполучається з тим же самим епітопом, що й кожне з анти-М/УТА альфа антитіл, наведених на Фіг.13А ії Фіг.13В8. Також передбачене антитіло, що сполучається з тим же самим епітопом, що й кожне з анти-М/ТА бета антитіл, наведених на Фіг. 14, Фіг. 15А і 158, Фіг. 16А і 168 і Фіг. 17А і 178.
У наступному варіанті втілення, анти-УУТА бета й анти-МЖМ/ТА альфа антитіла даного винаходу являють собою антигенсполучні фрагменти без області Ес, переважно, Е(аб)» або
К(аб). Таким чином, даний винахід передбачає кон'югати антитіло-антибіотик, де антитіло проти
МУ/ТА являє собою Е(абр/): або Е(аб).
В іншому аспекті даний винахід передбачає анти-МУТА моноклональне антитіло, що сполучається з М/ТА бета.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА (тейхоєві кислоти клітинної стінки) моноклональне антитіло включає легкий (І) ланцюг і важкий (Н) ланцюг, де: (а) Ї ланцюг включає СОМ 11, що включає послідовність КАБОТІЗСУМ А (ЗЕО ІЮ МО:33),
СОК 12, що включає послідовність КАБТГ ЕВ (ЗЕБО ІО МО:34), і СОК 13, що включає послідовність ОО0ОУКБУБЕМ (5ЕБО ІЮО МО:35); і Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗМУОІМ (5ЕБО ОО МО:36) СОК о Н?, що включає послідовність
М/ММАМЗОМТОМУАОКРОСсС (5БО 10 МО:37) і СОК НЗ, що включає послідовність
ЗІ МАСА ГавВмгеоІ (5ЕО І МО:З8); (б) Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність ВАБОТІБОМУМІ А (5ЕО ІО МО:39),
СОК 12, що включає послідовність КАБТГ ЕВ (ЗЕБО ІЮО МО:40), і СОК 13, що включає послідовність ОО0ОУКБУБЕМ (5ЕБО ІЮО МО:41); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗМУОІМ (5ЕБО ОО МО42), СОК о Н?, що включає послідовність
МММАМЗОМТОУАОКРОСсС (5БО 10 МО43) і СОК НЗ, що включає послідовність
ЗІ МАСАГавВмгеоІ (5ЕО І МО :44); (с) Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КАБОРМУ5КТЗІ А (5ЕО ІЮ МО:45),
СОК 12, що включає послідовність ЕТ55КАТ (5БО ІЮО МО:46), і СОК ІЗ, що включає послідовність НКУОБОРКТ (5БО ІО МО:47); і Н ланцюг включає СОК НІ, що включає 60 послідовність ММОБІ (5ЕБЕО ОО МО:х48), СОК НО, що включає послідовність
УМММРМЗУМТОУСОКРОС (5ЕО ІО МО:49), і СОК НЗ, що включає послідовність АУМКСОЇГІ ЗЕУ (ЗЕО ІЮ МО:50); (4) Ї ланцюг включає СОР 11, що включає послідовність КАБОЗМУ5ЗЗУЇІ А (ЗЕО ІЮО МО:51),
СОК 12, що включає послідовність ЮОАЗОКАТ (ЗЕБЕО ІЮО МО:52), і СОК ІЗ, що включає послідовність ОКУСО5ТРКР (5ЕБЕО ІО МО:53); і Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗМУОІМ (5ЕБО0О ОО МО:54), СОК НО, що включає послідовність
М/ММРМБОМТМУАОКРОСс (5БО 10 МО:55), і СОК НЗ, що включає послідовність
ЕЕМУЗКОТанмумУмУмамом (5ЕО ІЮ МО:56); (є) Ї ланцюг включає СОМ 11, що включає послідовність КАБІ СІТМНІ А (ЗЕО ІЮ МО:57),
СОК 12, що включає послідовність ЕАБІ ОБ (5БО ІО МО:58), і СОК 13, що включає послідовність ЕКСМ5ТРКТ (ЗЕБО ІЮ МО:59); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ММУОІМ (5ЕБЕО ІО МО:60), СОК НО, що включає послідовність
М/ММРОЗЗОКТОМАРКЕРКО (5БО ОО МО:61), і СОМ НЗ, що включає послідовність ссаУУрвзБамУнНІЗа! ОМ (5ЕО ІО МО:62); () Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КАБОЗМОАЇМІ А (5ЕО ІЮО МО:63),
СОК 12, що включає послідовність ЗУМЗМКАТ (5БО ІЮ МО: 64), і СОК ІЗ, що включає послідовність ОЇ УТЗЗКАГТ (5БО І МО:65); і Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність АЖМАММ (5ЕБО ІО МО66б6) СОК НО, що включає послідовність 5ІТКМЗОБІ УМАрЗМУКО (ЗЕО ІЮ МО:67), і СОК НЗ, що включає послідовність ГГ ААКІМАТОМ (ЗЕО ІО МО:68); (9) Ї ланцюг включає СОВ 11, що включає послідовність ВАБОСІНМО С (5ЕО 10 МО:69),
СОК 12, що включає послідовність РАБТГ ЕВ (ЗЕБО ІЮО МО:70), і СОК 13, що включає послідовність ГООНМУРРТ (5ЕБО ІО МО:71); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЖУ5МІ (5БЕО ОО МО:72), СОК НО, що включає послідовність
ЗІЗ5ЗеХІ УМАрБУКОо (ЗБО 10 МО:73), і СОК НЗ, що включає послідовність рарорії змУвавзавРНЕЮМ (5ЕО І МО:74); (п!) Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КАБОСІКМОЇ с (ЗЕО ІЮ МО:75),
СОК 12, що включає послідовність РАБТГ ЕВ (ЗЕБО ІЮО МО:76), і СОК 13, що включає послідовність ГООНМУРРЗ (ЗЕБО ІЮ МО:77); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає
Ко) послідовність ЖУ5МІ (5БО ОО МО:78), СОК НО, що включає послідовність
ЗІр55ЗКУКУУТОЗМКО (5БО ІО МО:79), і СОК НЗ, що включає послідовність рарорізуУУдавзавРЕЮМ (5ЕО ІЮ МО:80); () Її ланцюг включає СОМ 11, що включає послідовність КАБОЗМКТММА (ЗЕО ІЮ МО:81),
СОК 12, що включає послідовність ЗАБТІКАЗ (ЗЕБО ІЮ МО:82), і СОК ІЗ, що включає послідовність ГОМУМТУМРКТ (5ЕБО ІО МО:83); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ТМОМ5 (5БО ІО МО:84), СОК НО, що включає послідовність
ТПІСІОЮТТНУАОЗМАО (ЗЕО ІЮ МО:85), і СОК НЗ, що включає послідовність МЗОЇІМЗЕ (ЗЕО ІЮ
МО:86); () Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КАБОРІСЗБЗІ А (5ЕО ІЮ МО:87),
СОК 12, що включає послідовність АТЗ ОО (5ЕБО І МО:88), і СОК ІЗ, що включає послідовність ОО ММУМНе (5ЕБО ІО МО:89); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЮОМАМО (5БО ІО МО:90), СОК Н?, що включає послідовність
УМТеНУКТНУАОЗУКО (5ЕО ІО МО:91), і СОК НЗ, що включає послідовність КІМ ОБОБЕОМ (ЗЕО ІО МО:92); (К) Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КАБОБІСОМІ А (5ЕО ІЮ МО:93),
СОК 12, що включає послідовність УХУАЗ5МІ ЕС (5ЕБО ІО МО:94), і СОК 13, що включає послідовність О0ОУКБОМУЗ (5ЕБО ІЮ МО:95); і Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗМАММ (5ЕО ІЮ МО:96), СОК Н2, що включає послідовність МІЗБІЕТІУМАрЗУКО (ЗЕО ІО МО:97), і СОК НЗ, що включає послідовність ОКІ МОМРІ 55РМ5 (5ЕО ІЮ МО:98); () Її ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КЗЗОЗІРЕТЗЕМКМ М (ЗЕО 10
МО:99), СОК 12, що включає послідовність УУАЗТЕКЗ (ЗЕО ІЮ МО:100), і СОК ІЗ, що включає послідовність ОСОМУЕБРРУТ (ЗЕБО ІЮО МО:101); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗЕМУМН (ЗЕБО 0 МО: 102), СОК НО, що включає послідовність
ЕТММЕСТТТАМАЮЗМУМО (ЗЕО ІЮ МО:103), і СОК НЗ, що включає послідовність ЗОЇ БО (5ЕО
ІО МО:104); (т) Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КАБОЕТМНУІ М (ЗЕО ІЮО МО:105),
СОК 12, що включає послідовність МАМО (5ЕБО ІЮ МО:106), і СОК ІЗ, що включає послідовність ОСОЗУКТРУТ (5ЕБЕО ІЮ МО:107); і Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність БОМУУМ (ЗЕБО ОО МО: 108) СОК НО, що включає послідовність 60 МІ ЗОАНТОІКАБЗІ 55 (ЗЕО ІЮО МО:109), і СОК НЗ, що включає послідовність ЗОУУЗКУБІ ОМ
(ЗЕО ІЮО МО:110); або (п) Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КЗБОБІРКТЗАКМКМІ М (ЗЕО ІЮ
МО:99), СОК 12, що включає послідовність УУАЗТЕКЗ (ЗЕО ІЮ МО:100), і СОК ІЗ, що включає послідовність ОСОМУЕБРРУТ (ЗЕБО ІЮО МО:101); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗЕМУМН (5ЕБЕО ОО МО:102), СОК НО, що включає послідовність
ЕТММЕСТТТАМАЮЗМКО (5ЕО ІЮ МО:103), і СОК НЗ, що включає послідовність СЕС ОО (ЗЕО
ІО МО:118).
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з 5ЕО ІЮ
МО:112, де амінокислота Хаа у положенні 1 в 5ЕО ІЮ МО:112 являє собою О або ЕЕ, і амінокислота Хаа у положенні 2 в ЗЕО ІЮ МО:112 являє собою М, І або М. У деяких варіантах втілення, антитіло також включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де МІ включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з БЕО ІО МО:111. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де МІ включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:111. У будь-яких попередніх варіантах втілення ідентичність послідовності може становити 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095. У деяких варіантах втілення, МН антитіла включає послідовність 5ЕО І МО: 112, і Мі антитіла включає послідовність ФЕО ІЮ МО:111.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з 5ЕО І
МО:120 або 5ЕО ІОЮО МО:156. У деяких варіантах втілення, антитіло також включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де Мі включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з БЕО ІЮ МО:119. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де Мі включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з БЕО ІО МО:119. У будь-яких попередніх варіантах втілення ідентичність послідовності може становити 9695, 9790, 9895, 9995 або 10095. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ) і варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МІ. включає послідовність БЕО ІЮ МО:119, ії МН включає послідовність БЕО ІЮ МО:120 або 5ЕО ІО МО:156.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де МІ. включає послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ, вибраної з послідовності МІ. з
ЗЕО ІЮО МО:158, 5ЕО ІЮО МО:159, 5БО ІЮО МО:С160, 5БО 10 МО:161, 5БО ІЮ МО:162, 5ЕО І
МО:163, 5ЕО 10 МО:164, 5БО І МО:165, 5ЕО ІЮ МО:166, 5Е6ЕО ІЮ МО:167 й 5ЕО ІЮ МО:168. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга (УН), яка включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності УН, вибраної з послідовності МН з
ЗЕО ІЮ МО:127, 5ЕО ІЮО МО:133, 5БО 10 МО:134, 5БО ІЮ МО:169, 5БО ІЮ МО:170, 5ЕО І
МО:171, 5ЕО ІЮ МО:172, БЕО ІЮО МО:173, 5ЕО ІЮ МО:174, 5ЕО ІЮО МО:175 і 5ЕО ІО МО:176. У будь-яких попередніх варіантах втілення ідентичність послідовності може становити 9695, 9790, 9895, 9995 або 10095. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ) і варіабельну область важкого ланцюга (МН), де: (а) МІ антитіла включає амінокислотну послідовність що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:158, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:169; (б) Мі. антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:159, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:170; (с) Мі антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:160, і МН антитіла 60 включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:171; (4) Мі. антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з ЗЕО ІЮО МО:161, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:172; (6) МІ. антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:162, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:173; () Мі антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:163, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:174; (9) Мі антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:164, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:175; (п) МІ. антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:165, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:176; () М антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:166, і УН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:133; () Мі. антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з ЗЕО ІЮО МО:167, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:134; або
Зо (К) Мі антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9590 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ з 5ЕО ІЮ МО:168, і МН антитіла включає амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН з ЗЕО ІЮ МО:127.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-МЖ/ТА моноклональне антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ) і варіабельну область важкого ланцюга (МН), де: (а) Мі антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІЮ МО:158, ії МН антитіла включає послідовність МН з ЗЕО ІЮ МО:169; (б) М. антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІО МО:159, ії МН антитіла включає послідовність МН з ЗЕО ІЮ МО:170; (с) МІ антитіла включає послідовність МІ з 5ЕБО ІЮ МО:160, і МН антитіла включає послідовність МН з 5ЕО ІЮ МО:171; (4) Мі. антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІО МО:161, ії МН антитіла включає послідовність МН з ЗЕО ІЮ МО:172; (е) Мі. антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІЮ МО:162, і МН антитіла включає послідовність МН з ЗЕО ІЮ МО:173; () Мі антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІО МО:163, і МН антитіла включає послідовність МН з 5ЗЕО ІЮ МО:174; (9) Мі. антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІЮ МО:164, і МН антитіла включає послідовність МН з ЗЕО ІЮ МО:175;
БО (п) Мі. антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІЮ МО:165, і МН антитіла включає послідовність МН з БЕО ІЮ МО:176; () Мі антитіла включає послідовність МІ з 5ЕБЕО ІЮ МО:166, і МН антитіла включає послідовність МН з ЗЕО ІЮ МО:133; (Ї) М антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІЮ МО:167, і МН включає послідовність МН з
ЗЕО ІЮ МО:134; (К) МІ. антитіла включає послідовність МІ з БЕО ІО МО:168, і МН включає послідовність МН з
ЗЕО ІЮ МО:127; (Ї) МІ. антитіла включає послідовність МІ з 5ЕО ІЮО МО:113, ї МН включає послідовність МН з 5ЕО ІЮ МО:114; або 60 (т) МІ антитіла включає послідовність МІ з БЗЕО ІЮО МО:121, і МН включає послідовність МН з
ЗЕО ІЮ МО:138.
У деяких варіантах втілення антитіл, описаних вище, антитіло являє собою антигенсполучний фрагмент без області Ес. У деяких варіантах втілення, антитіло являє собою
Каб) або Р(ар)». У деяких варіантах втілення, антитіло також включає константну область важкого ланцюга і/або константну область легкого ланцюга, де константна область важкого ланцюга і/або константна область легкого ланцюга включають одну або декілька амінокислот, заміщених на залишки цистеїну. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну заміну А118С або 5400С, і/або константна область легкого ланцюга включає амінокислотну заміну М205С, де нумерація наведена відповідно до нумерації
ЕУ. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:149, і/або константна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:151. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:149, і константна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕОО ІЮ МО:150. У деяких варіантах втілення, константна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:148, і константна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:151.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де важкий ланцюг антитіла включає послідовність хЕО ІЮ МО:114, 5БЕО
ІО МО:116 або 5ЕО ІЮО МО:117, і легкий ланцюг антитіла включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:113; де амінокислота Хаа у положенні 2 в ЗЕО ІЮ МО:116 або 5ЕО ІОЮО МО:117 являє собою М, І або
М. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де важкий ланцюг антитіла включає послідовність хЕО ІЮ МО:114, 5БЕО
ІО МО:116 або 5ЕО ІЮ МО:117, і легкий ланцюг антитіла включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:115; де амінокислота Хаа у положенні 2 в ЗЕО ІЮО МО:116 або 5ЕО ІОЮО МО:117 являє собою М, І або
М. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де важкий ланцюг антитіла включає послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО:139, 5ЕО ІЮ МО:140, 5ЕО ІО МО:141, 5ЕО ІЮ МО:142, 5ЕО ІЮ МО:143 й 5ЕО ІЮО МО:144; і легкий ланцюг антитіла включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:113. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає легкий ланцюг і
Зо важкий ланцюг, де важкий ланцюг антитіла включає послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮО МО:139, БЕО ІЮО МО:140, 5ЕО ІЮ МО:141, БЕО ІО МО:142, 5ЕО ІЮ МО:143 і
ЗЕО ІЮ МО:144; і легкий ланцюг антитіла включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:115.
У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де важкий ланцюг антитіла включає послідовність хЕО ІЮ МО:146, ЗБЕ
ІО МО:147, 5ЕО ІЮ МО:157 або 5ЕО ІО МО 124, і легкий ланцюг антитіла включає послідовність
ЗБЕО ІО МО:121. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає важкий ланцюг і легсий ланцюг, де важкий ланцюг включає послідовність ЗЕ ІЮ
МО:146, 5БО ІЮ МО:147, 5БО І МО:157 або 5ЕБО ІЮО МО:124, і легкий ланцюг включає послідовність «ЕО ІЮ МО:123. У деяких варіантах втілення, виділене анти-М/ТА моноклональне антитіло включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де важкий ланцюг включає послідовність ХЕО
ІЮО МО:146, 5ЕБЕО ІЮ МО:147, 5ЕО ІО МО:157 або 5ЕО ІЮО МО:124, і легкий ланцюг включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:145.
У деяких варіантах втілення будь-якого з антитіл, описаних вище, антитіло не відноситься до ІДМ ізотипу. У деяких варіантах втілення будь-якого з антитіл, описаних вище, антитіло відноситься до ізотипу ДС (наприклад, ІдС1, Ідс2, ІдСеЗ, Ідс4), ЧЕ, дО або ІдА (наприклад,
ІДАТ або ІдА2). У деяких варіантах втілення будь-якого з антитіл, описаних вище, антитіло продукується клітиною-хазяїном у культурі клітин. У деяких варіантах втілення, клітиною- хазяїном є не людська клітина. У деяких варіантах втілення, клітина-хазяїн є прокаріотичною або еукаріотичною. У деяких варіантах втілення, клітина-хазяїн є клітиною ссавців (наприклад, людською або не людською клітиною ссавців). У деяких варіантах втілення, клітина-хазяїн являє собою клітину СНО.
В іншому аспекті, даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, що включає будь- які антитіла, розкриті в даному документі, і фармацевтично прийнятний носій.
У ще одному аспекті, даний винахід також передбачає виділену нуклеїнову кислоту, що кодує будь-які антитіла, розкриті в даному документі. У ще одному аспекті, даний винахід передбачає вектор, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує будь-які антитіла, розкриті в даному документі. В іншому аспекті вектор являє собою експресуючий вектор.
Даний винахід також передбачає клітину-хазяїна, яка включає нуклеїнову кислоту, що кодує будь-які антитіла, розкриті в даному документі. В іншому варіанті втілення клітина-хазяїн є бо прокаріотичною або еукаріотичною. У деяких варіантах втілення, клітина-хазяїн є клітиною ссавців (наприклад, людською або не людською клітиною ссавців). У деяких варіантах втілення, клітина-хазяїн являє собою клітину СНО.
Даний винахід також передбачає спосіб одержання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує будь-які антитіла, розкриті в даному документі, в умовах, що підходять для експресії нуклеїнової кислоти; і виділення антитіла, що продукується цією клітиною. У деяких варіантах втілення, спосіб також включає очищення антитіла.
Інший аспект даного винаходу являє собою сполуку кон'югат антитіло-антибіотик (ААС), що включає антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (МУТА) згідно з даним винаходом, ковалентно приєднану за допомогою пептидного лінкера до антибіотика типу рифаміцину. У деяких варіантах втілення кон'югатів антитіло-антибіотик, розкритих у даному винаході, антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА) сполучається з ЄїарнуІососсив ашеийв. У деяких варіантах втілення, антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки сполучається з метицилін- резистентним 5іарнуіососсиз ашгеив (МА5А).
У деяких варіантах втілення кон'югатів антитіло-антибіотик, розкритих у даному документі, антитіло включає: і) СОВ Ї ланцюга і Н ланцюга, що мають послідовності ФЕО 10 МО 99-104, або СОВ І ланцюга і Н ланцюга, що мають послідовності ФЕО ІЮ МО: 33-38; або її) МІ, що має послідовність ФЕО ІЮ МО:119 або 5ЕО ІЮ МО: 123, спарену з МН, що має послідовність 5ЕО 10
МО:120 або 5ЕО ІО МО: 156; або ії) МІ, що має послідовність БЕО ІО МО:111, спарену з МН, що має послідовність 5ХЕО ІЮ МО:112.
У деяких варіантах втілення, антибіотик типу рифаміцину являє собою антибіотик типу рифалазилу. У деяких варіантах втілення, антибіотик типу рифаміцину включає четвертинний амін, приєднаний до пептидного лінкера. У деяких варіантах втілення, антибіотик приєднаний до антитіла через пептидний лінкер, що приєднаний до цистеїну, введеному методами генної інженерії в анти-МТА антитіло. Цистеїн може бути введений методами генної інженерії в І. або
Н ланцюги модифікованого антитіла. У деяких варіантах втілення, залишок цистеїну перебуває в Ї ланцюгу. У деяких варіантах втілення, залишок цистеїну перебуває в Н ланцюгу.
Сполуки кон'югати антитіло-антибіотик даного винаходу можуть включати пептидний лінкер, що являє собою лінкер, який розщеплюється цистеїновою протеазою 5. ашеив; такі лінкери
Зо включають лінкер, який розщеплюється стафопаїном В або стафопаїном А. В одному з варіантів втілення, протеаза 5. ашеи5 являє собою ендопептидазу. В іншому варіанті втілення, лінкер являє собою лінкер, який розщеплюється протеазою хазяїна, переважно, лінкер, який розщеплюється людською протеазою катепсином В (наприклад, дипептидний лінкер ма1-сій).
Сполука кон'югату антитіло-антибіотик, наведена як приклад, має формулу:
АРр-(І -арх)р, де:
АБ являє собою антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки;
Ї являє собою пептидний лінкер, що має формулу: -ЗИ-Рер-у-, де біг являє собою сполучну частину; Рер являє собою пептид, що складається з двох- дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер; арх являє собою антибіотик типу рифаміцину; і р являє собою ціле число від 1 до 8.
В одному з варіантів втілення, будь-які із зазначених вище сполук кон'югатів антитіло- антибіотик мають співвідношення антибіотик/антитіло (ААК), рівне 2 або 4.
У деяких варіантах втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик має формулу І: (о);
І, Ге! | - і) ХУ ов
Е! та Ф он АН
АБ- - - - т 2 зо НО и
НМ о і де:
пунктирні лінії означають необов'язковий зв'язок;
Е являє собою Н, С1-Сі2 алкіл або С(О)СН:;
В' являє собою ОН;
В? являє собою СНАМ-(гетероцикліл), де гетероцикліл необов'язково заміщений однією або декількома групами, незалежно вибраними з С(О)СНвз, С1-С12 алкілу, Сі-С12 гетероарилу, С2-Сго гетероциклілу, Св-Сго арилу та Сз-С12 карбоциклілу; або В' ії Кк? утворюють п'яти- або шестичленний конденсований гетероарил або гетероцикліл, і необов'язково утворюють спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, де спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце необов'язково заміщене Н, Е, СІ, Ви, І, С1-С12 алкілом або ОН;
Ї являє собою пептидний лінкер, приєднаний до К: або до конденсованого гетероарилу або гетероциклілу, утвореному ЕК" і Кг; і
АБ являє собою антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/УТА).
У деяких із цих варіантів втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що має формулу Ї, відповідає формулі: (о);
І о | М-- ві о | хх (Ф154 / в й Що
Ав- Я - - -(2 3) М 7 о Но и,
НМ о
Сх де
ВЗ незалежно вибраний з Н і С.-Сі2 алкілу; п являє собою 1 або 2;
В" вибраний з Н, Е, СІ, Вг, І, С1-С12 алкілу та ОН; і 2 вибраний з МН, М(С1-С-і2 алкілу), О і 5.
У деяких із цих варіантів втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що має формулу Ї, відповідає формулі: (в)
І Ге! | - в) Кк ок 1 Фф
Кк Фф (Фін! АН ші Ф) ?,
Фін. /;, пу
М НМ (Ф) (во ртжє рі в
АВ--- 1 ' де РЕ? вибраний з Н і С.-С:» алкілу; і п являє собою 0 або 1.
У деяких із цих варіантів втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що має формулу Ї, відповідає формулі:
(в)
І о | - о Кк ок (б Ма С он хон
М
М но т, дь--- Н отит
НМ о сх де РЕ? вибраний з Н і С.-С:» алкілу; і п являє собою 0 або 1.
У деяких із цих варіантів втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що має формулу Ї, відповідає формулі: (в)
І, о | ю- (ен! о | и Ок 5 Гм (в) о НО и (вах, м. НМ о дві 5 Ж де РЕ? незалежно вибраний з Н і С.-С:2 алкілу; і п являє собою 0 або 1.
У деяких із цих варіантів втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що має формулу Ї, відповідає формулі: (в)
І Ге! | М- (Фін! о | МИ ок г й о Мои
НМ
АЬ-- 1 - -(ВЗ М о сх де ЕЗ незалежно вибраний з Н і С1-Сі» алкілу; і п являє собою 1 або 2.
У деяких із цих варіантів втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що має формулу Ї, відповідає формулі:
(о);
І, о | - он о Ку ОАдс сс он он хх КУ
М о о НО и,
Ф Нм о
АВ--І - -(СНз)»М в
У деяких варіантах втілення, передбачена сполука кон'югат антитіло-антибіотик (ААС), що включає антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА) даного винаходу, ковалентно приєднане за допомогою пептидного лінкера до антибіотика типу рифаміцину, де пептидний лінкер має формулу: -ЗИ-Рер-у-, де 5іг являє собою сполучну частину, ковалентно приєднану до антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА); Рер являє собою пептид, що складається з двох-дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер, ковалентно приєднаний до антибіотика типу рифаміцину. У деяких із цих варіантів втілення, 5іг має формулу: о
Дня і, де КЯ вибраний з групи, що складається з С1-Стіо алкілену-, -Сз-Св карбоцикло, -О-(С1-Св алкілу)-, -арилену-, -С1-С1о алкілен-арилену-, -арилен-С1-Сто алкілену-, -С1-С1о алкілен-(Сз-Св карбоцикло)-, -(Сз-Св карбоцикло)-С1-Сіо алкілену-, -Сз-Св гетероцикло-, -С1-Сто алкілен-(Сз-Св гетероцикло)-, -(Сз-Св гетероцикло)-С1-С1о алкілену-, -"СНаСНгО)- і -СНгСНгО)-СНе-; і г являє собою ціле число в діапазоні від 1 до 10. В одному з варіантів, КУ являє собою -(СНг)5- . У деяких із цих варіантів втілення, Рер включає від двох до дванадцяти амінокислотних залишків, незалежно вибраних із гліцину, аланіну, фенілаланіну, лізину, аргініну, валіну і цитруліну. В одному з варіантів, Рер вибраний з валін-цитруліну (маІ-сйї, мс); фенілаланін-лізину (їК); ацпАРАСвсо! (БО І МО: 126); їрт-сї; ОРіте БЕ (5ЕБО ІЮ МО: 129); валін-цитрулін- фенілаланіну (маІ-сйі-рпе); ОСАБА (ЗЕО ІЮ МО: 131) і Ії АРСа (ЗЕО ІО МО: 128). У деяких із цих варіантів втілення, У включає пара-амінобензил або пара-амінобензилоксикарбоніл.
У деяких варіантах втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик має формулу:
АА1
Н є,
М арх
АЬ--5и-М а
Нн (о, ААд2 де АБ, 5ІГ, У і арх такі, як визначено в даному документі, та АА!Т і АА2 незалежно вибрані з бічних ланцюгів амінокислот. У деяких таких варіантах втілення, бічний ланцюг амінокислоти незалежно вибраний з Н, -СНз, -СНа(СеН5), «СНгСНа.СНаСНеаМН», -«СНаСНа.СНаМнНОе(МН)МН», -
СнНеН(СНз)СНз ії -«СНЕСНаСНаМНО(О)МН». У деяких таких варіантах втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик має формулу:
Н є)
І
МА
Ар--ВЕ--М ух
Н г
НМ об, о о АТ Н о ра я м
Ар л-арх в) НО АА? о пра я МК р
Ар М - --7 арх
І В У о; н г
НМ оте, є)
О АН ду е) Н о лААгН є) о но дуе сит Ж х мА А, о нн о й Н
Х в о см. о е) о Ан о фут сич ЖК х дЬ М он
Н
,; о А о н о , арх
І
М. чи м.
Ар М - М ' ї І (Ф,; нн о й Н
НМ от ем,
У деяких таких варіантах втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик має формулу:
Ге! Ге в (в) ре М арх
Мч М 1 7 й в (е) (е) Ад?/Н де К" незалежно вибраний з Н і С1-С:12 алкілу. У деяких таких варіантах втілення, сполука кон'югат антитіло-антибіотик має формулу: (в) и, Ге) | -- он о | Ко ОАс (в) НМ о АД Н Ге! су Ш
АБ ки и с 0 О /АА2 (в)
Ли, Ге! | -- он (в) | КУ ОАс о М о о НО ис, : Ду
Ге! Н Ге! су (в)
АЬ ми а с
Н г НН о о З
Мн ; об мн,
(в)
Пр, Ге! | - он о | КЗ ОАс
М Го) Ге) НО,,, "у в; Ф НМ о (о) АА1 (в! М сич М о, і З ль М ї М
О /Ад2 (в) або (в) т, Ге! | - он о | ж ОАс ( о он кед
М (в) о НО ит о Ф НМ о вен
М ль проводи вах а ну кн (о) ме
МН он,
Інший аспект даного винаходу являє собою фармацевтичну композицію, що включає сполуку кон'югат антитіло-антибіотик даного винаходу.
Інший аспект даного винаходу являє собою спосіб лікування бактеріальної інфекції шляхом введення пацієнту терапевтично ефективної кількості сполуки кон'югату антитіло-антибіотик відповідно до будь-якого з наведених вище варіантів втілення. В одному з варіантів втілення, пацієнтом є людина. В одному з варіантів втілення, бактеріальна інфекція являє собою інфекцію Єїарнуососсив айгеив. У деяких варіантах втілення, у пацієнта діагностують інфекцію 5. ашеивз. У деяких варіантах втілення, лікування бактеріальної інфекції включає зниження бактеріального навантаження.
Даний винахід також передбачає спосіб знищення внутрішньоклітинного 5. ашеив у клітинах-хазяїнах пацієнта, інфікованого 5. ашеивх, без знищення клітин-хазяїнів, шляхом введення сполуки кон'югату анти-М/ТА-антибіотик відповідно до будь-якого з наведених вище варіантів втілення. Також передбачений спосіб знищення персистуючих бактеріальних клітин (наприклад, 5іарпй А) /л умо шляхом приведення персистуючої бактерії в контакт із ААС відповідно до будь-яких попередніх варіантів втілення.
В іншому варіанті втілення, спосіб лікування також включає введення другого терапевтичного агента. В іншому варіанті втілення другий терапевтичний агент являє собою антибіотик, у тому числі антибіотик проти 5. аштеи5 загалом, або МЕ5ЗА, зокрема.
В одному з варіантів втілення, другий антибіотик, що вводять у комбінації з сполукою кон'югатом антитіло-антибіотик даного винаходу, вибраний з антибіотиків наступних структурних класів: (ї) аміноглікозиди; (її) бета-лактами; (ії) макроліди/циклічні пептиди; (ім) тетрацикліни; (м) фторхіноліни/ фторхінолони; (мі) оксазолідинони.
В одному з варіантів втілення, другий антибіотик, що вводять у комбінації з сполукою кон'югатом антитіло-антибіотик даного винаходу, вибраний з кліндаміцину, новобіоцину, ретапамуліну, даптоміцину, (з5К-2140944, бО-400549, ситафлоксацину, тейкопланіну, триклозану, нафтиридону, радезоліду, доксорубіцину, ампіциліну, ванкоміцину, іміпенему,
Зо дорипенему, гемцитабіну, далбаванцину й азитроміцину.
У деяких варіантах втілення, у даному документі бактеріальне навантаження в суб'єкта було знижене до рівня, що не виявляється, після лікування. В одному з варіантів втілення, посів крові пацієнта є негативним після лікування у порівнянні з позитивним посівом крові до лікування. У деяких варіантах втілення, у даному документі стійкість до бактерій у суб'єкта є невиявленою або низькою. У деяких варіантах втілення, у даному документі суб'єкт не відповідає на лікування метициліном або ванкоміцином.
Інший аспект даного винаходу являє собою спосіб одержання антитіла або сполуки кон'югату антитіло-антибіотик даного винаходу, який включає кон'югування антибіотика типу рифаміцину з антитілом проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (МУТА).
Інший аспект даного винаходу являє собою набір для лікування бактеріальної інфекції, який включає фармацевтичну композицію даного винаходу та інструкції із застосування.
Інший аспект даного винаходу являє собою інтермедіат лінкер-антибіотик, що має формулу
І: (в)
І, Ге) | - (6) хх (Фі54
Е!
Я Фін АОН хХ-х -к252 о НО ит
НМ о
З І, де: пунктирні лінії означають необов'язковий зв'язок;
Е являє собою Н, С1-Сі2 алкіл або С(О)СН:;
А! являє собою ОН;
В? являє собою СН-АМ-(гетероцикліл), де гетероцикліл необов'язково заміщений однією або декількома групами, незалежно вибраними з С(О)СНз, С1-Сі12 алкілу, Сі-С12 гетероарилу, С2-Сго гетероциклілу, Св-Сго арилу і Сз-С12 карбоциклілу; або Р їі Кк? утворюють п'яти- або шестичленний конденсований гетероарил або гетероцикліл, і необов'язково утворюють спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, де спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільное кільце необов'язково заміщене Н, Е, СІ, Вг, І, С1-С12 алкілом або ОН;
Ї являє собою пептидний лінкер, приєднаний до К2? або конденсованого гетероарилу або гетероциклілу, утвореному В" і В-; та має формулу: -ЗИ-Рер-у-, де біг являє собою сполучну частину; Рер являє собою пептид, що складається з двох- дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер; і
Х являє собою реакційноздатну функціональну групу, вибрану з малеїіміду, тіолу, аміно, броміду, бромацетамідо, йодацетамідо, п- толуолсульфонату, йодиду, гідроксилу, карбоксилу,
Зо піридил дисульфіду і М- гідроксисукциніміду.
У деяких варіантах втілення інтермедіату лінкер-антибіотик, що має формулу ІІ, Х являє собою ? ( 4 М о з або о .
У деяких варіантах втілення, інтермедіат лінкер-антибіотик, що відповідає формулі Ії, має формулу:
І, Ге! | -
Ге (е); КО (Ф/54 х- Я -(«863 ух м 7 о НО ит,
НМ о і де
ВЗ незалежно вибраний з Н і С.-Сі2 алкілу; п являє собою 1 або 2;
В" вибраний з Н, Е, СІ, Ве, І, С1-Сі2 алкілу та ОН; і 2 вибраний з МН, М(С1-С-і2 алкілу), О і 5.
У деяких із цих варіантів втілення, інтермедіат лінкер-антибіотик, що відповідає формулі ЇЇ, має формулу: (о);
І о | -- он о | м Ос
М (Ф) (Ф) НО,,, ЩІ
Фе Нм о
З або (в) ть о | 0--
Он о | КУ ОАс
М Ге) о НО, пу о Ф НМ о і вв ра - М Ж
Н о Е н (в) йо
Х о Мне
Також передбачений спосіб знищення внутрішньоклітинного 5. ашгеив у клітинах-хазяїнах пацієнта, інфікованого 5. ашеив, без знищення клітин-хазяїнів, що включає введення кон'югату анти-М/ТА-антибіотик, докладно описаного в даному документі.
Варто розуміти, що одна, декілька або всі особливості різних варіантів втілення, описаних у даному документі, можуть бути об'єднані, щоб сформувати інші варіанти втілення даного винаходу. Ці та інші аспекти даного винаходу будуть очевидні фахівцям у даній області техніки.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
На Фіг. 1 показано, що вплив ванкоміцину або рифампіцину вбиває МК5А залежно від концентрації. Ванкоміцин тестували в концентрації 2 мкг/мл (білі квадрати) і 20 мкг/мл (чорні квадрати). Рифампіцин тестували в концентрації 0,02 мкг/мл (білі трикутники) і 0,2 мкг/мл (чорні трикутники).
На Фіг. 2 показано, що інфекція від інфікованих перитонеальних клітин могла передаватись остеобластам у присутності ванкоміцину.
На Фіг. 3 показана клітинна стінка грампозитивних бактерій, таких як 5. ашгеив, і схематичне зображення шарів тейхоєвих кислот клітинної стінки (МУТА), ліпотейхоєвих кислот (ІТА) і пептидогліканів (РОМ), які стабілізують клітинну мембрану та забезпечують сайти прикріплення.
На Фіг. 4 наведена хімічна структура та глікозильні модифікації тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА), докладно описані у Визначеннях.
На Фіг. 5 показані можливі механізми активації лікарського засобу для кон'югатів антитіло- антибіотик (ААС). Активний антибіотик (Абх) вивільняється після інтерналізації ААС у клітини ссавців.
На Фіг. А і 6В підсумовані характеристики АБ, які при первинному скринінгу бібліотеки тАр демонструють сполучення (за даними ЕГІ5ЗА) з препаратами клітинних стінок штамів 5. ашгеив
ОБАЗОО або УмМоод46б6, як описано у Прикладі 21. Серед АБ, які сполучаються з УМТА, 4 специфічні до М/ТА альфа, і 13 специфічно сполучаються з М/ТА бета.
На Фіг. 7А показаний аналіз із макрофагами /л7 уйго, що демонструє, що ААС знищує внутрішньоклітинні МАК5А.
На Фіг. 7В показано, що в макрофагах, остеобластах (МОб63), клітинах дихального епітелію (АБ549) і людських ендотеліальних клітинах пупкової вени (НОМЕС) відбувається внутрішньоклітинне знищення МЕ5А (штам О5АЗО0) під дією тіо-54497-НО-А118С-рірвок 102 у концентрації 50 мкг/мл у порівнянні з голим, некон'югованим анти-М/ТА антитілом 54497.
Пунктирна лінія означає межу виявлення для цього аналізу.
На Фіг. 7С наведене порівняння ААС, отриманих із використанням інтермедіатів лінкер- антибіотик ГГ А-51 і ГА-54 (Таблиця 2). Проводили опсонізацію МЕ5А антитілом 54497 як таким або ААС (ААС-102 або ААС-105 (Таблиця 3)) у різних концентраціях у діапазоні від 10 мкг/мл до 0,003 мкг/мл.
Зо На Фіг 70 показано, що ААС знищує внутрішньоклітинні бактерії без ушкодження макрофагів.
На Фіг. 7Е показане виділення живих ОБАЗОО з лізату клітин макрофагів. З макрофагів, інфікованих опсонізованими 5-4497-ААС бактеріями було виділено менше (в 10000 разів менше) живих 5. аштеиз у порівнянні з обробкою голим антитілом у контролі.
На Фіг. ВА показана ефективність тіо-54497-НО-АТ1180-МО-мс-РАВ-рірвов 102 ААС /л умо у моделі внутрішньочеревинної інфекції на мишах А/). Мишей інфікували МК5БА шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції й обробляли 50 мг/кг антитіла 54497 як такого або 50 мг/кг 102
ААС (НОС-А114С за Кабраї - НС-А118С ЕЕ), що вводять шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції.
Мишей умертвляли на 2 день після інфекції та вимірювали загальне бактеріальне навантаження у перитонеальному супернатанті (позаклітинні бактерії), перитонеальних клітинах (внутрішньоклітинні бактерії) або в нирках.
На Фіг. 88 показані результати для внутрішньовенної моделі інфекції /л у//о на мишах АЛ).
Мишей інфікували МК5А шляхом внутрішньовенної ін'єкції й обробляли 50 мг/кг антитіла 54497 як такого, 50 мг/кг тіо-54497-НОС-АТ1180-МО-мс-РАВ-рірвок 102 ААС або простою сумішшю 50 мг/кг антитіла 54497 ж 0,5 мг/кг вільного рифаміцину. Сірою пунктирною лінією позначена межа виявлення для кожного органу.
На Фіг. 9А показана ефективність тіо-54497-НОС-А1180-МО-мо-РАВ-рірвов 102 ААС у моделі внутрішньовенної інфекції за допомогою титрування 54497-рірВОВ ААбС.
На Фіг. 9В показано, що тіо-54497-НО-А1180-МО-мс-РАВ-диметилрірвОК 105 ААС більш ефективне, ніж тіо-54497-НО-А1180-МО-мс-РАВ-рірВОВ 102 ААС, що продемонстровано на моделі внутрішньовенної інфекції за допомогою титрування. Лікування антитілом 54497, 102
ААС або тіо-54497-НОС-А1180-МО-мсо-РАВ-диметил-рірВвОм. 112 ААС проводили шляхом їхнього введення в зазначених дозах через 30 хвилин після інфекції. Мишей умертвляли на 4 день після інфекції та, роблячи посіви, визначали загальну кількість бактерій, що вижили, на мишу (поєднували матеріал 2 нирок).
На Фіг. 9С показано, що тіо-54497-НО-А1180-МО-мс-РАВ-диметилрірвОК 105 ААС більш ефективне, ніж антитіло 54497 або антибіотик диметилрірвок 7 як такі, що продемнстровано в моделі внутрішньовенної інфекції. Мишей СВ17.5СІЮ інфікували 2х107 КУО МА5БА шляхом внутрішньовенної інфекції. Через один день після інфекції мишей обробляли 50 мк/кг антитіла 60 54497, 50 мг/кг ААС 105 або 0,5 мг/кг диметил-рірвоє 7, еквівалентною дозою антибіотика, що міститься в 50 мг/кг ААС. Мишей умертвляли на 4 день після інфекції та, роблячи посіви, визначали загальну кількість бактерій, що вижили, на мишу (поєднували матеріал 2 нирок).
На Фіг. 10А показаний рівень анти-5. ашеив антитіл у сироватці крові людини. Пацієнти, інфіковані 5. ашгеив, або здорові донори містять у сироватці крові високі кількості специфічних до М/ТА антитіл з тією самою специфічністю, що й анти-МУТА 54497. Зв'язування різних зразків сироватки дикого типу (М/Т) з МК5А, експресуючим антиген 54497, досліджували у порівнянні з сполученням з мутантним штамом МЕ5А ТагМ/Тагз ОКО (подвійний нокаут), у якого відсутні модифікації цукру, розпізнавані антитілом 54497.
На Фіг. 108 показано, що ААС ефективне у присутності фізіологічних рівнів людських Іде (10 мг/мл), що продемонстровано в аналізі макрофагів /л У/то із штамом МЕЗА ОЗАЗО0. Тіо-54497-
НО-АТ1180-МО-мс-РАВ-диметилрірВвОкК 105 ефективний у присутності 10 мг/мл людських Ід.
Штам МА5А 5АЗОО опсонізували ААС як таким або ААС, розведеним в 10 мг/мл людських до.
Загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, оцінювали через 2 дні після інфекції.
На Фіг. 10С показана модель інфекції /л м/о, що демонструє, що ААС ефективне у присутності фізіологічних рівнів людських дО. Дані об'єднані з З незалежних експериментів із використанням двох окремих препаратів ААС тіо-54497-НО-А1180-МО-мс-РАВ-диметилрірвок 105 або 112. У мишей, оброблених ААС, спостерігалось зниження бактеріального навантаження більше ніж на 4 порядки (І-критерій Стьюдента р-0,0005).
На Фіг. 11А показана модель інфекції /л у//о, що демонструє, що ААС більш ефективне, ніж сучасний стандарт лікування (5ОС) антибіотик ванкоміцин, у мишей, в яких створений нормальний рівень людських ДО. Мишей обробляли антитілом 54497 (50 мг/кг), ванкоміцином (100 мг/кг), тіо-54497-НО-А1180-МО-мс-РАВ-диметилрірВвОкК 105 ААС (50 мг/кг) або ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом, що не розпізнає МЕК5А, тіо-пи-анти 900 585-НОС-АТ1180-МО-мо-РАВ-диметилрірвок 110 ААС (50 мг/кг).
На Фіг. 118 показане відносне зв'язування анти-5. агеив антитіл із штамом ИЗАЗОО, виділеним із нирок у моделі інфекції /л у/хо, вимірюване за допомогою РАС5. Антитіло 54497 розпізнає модифікацію М-ацетилглюкозаміном, сполученим із тейхоєвою кислотою клітинної стінки (М/ТА) через бета-аномерний зв'язок на клітинній стінці 5. ашгеив. Антитіло 57578
Зо сполучається з аналогічною модифікацією М-ацетилглюкозаміном, приєднаним до М/ТА через альфа-аномерний зв'язок. Антитіло ПЕТ є позитивним контролем для анти-МЕЗА антитіл, що розпізнають модифікації цукру, виявлені в сімействі білків, заякорених у клітинній стінці та, що містить ЗОК-повтор. Антитіло ДО є негативним контролем та являє собою людський Ідс:, що не розпізнає 5. ашгеийв.
На Фіг. 11С показана модель інфекції /л у/мо, що демонструє, що у мишей, в яких створений нормальний рівень людських ідо, ААС тіо-56078-НО А1140-ІЇ СМ/Т-МО-мс-РАВ-диметилрірвок 129 більш ефективний, ніж голе анти-М/ТА антитіло 54497, що вводять відповідно до того самого режиму дозування, що й на Фіг. 11А. Мишей обробляли антитілом 54497 (50 мг/кг) або тіо-56078-НО А1140-І СМ/Т-МО-мо-РАВ-диметилрірВом. 129 ААС (50 мг/кг).
На Фіг. 12 наведений аналіз інгібування росту, що демонструє, що ААС не є токсичним для 5. айгеив, поки лінксер не буде розщеплений катепсином В. Ліворуч схематично показаний аналіз вивільнення з катепсином (Приклад 20). ААС обробляли катепсином В для вивільнення вільного антибіотика. Загальний рівень активності антибіотика у випадку інтактного ААС у порівнянні з ААС, обробленим катепсином В, визначали, роблячи серійні розведення отриманих реакційних сумішей і визначаючи мінімальну дозу ААС, при якій відбувалося інгібування росту 5. ашгеив. Верхній правий графік ілюструє аналіз вивільнення з катепсином для тіо-54497-НО-
А1180-МО-мс-РАВ-рірВОК 102, а нижній правий графік ілюструє аналіз вивільнення з катепсином для тіо-54497-НОС-А1180-МО-мо-РАВ-диметилрірвок 105.
На Фіг. 13А наведене вирівнювання амінокислотної послідовності варіабельних областей легких ланцюгів (МІ) чотирьох людських анти-М/ТА альфа антитіл (ЗЕО ІО МОЗ 25, 27, 29 і 31, відповідно, по порядку). Підкреслено послідовності СОК 11, 12 ї ІЗ відповідно до нумерації
Кабаї.
На Фіг. 138 наведене вирівнювання амінокислотної послідовності варіабельних областей важких ланцюгів (МН) чотирьох людських анти-М/ТА альфа антитіл, наведених на Фіг. 1ЗА.
Підкреслено послідовності СОК НІ, Н2 і НЗ відповідно до нумерації Кабраї (ЗЕО ІЮ МОБ 26, 28,
ЗО ї 32, відповідно, по порядку).
На Фіг. 14 наведені послідовності СОК ГІ. ї Н ланцюгів 13 людських анти-МТА бета антитіл (ЗЕО ІЮ МОБ 33-110).
На Фіг. 15А-1 їі 15А-2 наведене вирівнювання повнорозмірного ЇЙ ланцюга (легкий ланцюг) 60 анти-М/ТА бета АБ 6078 (немодифіковане антитіло) та його варіантів, м2, м3, м4 (ЗЕО Ір МО5
113, 113, 115, 113, 115, 113, 115 і 115, відповідно, по порядку). Підкреслено послідовності СОК
Ї1,12і13 відповідно до нумерації Кабаї. У прямокутниках показані залишки області контакту та залишки СОК відповідно до Кабаї і Споїпіа. Варіанти Ї ланцюга, що містять Су5, введений методами генної інженерії, відзначені символом С у чорному квадраті на кінці константної області (у цьому випадку залишок має номер 205 за ЕУ). Позначення варіанта, наприклад, м21І б-Сув5 означає, що варіант 2 містить Су5, введений методами генної інженерії, в Ї ланцюзі.
НОСІ С-Суб5х означає, що кожен з ланцюгів, Н і Її, містить Сух, введений методами генної інженерії. Варіанти 2, З і 4 містять зміни на початку Н ланцюга, як показано на Фіг. 158.
На Фіг. 158-1, 158-2, 158-3, 158-4 наведене вирівнювання повнорозмірного Н ланцюга (важкого ланцюга) анти-М/ТА бета антитіла 6078 (немодифіковане антитіло) та його варіантів, мг, х3, ма (ЗЕО ІЮ МОБ 114, 139-144 їі 143, відповідно, по порядку), у яких присутні зміни на початку Н ланцюга. Варіанти Н ланцюга, які містять Су5, введений методами генної інженерії, відзначені символом С у чорному квадраті на кінці константної області (у цьому випадку залишок має номер 118 за ЕМ).
На Фіг. 16А-1 і 16А-2 наведене вирівнювання повнорозмірного Її ланцюга анти-М/ТА бета антитіла 4497 (немодифіковане антитіло) і Суб-генно-інженерного І. ланцюга (ЗЕО ІЮ МОЗ 121, 123, 145 і 145, відповідно, по порядку). Підкреслено послідовності СОК1І1, 12 і І З відповідно до нумерації Кабаї. У прямокутниках показані залишки області контакту та залишки СОК відповідно до Кабаї і СпоїШпіа. Варіанти І ланцюга, що містять Су5, введений методами генної інженерії, відзначені символом С у пунктирному квадраті на кінці константної області (у цьому випадку залишок має номер 205 за ЕМ).
На Фіг. 168-1, 168-2, 168-3 наведене вирівнювання повнорозмірного Н ланцюга анти-МТА бета антитіла 4497 (немодифіковане) та його варіанта м8 із заміною О на Е у положенні 96 в
СОК НЗ, що містить або не містить Су, введений методами генної інженерії (ЗЕО ІЮ МОБ 146- 147, 157 і 147, відповідно, один по порядку). Варіанти Н ланцюга, які містять Су5, введений методами генної інженерії, відзначені символом С у чорному квадраті на кінці константної області (у цьому випадку залишок має номер 118 за ЕО).
На Фіг. 17А-1, 17А-2, 17А-3 наведене вирівнювання амінокислотних послідовностей повнорозмірних легких ланцюгів тринадцяти людських анти-М/ТА бета антитіл (5ЕО ІЮ МОБ 113,
Ко) 158-167, 121 і 168, відповідно, по порядку). Варіабельна область (МІ) відповідає амінокислотним положенням 1-107 відповідно до Кабаї. Підкреслено послідовності СОК1І1,12 ї
ІЗ відповідно до нумерації Кабаї.
На Фіг з 178-1 до 178-6 наведене вирівнювання амінокислотної послідовності повнорозмірних важких ланцюгів тринадцяти людських анти-М/ТА бета антитіл, наведених на
Фіг. 17А-1, 17А-2, 17А-3 (ЗЕО ІЮ МОБ 114, 169-176, 133-134, 138 і 127, відповідно, по порядку).
Варіабельна область (УН) відповідає амінокислотним положенням 1-113 відповідно до КаБбаї.
Підкреслені послідовності СОК НІ, Н2 ї НЗ відповідно до нумерації Кабваї. Амінокислота у положенні 118 за нумерацією Єи в Н ланцюзі, позначеному зірочкою, може бути замінена на Су з метою кон'югації лікарського засобу. Залишки, виділені чорним, можуть бути замінені на інші залишки, які не впливають на зв'язування антигена, з метою уникнути деамінування, ізомеризації аспарагінової кислоти, окислювання або М-глікозилювання.
На Фіг. 18А показане зв'язування мутантів АБ 4497 із клітинною стінкою 5. ашгеиз за даними
ЕПЗА.
На Фіг. 188 наведене порівняння АБ 4497 і його мутантів (ЗЕО ІЮ МОБ 177, 177, 177-178, 178-179, 179-180, 180 і 180, відповідно, по порядку) у виділених амінокислотних положеннях та їхній відносній силі зв'язування з антигеном за даними ЕГІЗА.
На Фіг. 19 наведені результати ЕАСЗ5 аналізу зв'язування АБ 6078 УЛ і мутантів із штамом
ИБАЗОО (5БАЗО0О-5РА), дефіцитним за білком А, як описано у Прикладі 23. Для мутантів показане таке саме зв'язування з 5. ашеив.
На Фіг. 20 показано, що попередня обробка 50 мг/кг вільних антитіл не ефективна в моделі внутрішньовенної інфекції. Мишам Ва!р/с шляхом внутрішньовенної ін'єкції вводили однократну дозу носія як контроль (РВ5) або 50 мг/кг антитіл за 30 хвилин до інфекції 2х107 КУО О5БАЗОО.
Експериментальні групи включали антитіло для ізотопічного контролю, що не зв'язується з 5. ацтеив (др), антитіло, спрямоване проти бета-модифікації тейхоєвих кислот клітинної стінки (4497), або антитіло, спрямоване проти альфа тейхоєвих кислот клітинної стінки (7578).
Контрольним мишам шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції два рази на день вводили 110 мг/кг ванкоміцину (Мапсо).
На Фіг. 21 і Фіг. 22 показано, що ААС, спрямовані або проти бета модифікації тейхоєвих кислот клітинної стінки, або проти альфа модифікації тейхоєвих кислот клітинної стінки, є бо ефективними в моделі внутрішньовенної інфекції на мишах, у яких створений нормальний рівень людських Дб. У мишей СВ17.5СІ0 створювали нормальний рівень людських Ідо, використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня, що становить, щонайменше, 10 мг/мл людських ІдсС у сироватці крові, після чого інфікували 2х107
КУО И5ЗАЗО0 шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Обробку починали через 1 день після інфекції тільки буфером як контроль (РВ5), 60 мг/кг бета-М/ТА ААС (136 ААС) або 60 мг/кг альфа-МТА
ААС (155 ААС).
На Фіг. 23А і фіг. 23В показаний синтез інтермедіату лінкер-антибіотик 51 з 2-нітробензолу- 1,3-діолу 1.
На Фіг. 24 показаний синтез інтермедіату лінкер-антибіотик, МС-мс-РАВ-диметил рірвок 54 з ТВ5-захищеного бензоксазинорифаміцину 4.
На Фіг. 25А і Фіг. 258 показаний синтез диметилрірВОК 7 з (5-фтор-2-нітро-1,3- фенілен)біс(окси)біс(метилен)дибензолу 9.
На Фіг. 26 наведена структура ЕКЕТ пептидного субстрату для підтвердження розщеплення, таІ-К("ТАМКА)ЗСАБАсОоСсК(флуоресцеїн) (5ЕО ІЮ МО: 125), що містить залишки, які найбільш часто зустрічаються у РІ11, Р2 і РЗ, отримані в результаті скринінгу протеазної активності КЕРІ.
Фланкуючі залишки Су у структурі пептиду КЕРІЇ РКЕТ були консервативними. Тіол- функціональна група на М-кінці забезпечувала кон'югацію з антитілами з реакційноздатними залишками цистеїну. При розщепленні пептиду ЕКЕТ ефект гасіння пропадає та спостерігається підвищення флуоресценції.
На Фіг. 27 наведена структура (іогАВ 54497-МО-(4САБАСіа-(рірвокК) («коровий пептид» наведений в 5ЕБО ІЮ МО: 126), спеціальної сполуки, яку використовують для ідентифікації активних фракцій, що містять протеази, які цікавлять. МаІ-Я4С:АРАСИас-рмМАЗІ («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 126) кон'югували з ТНІОБАВ 4497. ТНІОБАВ містить один реакційноздатний цистеїн. Протеаза 5. ашеив розщеплювала лінкер з С-кінця від Аа, вивільняючи Сіу-Стіу-Спу-(рірвов).
На Фіїг. 28 і Фіг. 29 показано, що МаІ-Кбатга)ЗАБАсОосК(флуоресцеїн) (ЗЕО ІО МО: 125)
ААС розщеплюється як у Ууооа46 (Фіг. 28), так й в ОБАЗОО (Фіг.29), коли він кон'югований з антитілом, що сполучається з 5. ашгеив (тіо-54497), і не розщеплюється, коли кон'югований з антитілом, що не сполучається з 5. ашеив (тіо-трастузумаб). Інтенсивність флуоресценції
Зо вимірюють протягом періоду часу, коли ТпіомМабрб 4497 таІ-Кбатга) о бАБАоосоК(флуоресцеїн) (ЗЕО ІО МО: 125) інкубують з культурами УУоод46 і О5БАЗОО МЕЗА, що перебувають у фазі логарифмічного росту. Кон'югати ТпіоМар 4497 ЕКЕТ пептид, отримані 3 таї!-
К(ТАМКА)ХОСАБдДОоОсОоК(флуоресцеїн) (5ЕО ІЮ МО: 125), наведеного на Фіг. 26, демонструють збільшення флуоресценції в обох штамах, що свідчить про те, що експериментальний лінкер розщеплюється протеазою 5. ашгеиз і про те, що протеаза є присутньою у клінічно значимому штамі МКЗА, ОБАЗОО (Фіг. 29). Щільність клітин впливає на швидкість розщеплення, у культурах з більш високою щільністю клітин (108 клітин/мл) розщеплення відбувається раніше. У випадку кон'югату, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом (тіо-трастузумаб), не відбувається збільшення флуоресценції у будь-яких умовах.
На Фіг. 30 наведені два оптимізованих лінкера для розщеплення ААС стафопаїном В.
Лінкери оптимізували для розщеплення стафопаїном В, включаючи переваги за залишками для
РА їі РТ. Лінкери були сконструйовані з використанням даних із скринінгу КЕРІЇ. 057 був доданий до С-кінця кожного лінкера як сурогатна заміна антибіотика.
На Фіг. 31 показані результати аналізу з макрофагами, що демонструють, що розщеплюваний стафопаїном ААС може знищувати внутрішньоклітинні бактерії. Для забезпечення зв'язування ААС з бактеріями штам 5. ашеив ИЗАЗО0О інкубували з різними дозами (100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл або 0,1 мкг/мл) антитіла 54497 як такого, тіо-54497 НС
М/Т (м8), ІС М2056-МО-мсо-РАВ-(диметилрірвокК) ААС-192 або тіо-54497 НО м1-МР-ІГ АРС-РАВОС- (піперазиноВоОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮО МО: 128) ААС-193 (Фіг. 31). Після інкубації протягом 1 години опсонізовані бактерії додавали до мишачих макрофагів та інкубували при 37 "С протягом 2 годин, щоб відбувся фагоцитоз. Після завершення фагоцитозу суміш для інфікування заміняли нормальним середовищем для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину, щоб вбити будь-які позаклітинні бактерії, які залишились, і через 2 дні визначали загальну кількість бактерій, що вижили, роблячи посіви серійних розведень лізатів макрофагів на чашках із триптичним соєвим агаром. ААС, розщеплюваний стафопаїном, міг знищувати внутрішньоклітинні ОБАЗО0 з аналогічною активністю, як й ААС, розщеплюваний катепсином В.
Сірою пунктирною лінією позначена межа виявлення для цього аналізу (10 КУО/ямку).
На Фіг. 32 показані результати аналізу з макрофагами, демонструючі, що ААС, який розщеплюють стафопаїном, можуть знищувати внутрішньоклітинні бактерії. ААС направляє дію бо антибіотика проти 5. ашеив за рахунок антиген-специфічного сполучення з антитілом. Штам 5.
агеив Моод46 був вибраний для цього експерименту, оскільки не експресує білок А, молекулу, що сполучається з Ес областю антитіл (Дб. Для сполучення ААС з бактеріями штам 5. ашгеив
УМоод46 протягом 1 години інкубували з 10 мкг/мл або 0,5 мкг/мл антитіла 54497; ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом, що містить розщеплюваний катепсином В лінкер, тіо-трастузумаб НС А118С-МО-мс-РАВ-(диметил-рірВвОВ) ААС-101; тіо-54497 НО МТ (м8), ГО М2050-МоО-мо-РАВ-(диметилрірВвВоОмК) ААС-192; ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом, що містить розщеплюваний стафопаїном лінкер, тіо-трастузумаб НС
А1180С-МР-І АРС-РАВС-(піперазиноВоК) («коровий пептид» розкритий в ЗЕО ІО МО: 128); або тіо-54497 НС м1-МР-ГАРО-РАВС-(піперазиноВоОК) («коровий пептид» розкритий в ЗЕО ІЮО МО: 128) ААС-193. Для обмеження неспецифічного сполучення ААС опсонізовані бактерії центрифугували, промивали один раз і ресуспендували у буфері до додавання до мишачих макрофагів. Після завершення фагоцитозу суміш для інфікування заміняли на нормальне середовище для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для знищення позаклітинних бактерій, що залишились, і через 2 дні визначали загальну кількість бактерій, що вижили, роблячи посіви серійних розведень лізатів макрофагів на чашках із триптичним соєвим агаром. 4497-ААС, що містить розщеплюваний стафопаїном лінкер, був здатний знищувати всі внутрішньоклітинні бактерії, що виявляють, тоді як ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом, показав відсутність активності.
На Фіг. 33 їі 34 показано, що розщеплюваний стафопаїном ААС активний у моделі внутрішньовенної інфекції на мишах /л7 умо. У мишей СВ17.5СІЮО створювали нормальний рівень людських ІдС, використовуючи режим дозування, оптимізований таким чином, щоб був досягнутий постійний рівень людських їдсС у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл. Мишей обробляли антитілом 4497 (50 мг/кг), ААС-215 з лінкером, розщеплюваним стафопаїном (50 мг/кг), або контрольним ААС з антитілом того самого ізотипу анти-дО, що містить лінкер, розщеплюваний стафопаїном (50 мг/кг). Мишам давали однократну дозу ААС- 215 в 1 день після інфекції шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Загальна кількість бактерій, що вижили, в 2 нирках (Фіг. 33) або в серці (Фіг. 34) визначали, роблячи посіви.
На Фіг. 35 і 36 наведені результати аналізу з макрофагами /л уйго для тіо-56078 ААС. На Фіг. показано, що ААС тіо-56078.м4.НО-МТ, І б-Суз-МО-мо-РАВ-(диметилрірвВоК) був
Зо ефективний для знищення внутрішньоклітинних бактерій у дозах 0,5 мкг/мл або вище при навантаженні антибіотика диметилрірвок ((ГА-54), що становить 2,0 (ААС-173) або 3,9 (ААС- 171) на антитіло тіо-56078. На Фіг. 36 показано, що тіо-56078.м4.НО-М/Т, І б-Субз-МО-мо-РАВ- (піперазвок) ефективний для знищення внутрішньоклітинних бактерій у дозах 0,5 мкг/мл або вище при навантаженні антибіотика піперазвок (ГА-65), що становить 1,8 (ААС-174) або 3,9 35 (ААС-172) на антитіло тіо-56078.
На Фіг. 37 і 38 наведені результати аналізу ефективності тіо-56078 ААС /п мімо у мишачій моделі внутрішньовенної інфекції У мишей СВ17.5СІ0 створювали нормальний рівень людських дб, використовуючи режим дозування, оптимізований таким чином, щоб був досягнутий постійний рівень людських ДС у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл. Мишей інфікували ОБАЗО0О й обробляли носієм як контроль (РВ5), тіо-56078.м4.НОС-МТ,
І б-Суб-МО-мо-РАВ-(диметилрірвОкК) ААС з навантаженням антибіотика диметилрірвок (ГА- 54), що становить 2,0 (ААС-173) або 3,9 (ААС-171) на тіо-56078 антитіло (Фіг. 37), і тіо-
З6078.м4.НО-МТ, І б-Субз-МО-мо-РАВ-(піперазВоК) з навантаженням піперазВокК антибіотика (І А-65), що становить 1,8 (ААС-174) або 3,9 (ААС-172) на тіо-56078 антитіло (Фіг. 38). Мишам давали однократну дозу ААС-215 в 1 день після інфекції шляхом внутрішньовенної ін'єкції й умертвляли на 4 день після інфекції. Загальну кількість бактерій, що вижили, в 2 нирках визначали, роблячи посіви. Обробка ААС з меншим навантаженням антибіотика призводила до зниження кількості бактерій приблизно в 1000 разів, а обробка ААС з високим навантаженням антибіотика призводила до зниження кількості бактерій більш ніж в 10000 разів.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Нижче буде дане докладне посилання на деякі варіанти втілення даного винаходу, приклади яких проілюстровані прикладеними структурами й формулами. Тоді як даний винахід буде описаний з використанням кінцевого числа варіантів втілення, включаючи способи, матеріали та приклади, такий опис не є обмежуючим, і даний винахід охоплює всі альтернативи, модифікації й еквіваленти, які є загальновідомими, або включені в даний опис. У випадку якщо один або декілька з включених літературних джерел, патентів й аналогічних матеріалів відрізняється від змісту цієї заявки або суперечить цій заявці, включаючи, але не обмежуючись певними термінами, використанням термінів, описаними методами або тому подібним, перевагу варто віддавати цій заявці. Якщо не визначено інше, всі технічні та наукові терміни, які бо використовуються в даному документі, мають ті самі значення, що зазвичай розуміються фахівцем із звичайною кваліфікацією в області, до якої належить цей винахід. Фахівцю в даній області техніки будуть очевидні численні способи й матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даному документі, які можуть бути використані для практичного здійснення даного винаходу. Даний винахід ніяк не обмежений описаними способами й матеріалами.
Всі опубліковані патенти, патентні заявки, патенти й інші посилання, згадані в даному документі, включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
І. ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИ
Методи й методики, описані або наведені у вигляді посилання в даному документі, як правило, добре відомі й зазвичай застосовуються з використанням традиційних підходів фахівцями в даній області техніки, наприклад, широко використовувані методики описані в затбргоокК еї аЇ., Мо/есиаг Сіопіпд: А Габогаїюгу Мапиа! За едйоп (2001) Соїй 5рііпд Нагбог
І арогаїогу Ргезв, Соїд Зргіпуд Нагбог, М.У.; Ситепі Ргоосоїв5 іп МоіІеси!аг Віо!оду (Е.М. А!йзибеї, еї аІ. едв., (2003)); Ше 5егієз Меїпойвз іп Епгутооду (Асадетіс Ргевв, Іпс.): РСА 2: А Ргасіїса!
Арргоасі (М.). МасРНегзоп, В.О. Натев апа с.8. Тауїог єдвз. (1995)), Напом апа Іапе, єдв. (1988) Аліїбоаіез, А Гарогаюгту Мапиа!, апа Апіта/ Се СиПпиге (В.І. Егезппеу, ей. (1987));
ОїЇїдописіеоїйде бупіпевів (М.9. Саї, ед., 1984); Меїподвз іп Моіесиіаг Віооду, Нитапа Ргев5; Се//
Віоюоду: А Гарогаюгту Моїероок (9.Е. Сеїїї5, єд., 1998) Асадетіс Ргев55; Апіта!/ Се// Сипиге (В.І.
ЕгезПппеу), ед., 1987); /птодисіоп о Се// апа Тізвие Сипиге (9У.Р. МашШег апа Р.Е. ВНобетгів, 1998)
Ріепит Ргев55; Се// апа Тізвие СиПйиге: Іарогаїогу Ргосейигез (А. Ооуїеє, 9У.В. Спінйнв, апа 0.а.
Меу»еїЇ, едв., 1993-8) У. ММіеу апа 5опв; Напабоок ої Ехрегітепіа! Іттипоіоду (О.М. Меїг апа С...
ВіасКмєїЇ, еа5.); Сепе Тапвієг Месіоїв г Маттаїпап Се/із (3.М. МіПег апа М.Р. Саїов, єдв., 1987);
РСВ: Тне Роутегазе СНаіп Неасіоп, (Миїїїв5 єї аї., ед5., 1994); Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоюду (У.Е. Соїїдап єї аї., ед5., 1991); бро Ргоїосої!з іп МоІесшаг Віо!оду (ММПеу апа бопв5, 1999);
ІттипорбіоІоду (С.А. дапемжау апа Р. Тгамег5, 1997); Апі/бодіев (Р. Ріпси, 1997); Апіроаіев: А
Ргасіїса! Арргоаси (0. Сацу., ед., ІВ Ргез5, 1988-1989); Мопосіопа! Апіродіез: А Ргасіїса!
Арргоасі (Р. Зпернега апа б. Оєап, єд5., Охгога Опімегейу Ргезв, 2000); Овіпу Апіроаіев5: А
Іабогаюгу Мапиа! (Е. Напйомж апа 0. ІГапе (Соїй Зріїпа Набог Іарогаїогу Ргев55, 1999); Те
Апіроаіез (М. 7апейці апа 9. 0. Сарга, ед5., Напуоод Асадетіс Рибіївєпегв, 1995); і Сапсе!:
Рііпсірієз апа Ргасіїсе ої Опсоіоду (М.Т. ОемМіа є! аї., єдв., У.В. І Ірріпсоїї Сотрапу, 1993).
Зо Номенклатура, яку використовують в цій заявці, заснована на систематичній номенклатурі
ІОРАС, якщо не зазначено інше. Якщо не зазначено інше, технічні й наукові терміни, використані в даному документі, мають ті самі значення, які зазвичай розуміються фахівцем із звичайною кваліфікацією в області, до якої належить цей винахід, і відповідають: Зіпдієїтоп еї аї (1994) ріспопагу ої Містобіооду апа Моіеси!ак Віоіоду, 2па єга., 9. ММіеу 8 5оп5, Мем/ МогК, МУ; і дапемау, С., Тгамегв, Р., Маїрої, М., ЗПІотенік (2001) /уттипорбіоіоду, Бій Еа., Сапапа Рибіївпіпо,
Мем Могк.
І. ВИЗНАЧЕННЯ
При вказівці кількості замісників термін "один або декілька" відноситься до діапазону від одного замісника до максимально можливого числа замісників, тобто до заміни одного водню й так далі до заміни всіх воднів на замісники. Термін "замісник" означає атом або групу атомів, що заміщають атом водню у вихідній молекулі. Термін "заміщений" означає, що зазначена група має один або декілька замісників. Якщо яка-небудь група може мати декілька замісників, і передбачені різноманітні можливі замісники, то замісники вибрані незалежно й не обов'язково повинні бути однаковими. Термін "незаміщений" означає, що зазначена група не має замісників.
Термін "необов'язково заміщений" означає, що зазначена група не заміщена або заміщена одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з групи можливих замісників. Коли зазначена кількість замісників, термін "один або декілька" означає від одного замісника до максимально можливого числа замісників, тобто заміну одного водню й так далі до заміни всіх воднів на замісники.
Термін "тейхоєві кислоти клітинної стінки" (М/ТА) означає аніонні глікополімери, ковалентно приєднані до пептидоглікану через фосфодіефірний зв'язок з Сб гідроксилом цукру М- ацетилмурамової кислоти. Тоді як точна хімічна структура може варіювати між організмами, в одному з варіантів втілення, М/ТА являють собою рибіт тейхоєву кислоту з повторюваними одиницями з'єднаного 1,5-фосфодіефірними зв'язками О-рибіту з Ю-аланіловим ефіром у положенні 2 і глікозильними замісниками у положенні 4. Глікозильні групи можуть являти собою
М-ацетилглюкозамініл «є (альфа) або В (бета), як у випадку 6. ашеив. Гідроксили на повторюваних одиницях алдитол/цукровий спирт фосфату заміщені катіонними ефірами О- аланіну та моносахаридами, такими як М-ацетилглюкозамін. В одному з аспектів, замісники гідроксилу включають ЮО-аланіл й альфа (а) або бета (В) СІСМНАс. В одному певному аспекті, бо М/ТА включає сполуку, що відповідає формулі:
дх ду -о щх и о" В У б" по чи ог оо ог о. й оф ні ї не дп ї де хвилясті лінії означають зв'язки з повторюваними одиницями або сайт приєднання поліалдитолу-р або пептидоглікану, де Х являє собою ЮО-аланіл або -Н; і М являє собою а (альфа)-СІСМНАс або ВД (бета)-СісМНАс. он о (е,
Но Ше СУ
МНАс
СіІСМНАс
У 5. ашеив МТА ковалентно зв'язані з 6-ОН М-ацетил мурамової кислоти (МигМАс) через дисахарид, що складається з М-ацетилглюкозаміну (СІСМАс)-1-Р і М-ацетилманозаміну (МапмАс), за яким ідуть дві або три гліцерол-фосфатні одиниці. Фактичний полімер М/ТА далі складається з 11-40 повторюваних одиниць рибіт-фосфат (КБо-Р). Послідовний синтез УУТА спочатку ініціюється ферментом, називаним ТадоО, і штами 5. ашеиве без гена Тадо (у результаті штучного видалення гена) не утворюють УТА. Повторювані одиниці можуть бути далі модифіковані О-аланіном (О-АЇа) у положенні С2-ОН і/або М-ацетилглюкозаміном (СІСМАс) у положенні С4-ОН через а- (альфа) або ДВ-(бета) глікозидні зв'язки. Залежно від штаму 5. ацтеив або фази росту бактерії глікозидний зв'язок може бути а -, ВД - або являти собою суміш двох аномерів.
Термін "антибіотик" (арх або Арх) включає будь-яку молекулу, що специфічно інгібує ріст або знищує мікроорганізми, такі як бактерії але не є летальною для хазяїна у введеній концентрації й інтервалі дозування. У певному аспекті антибіотик є нетоксичним для хазяїна у введеній концентрації й інтервалах дозування. Антибіотики, ефективні відносно бактерій, можуть бути класифіковані як бактерицидні (тобто прямо вбиваючі бактерії) або бактеріостатичні (тобто, що запобігають діленню бактерій). Бактерицидні антибіотики можуть бути далі класифіковані як антибіотики вузького або широкого спектра дії. Антибіотик широкого спектра дії являє собою антибіотик, ефективний відносно широкого діапазону бактерій, у тому числі грампозитивних і грамнегативних бактерій, на відміну від антибіотика вузького спектра дії, ефективного проти невеликого діапазону бактрій або певних сімейств бактерій. Приклади антибіотиків включають: (ії) аміноглікозиди, наприклад, амікацин, гентаміцин, канаміцин, неоміцин, нетилміцин, стрептоміцин, тобраміцин, пароміцин, (ії) ансаміцини, наприклад, гельданаміцин, гербіміцин, (ії) карбацефеми, наприклад, лоракарбеф, (ім), карбапенеми,
Зо наприклад, ертапенем, дорипенем, іміпенем/ циластатин, меропенем, (м) цефалоспорини (першого покоління), наприклад, цефадроксил, цефазолін, цефалотин, цефалексин, (мі) цефалоспорини (другого покоління), наприклад, цефлаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил, цефуроксим, (мі) цефалоспорини (третього покоління), наприклад, цефіксим, цефдинір, цефдиторен, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефтриаксон, (мі) ефалоспорини (четвертого покоління), наприклад, цефепім, (мії) цефалоспорини (п'ятого покоління), наприклад, цефтобіпрол, (їх) глікопептиди, наприклад, тейкопланін, ванкоміцин, (х) макроліди, наприклад, азитроміцин, кларитроміцин, диритроміцин, еритроміцин, рокситроміцин, тролеандоміцин, телітроміцин, спектиноміцин, (хі) монобактами, наприклад, азтреонам, (хії) пеніциліни, наприклад, амоксицилін, ампіцилін, азлоцилін, карбеніцилін, клоксацилін, диклоксацилін, флуклоксацилін, мезлоцилін, метицилін, нафцилін, оксацилін, пеніцилін, піперацилін, тикарцилін, |(хії) антибіотики поліпептиди, наприклад, бацитрацин, колістин поліміксин В, (хім) хінолони, наприклад, ципрофлоксацин, еноксацин, гатифлоксацин, левофлоксацин, лемефлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, тровафлоксацин, (ху) сульфаніламіди, наприклад, мафенід, пронтозил, сульфацетамід, сульфаметизол, сульфаніламід, сульфасалазин, сульфізоксазол, триметоприм, триметоприм-сульфаметоксазол (ТМП-СМК), (хм) тетрацикліни, наприклад, демеклоциклін, доксициклін, міноциклін, окситетрациклін, тетрациклін та (хмії) інші, такі як арсфенамін, хлорамфенікол, кліндаміцин, лінкоміцин, етамбутол, фосфоміцин, фузидієва кислота, фуразолідон, ізоніазид, лінезолід, метронідазол, мупіроцин, нітрофурантоїн, латенсиміцин, піразинамід, хінупристин/ дальфопристин, рифампіцин/ рифампіцин або тинідазол.
Використовуваний у даному документі термін "У/ТА антитіло" відноситься до антитіла, що сполучається з М/ТА, або М/ТА альфа, або М/ТА бета. Терміни "антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки альфа", або "анти-М/ТА альфа антитіло", або "анти-асМуТА", або "анти-ссіІсМас
МИТА антитіло" є взаємозамінними й означають антитіла, що специфічно сполучаються з тейхоєвою кислотою клітинної стінки (М/ТА) альфа. Аналогічно, терміни "антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки бета", або "анти-М/ТА бета антитіло", або "анти-ВУМТА", або "анти-ВСІсМас УМ/ТА антитіло" є взаємозамінними для позначення антитіла, що специфічно сполучаються з тейхоєвою кислотою клітинної стінки (МУ/УТА) бета. Терміни "анти-5іарі антитіло" й "антитіло, що сполучається з 5іарі" відносяться до антитіла, що здатно сполучати антиген на оїарнуІососсив айгеив (барні або 75. ашгеив") з афінністю, достатньою для того, щоб антитіло використовувалося в якості діагностичного та/або терапевтичного агента для спрямованої дії на оїарі. В одному з варіантів втілення, ступінь сполучення анти-5іарі антитіла з неспорідненим не-5іарп білком становить менше ніж приблизно 1095 від сполучення антитіла з МЕА5ЗА, де вимірювання проводять, наприклад, за допомогою, радіоіїмунологічного аналізу (КІА). У деяких варіантах втілення, антитіло, що сполучається з 5іарі, має константу дисоціації (Ка), яка становить х 1 мкм, х 100 НМ, «10 НМ, х5нНМ, 4 НМ, ЗНМ, х2нМ 1 НМ, х01 НМ, 0,01 нм або х 0,001 нМ (наприклад, 109 М або менше, наприклад, від 109 М до 1073 М, наприклад, від 109 М до 103 М). У деяких варіантах втілення, анти-5іаріп антитіло сполучається з епітопом зіарі, що є консервативним для різних видів 5арп.
Термін "егарнуюсоссив ацйгеив, стійкий до метициліну (МЕ5А), альтернативно, оїарнуІососсив аигеив з множинною лікарською стійкістю або біарнпуІососсив айгейв, стійкий до оксациліну (ОКЗА), відноситься до будь-якого штаму біарнпуососсив ацгеив, що є стійким до бета-лактамних антибіотиків, які включають пеніциліни (наприклад, метицилін, диклоксацилін, нафцилін, оксацилін і тому подібні) і цефалоспорини. "бїарпуососсивз агеив, чутливий до метициліну" (М55А) відноситься до будь-якого штаму біарну!ососсив аигеив, що є чутливим до бета-лактамних антибіотиків.
Термін "мінімальна інгібуюча концентрація" ("МІС") відноситься до найменшої концентрації антимікробного агента, що буде інгібувати видимий ріст мікроорганізму після інкубації протягом ночі. Аналізи для визначення МІС відомі. Один із способів описаний у Прикладі 18 нижче.
Зо Термін "антитілолї у даному документі використовується в широкому змісті й, зокрема, охоплює моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, димери, мультимери, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) й антигенсполучні фрагменти антитіл (Мійег еї а! (2003) 9. ої Іттипоіоду 170:4854-4861). Антитіла можуть являти собою мишачі, людські, гуманізовані, химерні антитіла, або можуть бути отримані з інших видів.
Антитіло являє собою білок, утворений імунною системою, здатний розпізнавати та зв'язувати певний антиген (Чапеулау, С., Тгамегв, Р., УмаїІрогі, М., ЗПІотепік (2001) Іттипо Віоіоду, Бій Еа.,
Сапапа Рибіїзпіпо, Мем Жогк). Цільовий антиген (антиген-мішень), як правило, має множину сайтів сполучення, названих епітопами, розпізнаваних СОК різноманітних антитіл. Кожне антитіло специфічно сполучається з різними епітопами, що мають різну структуру. Таким чином, один антиген може розпізнаватись та сполучатись більш ніж одним відповідним антитілом.
Антитіло включає повнорозмірну молекулу імуноглобуліну або імунологічно активну частину повнорозмірної молекули імуноглобуліну, тобто молекулу, що містить антигенсполучний сайт, що імуноспецифічно сполучається з цікавлячим антигеном-мішенню або його частиною, такі мішені включають, але не обмежуються ними, ракові клітини або клітини, які продукують аутоїмунні антитіла, сполучені з аутоїмунним захворюванням, інфіковану клітину або мікроорганізм, такий як бактерія. Імуноглобулін (Ід), розкритий у даному документі, може бути будь-якого ізотипу, за винятком ІДМ (наприклад, Ідс, ІДЕ, Ідо і Ідд), і підкласу (наприклад, Ідс1,
ІЧОо2, ІДЗ3, Ідс4, ІДА1 і ІдДАг). Імуноглобуліни можуть бути отримані з будь-яких видів. В одному з аспектів, (Ж являє собою Ід людини, миші або кролика. У певному варіанті втілення Ід має людське походження. "Клас" антитіла відноситься до типу константного домену або константної області важкого ланцюга. Існує п'ять основних класів антитіл: ІдА, дО, ЧЕ, Ідс і ДМ, деякі з яких можуть бути далі підрозділені на підкласи (ізотипи), наприклад, Іден, Ідсе2, Ідсз, ІДС, ІдАї і ІдА». Константні домени важкого ланцюга, що відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються с, 5, є, у і и, відповідно. "Нативні антитіла" відносяться до молекул імуноглобулінів, що мають різноманітні структури й зустрічаються у природі. Наприклад, нативні антитіла |Д являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни масою приблизно 150000 Дальтон, що складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, сполучених дисульфідними зв'язками. У кожному бо важкому ланцюзі в напрямку від М-кінця до С-кінця перебуває варіабельна область (МН), яку також називають важким варіабельним доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, далі слідують три константних домени (СНІ, СН2 ї СНЗ). Аналогічно, у напрямку від М-кінця до
С-кінця в кожному легкому ланцюзі перебуває варіабельна область (М), яку також називають легким варіабельним доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, далі слідує константний домен легкого ланцюга (СІ). Легкий ланцюг антитіла на основі амінокислотної послідовності константного домену може належати до одного з двох типів, які називають каппа (к) і лямбда (Х).
Терміни "повнорозмірне антитіло", "інтактне антитіло" та "ціле антитіло" використовуються в даному документі взаємозамінно для позначення антитіла, що має структуру, по суті аналогічну структурі нативного антитіла, або має важкі ланцюги, що містять область Ес, як визначено в даному документі. "Антигенсполучний фрагмент" антитіла відноситься до молекули, відмінної від інтактного антитіла, що включає частину інтактного антитіла, що сполучається з антигеном, з яким сполучається інтактне антитіло. Приклади фрагментів антитіла включають, але не обмежуються ними, Ем, Раб, Раб", Рар'-5Н, К(аб»; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕм); і мультиспецифічні антитіла, утворені фрагментами антитіл.
Використовуваний у даному документі термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто, індивідуальні антитіла, що становлять популяцію, є ідентичними та/або сполучаються з тим самим епітопом, за винятком можливих варіантів антитіл, наприклад, що містять мутації, що зустрічаються у природі, або утворюються у процесі одержання препаратів моноклональних антитіл (наприклад, природні розходження в глікозилюванні), такі варіанти, як правило, присутні в невеликих кількостях. Один із таких можливих варіантів для антитіл Ідс1 утворюється в результаті відщеплення С-кінцевого лізину (К) константної області важкого ланцюга. На відміну від препарату поліклональних антитіл, що зазвичай включає різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклональних антитіл спрямоване проти єдиної детермінанти на антигені. Таким чином, модифікатор "моноклональне" вказує на характер антитіла як отриманого з по суті гомогенної популяції антитіл, і не повинен бути витлумачений як потребуючий одержання антитіла яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла для застосування відповідно до даного винаходу можуть бути отримані різноманітними методами, включаючи, але не обмежуючись цим, гібридомний спосіб, способи рекомбінантних ДНК, фаговий дисплей і способи з використанням трансгенних тварин, що містять весь людський імуноглобуліновий локус або його частину, такі способи й інші приклади способів одержання моноклональних антитіл описані в даному документі. Крім їхньої специфічності, перевага моноклональних антитіл полягає в тому, що вони можуть бути синтезовані без домішок інших антитіл.
Термін "химерне антитіло" відноситься до антитіла, в якому частина важкого та/або легкого ланцюга отримана з одного джерела або виду, тоді як частина, що залишилася, важкого та/або легкого ланцюга отримана з іншого джерела або виду. "Людське антитіло" являє собою антитіло, яке має амінокислотну послідовність, що відповідає такій в антитілі, яке продукується людиною або людською клітиною або отримане з не людського джерела з використанням послідовностей, що кодують репертуар людських антитіл, або інших послідовностей, що кодують людські антитіла. Це визначення людського антитіла спеціально виключає гуманізоване антитіло, що включає не людські антигенсполучні залишки. "Гуманізоване антитіло" відноситься до химерного антитіла, що включає амінокислотні залишки з не людських НМК та амінокислотні залишки з людських ЕК. У деяких варіантах втілення, гуманізоване антитіло буде включати по суті все 3, щонайменше, одного й, як правило, двох варіабельних доменів, у яких всі або по суті всі НМК (наприклад, СОК) відповідають таким у не людському антитілі, і всі або по суті всі ЕК відповідають таким у людському антитілі. Гуманізоване антитіло необов'язково може включати, щонайменше, частину константної області антитіла, отриманої з людського антитіла. "Гуманізована форма" антитіла, наприклад, не людського антитіла, відноситься до антитіла, що було піддане гуманізації.
Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до домену важкого або легкого ланцюга антитіла, що бере участь у сполученні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга (МН і Мі, відповідно) нативного антитіла, як правило, мають аналогічні структури, де кожен домен включає чотири консервативні каркасні області (ЕК) і три гіперваріабельні області (НМК). (Дивіться, наприклад, Кіпаї єї а). Киру (510) Іттипо!оду, 6 ей., М.Н. Егеетап апа Со., раде 91 (2007).) Одного МН або МІ. домену може бути досить для додавання атигенсполучної специфічності. Більш того, антитіла, які сполучають конкретний антиген, можуть бути виділені з використанням УН або Мі. домену з антитіла, що сполучає антиген, для скринінгу бібліотеки комплементарних МІ. або МН доменів, відповідно.
Дивіться, наприклад, Ропоїапо єї аї., У. Іттипої. 150:880-887 (1993); Сіаїкзоп еї аї., Майте 352:624-628 (1991).
Термін "гіперваріабельна область", "НМК" або "НМ", який використовується у даному документі, відноситься до областей варіабельного домену антитіла, що є гіперваріабельними за послідовністю ("визначальні комплементарність областії або "СОК"), і/або утворюючим структурно обумовлені петлі, і/або містить залишки, які контактують з антигеном (області контакту з антигеном"). Зазвичай, антитіла включають шість НУ; три у МН (НІ, Н2, НУ) і три у МІ. (І1, 12, ІЗ). У нативних антитілах НЗ і ІЗ демонструють найбільшу розмаїтість серед шести
НМЕ, і НУ, зокрема, як вважається, відіграє унікальну роль у забезпеченні високої специфічності антитіл. Дивіться, наприклад, Хи еї аї., Іттипну 13:37-45 (2000); допп5оп апа Ми, іп Меїнодв іп
Моїесшіаг Віоіоду 248:1-25 (10, єд., Нитап Ргев5, Тоїомжа, МУ, 2003). Дійсно верблюжі антитіла, що зустрічаються у природі, які складаються тільки з важкого ланцюга, є функціональними й стабільними у відсутності легкого ланцюга (Натег5-Савієеттанп еї аї., (1993) Маїште 363:446-448; зЗпеніїй еї аї., (1996) Маїцге 5ігисі. Віої!. 3:733-736).
Використовується ряд способів розмежування НМЕ, і вони включені в даний документ.
Номенклатура Караї для визначальних комплементарність областей (СОК) заснована на варіабельності послідовності й є найбільш часто використовуваною (КарБбаї єї аЇ., Зедиепсев ої
Ргоївіпв ої Іттипоіодіса! Іпієге5і, Бій Ей. Рибіїс Неайй Бегмісе, Маїйопа! Іпвійшев ої Неацй,
ВеїШезаа, МО. (1991)). Споїйпіа відноситься до розташування структурних петель (Споїпіа апа
І е5к, (1987) 9. Мої. Віої. 196:901-917). Для розмежування НУК на підставі контакту з антигеном див. МасСайПшт еї аї. /. Мо/. Віо/. 262: 732-745 (1996). Номенклатура АБМ для НУК являє собою компроміс між Кабраї для НУК і Спошпіа для структурних петель і використовується програмним забезпеченням для моделювання антитіл Охіога МоіІесціа"5 АВМ. Виділення НУЄ. за системою «сопіасі» засновано на аналізі наявних кристалічних структур комплексу. Залишки для кожного з цих НМК наведені нижче.
Петля Кабаї АВ СВпойша Сошасі
Кі 24-34 га 2-1 130-136 12 150-156 50-56 150-152 136-155 13 159-197 189-197 1591-96 159-456
Ні о нНхі-нахв о НоеНнахв о Ноні НІО-НІЗВ (нумерація Кара
Ні 0 нНзі-нІ5 НнІв-НІ35 Нно2е-НІЗІ НЗО-НЗ5 (нумеранія СВОЇ Віа)
НІ 0 нзе-Нех Нхо-НІВ НнЬз-Ннях нае-нІВ
НІ нНнехнНній нНехній 0 не-нії наз-нії
НМА може включати наступні "подовжені НМА": 24-36 або 24-34 (І 1), 46-56 або 50-56 (І2) і 89-97 або 89-96 (І 3) в МІ і 26-35 (НІ), 50-65 або 49-65 (Н2г) і 93-102, 94-102 або 95-102 (НЗ) у
МН. Якщо не зазначено інше, залишки НМА, залишки СОВ та інші залишки у варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) нумеруються в даному документі відповідно до Кабаї еї аї., вище.
Вираз "нумерація залишків варіабельного домену за Кабаї або "нумерація амінокислотних положень за Кабаг і його варіації відносяться до системи нумерації, яка використовується для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга антитіл в
Кавбаї єї аІ., вище. Якщо використовувати цю систему нумерації, дійсна лінійна амінокислотна послідовність може містити менше амінокислот або може містити додаткові амінокислоти, що відповідають укороченням або вставкам у ЕФ або НУК варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може включати одиничну амінокислотну вставку (залишок
Бга відповідно до Кабаї) після залишку 52 в На і вставлені залишки (наприклад, залишки 8га, 825 ї 82с, тощо, відповідно до Караї) після залишку 82 у РЕА важкого ланцюга. Нумерація залишків Караї може бути визначена для даного антитіла шляхом вирівнювання областей гомології послідовності антитіла з "стандартною" пронумерованою за Кабаї послідовністю. "Каркасна область" або "ЕК" відноситься до залишків варіабельного домену, відмінних від залишків гіперваріабельної області (НМК). ЕК варіабельного домену зазвичай складається з чотирьох ЕК доменів: ЕКІ, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4. Відповідно, послідовності НМК і ЕК зазвичай перебувають у наступній послідовності у МН (або МІ): ЕВ1-НІ1(І1)-ЕН2-Н2(І2)-ЕВЗ-НЗІ(І 3)-ЕНА. "«Акцепторна людська каркасна область" для цілей даного документа являє собою каркасну область, що включає амінокислотну послідовність каркасної області варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) або каркасної області варіабельного домену важкого ланцюга (МН), отриману з каркасної області людського імуноглобуліну або людської консенсусної каркасної області, як визначено нижче. Акцепторна людська каркасна область, "отримана з" каркасної області людського імуноглобуліну або людської консенсусної каркасної області, може включати таку саму амінокислотну послідовність або може включати зміни в амінокислотній послідовності. У деяких варіантах втілення, кількість амінокислотних змін становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше або 2 або менше. У деяких варіантах втілення, акцепторна людська каркасна область Мі має послідовність, ідентичну послідовності МІ каркасної області людського імуноглобуліну або послідовності людської консенсусної каркасної області. "Людська консенсусна каркасна область" являє собою каркасну область, яка містить амінокислотні залишки, що найбільш часто зустрічаються, у вибірці послідовностей каркасних областей МІ або МН людського імуноглобуліну. Зазвичай, вибір послідовностей МІ або УНН людського імуноглобуліну здійснюють з підгрупи послідовностей варіабельного домену.
Зазвичай, підгрупа послідовностей являє собою підгрупу, як в Кабаї єї аІ., ЗХедиепсез ої Ргоїеіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, ЕШЩИ Еайоп, МІН Рибіїсайоп 91-3242, Вешезаа МО (1991), моїв. 1-3. В одному з варіантів втілення, для МІ підгрупа являє собою підгрупу каппа І, як в Кабаї еї аї., вище. В одному з варіантів втілення, для МН підгрупа являє собою підгрупу ІП, як в Кабаї єї аї., вище. "Афінність" зазвичай відноситься до сили всіх нековалентних взаємодій між одним сайтом сполучення молекули (наприклад, антитіла) і його партнером за сполученням (наприклад, антигеном). Якщо не зазначено інше, використовуваний у даному документі термін "афінність сполучення" відноситься до істинної афінності сполучення, яка відображає взаємодію 1:1 між членами пари, що сполучається (наприклад, антитілом та антигеном). Афінність молекули Х
Зо відносно свого партнера У, як правило, може бути представлена у вигляді константи дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна звичайними способами, відомими в даній області техніки, у тому числі, тими способами, які описані в даному документі.
Антитіло з "дозрілою афінністю" відноситься до антитіла з одним або декількома змінами в одній або декількох гіперваріабельних областях (НУК) у порівнянні з вихідним антитілом, що не містить таких змін, де такі зміни призводять до поліпшення афінності антитіла до антигена.
Термін "епітоп" відноситься до конкретного сайту на молекулі антигена, з яким сполучається антитіло. "Антитіло, що сполучається з тим же самим епітопом", що й антитіло порівняння, відноситься до антитіла, що блокує сполучення антитіла порівняння з його антигеном у конкурентному аналізі на 5095 або більше, і, навпаки, антитіло порівняння блокує сполучення антитіла з його антигеном у конкурентному аналізі на 5095 або більше. Приклади конкурентних аналізів передбачені в даному документі. "Голе антитіло" відноситься до антитіла, що не кон'юговане з гетерологічним фрагментом (наприклад, цитотоксичним фрагментом) або радіоактивною міткою. Голе антитіло може бути представлене в складі фармацевтичної композиції. "Ефекторні функції" відносяться до тих біологічних активностей, які сполучені з областю Ес антитіла, що варіює залежно від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: сполучення Сід і комплемент-залежну цитотоксичність (СОС); сполучення рецептора Ес; антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АОСС); фагоцитоз; понижуючу регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В клітинного рецептору); і активацію В клітин. "Антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність" або АОСС відноситься до форми цитотоксичності, при якій секретовані (ЖД, що сполучаються з рецепторами Ес (ЕсСК), присутніми на деяких цитотоксичних клітинах (наприклад, природні кілери (МК), нейтрофіли та макрофаги), роблять можливим специфічне сполучення цих цитотоксичних ефекторних клітин із клітиною-мішенню, що несе антиген, і наступне знищення клітини-мішені цитотоксинами.
Антитіла "направляють" цитотоксичні клітини та необхідні для знищення цільової клітини за цим механізмом. Первинні клітини, опосередковуючі АЮСС, МК клітини, експресують тільки
Есу(гамма)КІї, тоді як моноцити експресують Есугамма)КІ, Есугамма)Кі! ї Есугамма)КПП. бо Експресія рецепторів Ес на гемопоетичних клітинах підсумована в Таблиці З на сторінці 464 в
Вамеїсі апа Кіпеї, Аппи. Нему. Іттипої. 9: 457-92 (1991). Для оцінки активності АОСС молекули, що цікавить, може бути проведений аналіз АДСС /п міїго, такий як аналіз, описаний в О5 5,500, 362 або 05 5,821,337. Ефекторні клітини, які використовуються для таких аналізів, включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМСОС) і природні кілери (МК). Альтернативно або додатково, активність АЮСС молекули, що цікавить, можна оцінити /7 у//о, наприклад, в моделях на тваринах, таких як моделі, розкриті в Сіупез еї аІ., РМАБ5 ОА 95:652-656 (1998). "Фагоцитоз" відноситься до процесу, за допомогою якого патоген поглинається або інтерналізується клітиною-хазяїном (наприклад, макрофагом або нейтрофілом). Фагоцити опосередковують фагоцитоз трьома способами: (ї) прямо через рецептори клітинної поверхні (наприклад, лектини, інтегрини та скевенджер-рецептори) (її) за участю комплементу - рецептори комплементу (у тому числі через СКІ, рецептор для СЗ3Б, СКЗ і СК4) опосередковують сполучення та поглинання патогенів, опсонізованих комплементом, і (ії) за участю антитіл - рецептори Ес (у тому числі Есугаммакі, ЕсугаммакКІА ї ЕсугаммакША) сприяють сполученню з частинками, опсонізованими антитілами, які далі будуть інтерналізовані та злиті з лізосомами з утворенням фаголізосом. У даному винаході, автори думають, що такий спосіб (ії) відіграє значну роль у доставці терапевтичного агента анти-МА5А ААС в інфіковані лейкоцити, наприклад, нейтрофіли та макрофаги (Рпадосуїовзі5 ої Місгоре5: сотріехйу іп Асійоп ру 0. Опаетії! апа А ОгіпекКу. (2002) Аппиа! ВНемієм/ ої Іттипоїіоду, Мої 20:825). «Комплемент-залежна цитотоксичність" або "СОС" відноситься до лізису клітини-мішені у присутності комплементу. Активація комплементу за класичним шляхом ініціюється сполученням першого компонента системи комплементу (С14) з антитілами (відповідного підкласу), які сполучені з їхнім розпізнаним антигеном. Для оцінки активації комплементу може бути проведений аналіз СОС, наприклад, як описано в СбСа7апо-бапіого еї аї., у. Іттипої.
Меїтпоаз 202: 163 (1996).
Термін "область Ес" використовується в даному документі для позначення С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну. Термін включає нативну послідовність області Ес і варіанти області Ес. Незважаючи на те, що границі області Ес важкого ланцюга імуноглобуліну можуть варіювати, область Ес важкого ланцюга людського дб зазвичай визначають від амінокислотного залишку в положенні Суб5226 або від Рго230 до карбоксильного кінця Ід. С- кінцевий лізин (залишок 447 відповідно до системи нумерацією Є), також називаної Є0О індекс, як описано в КаБбаї еї аїЇ., Зедоепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодісаї! Іпіегев5і, Бій Ей. Рибіїс Неакн
Зегмісє, Майопа! Іпсійшев5 ої Неакй, Веїйезаа, МО, 1991) області Ес може бути вилучений, наприклад, у процесі одержання або очищення антитіла, або при використанні рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла. Відповідно, склад інтактного антитіла може включати популяцію антитіл, у якій вилучені всі залишки К447, популяцію антитіл, у якій не вилучені залишки К447, і популяцію антитіл, що має суміш антитіл з вилученими й невилученими залишками К447. Термін "рецептор Ес" або "Ес" також включає неонатальний рецептор, ЕсАп, що відповідає за перенос материнських дО до плоду. Сишуег евї аї., у. Іттипої. 117: 587 (1976) і Кіт еї аї., У. Іттипої. 24: 249 (1994). Способи вимірювання сполучення з ЕсВп відомі в рівні техніки (дивіться, наприклад, СсПпейе апа У/ага, Іттипої. Тодау 18: (12): 592-8 (1997); СНеїіє вї а!., Маїшге Віоїесппоіоду 15 (7): 637-40 (1997); Ніпоп еї аї., 9. Віої. Снет. 279(8): 6213-6 (2004); МО 2004/92219 (Ніпюп еї аі!.). Сполучення з ЕсВп /л умо і період напівжиття в сироватці людських поліпептидів, що сполучаються з ЕсНАп з високою афінністю, можна оцінити, наприклад, у трансгенних мишах або трансфікованих лініях людських клітин, експресуючих людський ЕсНп, або у приматах, яким вводять поліпептиди, що мають варіант області Ес. У МО 2004/42072 (Ргезіа) описані варіанти антитіл з поліпшеним або зниженим сполученням з Ес.
Дивіться також, наприклад, Зпієїаз еї аї., у. Віо!. Спет. 9(2): 6591-6604 (2001).
Може бути змінений вуглевод, приєднаний до області Ес. Нативні антитіла, продуковані клітинами ссавців, як правило, включають розгалужені, двухантенні олігосахариди, які зазвичай прикріплюються через М-зв'язок до А5п297 домену СН2 області Ес. Дивіться, наприклад, Умгідні еї аІ. (1997) ТІВТЕСН 15:26-32. Олігосахариди можуть включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, М-ацетилглюкозамін (СІСМАс), галактозу та сіалову кислоту, а також фруктозу, приєднану до СІСМАс в "стовбурі" двухантенної олігосахаридної структури. У деяких варіантах втілення, для створення ДО з деякими додатковими поліпшеними властивостями в ЇдДО може бути модифікований олігосахарид. Наприклад, передбачені модифіковані антитіла, що мають вуглеводну структуру без фукози, приєднаної (прямо або не прямо) до області Ес. Такі модифікації можуть призводити до поліпшеної функції АОСС. Дивіться, наприклад, 05 2003/0157108 (Ргеєта, ГГ); 05 2004/0093621 (Куосоула Накко Кодуо Со., ЦЯ). Приклади опублікованих патентів, пов'язаних із "дефукозилованими" або "дефіцитними за фукозою"
Ге) модифікаціями антитіл включають: О5 2003/0157108; УМО 2000/61739; МО 2001/29246; 5
Зо
2003/0115614; 05 2002/0164328; 05 2004/0093621; 005 2004/0132140; 005 2004/0110704; 05 2004/0110282; 005 2004/0109865; МО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586;. МО 2005/035778; МО2005/053742; МО2002/031140; ОКалакі єї аї., 9. Мої. Вії. 336: 1239-1249 (2004);
Уатапе-ОпПпикі еї а. Віотесп. Віоепд. 87: 614 (2004). Приклади ліній клітин, здатних продукувати дефукозиловані антитіла, включають клітини І ее 13 СНО, дефіцитні за фукозилуванням білків (ВірКка сеї аї. Агсп. Віоспет. Віорпуз. 249:533-545 (1986); опублікована заявка на патент США номер 2003/0157108 АЇ, Ргезіа, І; ії УМО 2004/056312 АЇ, Адатзв еї аі., особливо у Прикладі 11), і нокаутовані лінії клітин, такі як клітини СНО з нокаутом у гені альфа-1,6-фукозилтрансферази,
ЕШТВ (дивіться, наприклад, Хатапе-ОнНпикі еї а!., Віоїесн. Віоепо. 87: 614 (2004); Капаа, У. еї аї,
Віотесппої. Віоепо., 94(4):680-688 (2006); ії УМО2003/085107). "Виділене антитіло"ї являє собою антитіло, відділене від компонента його природного середовища. У деяких варіантах втілення, антитіло очищене до чистоти більше ніж 9595 або 9995, де чистота визначена, наприклад, електрофоретично (наприклад, 5О5-РАСЕ, ізоелектрофокусування (ІЕЕ), капілярний електрофорез) або хроматографічно (наприклад, іонообмінна або звернено-фазова ВЕРХ). Огляд способів оцінки чистоти антитіла дивіться, наприклад, у Ріаїтап еї а1., У. Спготайоадг. В 848:79-87 (2007). "Виділена нуклеїнова кислота" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що була відділена від компонента її природного середовища. Виділена нуклеїнова кислота включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай містять молекулу нуклеїнової кислоти, але молекула нуклеїнової кислоти присутня екстрахромосомно або розташована на хромосомі в іншому місці, що відрізняється від її природного розташування на хромосомі. "Виділена нуклеїнова кислота, що кодує анти-М/ТА бета антитіло" відноситься до однієї або декількох молекул нуклеїнових кислот, що кодують важкий та легкий ланцюги антитіла, при цьому така молекула нуклеїнової кислоти (молекули нуклеїнових кислот) може бути присутньою в одному векторі або в окремих векторах, і така молекула нуклеїнової кислоти (молекули нуклеїнових кислот) може бути присутньою в одному або декількох місцях у клітині-хазяїні.
Використовуваний у даному документі термін "специфічно сполучається з" або "специфічний до" відноситься до вимірюваних і відтворених взаємодій, таких як сполучення між
Зо мішенню й антитілом, що є показником присутності мішені у присутності гетерогенної популяції молекул, включаючи біологічні молекули. Наприклад, антитіло, що специфічно сполучається з мішенню (яка може бути епітопом), являє собою антитіло, що сполучається з цією мішенню з більшою афінністю, авідністю, легше й/або триваліше, ніж з іншими мішенями. В одному з варіантів втілення, ступінь сполучення антитіла з молекулою, що не відноситься до М/УТА-бета, становить приблизно менше ніж 1095 від сполучення антитіла з мішенню, де сполучення вимірюють, наприклад, за допомогою радіоімунологічного аналізу (КІА). У деяких варіантах втілення, антитіло, що специфічно сполучається з М/ТА бета, має константу дисоціації (Ка), що становить х 1 мкМ, х 100 НМ, х 10 нМ, х 1 нМ або х 0,1 нМ. У деяких варіантах втілення, антитіло специфічно зв'язується з епітопом, що є консервативним між різними видами. В іншому варіанті втілення, специфічне зв'язування необов'язково може включати виняткове зв'язування. "Афінність сполучення" зазвичай відноситься до сили всіх нековалентних взаємодій між однією ділянкою сполучення молекули (наприклад, антитіла) і його партнером за сполученням (наприклад, антигеном). Якщо не зазначено інше, використовуваний у даному документі термін "«афінність сполучення" відноситься до істинної афінності сполучення, яка відображає взаємодію 11 між членами пари, що сполучається (наприклад, антитілом й антигеном). Афінність молекули Х до свого партнера У зазвичай може бути представлена у вигляді константи дисоціації (Ка). Афінність можна виміряти звичайними способами, відомими в даній області техніки, у тому числі, тими способами, які описані в даному документі. Низькоафінні антитіла зазвичай сполучаються з антигеном повільно й, як правило, легко дисоціюють, у той час як високоафінні антитіла зазвичай сполучаються з антигеном швидше й, як правило, залишаються сполученими довше. У даній області техніки відомі різні способи вимірювання афінності сполучення, кожний з яких може бути використаний для цілей даного винаходу. Певні наведені як приклад варіанти втілення для вимірювання афінності сполучення описані нижче.
В одному з варіантів втілення "Ка" або "значення Ка" відповідно до цього винаходу вимірюють за допомогою аналізу сполучення радіоактивно міченого антигена (КІіІА), що проводять з використанням Раб варіанта антитіла, що цікавить, і його антигена, як описано в нижченаведеному аналізі. Афінність сполучення Бар з антигеном у розчині вимірюють, приводячи Раб у рівновагу з мінімальною концентрацією (725І)-міченого антигена у присутності титраційних серій неміченого антигена, далі захоплюючи зв'язаний антиген на планшеті,
Ге) покритим анти-Рар антитілом (дивіться, наприклад, Спеп еї аї., (1999) У. Мої. Вісі. 293:865-881).
Щоб підібрати умови для аналізу, мікротитраційні планшети (ОУМЕХ ТеспПпоїодіе5, пс.) покривають протягом ночі 5 мкг/мл сполучного анти-бРар антитіла (Сарре! арх) в 50 мМ карбонату натрію (рн 9,6), і далі блокують 295 (вага/об'єм) бичачого сироваткового альбуміну в
РВЗ протягом двох-п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). У неабсорбуючому планшеті (Мипс 2269620), 100 пМ або 26 пм Г:І|-антигена змішують з серійними розведеннями досліджуваного Раб (наприклад, відповідно до оцінки для анти-МЕСЕ антитіла, Рар-12, у Ргевіа еї а)ї., Сапсег Вев. 57:4593-4599 (1997)). Досліджуваний Раб далі інкубують протягом ночі; але інкубацію можна здійснювати протягом більш тривалого періоду часу (наприклад, приблизно 65 годин), щоб гарантувати, що рівновага досягнута. Після цього суміші переносять у планшет для сполучення й інкубують при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Розчин потім видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,195 розчином сурфактанту ТУМЕЕМ-2О"М у
РВ5. Після висихання планшетів додають 150 мкл/ямку сцинтилятора (МІСВОЗСІМТ-2О7М;
РаскКага) і планшети аналізують за допомогою лічильника гамма-випромінювання ТОРСОШМТ М (Раскага) протягом 10 хвилин. Концентрації кожного Бар, які дають 2095 або менше від максимального сполучення, вибирають для використання в конкурентних аналізах сполучення.
Відповідно до іншого варіанта втілення, Ка вимірюють за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу, використовуючи прилад ВІАСОКЕО-2000 або ВІАСОРЕ?-3000 (ВІАсоге,
Іпс., Різсаїаулау, МУ) при 25 "С з антигеном, іммобілізованим на чипах СМ5 при «10 одиницях відповіді (КО). Коротко, карбоксиметиловані декстранові чипи для біосенсору (СМ5, ВіІАсоге
Іпс.) активують М-етил-М-(З-диметиламінопропіл)-карбодіїмід гідрохлоридом (ЕОС) і М- гідроксисукцинімідом (МН5) відповідно до інструкцій виробника. Антиген розбавляють в 10 мМ ацетаті натрію, рН 4,8, до концентрації 5 мкг/мл (0,2 мкМ) і далі здійснюють введення розчину при швидкості потоку 5 мкл/хвилину для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (КО) сполученого білка. Після введення розчину антигена пропускають 1 М розчин етаноламіну для блокування непрореагованих груп. Для вимірювання кінетики пропускають серійні дворазові розведення Раб (від 0,78 нМ до 500 нМ) у РВ5 з 0,0595 сурфактанту ТУУЕЕМ 207М (РВ5Т) при 25 "С ї швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Коп) і швидкості дисоціації (Кок) розраховують, використовуючи просту модель сполучення Ленгмюра «один-до-одного» (ВіІАсоге? Емаїчайоп БЗоїйм/аге мегбіоп 3.2), одночасно проводячи апроксимацію сенсограми
Зо асоціації та дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Ка) розраховують як співвідношення
Конп/Коп. Дивіться, наприклад, Спеп еї аї., у). Мої. Віо!. 293:865-881 (1999). Якщо за даними аналізу поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, швидкість асоціації перевищує 105 М" сек", то швидкість асоціації можна визначити, використовуючи метод гасіння флуоресценції, в якому вимірюють збільшення або зменшення інтенсивності випущення (емісії) флуоресценції (екстинкція - 295 нм; емісія - 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25 "С для 20 нМ розчину антитіла проти антигена (ар форма) у РВЗ з рН 7,2 у присутності зростаючих концентрацій антигена, де вимірювання проводять у спектрофотометрі, такому як спектрофотометр із зупинкою потоку (Амім Іпвігитепії) або спектрофотометр серії 8000 51 М-АМІМСО М (Тептозресігопіс) з кюветою з перемішуванням. "Швидкість асоціації" або "Коп відповідно до цього винаходу також може бути визначена, як описано вище, з використанням систем ВІАСОРБЕО-2000 або ВІАСОКЕО-3000 (ВіІАсогеє, Іпс.,
Різсаїамжау, МУ).
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїнів" і "культура клітин-хазяїнів" використовуються взаємозамінно та відносяться до клітин, у які була введена екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи нащадків таких клітин. Клітини-хазяїни включають "трансформантів" і "трансформовані клітини", які включають первинну трансформовану клітину та її нащадків, незалежно від числа пасажів. Послідовність нуклеїнової кислоти нащадків може бути не повністю ідентичною нуклеїновій кислоті вихідної клітини, а може містити мутації. Мутантні нащадки, що мають ті самі функції або біологічну активність, на які вироблявся скринінг або за якими були вибрані вихідні трансформовані клітини, включені в це визначення.
Використовуваний у даному документі термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної відтворювати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона сполучена. Термін включає вектор як самореплікуючу структуру нуклеїнової кислоти, а також вектор, вбудований у геном клітини-хазяїна, в яку він був введений. Деякі вектори здатні регулювати експресію нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально сполучені. Такі вектори називаються в даному документі "експресуючими векторами". "Відсоток (95) ідентичності амінокислотних послідовностей" щодо послідовності поліпептиду порівняння визначають як відсоток амінокислотних залишків у послідовності, що цікавить, ідентичних амінокислотним залишкам у послідовності поліпептиду порівняння, після 60 вирівнювання послідовностей і введення розривів, якщо це необхідно, щоб досягти максимального відсотка ідентичності послідовностей, і без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовностей. Вирівнювання з метою визначення відсотка ідентичності послідовностей можна здійснити різними способами, що перебуває в межах компетентності фахівця в даній області техніки, наприклад, використовуючи загальнодоступне програмне забезпечення, таке як ВГА5Т, ВГА5ЗТ-2, АГІОМ або Медаїїдп (ОМА5БТАК). Фахівці в даній області техніки можуть визначити параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання за всією довжиною порівнюваних послідовностей. Для цілей даного документа, проте, значення 95 ідентичності амінокислотних послідовностей одержують, використовуючи комп'ютерну програму для порівняння послідовностей АГІОМ-2. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей АЇГІСМ-2 розроблена Сепепіесп, Іпс., і її програмний код був поданий з документацією користувача у Бюро реєстрації авторських прав США, Умазпіпаїоп 0О.С., 20559, де був зареєстрований під реєстраційним номером ТХО510087. Програма АГІСМ-2 є загальнодоступною від Сепепіесп, Іпс., Зоцшій Зап Егапсізсо, Саїйогпіа, або може бути скомпільована з програмного коду. Програма АГІОМ-2 повинна бути встановлена для користування на операційну систему ОМІХ, у тому числі, цифрову ОМІХ М4.00. Всі параметри порівняння послідовностей встановлюються програмою АГ ІОМ-2 і не змінюються.
У випадках, коли АГ ІОМ-2 використовується для порівняння амінокислотних послідовностей, до ідентичності амінокислотних послідовностей даної амінокислотної послідовності А щодо амінокислотної послідовності В, у порівнянні з амінокислотною послідовністю В або проти даної амінокислотної послідовності В (альтернативно можна сформулювати так: дана амінокислотна послідовність А, що має або володіє деяким 95 ідентичності амінокислотної послідовності щодо амінокислотної послідовності В, у порівнянні з амінокислотною послідовністю В або проти даної амінокислотної послідовності В) розраховується в такий спосіб: 100 помножити на відношення
Х/ї, де Х являє собою кількість амінокислотних залишків, визначених програмою для вирівнювання АГІОМ-2 як ідентичні збіги при вирівнюванні А і В, і де М являє собою загальну кількість амінокислотних залишків у В. Варто враховувати, що якщо довжина амінокислотної послідовності А не збігається з довжиною амінокислотної послідовності В, то 90 ідентичності амінокислотних послідовностей А і В не буде збігатися з 95 ідентичності амінокислотних послідовностей В і А. Якщо спеціально не зазначено інше, всі значення 95 ідентичності амінокислотних послідовностей, наведені в даному документі, отримані, як описано вище.
Термін "антибіотик типу рифаміцину" означає клас або групу антибіотиків, що мають структуру, аналогічну структурі рифаміцину.
Термін "антибіотик типу рифалазилу" означає клас або групу антибіотиків, що мають структуру, аналогічну структурі рифалазилу.
Коли зазначена кількість замісників, термін "один або декілька" відноситься до діапазону від одного замісника до максимально можливого числа замісників, тобто до заміни одного водню й так далі до заміни всіх воднів на замісники. Термін "замісник" означає атом або групу атомів, що заміщають атом водню у вихідній молекулі. Термін "заміщений" означає, що зазначена група має один або декілька замісників. Якщо яка-небудь група може мати декілька замісників, і передбачені різноманітні можливі замісники, то замісники вибрані незалежно й необов'язково повинні бути однаковими. Термін "незаміщений" означає, що зазначена група не має замісників.
Термін "необов'язково заміщений" означає, що зазначена група не заміщена або заміщена одним або декількома замісниками, незалежно вибраними з групи можливих замісників. Коли зазначена кількість замісників, термін "один або декілька" означає від одного замісника до максимально можливого числа замісників, тобто заміну одного водню й так далі до заміни всіх воднів на замісники.
Використовуваний у даному документі термін "алкіл" відноситься до насиченого моновалентного вуглеводневого радикалу з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що включає від одного до дванадцяти атомів вуглецю (С1-С12), де алкільний радикал може бути необов'язково незалежно заміщений одним або декількома замісниками, описаними нижче. В іншому варіанті втілення, алкільний радикал включає від одного до восьми атомів вуглецю (С1-
Св) або від одного до шести атомів вуглецю (С:1-Св). Приклади алкільних груп включають, але не обмежуються ними, метил (Ме, -СНвз), етил (Еї, -СНеСНвз), 1-пропіл (п-Рг, н-пропіл, -«СНаСНеСнН5), 2-пропіл (І-Рг, ізопропіл, -СН(СНз)г), 1-бутил (п-Ви, н-бутил, -«СНаСНгСНесСнН»з), 2-метил-1-пропіл (і-Ви, ізобутил, -«СНеСН(СнНз)»г), 2-бутил (5-Ви, втор-бутил, -«СН(СНз)СНеСнНвз), 2-метил-2-бутил (ї-
Ви, трет-бутил, -С(СНз)з), 1-пентил (н-пентил, -СНа.СН»аСН».СНоСН:І), 2-пентил (-
Ссн(СНнз)СнНгсСнНесн»), З-пентил (-СН(СНоСНВЗ)2), 2-метил-2-бутил (-С(СНз)»СНеСнНз), З-метил-2- бутил о (-СН(СНз)СнН(СНз)г), З-метил-1-бутил и (-СНаСНоСН(СН»з)г), 2-метил-1-бутил /(- бо СнНСН(СНз)СНосн;»), 1-гексил (-СНаСНа.СНСНоСНеСН:»), 2-гексил (-СН(СНіз)СНг.СНнНоСНесСнН З), 3-
гексил (-СН(СНЄСНз)(СНоСНеСнН»)), 2-метил-2-пентил (-С(СНз)2.СНоСНеСН»), З-метил-2-пентил (-
Ссн(СНзСн(СНз)СНосСН»), 4-метил-2-пентил о (-СН(СНі)СнНоСН(СНз)г), З-метил-З-пентил (-
С(СНз)СНаСН»з)г), 2-метил-З-пентил о (-СН(СНаСНз)СН(СН»з)2г), 2,З-диметил-2-бутил /(-
С(СНз)2СН(СнНз)»2), 3,3-диметил-2-бутил (-СН(СНз)С(СнНЗ)з, 1-гептил, 1-октил і тому подібне.
Використовуваний у даному документі термін "алкілен' відноситься до насиченого бівалентного вуглеводневого радикалу з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що включає від одного до дванадцяти атомів вуглецю (С1-С12), де алкіленовий радикал може бути необов'язково незалежно заміщений одним або декількома замісниками, описаними нижче. В іншому варіанті втілення, алкіленовий радикал включає від одного до восьми атомів вуглецю (С1-Св) або від одного до шести атомів вуглецю (С1-Св). Приклади алкіленових груп включають, але не обмежуються ними, метилен (-СНе-), етилен (-СНеСН»-), пропілен (-СНаСНеСнНе-) і тому подібне.
Термін "алкеніл" відноситься до моновалентного вуглеводневого радикалу з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що включає від двох до восьми атомів вуглецю (С2-Св) і, щонайменше, один ненасичений сайт, тобто 5р- подвійний зв'язок вуглець-вуглець, де алкеніловий радикал може бути необов'язково незалежно заміщений одним або декількома замісниками, описаними нижче, і включає радикали, що мають "цис" і "транс" орієнтацію, або альтернативно, "Е" і 2" орієнтації. Приклади включають, але не обмежуються ними, етиленіл або вініл (-СН-СН»), аліл (-СНеСН-СН») і тому подібне.
Термін "алкенілен" відноситься до бівалентного вуглеводневого радикалу з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що включає від двох до восьми атомів вуглецю (С2-Св) і, щонайменше, один ненасичений сайт, тобто 5р- подвійний зв'язок вуглець-вуглець, де алкеніленовий радикал може бути необов'язково незалежно заміщений одним або декількома замісниками, описаними нижче, і включає радикали, що мають "цис" і "транс" орієнтацію, або альтернативно, "Е" і 72" орієнтації. Приклади включають, але не обмежуються ними, етиленілен або вінілен (-СН-СН-), алілен (-ФНСН-СНЯ-), і тому подібне.
Термін "алкініл" відноситься до моновалентного вуглеводневого радикалу з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що включає від двох до восьми атомів вуглецю (С2-Св) і, щонайменше, один ненасичений сайт, тобто 5р потрійний зв'язок вуглець-вуглець, де алкініловий радикал може бути необов'язково незалежно заміщений одним або декількома замісниками, описаними нижче. Приклади включають, але не обмежуються ними, етиніл (- С-СН), пропініл (пропаргіл, -СНгС-СН), і тому подібне.
Термін "алкінілен" відноситься до моновалентного вуглеводневого радикалу з лінійним або розгалуженим ланцюгом, що включає від двох до восьми атомів вуглецю (С2-Св) і, щонайменше, один ненасичений сайт, тобто тобто 5р потрійний зв'язок вуглець-вуглець, де алкініленовий радикал може бути необов'язково незалежно заміщений одним або декількома замісниками, описаними нижче. Приклади включають, але не обмежуються ними, етинілен (-С-0-), пропінілен (пропаргілен, -СНьС-с- ), і тому подібне.
Терміни "карбоцикл", "карбоцикліл", "карбоциклічне кільце" та "циклоалкіл" відносяться до моновалентного, неароматичного, насиченого або частково ненасиченого кільця, що має від З до 12 атомів вуглецю (Сз-С12) у випадку моноциклічного кільця або від 7 до 12 атомів вуглецю у випадку біциклічного кільця. Біциклічні карбоцикли, що мають від 7 до 12 атомів, можуть бути організовані, наприклад, у біциклічні (4.51, (5.51, (5.6) або І6.6| системи, і біциклічні карбоцикли, що мають 9 або 10 атомів, можуть бути організовані у біциклічні І5.6| або І6.6)| системи, або системи з мостиковим зв'язком, такі як біцикло|2.2.1|)гептан, біцикло|2.2.2|октан.:/"і біциклоЇ3.2.2|Інонан. Спірозчленовані фрагменти також охоплюються цим визначенням.
Приклади моноциклічних карбоциклів включають, але не обмежуються ними, циклопропіл, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1і-еніл, 1-циклопент-2-еніл, 1-циклопент-3-еніл, циклогексил, 1-циклогексо-1-еніл, 1-циклогексо-2-еніл, 1-циклогексо-З-еніл, циклогексадієніл, циклогептил, циклооктил, циклононіл, циклодецил, циклоундецил, циклододецил і тому подібне.
Карбоциклічні групи можуть бути необов'язково та незалежно заміщені одним або декількома замісниками, описаними в даному документі. "Арил" означає моновалентний ароматичний вуглеводневий радикал, що включає 6-20 атомів вуглецю (Св-Сго), отриманий за рахунок видалення одного атома водню від одного атома вуглецю вихідної ароматичної кільцевої системи. Деякі арильні групи позначені в структурах, наведених як приклад, як "Аг". Арил включає біциклічні радикали, що включають ароматичне кільце, конденсоване з насиченим, частково ненасиченим кільцем або ароматичним карбоциклічним кільцем. Звичайні арильні групи включають, але не обмежуються ними, радикали, отримані з бензолу (феніл), заміщених бензолів, нафталіну, антрацену, біфенілу, 60 інденілу, інданілу, 1,2- дигідронафталіну, 1,2,3,4-тетрагідронафтилу та тому подібного. Арильні групи необов'язково та незалежно заміщені одним або декількома замісниками, описаними в даному документі. "Арилен' означає бівалентний ароматичний вуглеводневий радикал, що включає 6-20 атомів вуглецю (Св6-Сго), отриманий за рахунок видалення двох атомів водню від двох атомів вуглецю вихідної ароматичної кільцевої системи. Деякі ариленові групи позначені в структурах, наведених як приклад, як "Аг". Арилен включає біциклічні радикали, що включають ароматичне кільце, конденсоване з насиченим, частково ненасиченим кільцем або ароматичним карбоциклічним кільцем. Звичайні ариленові групи включають, але не обмежуються ними, радикали, отримані з бензолу (фенілен), заміщених бензолів, нафталіну, антрацену, біфенілену, інденілену, інданілену, 1,2-дигідронафталіну, 1,2,3,4-тетрагідронафтилу та тому подібного.
Ариленові групи необов'язково та незалежно заміщені одним або декількома замісниками, описаними в даному документі.
Терміни "гетероцикл", "тетероцикліл" і "геетероциклічне кільце" використовуються в даному документі взаємозамінно та відносяться до насиченого або частково ненасиченого (тобто має одну або декілька подвійних і/або потрійних зв'язків у кільці) карбоциклічного радикалу, що включає від З до приблизно 20 атомів у кільці, де, щонайменше, один атом кільця являє собою гетероатом, вибраний з азоту, кисню, фосфору та сірки, а атоми кільця, що залишились, являють собою С, де один або декілька атомів кільця необов'язково та незалежно заміщені одним або декількома замісниками, описаними нижче. Гетероцикл може являти собою моноцикл, що має від З до 7 членів у кільці (від 2 до 6 атомів вуглецю та від 1 до 4 гетероатомів, вибраних із М, О, Р і 5) або біцикл, що має від 7 до 10 членів у кільці (від 4 до 9 атомів вуглецю та від 1 до 6 гетероатомів, вибраних із М, О, Р і 5), наприклад, гетероцикл може являти собою біциклічну 14.51, (5.51, (5.6) або І6.6)| систему. Гетероцикли описані у Радпиеце, І ео А.; "Ргіпсіріе5 ої Модегп Негїегосусіїс Спетівзігу" (М/.А. Вепіатіп, Мем УогК, 1968), зокрема, у главах 1, 3,4,6, 7 і 9; "пе Спетівігу ої Неїегосусіїс Сотроипавз, А 5егіез ої Моподгари5" (опп Уміеу б 5оп5, Мем/
УоК, 1950 дотепер), зокрема, у томах 13, 14, 16, 19 їі 28; і У. Ат. Спет. бос. (1960) 82:5566. "Гетероцикліл" також включає радикали, в яких гетероциклічні радикали конденсовані з насиченим, частково ненасиченим або ароматичним карбоциклічним або гетероциклічним кільцем. Приклади гетероциклічних кілець включають, але не обмежуються ними, морфолін-4- іл, піперидин-1-іл, піперазиніл, піперазин-4-іл-2-он, піперазин-4-іл-3-он, піролідин-1-іл, тіоморфолін-4-іл, 5-діоксотіоморфолін-4-іл, азокан-і1-іл, азетидин-і-іл, октагідропіридо|1,2- а|піразин-2-іл, П,4Ядіазепан-1-іл, піролідиніл, тетрагідрофураніл, дигідрофураніл, тетрагідротієніл, тетрагідропіраніл, дигідропіраніл, тетрагідротіопіраніл, піперидино, морфоліно, тіоморфоліно, тіоксаніл, піперазиніл, гомопіперазиніл, азетидиніл, оксетаніл, тієтаніл, гомопіперидиніл, оксепаніл, тієпаніл, оксазепініл, діазепініл, тіазепініл, 2-піролініл, З-піролініл, індолініл, 2Н-піраніл, 4Н-піраніл, діоксаніл, 1,3-діоксоланіл, піразолініл, дитіаніл, дитіоланіл, дигідропіраніл, дигідротієніл, дигідрофураніл, піразолідинілімідазолініл, імідазолідиніл, 3- азабіцикло(/3.1.0)гексаніл, З-азабіцикло(|4.1.О|гептаніл, азабіцикло(2.2.2)гексаніл, ЗН-індоліл хінолізиніл і М-піридил сечовини. Спірозчленовані фрагменти також охоплюються цим визначенням. Прикладами гетероциклічної групи, де 2 атоми кільця заміщені оксо (-0) фрагментами, є піримідиноніл і 1,1-діоксо-тзіоморфолініл. Гетероциклічні групи в даному документі необов'язково та незалежно заміщені одним або декількома замісниками, описаними в даному документі.
Термін "гетероарил" відноситься до моновалентного ароматичного радикалу, що включає 5-, 6- або 7-членні кільця, і включає системи конденсованих кілець (щонайменше, одне з яких є ароматичною), що складаються з 5-20 атомів, які містять один або декілька гетероатомів, незалежно вибраних із азоту, кисню та сірки. Прикладами гетероарильних груп є піридиніл (у тому числі, наприклад, 2-гідроксипіридиніл), імідазоліл, імідазопіридиніл, піримідиніл (у тому числі, наприклад, 4-гідроксипіримідиніл), піразоліл, триазоліл, піразиніл, тетразоліл, фурил, тієніл, ізоксазоліл, тіазоліл, оксадіазоліл, оксазоліл, ізотіазоліл, піроліл, хінолініл, ізохінолініл, тетрагідроізохінолініл, індоліл, бензімідазоліл, бензофураніл, цинолініл, індазоліл, індолізиніл, фталазиніл, піридазиніл, триазиніл, ізоіндоліл, птеридиніл, пуриніл, оксадіазоліл, триазоліл, тіадіазоліл, тіадіазоліл, фуразаніл, бензофуразаніл, бензотіофеніл, бензотіазоліл, бензоксазоліл, хіназолініл, хіноксалініл, нафтиридиніл і фуропіридиніл. Гетероарильні групи необов'язково та незалежно заміщені одним або декількома замісниками, описаними в даному документі.
Гетероциклічні або гетероарильні групи можуть бути зв'язані через вуглець (вуглець- зв'язані) або азот (азот-зв'язані), де це можливо. Винятково для прикладу й не для обмежень, гетероцикли або гетероарили зв'язані через вуглець у положенні 2, 3, 4, 5 або 6 піридину, у 60 положенні 3, 4, 5 або 6 піридазину, у положенні 2, 4, 5 або 6 піримідину, у положенні 2, 3, 5 або
6 піразину, у положенні 2, 3, 4 або 5 фурану, тетрагідрофурану, тіофурану, тіофену, піролу або тетрагідропіролу, у положенні 2, 4 або 5 оксазолу, імідазолу або тіазолу, у положенні 3, 4 або 5 ізоксазолу, піразолу або ізотіазолу, у положенні 2 або З азиридину, у положенні 2, З або 4 азетидину, у положенні 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 хіноліну або у положенні 1, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 ізохіноліну.
Винятково для прикладу й не для обмежень, гетероцикли або гетероарили зв'язані через азот у положенні 1 азиридину, азетидину, піролу, піролідину, 2-піроліну, З-піроліну, імідазолу, імідазолідину, 2-імідазоліну, З-імідазоліну, піразолу, піразоліну, 2-піразоліну, З-піразоліну, піперидину, піперазину, індолу, індоліну, 1Н-індазолу, у положенні 2 ізоіндолу або ізоіндоліну, у положенні 4 морфоліну, а також у положенні 9 карбазолу або р-карболіну. «"Метаболіт" являє собою продукт конкретної сполуки або її солі, утворений у процесі метаболізму в організмі. Метаболіти сполуки можуть бути ідентифіковані з використанням стандартних способів, відомих у даній області техніки, та їхня активність може бути визначена з використанням тестів, таких як тести, описані в даному документі. Такі продукти можуть бути результатом, наприклад, окислювання, відновлення, гідролізу, амідування, деамідування, етерифікації, деетерифікації ферментативного розщеплення та подібного перетворення введеної сполуки. Відповідно, даний винахід включає метаболіти сполук згідно з даним винаходом, у тому числі, сполук, утворених у процесі контакту сполуки, що відповідає формулі І цього винаходу, з ссавцем протягом періоду часу, достатнього для утворення його метаболічного продукту.
Термін "фармацевтична лікарська форма" відноситься до препарату в такій формі, яка забезпечує ефективну біологічну активність активного інгредієнту, що міститься в ньому, і який не містить додаткових компонентів, що є неприйнятно токсичними для суб'єкта, якому вводять цю лікарську форму. "Стерильна" лікарська форма є асептичною або вільною від всіх живих мікроорганізмів та їхніх спор. "Стабільна" лікарська форма являє собою лікарську форму, в якій білок по суті зберігає свою фізичну й хімічну стабільність і цілісність при зберіганні. У даній області техніки доступні різні аналітичні методи для вимірювання стабільності білка, і їхній огляд наведений у Реріїйде апа
Зо Ргоївїп Огид Овєїїмегу, 247-301, Міпсепі І ее Еа., Магсеї! Оеккег, Іпс., Мем МогК, Мем Моїк, Рибв. (1991) і допез, А. Адм. Огид Оеїїмегу Кем. 10: 29-90 (1993). Стабільність може бути виміряна при вибраній температурі протягом вибраного періоду часу. Для швидкого скринінгу лікарську форму можна тримати при 40 С протягом 2 тижнів - 1 місяця, після чого вимірюють стабільність. Якщо лікарська форма передбачає зберігання при 2-8 "С, зазвичай лікарська форма буде стабільною при 30 "С або 40 "С протягом, щонайменше, 1 місяця та/або буде стабільною при 2-8 "С протягом, щонайменше, 2 років. Якщо лікарська форма передбачає зберігання при 30 "С, зазвичай лікарська форма буде стабільною протягом, щонайменше, 2 років при 30 С і/або буде стабільною при 40 "С протягом, щонайменше, 6 місяців. Наприклад, ступінь агрегації у процесі зберігання може бути використана як показник стабільності білка.
Таким чином, "стабільна" лікарська форма може являти собою лікарську форму, в якій менше ніж приблизно 1095 й, переважніше, менше ніж приблизно 595 білка присутня у вигляді агрегату.
В інших варіантах втілення може бути визначене будь-яке збільшення агрегації у процесі зберігання лікарської форми. «Ізотонічна" лікарська форма являє собою таку лікарську форму, що по суті має такий самий осмотичний тиск, як людська кров. Ізотонічна лікарська форма буде зазвичай мати осмотичний тиск, що становить від приблизно 250 до 350 мОсм. Термін "гіпотонічний" описує лікарську форму з осмотичним тиском нижче, ніж у людській крові. Відповідно, термін "гіпертонічний" використовується для опису лікарської форми з осмотичним тиском вище, ніж у людській крові.
Ізотонічність може бути виміряна з використанням, наприклад, осмометра парового тиску або кріоскопічного осмометра. Лікарські форми даного винаходу є гіпертонічними в результаті додавання солі й/або буфера.
Використовувані в даному документі "носії включають фармацевтично прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори, які є нетоксичними для клітини або ссавця, що піддають їхньому впливу, у використовуваних дозах і концентраціях. Часто фізіологічно прийнятний носій являє собою водний рН-буферний розчин. Приклади фізіологічно прийнятних носіїв включають буфери, такі як фосфатний буфер, цитратний буфер і буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, у тому числі аскорбінову кислоту; низькомолекулярні (приблизно менше 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, 60 аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, у тому числі глюкозу, манозу,
Зб або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; цукрові спирти, такі як маніт або сорбіт; солеутворюючі протиїони, такі як натрій; і/або неїонні сурфактанти, такі як ТУУЕЕМе, поліетиленгліколь (РЕС) і Р ШКОМІСЗ "М, "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнта у фармацевтичній композиції, відмінного від активного інгредієнта, що є нетоксичним для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає, але не обмежуються ними, буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант. "Фармацевтично прийнятна кислота" включає неорганічні й органічні кислоти, що є нетоксичними у використовуваній у лікарській формі концентрації та формі. Наприклад, підходящі неорганічні кислоти включають соляну кислоту, хлорну кислоту, бромистоводневу кислоту, йодистоводневу кислоту, азотну кислоту, сірчану кислоту, сульфонову кислоту, сульфінову кислоту, сульфанілову кислоту, фосфорну кислоту, вугільну кислоту та тому подібні кислоти. Підходящі органічні кислоти включають нерозгалужені та розгалужені алкільні, ароматичні, циклічні, циклоаліфатичні, арилаліфатичні, гетероциклічні, насичені, ненасичені, моно, ди- і три-карбоциклічні кислоти, у тому числі, наприклад, мурашину, оцтову, 2-гліколеву, трифтороцтову, фенілоцтову, триметилоцтову, трет-бутилоцтову, антранілову, пропанову, 2- оксипропанову, 2-оксопропанову, пропандіову, циклопентанпропіонову, циклопентанпропіонову,
З-фенілпропіонову, бутанову, бутандіову, бензойну, 3-(4-гідроксибензоїл)бензойну, 2-ацетокси- бензойну, аскорбінову, коричну, лаурилсірчану, стеаринову, муконову, мигдальну, бурштинову, ембонову, фумарову, яблучну, малеїнову, гідроксималеїнову, малонову, молочну, лимонну, винну, гліколеву, глюконову, піровиноградну, гліоксалеву, щавлеву, метансульфонову, бурштинову, саліцилову, фталеву, пальмітинову, пальмітолеїнову, пальмову, пальмітинову, тіоціанову, метансульфонову, етансульфонову, 1,2-етандисульфонову, 2- гідроксіетансульфонову, бензолсульфонову, 4-хлорбензолсульфонову, нафталін-2-сульфонову, п-толуолсульфонову, камфорсульфонову, 4-метилбіцикло|2.2.21-окт-2-ен-1-карбонову, глюкогептонову, 4,4'-метиленбіс-3-(гідроксі-2-ен-1-карбонову кислоту), гідроксинафталінову. "Фармацевтично прийнятні основи" включають неорганічні й органічні основи, що є нетоксичними у використовуваній у лікарській формі концентрації та формі. Наприклад, підходящі основи включають ті основи, які утворені з металів, що формують неорганічні основи, таких як літій, натрій, калій, магній, кальцій, амоній, залізо, цинк, мідь, марганець, алюміній, М-
Зо метилглюкаміну, морфоліну, піперидину й органічних нетоксичних основ, включаючи первинні, вторинні та третинні аміни, заміщені аміни, циклічні аміни й основні іонообмінні смоли
Інаприклад, МЩ(К) «г, (де КЕ" незалежно являє собою Н або С.-4 алкіл, наприклад, амоній, Трис)|, наприклад, ізопропіламін, триметиламін, діетиламін, триетиламін, трипропіламін, етаноламін, 2- діетиламіноетанол, триметамін, дициклогексиламін, лізин, аргінін, гістидин, кофеїн, прокаїн, гідрабамін, холін, бетаїн, етилендіамін, глюкозамін, метилглюкамін, теобромін, пурини, піперазин, піперидин, М-етилпіперидин, поліамінні смоли і тому подібне. Особливо переважними органічними нетоксичними основами є ізопропіламін, діетиламін, етаноламін, триметамін, дициклогексиламін, холін і кофеїн.
Додаткові фармацевтично прийнятні кислоти й основи, що використовують в даному винаході, включають кислоти й основи, які отримані з амінокислот, наприклад, гістидину, гліцину, фенілаланіну, аспарагінової кислоти, глутаміної кислоти, лізину й аспарагіну. "Фармацевтично прийнятні" буфери та солі включають буфери та солі, які отримані як із солей приєднання кислоти, так і з солей приєднання основи зазначених вище кислот і основ.
Конкретні буфери та/або солі включають солі гістидину, сукцинат й ацетат. "Фармацевтично прийнятний цукор' являє собою молекулу, що у комбінації з білком, що цікавить, значно запобігає або знижує хімічну та/або фізичну нестабільність білка при зберіганні.
Якщо передбачається, що лікарська форма буде ліофілізована та потім відновлена, "фармацевтично прийнятний цукор' може також називатися "ліопротектор". Приклади ліопротекторів включають цукри та їх відповідні цукрові спирти, амінокислоти, такі як глутамат натрію або гістидин; метиламін, такий як бетаїн; ліотропну сіль, таку як сульфат магнію; поліол, такий як трьохатомні або високомолекулярні цукрові спирти, наприклад, гліцерин, декстран, еритрит, гліцерин, арабіт, ксиліт, сорбіт і маніт; пропіленгліколь; поліетиленгліколь;
РІГОВОМІСВО; ї їхні комбінації. Додаткові приклади ліопротекторів включають гліцерин і желатин, і цукри мелібіозу, мелецитозу, рафінозу, манотриозу та стахіозу. Приклади відновлюваних цукрів включають глюкозу, мальтозу, лактозу, мальтулозу, ізо-мальтулозу та лактулозу. Приклади невідновлюваних цукріввключають невідновлювані глікозиди полігідрокси сполук, вибраних із цукрових спиртів та інших поліспиртів з нерозгалуженим ланцюгом.
Переважними цукровими спиртами є моноглікозиди, особливо ті сполуки, які отримані відновленням дисахаридів, таких як лактоза, маноза, лактулоза та мальтулоза. Глікозидні бічні 60 групи можуть бути або глюкозидними, або галактозидними. Додатковими прикладами цукрових спиртів є глюцит, мальтит, лактит та ізо-мальтит. Переважними фармацевтично прийнятними цукрами є невідновлювані цукри, трегалоза або сахароза. Фармацевтично прийнятні цукри додають до лікарської форми в "захисній кількості" (наприклад, до ліофілізації), що означає, що білок по суті зберігає свою фізичну й хімічну стабільність і цілісність у процесі зберігання (наприклад, після відновлення та зберігання).
Необхідний "розріджувач" у даному документі являє собою розріджувач, що є фармацевтично прийнятним (безпечним і нетоксичним для введення людині) (ф використовуваним для одержання рідкої лікарської форми, наприклад, лікарської форми, відновленої після ліофілізації Приклади розріджувачів включають стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (ВУМЕІ), рН-буферний розчин (наприклад, фосфатно- сольовий буферний розчин), стерильний сольовий розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози. В альтернативному варіанті втілення розріджувачі можуть включати водні розчини солей та/або буфери. "Консервант являє собою сполуку, яка може бути додана до лікарських форм, передбачених у даному документі, для зниження бактеріальної активності. Додавання консерванту може, наприклад, забезпечити одержання багатодозової лікарської форми (для багаторазового використання). Приклади потенційних консервантів включають октадецилдиметилбензил амонію хлорид, гексаметонію хлорид, бензалконію хлорид (суміш алкілбензилдиметиламонію хлоридів, у яких алкільні групи являють собою довголанцюгові сполуки) і бензетонію хлорид. Інші типи консервантів включають ароматичні спирти, такі як фенол, бутиловий і бензиловий спирт, алкілларабени, такі як метил- або пропілпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, З-пентанол і м-крезол. Найбільш переважним консервантом у даному документі є бензиловий спирт. «"Індивідуум", або "суб'єкт", або "пацієнт" є ссавцем. Ссавці включають одомашнених тварин (наприклад, корів, овець, котів, собак і коней), приматів (наприклад, людина та примати, що не відносяться до людини, такі як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, миші та пацюки), але не обмежуються ними. У деяких варіантах втілення, індивідуумом або суб'єктом є людина.
Використовуваний у даному документі термін "лікування" відноситься до клінічного втручання, яке спрямовано на зміну природного ходу захворювання або стану тканини або клітини в індивідуума, що піддається лікуванню в ході клінічної патології. Бажані ефекти від лікування включають, але не обмежуються ними, зменшення швидкості прогресування захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення хворобливого стану й ремісію або поліпшений прогноз, де ефекти вимірює фахівець у даній області техніки, такий як лікар. В одному з варіантів втілення, лікування може означати ослаблення симптомів, зменшення будь- яких прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, зменшення швидкості прогресування інфекційного захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення хворобливого стану й ремісію або поліпшений прогноз. У деяких варіантах втілення, антитіла даного винаходу використовуються для вповільнення розвитку захворювання або для вповільнення прогресування інфекційного захворювання.
Використовуване в даному документі вираження "у сполученні з" відноситься до застосування одного виду лікування на додаток до іншого виду лікування. У такому випадку, "у сполученні з" відноситься до застосування одного виду лікування до, у процесі або після застосування іншого виду лікування до індивідуума.
Термін "фагосома" відноситься до інтерналізованого оточеного мембраною ендоцитозного пухирця фагоцитуючої клітини. Фагоцитоз може бути ініційований безпосередньо, за участю антитіла або за участю комплементу. Термін "фаголізосома" відноситься до інтерналізованого клітинного пухирця, злитого з однією або декількома лізосомами.
Бактерії традиційно розділяють на основі їхнього фарбування за Грамом на дві основні групи, грампозитивні (Ст) і грамнегативні ((б3т-) бактерії. Грампозитивні бактерії оточені одношаровою ліпідною мембраною, і вони зазвичай містять товстий шар (20-80 нм) пептидогліканів, що містить барвник Грама. Грампозитивні бактерії забарвлюються темно-синім або фіолетовим при фарбуванні за Грамом. На противагу цьому, грамнегативні бактерії не можуть містити кристалічний фіолетовий барвник, і замість цього містять контрастний барвник (сафранін або фуксин) і стають червоними або рожевими. У грампозитивних клітинних стінках зазвичай відсутня зовнішня мембрана, що виявляється у грамнегативних бактерій.
Термін "бактеріємія" відноситься до присутності бактрій у кровотоці, що найчастіше виявляється при посівах крові. Бактерії можуть проникати в кровоток при важкому ускладненні інфекцій (таких як пневмонія або менінгіт), при хірургічному втручанні (особливо, що зачіпає слизові оболонки, такі як шлунково-кишковий тракт) або через катетери й інші чужорідні об'єкти, бо які розміщені в артерії або вені. Бактеріємія може мати декілька наслідків. Імунна відповідь на бактерії може викликати сепсис і септичний шок, смертність від яких відносно висока. Бактерії також можуть використовувати кров для поширення в інші частини організму, викликаючи інфекції в інших місцях, що відрізняються від первинного місця інфікування. Приклади включають ендокардит або остеомієліт. "Терапевтично ефективна кількість" являє собою мінімальну концентрацію, необхідну для досягнення відчутного поліпшення конкретного розладу. Терапевтично ефективна кількість у даному документі може варіювати відповідно до факторів, такими як стадія захворювання, вік, стать та вага пацієнта, а також здатність антитіла викликати бажану відповідь в індивідуума.
Терапевтично ефективна кількість також являє собою таку кількість, при якій будь-які токсичні або шкідливі ефекти від антибіотика є незначними у порівнянні з терапевтично сприятливими ефектами. В одному з варіантів втілення, терапевтично ефективна кількість являє собою кількість, ефективну для зниження бактеріємії у випадку інфекції /л у//о. В одному з аспектів, «терапевтично ефективна кількість" являє собою, щонайменше, кількість, ефективну для зниження бактеріального навантаження або кількості колонієутворюючих одиниць (КУО), виділених зі зразка, такого як кров, отриманого від пацієнта, щонайменше, на один порядок щодо бактеріального навантаження або кількості колонієутворюючих одиниць (КУС), виділених із зразка, такого як кров, отриманого від пацієнта до введення лікарського засобу. У більш певному аспекті, зниження становить, щонайменше, 2 порядки. В іншому аспекті, зниження становить 3, 4, 5 порядків. У ще одному аспекті, зниження призводить до рівня бактеріального навантаження або кількості колонієутворюючих одиниць, які нижче рівня виявлення. В іншому варіанті втілення терапевтично ефективна кількість являє собою кількість ААС в одній або декількох дозах, прийнятих у ході курсу лікування, що досить для одержання негативного посіву крові (тобто бактерії, на які спрямований ААС, не ростуть) у порівнянні з позитивним посівом крові до лікування або на початку лікування інфікованого пацієнта. "Профілактично ефективна кількість" відноситься до кількості, ефективної при необхідних дозах і протягом необхідного періоду часу для досягнення бажаного профілактичного результату. Зазвичай, але необов'язково, оскільки профілактична доза використовується для суб'єктів до захворювання, на ранніх стадіях захворювання або навіть до впливу умов, при яких зростає ризик інфекції, профілактично ефективна кількість може бути менше терапевтично
Зо ефективної кількості. В одному з варіантів втілення, профілактично ефективна кількість являє собою, щонайменше, кількість, ефективну для запобігання виникнення або зниження поширення інфекції від однієї клітини до іншої. "Хронічне" введення відноситься до безперервного введення лікарського засобу (лікарських засобів) на противагу однократному введенню, так що первісний терапевтичний ефект (активність) зберігається протягом тривалого періоду часу. "Переривчасте" введення являє собою лікування, що проводиться не безупинно та без перерв, а має циклічний характер.
Використовуваний термін "вкладиш в упакування" відноситься до інструкцій, зазвичай включених у комерційні впакування терапевтичних продуктів, які містять інформацію про показання, застосування, дозування, введення, комбіновану терапію, протипоказання й/або застереження, що стосуються застосування таких терапевтичних продуктів.
Термін "хіральний" відноситься до молекул, які мають властивості не сполучатися у просторі з своїм дзеркальним відображенням, тоді як термін "ахіральний" відноситься до молекул, які мають властивості сполучатися у просторі з своїми дзеркальними відображеннями.
Термін "стереоїзомери" відноситься до сполук, які мають ідентичну хімічну будову, але відрізняються розташуванням атомів або груп атомів у просторі. «Діастереомер" відноситься до стереоізомеру з двома або декількома центрами хіральності, і молекули яких не є дзеркальними зображеннями один одного. Діастереомери мають різні фізичні властивості, наприклад, температуру плавлення, температуру кипіння, спектральні властивості та хімічну акивність. Суміші діастереомерів можуть бути розділені за допомогою аналітичних процедур з високою роздільною здатністю, таких як електрофорез і хроматографія. "Енантіомери" відносяться до двох стереоіїзомерів сполуки, які не є поєднувальними дзеркальними відображеннями, один одного.
Стереохімічні визначення й умовні позначення, що використовуються в даному документі, як правило, збігаються з визначеннями й позначеннями в 5. Р. Рагкег, Ед., Месгам'-НІЇ Оісіопагу ої
Спетіса! Тепте (1984) МесСтам-Ні!Ї ВооК Сотрапу, Мем/ МогКк; і ЕПеі, Е. апа Уміеп, 85., зіегеоспетізігу ої Огдапіс Сотроипах (1994) допп УмМіеу 5 Зоп5, Іпс., Мем/ МЖогКк. Багато органічних сполук існують в оптично активних формах, тобто вони мають здатність обертати площину плоско-поляризованого світла. При описі оптично активної сполуки префікси О і Ї. або
К ої З використовуються для позначення абсолютної конфігурації молекули відносно її бо хірального центра (хіральних центрів). Префікси а і І або (ж) і (-у використовуються для позначення знака обертання плоско- поляризованого світла сполукою, при цьому (-) або 1 означає, що сполука є лівообертальною. Сполука з префіксом (ж) або а є правообертальною.
Для даної хімічної структури ці стереоізомери є ідентичними за винятком того, що вони являють собою дзеркальні відображення один одного. Певний стереоїзомер може також називатися енантіомером, і суміш таких ізомерів часто називається енантіомерною сумішшю. Суміш енантіомерів 50:50 називається рацемічною сумішшю або рацематом, вона може виникнути, якщо в хімічній реакції або процесі не було стереоселективності або стереоспецифічності.
Терміни "рацемічна суміш" і "рацемат" відносяться до еквімолярної суміші двох типів енантіомерів, позбавленої оптичної активності.
Термін "захисна група" відноситься до замісника, що зазвичай використовується для блокування або захисту конкретної функціональної групи, тоді як інші функціональні групи сполуки вступають у реакцію. Наприклад, "аміно-захисна група" являє собою замісник, приєднаний до аміногрупи, що блокує або захищає функціональну аміногрупу в сполуці.
Підходящі аміно-захисні групи включають, але не обмежуються ними, ацетильну, трифторацетильну, трет-бутоксикарбонільну (ВОС), бензилоксикарбонільну (СВ2) і 9- флуоренілметиленоксикарбонільну (ЕГтос). Загальний опис захисних груп та їхнє застосування дивіться в Т. МУ. сгеепе, Ргоїесіїме сгоир5 іп Огдапіс Зупіпеві5, Чопп УМіеу 5 Боп5, Мем/ ХогК, 1991, або у більш пізньому виданні.
Використовуваний у даному документі термін "приблизно" відноситься до звичайного діапазону помилки для відповідного значення, добре відомому фахівцю в даній області техніки.
Посилання "приблизно" на значення або параметр також включають (і описує) варіанти втілення, які відносяться до цього значення або параметра як такого.
Використовувані в даному документі форми однини включають також вказання множини, якщо в контексті ясно не зазначено інше. Наприклад, посилання на "антитіло" є посиланням на одне або множину антитіл, наприклад, на молярні кількості антитіл, і включає їхні еквіваленти, відомі фахівцям у даній області техніки, і тому подібне.
Ш. КОМПОЗИЦІЇ ТА СПОСОБИ
КОН'ЮГАТИ АНТИТІЛО-АНТИБІОТИК (ААС)
Сполуки ААС даного винаходу включають сполуки ААС, що мають антибактеріальну
Зо активність, які є ефективними проти ряду грампозитивних, грамнегативних патогенів людини та тварин, у тому числі, проти 5іарнуіососсі. У варіанті втілення, наведеному як приклад, сполуки
ААС включають антитіло з введеним методом генної інженерії цистеїном, кон'юговане, тобто ковалентно приєднане за допомогою лінкера до фрагмента антибіотика типу рифаміцину.
Біологічну активність фрагмента антибіотика типу рифаміцину модулюють за рахунок кон'югації з антитілом. Кон'югати антитіло-антибіотик (ААС) даного винаходу селективно доставляють ефективну дозу антибактеріального агента в осередок інфекції, завдяки чому підвищується селективність, тобто може бути використана менша ефективна доза, але при цьому збільшується терапевтичний індекс ("терапевтичне вікно").
Даний винахід передбачає нову антибактеріальну терапію, спрямовану на запобігання відхилення від дії антибіотиків цільової популяції бактерій, на яку не діє терапія традиційними антибіотиками. Для нової антибактеріальної терапії використовується кон'югат антитіло- антибіотик (ААС), у якому антитіло, специфічне до компонентів клітинної стінки 5. аштеив (у тому числі МА5А), хімічно сполучене з потужним антибіотиком (похідною рифаміцину). Антибіотик сполучений з антитілом через розщеплюваний протеазою пептидний лінкер, сконструйований таким чином, що він розщеплюється катепсином В, лізосомальною протеазою, виявленою у більшості типів клітин ссавців (Юиром/снік еї а! (2002) Віосопі. Снет. 13:855-869). ААС виступає як проліки, в яких антибіотик є неактивним (через великий розмір антитіла) доти, поки лінкер не буде розщеплений. Оскільки значна частина 5. ашеивх, виявленого у випадку природної інфекції, у деякий момент у ході інфекції поглинається клітинами-хазяїнами, у першу чергу, нейтрофілами та макрофагами, то цей час всередині клітин-хазяїнів дає можливість бактеріям уникнути дії антибіотика. ААС даного винаходу сконструйовані таким чином, щоб зв'язуватись з 5. ашгеиз і вивільняти антибіотик всередину фаголізосоми після того, як бактерія поглинена клітиною-хазяїном. Відповідно до цього механізму, завдяки ААС відбувається концентрування активного антибіотика конкретно в тих місцях, де б. ашеив5 погано піддається лікуванню традиційними антибіотиками. Хоча даний винахід не обмежений конкретним механізмом дії або не має на увазі конкретний механізм дії, ААС поліпшує активність антибіотика за трьома можливими механізмами: (1) ААС доставляє антибіотик всередину клітин ссавців, що поглинули бактерію, тим самим збільшуючи активність антибіотика, що погано дифундує у фаголізосоми з поглиненими бактеріями; (2) ААС опсонізує бактерію, тим самим збільшуючи поглинання бо вільних бактерій фагоцитарними клітинами, вивільняє антибіотик локально та знищує поглинену бактерію у фаголізосомах; (3) ААС поліпшує період напівжиття антибіотиків /л у//о (поліпшена фармакокінетика) за рахунок зв'язування антибіотика з антитілом. Поліпшена фармакокінетика
ААС забезпечує доставку достатньої кількості антибіотика в ділянки, у яких сконцентрований 5. ацгеих, але при цьому загальна доза антибіотика, що повинна бути введена системно, знижується. Ця особливість дає можливою тривалу терапію ААС з мінімальними побічними ефектами від антибіотика, спрямовану проти персистуючої інфекції.
Дана заявка описує створення нових терапевтичних агентів, кон'югованих анти-М/ТА антитіл, і їхнє застосування для лікування інфекцій, викликаних грампозитивними (Ст) бактеріями, у тому числі інфекцій, викликаних 5. ашгеив. Ці антитіла здатні направлено діяти на популяції
Сття бактерій, на які не діє терапія традиційними антибіотиками.
Сполука кон'югат антитіло-антибіотик даного винаходу включає антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки бета (МУТА бета), ковалентно приєднане за допомогою пептидного лінкера до антибіотика типу рифаміцину.
В одному з варіантів втілення, кон'югат антитіло-антибіотик має формулу:
АРр-(І -арх)р, де:
АБ являє собою антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки;
Ї являє собою пептидний лінкер, що має формулу: -ЗИ-Рер-у-, де біг являє собою сполучну частину; Рер являє собою пептид, що складається з двох- дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер; арх являє собою антибіотик типу рифаміцину; і р являє собою ціле число від 1 до 8.
Кількість фрагментів антибіотиків, що може бути кон'югована через реакційноздатний лінкер з молекулою антитіла, може бути обмежена кількістю вільних залишків цистеїну, які введені способами, описаними в даному документі. Приклади ААС, що відповідають формулі І, таким чином, включають антитіла, які мають 1, 2, З або 4 амінокислоти цистеїну, введені методами генної інженерії (Гуоп, К. еї а! (2012) Меїпоав іп Епгут. 502:123-138).
АНТИТІЛА ПРОТИ ТЕЙХОЄВИХ КИСЛОТ КЛІТИННОЇ СТІНКИ (УТА)
У даному документі розкриті деякі анти-М/ТА антитіла та кон'юговані анти-М/ТА антитіла, які сполучаються з М/УТА, що експресуються на деяких Ст бактеріях, у тому числі на оїарнпуососсив ашшеив. Анти-М/ТА антитіла можуть бути вибрані й отримані способами, описаними в 05 8283294; Меїїег Р. еї а! (2006) У Мої Віої. 358(3):764-72; І апно ., єї а! (2011) У
Міго!. 85(4):1820-33, і у Прикладі 21 нижче. Даний винахід передбачає композиції цих анти-МТА антитіл.
Клітинна стінка грампозитивних бактерій складається з товстого шару великого числа пептидогліканових (РОМ) оболонок, які не тільки стабілізують клітинну мембрану, але також забезпечують множину сайтів, до яких можуть бути приєднані інші молекули (Фіг. 3). Основним класом цих глікопротеїнів клітинної поверхні є тейхоєві кислоти ("ТА"), які являють собою багаті фосфатом молекули, виявлені на багатьох глікан-сполучних білках (СРВ). ТА бувають двох типів: (1) ліпотейхоєві кислоти (І ТА"), заякорені у плазматичній мембрані та простягаються від клітинної поверхні у пептидоглікановий шар; і (2) ТА клітинної стінки (МУТА), які ковалентно приєднані до пептидогліканів і простягаються крізь клітинну стінку та назовні за її межі (Фіг. 3).
М/ТА можуть становити до 6095 від загальної маси клітинної стінки у грампозитивних бактерій. У результаті, вони являють собою високо експресований антиген клітинної поверхні.
Хімічні структури М/ТА різні в різних організмах. В 5. ашгеиз М/ТА ковалентно зв'язані з 6-ОН
М-ацетилмурамової кислоти (МигМАс) через дисахарид, що складається з М-ацетилглюкозамін (СісМАс)-1-Р ії М-ацетилманозаміну (МапМАс), за яким ідуть приблизно дві або три одиниці гліцерол-фосфату (Фіг. 4). Даний полімер УУТА, таким чином, складається приблизно з 11-40 повторюваних одиниць рибіт-фосфату (Кро-Р). Покроковий синтез М/ТА спочатку ініціюється ферментом, що називається Тадо, і штами 5. ашгеивз, у яких відсутній ген Тадо (у результаті видалення гена), не синтезують МУТА. Повторювані одиниці можуть бути далі сполучені з О- аланіном (О-АІа) у положенні С2-ОН і/або з М-ацетилглюкозаміном (СІСМАс) у положенні С4-ОН через а- (альфа) або ВД-(бета) глікозидні зв'язки. Залежно від штаму 5. аигеих або фази росту бактерії глікозидні зв'язки можуть являти собою а-, Д- або суміш двох аномерів. Ці модифікації цукром СІСМАс здійснюють дві специфічні глікозилтрансферази 5. айгеиз (С(Ф15): Там си опосередковує утворення а-глікозидних зв'язків, тоді якТаг Ц5 опосередковує утворення ВД - (бета)глікозидних зв'язків.
Враховуючи істотні докази того, що внутрішньоклітинні МК5А захищені від антибіотиків, нові 60 терапевтичні композиції даного винаходу були розроблені для запобігання цього способу відхилення бактерій від дії антибіотиків, і нові терапевтичні композиції використовують антитіла, специфічні до 5. ашеив, щоб зв'язати антибіотик з бактерією, так що коли бактерія поглинається або іншим способом інтерналізується клітиною-хазяїном /п мімо, антибіотик разом із нею потрапляє в клітину-хазяїна.
В одному аспекті, даний винахід передбачає анти-МТА антитіла, які являють собою анти-
М/ТАса або анти-МТАВ. В іншому аспекті, даний винахід передбачає анти-5іарії айгецз5 антитіла.
Наведені як приклад антитіла клоновані з В клітин пацієнтів, інфікованих 5. ашгеив (як описано у
Прикладі 21). В одному з варіантів втілення, анти-М/ТА й анти-5іарі аигеи5 антитіла являють собою людські моноклональні антитіла. Даний винахід включає химерні антитіла та гуманізовані антитіла, що включають СОК антитіл проти М/ТА даного винаходу.
Для терапевтичного застосування УУТА антитіла даного винаходу, призначені для кон'югації з антибіотиками й утворення ААС, можуть належати до будь-якого ізотипу за винятком ЗМ. В одному з варіантів втілення, М/УТА антитіла є людськими антитілами ізотипу ДС. У більш певному варіанті втілення, УУТА антитіла являють собою людські Ідс1.
На Фіг. бА і 6В наведений список антитіл, які являють собою анти-МУТАса або анти-МУТА ВД. В описі й на Фігурах антитіла, позначені 4-значним номером (наприклад, 4497), також можуть бути позначені символом "5" на початку, наприклад, 54497; обидві назви відносяться до того самого антитіла дикого типу (М/Т), що має немодифіковану послідовність. Варіанти антитіл відмічені символом "У" після номера антитіла, наприклад, 4497.м8. Якщо не зазначено інше (наприклад, номер варіанта), наведені амінокислотні послідовності являють собою вихідні, немодифіковані/ незмінні послідовності. У цих антитілах може бути змінений один або декілька залишків, наприклад, з метою поліпшення рК, стабільності, експресії, можливості виробництва (наприклад, як описано у Прикладах нижче), із збереженням по суті приблизно такої самої або поліпшеної афінності зв'язування з антигеном у порівнянні з немодифікованим антитілом дикого типу. Варіанти даних УМУТА антитіл, що мають консервативні заміни амінокислот, включені в даний винахід. Нижче, якщо не зазначено інше, нумерація СОК наведена відповідно до КаБбаї, і нумерація константного домену наведена відповідно до нумерації ЕО.
На Фіг. 13А і Фіг. 138 наведене вирівнювання амінокислотної послідовності варіабельних областей легких ланцюгів (МІ) і варіабельних областей важких ланцюгів (МН), відповідно, чотирьох людських анти-М/ТА альфа антитіл. Підкреслені послідовності СОК1І1,12,13 і СОК
НТ, Н2, НЗ відповідно до нумерації Кабаї.
Таблиця бА
Послідовності СОК легкого ланцюга анти-УУТАа.
ЗЕО ІЮ МО: ЗЕО І МОг2 ЗЕО ІЮ МОЗ
ЗЕО ІЮ МО:7 ЗЕО ІЮ МО:8 ЗЕО ІЮ МО:9
ЗЕО І МОЗ ЗЕО ІО МО:14 ЗЕО І МО:15
ЗЕО ІЮ МО:19 ЗЕО ІЮ МО:20 ЗЕО ІЮ МО:21
Таблиця 6В
Послідовності СОК важкого ланцюга анти-УуУтАа. оУУМН 4461 (ЗЕ МІМРКОИТММАОВЕОС рсавБиасі во
МО (ЗЕО І МО:5) (ЗЕО І МО:б)
ОМУМІН
4624 | (ЗБОЮ МІМРМ ТО ТУМАОКЕВНО росавнасці Во
МО-10 (ЗЕО ІЮ МО-11) (ЗЕО І МО:12)
ОМУМІН
4399 (ЗЕО 1 МІМРМТОЕОСТММАОКЕОС росамАдаїі Во
МО-16 (ЗЕО ІЮ МО:17) (ЗЕО І МО:18) 267 БО ІНРОО5КТВУЗРОРОС 1 УС5005СУ5ОВАЕ55І САССУУУУОМОМ
МО: 22 (ЗЕО І МО:23) (ЗЕО І МО:24)
Послідовності кожної пари МІ. і МН.
Варіабельна область легкого ланцюга 4461
РІОМТО5РОБІ АМ5І ЧЕВАТІМСКОБОЗМІ БВНАММММ МАМ МОНКРООРРКІ МУ АЗТВЕРСМ
РОвЕЗИаБЗавзаИтовтІтІМ5І ОФдАЕРЄМАУУУСООУУТЗААТЕСОСТКМЕЇК (5ЕО І МО: 25)
Варіабельна область важкого ланцюга 4461
ОМОЇ МОБСАЕМАКРОАБУКУЗСКАБОУЗЕТОМУМНУУАОАРООСІ ЕМ МОУМІМЕКС,ССТММА
ОовЕосаеУТМТартТІЗААММОЇ АБІ ТВОЮ ТАУУМСУКОСОаЗОСЇ ВОРУСОСТТМТУ55 (5ЕБО 1
МО: 26)
Варіабельна область легкого ланцюга 4624
РІОМТО5РОБІ 5М5І СЕВАТІМСВОМОМІ І 55554МММІ А МООКРООРІ КО ТМУМАЗТВЕБОМР рагЕзазавзаторЕТтІ Ті ОАЕОМАУУУСООУМУАМРАТЕСОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 27)
Варіабельна область важкого ланцюга 4624
ОМО! ОО5БАУМЕУКАРИТЗУКУВСКТВаТмУТЕБОММІНММАГАРСОСІ ЕІ МСУЛМРМТОСТММАОК
ЕВОАМТМТАОТОІАТАМІ ЕМ55І Т5ОЮТАУУУСАКОоОСИ,Ввасі ВрімаРИТтмМмМТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 28)
Варіабельна область легкого ланцюга 4399
ЕІМГТО5РОБІ АМ5І ЧСЕВАТІМСКОМОММІ АЗЗМОКММІ АМ/УЕЄОНКРООРІ КОМУ АБІВЕБОМРО вЕЗОаЗИаБзаИаИТОЕТІ ТІЗ5І ВАЕОМАУУУСООХУУТЯРАТРСОСТКМЕРЕМ (5ЕО ІЮ МО: 29)
Варіабельна область важкого ланцюга 4399
ЕМО МОБСЕАЕУККРОТЗУКУЗСКАБИаМТЕТОММІНМ/ УВІ АРПОСІГ ЕІ МСУЛМРМТастМмМАОКЕ
ОосвАУТМТАОТІАТАУМЕЇ 5511 Т500ТАУУУСАКОоСС,аМАСІ ВОМУ СОСТ ТУТ (ЗЕО ІЮ МО: 30)
Варіабельна область легкого ланцюга 6267
РОГ ТОБРОБІ АМ5І СЕВАТІМСКОВОММІ М55ММКММІ АММООКРИООРРКІ ГІМУУАЗТВЕБИМР рагзазавзаторЕтІ Ті ОАЕОМАМУУСООУУТЗРРУТЕРСОСТКІ ЕЕ (5ЕО ІО МО: 31)
Варіабельна область важкого ланцюга 6267
ЕМОЇ МОБОАЕМККРОЕБІ КІЗСКОаБОаУЗЕТБМУМОЕМУУВОМРИаКаі и ЕУМапнРароікТАМРБЕ
ОСОМТІЗАОК5ІЗТАМІ ОМУМ5ОІ КАБОТАМУМСАВІ МСЗСС,СЗСУБОВАЕЗ5І СДОсСУУмУУСМИОУМИ
Зо ООСТТУТМУ55 (ЗЕО ІЮ МО: 32).
Даний винахід передбачає виділене моноклональне антитіло, що зв'язується з тейхоєвою кислотою клітинної стінки (М/ТА), що включає легкий ланцюг і Н ланцюг, де Г ланцюг включає
СОКІ1І1, 12, ІЗ, і Н ланцюг включає СОК НІ, Н2, НЗ, де СОК 11, 12, І З ї НІ, Н2, НЗ включають амінокислотні послідовності СОК кожного з антитіл 4461 (5ЕО ІЮ МО: 1-6), 4624 (5ЕО І МО: 7- 12), 4399 (5ЕО ІЮ МО: 13-18) і 6267 (5ЕО ІЮ МО: 19-24), відповідно, як показано в Таблицях 6А і 68.
В іншому варіанті втілення, виділене моноклональне антитіло, що зв'язується з УМТА, включає варіабельну область Н (МН) і варіабельну область Ї ланцюга (МІ), де МН має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності області МН кожного з антитіл 4461, 4624, 4399 і 6267, відповідно. У ще одному конкретному варіанті втілення, ідентичність послідовностей становить 9695, 9795, 9895, 9995 або 100905.
Даний винахід також передбачає анти-УМУТА бета антитіла, що включають послідовності СОМ ї Н ланцюгів, як показано на Фіг. 14. В одному з варіантів втілення, виділені анти-М/ТА бета моноклональні антитіла включають СОК 11, 12, І З ї НІ, Н2, НЗ, вибрані з групи, що складається з СОК кожного з 13 антитіл, наведених на Фіг. 14. В іншому варіанті втілення, даний винахід передбачає виділені анти-МЖМ/ТА бета антитіла, що мають, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності за довжиною М доменів з кожним з 13 антитіл. У ще одному певному варіанті втілення, ідентичність послідовностей становить 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095.
З 13 анти-М/ТГА бета антитіл, 6078 і 4497 були модифіковані для одержання ії) варіантів, що містять Сух, введений методами генної інженерії в один з Ї або Н ланцюгів, або в обидва ланцюги Г. і Н, для кон'югації з інтермедіатом лінкер-антибіотик; і ії) варіантів, у яких перший залишок в Н ланцюзі О змінений на Е (м2) або перші два залишки ОМ змінені на ЕЇ або ЕМ (хЗ і ма).
На Фіг. 15А-1 ї 15А-2 наведена амінокислотна послідовність повнорозмірного Ї ланцюга анти-М/ТА бета антитіла 6078 (немодифіковане) і її варіантів, м2, м3, м4. Варіанти І. ланцюга, які містять Су5, введений методами генної інженерії, відзначені символом С у чорному квадраті на кінці константної області (у цьому випадку залишок має номер 205 згідно з ЕШ). Позначення варіанта, наприклад, м2/ С-Сув5, означає, що варіант 2 містить Су5, введений методами генної інженерії, в Ї ланцюзі. НОСІ С-Су5х означає, що Су5з, введений методами генної інженерії, міститься як в Н ланцюзі, так і в Ї ланцюзі антитіла. На Фігурах з 158-1 до 158-4 наведене вирівнювання повнорозмірного Н ланцюга анти-М/ТА бета антитіла 6078 (немодифікованого) і її варіантів, м2, м3, м4, у яких змінені перший залишок або перші два залишки в Н ланцюзі.
Варіанти Н ланцюга, які містять Су5, введений методами генної інженерії, відмічені символом С у чорному квадраті на кінці константної області "у цьому випадку залишок має номер 118 згідно
З Е)).
Варіабельна область легкого ланцюга (МІ) 6078
РІММТО5РБІЇ ЗЗАБМаОВМТІТ СВАБОТІЗСУМ АМ/МООКРАЕАРКІ ПУКАБЗТІ ЕЗСУМРЗАЕЗОаБа
ЗаТЕНТІ ТІ ОРОВРГСИІМУСООУКОУВЕМЕеС,ОСТКМЕЇК (5ЕО 10 МО:111)
Варіабельна область важкого ланцюга (МН) 6078
ХХТО МОБІАЕУККРОАБУКУЗСЕАЗИОМТІ ТМ ПІМУУВОАТаОаРЕУМСОУМУММАМЗОМТамА
ОокеОаеМтТІТартвІЗТАММЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВЗІ УВОАГавАУБрІ МУСаВаті МТУ (5ЕО
ІО МО:112) де Х являє собою О або Е; і Хі являє собою М, І або М.
Зо Легкий ланцюг 6078
РІММТО5РБІЇ ЗЗАБМаОВМТІТ СВАБОТІЗСУМ АМ/МООКРАЕАРКІ ПУКАБЗТІ ЕЗСУМРЗАЕЗОаБа
ЗаТЕНЕТІ ТІЗ5І ОРОВБРСІМУСООУКОУВЕМЕеаОС,СТКМЕІКАТУМААРЗУРІЕРРБЗОЕОЇ КатТАБМУМОІ
ЕММЕМРАЕАКМОУМУКМОМА! О5аМЗОЕЗМТЕОаО5КОБЗТУБІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕМУТНОС
І 55РУТКЗЕМАСЕС (5ЕО ІЮ МО:113)
Легкий ланцюг з введеним методом генної інженерії цистеїном 6078
РІММТО5РБІЇ ЗЗАБМаОВМТІТ СВАБОТІЗСУМ АМ/МООКРАЕАРКІ ПУКАБЗТІ ЕЗСУМРЗАЕЗОаБа
ЗаТЕНРТІ ТІЗБІ ОРОВБГСІМУСООУКОУВЕМЕеИОСТКУЕІКАТМААРЗУРІЕРРБЗОЕОЇ КБатТАБУМСІ.
ЕММЕМРАЕАКМОМУКМОМАГ О52МЗОЕЗМТЕООЗКОБЗТУБІ 551Т7І ТІ ЗКАЮОМЕКНКУМАСЕУТНОІ.
ЗЗРОТКЗЕМАСЕС (5ЕО ІО МО:115)
Повнорозмірний важкий ланцюг М/Т 6078
ОМОЇ МОБЕАЕУМККРОАБУКУЗСЕАБИачхті Т5МОІМУУВОАТаОСРЕУМСОУММАМЗИМТамМА
ОКЕеОаВМТтІ ТартТ5ІЗТАУМЕЇ 551 АЗЕОТАУУУСАВЗІ УваАгавмвЕрі муаваті МТГУЗ5ЗАЗТК
СРОЗМЕРІ АРЗЗКЗТЗИаС,ТААГ ас МКЩОМЕРЕРУТУБУУМЗСИАЇ ТЗаМНТЕРАМІ О550І 51 55УМ ТМ
РІЗІ атОТМміСМУМНнНКРЗУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГІЇ СОРБУГБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТ
РЕМТСУУМОУМЗ5НЕОРЕУКЕМУУУрамМмЕМНМАКТКРАЕЄОММЗТУВУМ5МІ ТМ НОБУУЛІ МЕОКЕМКС
КУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАЕЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКИОЕМРБЗОІАМЕМЕЗМСООРЕМ
МУКТТРРМ'ОБОСОЗЕРІ ЗК ТМОКЗАМОСаМУЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКБІ БІБРО (ЗЕБО (І
МО:114)
Повнорозмірний важкий ланцюг варіанта 6078 (м2, м3 або м4)
ЕХО МОБІАЕУККРОАБУКУЗСЕАЗИМТІ ТМ ІМУУВОАТаОаРЕУМСМУММАМЗОМТИамАО кРоавмтітартвІЗТАМУМЕЇ 55І ВЗЕОТАУУУСАВНЗОІІ УваАгавУБрі маваті мІГУЗЗАВЗТКаР
ЗМЕРІ АРЗЗКЗТЗаИаатАА ас МКЩОМЕРЕРУТУБУУМЗСИАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О550І М5І 55 ТУР
ЗОЗ ЕТОТМІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇГЇ аРЗМУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕ
МТСУММОУЗНЕОРЕУКЕМУ УУраМЕМНМАКТКРАЕЄОУМОЗТУВМУУЗМІ ТМ НОСІ МЕОКЕУКСКМ
ЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКИОРАВЕРОМУУТІ РРОЗВЕЕМТКМОМ5І ТС УКЕЕМРЗОІАМЕМЕЗМООРЕММУ
КТТРРМ ОБравзЕРІ ЗК ТУОКЗАМООСММЕЗСЗУММНЕАІ НМНУТОКБІ 5І ЗР (ЗЕО ІО
МО:116) де Х може являти собою М, І або М.
Сув-генно-інженерний важкий ланцюг варіанта 6078 (м2, мЗ або м4)
ЕХО МОБІАЕУККРОАБУКУЗСЕАЗИМТІ ТМ ІМУУВОАТаОаРЕУМСМУММАМЗОМТИамАО 60 кРоавмтітартвІЗТАМУМЕЇ 55І ВЗЕОТАУУУСАВЗОІ УваАгаевУБрі маваті мтуЗЗоТКаР
ЗМЕРІ АРЗЗКЗТЗаИаатАА ас МКЩОМЕРЕРУТУБУУМЗСАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О550І М5І 55 ТУР
ЗОЗ ЕТОТМІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇГЇ аРЗМУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕ
МТСУММОУЗНЕОРЕУКЕМУ УУраМЕМНМАКТКРАЕЄОУМОЗТУВМУУЗМІ ТМ НОСІ МЕОКЕУКСКМ
ЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСИОРАВЕРОМУУТІ РРОЗВЕЕМТКМОМ5І ТС УКЕЕМРЗОІАМЕЖМЕЗМООРЕММУ
КТТРРМ ОБравзЕРІ УЗКІТУОКЗАМООСММЕЗСЗУММНЕАІ НМНУТОКБІ 5І ЗРО (ЗЕО ІО
МО:117) де Х може являти собою М, І або М.
В одному з варіантів втілення, даний винахід передбачає виділене анти-М/ТА бета антитіло, що включає важкий і легкий ланцюг, де важкий ланцюг включає УН, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 112. У додатковому варіанті втілення, це антитіло також включає МІ, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО: 111. У певному варіанті втілення, анти-М/ТА бета антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де
Ї ланцюг включає МІ з БЕО ІЮО МО: 111, і Н ланцюг включає МН з 5ЕО ІЮ МО: 112. У ще одному певному варіанті втілення, виділене анти-М/ТА бета антитіло включає І ланцюг з ЗЕО ІЮ МО: 113 і Н ланцюг з БЕО ІО МО: 114.
Сув-генно-інженерні варіанти Н і Ї ланцюгів 6078 можуть бути спарені в кожній з наступних комбінацій з утворенням повних антитіл для кон'югації з інтермедіатами лінкер-Арх й утворення анти-МТА ААС згідно з даним винаходом. Немодифікований І ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:113) може бути спарений з Суз-генно-інженерним варіантом Н ланцюга з ЗЕО ІО МО: 117; варіант може являти собою такий варіант, у якому Х являє собою М, І або М. Суб-генно-інженерний І!. ланцюг з
ЗЕО ІЮ МО: 115 може бути спарений з Н ланцюгом з 5ЕО ІЮ МО:114; варіантом Н ланцюга з
ЗЕО ІЮ МО:116; або Суз-генно-інженерним варіантом Н ланцюга з 5ЕО ІЮ МО:117 (у цьому варіанті як Н, так і Ї ланцюги містять Су5, введений методами генної інженерії). У конкретному варіанті втілення, анти-М/ТА бета антитіло й анти-М/ТА бета ААС даного винаходу включають 1. ланцюг з БЕО ІО МО: 115 і Н ланцюг з БЕО ІЮ МО:116.
На Фіг. 16А-1 ії 16А-2 наведений повнорозмірний ЇЇ ланцюг анти-М/ТА бета антитіла 4497 (немодифіковане) і її варіантів м8. Варіанти Ї ланцюга, які містять Сух, введений методами генної інженерії, позначені символом С у чорному квадраті на кінці константної області (залишок має номер 205 за Е). На Фіг. 168-1, 168-2, 168-3 наведене вирівнювання повнорозмірного Н ланцюга анти-М/ТА бета антитіла 4497 (немодифіковане) і її варіанта м8, у якому О замінений на
Е у положенні 96 в СОК НЗ, і який містить або не містить Сух, введений методами генної інженерії. Варіанти Н ланцюга, які містять Су5, введений методами генної інженерії, позначені символом С у чорному квадраті на кінці константної області (у цьому випадку залишок має номер 118 за ЕЮ). Немодифікований СОК НЗ має послідовність ЗО ОО (5ЕО ІО МО:104);
СО НЗ 4497у8 має послідовність ЗЕ БО (ЗЕО ІЮ МО:118).
Варіабельна область легкого ланцюга 4497
РІОГТОБРОБІ АУ5І СЕВАТІМСКОЗОВІЕВТЗАМКМІ І МУ МООВРООРРА ІНУАЗТАКбИамР рвЕзаваратовт І ОАЕОМАІМУСООМЕБРРУТЕСОТКІ БІК (5ЕО ІЮ МО: 119)
Варіабельна область важкого ланцюга 4497
ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСБАЗИаЕЗЕМЗЕМУМНУУВОУРИаКаИаї ммІЗЕТММЕСТТТАМАОЗ
УМвавніІЗзВОМАКМТІ М ЕМММІ ВЕЕОТАУУУСАварааті оруцоаті мтУ55 (5ЕО І МО: 120)
Варіабельна область важкого ланцюга 4497.у8
ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСБАЗИаЕЗЕМЗЕМУМНУУВОУРИаКаИаї ммІЗЕТММЕСТТТАМАОЗ
УВавнІЗвВОМАКМТІ М ЕМММІ ВЕЕОТАУУУСАВСЕСИа рруУусоОатІ МТУ55 (ЗЕО ІО МО: 156)
Легкий ланцюг 4497
РІОГТОБРОБІ АУ5І СЕВАТІМСКОЗОВІЕВТЗАМКМІ І МУ МООВРООРРА ІНУАЗТАКбИамР рагЕзазарРатовтІ ті АЕОМАІМСООХЕЗРРУТЕРСОСТКІ ЕІКАТМААРЗУРІЕРРБЗОЕБОЇІ КО
ТАБМУСІ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАЇ ОБОаМЗОЕЗУМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ ЗКАЮОМЕКНКУММАСЕ
МТНОІ 55РУТКЗЕМАСЕС (ЗЕО ІЮ МО: 121)
Важкий ланцюг 4497 м.8
ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСБАЗИаЕЗЕМЗЕМУМНУУВОУРИаКаИаї ммІЗЕТММЕСТТТАМАОЗ
УувавніІЗзВОМАКМТІ М ЕМММІ ВЕЕОТАУУМСАВаЕааІ! ррмусоОстІі МГМ55АВТКОаРБЗМЕРІ АР
ЗКЗТЗаатАА! ас МКОМЕРЕРУТУЗУУМЗИАІ ТЗаУНТЕРАМІ О55(2І.51 55 УР ОТО
СМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇГЇ СаРБЗУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУУМ ОМ
ЗНЕОРЕУКЕММ УМрОаМЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІ
ЕКТІЗКАКИОРВЕРОММУТІ РРЗВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКИОЕМРБЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ 0 зравЕн мк ТМОКЗАМООСММЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І ЗРО (ЗЕО ІЮ МО: 122)
Легкий ланцюг 4497-Сув
РІОГТОБРОБІ АУ5І СЕВАТІМСКОЗОВІЕВТЗАМКМІ І МУ МООВРООРРА ІНУАЗТАКбИамР рагЕзазарРатовтІ ті АЕОМАІМСООМЕЗРРУТЕРСОСТКІ ЕІКАТМААРБЗУРІЕРРБОЕОЇ КО 60 00/ ТАБММСОП ММЕМРАЕАКМОМ/КМОМАГ ОБаИМЗОЕЗМТЕОО5КОЗТМУБІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКММАСЕ
МТНОІ 55РУТКЗЕМАСЕС (5ЕО ІЮ МО: 123)
Важкий ланцюг 4497.у8
ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСБАЗИаЕЗЕМЗЕМУМНУУВОУРИаКаИаї ммІЗЕТММЕСТТТАМАОЗ
УуУвавніІЗзВОМАКМТІ М ЕМММІ ВЕЕОТАУУУСАВИЕСаИаг ромсоОсатІі МГМУ55ЗАЗТКаРЗМУЕРІ АР
ЗКЗТЗаатАА! ас МКОМЕРЕРУТУЗУУМЗИАІ ТЗаУНТЕРАМІ О55(2І.51 55 УР ОТО
СМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГ І СОаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУМУМОМ
ЗНЕОРЕУКЕММ УМрОаМЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІ
ЕКТІЗКАКИОРВЕРОММУТІ РРОЗВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКИОЕМРБЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ 0 5рОБЕР ЗК ТМОКБеЕМОООММЕ5СЗУММНЕАНМНУТОКЗБІ 5І. 5РО (5ЕО ІЮО МО: 157; так само як в ЗЕО ІЮ МОЧ22).
Важкий ланцюг 4497.м8-Сув
ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІ ВІ БСБАЗИаЕЗЕМЗЕМУМНУУВОУРИаКаИаї ммІЗЕТММЕСТТТАМАОЗ
УВавнІЗвВОМАКМТІ М ЕМММІ ВЕЕОТАУУУСАВИаєСаИаг ромсоОсатІі МГУ55ОЗТКаРБЗМУЕРІ АР
ЗКЗТЗаатАА! ас МКОМЕРЕРУТУЗУУМЗИАІ ТЗаУНТЕРАМІ О55(2І.51 55 УР ОТО
СМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕГ І СаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУМУМОМ
ЗНЕОРЕУКЕММ УМрОаМЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУВМУМУМІ ТМ НОБУ/ЛІ аКЕМКОСКМУ5МКАЇ РАРІЕ
КТІЗКАКОРАЕЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І ТС УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ 05 рав;гЕг кі МОКЗАМООСММУЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОКБІ 5І ЗРО (ЗЕО ІЮ МО: 124)
Інше виділене анти-М/ТА бета антитіло, передбачене даним винаходом, включає важкий та легкий ланцюги, де важкий ланцюг включає МН, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО: 120. У додатковому варіанті втілення, це антитіло також включає
МІ,, що має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з 560 ІЮ МО: 119. У певному варіанті втілення, анти-М/ТГА бета антитіло включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де Ї ланцюг включає
МІ. з БЕО ІО МО: 119, і Н ланцюг включає МН з 5ЕО ІЮ МО: 120. У ще одному певному варіанті втілення, виділене анти-М/ТА бета антитіло включає ЇЇ ланцюг з 5ЕО ІЮ МО: 121 і Н ланцюг з
ЗЕО І МО: 122.
Сув-генно-інженерні варіанти Н і Ї ланцюгів 4497 можуть бути спарені в кожній з наступних комбінацій з утворенням повних антитіл для кон'югації з інтермедіатами лінкер-Арх й утворення анти-МТА ААС згідно з даним винаходом. Немодифікований І ланцюг (ЗЕО ІЮ МО:121) може
Зо бути спарений з Суз-генно-інженерним варіантом Н ланцюга з 5ЕО ІЮО МО: 124. Сув-генно- інженерний І. ланцюг з БЕО ІЮ МО: 123 може бути спарений з варіантом Н ланцюга з ЗЕО ІЮ
МО:157; або Суз-генно-інженерним варіантом Н ланцюга з 5ЕО ІЮО МО:124 (у цьому варіанті як
Н, так і Г ланцюги містять Су5, введений методами генної інженерії). У конкретному варіанті втілення, анти-М/ТГА бета антитіло й анти-М/ГА бета ААС даного винаходу включають ГІ. ланцюг з
ЗЕО І МО: 123.
Інший варіант втілення являє собою антитіло, що зв'язується з тим же самим епітопом, що й кожне з анти-МТА альфа антитіл, наведених на Фіг. 13А і Фіг. 13В. Також передбачене антитіло, що зв'язується з тим же самим епітопом, що й кожне з анти-УМ/ТА бета антитіл, наведених з Фіг. 14, Фіг. 15А і 158 і Фіг. 16А і 168.
На зв'язування анти-М/ТА антитіл з М/УТА впливає аномерна орієнтація СІСМАс-модифікацій цукру на М/ТА. М/ТА модифіковані М-ацетиглюкозаміном (СІСМАс) у положенні С4-ОН через а- або В-глікозидні зв'язки під дією ТакгМ глікозилтрансферази або Таг5 глікозилтрансферази, відповідно. Відповідно, препарати клітинних стінок зі штамів-мутантів за глікозилтрансферазою, в яких відсутній Таг(АТагм), Таг (АТаг5) або обидва ферменти, ТагМ і Таг5 (АТагмМ/АтТаге), були проаналізовані за допомогою імуноблотингу з антитілами проти УУТА. УТА антитіло (57574), специфічне до а-сісМАс модифікаціям на М/ТГА, не зв'язується з препаратом клітинної стінки з штаму АТагм. Навпаки, УУТА антитіло (54462), специфічне до модифікацій В-сІСМАс на УТА, не зв'язується з препаратом клітинної стінки зі штаму АТаг5. Як і очікувалось, обидва цих антитіла не зв'язуються з препаратами клітинних стінок із штаму з делецією, в якого відсутні обидві глікозилтрансферази (АТагМ/АтТагв), і також із штаму, в якого відсутні М/ТА (АТадо). Відповідно до цього аналізу, антитіла були охарактеризовані як анти- а-сісСМАс М/ТА моноклональні антитіла або як анти- Д-СІСМАс М/ТА моноклональні антитіла, як зазначено в Таблиці та на фіг. бА і 68.
Методами генної інженерії в реакційноздатні ділянки в антитілі можуть бути введені залишки амінокислоти цистеїн, які не утворюють внутрішньоланцюгові або міжланцюгові дисульфідні зв'язки (Чипиїшіа, еї аїІ., 2008р Маїшиге Віоїесп., 26(8):925-932; ЮОогпап еї а! (2009) Віоса 114(13)у2721-2729; 005 7521541; 05 7723485; МО2009/052249, Зпеп вї а! (2012) Майшге Віотесн.,
З0(2):184-191; Уипшшіа сеї а! (2008) дЧоик ої Іттип. Меїподз 332:41-52). Тіоли цистеїнів, введених методами генної інженерії, можуть реагувати з лінкерами або інтермедіатами лінкер-антибіотик бо даного винаходу, у яких є тіол- реакційноздатні електрофільні групи, такі як малеїмід або альфа-галоген амід, з утворенням ААС із фрагментами антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном (ТпіоМаб) і антибіотика (арх). Таким чином, можна задати, контролювати й знати розташування фрагмента антибіотика. Можна контролювати навантаження антибіотика, оскільки тіольні групи цистеїну, введеного методами генної інженерії, як правило, реагують з тіол-реакційноздатними лінкерами або інтермедіатами лінкер-антибіотик з високим виходом.
Введення амінокислоти цистеїну в анти-М/ТА антитіло шляхом заміни в одному сайті важкого або легкого ланцюга дає два нових цистеїни в симетричному тетрамерному антитілі. Можна одержати майже гомогенний продукт кон'югації ААС з навантаженням антибіотика, приблизно рівний 2.
У деяких варіантах втілення, може бути бажаним одержати анти-МТА антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном, наприклад, "ПпіоМаб", у яких один або декілька залишків антитіла заміщені на залишки цистеїну. У конкретних варіантах втілення, заміщені залишки перебувають у доступних ділянках антитіла. У результаті заміни цих залишків на цистеїн реакційноздатні тіольні групи виявляються розташованими в доступних ділянках антитіла та можуть бути використані для кон'югації антитіла з іншими фрагментами, такими як фрагменти антитіла або фрагменти лінкер-антибіотик, з метою одержання імунокон'югату, як описано далі в даному документі. У деяких варіантах втілення, будь-який один або декілька з наступних залишків можуть бути заміщені на цистеїн, включаючи М205 (нумерація за Кабраї легкого ланцюга; А118 (нумерація ЕЮ) важкого ланцюга; і 5400 (нумерація ЕО) області Ес важкого ланцюга. Наведені необмежуючі приклади мутантів анти-УУТА антитіла з цистеїн генно- інженерним важким ланцюгом АТ18С (5ЕБЕО ІЮ МО: 149) і легеим ланцюгом М205С (5ЕО ІО
МО:151). Анти-М/ТА антитіла з введеним методом генної інженерії цистетїном можуть бути отримані, як описано в Уипиїшіа, єї аіІ., 20086 Маїшге Віоївсн., 26(8):925-932; 05 7521541; 05- 2011/0301334.
В іншому варіанті втілення даний винахід відноситься до виділеного анти-МУТА антитіла, що включає важкий та легкий ланцюги, де важкий ланцюг включає послідовність константної області важкого ланцюга дикого типу або мутанта з введеним методом генної інженерії цистеїном (ТпіоМаб) і послідовність константної області легсого ланцюга дикого типу або мутанта з введеним методом генної інженерії цистеїном (ТпіоМаб). В одному з варіантів, важкий ланцюг має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з константною областю важкого ланцюга (ІдС1) дикого типу
АЗТКОаРБОМЕРІ АРІЗКЗТЗОаСТААГаСІ МКОУМЕРЕРУТУБМ МЗСОАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О55О011 51.
ЗМУ УРБЗБЗІ ТО ТМІСМУМНКРОМТКМОККМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇ І СОаРБЗМУБІ ЕРРКРКОТ
ГМІЗАТРЕУТСМУУМОМЗНЕОРЕУКЕММ УМО МЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУВУММІ ТМ НОСІ МО
КЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКЕОРРАЕЕРОММТІ РРОВЕЕМТКМОМБ5І ТС УКИЕМРБЗОІАМЕМ ЕМ
СОРЕММУКТТРРМІ ОБОаЗЕРІ ЗК ТМОКЗАУМООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОК (ЗЕО І МО:148) константною областю важкого ланцюга (Ідс1) А118С "ТніоМар"
С5ТКаРЗМЕРІ АРЗЗКЗТЗИааТтТАА ас МКЩОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О550І 5
І 5548. ТУРБО ЕТО ГМСМУМНКРУОМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇЇ СОРБЗМУБІ ЕРРКРКО
ТЕМІЗАТРЕУТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕММ УМО МЕУМНМАКТКРАЕЕОСУМЗТУВМУМУМІ ТМІ НОБУМІ М
СКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКИОРАЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМУБІ ТС УКаЕМРЗОІАМЕМЕЗ
МаоРЕММУКТТРРМІ О5ОраЗЕРІ ЗК ТОКЗАМОСОаММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ І РОК (ЗЕО І МО:149) і легкий ланцюг має, щонайменше, 9595 ідентичність послідовності з константною областю легкого ланцюга (каппа) дикого типу
ВАТУМААРБЗУРІЕРРБЗОЕОЇ КЗатАБУМСТ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАГ ОБОаМЗОЕЗУТЕООЗКО
ТУБІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕМУТНОІ 55РУТКОЗЕМАИаЕС (ЗЕО І МО:150) константною областю легкого ланцюга (каппа) М205С "ТпіоМар"
ВАТУМААРБЗУРІЕРРБЗОЕОЇ КЗатАБУМСТ І ММЕМРАЕАКМОМКМОМАГ ОБОаМЗОЕЗУТЕООЗКО
ТУБІ З5ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКУМАСЕМУТНОСІ 55РСТКЗЕМАСЕС (ЗЕО ІЮ МО:151).
ААС даного винаходу включають анти-М/ТА антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном, у яких одна або декілька амінокислот в антитілі дикого типу або вихідному анти-М/ТА антитілі заміщені на амінокислоту цистеїн. Будь-яка форма антитіла може бути змінена таким чином, тобто мутована. Наприклад, вихідний Бар фрагмент антитіла може бути змінений для одержання Бар з введеним методом генної інженерії цистеїном, що називається в даному документі ЧпіоБАВ." Аналогічно, вихідне моноклональне антитіло може бути змінене для 60 одержання "ПпіоМаб". Слід зазначити, що мутація в одному сайті дає один введений методами генної інженерії залишок цистеїну в ТПІОЕАВ, тоді як мутація в одному сайті дає два введених методи генної інженерії залишку цистеїну в ТпіоМар через димерну природу Ідс антитіла. У мутантах із заміщеними (введеними методами генної інженерії") залишками цистеїну (Суз) оцінюють реакційну здатність введених методами генної інженерії тіольних груп цистеїнів.
Антитіла, описані в даному документі, можуть бути отримані з використанням клітин-хазяїнів у культурі. Клітини-хазяїни можна трансформувати векторами (експресуючими векторами або векторами для клонування), які включають одну або декілька нуклеїнових кислот, що кодують антитіла, описані в даному документі. Клітини можна культивувати в умовах, що підходять для одержання антитіл, і антитіла, продуковані клітиною, далі можуть бути очищені. Підходящі клітини для одержання антитіл можуть включати клітини прокаріот, дріжджів або вищих еукаріот (наприклад, ссавців). У деяких варіантах втілення, використовують клітину ссавців (людську або не людську клітину ссавців). У деяких варіантах втілення, використовують клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО).
Клітини ссавців можна культивувати, і розмноження клітин ссавців у культурі (культурі тканини) є рутинною процедурою. Приклади ліній клітин ссавців, які можуть бути використані в якості хазяїнів, включають, без обмеження, лінію клітин нирок мавпи СМ1, трансформовану
ЗУ40 (Сб05-7, АТСС СІ 1651); лінію клітин людських ембріональних нирок (клітини 293 або 293, субклоновані для росту в суспензійний культурі, Сгапат еї а/., /. Степ Міго!ї. 36:59 (1977)); клітини нирки дитинчати хом'яка (ВНК, АТСС СС 10); клітини Сертолі мишей (ТМ4, Майег, Віо/.
Нергой. 23:243-251 (1980)); клітини нирок мавпи (СМ1І АТСС ССІ 70); клітини нирок африканської зеленої мавпи (МЕКО-76, АТОС СВІ -1587); людські клітини карциноми шийки матки (НЕГА, АТСС СС 2); клітини нирок собаки (МОСК, АТСС СС 34); клітини печінки сірого пацюка Вийаю (ВК ЗА, АТСС СКІ 1442); людські клітини легенів (МУИ138, АТСС СС 75); людські клітини печінки (Нер 52, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози мишей (ММТ 060562, АТСС СС 51); клітини ТКІ (Маїег еї а/., Аппа/5 М.У. Асай. сі. 383:44-68 (1982)); клітини
МАС 5; клітини Е54; і лінію людської гепатоми (Нер 52). Інші використовувані в якості хазяїнів лінії клітин ссавців включають лінії клітин мієломи, такі як МБО і Бр2/0. Огляд деяких ліній клітин ссавців, які можуть бути використані в якості хазяїнів для одержання антитіл, дивіться, наприклад, в Хагакі апа Уми, Меїйосіз /п Моіеси!аг Віоіоду, Мої. 248 (В. К. б. 10, ед., Нитапа
Зо Рге55, Тоїома, М.)., 2003), рр. 255-268.
В якості хазяїнів також можуть бути використані культури рослинних клітин бавовни, кукурудзи, картоплі, соєвих бобів, петунії, томатів, ряски (І епіпасеає), люцерни (М. ігипсайшіа) і тютюну.
Підходящі прокаріотичні клітини для цих цілей включають еубактерій, таких як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Епіегобасіегіасеає, такі як Е5спегісніа, наприклад, БЕ. соїї, Епіегобасієї, Епмуіпіа, КіІебрзіеПа, Ргоїеив, бЗаІтопег/а, наприклад, баІтопейа урпітипит, бетайа, наприклад, бетаца тагсезсапв і ЄРідеПа, а також Васі/ї, такі як В. вирів і В.
ГІспепіюгттів (наприклад, В. Пспеппогтів АТР, розкритий в БО 266,710, опублікованому 12 квітня 1989), Рвзеидотопав, такі як Р. аегидіпоза, і бгеріотусевз. Серед Е. соїї кращим хазяїном для клонування є Е. со// 294 (АТСС 31,446), хоча підходящими є й інші штами, такі як Є. со); В, Е. сої
Х1776 (АТСС 31,537) і Б. сої МІ/3110 (АТС 27,325). Ці приклади наведені тільки як приклад і не призначені для обмеження об'єму даного винаходу.
На додаток до прокаріотів підходящими хазяїнами для клонування або експресії векторів, що кодують антитіла, є еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі. басспаготусез сегемізіає, або звичайні пекарські дріжджі, є найбільш часто використовуваними серед нижчих еукаріотичних мікроорганізмів-хазяїнів. Проте, ряд інших родів, видів і штамів, таких як бсрігозасспаготусез ротбе; Кіпсуулеготусевз, такі як, наприклад, К. Іасії5, К. тМадіїїв (АТС 12,424), К. риїдансивз (АТС 16,045), К. ш/іскегатії (АТОС 24178), К. шалі (АТС 56,500),
К. аюзорнійагит (АТСС 36,906), К. Шегтоїіоіегапв і К. тагхіапив; уатома (ЕР 402226); Рісніа разіогіз (ЕР 183,070); Сапаїда; Трисподепта геезіа (ЕР 244234); Мешиговрога ставзза; осНпулаппіотусев, такі як бспмаппіотусев оссідепіа!/йв; і нитчасті гриби, такі як, наприклад,
Меиймгозрога, Репістит, Тоуросіадіит, і АзрегдіЛив5, такі як А. піашапз і А. підег, широко доступні та можуть бути використані в даному документі.
ФРАГМЕНТИ АНТИБІОТИКА ТИПУ РИФАМІЦИНУ
Фрагмент антибіотика (арх) кон'югатів антитіло-антибіотик (ААС) даного винаходу являє собою антибіотик типу рифаміцину або групу, що має цитотоксичний або цитостатичний ефект.
Рифаміцини являють собою групу антибіотиків, які одержують або з природних джерел, бактерій Мосагаїа теайетапеї, Атусоїаюрвіх тесййетапеї, або штучно. Вони являють собою підклас більшого сімейства ансаміцинів, які інгібують бактеріальну РНК полімеразу (Рціїї еї аї 60 (1995) Апіітістоб. Адепі5 СпетоїНег. 39:1489-1492; Рекіївіюм, єї а! (2008) Ргос Маї! Асай 5сі ОБА,
105(39): 14820-5) і мають активність проти грампозитивних і деяких грамнегативних бактерій.
Рифаміцини особливо ефективні проти мікобактрій і тому використовуються для лікування туберкульозу, лепри й інфекцій мікобактеріального комплексу (МАС). Група антибіотиків типу рифаміцину включає "класичні" лікарські препарати рифаміцину, а також похідні рифаміцину, рифампіцин (рифампін, реєстраційний номер СА 13292-46-1), рифабутин (реєстраційний номер
СА 72559-06-95 005 2011/0178001), рифапентин і рифалазил (реєстраційний номер СА 129791- 92-0, Воїнвзівїп еї а! (2003) Ехреп Оріп. Іпмевіїд. Огид5 12(2):255-271; Еціїї еї а! (1994) Апіїтісгоб.
Адепіз Спетоїйег. 38:1118-1122). До багатьох антибіотиків типу рифаміцину розвивається стійкість (М/іспеЇпацз еї а! (2001) 9. Апійпісгор. СпетоїПег. 47:153-156). Рифаміцини були вперше виділені в 1957 з ферментативної культури бгеріотусез теаіпетапеї!. Було відкрито біля семи рифаміцинів, названих рифаміцин А, В, С, 0, Е, 5 ї БМ (05 3150046). Рифаміцин В першим був введений у комерційну практику та використовувався для лікування стійкого до лікарських засобів туберкульозу в 1960-х. Рифаміцини використовували для лікування багатьох захворювань, серед яких найбільш значимим був ВІЛ-асоційований туберкульоз. Через велику кількість доступних аналогів і похідних рифаміцини широко використовували для елімінації патогенних бактерій, що стали стійкими до зазвичай використовуваних антибіотиків. Наприклад, рифампіцин відомий своєю потужною дією та здатністю запобігати виникненню стійкості до лікарських засобів. Він швидко знищує штами бацил, що швидко діляться, а також "персистуючі" клітини, які залишаються біологічно неактивними протягом тривалих періодів часу, що дозволяє їм уникати дії антибіотиків. Крім того, рифабутин і рифапентин обидва використовувались проти туберкульозу, набутого ВІЛ-позитивними пацієнтами.
Фрагменти антибіотика (арх) кон'югатів антитіло-антибіотик, що відповідають формулі І, являють собою фрагменти типу рифаміцину, що мають структуру: (в) "тв! С ю-- в) Кк ок 1
Кк ТЕ он ЖК хон 2 мо НО,,, чу
НМ о «і де: пунктирні лінії означають необов'язковий зв'язок;
Е являє собою Н, С1-Сі2 алкіл або С(О)СН:;
А! являє собою ОН;
В2 являє собою СНАМ-(гетероцикліл), де гетероцикліл необов'язково заміщений однією або декількома групами, незалежно вибраними з С(О)СН»з, С:1-Сі2 алкілу, Сі-С12 гетероарилу, С2-Сго гетероциклілу, Св-Сго арилу та Сз-С12 карбоциклілу; або В' ії Кк? утворюють п'яти- або шестичленний конденсований гетероарил або гетероцикліл, і необов'язково утворюють спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, де спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце необов'язково заміщене Н, РЕ, СІ, Вг, І, С1-С:12 алкілом або ОН; де пептидний лінкер Ї ковалентно приєднаний до К-.
Варіант втілення фрагмента типу рифаміцину являє собою:
(в)
І, о | -
Ге 6) ж (Фів (взрм 2 о Полин
НИ о і де КЗ незалежно вибраний з Н і С1-С:і2 алкілу; ЕК" вибраний з Н, РЕ, СІ, Вг, І, С1-С:12» алкілу та
ОН; і 7 вибраний з МН, М(С1-Сч2 алкілу), О і 5; і де пептидний лінкер І. ковалентно приєднаний до атома азоту М(БЗ)».
Варіант втілення фрагмента типу рифампіцину являє собою: (6)
Ли, о | М-- во 1 в Ф он хон
ОННо,,, пу ай Нм (Ф)
Е де
В? вибраний з Н і С:-Сі2 алкілу; і де пептидний лінкер Ї ковалентно приєднаний до атома азоту МЕ?.
Варіант втілення фрагмента типу рифабутину являє собою: (9)
І, Ге! | -- в) Кк ок
Ма Ф ОНА ХОнН вм
М Ге) НО,,, пу
НМ о і де Е? вибраний з Н і С.і-С:2 алкілу; і де пептидний лінкер І. ковалентно приєднаний до атома азоту МЕ?.
Варіант втілення фрагмента типу бензоксазинорифаміцину являє собою:
(в)
І о | М
Фін. о | а Ок як; (в) о НО, пу во
Ж де ЕР» вибраний з Н і С.1-Сі2 алкілу; і де пептидний лінкер І. ковалентно приєднаний до атома азоту МЕЗО.
Варіант втілення фрагмента типу бензоксазинорифаміцину, що називається у даному документі рірВоОЕК, являє собою: (о); и, о | М-- о); . он | КЗ ок г й о Но ит
Нию (о); (В3р»М
Ж де КЗ незалежно вибраний з Н і С1-Сі2 алкілу; і де пептидний лінкер ЇЇ ковалентно приєднаний до атома азоту М(БЗ)».
Варіант втілення фрагмента типу бензоксазинорифаміцину, що називається у даному документі диметил рірвок, являє собою: (в,
І, о | - (Фін! о | ХУ ОАс
НМ о (СНз)»м сх де пептидний лінкер Ї ковалентно приєднаний до атома азоту М(СНз)».
Напівсинтетична похідна рифаміцин 5 або відновлена натрієва сіль рифаміцину ЗМ можуть бути перетворені в антибіотики типу рифалазилу за кілька стадій, де К являє собою Н або Ас,
ВЗ незалежно вибраний з Н і С1-С:12 алкілу; КЕ" вибраний з Н, Е, СІ, Вг, І, С1-С:12 алкілу і ОН; і 7 вибраний з МН, М(С1і-Сі2 алкілу), О і 5, як показано на Фіг. 9-11. Можуть бути отримані бензоксазино (7 - О), бензтіазино (7 - 5), бенздіазино (7 - МН, М(С1-С12 алкілу рифаміцини (057271165). Аналоги бензоксазинорифаміцину (ВОК), бензтіазинорифаміцину (ВТК) і бенздіазинорифаміцину (ВОК), які містять замісники, нумеруються згідно зі схемою нумерації, передбаченою у формулі А у колонці 28 в 05 7271165, включеному в даний документ за допомогою посилання для цієї мети. "25-О-деацетил" рифаміцин означає аналог рифаміцину, в якого була вилучена ацетильна група у положенні 25. Аналоги, в яких це положення далі дериватизується, називаються "25-О-деацетил-25-(замісниюрифаміцин", при цьому "замісник" заміняється на повну назву сполуки відповідно до номенклатури для дериватизуючої групи.
Фрагменти антибіотика типу рифаміцину можуть бути синтезовані способами, аналогічними
Б тим, які розкриті в 5 4610919; 05 4983602; 05 5786349; 0055981522; 05 4859661; 05 7271165; 2011/0178001; 5еїїдзоп, єї аї., (2001) Апії-Сапсег Огиде 12:305-13; Спет. РНагт. Виї., (1993) 41:148, кожний з яких включений у даний документ за допомогою посилання. Фрагменти антибіотика типу рифаміцину можуть бути піддані скринінгу на антибактеріальну активність шляхом вимірювання їх мінімальної інгібуючої концентрації (МІС) з використанням стандартних аналізів МІС /л міто (ТотіокКа єї аї., (1993) Апіїтістор. Адепів СпетоїНег. 37:67). щи вх А Вас В х й т СТР що 5 щи че ов сн шен ши ї ! Рак дивом ж у НО
НМ. КН Е . М Й й З
Рифаміцин 5 бензонсазинорифаміцин
ПЕПТИДНІ ЛІНКЕРИ
"Пептидний лінкер" (І) являє собою біфункціональний або мультифункціональний фрагмент, що ковалентно приєднаний до одного або декількох фрагментів антибіотиків (арх) й антитіла (АБ) з утворенням кон'югату антитіло-антибіотик (ААС), що відповідає формулі І. Пептидні лінкери в ААС є субстратами для розщеплення внутрішньоклітинними протеазами, у тому числі в лізосомах. Протеази включають різні катепсини та каспази. Розщеплення пептидного лінкера в ААС всередині клітини може вивільняти антибіотик типу рифаміцину з антибактеріальною дією.
Кількість активного антибіотика, що вивільняється в результаті розщеплення ААС, може бути виміряна за допомогою аналізу вивільнення з каспазою з Прикладу 20.
Кон'югати антитіло-антибіотик (ААС) можна одержувати з використанням лінкера або інтермедіату лінкер-антибіотик, що мають реакційноздатну функціональну групу для зв'язування з антибіотиком (абх) і з антитілом (АБ). В одному з варіантів втілення, наведеному як приклад, тіол цистеїну в антитілі з введеним методом генної інженерії цистеїном (АБ) може утворювати зв'язок з функціональною групою лінкерного реагенту, фрагментом антибіотика або інтермедіатом антибіотик-лінкер.
В одному з аспектів, лінкерний реагент або інтермедіат лінкер-антибіотик мають
Зо реакційноздатний сайт із електрофільною групою, що реагує з нуклеофільним цистеїном на антитілі. Тіол цистеїну антитіла реагує з електрофільною групою лінкерного реагенту або інтермедіату лінкер-антибіотик з утворенням ковалентного зв'язку. Використовувані електрофільні групи включають малеїімідні та галогенацетамідні групи, але не обмежуються ними.
Антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном реагують з лінкерними реагентами або інтермедіатами лінкер-антибіотик, що несуть електрофільні функціональні групи, такі як малеїмідна або Г-галогенкарбонільна, згідно зі способом кон'югації, описаним на сторінці 766 в
Кіниз5тап, єї а! (2004), Віосоп/іидає СРетізну 15(4):765-773, і відповідно до протоколу з
Прикладу 19.
В іншому варіанті втілення, реакційноздатна група лінкерного реагенту або інтермедіату лінкер-антибіотик містить тіол-реакційноздатну функціональну групу, що може утворювати зв'язок з вільним тіолом цистеїну антитіла. Приклади тіол-реакційноздатних функціональних груп включають малеїмід, о-галогенацетил, активовані ефіри, такі як сукцинімідні ефіри, 4-нітрофенілові ефіри, пентафторфенілові ефіри, тетрафторфенілові ефіри, ангідриди, хлорангідриди кислот, сульфонілхлориди, ізоціанати та ізотіоціанати, але не обмежуються ними.
В іншому варіанті втілення, лінкерний реагент та інтермедіат антибіотик-лінкер має реакційноздатну функціональну групу з нуклеофільною групою, що реагує з електрофільною групою на антитілі. Використовувані електрофільні групи на антитілі включають піридил дисульфідні, альдегідні або кетонові карбонільні групи, але не обмежуються ними. Гетероатом нуклеофільної групи лінкерного реагенту або інтермедіату антибіотик-лінкер може реагувати з електрофільною групою на оантитілі й утворювати ковалентний зв'язок з антитілом.
Використовувані нуклеофільні групи на лінкерних реагентах або інтермедіатах антибіотик-лінкер включають гідразид, оксим, аміно, тіол, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат й арилгідразид, але не обмежуються ними. Електрофільна група на антитілі забезпечує зручний сайт для прикріплення лінкерного реагенту або інтермедіату антибіотик-лінкер.
Пептидний лінкер може включати один або декілька компонентів лінкера. Приклади компонентів лінкера включають пептидну частину, б-малеїімідокапроїл СМС, малеїімідопропаноїл ("МР"), валін-цитрулін ("маІ-сі" або "мс"), аланін-фенілаланін (аіа-рпе"), п- амінобензилоксикарбоніл. ("РАВ"), М-сукцинімідил-4-(2-піридилтіо)упентаноат (СЗРР") і 4-(М- малеїмідометил)циклогексан-і карбоксилат (МСОС"). Різні компоненти лінкера відомі в даній області техніки, деякі з них описані нижче.
В іншому варіанті втілення лінкер може бути заміщений групами, які модулюють розчинність або реакційну здатність. Наприклад, заряджений замісник, такий як сульфонат (-5О5) або амоній, може збільшувати розчинність реагенту у воді та полегшувати проведення реакції зв'язування лінкерного реагенту з антитілом або фрагментом антибіотика або полегшувати проведення реакції зв'язування АБб-І (інтермедіат антитіло-лінкер) з арх або абх-!. (інтермедіат антибіотик-лінкер) з АБ залежно від способу синтезу, що використовується для одержання ААС.
ААС даного винаходу спеціально включають, без обмеження, ті ААС, які отримані за допомогою наступних лінкерних реагентів: ВМРЕО, ВМРБ5, ЕМОС5, СМВ5, НВУ5, І С-5МОС,
МВ5, МРВН, ВАР, 5ІА, БІАВ, МОСС, 5МРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМО5, сульфо-2МВ5, сульфо-
КМИиИ5, сульфо-МВ5, сульфо-БІАВ, сульфо-ЗМОС, сульфо-ЗМРВ, 5У5В (сукцинімідил-(4- вінілсульфон)бензоат) і біс-малеімідних реагентів, таких як ОТМЕ, ВМВ, ВМОВ, ВМН, ВМОЕ,
ВМ(РЕС)», і ВМ(РЕС)з. Біс-малеїмідні реагенти забезпечують можливість приєднання тіольної
Зо групи антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном до фрагменту антитіла, яке містить тіол, мітці або інтермедіату лінкера послідовним або конвергентним способом. Інші функціональні групи, крім малеїімідної, які реагують з тіольною групою антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном, тіольною групою фрагменту антибіотика або інтермедіату лінкер-антибіотик, включають бромацетамід, вінілліридин, дисульфід, піридил дисульфід, ізоціанат та ізотіоціанат. о) (Ф) х о о); мита мит
Х о Х / (є, в) (в)
ВМ(РЕС)» ВМ(РЕС)»
Використовувані лінкерні реагенти також можуть бути отримані з інших комерційних джерел, такі як МоЇесціаг Віозсіепсез Іпс. (Воцідег, СО), або синтезовані відповідно до методик, описаних в ТокКі еї а! (2002) У. Огд. Спет. 67:1866-1872; Юиромснік, еї аї. (1997) Теманеагоп І енНегв, 38:5257-60; УМаїКег, М.А. (1995) 9. Огу. Спет. 60:5352-5355; Егівсп єї а! (1996) Віосопідаїеє
Спет. 7:180-186; 05 6214345; МО 02/088172; 005 2003130189; О052003096743; МО 03/026577;
МО 03/043583; і МО 04/032828.
В іншому варіанті втілення, фрагмент пептидного лінкера ААС включає лінкер дендритного типу для ковалентного приєднання більше ніж одного фрагменту антибіотика до антитіла за допомогою розгалуженого мультифункціонального фрагменту лінкера (Зип еї а! (2002)
Віоогдапіс а Меаісіпа! Спетівту Гецег5 12:2213-2215; Б!ип єї а! (2003) Вісогдапіс « Медісіпа!
СРетівзту 11:1761-1768). За допомогою дендритних лінкерів може бути збільшене молярне співвідношення антибіотик: антитіло, тобто навантаження, що пов'язане з активністю ААС.
Таким чином, якщо антитіло з введеним методом генної інженерії цистеїном містить тільки одну реакційноздатну тіольну групу цистеїну, за допомогою дендритного лінкера може бути приєднана множина фрагментів антибіотика.
У деяких варіантах втілення ААС, що відповідають формулі І, пептидний лінкер має формулу: -ЗИ-Рер-у-,
де 5іг являє собою сполучну частину, ковалентно приєднану до антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА); Рер являє собою пептид, що складається з двох-дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер, ковалентно приєднаний до антибіотика типу рифаміцину. Приклади варіантів втілення таких лінкерів описані в О57498298, спеціально включеному в даний документ за допомогою посилання.
В одному з варіантів втілення, сполучна частина "5іг" має формулу: (в) о) з де ВУ вибраний з групи, що складається з С1-Сто алкілену-, -Сз-Св карбоцикло, -О-(С1-Св алкілу)-, -арилену-, -С1-С1о алкілен-арилену-, -арилен-С1-Сто алкілену-, -С1-С1о алкілен-(Сз-Св карбоцикло)-, -(Сз-Св карбоцикло)-С1-С:1о алкілену-, -Сз-Св гетероцикло-, -С1-С1о алкілен-(Сз-Св гетероцикло)-, -(Сз-Св гетероцикло)-С1-С1о алкілену-, -"СНаСНгО)- і -СНгСНгО)-СНе-; і г являє собою ціле число в діапазоні від 1 до 10.
Приклади сполучної частини наведені нижче (де хвиляста лінія означає місце ковалентного приєднання до антитіла): ) пана (в) (в) Мо о с) 3-- ту о МР (в); (в); п
А ут
І н о) (в); о : оса е);
Ге; (в)
КА о .
Пептидна частина "Рер" включає два або більше амінокислотних залишки, які зустрічаються у природі, включаючи двадцять основних амінокислот, а також мінорні амінокислоти, такі як цитрулін, добре відомі в області біохімії. Амінокислоти відрізняються своїми бічними ланцюгами. Пептидна частина, таким чином, включає два або більше бічні ланцюги амінокислот, включаючи, але не обмежуючись цим, -СНз (аланін), -
СнНаСнН.СнНаМНе(МН)МН»5 (аргінін), -СНгС(О)МН»е (аспарагін), -СН2СО»2Н (аспарагінова кислота), -
СН.СнНгСНгМНОе(О)МН» (цитрулін), -СНоЗН (цистеїн), -«СНаСНоСО»гН (глутамінова кислота), -
СНСНС(ОМН» (глутамін), -Н (гліцин), -СНа(імідазоліл) (гістидин), -«СН(СНз)СНеСнНз (ізолейцин), -СНСН(СНз)СНз (лейцин), -«СНаСН.СНоСНеоМН» (лізин), -«СН».СНеЗСН»: (метіонін), -СНеа(СвіН5) (фенілаланін), -СНаСНоСН»г- (пролін), -СНгОН (серин), -СН(ОН)СН:з (треонін), -СНа(індол) (триптофан), -СНа(п-СеєНОН) (тирозин), -СНСН(СНз)СНз (валін). Дивіться сторінки 1076-1077,
"Огдапіс Спетівігу" Бій Ба. дойп МеМиту, ВгооКв/Соіє рир. (2000). Амінокислотні залишки пептидної частини включають всі стереоіїзомери, і можуть бути в ЮО або Ї конфігураціях. В одному з варіантів втілення, Рер включає від двох до дванадцяти амінокислотних залишків, незалежно вибраних із гліцину, аланіну, фенілаланіну, лізину, аргініну, валіну та цитруліну. В одному з таких варіантів втілення, амінокислотна частина забезпечує можливість розщеплення лінкера протеазою, полегшуючи тим самим вивільнення антибіотика з ААС при впливі внутрішньоклітинних протеаз, таких як лізосомальні ферменти (Оогопіпа еї а). (2003) Маї.
Віоїесппої. 21:778-784). Приклади амінокислотної частини включають дипептид, трипептид, тетрапептид, пентапептид і гексапептид, але не обмежуються ними. Приклади дипептидів включають валін-цитрулін (ус або ма!1!-сі), аланін-фенілаланін (аї або аіа-рпе); фенілаланін-лізин (ЖК або рпе-Іу5); або М-метил-валін-цитрулін (Ме-маІ-сі). Приклади трипептидів включають гліцин-валін-цитрулін (діу-маІ-сі), валін-цитрулін-фенілаланін (маІ-сі-рпе) і гліцин-гліцин-гліцин (аіу-аІу-чІу). Додаткові пептидні лінкнери включають СОдДЕгдОосОс (5БО ІЮ МО: 126); Ірт-сіб;
ОоРІтеї! РЕ (ЗЕО ІО МО: 129); і Ії АР (ЗЕО ІЮ МО: 128). Пептидні лінкери можуть бути отримані за рахунок утворення пептидного зв'язку між двома або декількома амінокислотами та/або пептидними фрагментами. Такі пептидні зв'язки можуть бути отримані, наприклад, відповідно до методу рідкофазного синтезу (Е. Зспгодег апа К. ГиБбКе (1965) "Те Рерііаев", моїште 1, рр 76- 136, Асадетіс Ргев55), добре відомого в області пептидної хімії. Амінокислотна частина може бути сконструйована й оптимізована для селективного ферментативного розщеплення конкретним ферментом, наприклад, асоційованою з пухлиною протеазою, катепсиномВ, Сі або протеазою плазміном.
В одному з варіантів втілення, спейсер М включає пара-амінобензил або пара- амінобензилоксикарбоніл. "Не саморозщеплюючий" спейсер являє собою спейсер, у якому частина спейсера або весь спейсер залишаються зв'язаними з фрагментом антибіотика при ферментативному (наприклад, протеолітичному) розщепленні ААС. Приклади не саморозщеплюючих спейсерів включають гліциновий спейсер і спейсер гліцин-гліцин, але не обмежуються ними. Також передбачені інші комбінації пептидних спейсерів, підданих послідовність-специфічному ферментативному розщепленню. Наприклад, ферментативне розщеплення ААС, що містять спейсер гліцин-гліцин, асоційованою з пухлинною клітиною
Зо протеазою буде призводити до вивільнення фрагмента гліцин-гліцин-антибіотик від ААС, що залишилось. В одному з таких варіантів втілення, фрагмент гліцин-гліцин-антибіотик далі піддають окремій стадії гідролізу в пухлинній клітині, таким чином, відщдеплюючи спейсер гліцин- гліцин від фрагмента антибіотика.
Завдяки спейсеру фрагмент антибіотика може вивільнятися без окремої стадії гідролізу.
Спейсер може бути "саморозщеплюючим" або "не саморозщеплюючим". У деяких варіантах втілення, спейсер лінкера включає п-амінобензильну одиницю (РАВ). В одному з таких варіантів втілення, п-амінобензиловий спирт приєднаний до амінокислоти за допомогою амідного зв'язку, а між п-амінобензильною групою та фрагментом антитіла перебуває така група як карбамат, метилкарбамат або карбонат (Натапп еї аї. (2005) Ехреп Оріп. ТНег. Раїепів (2005) 15:1087- 1103). В одному з варіантів втілення, спейсер являє собою п-амінобензилоксикарбоніл (РАВ).
В одному з варіантів втілення, антибіотик утворить четвертинний амін, наприклад, диметиламінопіперидильну групу, коли приєднується до РАВ спейсера пептидного лінкера.
Прикладами таких четвертинних амінів є інтермедіати лінкер-антибіотик (ГА) 54, 61, 66, 67, 73, 74, 76, 78, 79, 83, 84 з Таблиці 2. Четвертинна аміногрупа може модулювати розщеплення фрагмента антибіотика для оптимізації антибактеріальної дії ААС. В іншому варіанті втілення, антибіотик зв'язаний з спейсером РАВС пептидного лінкера, утворюючи карбаматну функціональну групу в ААС. Така карбаматна функціональна група може також оптимізувати антибактеріальну дію ААС. Прикладами інтермедіатів РАВС карбаматний лінкер-антибіотик (І А)
Є 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58,62,63, 64, 65, 72, 75, 80, 81, 87 з Таблиці 2. В інших інтермедіатах лінкер-антибіотик (ГА) використані амідна (59, 69, 70, 71, 77, 82, 85) або фенольна (60, 68, 86) групи.
Інші приклади спейсерів, що саморозщеплюються, включають, але не обмежуються ними, ароматичні сполуки, які з погляду електронної будови аналогічні групі РАВ, такі як похідні 2- аміноіїмідазол-5--метанолу (05 7375078; Нау еї а. (1999) Вісого. Мей. Сет. / еїї. 9:2237) і орто- або пара-амінобензилацетали. Можуть використовуватись спейсери, що перетерпіли циклізацію в ході гідролізу амідного зв'язку, такі як заміщені та незаміщені аміди 4-аміномасляної кислоти (Коагідчцез єї а! (1995) Спетівігу Віоіоду 2:223), відповідно заміщені біцикло(2.2.11 і біциклоїЇ2.2.21 кільцеві системи (Зіогт ей а! (1972) у Ате!г. Сет. бос. 945815) й аміди 2- амінофенілпропіонової кислоти (Атб5беггу, еї аі (1990) /. Огд. Спет. 55:5867). Відщеплення бо лікарських засобів, що містять амін, приєднаних до гліцину (Кіпд5ригу еї а! (1984) /. Мей. Спет.
27:1447), також є прикладом спейсерів, що саморозщеплюються, корисних для ААС.
ІНТЕРМЕДІАТИ ЛІНКЕР-АНТИБІОТИК, ЩО ВИКОРИСТОВУЮТЬСЯ ДЛЯ ААС
Інтермедіати лінкер-антибіотик (ГА), що відповідають формулі ІІ та наведені в Таблиці 2, були отримані за рахунок зв'язування фрагмента антибіотика типу рифаміцину з пептидним лінкерним реагентом, як описано як приклад на Фіг. 23-25 й у Прикладах 1-17. Лінкерні реагенти були отримані способами, описаними у М/О 2012/113847; 5 7659241; 05 7498298; 05 20090111756; ОБ 2009/0018086; 05 6214345; МЮиромснік еї а! (2002) Віосопішдає Спет. 13(4):855-869, включаючи 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)гексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 6 в) і) (Ф) Ге) А « баба М. КД й о
М М - М
Н ї МО» о о ви
МН но 6 6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-М-((5)-1-((5)-1-(4-(гідроксиметил). феніламіно)-1-оксо- 5-уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)угексанамід 8 в); / о но Дон о Н г Н
НМ о7емн, В
М-((5)-1-((5)-1-(4-(хлорметил)феніламіно)-1-оксо-5-уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1- оксобутан-2-іл)-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексанамід 9 і) / о но ува: (о; Н г Н
НМ вай 9
Таблиця 2
Інтермедіати лінкер-антибіотик (ГА)
Номер ГА Структура
ІГ А-51 о М
ЛІ, | іо) і
Ко (в) - (в) но фі о /Ф о они (в / (9) о ц о ду НМ аа МА ска о н ї н (0) йо
МН об
Номер ГА Структура
ГА-Б2 ж
Лі, ку о о 2 (о) в он | Ж се ОНА дон
Ге) Фі (в о НО, и пу
ІФ) / о ц о ев НМ Ш ки М. ж о но й й
НМ нм мн;
ГА-53 " ля о | о-о он 9 ї об х /во ОНА хон о М о о НО и о ц о Н о дуби ни (в) мито аа не й
Х ЩІ Но хн о о т
МН фено
І д-54 9) / р є) | КО Ге) он о і хх о7х /в он ОН
М о То НО и, (в) К НМ (в) / ввшешх аа іо сх о Но г Н
НИ он;
ГА-55 ти ю-- но о | 4 ее ОН
М он/сеВ нф
Ге! го) Ср
М о но / о н о во
Н Е Н
(в) (в) г
НМ вач
Номер ГА Структура
ГА-56 пу щ шо ю-- он (в) | в ох
С он /Є он ід! (в) М (в о НО и, / й (в) () уожа нн о
Н
СУ, є (в) нов г й нм ом,
ГА-57 - М р он о н он оо н у о зо НО и ни.
М ат і Фо
Н : Н во он,
І А-58 у о | Мо парео М ще фФ г / о о о ее он о улОн
Ге нд дн нм о
Ї А нм наго
І А-59 т Ко 5 о он Ге) КУ 7 /в оно лЛон
Ге) о о Ге) о М Ге) о НО, я и ВХ НД КИ нт. со 4 но на НИ но Н Ф о І
І А-60 Г/л (Ф) - ке ГФ) о); КК у в о 09 о / но
КОЮ Со он ОН
Ф) н є) - н о ОО, "у
Г нію
НМ наго с
Номер ГА Структура
Й о!
ГА-61 ти о-- о Ку он Ї д он н
М (Фе) о НО, п о о Є НМ о / Н о ей пААКХ ХА, си
Ге) н о Б- Н є надо
І А-62 (в) по | хо о | хо, ув он уон о
М 5 о НО, чу ми М.А ин Ф о но г й
НМ но
І А-63 (в) !
І, о | Ко) о У ОН
С ФВ | он хн
Ге (м З Ге) НО,, чу ч вве: ан о На ан ха
З о м мно
Н
І А-64 (в)
Г/л Ге) | Ко) он о ; «ОН ув он оон (м Ге) о НО,, щл
ІФ) НМ о о о. (в) і вв
САЛА, 7 и о Но 5
МН ом,
Номер ГА Структура
І А-65 ()
Ли, Ге! | К(е) Ж
КУ он 97 о
Се он АН о о О.М НМ о і вв
САЛА, т хо о Но й
МН оно й (в
І А-66 пу | Ку о он 97 узи об ув ОНД, мон
ІФ, о о МО и пу ще; во / (е) о н о ру «. ки а
Ге! Н 0 Е н є нас о
І А-67 й л --о М о он 9 щу ва м |і
Гм о о НО и
Ява нм в. о) У (в) М т
Ї ря й де
М Й-кн о (в)
І А-68
Пр а Ко) А о Ме оте) / (в) Н Ге! С (в) пр ч
Н й у они (в) її рови о
М НМ (в)
Нию
А Же
Нам бо бо
Номер ГА Структура
І А-69 с) | йо й - ' ГФ) г У- он ге) Ї У (Ф) /в он МОН
ХХ о (; ож (в) (; м (в) о НО и
ААси ККАЛ о нм. о й
М Н ця Но о хх, сі о во
І А-70 (в) 1 / І оо 4 о х - он о | ж о ув оН/ сон
Кк о о о жо о у; о о НО, и,
Али жа ве Ні. о
Х н Ці н о а н о а н о то і
І А-71 о | 4 //, - (Ф) т-о0 - У- он о ьо в ОН он
Ге) в) (в) но ,
Нн М (в) (в) 7, 1, и, о НМ о
Х н о Е н о Н о т с
МН об,
І А-72 (Ф) «М о- он 973 «СОН /Фо он КкООН
М (о) ОНО,, й о НИ о. / о о) но ува: :ч о но и
МН о Мн»
Номер ГА Структура
ГА-73 о
Пр, Ге! кед що «о-о ув (Фін! «ОН
С З оно, Я
Ї у НМ те о но дит Ш о Но г Н
НМ но
ГА-74 о. /, (е)
ГФ) хи () чу о-«о
ТО; (в оно, и,
І М
/ Й (в; но т Н о. о Но г й
НМ по
ГА-75 тр і йо Ко)
Ко
Го) 0-4 ев он от (о) б, 5 оно, и,
Микити мим АЛ о Но в о «он
Н 2
ГА-76 (9) ї поко | хо
КУ он о (в/н! ув Фін хН (М Ге) о НО, пу , Нм о Н о сут Ш
М М Се
Но й
МН
Озуро ОМ
Номер ГА Структура
ГА-77 (Ф; по ха о хо он ж ув он «оно
М (в, оно, ил, в) / о Н о НИ о,
Ми МИ хх ) Но й
МН он;
І А-78 (в) фо хо о он о Хо-4 ув ОН он / о но ув НМ о моли и
З но і с
Мн о? мно
І А-79 (в лі, о лок - Ге) КУ А о о Я
М (о) о НО и, (в) | НМ о / о цу о що аа Ми с о Н Ши Н нм но
ГА-80 КИ. "Ко М о
Ге) щу о ув З он Кулон
М о о НО ит о НМ о / (в) о ц о су Ф аа м о нав ві Н
МН оно
Номер ГА Структура
І А-81 9) //,, Ї І
Ге) Ко) о КО (Фін! ев он «он / (Фе) о ц о ру НМ (в) аа м хх Ї о н о в
МН но
І А-82 (в
І, о | Ко; х он о ОН
М (о) о НО, и, (в) / о но НМ й мли до с дв но ві Н
МН об
ГА-83 т п, (еще)
ГФ) хх (в) чу 67 м. рф З оно юн жа о но Ду З ен
М НМ
Ф-А- ОХ ж / Ш (Ф) що г н Ж
Ню наго
І А-84 (в й | еще) о К о КУ - м І о гм 8 о НО и / (о) но Зм НМ о аа М в но
Номер ГА Структура
І А-85 і) и, о | о ГФ)
Кур вв
М (в о НО, и, 9) НМ « ААЛ нХ Й " М ОМ ска 9 но ві Н
МН об,
І А-86 (в) вне (в) КУ / Ге) Н Ге) с ів) (в) ми м. ув он он н ї н (Ф) г ді о о НО,, "7
НМ ЗМ НМ Ш наго Ж
Ав; пра 7, о х
КО ї- оно | (в)
Ма ОН мн о но но н и М. ХА Ху Й о о Но ит хх (в) Ге) о о. АМН о ІФ. у Я Фф
Ге)
І А-88 о; щ- Ф) | б он 9 Ф «оон
Сен а О ге) НО, в ! НМ о 9
Н в й: о і
Рух о У щ фун» в)
Номер ГА Структура
І А-89 й І
І
7. Ге! Ко) он Ге) | КУ ото ув онКУюН о М (в оно, и, (в) НМ і вав. у аа МИ З
Ге! н Ге! 5
МН а
І А-90 о о ю о он Ге) КУ о сс (Фін! АН
Ф) (в (в М НМ. о
М СМ ве: (є) Но г Н
НМ наго
І А-91 о я о | ке) Ге! он о | і ок.
М (0) о) НО, щу о о о Ме НК. ло
Зав і М ікон За
Ф) Н Ге! г Н
НМ но
І А-92 й о. .МН т ва 2 че Ко) у
Мн он ГФ) й (в) 1Ф) о чн ї Н ув оно он ту Й ІФ Н М О НО, и, о ОА (в) о. НМ о о с
Номер ГА Структура
І А-93 НОМ. ро ні. й це о Нн |) тр, о о о М о М М я дл КИ ово -- НМ о
Ф
ГА-94 Ж що го) е) охунь он о | ще оо г / вот о Н о Н М о НО, тещу чув М но о ра о шк с (в)
І А-95 (в)
Лі, (є! | кед он о фе хе) / во он Дей
Ге) М (о) оно, им, о НМ о
Н о) Ге! - с аа
Х Н
(є)
І А-96 (в)
Ти, о | ху о он о Ф с -еев о М (в о НО, и у (е) / (в) но ру НМ. о мули М кі о Н ще Н
МН он,
Номер ГА Структура
І А-97 (в)
Ли, о | Ко) он о ХУ он ув он Кун о Гм о о Но и, / (Ф) о ц о др ни (є! н пОААДХ КА, Ф
Го н о в
І! он,
І А-98 й
І
". Ге! Ко) он ГФ) і КУ ото
С Фін! мн о гм о оно, ит,
І о о но дея ню о.
МН об мн,
І А-99 (в) лі, Ге! | ху о
М он 973 Хао- /в оно мн
М (в о НО, и у нм й / (в) о ц о щу с ми Му о Но й й
НМ наго
Номер ГА Структура
А-100 о й
Ка; (о;
НМ о о? МН НН ше льй
Б но (в) п, ни в. о (о) 5 із овоая ноті і (х Хв у
Ге) М НМ (є!
ДА Н ж
І А-101 (в) а
М
(в)
МН» о Мн нео с) че по | о
НМ оо с ао-4 м 1 ом х он ую
М (о) о НО и,
НМ о
Те) й
ГА-102 о СО
Ге) 9) й т н о т / дра М.А Кат но о
Й ЕЕ НН |! в) /4 о й Фо 7 лі чої р он он!" Д нам" бо | 9 но ото 4 " он
Номер ГА Структура
І А-103 о);
І, Ге) | ю-- ГФ)
КО он 97 Из «Мо ув он лОоНн
Н
(м (е) о НО, п о и но / і, (в) но ди" ан МИХ хх 19) Н Ши н
НИ наго
І А-104 о он - о о Чо но у ашко; о з аа Ми раоан - М У, и
Х ноаНО Н Ь Це в) Х м -
НМ вне о о о от Шен! ій -
І А-105 Ме й (в) НМ
Ли, Ге! | Кто у о о он Ге) КО (є! (в) М т М чі х наве У їх З ОН Ах) ІФ) Ге) б
М (в) о биту ем НМ Ш с
І А-106 9) і в) що о - о хх / о ц о а: Ге) У о-й.
Ге) - г фі о о НО,, "у ьо НИ й І ном" Хо Же
ГА-107 (в) 7, о | кед (в) (Фін! ге) КУ оса з опи Чон (9) / о но ди НМ. ро аа м. | хо о Но г Н
НИ но
Номер ГА Структура
І А-108 (в) п, о | х- он 075 Хуон /в он Сн у хи ДК оно аа ат М.Х В: НМ Ге) в) Н 2 Н
Ши с
НМ но
І А-109 (о) /;, о | кед о
КК он (в) ХХ 0-4
Ге) Се (Фін! юн с ААХЛОСІ г г й НМ о о
ГФ) Нн о - НН й за
НМ но
ГА-110 о лі, Ге! | ху (є ХМ оН (в) / Фі 8 о НО и чу (в / о Н о ува ни Ш аа МА с
З ну ві Н
МН он
ГА-111 о о он
АБУ, он о І ме он а
КД но о М о |в) х аа М д- й М ах о нн
Ге) Нн о в НН г :
НМ Ф, наго
Номер ГА Структура
І А-112 (в)
Ли, о | ло- о
КУ он 9 М 0-4 ув ОН он (в) пн о о о НО, / (в) но дик 8 / в) Н Ши Н Ф
НМ нм Зо
І А-113 с) /и,, о | кед (в) м ц о но ра ві (в) Ку 0-47 мити дош М он «ОН
Ге) н о - Н у /Ф в о НО, и,
НМ -к НМ є! ни Зо с
І А-114 9) | М
Г/л (оо) /Я о хх ща чу б (Фе) Мо ОН ОН
Мои м ва Н о НО ит,
Ге) Но дн НМ о г
НМ М на Зо
І А-115 й /, Ге) в) ж ве о /Фф 8 о НО и, 9) / о Н о ува НМ Ш д не ві Н
МН о
Номер ГА Структура
ГА-116 за
Ли, Ге! | ло Ге! он о7 хо, сс он «ОН (в) гм о о НО, и жа моли М. Д
М см ще о но г Н
НМ но
ГА-17 - о
Не)
І
НМ нам. у-К он и т (в) о
Ін, ГФ) де Ге)
ХХ оо | з о-4 о о Се он Кулон
Е ної т : М о о НО и р - гук, НИ Ш ху
Номер ГА Структура
ГА-118 о-х
М
; (в)
Нам нм
У очічу о но (в)
ЛІ, Ге! | Мк ГФ) х о о КУ о-М
М он о о сх а он
Е НО), и. но тр с: /Ф о) ОСИ
НИМ
Я (Ф)
СО с
ВАРІАНТИ ВТІЛЕННЯ КОН'ЮГАТІВ АНТИТІЛО-АНТИБІОТИК
Антитіло 54497 було кон'юговано з похідними рифаміцину, зазначеним у Таблиці 3, що називається рірвоОк, і іншими похідними рифаміцину, за допомогою пептидного лінкера, розщеплюваного протеазою. Лінкер сконструйований таким чином, щоб він міг бути розщеплений лізосомальними протеазами, у тому числі катепсинами В, О та іншими протеазами, що розпізнають пептидні фрагменти, включаючи дипептид валін-цитрулін (ма!-сії, ме) (ОиБромуспік єї аі (2002) Віосопі Сет. 13:855-869). Утворення інтермедіату лінкер- антибіотик, що складається з антибіотика та лінкера МОС-мс-РАВ або інших лінкерів, докладно описано у Прикладах 1-17. Лінкер сконструйований таким чином, що розщеплення амідного зв'язку у фрагменті РАВ призводить до відділення антитіла від антибіотика в активному стані.
ААС, що називається 54497-диметил-рірвокК, ідентичний 54497-рірВвВОК ААС за винятком наявності диметилованої аміногрупи в антибіотику та оксикарбонільної групи в лінкері.
На Фіг. 5 наведений можливий механізм активації лікарського засобу для кон'югатів антитіло-антибіотик (ААС). Активний антибіотик (АБ) вивільняється тільки після інтерналізації
ААС всередину клітин ссавців. бар фрагмент антитіла в ААС зв'язується з 5. ашеив, тоді як фрагмент Ес ААС підсилює поглинання бактерій за рахунок зв'язування через Ес-рецептор із фагоцитарними клітинами, у тому числі нейтрофілами та макрофагами. Після інтерналізації у фаголізосоми лінкер МаІ-Сй розщеплюється лізосомальними протеазами з вивільненням активного антибіотика всередині фаголізосоми.
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик (ААС) даного винаходу включає наступні сполуки:
АА1
Н в)
М арх д;-ВЕ-М а
НО АА2 де ААТ і АА2 незалежно вибрані з бічних ланцюгів амінокислот, включаючи Н, -СН»Зз, -
СНа(СенНв), -бСнесСнесСнгсНнеМН», -СнасненаМне(МН)МН», -СНонН(СНз)СНз і -
СнН.СнНгСНаМНое(О)МН»; і включає формули:
нЕ о
МК
Ар--ВЕ-М усу
Н г
НМ об нн, о в) Ан о) чучочуФч М арх с) Н с) Ад2 в) о н є) чл МЖК арх
Ар м Н чт о н г
НМ от е)
О ААТнНО дуе ) Н ОО дАНн е) о но Де ! о н г Н
Х в о сМмн. о ) о Ан о а о" арх ск х дЬ М он о) НО ддьн і; о А о Н о (Ф) арх
І
Ар М м М ' г І (о; н г Н
АХ о Мн.
Ге! в" п (е; ре М ах чар М 7 7
АБ -к ка Е. Е. Ге)
Н
(в) (в) АдоН
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик (ААС) даного винаходу включає наступні сполуки: (в);
Іі, о | ю-- в) о хх ок в! о пуд
АБ--І-- й552 о НО ит
НМ о ж І де: пунктирні лінії означають необов'язковий зв'язок;
Е являє собою Н, С1-Сі2 алкіл або С(О)СН:;
В' являє собою ОН;
В2 являє собою СНАМ-(гетероцикліл), де гетероцикліл необов'язково заміщений однією або декількома групами, незалежно вибраними з С(О)СНвз, С1-С12 алкілу, Сі-С12 гетероарилу, С2-Сго гетероциклілу, Св-Сго арилу та Сз-С12 карбоциклілу; або В' ії Кк? утворюють п'яти- або шестичленний конденсований гетероарил або гетероцикліл, і необов'язково утворюють спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, де спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце необов'язково заміщене Н, Е, СІ, Вг, І, С1-С12 алкілом або ОН;
Ї являє собою пептидний лінкер, приєднаний до ЕК? або конденсованому гетероарилу або гетероциклілу, утвореним Кі К2; і
АБ являє собою антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/УТА).
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик даного винаходу включає наступні сполуки:
(в)
І, Те) | - рі о КУ (Ф/54
АЬ-- --(83М 7 о НО и,
НИ о ші де ЕЗ незалежно вибраний з Н і С.і-С:2 алкілу; п являє собою 1 або 2; В" вибраний з Н, Е, СІ,
Ви, І, С1-Сі2 алкілу та ОН; і 7 вибраний з МН, М(С1-Си2 алкілу), О і 5.
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик даного винаходу включає наступний фрагмент антибіотика типу рифампіну: (в)
Пи, о | М- (в) хх ок 1 й У ОНИ, МОН
Інф) ',
Фін. /,, пу
М НИ (е) (ву Ж
Ж
/ хх
Ар- І , де Е? вибраний з Н і С:-Сі2 алкілу; і п являє собою 0 або 1.
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик даного винаходу включає наступний фрагмент антибіотика типу рифабутину: (9)
І, Ге! | М- (6) хх ок
Ге; о Мат ф он хон
М
М но 1, дь--- Н отит
НМ о
Ме ; де Е? вибраний з Н і С:-Сі2 алкілу; і п являє собою 0 або 1.
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик даного винаходу включає наступний фрагмент антибіотика типу рифалазилу:
(Ф)
І, Ге! | - (Фін! о | ги ок гм (в) о НО,,, пу (вах, м. Нм (в) дві сх де В» незалежно вибраний з Н і С1-Сі» алкілу; і п являє собою 0 або 1.
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик даного винаходу включає наступний фрагмент антибіотика типу рірВок: (9)
І Ге! | М- он 9 | ук мов г й о Мои
НМ
АБ-І-(КЗМ о 5 сх де ЕЗ незалежно вибраний з Н і С.-С:2 алкілу; і п являє собою 1 або 2.
Один із варіантів втілення сполук кон'югатів антитіло-антибіотик даного винаходу включає наступну сполуку: (в)
І, Ге! | - (Фін! о | КИ Ос
М о о НО, що
Кя Нм о
АВБ--1- ---1ЧтСН3ЬМ сх
Інші варіанти втілення сполук кон'югат антитіло-антибіотик даного винаходу включають наступні сполуки:
(в) п, о | - он 9 | КЗ ОАс о М о о НО и, о ХХ НМ. а»о о АМмМНОО су М
АБ кити з 0 О /АА2 (в)
ПМ, Ге! | -- он о | КУ ОАс (в)
НМ о цу о су (Фо)
АЬ права да зов, нд кН (в) Ве
Мн об кн; (в) ту ою он о | КЗ ОАс
М (в) |в) НО, пу о Ф нм о (в) АдІ1 (в) М сич М / во, у; Зк тор а ови
Ге! (9) Ад2 і (в)
Пр, Ге! | - он о | Кк ОАс
М Ге) о НО и, о Ф НМ о «НВ дух
Аь ра а М.А с ну кн (в) ме
МН об нн,
НАВАНТАЖЕННЯ АНТИБІОТИКА ДЛЯ ААС
Навантаження антибіотика виражається параметром р, і являє собою середню кількість фрагментів антибіотика (арх) на антитіло в молекулі, що відповідає формулі І. Навантаження антибіотика може варіювати в діапазоні від 1 до 20 фрагментів антибіотика (0) на антитіло.
ААС, що відповідає формулі І, включає набір або пул антитіл, кон'югованих з різною кількістю фрагментів антибіотиків, від 1 до 20. Середню кількість фрагментів антибіотика на антитіло у препаратах ААС, отриманих реакцією кон'югації можна охарактеризувати звичайними способами, такими як мас-спектрометрія, ІФА аналіз і ВЕРХ. Також можна визначити кількісний розподіл ААС за значеннями р. У деяких випадках поділ та очищення гомогенного ААС, у якого р являє собою певне значення, від ААС з іншими навантаженнями антибіотика, а також вивчення його властивостей можна досягти такими способами як звернена-фазова ВЕРХ або електрофорез.
Для деяких кон'югатів антитіло-антибіотик р може бути обмежено кількістю сайтів приєднання на антитілі. Наприклад, якщо приєднання здійснюється за тіолом цистеїну, як в ілюстративних варіантах втілення, наведених вище, антитіло може мати тільки одну або декілька тіольних груп цистеїну, або може мати тільки одну або декілька досить реакційноздатних тіольних груп, за якими може бути приєднаний лінкер. У деяких варіантах втілення, більш високе навантаження антибіотика, наприклад р»5, може викликати агрегацію, нерозчинність, токсичність або втрату здатності проникати в клітини для певних кон'югатів антитіло-антибіотик. У деяких варіантах втілення, навантаження антибіотика для ААС даного винаходу варіює від 1 до приблизно 8; від приблизно 2 до приблизно 6; від приблизно 2 до приблизно 4; або від приблизно З до приблизно 5; або становить приблизно 4; або приблизно 2.
У деяких варіантах втілення, у ході реакції кон'югації з антитілом кон'югують меншу кількість фрагментів антибіотика у порівнянні з теоретичним максимумом. Антитіло може містити, наприклад, залишки лізину, які не реагують з інтермедіатом антибіотик-лінкер або лінкерним реагентом, як обговорюється нижче. Як правило, антитіла не містять багато вільних і реакційноздатних тіольних груп цистеїну, які можуть бути зв'язані з фрагментом антибіотика; у дійсності, більшість тіольних залишків цистеїну в антитілах існують у вигляді дисульфідних містків. У деяких варіантах втілення, антитіло може бути відновлено відновлюючим агентом, таким як дитіотреїтол (0ТТ) або трикарбонілетилфосфін (ТСЕР), у частково або повністю відновлюючих умовах, з утворенням тіольних груп цистеїну. У деяких варіантах втілення, антитіло піддають впливу денатуруючих умов для виявлення реакційноздатних нуклеофільних груп, таких як лізин або цистеїн.
Навантаження (співвідношення антибіотик/(антитіло, "ААК") для ААС можна контролювати різними способами, наприклад: () обмежуючи молярний надлишок інтермедіату антибіотик- лінкер або лінкерного реагенту щодо антитіла, (її) обмежуючи тривалість або температуру реакції кон'югації, і (ії) використовуючи часткові або обмежені відновлюючі умови, для модифікації тіолу цистеїну.
Варто розуміти, що якщо з інтермедіатом антибіотик-лінкер або з лінкерним реагентом і далі з реагентом фрагментом антибіотика реагує більше однієї нуклеофільної групи, то отриманий продукт являє собою суміш сполук ААС, у яких до антитіла прикріплені один або більше фрагментів антибіотиків. Середню кількість антибіотиків на антитіло для суміші можна розрахувати за допомогою подвійного аналізу ЕГІ5А з антитілами, які специфічні для антитіла та специфічні для антибіотика. Індивідуальні молекули ААС можуть бути ідентифіковані в суміші за допомогою мас-спектрометрії та розділені за допомогою ВЕРХ, наприклад, за допомогою хроматографії гідрофобних взаємодій (дивіться, наприклад, Мебопаді еї а! (2006) Ргої. Епог.
Оевзідп є ЗеїІесійоп 19(7):299-307; Натрбіеї! еї а! (2004) Сіїіп. Сапсег Нев. 10:7063-7070; Натбіей,
К.., еї аїЇ. "ЕПесі ої агид Іоадіпд оп Ше рпаптасоїіоду, рпаптасокіпеїйс5, апа (юхісйу ої ап апії-
СОЗ30 апіроду-агид сопідаце," Абзігасі Мо. 624, Атегісап А55осіайноп тог Сапсег Кезеагсі, 2004
Аппиаї! Мееїіпд, Магсйп 27-31, 2004, Ргосеєдіпд5 ої Те ААСВЕ, Моїште 45, Магсп 2004; АїПеу, 5.С., еї аІ. "Сопігоїїпуд (Ве Іосайоп ої агид абасптепі іп апіроду-агид сопідасе5," АбБзігасі Мо. 627,
Атетісап Аззосіайоп їог Сапсег Везвєагсі, 2004 Аппиа! Меевїіпа, Магси 27-31, 2004, Ргосеєдіпд5 ог пе ААСК, МоїЇште 45, Магсй 2004). У деяких варіантах втілення, гомогенний ААС з однаковим значенням навантаження антибіотиком може бути виділений з суміші за допомогою електрофорезу або хроматографії. Антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном даного винаходу являють собою більш гомогенні препарати, оскільки реакційноздатні сайти на антитілі в основному обмежені тіолами цистеїнів, введених методами генної інженерії. В одному з варіантів втілення, середня кількість фрагментів антибіотика на антитіло перебуває в діапазоні від приблизно 1 до приблизно 20. У деяких варіантах втілення, діапазон вибирають і контролюють на рівні від приблизно 1 до 4.
СПОСОБИ ОДЕРЖАННЯ КОН'ЮГАТІВ АНТИТІЛО-АНТИБІОТИК
ААС, що відповідає формулі І, може бути отриманий декількома способами з використанням реакцій, умов і реагентів з області органічної хімії, відомих фахівцям у даній області техніки, бо включаючи: (1) реакцію нуклеофільної групи антитіла з бівалентним лінкерним реагентом з утворенням АБ-Ї за допомогою ковалентного зв'язку та наступну реакцію з фрагментом антибіотика (арх); і (2) реакцію нуклеофільної групи фрагмента антибіотика з бівалентним лінкерним реагентом з утворенням І-арх за допомогою ковалентного зв'язку та наступну реакцію з нуклеофільною групою антитіла. Приклади способів одержання ААС, що відповідають формулі І, описаним вище шляхом, описані в 5 7498298, що спеціально включений у даний документ за допомогою посилання.
Нуклеофільні групи антитіла включають, без обмеження: (ї) М-кінцеві аміногрупи, (ії) аміногрупи бічного ланцюга, наприклад, лізину, (ії) тіольні групи бічного ланцюга, наприклад, цистеїну, і (ім) гідроксильні групи або аміногрупи цукру, якщо антитіло глікозильоване.
Аміногрупи, тіольні та гідроксильні групи є нуклеофільними і можуть реагувати з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами лінкерних фрагментів і лінкерних реагентів, включаючи (ї) активовані складні ефіри, такі як МН5 ефіри, НОВІ ефіри, галогенформіати та галогенангідриди; (ії) алкіл і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; (ії) альдегіди, кетони, карбоксильні та малеїімідні групи. Деякі антитіла містять відновлювані міжланцюгові дисульфідні зв'язки, тобто цистеїнові містки. Антитіла можна зробити реакційноздатними для кон'югації з лінкерними реагентами шляхом обробки відновлюючим агентом, таким як ОТТ (дитіотреїтол) або трикарбонілетилфосфін (ТСЕР), так що антитіло частково або повністю відновлюється.
Кожен цистеїновий місток буде теоретично утворювати, таким чином, два реакційноздатних тіольних нуклеофіли. Додаткові нуклеофільні групи можуть бути введені в антитіла за допомогою модифікації залишків лізину, наприклад, за рахунок реакції залишків лізину з 2- імінотіоланом (реагент Траута), що призводить до перетворення аміну в тіол. Реакційноздатні тіольні групи можуть бути введені в антитіло за рахунок введення одного, двох, трьох, чотирьох або більшого числа залишків цистеїну (наприклад, одержуючи варіанти антитіл, що включають один або декілька неприродних амінокислотних залишків цистеїну).
Кон'югати антитіло-антибіотик даного винаходу також можуть бути отримані реакцією між електрофільною групою на антитілі, такою як альдегідна або кетонова карбонільна група, і нуклеофільною групою на лінкерному реагенті або антибіотику. Використовувані нуклеофільні групи на лінкерному реагенті включають гідразид, оксим, аміно, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат й арилгідразид, але не обмежуються ними. В одному з варіантів втілення,
Зо антитіло модифіковане для введення електрофільних фрагментів, які можуть реагувати з нуклеофільними замісниками на лінкерному реагенті або антибіотику. В іншому варіанті втілення, цукри глікозильованого антитіла можуть бути окислені, наприклад, окислюючими реагентами на основі періодату, з утворенням альдегідних або кетонових груп, які можуть реагувати з аміногрупою лінкерного реагенту або фрагменту антибіотика. Одержувані іміногрупи основи Шиффа можуть утворювати стабільний зв'язок або можуть бути відновлені, наприклад, борогідридними реагентами, з утворенням стабільних амінних зв'язків. В одному з варіантів втілення, реакція вуглеводної частини глікозильованого антитіла з галактозооксидазою, або з метаперіодатом натрію може призводити до утворення карбонільних (альдегідних і кетонових) груп в антитілі, які можуть реагувати з відповідними групами на антибіотику (Нептптапзоп, Віосопішдаєє Тесппідце5). В іншому варіанті втілення антитіла, що містять М-кінцеві залишки серину або треоніну, можуть реагувати з метаперіодатом натрію, що призводить до утворення альдегіду замість першої амінокислоти (сеодпедап 5 5ігоп, (1992)
Віосопіидае Сет. 3:138-146; 05 5362852). Такий альдегід може реагувати з фрагментом антибіотика або нуклеофілом лінкера.
Нуклеофільні групи на фрагменті антибіотика включають, без обмеження, аміно, тіольні, гідроксильні, гідразидні, оксимні, гідразинові, тіосемікарбазонові, гідразинкарбоксилатні й арилгідразидні групи, здатні реагувати з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами на лінкерних фрагментах і лінкерних реагентах, включаючи (ї) активовані складні ефіри, такі як МН5 ефіри, НОВІ ефіри, галогенформіати та галогенангідриди; (ії) алкіл і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; (ії) альдегіди, кетони, карбоксильні та малеїімідні групи.
Кон'югати антитіло-антибіотик (ААС), наведені в Таблиці 3, були отримані кон'югацією описаних анти-М/ТА антитіл з інтермедіатами лінкер-антибіотик, наведеними в Таблиці 2, згідно зі способами, описаними у Прикладі 24. Ефективність ААС тестували в аналізі з макрофагами /лп уйго (Приклад 18) і в моделі мишачих нирок /л умо (Приклад 19).
Таблиця З
Кон'югати антитіло-антибіотик (ААС) зем! вне 00000 ду Мк
Номер ААС Формула ААС ГА Мо ААВ" (Таблиця 2) рірвон деацетилВвВОК) (диметилрірвок) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 126) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 126) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 126) деацетилВвВОК) деацетилВтТ Кк)
НК ііі и НИЙ ПБІВ деацетилВвВОК) диметилрірВвОВ диметилрірвОВ ізопропілрірВОкК) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 129) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 130) (диметилрірвок)
зем! вне 00000 ду Мк
Номер ААС Формула ААС ГА Мо ААВ" (Таблиця 2) (піперазвок) (диметилрірвок) (піперазвок) (диметилрірвок) (диметилрірвок) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 131) «коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 131 деацетилВОкК диметиламінопіролВОК) диметилрірвок) (диметилрірвок) (диметилрірвок) о ААС-І58 |тіо-54497у8-іС-МС-ус-(деацетил, фенілрірВОЮ).Д | ї1А82 | - метиламіноетилВ'ТК) диметиламінорірвОйВ
З-піроловВок) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 128) (монометиламінорірвок) диметилрірвов (метил,етиламінорірвок) (амінометилрірвок) фенілацеталь-(диметиламінорірвок)
зем! вне 00000 ду Мк
Номер ААС Формула ААС ГА Мо ААВ" (Таблиця 2) (диметилрірвок) (піперазвок) (диметилрірвок) рірВог (азетидинілвок) деацетилВОм (етиламінопіперазиноВоОК) оксиВво В оксивоК) диметиламінорірвок) рірвтА ізопропілрірВОкК) (метилрифампіцин) (диметилрірвок) (диметилрірвок) ізопропілрірВОкК) метилрифампіцин (диметиламіноетилпіперазиноВОВ (диметилрірвок) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 128) аніліноацеталь-(диметиламінорірвок) (триметиламоній-рір, оксиВоОкК) фторрірВОкК) тіопропіл, деацетил ВОК) метиламінопропілвок)
лінкер-арх
Номер ААС Формула ААС ГА Мо ААВ" (Таблиця 2) деацетил ВОК) во тіопропіл ВОК) диметиламінорірвок) ізобутилрифабутин) фторрірвоїк оксивОК оксивОК деацетилВвВОК) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 128) (піперазвок) (монометиламінорірвок) (диметилрірвок) (піперазвок) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 128) " ААК - середнє відношення антибіотик/антитіло
Дикий тип (У/1"), мутантне антитіло з введеним методом генної інженерії цистеїном ("тіо"), легкий ланцюг ("С"), важкий ланцюг ("НС"), б-малеїімідокапроїл ("МС"), малеімідопропаноїл
СМР"), валін-цитрулін ("маІ-сй' або "мс", аланін-фенілаланін (аіа-рпе"), п-амінобензил
СРАВУ") і п-амінобензилоксикарбоніл (РАВС") ща - підлягає визначенню
НО-А1Т14С (Кара) - НС-АТ1180 (Е)О) Й
АНАЛІЗ /М МІТРО ДЕМОНСТРУЮЧИИЙ, ЩО ААС ЗНИЩУЄ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННОГО
МАБЗА
Експерименти /л уйго підтверджують, що ААС вивільняє активний антибіотик тільки після розщеплення лінкера між антитілом й антибіотиком відповідним ферментом, таким як катепсин
В. МАБА культивували протягом ночі в нормальному середовищі для росту бактерій з додаванням до 10 мкг/мл ААС. Інкубація МАБА з 54497-рірВОВ ААС або 54497-диметил- рірвоОй ААС не призводила до інгібування росту бактерій, якщо ААС не були попередньо оброблені катепсином В, щоб відбулося вивільнення активного антибіотика. В аналізі /л МйгО з використанням мишачих перитонеальних макрофагів підтверджено, що ААС вивільняє активний антибіотик і знищує МАБА всередині фагоцитуючих клітин (Приклад 18). ААС, що включає антитіло /Е1, яке зв'язується з сімейством білків, асоційованих із клітинною стінкою, кон'югували з похідною рифаміцину. 5. ашеивз (штам Мемлтап) обробляли різними дозами гЕ1-ААС або еквівалентними дозами антитіла, рифампіцину або сумішшю антитіла та вільного рифампіцину, щоб забезпечити зв'язування антитіла з бактерією (опсонізацію), і через 1 годину інкубації опсонізовані бактерії додавали до макрофагів (Фіг. 7А).
На Фіг. 7А наведені результати аналізу з макрофагами /л міго демонструючі, що ААС знищує внутрішньоклітинні МАБА. 65. ашеив (Меултап) інкубували з антитілом пЕ1, вільним рифампіцином, простою сумішшю антитіла /Е1 і вільного рифампіцину, комбінованих у тому ж співвідношенні антитіло/антибіотик, що й в ААС, або з гЕ1-ААС протягом 1 години та додавали до мишачих макрофагів. Макрофаги інкубували при 37 "С протягом 2 годин, щоб відбувся фагоцитоз. Після закінчення фагоцитозу суміш для інфікування заміщали на нормальне середовище для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для інгібування росту позаклітинних бактерій і через 2 дні після інфекції визначали загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, роблячи посіви.
Макрофаги інфікували протягом 2 годин і суміш для інфікування видаляли й заміщали на середовище, що містить гентаміцин, для знищення будь-яких позаклітинних бактерій, що залишились, які не були захоплені макрофагами. Через 2 дні макрофаги лізували та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, роблячи посіви на чашки з агаром. Аналіз показав, що обробка ААС призводить до зниження кількості внутрішньоклітинних бактерій більше ніж в 100 разів у порівнянні з обробкою простою сумішшю антитіла гг1 і вільного рифампіцину, комбінованих у тому ж співвідношенні антитіло/антибіотик, що й в ААС (Фіг. 7А).
МАЗА може проникати в ряд нефагоцитарних типів клітин, у тому числі в остеобласти та різні епітеліальні й ендотеліальні клітини (Саглопі апа КепПу, (2008) Тгепавз іп Містобіоїоду). МА5ЗА може інфікувати лінію клітин остеобластів (МО63), лінію клітин дихального епітелію (А549) та первинні культури людських ендотеліальних клітин пупкової вени (НОМЕС). На Фіг. 7В показане внутрішньоклітинне знищення МЕКЗА (штам ОБАЗО0) 50 мкг/мл 54497-рір ВОК ААС 102 у макрофагах, остеобластах (МО63), клітинах дихального епітелію (А549) та людських ендотеліальних клітинах пупкової вени (НОМЕС), тоді як некон'юговане антитіло 54497 не
Зо давало такий ефект. Ці типи клітин, імовірно, експресують катепсин В на більш низькому загальному рівні, ніж професійні фагоцитарні клітини, такі як макрофаги, проте, МЕ5А, оброблені 50 мкг/мл 54497-рірвокК ААС 102, ефективно знищувались після інтерналізації у всіх трьох зазначених лініях клітин. Пунктирна лінія означає межу виявлення для цього аналізу.
Для порівняння активності ААС, що мають варіації в лінкері, який з'єднує антитіло з антибіотиком, проводили аналіз /л уйго. 54497-диметил-рір ВОК ААС є більш активним, ніж 54497-рірвок ААС в аналізі внутрішньоклітинного знищення в макрофагах. 54497-рірВОВ ААС і 54497-диметил-рірВвОкК ААС титрували для визначення мінімальної ефективної дози в цьому аналізі внутрішньоклітинного знищення в макрофагах (Фіг. 7С). Обробка, щонайменше, 2 мкг/мл
ААС може бути необхідною для досягнення оптимального кліренсу внутрішньоклітинних бактерій.
На Фіг. 7С показане порівняння ААС, отриманих з використанням рірвок 51, ї ААС, отриманих з використанням диметил-рірвОВ (аіМе-рірвок) 54. МЕ5А опсонізували антитілом 54497 як таким або ААС, вибраним із 54497-рірвок 102 і 54497-диметил-рірвок 105, у різних концентраціях у діапазоні від 10 мкг/мл до 0,003 мкг/мл. Ці дані показали, що для обох ААС оптимальне знищення відбувалось при концентраціях ААС 2 мкг/мл і вище з дозозалежною втратою активності, що стала помітною при 0,4 мкг/мл. Загальний рівень знищення бактерій був значно вище у випадку 54497 диметил-рір ВОК ААС 105. Обробка більш високими дозами 54497-диметил-рір ВОК ААС 105 призводила до елімінації внутрішньоклітинних бактерій до рівня нижче межі виявлення, і при використанні субоптимальної дози 0,4 мкг/мл ААС спостерігалося зниження кількості бактерій більше ніж в 300 разів.
На Фіг. 70 показано, що ААС знищує внутрішньоклітинні бактерії без негативного впливу на макрофаги. Штам 5. ашеих ОБАЗОО попередньо інкубували з 50 мкг/мл анти-5. ашеиз антитіла 54497 (антитіло) або 50 мкг/мл тіо-54497-НО-А1180-МО-мс-РАВ-диметилрір ВОК 105 ААС протягом 1 години для забезпечення зв'язування антитіла з бактерією. Опсонізовані бактерії додавали до мишачих перитонеальних макрофагів із множинністю зараження 10-20 бактерій на макрофаг та інкубували при 37 "С протягом 2 годин, щоб відбувся фагоцитоз. Після завершення фагоцитозу вільні бактерії видаляли, і макрофаги культивували протягом 2 днів у нормальному середовищі для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для знищення неінтерналізованих бактерій. Наприкінці періоду культивування оцінювали виживання макрофагів, визначаючи бо вивільнення цитоплазматичної лактатдегідрогенази (ОН) у супернатант клітинної культури.
Загальну кількість ОН, вивільнену в кожній ямці, порівнювали з контрольними ямками, що містять макрофаги, які були лізовані додаванням у ямки детергенту. Вимірювали ступінь лізису макрофагальних клітин у ямках, оброблених детергентом, не інфікованих макрофагів, макрофагів, інфікованих бактеріями штаму ИБЗАЗО0, попередньо опсонізованими антитілом 54497, або макрофагів, інфікованих бактеріями штаму ОЗАЗОО, попередньо опсонізованими тіо- 54497-НО-А1180-МО-мо-РАВ-диметилрірвок 105 ААС.
На Фіг. 7Е показане виділення живих бактерій штаму ОЗАЗО0, що міститься всередині макрофагів, з клітинного лізату макрофагів, описаного вище. Для оцінки кількості бактеріальних клітин, що вижили, макрофаги лізували та робили посіви серійних розведень клітинного лізату.
На Фіг. 9 наведений аналіз інгібування росту, демонструючий, що ААС є нетоксичним для 5. ацгтеие, доки лінкер не буде розщеплений катепсином В. Схема аналізу вивільнення з катепсином (Приклад 20) наведена ліворуч. ААС обробляють катепсином В для вивільнення вільного антибіотика. Загальний рівень активності антибіотика у випадку інтактного ААС і ААС, обробленого катепсином В, визначали, роблячи серійні розведення отриманих реакційних сумішей і визначаючи мінімальну дозу ААС, при якій відбувалося інгібування росту 5. ашеив.
Верхній правий графік демонструє результати аналізу вивільнення з катепсином для тіо-54497-
НО-АТ180-МО-мс-РАВ-рірвОК 102, а нижній правий графік демонструє результати аналізу вивільнення з катепсином для тіо-54497-НОС-А1180-МО-мс-РАВ-диметилрірвок 105.
ЕФЕКТИВНІСТЬ КОН'ЮГАТІВ АНТИТІЛО-АНТИБІОТИК /М М//О
Для тестування ефективності ААС була створена модель перитоніту /п умо на мишах. У цій моделі мишей інфікували шляхом внутрішньочеревинної (І.Р.) ін'єкції МК5А і визначали бактеріальне навантаження через 2 дні після інфекції у перитонеальній рідині та в нирках.
Бактерії, зібрані з черевної порожнини, являли собою або вільно плаваючі позаклітинні бактерії, або бактерії, інтерналізовані всередину перитонеальних клітин, у першу чергу, всередину нейтрофілів і макрофагів, приваблюваних у місце інфекції. Незважаючи на те, що бактерії, ідентифіковані в цій моделі, були чутливими до обробки антибіотиком, було показано, що внутрішньоклітинні бактерії не відповідають на обробку рядом клінічно значимих антибіотиків, у тому числі рифампіном (зЗапарбего еї а! (2009) Апітісгобіа! Адепі5 СпетоїПег), і тому являються відмінною мішенню для тестування ефективності даного ААС.
Коо) На Фіг. 8А показана ефективність 54497-рірВОВ ААС 102 /п уміуо. Модель внутрішньочеревинної інфекції на мишах А/). Мишей інфікували 5х107 КУО МЕ5БА шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції й обробляли 50 мг/кг антитіла 54497 як такого або 50 мг/кг 54497- рірвоОКк ААС 102, що вводять шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції (протокол 11-2032А).
Мишей умертвляли на 2 день після інфекції та вимірювали загальне бактеріальне навантаження у перитонеальному супернатанті (позаклітинні бактерії), перитонеальних клітинах (внутрішньоклітинні бактерії) або в нирках.
Мишей АЛ) інфікували О5АЗОО і вводили їм 50 мг/кг антитіла 54497, або 54497-рірВОВ ААС 102 через тридцять хвилин після інфекції. Через 2 дні мишей умертвляли та бактеріальне навантаження вимірювали у перитонеальних змивах та в нирках. Щоб розрізнити позаклітинні та внутрішньоклітинні бактерії, перитонеальні змиви акуратно центрифугували для відділення супернатанта, що містить позаклітинні бактерії, від перитонеальних клітин. Перитонеальні клітини обробляли лізостафіном для знищення будь-яких забруднюючих позаклітинних бактерій і лізували для оцінки загальної кількості внутрішньоклітинних бактерій на момент дослідження.
Тоді як у мишей, оброблених антитілом як таким, кількість внутрішньоклітинних і позаклітинних бактерій становила 105 і 105 КУО у перитонеальному змиві та 107 ї 106 бактерій в нирках, у мишей, оброблених 54497-рірВвокК ААС, відбувалася елімінація інфекції до рівня нижче межі виявлення. Ці дані свідчать про те, що, незважаючи на те, що ААС сконструйовано таким чином, що вивільнення активного антибіотика відбувається всередині фаголізосоми, спостерігається відмінний кліренс як внутрішньоклітинних, так і позаклітинних пулів МЕК5А.
Оскільки позаклітинні бактерії не знищуються прямо ААС, той факт, що ці бактрії також елімінувалися в результаті обробки ААС, дозволяє припустити, що або значна частина позаклітинних бактерій поглинається клітинами в якийсь момент у ході інфекції, або ААС може підсилювати поглинання внутрішньоклітинних бактерій, тим самим збільшуючи відносну частку бактерій, що є внутрішньоклітинними, де вони ефективно знищуються ААС.
Ефективність ААС досліджували в моделі внутрішньовенної інфекції. У цій моделі відразу після зараження 5. ашгеих поглинають циркулюючі нейтрофіли, так що більша частина бакетрій, виявлених у крові, асоційована з клітинами-хазяїнами через хвилини після зараження (Кодегв, еїаі (1956) У. Ехр. Мей. 103:713-742). Мишей А/) інфікували 2х105 КУО МЕА5А шляхом внутрішньовенної ін'єкції та далі обробляли 50 мг/кг ААС шляхом внутрішньовенної ін'єкції бо через 30 хвилин після зараження. У цій моделі первинним місцем інфекції є нирки, і в мишей розвивався великий абсцес, що міг бути виявлений через два дні після інфекції та не зникав протягом до 30 днів у відсутності лікування. Обробка 50 мг/кг 54497-рірВОМВ ААС 102 призводила до елімінування інфекції у всіх мишей, що беруть участь у тестуванні (Фіг. 88).
На Фіг. 88 показана модель внутрішньовенної інфекції на мишах АЛ). Мишей інфікували 2х105 КУО шляхом внутрішньовенної ін'єкції й обробляли 50 мг/кг антитіла 54497, 50 мг/кг
З4497-рірВОК ААС 102 або простою сумішшю 50 мг/кг антитіла 54497 ї- 0,5 мг/кг вільного рифаміцину. Зазначені варіанти обробки доставляли шляхом внутрішньовенної ін'єкції через 30 хвилин після інфекції та нирки збирали через 4 дні після інфекції. Сірі пунктирні лінії означають межу виявлення для кожного органа. Обробка в контрольних групах 50 мг/кг антитіла 54497 як такого або простою сумішшю 50 мг/кг антитіла 54497 плюс 0,5 мг/кг рифаміцину (еквівалентна доза антибіотика, що перебуває в 50 мг/кг ААС) була неефективною.
Ефективність ААС, отриманих з використанням фрагментів антибіотиків рірвок і диметил- рірвокє, порівнювали в моделі внутрішньовенної інфекції на мишах АЛ) /л мімо. 54497-рірВвОВ
ААС 102 (Фіг. 9А) або 54497-диметил-рір ВОМ ААС 105 (Фіг. 98) вводили в різних дозах у діапазоні від 50 мг/кг до 2 мг/кг через 30 хвилин після інфекції та через 4 дні після інфекції для визначення загального бактеріального навантаження досліджували нирки. На Фіг. 9А показана ефективність рірВоОК ААС 102 у моделі внутрішньовенної інфекції шляхом титрування 54497- рірвов ААС 102. Самок мишей А/) у віці семи тижнів інфікували 2х105 КУО МЕ5А (штам
ОИОБАЗО0) шляхом внутрішньовенної ін'єкції у хвостову вену. На Фіг. 98 показана ефективність диметил-рірВОК ААС 105 у моделі внутрішньовенної інфекції шляхом титрування 54497- диметил-рірВвОК ААС 105. Антитіло 54497, ААС 102 або ААС 105 вводили в зазначених дозах через 30 хвилин після інфекції. Мишей умертвляли через 4 дні після інфекції та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, на мишу (2 об'єднані нирки), роблячи посіви.
Обидва ААС були ефективні в найбільш високій дозі 50 мг/кг, проте, 54497-рірВОВ ААС 102 був тільки частково ефективний у більш низьких дозах. 54497-диметил-рірвОВ ААС 105 призводив до повного кліренсу бактерій у дозах вище 10 мг/кг. Наступні експерименти показали, що дози вище 15 мг/кг були необхідні для стабільного кліренсу бактерій. На Фіг. 9А і 98 показано, що тіо-54497-НОС-А1180-МО-мсо-РАВ-диметилрірвок 105 ААС більш ефективний, ніж тіо-54497-НОС-АТ1180-МО-мо-РАВ-рірвОВ 102 ААС у моделі внутрішньовенної інфекції, що
Зо вказує на ефект структурного розходження карбамату (51) і диметилпіперидилу (54) між 102 і 105, відповідно.
Мишей обробляли ААС через 30 хвилин після інфекції. Щоб краще відтворити умови, що виникають у пацієнтів з МК5А, які потребують лікування, визначили, чи є ААС ефективним для елімінації розвиненої інфекції, і чи забезпечує зв'язування антибіотика з анти-5. ашеив антитілом певну перевагу у порівнянні з лікуванням антибіотиком як таким. З цією метою порівнювали ефективність ААС з еквівалентною дозою антибіотика диметил-рірвОвВ.
На Фіг. 9С показано, що мишей СВ17.5СІО інфікували 2х107 КУО МЕА5БА шляхом внутрішньовенної ін'єкції (протокол 12-2418). Через день після інфекції мишей обробляли 50 мг/кг антитіла 54497, 50 мг/кг 54497 диметил-рірВОК ААС 105 або 0,5 мг/кг антибіотика диметил-рірВвВОК 7, еквівалентною дозою антибіотика, що міститься в 50 мг/кг ААС. Мишей умертвляли через 4 дні після інфекції та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, на мишу (2 об'єднані нирки), роблячи посіви. Обробка 50 мг/кг 54497-диметил-рірВвОК ААС була явно ефективніше через 1 день після інфекції, тоді як обробка еквівалентною дозою диметил- рірвок як такого не призводила до елімінації інфекції.
ОБРОБКА ААС ЕФЕКТИВНІШЕ У ПРИСУТНОСТІ ЛЮДСЬКИХ АНТИТІЛ І КРАЩЕ, НІЖ
ОБРОБКА ІСНУЮЧИМ СТАНДАРТОМ ЛІКУВАННЯ (50С) ВАНКОМІЦИНОМ
Антитіло 54497 клонували з В клітин, отриманих з пацієнтів, інфікованих 5. айгеив. Це викликало побоювання, що нормальна людська сироватка крові або сироватка пацієнтів, інфікованих МЕК5А, може містити анти-МЕК5А антитіла, які будуть конкурувати за зв'язування з розробленим ААС. Для з'ясування цієї обставини людську сироватку крові, отриману з нормальних здорових донорів і ряду МЕ5А пацієнтів, тестували для оцінки загального рівня анти-МК5А антитіл, які розпізнають той же самий антиген, що й ААС. Був розроблений аналіз на основі ЕГІЗА з використанням препаратів клітинних стінок з МК5А. Для зменшення не специфічного зв'язування з препаратами клітинних стінок у цьому аналізі був використаний штам МЕЗА, дефіцитний за геном білка А. Білок А зв'язується з Ес областю дос антитіл.
Зв'язування різних зразків сироватки дикого типу (М/Т) з МАК5А, експресуючими антиген 54497 (Фіг. 10А, М/Т), досліджували у порівнянні зі зв'язуванням з мутантним штамом МЕЗА Таг/Таг
ОКО (подвійний нокаут), у якого відсутні модифікації цукру, які розпізнаються антитілом 54497.
На Фіг. 10А показаний рівень анти-5. агеих антитіл у сироватці крові людини. Пацієнти, бо інфіковані б. ашеив, або здорові донори містять у сироватці крові високі рівні антитіл,
специфічних проти УУТА, з тією ж самою специфічністю, що й анти-М/ТА 54497.
Стандартну криву будували, використовуючи моноклональне антитіло, що зв'язується з тим же самим антигеном, який розпізнається 54497. Порівнюючи рівень зв'язування в зразках сироватки крові з сигналом, отриманим від антитіла, що використовується для побудови стандартної кривої, оцінювали рівень анти-МК5А антитіл, що є присутнім у зразках сироватки крові, отриманих від здорових донорів або пацієнтів з МЕ5А, або у препаратах загального до, виділених з нормальної сироватки крові (Фіг. 10А). Нормальна людська сироватка крові містить 10-15 мг/мл всіх до (Мап? еї аї. (2005) Аппи Кему. Іттипої. 23:367). Аналіз реактивності анти-
МЕ5А у різних зразках сироватки крові виявив, що до 300 мкг/мл таких антитіл потенційно мають реактивність у відношенні того ж самого антигена, який розпізнається 54497, і тому, імовірно, конкурують з ААС за зв'язування.
Антитіло 54497 використовували для одержання ААС завдяки певним властивостям, включаючи дуже високе зв'язування з МЕК5БА (за оцінками, 50000 сайтів зв'язування на бактерію). Достатня кількість ААС зможе зв'язуватися з МЕ5А навіть у присутності конкуруючих антитіл, виявлених у людській сироватці. Щоб перевірити це безпосередньо, 54497 -диметил- рірвок ААС титрували у буфері з додаванням 10 мг/мл людських дес (Фіг. 108, «чІСІМ) і вимірювали рівень знищення внутрішньоклітинних бактерій в аналізі внутрішньоклітинного знищення в макрофагах.
На Фіг. 108 показані результати для моделі інфекції /л у//о, що демонструють, що ААС ефективно у присутності фізіологічних рівнів людських дО. Аналіз /л мйгто з макрофагами та штамом МАКЗА ОБАЗОО показав, що 54497-диметил-рірвВОК ААС 105 ефективний у присутності 10 мг/мл людських Ід. Штам МК5ЗА ОЗАЗОО опсонізували ААС як таким або ААС, розведеним в 10 мг/мл людських ІдС, протягом 1 години при 37 "С з перемішуванням. Опсонізовані бактерії додавали безпосередньо до мишачих перитонеальних макрофагів та інкубували протягом 2 годин, щоб пройшов фагоцитоз. Після інфекції макрофагальну культуру підтримували у повному середовищі з додаванням гентаміцину, і загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, оцінювали через 2 дні після інфекції. Ці дані свідчать про те, що, незважаючи на те, що людські дО дійсно інгібували дію ААС при більш низьких дозах, при використанні доз вище 10 мкг/мл, які являють собою концентрацію антитіла, що легко можна досягти /л у//о, досягалося
Зо відмінне знищення бактерій. (до нормальної сироватки крові можуть зменшити функціональний ефект 105 ААС. Оскільки для прояву ААС максимальної активності знищення всередині макрофагів може вимагатися як високе зв'язування антигена, так й ефективна взаємодія з ЕСК (для опосередкованого опсонізацією фагоцитозу), що існують у сироватці крові антитіла можуть конкурувати за зв'язування з МУТА, і відповідні імунні комплекси, що утворилися, можуть конкурувати за зв'язування з ЕсК на макрофагах.
Для того, щоб підтвердити, що ААС буде ефективний у присутності конкуруючих людських антитіл /л м/мо, модель інфекції /л мімо була модифікована для створення мишей, які експресують нормальні рівні людських ІдсС у сироватці крові У мишей СВ17:5СІО, в яких відсутні як Т клітини, так і В клітини, і тому відсутні антитіла в сироватці крові (Возпа 5 Сагтої), (1991) Апп Кем Ітітипої. 9:323), створювали рівень людських ДО, що становить 10 мг/мл, шляхом щоденного дозування високими концентраціями людських дос (СІМ). Попередні дослідження підтвердили, що ці миші, названі ЗСІО:пиїдО, дійсно мають постійний рівень людських ДС у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл, і що ці миші були так само чутливі до інфекції МЕК5А, як і неопрацьований контроль. Мишей ЗСІО:пиЇдо інфікували
МЕ5А й обробляли або антитілом 54497, або 54497-диметил-рірВОК ААС (50 мг/кг) через 1 день після інфекції. Через чотири дні після інфекції оцінювали бактеріальне навантаження в нирках (Фіг 10С).
На Фіг. 10С наведені комбіновані дані з З незалежних експериментів з використанням 2 окремих препаратів тіо-54497-НОС-А1180-МО-мсо-РАВ-диметил-рір ВОК ААС 105 або 112. У мишей СВ17.5СІЮО створювали рівень людських ІдсС, використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня людських дос у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл. Мишей обробляли антитілом 54497 (50 мг/кг) або 54497-диметил- рірвок ААС (50 мг/кг). У мишей, оброблених ААС, спостерігалося зниження бактеріального навантаження більше ніж на 4 порядки (І-критерій Стьюдента р-0,0005). У мишей, оброблених 54497-диметил-рірвОК ААС, бактеріальне навантаження було в середньому в 10000 разів нижче у порівнянні з мишами, обробленими антитілом 54497 як контроль, що свідчить про те, що ААС явно ефективніше навіть у присутності високих доз конкуруючих людських анти-МАБА антитіл.
Ефективність ААС порівнювали з ефективністю обробки ванкоміцином, сучасним бо стандартом лікування для інфекцій МАК5А. На Фіг. 11А показана модель інфекції /л м/о, що демонструє, що в мишей з нормальним рівнем людських (4 ААС більш ефективний, ніж сучасний стандарт лікування (50) антибіотик ванкоміцин. У мишей СВ17.5СІО створювали рівень людських ІдсС, використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня людських дос у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл. Мишей обробляли антитілом 54497 (50 мг/кг), ванкоміцином (100 мг/кг), 54497-диметил-рірВОВ ААС (50 мг/кг) 112 або ААС, що містить антитіло з тим же самим ізотипом, що не розпізнає МЕА5А, тіо-пи-анти дО 585-НОС-АТ1180-МО-мс-РАВ-диметилрір ВОК ААС 110 (50 мг/кг) Мишам, що одержують ААС, давали однократну дозу ААС в 1 день після інфекції шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Мишам, що одержують ванкоміцин, робили внутрішньочеревинні ін'єкції антибіотика два рази на день. Всіх мишей умертвляли на 4 день після інфекції та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, на мишу (2 об'єднані нирки), роблячи посіви.
Обробка ванкоміцином ефективна для лікування інфекції МЕК5А у мишачій моделі внутрішньовенної інфекції, якщо лікування починали через 30 хвилин після інфекції. Дозування два рази на день 100 мг/кг ванкоміцину не призводило до елімінації інфекції, і призводило тільки до зниження бактеріального навантаження приблизно в 50 разів, коли лікування починали пізніше, ніж через 1 день після інфекції (Фіг. 11А). Дивовижно, що обробка однократною дозою 54497-диметил-рірвВОК ААС через 1 день після інфекції призводила до елімінації інфекції у більшості мишей. Дивно, що обробка контрольним ААС, що містить людське антитіло Ідс, що не розпізнає 5. ашгеив (ДО-ААС), мала таку саму ефективність у цій моделі. Антитіло ФО не розпізнає 5. ашеив своїм антиген-сполучним сайтом, проте, антитіло може зв'язуватись з білком А, виявленим на 5. ашеийв.
На Фіг. 11С показана модель інфекції /л7 у/о, яка демонструє, що ААС тіо-56078-НО А1140-
І СМ/Т-МО-мс-РАВ-диметилрірвок 129 більш ефективний, ніж голе анти-УУТА антитіло 54497 при введенні відповідно до того самого режиму, що й на Фіг. 11А, у мишей, в яких створений нормальний рівень людських ДО. У мишей СВ17.5СІ0О створювали рівень людських Ідс, використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня людських
Ід у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл. Мишей обробляли антитілом 54497 (50 мг/кг) або тіо-56078-НО А11406-ІЇ СМ/Т-МО-мо-РАВ-диметилрірвок 129 ААС (50 мг/кг).
Аналіз ЕАС5 показав, що фарбування бактерій, виділених при інфекції /л У/Уо, високими
Зо концентраціями антитіл ДО дає низький рівень зв'язування з 5. ашеив щодо зв'язування анти-
МЕ5А антитіл з МЕК5А, виділених з інфікованих нирок (Фіг. 118). Мишей інфікували МА5А шляхом внутрішньовенної ін'єкції, і інфіковані нирки видаляли через З дні після інфекції та гомогенізували. Анти-МК5А або контрольні антитіла були позначені АІеха-488 і проаналізовані в діапазоні концентрацій між 0,08 мкг/мл і 50 мкг/мл. Антитіло 54497 розпізнає модифікацію М- ацетилглюкозаміном, зв'язаним з тейхоєвою кислотою клітинної стінки (М/ТА) через бета- аномерний зв'язок на клітинній стінці 5. ашеив. Антитіло 57578 зв'язується з аналогічною модифікацією М-ацетилглюкозаміном, приєднаним до М/ТА через альфа-аномерний зв'язок.
Антитіло ГЕ1 є позитивним контролем для анти-МЕ5А антитіла, що розпізнає модифікації цукру, виявлені на сімействі, що містять БОР. повтори білків, заякорених у клітинній стінці. Антитіло ЗО є людським Ідс:і і негативним контролем, що не розпізнає 5. ашеив. Незважаючи на те, що загальний рівень зв'язування з антитілом 90 значно нижче, ніж спостережуваний для антитіла 54497 (за оцінкою, щонайменше, в 30 разів менше, за даними аналізу БАС5, Фіг. 118), обмежена ефективність, спостережувана для 90-ААС, свідчить про те, що навіть низький рівень зв'язування ААС на МЕККА /7 м/о достатній для досягнення ефективності, еквівалентної зниженню КУО у випадку ванкоміцину.
Наведені вище дані явно демонструють, що ААС може вбивати внутрішньоклітинні МЕ5А і що 54497-рірвок і 54497 диметил-рірВвОК ААС ефективні для обмеження інфекції МЕК5А як /п уйго, так й /п умо. ААС даного винаходу діє, знищуючи бактерії всередині клітин ссавців, і, тим самим, є унікальним терапевтичним агентом, більш ефективним для знищення популяцій бактерій, стійких до лікування ванкоміцином.
На Фіг. 20 показано, що попередня обробка 50 мг/кг вільного антитіла не ефективна в моделі внутрішньовенної інфекції. Мишам Ваїр/с давали однократну дозу носія як контроль (РВ5) або 50 мг/кг антитіла шляхом внутрішньовенної ін'єкції за 30 хвилин до інфекції 2х107 КУО О5АЗОО.
Групи порівняння включали обробку контрольним антитілом з тим же самим ізотипом, що не зв'язується з 5. ашеиз (дО), антитілом, спрямованим проти бета модифікації тейхоєвої кислоти клітинної стінки (4497), або антитілом, спрямованим проти альфа модифікації тейхоєвої кислоти клітинної стінки (7578). Контрольним мишам два рази на день шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції вводили 110 мг/кг ванкоміцину (Мапсо). Всіх мишей умертвляли на 4 день після інфекції та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, у нирках (2 об'єднані нирки), роблячи бо посіви. Незважаючи на те, що попередня обробка ванкоміцином призводила до елімінації інфекції у всіх мишей у цьому дослідженні, попередня обробка антитілом проти клітинної стінки 5. ашеиз не впливала на бактеріальне навантаження.
На Фіг. 21 і 22 показано, що ААС, спрямовані проти бета модифікації тейхоєвої кислоти клітинної стінки, або проти альфа модифікації тейхоєвої кислоти клітинної стінки, ефективні в моделі внутрішньовенної інфекції на мишах, у яких створений нормальний рівень людських до.
У мишей СВ17.5СІЮО створювали рівень людських ІдС, використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня людських дос у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл, і інфікували їх 2х107 КУО О5БАЗО0 шляхом внутрішньовенної ін'єкції.
Через 1 день після інфекції здійснювали обробку тільки буфером як контроль (РВ5), 60 мг/кг бета-М/ТА ААС (136 ААС) або 60 мг/кг альфа-УУТА ААС (155 ААС). Мишей умертвляли на 4 день після інфекції та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, в нирках (2 об'єднані нирки, Фіг. 21) і серце (Фіг. 22), роблячи посіви. Обробка бета-М/ТА ААС призводила до зниження бактеріального навантаження в 100000 разів у нирках у порівнянні з обробкою мишей носієм як контроль. Обробка альфа-У/ТА ААС призводила до середнього зниження бактеріального навантаження в 9000 разів у нирках.
На сьогодні залишається неясним, чому існуючі доступні антибіотики часто виявляються неефективними для знищення внутрішньоклітинних пулів бактерій. Антибіотики можуть бути неефективними, оскільки їхня концентрація всередині клітин не досягає достатнього рівня, або тому що антибіотики не проникають у фаголізосомальний компартмент, де зберігаються пули внутрішньоклітинних бактерій, або тому що антибіотики можуть видалятися з клітин ссавців за рахунок активності насосів, що викидають. Антибіотики можуть руйнуватись в жорстких умовах, таких як умови всередині фаголізосоми, що включають низький рН, наявність агентів, що відновлюють, і агентів, що окисляють, які вивільняються спеціально для знищення фагоцитованої бактерії. Альтернативно, антибіотики можуть бути неефективними, тому що бактерії підсилюють свої захисні механізми або не діляться всередині фаголізосоми та тому тимчасово стають нечутливими до антибіотиків. Відносна важливість цих механізмів стійкості до антибіотиків буде різною для різних патогенів і для кожного антибіотика. Компоненти антибіотики розробленого ААС, рірвок і диметил-рірВОК, дійсно є могутнішими, ніж рифампіцин, відносно знищення внутрішньоклітинних МЕК5БА при тестуванні вільних
Зо антибіотиків. Зв'язування цих антибіотиків з антитілом забезпечує реальне дозозалежне збільшення ефективності, спостережуване /п умо (Фі. 9С). У цьому випадку поліпшена ефективність ААС у порівнянні з антибіотиком як таким, імовірно, пояснюється сполученням його здатності опсонізувати бактерії з поліпшеною фармакокінетикою ААС. Більшість вільних антибіотиків швидко виводяться /л7 мімо і вимагають повторного дозування з більш високою концентрацією антибіотика для підтримки достатньої концентрації антибіотика в сироватці крові.
На противагу цьому ААС має тривалий період напівжиття в сироватці крові через наявність у молекулі частини антитіла. Оскільки ААС вивільняє антибіотик тільки після зв'язування з 5. ашцгецв і спільного транспортування бактерією в обмежений простір фаголізосоми, невеликі дози антибіотика концентруються в ніші, де більшість антибіотиків не діють. Таким чином, на додаток до того, що ААС діють у захищених резервуарах внутрішньоклітинних бактерій, ААС можуть полегшувати використання могутніших антибіотиків, які можуть виявитись занадто токсичними для використання як одиночний агент, обмежуючи вивільнення антибіотика місцем, де це необхідно.
На Фіїг. 35 і 36 наведені результати аналізу тіо-56078 ААС з макрофагами /п міто. 5. ашеив (О5АЗО0О МА5384) інкубували з некон'югованим антитілом 56078 у концентрації 50 мкг/мл і з
ААС у концентрації 50 мкг/мл, 5 мкг/мл, 0,5 мкг/мл або 0,05 мкг/мл протягом 1 години, щоб відбулося зв'язування антитіла з бактеріями. Отримані опсонізовані бактерії додавали до мишачих макрофагів та інкубували при 37 "С, щоб пройшов фагоцитоз. Через 2 години суміш для інфікування видаляли та заміщали на нормальне середовище для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для знищення будь-яких позаклітинних бактерій, що залишились. Загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, визначали через 2 дні після посіву серійних розведень лізатів макрофагів на чашки з триптичним соєвим агаром. Як показано на Фіг. 35, тіо-
З6078.м4.НО-МТ, І б-Субз-МО-мо-РАВ-(диметилрір ВОК) ААС був ефективний для знищення внутрішньоклітинних бактерій у дозах 0,5 мкг/мл і вище при навантаженні антибіотика диметилрірвок (І А-54), що становить 2,0 (ААС-173) або 3,9 (ААС-171) на тіо-56078 антитіло.
Як показано на Фіг. 36, тіо-56078.м4.НО-М/Т, І С-Суз-МО-мо-РАВ-(піперазВвок) був ефективний для знищення внутрішньоклітинних бактерій у дозах 0,5 мкг/мл і вище при навантаженні антибіотика піперазвок (І А-65), що становить 1,8 (ААС-174) або 3,9 (ААС-172) на тіо-56078 антитіло. бо На Фіг. 37 і 38 наведені результати аналізу ефективності тіо-56078 ААС у мишачій моделі внутрішньовенної інфекції /л умо. У мишей СВ17.5СІ0О створювали рівень людських до, використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня, що становить, щонайменше, 10 мг/мл людських дО у сироватці крові. Мишей інфікували ОБАЗОО й обробляли носієм як контроль (РВ5), тіо-56078.м4.НОС-МУТ, І б-Суб-МО-мо-РАВ-(диметилрірвВоОм)
ААС з навантаженням антибіотика диметилрірвок (І А-54), що становить 2,0 (ААС-173) або 3,9 (ААС-171) на тіо-56078 антитіло (Фіг. 37), і тіо-56078.м4.НО-МТ, І1ІСб-Суб-МО-мо-РАВ- (піперазВокК) з навантаженням антибіотика піперазвок (І А-65), що становить 1,8 (ААС-174) або 3,9 (ААС-172) на тіо-56078 антитіло (Фіг. 38). Мишам давали однократну дозу ААС в 1 день після інфекції шляхом внутрішньовенної ін'єкції й умертвляли їх на 4 день після інфекції.
Загальну кількість бактерій, що вижили, в 2 нирках визначали, роблячи посіви. Обробка ААС з більш низьким навантаженням антибіотика призводила до зниження кількості бактерій приблизно в 1000 разів, і обробка ААС з більш високим навантаженням антибіотика призводила до зниження кількості бактерій приблизно в 10000 разів.
РОЗЩЕПЛЮВАНІ СТАФОПАЇНОМ В ЛІНКЕРИ ДЛЯ КОН'ЮГАТІВ АНТИТІЛО-АНТИБІОТИК
Лінкер, розщеплюваний протеазою, як описано в даному документі, розщеплюється стафопаїном В, ендопептидазою, секретованою 5. ашеив. Щоб сконструювати лінкер, що буде специфічно розщеплюватись бактерією Єарнуососсив ашцтеив, о протеазну активність супернатанту клітинної культури 5. ашгеиз характеризували з використанням ЕКЕТ пептидної біліотеки. За результатами цього скринінгу була ідентифікована унікальна субстратна специфічність. З використанням цього субстрату з супернатанту культури клітин був очищений фермент, що має цю активність, ідентифікований як стафопаїн В. Грунтуючись на цій ідентифікації, був створений лінкер, оптимізований для розщеплення стафопаїном В, і зв'язаний з піперазино-рифаміцином: (в)
І, о | кед о
ХХ он о | о-К /Ф он «он
Мк о о Но и чт нм. НМ о
Ф
Піперазино-рифаміцин є потужним рифалазил-подібним антибіотиком. Продемонстрована ефективність отриманого ААС у моделях інфекції МАК5А /л м/тго й /пл мімо, що припускає новий механізм спрямованої дії на інфекції МЕ5А. Стафопаїн В являє собою секретовану цистеїнову протеазу з ендопептидаз сімейства папаїну (реєстраційний номер СА5 347841-89-8, бідта-
АІдгісн 253951, Рійрек еї аі (2005) У. Віої. Спет. 280 (15): 14669-74), що має унікальну
Зо субстратну специфічність у відношенні об'ємних ароматичних бічних ланцюгів у положенні Р2.
Експресія стафопаїну В контролюється геном адг (або допоміжним геном-регулятором) системи дистаційних мікроб-мікробних взаємодій (системи диогит 5епвіпод) (Чаплоп, Ї. апа 5. Агмід5оп (1990) Тне ЕМВО іоиштпаї 9(5): 1391-1399) як частина стафілококового протеолітичного каскаду (ЗСР). Адг модулює експресію секретованих протеаз та інших факторів вірулентності 5. ашгеийв, у тому числі ауреолізину, М8 і стафопаїну А (Зпам/, Г., Е. СоіопкКа, еї аї. (2004) Місгоріоіоду 15О(РІ 1): 217-228). Стафопаїн В є потужним чинником вірулентності через його здатність руйнувати сполучні тканини хазяїна, а також збільшувати активність деяких білків імунної системи (Ітатига, Т., 5. Тапазе, еї аї. (2005) доштаї ої ехрептепіаї! тедісіпе 201(10): 1669-1676;
Роїетра, 9., А. Юибіп, еї аї. (1988) ЧЧошгпаї ої рБіоіодіса! спетівігу 263(6): 2664-2667; Опбауазвні, Т.,
А. Ігів, еї а). (2011) Місторіоіоду 157(РІ 3): 786-792; Зтадиг, у., К. СиліК, еї аї. (2009); Віоіодісаї! спетівзігу 390(4): 361-371; Зтадитг, у., К. (зи2іК, єї аї. (2009); доштпаї ої іппайе іттипйу 1(2): 98- 108; Киїїд, Р., В. А. 7абеї, еї аї. (2007); доштаї ої іттипоіоду 178(6): 3713-3720). Роль, яку стафопаїн В грає як важливий фактор вірулентності, робить його привабливою мішенню для опосередкованого протеазою вивільнення антибіотика.
Ідентифікація субстратів розщеплюваних протеазами біарнпуІососсиз ашеийв.
Для ідентифікації субстратів, легко розщеплюваних ендопептидазами 5. ашеив, супернатант від нічної культури штаму 5. ашеив Мооа46 інкубували з комерційно доступною
ЕВЕТ пептидною бібліотекою. Штам УУоод46 містить конститутивно активний локус адг, таким чином, штам М/00446 має підвищену експресію протеази у порівнянні з диким типом. ЕНЕТ пептидна бібліотека, Варій Епадореріїдавзе Р"гоїйіпу Гіргагу або Рерзеї5"м КЕРІЇ (Мітоїіорев,
Місіога, А!йвігайа) складається з 512 лунок з 8 флуорогенними пептидами з внутрішньомолекулярним гасінням флуоресценції на ямку в 96-ямкових планшетах. Пептиди флуоресціюють при розщепленні, що дозволяє контролювати протеолітичну активність у реальному часі. Кожен пептид має варіабельну корову частину, що включає три амінокислотних залишки, фланковану залишками гліцину з обох боків, і додаткові два залишки лізину на С-кінці для забезпечення розчинності. Супернатант від культури Ууоод46 додавали до бібліотеки, і планшети інкубували протягом ночі при 37 "С. Ямки, для яких спостерігалось збільшення флуоресценції в 15 разів і більше (всього 12 з 512 ямок), аналізували за допомогою І С-М5 (Адіїепії О-ТОЕ) для визначення продуктів розщеплення. Сайти розщеплення були ранжовані на основі частоти (Таблиця 4). Серед найбільш часто розщеплюваних сайтів, був виявлений патерн субстратної специфічності, зокрема, перевага об'ємних гідрофобних бічних ланцюгів
Рпе і Туг у положенні Ра.
Таблиця 4
Переважні амінокислоти у послідовностях КЕРІ ЇЇ, розщеплюваних протеазами, синтезованими
Мооа46. Зазначена частота в кожному положенні (90) 7 | ля | 806 1 00 1 286 | 357 | 000 1-24 | 71 1 ю юфщ00 1 юж00 | 71 | 00
АМ | 00 | 43 | 00 | 500 | 286 / 00 мо Її 71 1 71 1 00 1 00 1 71 | 00 8 | 00 1 1453 | 00 | 143 | 00 | 00
РМ | 00 | 00 | лобо | 00 / 214 | 00 кА | 00 | 71 | 00 | 71 | 00 | 00
Частота амінокислотних залишків для кожного положення у ЕКЕТ пептидах у ямках, для яких спостерігалося найбільше збільшення флуоресценції. Пептиди РЕРІ і містять послідовність
МСА-СТу-Сіу-Сіу-Хаа-Уаа-7аа-Сіу-Сіу-ЮОРА-Гуз-Гуз (5БО ІЮ МО: 132), де Хаа, Маа і 7аа варіюють. Залишки гліцину, представлені в таблиці, являють собою залишки су, які фланкують варіабельну корову частину. Хоча залишки Су найбільш часто зустрічаються в деяких положеннях, вони мало говорять про субстратну специфічність. При розробці лінкерів переваги віддавалися амінокислотам з варіабельною коровою частиною. Амінокислоти, які не були найбільше часто зустрічаючимися, були виключені з таблиці.
Розробка та кон'югування ЕКЕТ субстрату, розщеплюваного протеазою МЕЗА /л Уго.
Пептид конструювали та синтезували, використовуючи залишки, що найбільше часто зустрічаються, в розщеплюваних пептидахза даними скринінгу КЕР'Ї з врахуванням інформації про специфічність для Р11, Р2 і Р3. Пептид мав послідовність СОАДЕдОСс( (5ЕО ІЮ МО: 126) і повинен був розщеплюватись між САРА (5ЕО ІЮ МО: 131) і 500. Пептид синтезували, використовуючи метод твердофазного синтезу з включенням флуоресцентних барвників, тетраметилродаміну (ТАМКА) і флуоресцеїну в якості ЕКЕТ пари (Фіг. 26), на М-кінець пептиду
Зо для кон'югації з залишками цистеїну антитіла додавали малеімідо-пропіонову кислоту.
Отриманий таІ-РВЕТ-пептид, малеїмідо-пропіонова кислота (МР)-ГуУб(«ТАМВА)-Спу-СТу-АІа-РНе-
АІа-Спіу-Стіу-Спу-І ух(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮО МО: 125) кон'югували з ТпіомМар антитілом з введеним методом генної інженерії цистеїном, тіо-54497. таІ-ЕВЕТ- пептид також кон'югували з анти-Нег2 ТпіоМар трастузумабом з введеним методом генної інженерії цистеїном як незв'язуючий контроль.
Тіо-54497-МР-К(Татга)їссАгАсоОоК(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ
МО: 125) РЕКЕТ кон'югат і несполучний контрольний ЕКЕТ кон'югат, Тіо-трастузумаб-МрР-
К(Татга)сзАБАСОсСсК(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в 5ЕБО ІЮО МО: 125), інкубували з культурами Ууосоа46 (фіг. 28) і ОБАЗОО дикого типу (Фіг. 29) у логарифмічній фазі росту при щільності клітин 108 клітин/мл і 107 клітин/мл у триптичному соєвому бульйоні (Т5В).
Кінцева концентрація МР-Ї уз(ТАМАА)-СТу-СТу-АІіа-Рпе-Аіа-СтТу-сту-Спу-Г уз(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 125) у всіх ямках була 2 мкМ. Флуоресценцію реєстрували в часі при 37 "С, екстинкція А495 нм/ емісія А518 нм. Збільшення інтенсивності флуоресценції спостерігали у випадку 4497-таІ-РНЕТ-пептид кон'югату як для УМоса46, так і для
О5АЗОО, що свідчить про те, що ЕКЕТ пептид розщеплювався протеазою 5. ашеив, і протеаза була присутня в обох штамах. Лінкерна частина МР-К(Татга)їссАгдососК(флуоресцеїн)
(«коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 125) розщеплювалася як у випадку Ууоод46, так й у випадку ОЗБАЗОО0, коли була кон'югована з антитілом, що зв'язується з 5. ашеив. Було важливо підтвердити розщеплення цієї моделі лінкера в ОБАЗО0О, оскільки ОБАЗО0О відноситься до клінічно значимого штаму МЕК5А, мішені для потенційного терапевтичного агента кон'югат антитіло-антибіотик (ААС). Для ЕКЕТ кон'югату тіо-54497-МР-
К(«Татга)ссАБАсОоСсК(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 125) показали збільшення флуоресценції в обох штамах, що свідчить про те, що лінкер розщеплюється протеазою 5. аштеив, і протеаза є присутньою у клінічно значимому штамі МКЗА, ОБАЗОО.
Щільність клітин впливає на розщеплення, розщеплення відбувається швидше в культурах з більш високою щільністю клітин. Для не зв'язуючого контролю, кон'югату Тіо-трастузумаб-МР-
К(Татга)ссАЕГАСОСК (флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 125), не було показано збільшення флуоресценції в жодній з тестованих умов.
На основі розщеплюваного субстрату, ідентифікованого в клітинних аналізах, був отриманий інтермедіат лінкер-антибіотик І А-59 (Таблиця 2), який кон'югували з антитілами з утворенням анти-МК5А з важким ланцюгом, у який методом генної інженерії введений цистеїн, тіо-5 4497 (ААС-113) і тіо-5 4462 (ААС-114) , і анти-НЕКЗ2 з легким ланцюгом тіо-трастузумабу (ААС-115), наведених у Таблиці 3. Для ОСАБдДОСсО (5ЕО ІЮ МО: 126), зв'язаного з ААС, продемонстровані більш високі швидкості розщеплення у порівнянні з ЕКЕТ-пептидом при інкубації з концентрованим супернатантом з нічної культури Ууоо946, що свідчить про те, що лінкер- антибіотик є кращим субстратом для невідомої досліджуваної протеази. Розщеплення відбувалося в очікуваному сайті між аланіном і гліцином у зв'язаному з ААС (ААС-113, ААС-114,
ААС-115) ОСАРАСОО («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 126). Цей лінкер-антибіотик (ГА-59) не є оптимізованою системою доставки для антибіотика, оскільки при розщепленні вивільняється (зоо-рифаміцин, а не вільний рифаміцин. Хоча терапевтичний потенціал цього інтермедіату лінкер-антибіотик може бути невизначеним, його здатність ефективно розщеплюватись протеазою робить його корисним інструментом для ідентифікації фракцій, що містять активну представляючу інтерес протеазу. Інтермедіат лінкер-антибіотик ГГ А-59 кон'югували з Рар частиною антитіла тіо-54497 (5еспеег, у. М., МУ. Запаомаї, еї аї. (2012). Ріо опе 742): е51817). Антитіла Раб з введеним методом генної інженерії цистеїном, "піогАВ", мають
Зо один реакційноздатний цистеїн, що дозволяє провести сайт-специфічну кон'югацію однієї сполуки з реакційноздатним тіолом. ТпПісгАВ 5-4497 реагував з З-кратним молярним надлишком
ГА-59 відносно ІПіогАВ протягом 1 години на 50 мМ Трис із рН 7,5, 150мМ Масі при кімнатній температурі. Надлишок ГА-59 видаляли від ААС діафільтрацією у РВ5. Отриманий кон'югат,
ІіогАВ 54497-МСО-ССПАБгАСОС-(рірвовє) («коровий пептид» наведений в 5ХЕО ІЮ МО: 126) (Фіг. 217) використовували як інструмент для ідентифікації активних фракцій, де розщеплення лінкера виявляли за допомогою І. С-М5 аналіза.
Оптимізація лінкерів для ефективного розщеплення стафопаїном В.
В інтермедіаті лінкер-антибіотик ГА-59 МОо-сасАгРАсааца-(рірвокК) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 126) залишки субстрату оптимізовані у положеннях РІ, Р2 і РЗ.
Використовуючи результати скринінгу КЕРІ, були розроблені та синтезовані два нових лінкери з включенням кращого залишку для Рі (Фіг. 30). малеїімідо-пропіонат-І еи-АіІа-Рпе-АІа-АІіа («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 136) і малеімідо-пропіонат-І еи-АІа-Рне-Спіу-Аіа («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 135) були синтезовані методом твердофазного синтезу. При скринінгу КЕР'Ї виявилося, що найбільш частими залишками у РА були ізолейцин і лейцин (не з огляду на гліцин). Для обмеження кількості синтезованих лінкерів був вибраний тільки один залишок, лейцин. Аїа і сіІу чергували у положенні Р1, щоб досліджувати їхній вплив на розщеплюваність. Також був включений залишок Аа у Рт1". Як сурогатна заміна антибіотика до С-кінця обох лінкерів додавали О5ЗМФ/ (ксантиліум, /9-(2-Ц4-((2,5-діоксо-1- піролідиніл)окси|карбоніл|-1-піперидиніл|Іісульфоніл|феніл|-3,6-біс(іметилфеніламіно)-МНО ефір, хлорид, реєстраційний номер СА5 304014-12-8, І Пе Тесппоіодіев) (Фіг. 30). Включення О5УФ дозволяло оцінювати розщеплюваність цих лінкерів без використання дорогих і важкосинтезованих антибіотиків.
Експериментальні лінкери таІ-пептид-05У/ кон'югували з (піобАВ 54497 для оцінки розщеплюваності цих лінкерів. Кон'югування проводили, як описано раніше. Оцінювали розщеплюваність отриманих кон'югатів (пісОБАВ 54497 лінкер-О05У7 стафопаїном В, стафопаїном А і людським катепсином В при рн 7,2 (Таблиця 5). Як і стафопаїн В, стафопаїн А являє собою секретовану цистеїнову протеазу б. ашеив із протеаз сімейства папаїну.
Стафопаїн А структурно аналогічний стафопаїну В, але має більш широку субстратну специфічність (Ріїїрек, К., М. Кгуспоп, еї аІ. (2003). Тпе Чдошигпаї! ої ріоіодіса! спетівігу 278(42): бо 40959-40966). Катепсин В, цистеїнова лізосомальна протеаза ссавців, також є представником ендопептидаз сімейства папаїну. Вважається, що катепсин В розщеплює лінкер валін-цитрулін, що використовується в інших лінкерах ААС, описаних у цьому патенті.
Таблиця 5
Розщеплення оптимізованих лінкерів стафопаїнами і людським катепсином В 00000001 СтафопаїнА | Стафопаїнв | Катепсинв
МР-ГАРад-О5У7 Відсоток З8 100 100 («коровий пептид»| розщеплення наведений в 5ЕО ІО МО: рН 7,2 135) Продукт А-О5У7 А-О5У7 А-О5У7 (Фіг. 30) розщеплення
МР-ГАБРДА-О5У 7 Відсоток 23 100 100 («коровий пептид»| розщеплення наведений в 5ЕО ІО МО: рН 7,2 136) Продукт А-О5У7 А-О5У7 А-О5У7, (Фіг. 30) розщеплення О5У7
МР-І АРа-РАВО- Відсоток 100 100 100 (піперазиноВоОК) розщеплення («коровий пептид»| рН 5 наведений в 5ЕО ІЮ МО: Відсоток 46 100 64 128) розщеплення
І А-104 рн 7,2
Продукт піперазино- піперазино- розщеплення рифаміцин рифаміцин
У Таблиці 5 наведені дані аналізів розщеплення оптимізованих лінкерів, кон'югованих з
ІПіОгАВ, під дією стафопаїну А, стафопаїну В і катепсину В. Отриманий лінкер-антибіотик, МР-
ГАБО-піперазино-рифаміцин («коровий пептид» наведений в 5ЕБЕО ІЮО МО: 128), ефективно розщеплюється всіма трьома протеазами. Розщеплення стафопаїнами призводить до вивільнення вільного рифаміцину. Розщеплення катепсином В призводить до вивільнення Рпе-
Сіу-піперазино-рифаміцину (Приклад 26).
Розробка та кон'югування лінкера, розщеплення якого стафопаїном В призводить до вивільнення вільного антибіотика.
За результатами аналізів розщеплення тестованих експериментальних лінкерів для приєднання антибіотика був вибраний та!-І АЕСА («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 135). Потрібна була подальша оптимізація цього лінкера, щоб при протеолітичному розщепленні лінкера вивільнявся вільний антибіотик. Щоб досягти цього, Аа у РІ" заміщали на п-амінобензил (РАВ) або п-амінобензилоксикарбоніл (РАВС). Для одержання інтермедіатів лінкер-антибіотик ГА-88, МОС-Г АРа-РАВ-(диметиламіно-З-піролоВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128), і ГА-104, МР-І АРС-РАВС-(піперазиноВоОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128), до С-кінця цього лінкера додавали піперазино-рифаміцин. При розщепленні після СЗіу у положенні РІ групи РАВ і РАВС піддаються саморозщепленню, вивільняючи вільний антибіотик. І А-88 кон'югували з утворенням тіо-54497-у8-І СУ2050-МО-
ГАРа-РАВ-(диметиламіно-З-піролоВвоОкК) ААС-163 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 128) (Таблиця 3). ГА-104 кон'югували з утворенням ААС-193, ААС-215 і ААС-222. Аналізи розщеплення ААС 193 стафопаїном А, стафопаїном В і катепсином В проводили при рн 7,2 і рн 5. Ці значення рН були вибрані, оскільки вони рівні рН у плазмі (рН 7,2) або в середовищі фаголізосоми (рН 5). Стафопаїн В демонстрував 10095 розщеплення як при рн 5, так і при 7,2.
Стафопаїн А демонстрував 10095 розщеплення при рн 5 і 6495 розщеплення при рн 7,2.
Заміна Аа на РАВС у групі Р1" призводила до зміни сайту розщеплення лінкера катепсином
Зо В. При розщепленні катепсином В вивільнявся РПе-Сіу-РАВС-(піперазиноВОК). При застосуванні як терапевтичний агент, потенційне розщеплення цього лінкера катепсином В з більшою ймовірністю буде відбуватися в лізосомальному компартменті макрофагів. У цих умовах інші протеази, у тому числі стафопаїн В, можуть далі процесувати ЕС-РАВС-піперазино-
рифаміцин з вивільненням вільного антибіотика.
Інтермедіат лінкер-антибіотик МР-ГАРС-РАВС-(піперазиноВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІО МО: 128) ГА-104 кон'югували з ТпіоМар 54497 для оцінки ефективності отриманих ААС-193, ААС-215, ААС-222 /п міо й /п умо. Також кон'югацією ГА-104 з ТпіоМар анти-Нег2 і ТпіоМар анти-90, де обидва антитіла являють собою контролі 3 тим же самим ізотипом, були отримані два контрольних кон'югати. Для кон'югату за легким ланцюгом ТпіоМар 4497 МР-Г АБО-РАВС-піперазино-рифаміцин («коровий пептид» наведений в 5ЗЕО ІЮ МО: 128)
ААС-215 співвідношення лікарський засіб/ антитіло (САКЕ) становило 1,6, як і для контрольного кон'югату ТпіоМаб анти-90. Для кон'югату ТпіоМаб анти-Нег2 таї!-ЇАгСа-РАВС-піперазино- рифаміцин («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128) співвідношення ВАК становило 1,5.
Для ідентифікації субстратів, легко розщеплюваних секретованими протеазами, супернатант клітинної культури 6. ашеиве скринували з використанням ЕКЕТ пептидної бібліотеки. Результати цього скринінгу показали, що у переважній більшості випадків вимірювана протеазна активність може бути приписана одній секретованій цистеїновій протеазі 5. ашеив, стафопаїну В. Пептидні лінкери, сконструйовані для розщеплення стафопаїном В, були оптимізовані, і був ідентифікований субстрат, ефективно розщеплюваний з вивільненням вільного антибіотика. Отриманий лінкер також розщеплюється протеазою стафопаїном А 5. ацгецив і людською протеазою катепсином В, що є цистеїновими протеазами.
При кон'югації з антитілом, що зв'язується з 5. ашеив, отриманий ААС має ефективність як іп міїго, так і /п умо. Ендогенні ендопептидази МК5А забезпечують механізм для спрямованої дії на інфекції МАЕ5ЗА і вивільнення антибіотика залежним безпосередньо від захворювання способом. Здатність цього лінкера розщеплюватись протеазами, секретованими 5. ашеив, забезпечує можливість спрямованої дії на МАЕ5А, що перебувають у людських нейтрофілах, а також позаклітинно у плазмі/ тканині хазяїна. Ця подвійна дія забезпечує вивільнення високих концентрацій антибіотика як у внутрішньоклітинному, так і у позаклітинному місці інфекції.
Експресія стафопаїну А і В підвищена в людських нейтрофілах і вважається важливим фактором вірулентності (Вигіак, С., еї аї. (2007) СеїЇшіаг тісгоріоіоду 9(5):1172-1190), роблячи їх привабливими мішенями для опосередкованого протеазами вивільнення антибіотиків.
Людський катепсин В також розщеплює лінкер, представляючи альтернативний шлях
Зо вивільнення. Спостережувана ефективність ААС, імовірно, є результатом активності множини протеаз, як протеаз 5. ашеив, так і протеаз хазяїна, що беруть участь у вивільненні антибіотика або фрагмента антибіотика. Стабільний у сироватці крові лінкер, розщеплюваний набором протеаз, забезпечує механізм вивільнення, що дозволить обійти стійкість бактерії.
СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ ТА ЗАПОБІГАННЯ ІНФЕКЦІЙ КОН'ЮГАТАМИ АНТИТІЛО-
АНТИБІОТИК
ААС даного винаходу використовуються як антимікробні агенти, ефективні проти ряду грампозитивних бактерій людини та тварин, у тому числі, проти Єарнуюососсі, наприклад, 5. ацтейв, 5. заргорпуйсив і 5. вітшапв; і ібІега, наприклад, //5;їепа топосуїодепев; Епіегососсі, наприклад, Є. /аеса/їв; Єгеріососсі, наприклад, 5. рпеитопіає; Сіозігідіит, наприклад, С. аїйісле.
Персистуюча бактеріємія може бути результатом інтерналізації бактерій у клітині-хазяїні. За допомогою механізмів, які дотепер залишаються не до кінця зрозумілими, інтерналізовані патогени можуть уникати імунного розпізнавання та виживати всередині клітин-хазяїнів. Такі організми включають 5. ашгеиз, баітопепЛа (наприклад, 5. урі, 65. спогегаезиїв і 5. епіепіаїв5),
ІГедіопейла (наприклад, /. рпешторнйа), Гібсїена (наприклад, /. топосуїодепев), ВгисеПа (наприклад, 8. аропив, В. те/Пепвів, В. виів), Спіатуаіа (С. рпеитопіва, С. аснпотаї)), Ніскенвіа 5рр., опіде!а (наприклад, 5. Лехпе!і) і тусобасіепа.
Після проникнення в кров'яне русло 5. ашгеиз може викликати метастатичні інфекції по суті у будь-якому органі. Вторинні інфекції виникають приблизно в одній третині всіх випадків до початку терапії (Гоулег еї аї., (2003) Агсп. Іпіегп. Мей. 163:2066-2072) і навіть у 1095 пацієнтів після початку терапії (Каїр еї аї!., (2006) Зсапа. .). Іптесі. рі5., 38:7-14). Особливостями інфекцій
Є більші скупчення гною, руйнування тканини й утворення абсцесів (у всіх випадках виявляються більші кількості нейтрофілів). Тільки приблизно у 595 пацієнтів розвиваються ускладнення, якщо бактеріємія проходить протягом 48 годин, але цей рівень зростає до 4095, якщо бактеріємія триває три дні.
Незважаючи на те, що 6. ашгеив зазвичай вважаються позаклітинним патогеном, що секретує токсини, існують дані про те, що він може виживати всередині ендотеліальних клітин, кератиноцитів, фібробластів й остеокластів (АІехапаег еї аї, (2001) Аррі. Місгобіої!. Віогесппо!). 56:361-366; Сяагопі єї аії, (2009) Тгтепав МістобріоІ. 17:59-65). Нейтрофіли та макрофаги є ключовими компонентами вродженої імунної відповіді хазяїна на бактеріальну інфекцію. Ці бо клітини інтерналізують 5. ашеиве шляхом фагоцитозу, що може бути посилений за рахунок антитіл, комплементу або лектинів хазяїна, таких як маноза-зв'язуючий білок, які можуть зв'язуватись одночасно з патогеном і нейтрофілами, макрофагами та іншими професійними фагоцитами. Як згадувалося раніше, 5. ашеив не тільки виживає в лізосомальному оточенні, але в дійсності може використовувати це як механізм персистенції в хазяїні.
Кон'югати антитіло-антибіотик (ААС) даного винаходу мають значні терапевтичні переваги для лікування внутрішньоклітинних патогенів, у тому числі тих, які перебувають у фаголізосомах. В одному з варіантів втілення, патоген інтерналізований у клітини лейкоцитів, і внутрішньоклітинним компонентом є фаголізосома. В інтактному ААС варіабельна область антитіла зв'язується з антигеном клітинної поверхні бактерій (опсонізація). Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь теорією, автори думають, що, згідно з одним із механізмів, зв'язування антитіла ААС з клітинною поверхнею бактерій залучає фагоцити до бактерій. Частина Ес антитіла зв'язується з Ес рецептором на фагоциті, полегшуючи фагоцитоз. Після того як відбувся фагоцитоз комплексу ААС-бактерія, при злитті з лізосомою лінкер ААС розщеплюється під дією фаголізосомальних ферментів, що призводить до вивільнення активного антибіотика.
Через обмежений простір і щодо високої локальної концентрації Абх (приблизно 107 на бактерію) фаголізосома більше не підтримує виживання внутрішньоклітинного патогену (Фіг. 5).
Оскільки ААС по суті являє собою неактивні проліки, терапевтичний індекс антибіотика може бути збільшений у порівнянні з вільною (некон'югованою формою). Антитіло забезпечує патоген-специфічну спрямовану дію, у той час розщеплюваний лінкер розщеплюється в умовах, характерних для внутрішньоклітинної локалізації збудника. Дія може бути вчинена безпосередньо на опсонізований патоген, а також на інші патогени, які спільно локалізовані у фаголізосомах. У певному аспекті, патогеном є 5. ашгеийв.
Толерантність до антибіотика являє собою здатність патогена, що викликає захворювання, бути стійким до знищення антибіотиками та іншими антимікробними агентами, і за механізмом вона відрізняється від множинної лікарської стійкості (Гем/і5 К (2007). "Регвівієг сеїі5, догптапсу апа іптесійоив дібеабзе". Майте Неуїем/є Містобіоюду 5 (1): 48-56. адоі:10.1038/питісго1557).
Швидше за все, ця форма толерантності обумовлена невеликою субпопуляцією мікробних клітин, що називають персистуючими (Віддег Ум (14 Осіорег 1944). "Ттєаітепі ої зіарнуіососсаї іптесіопе м/йй репісіип Бу іпіептШепі 5іепйй2айоп". Гапсеї 244 (6320): 497-500). Ці клітини не
Зо мають множинну лікарську стійкість у класичному змісті, але, скоріше, є дрімаючими клітинами, які толерантні до лікування антибіотиками, що знищують їх генетично ідентичні родинні клітини.
Ця толерантність до антибіотиків обумовлена фізіологічним станом, при якому відсутній розподіл, або він відбувається надзвичайно повільно. Коли антимікробне лікування не призводить до знищення персистуючих клітин, вони стають джерелом повторюваних хронічних інфекцій. Кон'югати антитіло-антибіотик даного винаходу мають унікальну властивість знищувати ці персистуючі клітини та придушувати появу бактеріальних популяцій з множинною лікарською стійкістю.
В іншому варіанті втілення, ААС даного винаходу може використовуватись для лікування інфекції незалежно від внутрішньоклітинного компартмента, в якому патоген виживає.
В іншому варіанті втілення, ААС також може використовуватись для спрямованої дії на бактерії у плаваючій формі або у вигляді плівок (наприклад: 5. ашеив, К. рпеитопіа, Е. сої, А. раитаппії, Р. аегидіпоза і Епіегобасіепасеає) за рахунок опосередкованої антитілами опсонізації що призводить до інтерналізації бактерій професійними фагоцитами. Коли фагосома зіллється з лізосомою, у кислому або протеолітичному середовищі фаголізосоми з
ААС будуть виділятися досить високі концентрації вільного антибіотика для знищення фагоцитованого патогена.
Способи лікування інфекцій кон'югатами антитіло-антибіотик (ААС) даного винаходу включають лікування бактеріальних легеневих інфекцій, таких як пневмонія, викликана 5. ацгеиве, або туберкульоз, бактеріальних інфекцій очей, таких як трахома та кон'юнктивіт, інфекцій серця, головного мозку або шкіри, інфекцій шлунково-кишкового тракту, таких як діарея мандрівників, остеомієліт, виразковий коліт, синдром роздратованого кишечнику (СРК), хвороба
Крона та ЗЗК (запальне захворювання кишечнику) загалом, бактеріальних менінгітів й абсцесів у будь-якому органі, такому як м'язи, печінка, оболонки головного мозку або легені. Бактеріальні інфекції можуть бути в інших частинах тіла, таких як сечовивідні шляхи, кров'яне русло, рана або місце встановлення катетера. ААС даного винаходу корисні для лікування інфекцій, що погано піддаються лікуванню, які включають біоплівки, імплантати або недоступні місця (наприклад, остеомієліт й інфекції протезних зв'язок), і інфекції з високою смертністю, такі як внутрішньолікарняна пневмонія та бактеріємія. Уразливі групи пацієнтів, яких можна лікувати для запобігання інфекції, викликаної бїарнпуососса! айгеив, включають пацієнтів після бо гемодіалізу, пацієнтів з ослабленим імунітетом, пацієнтів у відділеннях інтенсивної терапії та деяких пацієнтів, які перенесли хірургічне втручання. В іншому аспекті, даний винахід передбачає спосіб знищення, лікування або запобігання мікробної інфекції у тварин, переважно, у ссавців, і, ще переважніше, у людини, який включає введення тварині ААС або фармацевтичної композиції ААС даного винаходу. Даний винахід також підходить для лікування або запобігання захворювань, пов'язаних з мікробними інфекціями, або є результатом таких мікробних інфекцій. Такі способи лікування або запобігання можуть включати пероральне, місцеве, внутрішньовенне, внутрішньом'язове або підшкірне введення композиції даного винаходу. Наприклад, до хірургічного втручання або встановлювання внутрішньовенного катетера, у випадку знаходження у відділенні інтенсивної терапії, при трансплантації, у процесі або після хіміотерапії раку або у випадку інших ситуацій, пов'язаних з високим ризиком інфекції,
ААС даного винаходу можуть бути введені для запобігання початку або поширення інфекції.
Бактеріальна інфекція може бути викликана бактерією в активній і неактивній формі, і ААС вводять у кількості та протягом періоду часу, які достатні для лікування як активної, так і неактивної, латентної форми бактеріальної інфекції, тривалість лікування якої довше, ніж необхідно для лікування активної форми бактеріальної інфекції.
У результаті аналізу різних грам-позитивних бактерій виявлено, що М/ТА бета експресуються на всіх 5. ашгеив, у тому числі штамами МЕЗА і М55А, а також на штамах, що не відносяться до бар! ашеив, таких як 5. заргорнуйсиз і 5. зітиапв. МТА альфа (альфа-СІ сМАс рибіт М/ТА) присутні на більшості, але не на всіх б. ашеив, і також присутні на //віела топосуїодепевз. МТА відсутні у грам-негативних бактерій. Таким чином, один аспект даного винаходу являє собою спосіб лікування пацієнта, інфікованого 5. ашеив, або 5. заргорнуйсив, або 6. зітшапх5, шляхом введення терапевтично ефективної кількості анти-М/ТА бета-ААС даного винаходу. Інший аспект даного винаходу являє собою спосіб лікування пацієнта, інфікованого 5. ашгеиз або //«їІепа топосуїодепевз, шляхом введення терапевтично ефективної кількості анти-М/ТА альфа-ААС даного винаходу. Даний винахід також включає спосіб запобігання інфекцій, викликаних 5. ашеивх, або 5. заргорнуйсивх, або 65. вітиап5, шляхом введення терапевтично ефективної кількості анти-М/ТА бета-ААС даного винаходу в умовах лікарні, наприклад, при хірургічному втручанні, у випадку опікового хворого та при трансплантації органів.
Зо У пацієнта, якому потрібне лікування від бактеріальної інфекції, що визначає лікар-фахівець у даній області, також необов'язково може бути визначений вид бактерії, яким він інфікований.
Оскільки стан пацієнта з бактеріальною інфекцією може погіршитися дуже швидко, протягом годин, при надходженні в лікарню йому можуть бути введені анти-М/ТА-ААС даного винаходу поряд із одним або декількома стандартами лікування антибіотиками, такими як ванкоміцин.
Коли діагностичні результати стають відомі та вказують на наявність, наприклад, інфекції 5. ацгеив, можна продовжувати лікування пацієнта анти-МУТА ААС. Таким чином, в одному з варіантів втілення способу лікування бактеріальної інфекції або, зокрема, інфекції 5. ашгеийв, пацієнту вводять терапевтично ефективну кількість анти-М/ТА бета ААС. У способах лікування або запобігання даного винаходу ААС даного винаходу можуть бути введені як єдиний терапевтичний агент або разом із іншими агентами, такими як агенти, які описані нижче. Як показано в доклінічних моделях, ААС даного винаходу перевершує ванкоміцин для лікування
МЕЗ5А. Порівняння ААС з 5ОС можна здійснити, наприклад, за зниженням рівня смертності. У пацієнта, що піддається лікуванню, варто оцінювати чутливість до лікування ААС за допомогою різних факторів. Приклади ознак і симптомів, які лікарі можуть використовувати для оцінки поліпшень у пацієнтів, включають наступні ознаки й симптоми: нормалізація рівня лейкоцитів у крові, якщо він був підвищений на момент постановки діагнозу, нормалізація температури тіла, якщо вона була підвищена (лихоманка) на момент постановки діагнозу, кліренс посівів крові, візуальні поліпшення стану ран, у тому числі зменшення еритеми та дренажу гною, зниження потреби в штучній вентиляції легенів, наприклад, пацієнту, що перебуває на штучній вентиляції
БО легенів, потрібно менше кисню або менша швидкість вентилювання, більше не потрібна вентиляція легенів, якщо пацієнт перебував на штучній вентиляції легенів на момент постановки діагнозу, потрібне застосування меншої кількості лікарських засобів для підтримки стабільного кров'яного тиску, якщо ці лікарські засоби були необхідні на момент постановки діагнозу, нормалізація відхилень у лабораторних аналізах, які припускають органну недостатність, таких як підвищений креатинін або тести функціонування нирок, якщо вони були не нормальними на момент постановки діагнозу, і поліпшення рентгенівської візуалізації (наприклад, рентгена грудної клітки, якщо раніше передбачалася пневмонія). У пацієнта у відділенні інтенсивної терапії ці фактори варто вимірювати, щонайменше, щодня. Лихоманку можна контролювати за рівнем лейкоцитів у крові, включаючи абсолютну кількість нейтрофілів у бо крові, а також за тим, що більше не спостерігається "зрушення вліво" (поява бластних клітин,
що вказує на збільшення продукції нейтрофілів у відповідь на активну інфекцію).
В контексті способів лікування даного винаходу пацієнт із бактеріальною інфекцією піддається лікуванню, якщо за оцінкою лікаря спостерігається значне вимірне поліпшення, щонайменше, двох або декількох згаданих вище факторів у порівнянні із значеннями, ознаками або симптомами до або на початку лікування, або в момент постановки діагнозу. У деяких варіантах втілення, спостерігається вимірне поліпшення 3, 4, 5, 6 або більше згаданих вище факторів. У деяких варіантах втілення, вимірне поліпшення факторів становить, щонайменше,
БО, бою, 7090, 8090, 9095, 95965 або 10095 у порівнянні із значеннями до лікування. Як правило, пацієнт може вважатися повністю вилікуваним від бактеріальної інфекції (наприклад, інфекції, викликаної 5. ашгеив), якщо вимірні поліпшення у пацієнта включають наступне: ї) відсутність росту раніше ідентифікованих бактерій при повторних посівах крові або в культурах тканини (зазвичай декількох); ії) нормалізацію лихоманки; ії) нормалізацію рівня УУВС; і їм) свідчення повного, або часткового відновлення функціонування органів (легені, печінка, нирки, судинний колапс), з огляду на існуючі раніше у пацієнта супутні захворювання.
Дозування
У будь-якому з наведених вище аспектів, доза ААС для лікування інфікованого пацієнта становить зазвичай від приблизно 0,001 до 1000 мг/кг/день. В одному з варіантів втілення, пацієнта з бактеріальною інфекцією лікують дозою ААС у діапазоні від приблизно 1 мг/кг до приблизно 100 мг/кг, як правило, від приблизно 5 мг/кг до приблизно 90 мг/кг, конкретніше, від 10 мг/кг до 50 мг/кг. ААС можна давати щодня (наприклад, однократна доза від 5 до 50 мг/кг/день) або рідше (наприклад, однократна доза 5, 12,5 або 25 мг/кг/ тиждень). Одна доза може бути розділена на 2 дні, наприклад, 25 мг/кг в один день та 25 мг/кг наступного дня.
Пацієнту може вводитись доза кожні З дні (430), один раз на тиждень через кожні два тижні (аОУМ) протягом 1-8 тижнів. В одному з варіантів втілення, пацієнту вводять ААС даного винаходу шляхом внутрішньовенного введення один раз на тиждень протягом 2-6 тижнів із стандартом лікування (50С) для лікування бактеріальної інфекції, такої як інфекція, викликана еЗарп А. Тривалість лікування буде залежати від стану пацієнта або ступеня інфекції, наприклад, тривалість становить 2 тижні для неускладненої бактеріємії або б тижнів для бактеріємії з ендокардитом.
В одному з варіантів втілення, ААС вводять у початковій дозі від 2,5 до 100 мг/кг протягом одного-семи послідовних днів, після чого вводять підтримуючу дозу, яка складається від 0,005 до 10 мг/кг один раз кожні один-сім днів протягом одного місяця.
Спосіб введення
Для лікування бактеріальних інфекцій ААС даного винаходу можуть бути введені у будь-якій із зазначених вище доз внутрішньовенно (і.м.) або підшкірно. В одному з варіантів втілення,
М/ТА-ААС вводять внутрішньовенно. У певному варіанті втілення, М/ТА-ААС, що вводять і.м. шляхом, являє собою М/ТА-бета ААС, конкретніше, МУТА-бета ААС, у якому М/ТА-бета антитіло вибране з групи антитіл з амінокислотними послідовностями, розкритими на Фіг. 14, Фіг. 15А,
Фіг. 158, Фіг. 16А і Фіг. 168.
Комбінована терапія
Якщо буде потреба, як це визначено лікарем пацієнта, ААС може бути введений разом із одним або декількома додатковими терапевтичними або профілактичними агентами, наприклад, другим додатковим терапевтичним або профілактичним агентом.
В одному з варіантів втілення, другий антибіотик, що вводять у комбінації зі сполукою кон'югатом антитіло-антибіотик даного винаходу, вибраний з антибіотиків, що належать до наступних структурних класів: (ї) аміноглікозиди; (ії) бета-лактами; (ії) макроліди/циклічні пептиди; (ім) тетрацикліни; (м) фторхіноліни/фторхінолони й (мі) оксазолідинони. Дивіться Зпаму,
К. апа Ваграснпуп, М. (2011) Апп. М.М. Асад. сі. 1241:48-70; Зцйцісійне, 9. (2011) Апп. М.У. Асад. зЗсі. 1241:122-152.
В одному з варіантів втілення, другий антибіотик, що вводять у комбінації зі сполукою кон'югатом антитіло-антибіотик даного винаходу, вибраний з кліндаміцину, новобіоцину, ретапамуліну, даптоміцину, (з5К-2140944, бО-400549, ситафлоксацину, тейкопланіну, триклозану, нафтиридону, радезоліду, доксорубіцину, ампіциліну, ванкоміцину, іміпенему, дорипенему, гемцитабіну, далбаванцину й азитроміцину.
Додатковими прикладами зазначених додаткових терапевтичних або профілактичних агентів є протизапальні агенти (наприклад, нестероїдні протизапальні лікарські засоби (НПЗ33; наприклад, кетопрофен деїоргоїеп, диклофенак, дифлунізал, етодолак, фенопрофен, флурбіпрофен, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, меклофенамат, мефенамова кислота, мелоксикам, набумеон, напроксен натрію, оксапрозин, піроксикам, суліндак, толметин, бо целекоксиб, рофекоксиб, аспірин, холін саліцилат, салсалат і саліцилат натрію та магнію) і стероїди (наприклад, кортизон, дексаметазон, гідрокортизон, метилпреднізолон, преднізолон, преднізон, триамцинолон)), антибактеріальні агенти (наприклад, азитроміцин, кларитроміцин, еритроміцин, гатифлоксацин, левофлоксацин, амоксицилін, метронідазол, пеніцилін о, пеніцилін М, метицилін, оксацилін, клоксацилін, диклоксацилін, нафцилін, ампіцилін, карбеніцилін, тикарцилін, мезлоцилін, піперацилін, азлоцилін, темоцилін, цефалотин, цефапірин, цефрадин, цефалоридин, цефазолін, цефамандол, цефуроксим, цефалексин, цефпрозил, цефаклор, лоракарбефу, цефокситин, цефметазол, цефотаксим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим, цефиксим, цефподоксим, цефтибутену, цефдинір, цефпіром, цефепім, ВА 5788, ВАГ9141, іміпенем, ертапенем, меропенем, азтреонам, клавуланат, сульбактам, тазобактам, стрептоміцин, неоміцин, канаміцин, пароміцин, гентаміцин, тобраміцин, амікацин, нетилміцин, спектиноміцин, сизоміцин, дибекалін, ізепаміцин, тетрациклін, хлортетрациклін, демеклоциклін, міноциклін, окситетрациклін, метациклін, доксициклін, телітроміцин, АВТ-773, лінкоміцин, кліндаміцин, ванкоміцин, оритаванцин, далбаванцин, тейкопланін, хінупристин і дальфопристин, сульфаніламід, п-амінобензойна кислота, сульфадіазин, сульфізоксазол, сульфаметоксазол, сульфаталідин, лінезолід, налідиксова кислота, оксолінова кислота, норфлоксацин, перфлоксацин, еноксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, темафлоксацин, ломефлоксацин, флероксацин, грепафлоксацин, спарфлоксацин, тровафлоксацин, клінафлоксацин, моксифлоксацин, геміфлоксацин, ситафлоксацин, даптоміцин гареноксацин, рамопланін, фаропенем, поліміксин, тигециклін, А2О2563 або триметоприм), антибактеріальні антитіла, включаючи антитіла до того ж самого або іншого антигена, до якого спрямований ААС, Ад, інгібітори агрегації тромбоцитів (наприклад, абциксимаб, аспірин, цилостазол, клопідогрел, дипіридамол, ептифібатид, тиклопідин або тирофібан), антикоагулянти (наприклад, дальтепарин, данапароїдом, еноксапарин, гепарини, тинзапарин або варфарин), жарознижуючі (наприклад, ацетамінофен) або гіполіпідемічні агенти (наприклад, холестирамін, колестипол, нікотинова кислота, гемфіброзил, пробукол, езетиміб, або статини, такі як аторвастатин, розувастатин, ловастатин, симвастатин, правастатин, церивастатин і флувастатин). В одному з варіантів втілення, ААС даного винаходу вводять у комбінації з стандартом лікування (50) для 5. ашгеиз (включаючи метицилін-стійкі та метицилін-ч-утливі штами). М55А зазвичай лікують нафциліном або
Зо оксациліном, і МЕЗА зазвичай лікують ванкоміцином або цефалозином.
Ці додаткові агенти можуть бути введені протягом 14 днів, 7 днів, 1 дня, 12 годин або 1 години після введення ААС, або одночасно з ним. Додаткові терапевтичні агенти можуть перебувати в тій же самій або в іншій фармацевтичній композиції, що й ААС. Якщо вони перебувають в інших фармацевтичних композиціях, то можуть бути використані різні способи введення. Наприклад, ААС може бути введений внутрішньовенно або підшкірно, тоді як другий агент може бути введений пероральним шляхом.
ФАРМАЦЕВТИЧНІ ЛІКАРСЬКІ ФОРМИ
Даний винахід також передбачає фармацевтичні композиції, що містять ААС, і способи лікування бактеріальної інфекції з використанням фармацевтичних композицій, що містять ААС.
Такі композиції можуть також включати підходящі ексципієнти, такі як фармацевтично прийнятні ексципієнти (носії), у тому числі буфери, кислоти, основи, цукри, розріджувачі, гліданти, консерванти тощо, добре відомі в даній області техніки й описані в даному документі. Дані способи та композиції можуть бути використані як такі або в комбінації з іншими загальноприйнятими способами й/або агентами для лікування інфекційних захворювань. В одному з аспектів, даний винахід також передбачає фармацевтичні лікарські форми, що включають, щонайменше, одне антитіло даного винаходу й/або, щонайменше, один його кон'югат антитіло-антибіотик (ААС). У деяких варіантах втілення, фармацевтична лікарська форма включає 1) антитіло даного винаходу й/або його ААС і 2) фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах втілення, фармацевтична лікарська форма включає 1) антитіло даного винаходу й/або його ААС та, необов'язково, 2) щонайменше, один додатковий терапевтичний агент.
Фармацевтичні композиції, що включають антитіло або ААС даного винаходу, одержують для зберігання шляхом змішування антитіла або ААС, що має бажаний ступінь чистоти, з фізіологічно прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами (Кетіпдіоп'5
РРагтасешіса! бсіепсев 161п едйіоп, О5ої, А. Ед. (1980)) у формі водних розчинів або у вигляді ліофілізованих або сухих лікарських форм. Прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів у застосовуваних дозах і концентраціях, і включають буфери, такі як фосфатний, цитратний, гістидиновий буфер та інші буфери на основі органічних кислот; антиоксиданти, у тому числі аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як 60 октадецилдиметилбензиламоній хлорид; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію, хлорид бензетонію); фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілларабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; і м-крезол); низькомолекулярні (приблизно менше 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, у тому числі глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиіїони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси 7п-білок); і/або неіїонні сурфактанти, такі як ТУМЕЕМГ,
РІГ ЮАОМІСВГ або поліетиленгліколь (РЕСб). Фармацевтичні лікарські форми, що використовуються для введення /л у//о, зазвичай є стерильними, що легко досягається шляхом фільтрації через стерильні фільтраційні мембрани.
Активні інгредієнти також можуть бути укладені в мікрокапсули, отримані, наприклад, методом коацервації або шляхом міжфазної полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули та полі-(метилметакрилатні) мікрокапсули, відповідно, у колоїдні системи доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки та нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методи розкриті в
Кетіпдіоп'5 Рпагтасеційса! 5сіепсез 161й єдійоп, Озої, А. Ес. (1980).
Можуть бути отримані препарати з вповільненим вивільненням. Підходящі приклади препаратів з вповільненим вивільненням включають напівпроникні матрикси з твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло або ААС даного винаходу, де матрикси перебувають у вигляді формованих виробів, наприклад, плівки або мікрокапсули. Приклади матриксів з вповільненим вивільненням включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, з полі(2- гідроксіетил-метакрилату) або з полі(вінілового спирту)), полілактиди (патент США номер 3,773,919), співполімери І-глутамінової кислоти та у-етил-І-глутамату, що не розщеплює етиленвінілацетат, що розщеплюють співполімери молочної кислоти та гліколевої кислоти, такі як ГШРКОМ ОРЕРОТ" мМ (ін'єктовані мікросфери, що складаються з співполімеру молочної кислоти та гліколевої кислоти й ацетату лейпроліду) і полі-О-(-)-3-гідроксимасляну кислоту. Тоді як полімери, такі як етиленвінілацетат і співполімер молочної кислоти та гліколевої кислоти можуть вивільняти молекули протягом 100 днів, деякі гідрогелі вивільняють білки протягом більш
Зо коротких періодів часу. Коли інкапсулювання антитіла або ААС залишаються в тілі протягом тривалих періодів часу, вони можуть денатурувати або агрегувати у результаті впливу вологи при 37 "С, що призводить до втрати біологічної активності та можливих змін імуногенності.
Можуть бути розроблені раціональні стратегії для стабілізації залежно від залученого механізму. Наприклад, якщо виявлено, що агрегація відбувається за механізмом, що полягає в утворенні міжмолекулярного 5-5 зв'язку в результаті тіол-дисульфідного обміну, стабілізацію можна здійснити за рахунок модифікування сульфгідрильних залишків, ліофілізації з кислих розчинів, контролю вмісту вологи, використання відповідних добавок і розробки спеціальних полімерних матриксних композицій.
Антитіло може бути складене у вигляді будь-якої підходящої лікарської форми для доставки в цільову клітину/ тканину. Наприклад, антитіла можуть бути складені у види ліпосом, невеликих везикул, що складаються з різних типів ліпідів, фосфоліпідів і/або сурфактантів, що використовуються для доставки лікарського засобу ссавцеві. Компоненти ліпосоми зазвичай організовані у вигляді бішару, аналогічно організації ліпідів у біологічних мембранах. Ліпосоми, що містять антитіла, одержують способами, відомими в даній області техніки, такими як способи, описані в Ерзівїп еї аї., (1985) Ргос. Маїї. Асайа. бсі. БА 82:3688; Нулапа еї аї!., (1980)
Ргос. Майї! Асай. бсі. БА 77:4030; 005 4485045; 005 4544545; МО 97/38731; 005 5013556.
Особливо корисні ліпосоми можуть бути отримані способом зворотньо-фазового випарювання ліпідної композиції що включає фосфатидилхолін, холестерин і РЕСБ- дериватизований фосфатидилетаноламін (РЕОС-РЕ). Ліпосоми продавлюють через фільтри з певним розміром пор для одержання ліпосом з бажаним діаметром. Фрагменти Раб' антитіла даного винаходу можуть бути кон'юговані з ліпосомами, як описано в Магіїйп еї аї., (1982) .. Віо!.
Сет. 257:286-288, за допомогою реакції дисульфідного обміну. У ліпосомі необов'язково міситься хіміотерапевтичний агент (Сабіоп еї аї., (1989) /. Майопа! Сапсег пі. 81(19):1484).
СПОСОБИ ТА КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ ТА ВИЯВЛЕННЯ
У деяких варіантах втілення, будь-які передбачені в даному документі антитіла використовують для виявлення наявності МАЕ5ЗА у біологічному зразку. Використовуваний у даному документі термін "виявлення" включає кількісне або якісне виявлення. "Біологічний зразок" включає, наприклад, кров, сироватку, плазму, тканину, мокротиння, аспірат, мазок і тому подібне. 60 В одному з варіантів втілення, передбачене анти-М/ТА антитіло для застосування в способі діагностики або виявлення. В іншому аспекті передбачений спосіб виявлення наявності УТА у біологічному зразку. У деяких варіантах втілення, спосіб включає приведення в контакт біологічного зразка з анти-М/УТА антитілом, як описано в даному документі, в умовах, що підходять для зв'язування анти-М/ТА антитіла з УМУТА, і виявлення того, чи утворюється комплекс між анти-М/ТА антитілом і МТА у біологічному зразку. Такий спосіб може являти собою спосіб /л уйго або /п мімо. В одному з варіантів втілення, анти-МЕЗА антитіло використовують для вибору суб'єктів, яким підходить терапія анти-МЕЗА антитілом, наприклад, якщо МЕК5А є біомаркером для вибору пацієнтів.
В одному з варіантів втілення, наведених як приклад, анти-М/ГТА антитіло використовують для виявлення МЕБА-позитивної інфекції в суб'єкта /п м/о, наприклад, за допомогою візуалізації /л у/хо, наприклад, для цілей діагностики, прогнозування або здійснення лікування інфекції, визначення підходящого курсу терапії або моніторингу відповіді інфекції на терапію.
Один із способів виявлення /л м/мо, відомих у даній області техніки, являє собою імуно- позитронну емісійну томографію (імуно-ПЕТ), як описано, наприклад, мап Юопдеп еї аї., (2007)
Те Опсоїіодіві 12:1379-1389 й Мегеї! еї аї., (2003) 9. Мисі. Мей. 44:1271-1281. У таких варіантах втілення спосіб передбачений для виявлення Єіарп-позитивної інфекції в суб'єкта, де спосіб включає введення міченого анти-єтарі антитіла суб'єкту, що має біари-позитивну інфекцію, або в якого підозрюють Єїарп-позитивну інфекцію, і виявлення міченого анти-5іїарй антитіла в суб'єкта, при цьому виявлення міченого анти-5іарй антитіла вказує на Єтарп-позитивну інфекцію в цього пацієнта. У деяких таких варіантах втілення, мічене анти-їарі антитіло включає анти-
Зіарі антитіло, кон'юговане з випромінювачем позитронів, таким як 98Са, 8, 64, 86у, 76Ву, 892 і 124). У конкретному варіанті втілення, випромінювачем позитронів є 892.
В інших варіантах втілення, спосіб діагностики або виявлення включає контакт першого анти-старп антитіла, імобілізованого на субстраті, з біологічним зразком, що тестують на наявність Зіарй, вплив на субстрат другого анти-бїарпй антитіла та виявлення того, чи зв'язалося друге анти-біарй антитіло з комплексом, утвореним між першим анти-єїарн антитілом і Єїарйи у біологічному зразку. Субстрат може являти собою будь-яке підтримуюче середовище, наприклад, скло, метал, кераміку, полімерні кульки, пластинки, чипи й інші субстрати. У деяких варіантах втілення, біологічний зразок включає клітину або тканину
Зо (наприклад, біопсійний матеріал, у тому числі ракову тканину або тканину з підозрою на колоректальний рак, рак ендометрію, рак підшлункової залози або рак яєчників). У деяких варіантах втілення, перше й друге анти-5іарпй антитіло являють собою будь-які антитіла, описані в даному документі. У таких варіантах втілення, друге анти-МТА антитіло може являти собою анти-МТА антитіла 54497, 54462, 56978, 54487 або антитіла, отримані з них, як описано в даному документі.
Приклади розладів, які можуть бути діагностовані або виявлені відповідно до будь-якого з наведених вище варіантів втілення з використанням таких тестів як імуногістохімія (ІГХ) або гібридизація іп 5йи (І5Н), включають МА5А-позитивну інфекцію. У деяких варіантах втілення, еїарп-позитивна інфекція являє собою інфекцію, при якій спостерігається експресія 5іарп відповідно до виявлення мРНК зіарії при ПЛР аналізі зі зворотньою транскрипцією (ЗТ-ПЛР). У деяких варіантах втілення, ЗТ-ПЛР являє собою кількісну ЗТ-ПЛР (Егапсоїз Р апа 5снгепзеї у (2008). "Нарій Оіадповзіє апа Туріпа ої еЄгарнуіососсив ацгеив". єЄгбарнпуососсив: Мо/іесша!
Сепейсв. Саівієї Асадетіс Ргез5; МаскКау ІМ, еєа. (2007)) і ПЛР у реальному часі ("Неа/!-Тіте РСА іп МістобіоІоду: Егот Оіадповів о СНагасієгігайноп. Саївієї Асадетіс Ргевв).
У деяких варіантах втілення, передбачені мічені антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА). Мітки включають, без обмеження, мітки та фрагменти, що виявляють прямо (такі як флуоресцентні, хромофорні, електроннощільні, хемілюмінесцентні та радіоактивні мітки), а також фрагменти, такі як ферменти або ліганди, які виявляють побічно, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або молекулярної взаємодії. Приклади міток включають,
БО але не обмежуються ними, радіоізотопи ЗР, 790, 125І, ЗН їі 791, флуорофори, такі як хелати рідкоземельних металів або флуоресцеїн і його похідні, родамін і його похідні, дансил, умбеліферон, люциферази, наприклад, люцифераза світлячків і бактеріальну люциферазу (005 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіон, пероксидазу хрону (НАР), лужну фосфатазу, р- галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази цукрів, наприклад, глюкооксидазу, галактозооксидазу та глюкозо-6-фосфат дегідрогеназу, оксидази гетероциклів, такі як уриказа та ксантиноксидаза, зв'язані з ферментом, що використовує перекис водню для окислювання попередника барвника, таким як НАР, лактопероксидаза або мікропероксидаза, біотин/ авідин, спінові мітки, мітки бактеріофаги, стабільні вільні радикали і тому подібне. В іншому варіанті втілення мітка являє собою випромінювач позитронів. Випромінювачі позитронів включають 60 бв(За, 8, 64бу, 86, 76Ву, 892у й 124), але не обмежуються ними. У конкретному варіанті втілення,
випромінювач позитронів являє собою 897тг.
Клінічно, симптоми інфекцій, викликаних МА5А, аналогічні тим, які викликані метицилін- стійким Єгарну!ососсив айгеив (М5БЗА), і включають абсцеси та флегмони. Часто абсцес супроводжується областями центрального некрозу. Фурункули являють собою звичайне явище, особливо у випадку спалаху МЕЗА. Ураження також можуть бути неправильно діагностовані як укус павука через загальне почервоніння, що поширюється від некротичного центра. Додатково, інфекції можуть виявитись як імпетиго, фолікуліт, глибокосидячий абсцес, піоміозит, остеомієліт, некротизуючий фасцит, стафілококовий інфекційно-токсичний шок, пневмонія та сепсис. Серйозні системні інфекції більш поширені в осіб, що мають в анамнезі внутрішньовенне введення наркотиків, діабет або інші стани, що послабляють імунітет.
Стандартні підходи до лікування інфекцій МК5А включають консервативні, механічні види лікування, такі як (ії) теплі ванночки та компреси, (ії) розріз і дренаж, і (ії) видалення чужорідного пристрою (наприклад, катетера), що викликає інфекцію. Для більш серйозних інфекцій, особливо тих, при яких спостерігається флегмона, прописують антибіотики (Арх). Для легких або помірних інфекцій, антибіотики включають триметоприм-сульфаметоксазол (ТМР-Б5МХУ), кліндаміцин, доксициклін, міноциклін, тетрациклін, рифампіцин, ванкоміцин, лінезолід. Як правило, режим лікування включає 5-10 днів з періодичними перевірками й оцінками у процесі та після періоду лікування.
Додаткові види лікування включають деколонізацію, особливо в ситуації, коли у пацієнта спостерігаються повторювані інфекції, або коли пацієнт перебуває в місці, де виник спалах
МЕАЗА. Деколонізація являє собою процедуру, при якій видаляється флора, що населяє ніздрі пацієнта. Це здійснюється шляхом місцевого застосування 295 мазі мупіроцину, у великій кількості нанесеній в обидві ніздрі протягом 5-10 днів, і місцевого промивання 495 розчином хлоргексидин глюконату протягом 5 днів.
ВИРОБИ
В іншому аспекті даного винаходу передбачений виріб, що містить матеріали, які використовуються для лікування, запобігання та/або діагностики розладів, описаних вище.
Виріб включає контейнер та етикетку або вкладиш в упакуванні, закріплені на контейнері або зв'язані з ним. Підходящі контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони, шприци, мішки з
Зо розчинами для внутрішньовенного введення і тому подібне. Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, таких як скло або пластик. Контейнер містить композицію, яка як така або в комбінації з іншою композицією є ефективною для лікування, запобігання та/або діагностики розладу, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може являти собою мішок з розчином для внутрішньовенного введення або флакон із пробкою, яку проколюють голкою для підшкірної ін'єкції). Щонайменше, один активний агент у композиції являє собою антитіло або імунокон'югат даного винаходу. На етикетці або вкладиші в упакуванні зазначено, що композиція використовується для лікування вибраного стану. Більш того, виріб може включати (а) перший контейнер з композицією, яка міститься в ньому, що включає антитіло або імунокон'югат даного винаходу; і (б) другий контейнер з композицією, яка міститься в ньому, що містить додатковий цитотоксичний або інший терапевтичний агент. Виріб у цьому варіанті втілення даного винаходу також може включати вкладиш в упакуванні, на якому зазначено, що композиції можуть бути використані для лікування конкретного стану.
Альтернативно або додатково, виріб може також включати другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВУМЕЇ), фосфатно-сольовий буферний розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози. Він може також включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору або для користувача, у тому числі інші буфери, розріджувачі, наповнювачі, голки та шприци.
ПРИКЛАДИ
Нижче наведені приклади способів і композицій даного винаходу. Зрозуміло, що з урахуванням загального опису, наведеного вище, можуть бути реалізовані різні інші варіанти втілення.
Приклад 1. МС-мо-РАВ-рірвой 51. 2-нітробензол-1,3-діол 1 гідрували газоподібним воднем над паладієвим каталізатором на вуглецевому носії в етанолі з утворенням 2-амінобензол-1,3-діолу 2, виділеного у вигляді хлористоводневої солі (Фіг. 23А і 238). Захист однієї з груп 2, що здійснюється за допомогою трет-бутилдиметилсиліл хлориду та триетиламіну в дихлорметані/ тетрагідрофурані, призводив до утворення 2-аміно-3-(трет-бутилдиметилсилілокси)фенолу 3. Рифаміцин 5 (СпетезПпийе Іпс.,
Егетопі, СА, О5 7342011; 005 7271165; 05 7547692) вводили в реакцію з З у реакції окисної конденсації з двоокисом марганцю або газоподібним киснем у толуолі при кімнатній температурі бо з утворенням ТВ5-заміщеного бензоксазинорифаміцину 4. Реакція 4 з піперидин-4-аміном і двоокисом марганцю призводила до утворення піперидил бензоксазинорифаміцину (рірвок) 5.
Піперидил бензоксазинорифаміцин (рірвок) 5 (0,02 ммоль) і 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо- 2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4- нітрофеніл карбонат 6 (0,02 ммоль) змішували в ОМЕ (0,4 мл) при кімнатній температурі (КТ).
До цієї суміші додавали 2,5 еквіваленти М,М'-діїззопропілетиламіну. Розчин перемішували протягом від однієї до приблизно 12 годин і контролювали утворення продукту за допомогою
ІЇС/М5. По закінченні реакції розчин розбавляли ЮОМЕ, піддавали ВЕРХ й очищали в кислих умовах з одержанням МО -мо-РАВ-рірвок 51. М/2 - 1498,9. Вихід 40905.
Приклад 2. МО-ІК-РАВ-рірвой 52.
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, 6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-
М-((5)-1-((5)-5-гуанідино-1-(4-(гідроксиметил)феніламіно)-1-оксопентан-2-іламіно)-1-оксо-3- фенілпропан-2-іл)угексанамід 12 перетворювали в 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н- пірол-1-ілугексанамідо)-3-фенілпропанамідо)-5-гуанідинопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 13. й (в) он / но ей аа й а у о Но г Н
НМ 12 нм мно (в) (е) / о ц о дур» аа
М до ІФ о Н г Н МО» ї 13
Піперидил бензоксазинорифаміцин (рірвокг) 5 (0,02 ммоль) і 13 (0,02 ммоль) змішували в
ОМЕ (0,4 мл) при кімнатній температурі (ВТ). До цієї суміші додавали 2,5 еквіваленти М,М'- діізопропілетиламіну. Розчин перемішували протягом від однієї до приблизно 12 годин і контролювали утворення продукту за допомогою І С/М5. Після закінчення реакції розчин розбавляли ОМЕ, піддавали ВЕРХ й очищали в кислих умовах з одержанням МО-ІК-РАВ-рірвов 52. М/2 - 15458. Вихід 3295.
Приклад 3. МР-мс-РАВ-рірвой 53.
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, 6-(2-(2-(2-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н- пірол-1-іл)етоксі)етоксі)зацетамідо)-М-((5)-1-((5)-1-(4-(гідроксиметил)феніламіно)-1-оксо-5- уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)угексанамід 14 перетворювали в 4-(175,205)- 1-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-17-ізопропіл-8,15,18-триоксо-20-(3-уреїдопропіл)-3,6- діокса-9,16,19-триазагенейкозанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 15.
о Н о но Дн фею у,
Х Н о Н о о т » 14 МН ом
Х
() Н в) но є, в) флот, у Фі
Х Но хх н МО» о о т 15 МН бек
Піперидил бензоксазинорифаміцин (рірвокг) 5 (0,02 ммоль) і 15 (0,02 ммоль) змішували в
ОМЕ (0,4 мл) при кімнатній температурі (ВТ). До цієї суміші додавали 2,5 еквіваленти М,М'- дізопропілетиламіну. Розчин перемішували протягом від однієї до приблизно 12 годин і контролювали утворення продукту за допомогою І С/М5. Після закінчення реакції розчин розбавляли ЮОМЕ, піддавали ВЕРХ й очищали в кислих умовах з одержанням МР-мс-РАВ- рірвок 53. М/2 - 1644,8. Вихід 57965.
Приклад 4. МС-мс-РАВ-диметилрірвок 54.
Реакція М,М-диметилпіперидин-4-аміну з ТВ5-заміщеним бензоксазинорифаміцином 4 давала диметилпіперидил бензоксазинорифаміцин (диметил рірвок) 7 (Фіг. 24).
Альтернативно, (5-фтор-2-нітро-1,3-фенілен)біс(окси)біс(метиленіудибензол 9 гідрували газоподібним воднем над паладієвим каталізатором на вуглецевому носії в тетрагідрофурані/ метанолі для видалення бензильних груп з утворенням 2-аміно-5-фторбензол-1,3-діолу 10.
Комерційно доступний рифаміцин З або натрієва сіль рифаміцину ЗМ (СпетеПпийіе Іпс.,
Егетопі, СА) реагували з 2-аміно-5-фторбензол-1,3-діолом 10 у реакції окисної конденсації на повітрі або у фероціаніді калію в етилацетаті при 60 Сб з утворенням фторбензоксазинорифаміцину 11. Заміна фтору на М,М-диметилпіперидин-4-амін призводила до утворення диметил рірвок 7 (Фіг. 25А і 258). 6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)-М-((5)-1-((5)-1-(4-(гідроксиметил). феніламіно)-1-оксо- 5-уреїдопентан-2-іламіно)-З-метил-1-оксобутан-2-ілугексанамід 8, отриманий відповідно до методик, описаних у УМО 2012113847; 05 7659241; 5 7498298; 005 20090111756; 05 20090018086; 005 6214345; Юиромснік еї а! (2002) Віосопіпдаїє Спет. 13(4):855-869 (1,009 г, 1,762 ммоль, 1,000, 1009 мг) змішували з М.М-диметилформамідом (6 мл, 77 ммоль, 44, 5700 мг). До цієї суміші додавали розчин тіонілхлориду (1,1 еквіваленту, 1,938 ммоль, 1,100, 231 мг) у дихлорметані (ОСМ) (1 мл, 15,44 ммоль, 8,765, 1325 мг) по краплям (1/2 додавали протягом 1 години, розчин перемішували протягом однієї години при кімнатній температурі (КТ) і половину, що залишилася, далі додавали протягом однієї години). У розчину зберігався жовтий колір. Далі по краплям обережно додавали 0,6 еквіваленту тіонілхлориду у вигляді розчину в 0,5 мл ОСМ.
Зо Колір реакційної суміші залишався жовтим, і її перемішували в закритому стані протягом ночі при КТ. Утворення продукту реакції бензилхлориду 9 контролювали за допомогою І С/М5 (до виходу 8895). Далі по краплям обережно додавали 0,22 еквіваленту тіонілхлориду в 0,3 мл ОСМ.
Коли вихід бензилхлориду 9 досягав 9295, реакційну суміш барботували М». Речовину концентрували з 0,3 М до 0,6 М. Продукт М-((5)-1-((5)-1-(4-(хлорметил)феніламіно)-1-оксо-5- уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол- 1- іл)угексанамід 9 зберігали в холодильнику у вигляді 0,6 М розчину та використовували в такому вигляді. М/2 591,3, вихід 9295.
У сосуді М-((5)-1-((5)-1-(4-(хлорметил)феніламіно)-1-оксо-5-уреїдопентан-2-іламіно)-3- метил-1-оксобутан-2-іл)-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексанамід 9 (0,9 ммоль) охолоджували до 0 "С і додавали диметилпіперидил бензоксазинорифаміцин (диметил рірвок)
7 (0,75 г, 0,81 ммоль, 0,46, 750 мг). Суміш розбавляли 1,5 мл ОМЕ для одержання концентрації 0,3 М. Суміш перемішували на повітрі протягом 30 хвилин. Додавали М,М-діїззопропілетиламін (3,5 ммоль, 3,5 ммоль, 2,0, 460 мг) і реакційну суміш перемішували протягом ночі у відкритому для доступу повітря стані. Протягом 4 днів до реакційної суміші при постійному перемішуванні з доступом повітря 4 рази додавали 0,2 еквіваленти основи М,М-діззопропілетиламін до припинення розвитку реакції. Реакційну суміш розбавляли ОМЕ й очищали за допомогою ВЕРХ (20-6095 АСМ/ЕАН2гО) декількома порціями з одержанням МС-мс-РАВ-диметилрірвОкК 54.
М/2-1482,8, вихід: 32905.
Приклад 5. МС-мс-РАВ-монометилрір, деацетилВОКк 55.
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, М-метилпіперидин-4-амін і ТВ5- заміщений деацетил, бензоксазинорифаміцин вводили в реакцію з двоокисом марганцю з утворенням монометилпіперидил бензоксазинорифаміцину (рірвок) 16. (в)
Лі, Ге! | х- он о с чаОН ув лук
НМ нм о с | 16 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)гексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 6 і 16 реагували з утворенням МО-мс-РАВ- монометилрір, деацетилВОН 55 з виходом 2695 (М/2 - 1456,5).
Приклад 6. МС-мс-РАВ-монометилрірвок 56.
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, М-метилпіперидин-4-амін і ТВ5- заміщений бензоксазинорифаміцин 4 вводили в реакцію з двоокисом марганцю з утворенням монометилпіперидил бензоксазинорифаміцину (рірвок) 17. (9)
І, о | х- Ж он 9 | дао /в лук у о о НО,, "у
НМ НМ о «Ла 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)гексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 6 і 17 реагували з утворенням МО-мс-РАВ- монометилрірВвог 56 з виходом 2595 (М/2 - 1471,0).
Приклад 7. МО-мс-РАВ- рір, деацетилВОй 57.
Зо Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, піперидин-4-амін і ТВ5-заміщений деацетилбензоксазинорифаміцин 18 вводили в реакцію з двоокисом марганцю з утворенням піперидил, десацетилбензоксазинорифаміцину (рір деацетил ВОНВ) 19.
(в) (в) лі, Ге! | х- Ли, Ге! | х-- он і) | сх (Фін) он Го! Є он
СО онеюН --ж /в служ о то НО, и чу, фі; ото НО, и,
НМ о ном НК. що с 18 хх | 19
Піперидил, десацетилбензоксазинорифаміцин 19 (0,02 ммоль) і 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо- 2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4- нітрофеніл карбонат 6 (0,02 ммоль) реагували з утворенням МО-мс-РАВ-рір, деацетилВОВ 57.
М/2 - 14566. Вихід 13965.
Приклад 8. МС-мс-РАВ-рифабутин 58.
З ух //,, о | Іс) ІФ) (є) щу о
М он ) ' пз Ж
НМ он
М Ге) НО,, чу
НМ о
Ж 20
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, дез-ізобутил рифабутин 20 (0,02 ммоль) і 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 6 (0,02 ммоль) реагували з утворенням МО- мое-РАВ-рифабутину 58. М/2-1389,6. Вихід 2195.
Приклад 9. МО-С4С2АРАССа-рірвов («коровий пептид» наведений в 5ЕО 10 МО: 126) 59. о о) но но но но ою о в ти во
Н Н ж НН Н
Х о о) (о) о) ї о 21
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, малеіїмід пептид 21 кон'югували з піперидил бензоксазинорифаміцином (рірВОВ) 5 у стандартних для формування амідного зв'язку умовах з утворенням МО-ССАБдСсаа-рірвок («коровий пептид» наведений в 5ЕО І
МО: 126) 59. М/2-1626,0. Вихід 13965.
Приклад 10. МС-мо-РАВ-тії 60. (в); г/л Ге! | х-- Х но о ца
Со лу о то НО, и, ни Ге! 22
Хе
У невеликому флаконі 0,05 мл 0,6М розчину М-((5)-1-((5)-1-(4-(хлорметил) феніламіно)-1- оксо-5-уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол- 1- іл)угексанаміду 9, отриманого відповідно до процедури, описаної у Прикладі 4, охолоджували до 0 С і додавали 1 еквівалент бензоксазинорифаміцину 22, після чого суміш перемішували протягом 5 хвилин. До цього розчину при 0 «С додавали К»СОз (15 еквівалентів) і стінки флакона промивали 0,05 мл ОМЕ. Реакційну суміш перемішували у відкритому для доступу повітря стані при кімнатній температурі протягом 1-4 годин. Коли 9 повністю вступало в реакцію, тверді речовини відфільтровували, і зібраний фільтрат розбавляли ОМЕ. Після очищення за допомогою ВЕРХ одержували МО-мс-РАВ-тії 60 з виходом 1195 (М/2 - 1356,9).
Приклад 11. МС-мс-РАВ-диметилрір, деацетилВОк 61. (6) /, Ге) | -
Фін о | МИ он /г онАХ. хон
НМ й у 23 в:
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 4, М-((5)-1-((5)-1-(4- (хлорметил)феніламіно)-1-оксо-5-уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)-6-(2,5- діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1-іл)угексанамід 9 вводили в реакцію з диметилпіперидил, деацетилбензоксазинорифаміцином (диметил, деацетил рірвокг) 23 з утворенням МО-мс-РАВ- диметилрір, деацетилВОй 61. М/2 - 144066.
Приклад 12. МС-мо-РАВ-піперазвтк 62. (в) і, о | ло о (6) Кк) о-С
СС он «он гм 5 ге) НО,, Щи нм. НМ. о і 24
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро- 1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат б вводили в реакцію з піперазино бензтіазинорифаміцином (піперазВтТА) 24 з утворенням МО-мс-РАВ-піперазвВт й 62. М/2 - 1483,7.
Приклад 13. МОС-мс-РАВ-піпераз, деацетилВТ А 63.
(в) /І,, о | ке о Он
Як 8 о НО, ил нм. НМ. о і 25
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро- 1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат б вводили в реакцію з піперазино, деацетилбензтіазинорифаміцином (рірвтЕ) 25 з утворенням МО-мс-РАВ-піпераз, деацетилВТА 63. М/2 - 1441,6.
Приклад 14. МС-мо-РАВ-піпераз, деацетилВОк 64. (8); / ІТ
Іо Ко,
КУ он о | (Фін! (м о оно, ит, нм. НМ. о кі 26
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро- 1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат б вводили в реакцію з піперазил, деацетилбензоксазинорифаміцином (деацетил рірвовг) 26 з утворенням МО-ус-РАВ-піпераз, деацетилВОй 64. М/2 - 14416.
Приклад 15. МС-мо-РАВ-піперазвок 65. (о) / М 7, Ге! Ко) (Ф) о КУ ох он (м (Ф) о НО,, чу нм. НМ. о кі 27
Після закінчення процедури, описаної у Прикладі 1, 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро- 1Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат б вводили в реакцію з піперазил бензоксазинорифаміцином (піперазилВОй) 27 з утворенням МО-мс-РАВ-піперазвВой 65. М/2 - 1482,7.
Приклад 16. МО-мо-бісРАВ-диметилрірВвВОй 66.
У флаконі 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-іл)угексанамідо)-3- метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4-нітрофеніл карбонат 6 (1,56 г, 2,11 ммоль,
10095 за масою) змішували з ОМЕ (55 еквівалентів, 116 ммоль, 55,0, 8,5 г) і перемішували при
ВТ. До цієї мутної жовтої суміші додавали (4-амінофеніл)метанол (РАВ, 1,1 еквівалента, 2,33 ммоль, 1,10, 286 мг) і 1-гідроксибензотриазол (0,37 еквівалента, 0,782 ммоль, 0,370, 106 мг) з наступним додаванням М,М'-дізопропілетиламіну (1 еквівалента, 2,11 ммоль, 1,00, 276 мгГг).
Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин, утворення продукту реакції контролювали за допомогою І С/М5. Додатково додавали 1 еквівалент М,М'-діззопропілетиламіну (основа Хуніга) і 100 мг (4-амінофеніл)метанолу. Реакційну суміш перемішували протягом ночі при КТ у закритому стані. Щоб преципітувати продукт, по краплях додавали приблизно 0,5 л діетилового ефіру. Ефір декантували, тверду речовину розчиняли в ОМЕ і прямо очищали за допомогою
ВЕРХ декількома порціями з утворенням 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1- ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4- (гідроксиметил)фенілкарбамату 28 (0,435 г) з загальним практичним виходом 2895 (М/2: 722,5), що має структуру: он о і) і Я мя сучА
М. чи МИ Н о но і Н
Д
28
Нам То .
Після процедури, описаної у Прикладі 4, 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1- ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4- (гідроксиметил)фенілкарбамат 28 вводили в реакцію з тіонілхлоридом з утворенням 4-((5)-2- ((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол-1-ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5- уреїдопентанамідо)бензил 4-(хлорметил)фенілкарбамату 29 з практичним виходом 4795 (М/2: 740,4), що має структуру:
СІ
) (в) і ХХ НА суч мли МИ Н о но і Н
МН наго 29
Після процедури, описаної у Прикладі 4, 4-((5)-2-((5)-2-(6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1Н-пірол-1- ілугексанамідо)-3-метилбутанамідо)-5-уреїдопентанамідо)бензил 4-(хлорметил)фенілкарбамат 29 вводили в реакцію з диметилпіперидил бензоксазинорифаміцином (диметил рірвок) 7 з утворенням МОС-мс-бісРАВ-диметилрірвок. 66 з виходом 595 (М/7: 16321).
Зо Приклад 17. МС-мо-РАВ-метилпіпераз ВОК 67.
(в)
Й, о | «о р
КУ он 9 | о он КУ г (в) о НО, чу
А нм о і 30
Після процедури, описаної у Прикладі 4, М-((5)-1-((5)-1-(4--(хлорметил)феніламіно)-1-оксо-5- уреїдопентан-2-іламіно)-3-метил-1-оксобутан-2-іл)-6-(2,5-діоксо-2,5-дигідро-1 Н-пірол- 1- іл)угексанамід 9 вводили в реакцію з метилпіперазино бензоксазинорифаміцином (метил піперазВоР) 30 з утворенням МО-мкс-РАВ-метилпіпераз ВОВ 67. М/2 - 145468.
Приклад 18. Внутрішньоклітинні МА5А захищені від антибіотиків.
Цей приклад доводить, що МАБА можуть виживати всередині клітин /л у//о. При інфекції внутрішньоклітинні МА5ЗА можуть виживати та захищені від лікування антибіотиками (такими як
ЗОС ванкоміцин), що дозволяє інфекції передаватись від однієї клітини до іншої.
Визначення МІС для позаклітинних бактерій. МІС для позаклітинних бактерій визначали, роблячи серійні розведення антибіотиків в 2 рази в триптичному соєвому бульйоні. Розведення антибіотиків робили в чотирьох повторах в 96 ямкових планшетах для культивування. МК5ЗА (МеЕ5384 штам О5АЗОО) брали з експоненціально зростаючої культури та розбавляли до 1х107
КУО/мл. Бактерії культивували у присутності антибіотика протягом 18-24 годин з перемішуванням при 37 С, і ріст бактерій визначали за показниками оптичної щільності (00) при 630 нм. МІС визначали як дозу антибіотика, що інгібує ріст бактерій на »9095.
Визначення МІС для внутрішньоклітинних бактерій. Внутрішньоклітинну МІС визначали на бактеріях, поглинених мишачими перитонеальними макрофагами. Макрофаги вирощували в 24 ямкових планшетах для культивування до щільності 4х105 клітин/мл та інфікували МКЗА (МК5384 штам О5БАЗО0) у співвідношенні 10-20 бактерій на макрофаг. Культури макрофагів підтримували в середовищі для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для інгібування росту позаклітинних бактерій, і тестовані антибіотики додавали в середовище для росту через 1 день після інфекції. Виживання внутрішньоклітинних бактерій оцінювали через 24 години після додавання антибіотиків. Макрофаги лізували у буферному сольовому розчині Хенкса з додаванням 0,195 бичачого сироваткового альбуміну і 0,195 ТІйоп-Х, і робили серійні розведення лізату у фосфатно-сольовому буферному розчині, що містить 0,0595 Пмуееп-20.
Кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, визначали, роблячи посіви на чашках із триптичним соєвим агаром з додаванням 595 дефібринованої овечої крові.
Зо Виділення перитонеальних макрофагів. Перитонеальні макрофаги виділяли з черевної порожнини мишей Ваїр/с у віці 6-8 тижнів (Спагіез Кімег І арогафогіе5, Ноїйе(ег, СА). Для підвищення виходу макрофагів мишам попередньо робили внутрішньочеревинну ін'єкцію 1 мл тіогліколевого середовища (Весіоп бісКіпхоп). Тіогліколеве середовище готували в концентрації 495 у воді, стерилізували автоклавуванням і використовували через 20 днів - 6 місяців.
Перитонеальні макрофаги збирали через 4 дні після введення тіогліколяту, промиваючи перитонеальну порожнину холодним фосфатно-сольовим розчином. Макрофаги вирощували на середовищі Ігла, модифікованому за способом Дульбекко, (МЕМ) з додаванням 1095 фетальної телячої сироватки і 10 мМ НЕРЕХБ, без антибіотиків, до щільності 4х10» клітин/ямку в 24-ямкових чашках для культивування. Макрофаги культивували протягом ночі, щоб вони прикріпилися до чашки. Цей аналіз також використовували для тестування внутрішньоклітинного знищення в нефагоцитарних типах клітин. Лінії клітин МО63З (СКІ -1427) і
А5Б49 (ССІ 185) одержували з АТСС і підтримували в середовищі для культивування тканин
ЕРМІ 1640 з додаванням 10 мМ Нерез і 10 95 фетальної телячої сироватки (КРМІ-10). Клітини
НОМЕС одержували від Їопла і підтримували у повному середовищі для культивування ендотеліальних клітин ЕСМ (І опа, УмаїЇКегеміПе, МО).
Інфікування макрофагів опсонізованими МК5ЗА. Штам МКЗА ОБАЗОО (МК5384) одержували з репозиторію МАКЗА (Спапійу, Мігдіпіад. У деяких експериментах використовували штам 5. ацгеив Меуллап (АТСС25904). У всіх експериментах бактерії культивували в триптичному соєвому бульйоні. Для оцінки внутрішньоклітинного знищення, опосередкованого ААС, ОБАЗО0 брали з експоненціально зростаючої культури та промивали в НВ (збалансований сольовий розчин Хенкса з додаванням 10 мМ НЕРЕЗ і 0,195 бичачого сироваткового альбуміну). ААС або антитіла розбавляли в НВ та інкубували з бактеріями протягом 1 години, щоб відбулося зв'язування антитіл з бактеріями (опсонізація), і опсонізовані бактерії використовували для інфікування макрофагів при співвідношенні 10-20 бактерій на макрофаг (4х105 бактерій в 250 мкл НВ на ямку). Безпосередньо перед інфікуванням макрофаги попередньо промивали безсироватковоим середовищем ОМЕМ та інфікували, проводячи інкубацію при 37 "С у зволожуючому інкубаторі для культивування тканин з 595 СО», щоб пройшов фагоцитоз бактерій. Через 2 години суміш для інфікування видаляли та заміняли нормальним середовищем для росту (ОМЕМ з додаванням 1095 фетальної телячої сироватки, 10 мМ
НЕРЕФЗ), і додавали гентаміцин у концентрації 50 мкг/мл для запобігання росту позаклітинних бактерій. Наприкінці періоду інкубації макрофаги промивали безсироватковоим середовищем і клітини лізували в НВ з додаванням 0,195 ТіІйоп-Х (лізис макрофагів без ушкодження внутрішньоклітинних бактерій). У деяких експериментах життєздатність макрофагів оцінювали наприкінці періоду культивування, детектуючи вивільнення цитоплазматичної лактатдегідрогенази (ОН) у супернатант клітинної культури з використанням набору ТОН
Суюїохіспу Оеїесіоп Кії (Ргодисі 11644793001, НВоспе Оіадповіїс5 Согр, Іпаіапароїїв, ІМ).
Супернатанти збирали й аналізували відразу відповідно до інструкцій виробників. Серійні розведення лізату робили у фосфатно-сольовому буферному розчині з додаванням 0,0595
Тмжеєеп-20 (для руйнування агрегатів бактерій), і загальну кількість бактерій, що вижили, визначали, роблячи посіви на триптичний соєвий агар з 595 дефібринованою овечою кров'ю.
Отримання інфікованих МЕКЗА перитонеальних клітин. 6-8 тижневих самок мишей А/) (ШАХ М
Місе, даскбоп Гарогайгеб5) інфікували 1х1!085 КУО штаму ИБАЗО0О МА5384 шляхом перитонеальної ін'єкції. Перитонеальні змиви збирали через 1 день після інфекції та інфіковані перитонеальні клітини обробляли 50 мкг/мл лізостафіну, розведеного у буфері Нере5 з додаванням 0,195 БСА (буфер НВ), протягом 30 хвилин при 37 "С. Перитонеальні клітини далі промивали 2х крижаним буфером НВ. Перитонеальні клітини розбавляли до 1х105 клітин/мл у середовищі для культивування тканин КРМІ 1640 з додаванням 10 мМ Нерезв, 10 95 фетальної
Зо телячої сироватки та 5 мкг/мл ванкоміцину. Вільні МКЕЗА з первинної інфекції зберігали протягом ночі при 4 9С у фосфатно-сольовому буферному розчині як контроль для позаклітинних бактерій, які не піддавалися знищенню нейтрофілами.
Перенесення інфекції з перитонеальних клітин в остеобласти. Лінію клітин остеобластів
МО63 одержували з АТСС (СКІ -1427) і підтримували в середовищі для культивування тканин
КРМІ 1640 з додаванням 10 мМ Нерев5з і 10 906 фетальної телячої сироватки (КРМІ-10).
Остеобласти вирощували в 24-ямкових планшетах для культивування та культивували до одержання безперервного шару клітин. У день експерименту остеобласти промивали один раз
ЕРМІ (без добавок). МЕЗА або інфіковані перитонеальні клітини розбавляли у повній КРМІ-10, і безпосередньо перед інфікуванням до них додавали ванкоміцин до 5 мкг/мл. Перитонеальні клітини додавали до остеобластів у концентрації 1х105 перитонеальних клітин/мл. Зразок клітин лізували 0,195 Т/йоп-х для визначення фактичної концентрації живих внутрішньоклітинних бактерій під час інфекції. Фактичний титр для всіх інфекцій визначали, роблячи посіви серійних розведень бактерій на триптичний соєвий агар з 595 дефібринованою овечою кров'ю.
Остеобласти МОб63 вирощували в 4-ямкових скляних слайдах-камерах і культивували в середовищі для культивування тканин КРМІ 1640 з додаванням 10 мМ Нерез і 10 956 фетальної телячої сироватки (КРМІ-10) до одержання безперервного шару клітин. У день інфекції ямки промивали безсироватковоим середовищем та інфікували суспензією інфікованих перитонеальних клітин або штамом ИБАЗО0О МЕ5А, розведеними у повній ЕРМІ-10О з додаванням 5 мкг/мл ванкоміцину. Через день після інфекції клітини промивали фосфатно- сольовим буфером (РВЗ) і фіксували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі у РВ5 з 2965 параформальдегідом. Клітини Зх промивали РВ5 і пермеабілізували у РВЗ5 з 0,195 сапоніном протягом 30 хвилин при кімнатній температурі.
Імунофлуоресценція. МЕК5ЗА ідентифікували фарбуванням за допомогою 20 мкг/мл кролячого анти-Зіарп 20920 (арсат, Сатрбгідде, МА) з наступним фарбуванням антитілами проти антитіл кролика, міченими родаміном (Часкзоп ІттипоКезеагсі, 711-026-152). Клітинні мембрани перитонеальних клітин офарблювали комплексом бета субодиниця холеротоксину- біотин (Іпмігодеп, Сагірайд, СА) з наступним фарбуванням стрептавідином Суб (ВО Віозсіепсе5 зап уозе, СА). Зв'язування холеротоксину з перитонеальними клітинами підтверджували спільним фарбуванням анти-СО11Б6 АЇеха 488 клон М1/70 (ВО Біозсіепсе5). Предметні стекла бо покривали гістологічним середовищем Ргоїопда соїй з САРІ (Іпмігодеп, Сагізрай СА). Предметні стекла візуалізували з використанням конфокального мікроскопа Іеіса ЗРЕ. Зображення одержували у вигляді серій зрізів за віссю 2 і поєднували для одержання максимально об'ємних зображень.
Виживання 5. ашгеиз всередині клітин ссавців забезпечує життєздатну нішу, що дозволяє розвитися персистуючій інфекції при антибіотикотерапії. 5. ашгеих можуть інфікувати деякі типи клітин ссавців і виживати всередині них, включаючи такі клітини як нейтрофіли, макрофаги, остеобласти й епітеліальні клітини (Саглопі, С. апа МУ. Г. КеПеу (2009) Пепаз Місгторбіо! 17(2): 59- 65). Для того, щоб прямо протестувати, чи захищені внутрішньоклітинні МАКЗА від дії антибіотиків, автори порівнювали здатність ряду клінічно схвалених антибіотиків знищувати позаклітинні МЕ5А, які культивуються в стандартному середовищі для росту бактерій, з їхньою здатністю знищувати внутрішньоклітинні МЕЗА, що перебувають всередині мишачих макрофагів (Таблиця 1). Для цього аналізу вибрали мишачі перитонеальні макрофаги, оскільки ці клітини являють собою генетично нормальні первинні клітини, що є природним компонентом вродженої імунної відповіді на 5. ашеив. Аналіз підтвердив, що ці клітини легко інфікуються та культивуються /л уйго. МКЗА можуть виживати всередині клітин до шести днів після інфекції макрофагів (Кибіса, М., К. с«зи;іК, еї а). (2008) Ріо Опе З(1): е1409). Для тестування внутрішньоклітинної дії антибіотиків макрофаги інфікували МЕ5А та культивували у присутності гентаміцину, антибіотика, про який відомо, що він неактивний у фаголізосомах через низький рівень клітинного захоплення цього антибіотика (Мацдаих, Р. апа Р. А. М/аідмоде! (1979)
Апіїтістоб Адепіз СпетоїНег! 16(6): 743-749). Тестовані антибіотики додавали до культурального середовища (на додаток до гентаміцину) через один день після інфекції в діапазоні доз, вибраних таким чином, щоб включати клінічно досяжні рівні в сироватці крові (показані у вигляді
Стах у сироватці крові в Таблиці 1). Цей аналіз показав, що хоча позаклітинні МК5А дуже чутливі інгібуванню росту низькими дозами ванкоміцину, даптоміцину, лінезоліду або рифампіцину в рідкій культурі, всі чотири види антибіотиків не знищували той же самий штам внутрішньоклітинних МКЗА, що перебувають всередині макрофагів. Примітно, що, навіть використовуючи рифампіцин, що вважається одним із кращих антибіотиків для лікування внутрішньоклітинних інфекцій, таких як туберкульоз, вдалося досягти мінімального знищення внутрішньоклітинних МЕ5А за увесь час експерименту та з усіма режимами дозування.
Коо)
Таблиця 1
Мінімальні інгібуючі концентрації (МІС) для деяких антибіотиків
Позаклітинні Внутрішньоклітинні Стах у сироватці крові
Антибіотики (АБх) МА5ЗА МА5ЗА (мкг/мл)
МІС (мкг/мл) МІС (мкг/мл) 0000 дапомідиннї/////17777771411|1111мою 11111180
Наведені вище дані підтверджують, що внутрішньоклітинні бактерії захищені від антибіотиків у той час, коли вони перебувають всередині клітин. Проте, МА5А не вважаються дійсними внутрішньоклітинними патогенами, у тому розумінні, що вони не можуть інфікувати сусідні клітини прямо за рахунок переносу з клітини в клітину, і більшість інфікованих клітин будуть лізуватись, вивільняючи при цьому внутрішньоклітинні бактерії. Таким чином, зберігається можливість того, що внутрішньоклітинний пул після вивільнення неминуче буде піддаватися впливу позаклітинних антибіотиків, щонайменше, тимчасово, навіть якщо бактерії були негайно захоплені сусідніми клітинами. Поглинання вільних МАБА макрофагами триває від 15 до 90 хвилин (дані не показані), що припускає, що якщо бактерії змогли протистояти короткому впливу антибіотика, вони можуть залишатися захищеними у внутрішньоклітинній ніші, послідовно переміщаючись від однієї вмираючої клітини до нової клітини-хазяїна. Щоб визначити, чи досить короткого впливу антибіотиків, щоб знищити МА5БА, автори тестували ванкоміцин, сучасний стандарт лікування МА5А інфекцій, і рифампін. МЕЗА брали з активно зростаючої культури та розбавляли до 1х105 бактерій/мл у нормальному середовищі для росту.
Антибіотики додавали у двох дозах, що перебувають між значеннями 2х і 10х очікуваної мінімальної інгібуючої концентрації (МІС). Проби відбирали в різний час між 30 хвилинами і 5 годинами, і антибіотик видаляли центрифугуванням і розведенням. Загальну кількість бактерій, що вижили, у культурі визначали, роблячи посіви на чашки з агаром.
На Фіг. 1 показане порівняння часу знищення МЕ5А, що активно діляться, для ванкоміцину (мапсо) і рифампіцину (Кіїаї. МАК5БА культивували протягом 5 годин у середовищі Т5В у присутності антибіотиків. У зазначені моменти часу відбирали проби культури та видаляли антибіотик центрифугуванням. Загальну кількість бактерій, що вижили, визначали в кожний момент часу, роблячи посіви. Ванкоміцин тестували в концентраціях 2 мкг/мл (білий квадрат) і 20 мкг/мл (чорний квадрат). Рифампін тестували в концентрації 0,02 мкг/мл (білий трикутник) і 0,2 мкг/мл (чорний трикутник). Ці дані (Фіг. 1) показали, що хоча обидва антибіотики ефективно інгібували ріст бактерій, і через 5 годин кількість життєздатних бактерій зменшилася в 100 разів, знищення бактерій відбувалося поступово протягом 5 годин спостережень, і 9095 бактерій, що залишалися життєздатними протягом перших двох годин обробки антибіотиком, потенційно могли бути поглинені клітинами-хазяїнами.
Автори аналізували перенесення інфекції внутрішньоклітинних пулів МКЗА у пермісивні внутрішньоклітинні ніші у присутності ванкоміцину. 5. ашйеиз може виживати всередині остеобластів, і внутрішньоклітинні пули 5. ашеив спостерігали у пацієнтів з остеомієлітом, станом, при якому хронічна інфекція 6. ашеивх, як відомо, не піддається лікуванню антибіотиками (Тпмайез апа Сапі, (2011) Маїшге Неміємує Містобіоіоду 9:215-222; ЕЦпдоп еї аї., (2006) У. Оппоредіс Резеагсй 24(1): 87-93; Вовзе еї аї., (2005) У. Вопе апа доїпі Зигдегу, 87(6): 1343-1347). Був розроблений аналіз /л уйго з використанням лінії клітин остеобластів МОб3, оскільки ця лінія клітин, як повідомлялося, може містити внутрішньоклітинні 5. ашгеиз (Саггопі апа КепПу, (2008) Тгепаз іп МісгобріоІоду). Цей аналіз підтвердив, що МК5ЗА можуть інфікувати клітини МОб63, і життєздатні внутрішньоклітинні бактерії можуть бути виділені з інфікованих клітин МО63З протягом періоду часу до 6 днів /л м/го. Для одержання пулу внутрішньоклітинних 5. ашеив перитонеальні клітини збирали з мишей, які були інфіковані шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції МК5А (Фіг. 2).
На Фіг. 2 показане перенесення інфекції з інфікованих перитонеальних клітин в остеобласти у присутності ванкоміцину. Для одержання пулу внутрішньоклітинного 65. ашеив мишей А// інфікували МЕ5А, і інфіковані перитонеальні клітини брали через 1 день після інфекції.
Аналогічним чином отримані клітини, як повідомлялося, містять життєздатні внутрішньоклітинні бактерії, які можуть переносити інфекцію в моделі інфекції /л у//о (Стезпат евї а! / /ттипо! 2000; 164:3713-3722). Інфіковані перитонеальні клітини, складаються, в основному, з суміші нейтрофілів і макрофагів, і приблизно 1095 клітин містять внутрішньоклітинні бактерії. Клітини обробляли лізостафіном для видалення позаклітинних бактерій і суспендували в середовищі для росту з додаванням 5 мкг/мл ванкоміцину. Зразок перитонеальних клітин, що використовують для інфекції, лізували для визначення точної дози життєздатних внутрішньоклітинних МК5БА у момент інфікування, і різні дози вільних внутрішньоклітинних
МЕАЗА також розбавляли в середовищі з ванкоміцином для порівняння. Перитонеальні клітини (внутрішньоклітинні МЕ5А) або вільні бактерії (позаклітинні МК5А) далі додавали до моношару остеобластів МОб6З3 і культивували протягом 4 годин (білі стовпчики) або 1 дня (чорні стовпчики). Загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, у кожній ямці визначали, роблячи посіви лізатів на планшети з агаром. Внутрішньоклітинні МКЗА були захищені від ванкоміцину на відміну від позаклітинних МК5А контролів. Ямки інфікували З3х107 внутрішньоклітинних бактерій, кількість яких досягла 8750 (приблизно 1 третина інфекційної дози) через 1 день після інфекції, тоді як позаклітинні бактерії ефективно знищувались, так що аналогічна доза вільних МЕ5А дала тільки 375 внутрішньоклітинних бактерій через 1 день після інфекції.
За допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії також було продемонстроване перенесення інфекції з перитонеальних клітин в остеобласти МОб63. Перитонеальні клітини збирали з мишей через 1 день після інфікування МКЗА й обробляли лізостафіном для знищення будь-яких забруднюючих бактерій (внутрішньоклітинна інфекція). Вільні МК5А брали з активно зростаючої культури й промивали у РВЗ (позаклітинна інфекція). Загальну кількість життєздатних бактерій у зразках внутрішньоклітинної та позаклітинної інфекції підтверджували, роблячи посіви на чашки з агаром, і обидва зразки суспенували в середовищі з додаванням 5 мкг/мл ванкоміцину безпосередньо перед додаванням до безперервного шару остеобластів МО63, культивованих у слайдах-камерах. Через один день після інфекції клітини МОб3 промивали для видалення позаклітинних бактерій, пермеабілізували й офарблювали анти-5. ашеив антитілом для ідентифікації внутрішньоклітинних МЕКЗА і холеротоксином, що переважно зв'язується з клітинними мембранами перитонеальних клітин. Всі клітинні ядра також офарблювали САРІ для 60 підтвердження того, що моношар МоОб3 був інтактним. Слайд-камери досліджували за допомогою конфокальної мікроскопії.
Ямки, інфіковані перитонеальними клітинами, містили безперервний моношар клітин МОб3, і перитонеальні макрофаги були добре видні у верхній частині шару МОб63. Багато макрофагів очевидно були інфіковані МК5БА, які були видні у вигляді кластерів червоних бактерій на одноколірному зображенні або у вигляді білих частинок на графічному накладеному зображенні.
На додаток до інфікованих макрофагів були отримані чіткі приклади бактерій, асоційованих тільки з клітинами МОб63. Інфіковані клітини МОб63 також видні в ямках, інфікованих вільними
МЕАЗА. Інфекція вільними МК5ЗА вимагає більше інокуляту для досягнення аналогічного рівня інфекції в клітинах МОб3.
Наведені вище результати свідчать про те, що як вільні, так і внутрішньоклітинні МАЗА можуть виживати та інфікувати клітини МоОб63 у присутності ванкоміцину. Бактерії з внутрішньоклітинної інфекції виживали значно краще після лікування ванкоміцином, ніж вільні бактерії в цих же умовах. Інфекція 3х107 КУО внутрішньоклітинних бактерій давала 8,7х103 КУО внутрішньоклітинних бактерій через 1 день після інфекції. Інфекція аналогічною дозою вільних бактерій давала тільки 375 внутрішньоклітинних бактерій через 1 день після інфекції, що свідчить про те, що внутрішньоклітинні бактерії можуть виживати до 20 разів краще, ніж вільні бактерії. Для всіх інфекційних доз вдавалося виділяти більше внутрішньоклітинних бактерій (в 1,5 - 6 разів) через 1 день після інфекції у порівнянні з 4 годинами після інфекції. Оскільки ванкоміцин після додавання до вільних МЕ5БА повністю інгібує їхній ріст (Фіг. 1), ці дані припускають, що МЕК5БА повинні відтворюватись шляхом внутрішньоклітинного розподілу в якийсь момент незважаючи на вплив ванкоміцину в культуральному середовищі. Хоча МАЗА значно не діляться всередині мишачих макрофагів (неопубліковані спостереження авторів), існує важливе свідчення того, що б. айгеиз може уникати фаголізосоми та відтворюватись шляхом клітинного розподілу в цитоплазмі нефагоцитарних клітин (даггу, Т. М., 5. Метпті, еї аї. (2008) Се// Місгобіо! 10(9): 1801-1814). Взяті разом, наведені вище спостереження дають можливість припустити, що навіть при постійному впливі ванкоміцину вільні МКЗА можуть інфікувати клітини, і внутрішньоклітинні МКЗА можуть переходити з однієї клітини в іншу. Ці механізми виявляють потенційний механізм для підтримки та навіть поширення інфекції при здійсненні постійної антибіотикотерапії.
Зо Приклад 19. Моделі інфекцій /л У//о.
Модель перитоніту. 7-тижневих самок мишей А/) (даскзоп І арогафогіе5) інфікували шляхом перитонеальної ін'єкції 5х1!07 КУО О5БАЗО0. Мишей умертвляли через 2 дні після інфекції та черевну порожнину промивали 5 мл холодного фосфатно-сольового буферного розчину (РВ5Б).
Нирки гомогенізували у 5 мл РВ5, як описано нижче для моделі внутрішньовенної інфекції.
Перитонеальні змиви центрифугували протягом 5 хвилин при 1000 об/хв при 4 "С у настільній центрифузі. Супернатант збирали як джерело позаклітинних бактерій, а осад клітин (дебрис), що містить перитонеальні клітини, збирали в якості внутрішньоклітинної фракції. Клітини обробляли 50 мкг/мл лізостафіну протягом 20 хвилин при 37 "С для знищення забруднюючих позаклітинних бактерій. Перитонеальні клітини промивали Зх у крижаному РВ5 для видалення лізостафіну до аналізу. Для підрахунку кількості внутрішньоклітинних КУО перитонеальні клітини лізували в НВ (збалансований сольовий розчин Хенкса з додаванням 10 мМ НЕРЕЗ і 0,195 бичачого сироваткового альбуміну) з 0,195 Тийоп-Х, і серійні розведення лізату робили у
РВЗ з 0,0595 Тмееп-20.
Модель внутрішньовенної інфекції. 7 тижневих самок мишей використовували для всіх експериментів /л умо та інфікування здійснювали шляхом внутрішньовенної ін'єкції у хвостову вену. Мишей А/) (Часкбзоп Га) інфікували дозою 2х1056 КУО. Мишей ВаїБр/с (Спагіе5 Кімег
І абогагогіє5, Ноїїїсїег, СА) інфікували дозою 2х107 КУО. Для вивчення ролі конкуруючих людських До (модель ЗСІЮ МІС) мишам СВ17.5СІО (Спапез Кімег І арогашюгіе5, Ноїіетег, СА) вводили імуноглобулін Саттасага 5/0 ІСІМ (АБО Неанйсаге, Вгоок5 КУ), використовуючи режим дозування, оптимізований для досягнення постійного рівня людських Ідс у сироватці крові 210 мг/мл. ІБІМ вводили у початковій внутрішньовенній дозі 30 мг на мишу з наступним введенням другої дози 15 мг/мишу шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції через 6 годин, і далі
ІБІМ вводили щодня в дозі 15 мг на мишу шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції протягом З послідовних днів. Через 4 години після першої дози ІСБІМ мишей інфікували 2х107 КУО МЕ5А, розведеними у фосфатно-сольовому буфері, шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Мишам, що одержували ванкоміцин, два рази на день робили внутрішньочеревинні ін'єкції 100 мг/кг ванкоміцину, починаючи між 6 і 24 годинами після інфекції, і далі протягом всього дослідження.
Експериментальні терапевтичні агенти (ААС, анти-МЕ5А антитіла або вільний антибіотик диметил-рірВОК) розбавляли у фосфатно-сольовому буферному розчині та вводили шляхом бо однократної внутрішньовенної ін'єкції через 30 хвилин - 24 години після інфекції. Всіх мишей умертвляли на 4 день після інфекції та нирки збирали у 5 мл фосфатно-сольовий буфер. Зразки тканини гомогенізували з використанням сепіемАсз5 різзосіаг "м (Міпнепуїі Віоїтес, Аиригп, СА).
Загальну кількість виділених бактерій на мишу (2 нирки) визначали, роблячи посіви серійних розведень гомогенатів тканини у РВ5 з 0,0595 Тмеєп на триптичному соєвому агарі з 595 дефібринованою овечою кров'ю.
Приклад 20. Аналіз вивільнення з катепсином/ каспазою.
Для кількісної оцінки кількості активного антибіотика, що вивільняється з ААС після обробки катепсином В, ААС розбавляли до 200 мкг/мл у буфері для катепсину (20 мМ ацетат натрію, 1
ММ ЕДТА, 5 мм І-цистеїн). Див. сторінку 863 в бибом/спікК еї а! (2002) Віосоп). Спет. 13:855-869, де документ включений сюди за допомогою посилання для цілей опису цього аналізу. Катепсин
В (з бичачої селезінки, БІЗМА С7800) додавали в концентрації 10 мкг/мл і зразки інкубували протягом 1 години при 37 "С. Як контроль ААС інкубували тільки у буфері. Реакцію зупиняли додаванням 10 об'ємів середовища для росту бактерій, триптичного соєвого бульйону з рН 7,4 (Т5В). Для оцінки загального вивільнення активного антибіотика робили серійні розведення реакційної суміші в чотирьох повторах в Т5В в 96-ямкових планшетах і додавали штам О5БАЗО0 5. ашеив у кожну ямку до кінцевої щільності 2х103 КУО/мл. Культури інкубували протягом ночі при З "С з перемішуванням, і ріст бактерій оцінювали, вимірюючи поглинання при 630 нм, використовуючи планшетний спектрофотометр.
Приклад 21. Одержання анти-М/ТГА антитіл.
Одержання, скринінг і вибір антитіл.
Скорочення: МЕЗА (метицилін-стійкий 5. ашеив); МЗЗА (метицилін-чутливий 5. ашеив);
МІЗА (стійкий до інтермедіату ванкоміцину 5. ашеив); І! ТА (ліпотейхоєва кислота); Т5В (триптичний соєвий бульйон); СМУР (препарат клітинної стінки).
Людські антитіла (дб клонували з периферичних В клітин, отриманих з пацієнтів після інфекції 5. ашгеив, використовуючи технологію Зутріех"М (Зутрподеп, Гупобу, Оептагк), при якій зберігається пара між відповідними важкими та легкими ланцюгами антитіла, як описано в 5 8,283,294: "Меїтоай ог сіопіпд содпаїе апіїбодіе5"; Меї|ег РУ еї аї. дошгтаї ої МоїІесшіаг Віоіоду 358:764-772 (2006); і Їапцо У еї аї. У Мігої. 85(4):1820-33 (Бер 2011). Плазмобласти та клітини пам'яті використовували як генетичне джерело репертуару рекомбінантних повнорозмірних дз.
Зо Індивідуальні клони антитіл експресували шляхом трансфекції клітин ссавців, як описано в
Меї|ег РУ, еї аІ. Меїйодз іп МоїІесшіаг Віоіоду 525: 261-277, хім. (2009). Супернатанти, що містять повнорозмірні антитіла ІдсС1, збирали через сім днів і використовували для скринінгу на зв'язування з антигеном за допомогою непрямого ЕГІЗА у первинному скринінгу. Одержували бібліотеку моноклональних антитіл, які при проведенні ЕГІЗБА демонстрували позитивне зв'язування з препаратами клітинних стінок із штамів ОБАЗОО або Ууоод46 5. ашеив. Антитіла далі продукували із застосуванням 200-мл часових трансфекцій та очищали за допомогою хроматографії на білку А (Марзеїесі ЗиКе, СЕ І Ме Зсіепсе5, Різсаїажау, МУ) для подальшого тестування. Для великомасштабного одержання антитіл антитіла продукували в клітинах СНО.
Клітини СНО трансфікували векторами, кодуючими Мі і МН, ї (дб очищали з культурального середовища за допомогою афінної хроматографії на білку А.
Таблиця 7
Список антигенів, використаних для виділення антитіл. джерело
Тейхоєва кислота клітинної стінки (М/ТА) з арії А.
Номер за каталогом К84500 (2 мг/флакон), номер Метіаіап І Те
М/ТА | партії 5Е14909. Зсіепсез 2 мкг/мл нн тот ета ож
РОМ | каталогом 77140, номер партії 1396845 Зідта 2 мкг/мл
РР ев іісісі РМЕЧІ ПИ
СМ Ж | фаза Сепепієсн, 100хХ см яз |СУМОЗАЗО0, ТВ. Стаціонарна фаза |Сепепівст 500Х і смуяа |СУУУмооа46, Т5В. Стаціонарна фаза |Сепепівст5О0Х
СМ ї СМ/ЯЗ завжди змішували при одержанні покриття для ЕЇ І5А.
На Фіг. 6 підсумовані дані первинного скринінгу антитіл за допомогою ЕГ ІЗА. Всі антитіла (за винятком 4569) були виділені при скринінгу з сумішшю препаратів клітинної стінки О5БАЗОО (препарат, який не містить залізо : Т5В у співвідношенні 96:4). Всі моноклональні антитіла до
СІСМАс бета (за винятком 6259), 5ОК і РОМ (4479) демонстрували позитивне зв'язування з РОМ і М/УТА при первинному скринінгу. Всі антитіла до сісСМАс альфа були виявлені тільки при скринінгу на зв'язування з сумішшю ОЗАЗО0 СУМУ. 4569 (специфічний до І ТА) був виявлений при скринінгу з М/о0д46 СУУР.
Вибір анти-М/ТА моноклонального антитіла з бібліотеки з використанням проточної цитометрії ех мімо
Кожне моноклональне антитіло в цій бібліотеці оцінювали з погляду трьох критеріїв добору: (1) відносна інтенсивність зв'язування моноклонального антитіла з поверхнею МЕК5БА як показник високої експресії відповідного розпізнаного антигена, що буде сприяти доставці антибіотика на високому рівні; (2) стабільність зв'язування моноклональних антитіл з МЕК5А, виділеними з великої розмаїтості інфікованих тканин, як показник стабільної експресії розпізнаного антигена на клітинній поверхні МК5БА /л м/мо у ході інфекцій; і (3) здатність моноклональних антитіл зв'язуватись з панеллю клінічно значимих штамів 5. ашеиз як показник збереження експресії розпізнаного антигена клітинної поверхні. З цією метою для тестування реактивності всіх цих попередньо вибраних культуральних супернатантів моноклональних антитіл до 5. ашеиз з різних інфікованих тканин і з різних штамів 5. ашеиз була використана проточна цитометрія.
Для всіх моноклональних антитіл у бібліотеці аналізували їхню здатність зв'язуватись з
МЕАЗА з інфікованих нирок, селезінки, печінки та легенів мишей, які були інфіковані МАЗА
О5БАЗОО; і з серця або нирок кроликів, які були інфіковані ОБАЗО0 СОЇ. у моделі ендокардиту на кролику. Здатність антитіла розпізнавати 6. айгеив з різних інфікованих тканин збільшує ймовірність терапевтичного антитіла бути активним відносно великої розмаїтості різних клінічних інфекцій 5. ашеив. Бактерії аналізували відразу після збору органів, тобто без субкультивування, для запобігання фенотипових змін, викликаних умовами культивування /лп уйго. Раніше ми спостерігали, що деякі антигени клітинної поверхні 5. ашгеиз, експресовані при культивуванні /лп уйго, перестають експресуватись в інфікованих тканинах. Антитіла, спрямовані проти таких антигенів, навряд чи будуть корисні для лікування інфекцій. У ході аналізу цієї
Зо бібліотеки моноклональних антитіл на різних інфікованих тканинах це спостереження підтвердилось для значної кількості антитіл, які демонструють значне зв'язування з бактеріями 5. ашеив з культури, і відсутність зв'язування з бактеріями з всіх тестованих тканин. Деякі антитіла зв'язувались з бактеріями з деяких, але не з всіх тестованих інфікованих тканин. Тому в даному винаході ми проводили пошук антитіл, які могли розпізнавати бактерії у всіх тестованих інфекційних умовах. Оцінювані параметри були наступними: (1) відносна інтенсивність флуоресценції як показник представленості антигена; (2) кількість органів, що офарблюються позитивно, як показник стабільності експресії антигена; і (3) здатність моноклональних антитіл зв'язуватись з панеллю клінічно значимих штамів 5. ашеиз як показник збереження експресії розпізнаного антигена клітинної поверхні. Інтенсивність флуоресценції тестованих антитіл визначали щодо контрольного антитіла з тим же самим ізотипом, спрямованого проти неспорідненого антигена, наприклад, моноклонального антитіла ІдДс1 проти вірусу герпесу 90:5237 (посилання нижче). Моноклональні антитіла проти М/ТА-бета не тільки демонструють найбільшу представленість антигена, але також демонструють найбільш стабільне зв'язування з МЕК5А з всіх тестованих інфікованих тканин, зазначених вище.
Додатково, ми тестували здатність цих моноклональних антитіл зв'язуватись з наступними штамами 5. ашеив, які культивували /л мігто в ТВ: ОБЗАЗО0 (МЕ5А), ОБА400 (МЕЗА), СОЇ (МА5А), МАБА252 (МА5А), Умоса46 (М55А), Козепрасії (МЗ5ЗА), Меултпап (М55А) і Ми50 (МІ5А).
Було виявлено, що анти-МЖМ/УТА бета моноклональні антитіла, але не анти-МТА альфа моноклональні антитіла реагують з усіма цими штамами. Аналіз зв'язування з різними штамами
БО свідчить про те, що М/ТГА бета більш консервативні, ніж МУТА альфа й тому більше підходять для ААС.
Приклад 22. Характеристика антитіл, що мають специфічність проти тейхоєвих кислот клітинної стінки 5. ашеийв. ії) Підтвердження специфічності антитіл до МУ/УТА.
Препарати клітинної стінки (СМУР) з штаму 5. аигеиз дикого типу (М/Т) і мутантного штаму 5. ацтеийв, в якого відсутній УУТА (АТадо; штам УУТА-пиї), одержували інкубацією 40 мг осаду штамів 5. ашгеив з 1 мл 10 мМ Трис-НСІ (рН 7,4) з додаванням 3095 рафінози, 100 мкг/мл лізостафіну (Се бсіепсе5, Сапіоп, МА) і коктейлю інгібіторів протеаз без ЕДТА (Коспе,
Ріеазапоп, СА) протягом 30 хв при 37 "С. Лізати центрифугували при 11600 х д протягом 5 хв і бо збирали супернатанти, що містять компоненти клітинної стінки. Для імуноблотингу білки розділяли в 4-1295 Трис-гліциновому гелі та переносили на нітроцелюлозну мембрану (Іпмігодеп, Сагізрай, СА), потім проводили блотинг із зазначеними тестованими антитілами проти М/ТА або з контрольними антитілами проти РОМ і І ТА.
Імуноблотинг показав, що антитіла проти М/ТА зв'язуються з препаратами М/Т клітинної стінки з 5. ашеиз М/Т, але не з препаратами клітинної стінки з штаму АТадо, в якого відсутні
М/ТА. Контрольні антитіла проти пептидоглікану (анти-РОМ) і ліпотейхоєвої кислоти (анти-їЇ ТА) добре зв'язуються з обома препаратами клітинної стінки. Ці дані свідчать про специфічність тестованих антитіл проти УУТА. ії) Проточна цитометрія для визначення ступеня зв'язування моноклонального антитіла з поверхнею МЕК5А.
Експресію антигена клітинної поверхні на цілій бактерії з інфікованих тканин аналізували за допомогою проточної цитометрії, використовуючи наступний протокол. Для фарбування антитілами бактерій з інфікованих мишачих тканин 6-8 тижневим самкам мишей С57В1/6 (Спапеб5 Кімег, УМітіпдіоп, МА) внутрішньовенно вводили 108 КУО, що перебувають у логарифмічній фазі росту ОБАЗО0 у РВ5. Органи мишей збирали через два дні після інфекції.
Інфекційний ендокардит у кроликів (ІЄ) викликали, як описано раніше в Тайеміп Р. єї аї.
АпіїтістобіаІ адепіб апа спетоїПегару 54: 610-613 (2010). Кроликам внутрішньовенно вводили
Б5х107 КУО МА5А штаму СОЇ. у стаціонарній фазі росту та вегетації на серці збирали через вісімнадцять днів. Обробку 30 мг/кг ванкоміцину здійснювали шляхом внутрішньовенного введення два рази на день через 18 годин після інфекції 7х107 КУО в стаціонарній фазі.
Для лізису мишачих і кролячих клітин тканини гомогенізували в спеціальних флаконах М їмре5 (Мійепуії, Айбигп, СА), використовуючи клітинний дисоціатор депіемаАсС5 (Міпепуї), з наступною інкубацією протягом 10 хв при КТ у РВ5, що містить 0,195 Тійоп-Х100 (ТНепто), 10 мкг/мл ДНКази І (Коспе) і коктейль інгібіторів протеаз Сотрієїе Міпі (Коспе). Суспензії пропускали через фільтр 40 мікронів (ВО) і промивали НВЗЗ без фенолового червоного з додаванням 0,195 БСА без до (бідта) і 10 мМ Неревз, рН 7,4 (буфер НВ). Суспензії бактерій далі інкубували з 300 мкг/мл кролячих Ідс (бЗідта) у буфері НВ протягом 1 години при кімнатній температурі (КТ) для блокування неспецифічного зв'язування дос. Бактерії офарблювали 2 мкг/мл первинних антитіл, включаючи моноклональне антитіло ГЕ1 або контрольне антитіло
Зо Ід9О1 з тим же самим ізотипом проти вірусу герпесу 90:5237 (МаКатига СВ еїаї., У Міо! 67: 6179- 6191 (1993)), і далі флуоресцентними вторинними антитілами проти людських дс (Часк5оп
Іттипогезеагсй, УМебі Стгоме, РА). Щоб диференціювати бактерії від дебрису мишачих і кролячих органів, проводили подвійне фарбування, використовуючи 20 мкг/мл мишачого моноклонального антитіла 702 проти пептидоглікану 5. ашеив (Абсат, Сатргідде, МА) і флуоресцентно-мічене вторинне антитіло проти дО миші (Чдаскбзоп Іттипогезеагсі). Бактерії промивали й аналізували, використовуючи ЕАСзЗсСаїїриг (ВО). У процесі проточної цитометрії бактерії визначали як позитивно забарвлені моноклональним антитілом 702 на графіках із флуоресценцією у двох каналах. ії) Вимірювання афінності зв'язування з 5. айгеи5 й антигенної щільності на МК5А.
У Таблиці 8 наведені результати аналізу рівноважного зв'язування антитіл до МЕ5ЗА з штамом Мемтап-дД5РА й антигенної щільності на бактерії.
Таблиця 8
Антигенна щільність,
Антитіло до МАЗА Специфічність Середня Ко, нМ (п-2) середня кількість сайтів/ бактерію
Значення Ко й антигенної щільності були отримані з використанням клітинного аналізу зв'язування з радіоактивним лігандом у наступних умовах аналізух ОМЕМ ж буфер для зв'язування з 2,596 мишачою сироваткою крові; зв'язування протягом 2 годин при кімнатній температурі (КТ); 400000 бактерій/ямку.
Антитіло 6263 аналогічно 6078, оскільки їхні послідовності дуже схожі. За винятком другого залишку (К у порівнянні з 5) в СОК НЗ всі інші залишки послідовностей СОК І і Н ланцюгів ідентичні.
Приклад 23. Створення мутантних УУТА антитіл.
Коротко, для експресії антитіл у вигляді (91 область МН кожного анти-М/ТА бета антитіла клонували та зв'язували з константною областю людського Н ланцюга гамма, і МІ. зв'язували з константною областю каппа. У деяких випадках, послідовності дикого типу були змінені в деяких положеннях для поліпшення стабільності антитіла, як описано нижче. Далі були отримані антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном (ТпіоМабв5). і. Зв'язування варіабельних областей з константними областями.
Області МН М/ТГА бета антитіл, ідентифіковані з бібліотеки людських антитіл, як описано вище, зв'язували з людськими константними областями у! для одержання повнорозмірних антитіл ЇДС1. Ї ланцюги являли собою І ланцюги каппа. і. Одержання стабільних варіантів
М/ТА антитіла, показані на Фіг. 14 (дивіться, зокрема, Фіг. 15А, 158, 16А, 168), були генетично змінені для поліпшення деяких властивостей (наприклад, щоб уникнути деамінування, ізомеризації аспарагінової кислоти, окислювання або М-глікозилювання) і протестовані на зв'язування антигена, а також хімічну стабільність після введення амінокислотних замін. Одноланцюгова ДНК клонів, що кодують важкий або легкий ланцюги, була очищена з фагових частинок М13КО7, що ростуть у клітинах б. со/ Су236, з використанням набору ОІАргер Зріп М13 (Оіадеп) 5- Фосфорильовані синтетичні олігонуклеотиди, що мають послідовності: 5- СССАпаАстТасАссАааставАТСТоТаААТатАСТОСАИтТТас- 3 (5ЕО І МО: 152) 5- ССАпАСтТасСАсСАастасСАССТОТаААТатАСТОСАСИТТОас- 3 (ЗЕО ІЮ МО: 153)
БССАСОСТТСССТООССССАМТ МаТтСсААаТоСАЗСМУКСАССТСТТаСАСАСТААТАСАСАСО-
З'(ЗЕО ІЮО МО: 154); і 5-бСбтаасСсСсСАатсаТСААатосТоСТТСАССТСТТаСАСАСТААТАСАСАСО- 3 (ЗЕО ІЮ МО: 155) (коди ІПРАС) були використані для одержання мутантних клонів, що кодують антитіла, за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу, спрямованого олігонуклеотидами, відповідно до методики, описаної в КипкКеї, Т.А. (1985). Наріа апа ейісієпі 5іе-5ресіїс тшиїадепевів мйпоцї рпепоїуріс
Зо зеІесіоп. Ргосеєдіпд5 ої Ше Маїйопа! Асадету ої Зсіепсе5 ОБА 82(2): 488-492. Мутовану ДНК використовували для трансформації клітин Є. со// ХІ 1-ВіІне (Адіїепі Тесппо!іодієв), які висіювали на планшети з І ша Вгоїй, що містять 50 мкг/мл карбеніциліну. Колонії збирали індивідуально та ростили в рідкому середовищі І іа Вгоїй, що містить 50 мкг/мл карбеніциліну. Виділений препарат ДНК секвенували для підтвердження присутності мутацій.
В антитілі 6078 друга амінокислота у МН, Меї (теї-2), піддана окислюванню. Тому Меї-2 заміняли шляхом мутації на Пе або Маї, щоб уникнути окислювання залишку. Оскільки зміна Меї- 2 може впливати на афінність зв'язування, здатність мутантів зв'язуватися з біарпй СМ/Р тестували за допомогою ЕЇ І5А.
Було виявлено, що мотиви "ОС" або "ОО" в СОВ НЗ піддані трансформації в ізоаспарагінову кислоту. Антитіло АБ 4497 містить ОС у положеннях 96 і 97 СОВ НЗ (дивіться Фіг. 188) і було змінено для збільшення стабільності. СОН НЗ зазвичай дуже важливий для зв'язування антигена, тому деякі мутанти тестували на зв'язування з антигеном і хімічною стабільністю (дивіться Фіг. 18А). Мутант 096Е (м8) зберігає зв'язування з антигеном, так само як і антитіло дикого типу 4497 (Фіг. 184А; Фіг. 188), і є стабільним і не утворює ізоаспарагінової кислоти.
ЕПЗА з арп СМУР
Для аналізу мутантів антитіла 6078 препарати клітинної стінки 5. ашеив ОБАЗО0 АБРА (МТ), оброблені лізостафіном, що містять 1х109 бактерій/мл розбавляли, 1/100 в 0,05 карбонаті натрію з рН 9,6 і покривали ними 384- ямкові планшети для ЕГІЗА (Мипс; Меріипе, МУ) при інкубації протягом ночі при 4 "С. Планшети промивали РВ5 з 0,0595 Туеєеп-20 і блокували інкубацією протягом 2 годин з РВ5 плюс 0,595 бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Ці та всі наступні інкубації проводили при кімнатній температурі з обережним перемішуванням. Зразки антитіл розбавляли у буфері для розведення зразка/ стандарту (РВ5, 0,595 БСА, 0,0595 Тмееп 20, 0,2595 СНАР5, 5 мМ ЕДТА, 0,35М Масі, 15 мільйонних частин прокліну (рН 7,4)) додавали до промитих планшетів та інкубували протягом 1,5 - 2 годин. Зв'язавшись з планшетом анти-5. ацгеив антитіла виявляли 1-годинною інкубацією з кон'югованим з пероксидазою Е(аб)2 фрагментом козячого антитіла проти Ідс(Есу) людини (даскзоп ІттипоВРезеагси; УУевіСтгоме,
РА), розведеним до 40 нг/мл у буфері для аналізу (РВ5, 0,595 БСА, 15 мільйонних частин прокліну, 0,0595 Тмееп 20). Після кінцевого промивання додавали тетраметилбензидин (КРІ,
Сайпегериго, МО), фарбування розвивалося протягом 5-10 хвилин, і реакцію зупиняли 1 М бо фосфорною кислотою. Планшети аналізували при 450 нм із контрольним вимірюванням при 620 нм, використовуючи мікропланшетний спектрофотометр. ії. Одержання мутантів, у які методами генної інженерії введений Суб (ТпіоМабзв).
Повнорозмірні ТпіоМар продукували шляхом введення цистеїну в Н ланцюг (в СНІ) або |. ланцюг (Ск) у заздалегідь певне положення, як вказувалося раніше й описано нижче, щоб забезпечити кон'югацію антитіла з інтермедіатом лінкер-антибіотик. Н і Її ланцюги далі клонували в окремі плазміди та кодуючі Н і Ї ланцюги плазмідами трансфікували клітини 293, в яких вони експресувались і збирались в інтактні антитіла. Обидва ланцюги також можуть бути клоновані в одну експресуючу плазміду. За рахунок експресії бажаної комбінації Сух-мутантних ланцюгів і ланцюгів дикого типу були отримані Ідс1, що мають 2 Су, введених методами генної інженерії, по одному в кожному з Н ланцюгів, або 2 Су, введених методами генної інженерії, по одному в кожному з І. ланцюгів, або комбінацію 2 Н і 2 Ї ланцюгів з Сух5, введеними методами генної інженерії (НСІ СсСубв).
На Фіг. 15А і 158 наведені антитіла 6078 М/ і мутанти з комбінацією НС Сузх і ІС Су. Також тестували здатність мутанту 6078 зв'язуватись з ОБАЗО0 5іарії А, дефіцитним за білком А, з нічної культури. За результатами аналізу ГАС5, як показано на Фіг. 19, мутантні антитіла зв'язувались з ОБАЗОО так само, як антитіло 6078 У/Т (незмінене); амінокислотні зміни в мутантах не впливали на зв'язування з 5їарії А. д є неспецифічним негативним контрольним антитілом.
Приклад 24. Препарат кон'югату анти-М/ТА антитіло-антибіотик.
Кон'югати антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки з антибіотиком (ААС) з Таблиці З одержували кон'югацією анти-М/ТА антитіла з інтермедіатом лінкер-антибіотик, включаючи інтермедіати з Таблиці 2. Перед кон'югацією анти-М/ТА антитіла частково відновлювали ТСЕР, використовуючи стандартні способи, відповідно до методики, описаної у УМО 2004/010957, розкриття якої включено в даний документ за допомогою посилання для цієї мети. Частково відновлені антитіла кон'югували з інтермедіатом лінкер-антибіотик, використовуючи стандартні способи, відповідно до методики, описаної, наприклад, в Юогопіпа еї аіЇ. (2003) Маї. Віогеснпої. 21:778-784 і 052005/0238649 А1. Коротко, частково відновлені антитіла комбінували з інтермедіатом лінкер-антибіотик, щоб можна було кон'югувати інтермедіат лінкер-антибіотик з відновленими залишками цистеїну антитіла. Реакції кон'югації зупиняли й ААС очищали.
Зо Визначали навантаження антибіотика (середня кількість фрагментів антибіотика на антитіло) для кожного ААС, і вона становила приблизно між 1 і 2 для антитіл проти тейхоєвих кислот клітинної стінки з одним мутантним сайтом цистеїну, введеним методами генної інженерії.
Відновлення/окислення ТпіоМар для кон'югації. Повнорозмірні моноклональні антитіла з введеним методом генної інженерії цистеїном (Тпіомаб - Чдипишіа, єї а!., 20086 Маїшге Віоїеспн., 26(8):925-932; Юотап еї а! (2009) Віооай 114(13)2721-27295 005 7521541; 05 7723485;
МО2009/052249, Зпеп еї аї (2012) Маїшге Віоїесп., 30(2):184-191; Уудипшшіа єї а! (2008) дошк ої
Іттип. Меїйпод5 332:41-52), експресовані в клітинах СНО, відновлювали приблизно 20-40 кратним надлишком ТСЕР (трис(2-карбоксіетил) фосфін гідрохлориду) або ОТ (дитіотреїтол) в 50 мМ Трис із рН 7,5 і 2 мМ ЕДТА протягом З годин при 37 "С або протягом ночі при кімнатній температурі. (Сеї; еї а/ (1999) Ала/. Віоспет. Мо! 273:73-80; 5оМйес Мепійгез, Вемепу, МА).
Відновлене ТПпіоМаб розбавляли та наносили на колонку НіТгар 5 в 10 мМ ацетаті натрію, рН 5, і елюювали РВ5, що містить 0,3 М хлорид натрію. Альтернативно, антитіло закисляли додаванням 1/20 об'єму 10 95 оцтової кислоти, розведеної 10 мМ сукцинатом з рН 5, наносили на колонку і далі промивали 10 об'ємами колонки сукцинатного буфера. Елюцію з колонки здійснювали 50 мМ Трис, рН 7,5, 2 ММ ЕДТА.
Елюйоване відновлене ТпіоМар обробляли 15 кратним молярним надлишком ОНАА (дегідроаскорбінової кислоти) або 200 нМ водним розчином сульфату міді (Сизоз).
Окислювання міжланцюгових дисульфідних зв'язків завершувалось приблизно через три години або пізніше. Окислювання атмосферним повітрям також було ефективним. Повторно окислене антитіло діалізували в 20 мМ сукцинаті натрію з рН 5, 150 мМ Масі, 2 мМ ЕДТА та зберігали замороженими при -20 "С.
Кон'югація Тіо-МаБб з інтермедіатами лінкер-антибіотик.
Деблоковані повторно окислені тіо-антитіла (ТпіоМар) вводили в реакцію з 6-8 молярним надлишком інтермедіату лінкер-антибіотик з Таблиці 2 (з концентрованого розчину в ОМ5О у концентрації 20 мМ) в 50 мМ Трис, рН 8, до завершення реакції (16-24 годин), що визначали за допомогою І С-М5 аналізу реакційної суміші.
Неочищені кон'югати антитіло-антибіотик (ААС) далі наносили на катіонообмінну колонку після розведення 20 мМ сукцинатом натрію, рН 5. Колонку промивали, щонайменше, 10 об'ємами колонки 20 мМ сукцинату натрію, рН 5, і антитіло елюювали РВ5. ААС переводили в бо 20 мМ Ніз/ацетат, рн 5, з 240 мМ сахарози з використанням колонок для гель-фільтрації. ААС були охарактеризовані за допомогою Уф-спектроскопії для визначення концентрації білка, аналітичної ЕС (ексклюзійна хроматографія) для аналізу агрегації і ЇС-М5 до та після обробки лізин С-ендопептидазою.
Ексклюзійну хроматографію проводили, використовуючи колонку Зподех КУУ802.5 в 0,2М фосфаті калію, рН 6,2, з 0,25 мМ хлоридом калію та 1595 ІРА при швидкості потоку 0,75 мл/хв.
Ступінь агрегації ААС визначали інтегруванням площі елюйованого піка в спектрі поглинання при 280 нм.
І С-М5 аналіз проводили, використовуючи прилад Адіепі ОТОЕ 6520 Е5І. Як приклад, ААС, отриманий таким хімічним чином, обробляли 1:500 вага/вага ендопептидазою Гуз С (Рготеда) у
Трис, рН 7,5, протягом 30 хв при 37 "С. Отримані фрагменти розщеплення наносили на колонку
РІАР-5, Т000А, 8 мкм, нагрівали до 80 "С та елюювали градієнтом від 3095 В до 4095 В протягом 5 хвилин. Рухома фаза А: НгО з 0,0595 ТФО. Рухома фаза В: ацетонітрил з 0,0490
ТФО. Швидкість потоку: 0,5 мл/хв. Елюцію білка контролювали за УФ-поглинанням при 280 нм перед електророзпилювальною іонізацією та М5 аналізом. Зазвичай досягали хроматографічного дозволу некон'югованого фрагмента с, некон'югованого аб, що залишився, і антибіотик-ар. Отримані спектри т/7 деконволюювали, використовуючи програмне забезпечення Ма55 Нипіег"м (Адіїепі ТесппоЇодіеєх) для розрахунку маси фрагментів антитіла.
Приклад 25. Ідентифікація й очищення стафопаїну В як протеази, що здійснює розщеплення.
Супернатант із З літрів нічної культури М/о0д46 піддавали концентруванню та заміні буфера на 50 мМ фосфат натрію, рН 7, з використанням ТЕБЕ (10 кДа). Зразок наносили на колонку з
Сефарози ЕЕ і білки розділяли хроматографічно, використовуючи градієнт 0-300 мМ Масі в 50
ММ фосфаті натрію, рН 7. Активні фракції ідентифікували інкубацією з ШіоБАВ 54497-МО- ааАРгАСсОО-(рірвогє) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 126), показаним на Фіг. 27, і за допомогою І С-М5 аналізу оцінювали розщеплення лінкера в очікуваному сайті. Активні фракції поєднували та додавали сульфат амонію до концентрації 2 М. Білки далі очищали за допомогою хроматографії гідрофобних взаємодій на фенілсефарозі з використанням градієнта 2-0 М сульфату амонію в 50 мМ Трис із рН 7,5. Знову ідентифікували активні фракції,
Зо використовуючи для цього зазначену сполуку. Ці фракції поєднували й далі очищали на колонці
З Мопо СО в 50 мМ ацетаті натрію з рН 5,5, використовуючи градієнт солі 0-1 М Масі. Активні фракції з цього хроматографічного етапу ідентифікували, як і раніше, поєднували та піддавали ексклюзійній хроматографії у РВ5. Ідентифікували активні фракції та за допомогою 5О5-РАСЕ визначали, що вони містять один білок, що цікавить.
Збагачені активні фракції після очищення на с Сефарозі були охарактеризовані, щоб визначити клас протеази, відповідальної за активність. Було виявлено, що протеаза інгібується
М-етилмалеїмідом, що вказує на те, що, імовірно, фермент є цистеїновою протеазою. Після розгляду відомих секретованих цистеїнових протеаз ЄїарнуІососсив ашгеив, було визначено, що стафопаїн В має субстратну специфічність, аналогічну тій, яку спостерігали при скринінгу КЕРІ і (КаїпзкКа, М., Т. Капука, єї а. (2012). Віоспітіє 94(2): 318). Очищений стафопаїн В одержували від Зідта-Аїдгісп та інкубували з (іогАВ 54497-МО-4САРАдСаа-(рірвок) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 126), показаний на Фіг. 27. Було виявлено, що стафопаїн В розщеплює лінкер у тому ж самому сайті, що й активна протеаза, очищена з супернатанта У/оод46.
Стафопаїн В й активну протеазу, очищену з супернатанта культури клітин, інкубували з Аїеха
Еіпогб 488 С5 малеїмідом (Іпмігодеп, ІМе Тесппоіодіе5, Тпепто Рібзпег Зсіепійіс Іпс.), щоб здійснити мічення цистеїнів активних сайтів. Зразки аналізували за допомогою 50О5-РАСЕ, що призвело до ідентифікації протеази як стафопаїн В. Активні фракції після очищення ЗЕС також піддавали аналізу 5ХО5-РАСЕ разом із очищеним стафопаїном В, у присутності АІеха Ріпог 488 і без нього.
Збагачені активні фракції для очищення на ОО Сефарозі також аналізували за допомогою протеомної мас-спектрометрії. Десять мікрограмів активних фракцій В11, В12 ї СО02, десять мікрограмів активних фракцій 1, 2, З і десять мікрограмів неактивної фракції піддавали 505-
РАСБЕ. Смуги вирізали з гелів і піддавали трипсинолізу протягом ночі. Оброблені трипсином зразки аналізували за допомогою І С-М5/М5, і результати тандемної мас-спектрометрії підтверджували пошуком за базою даних, використовуючи алгоритм пошуку Мабсої. Стафопаїн
В був найбільш представленою цистеїновою протеазою в активних фракціях. Аутолізин, що також є цистеїновою протеазою, також був високо представлений, але найбільша представленість унікальними пептидами була в неактивній фракції, негативному контролі, тому аутолізин був виключений з розгляду. Мас-спектрометричний протеомний аналіз активних бо фракцій після очищення на 0 Сефарозі показав високу перевагу стафопаїну В. Дані фільтрували за білками 5. ашгеиз і ранжували за числом пептидів в активній фракції 1.
Активну протеазу очищали з супернатанта культури клітин Ууооа46 5. ашгеив. Клітини росли протягом ночі при 37 "С в З літрах Т5В. Клітини видаляли центрифугуванням при 10000 х д протягом 10 хв. Культуральний супернатант пропускали через два 0,22 мкм фільтри. Далі, проводили концентрування та здійснювали заміну буфера на 50 мМ фосфат натрію з рН 7 з використанням ТЕЕ з мембраною 10 кДа. Зразки концентрували в десять разів до об'єму 300 мл. Зразок наносили на ОО Сефарозу ЕЕ (СЕ Неансаге Віозсіепсе5 АВ) і білки розділяли хроматографічно, використовуючи градієнт 0-300 мМ Масі в 50 мМ фосфату натрію, рН 7.
Активні фракції поєднували та додавали сульфат амонію до концентрації 2 М. Білки далі очищували за допомогою хроматографії гідрофобних взаємодій на Фенілсефарозі (СЕ
Неайсаге Віозсіепсез5 АВ) з використанням градієнта 2-0 М сульфату амонію в 50 мМ Трис із рН 7,5. Активні фракції поєднували й далі очищали на Мопо О (СЕ Неайвсаге Віозсіепсез5 АВ) в 50 мМ ацетаті натрію, рН 5,5, використовуючи градієнт солі 0-1 М Масі. Активні фракції з цього хроматографічного етапу ідентифікували, як і раніше, поєднували та піддавали ексклюзійній хроматографії (7епіх-150, 5ерах Тесппоїіодієз) у РВ5.
Для ідентифікації фракцій, що містять цікавлячу нас активну протеазу, 100 мкл кожної фракції переносили в 9б-ямковий планшет, де їх інкубували з 25 мкг ШіоБАВ 4497 таї-
СОАРАСИаСй-ЮОМАЗІ («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 126). Після кожного хроматографічного етапу аналізували активність фракцій, і використовували 100 мкл фракції поза залежністю від концентрації білка. Зразки інкубували протягом ночі при 37 "С і далі аналізували за допомогою І С-М5 для ідентифікації фракцій, де відбулося розщеплення протеазою інтермедіату лінкер-антибіотик. Об'єднані активні фракції після хроматографії на о
Сефарозі ЕЕ мали концентрацію загального білка 14 мг/мл. 200 мкг пулу розбавляли до 2 мг/мл у РВЗ та інкубували з М-етилмалеіїмідом (МЕМ, Зідта) у кінцевій концентрації 0,1 мМ і без нього. Зразки інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. 25 мкг ПіогАВ 4497 таї!-
СОаСАгдОааОа-ОМАЗІ1 («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 126) додавали до всіх зразків і суміш інкубували при 37 "С протягом 2 годин. Через 2 години зразки аналізували за допомогою
ЇС-М5 для визначення, чи відбулося розщеплення протеазою інтермедіату лінкер-антибіотик.
Приблизно 50 мкл активних фракцій після ЕС інкубували з 0,1 мМ Аїеха Ріног 488 Сх малеїімід
Зо (Іпийгодеп) протягом 1 години поза залежністю від концентрації білка для здійснення мічення.
Аналіз розщеплення з очищеними протеазами проводили шляхом інкубації 5 мкМ кон'югату
ІПіоГАВ з 50 НМ протеази в кінцевому об'ємі 100 мкл. Аналізи проводили або у РВ5 з рН 7 2, 4
ММ Г-Субв, 2,5 мМ ЕДТА, або в 100 мМ цитрату натрію з рН 5, 100 мМ Масі, 4 мМ І -Сув, 2,5 ММ
ЕДТА. Зразки інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Через 2 години реакцію розщеплення зупиняли розведенням 1:1 195 ТФО. Зразки далі аналізували за допомогою ЇС-М5 для визначення відсотка розщеплення лінкера. Відсоток розщеплення лінкера визначали інтегруванням піків хроматограм Агво розщеплених та інтактних сполук. Фрагменти антибіотика або хромофору, додані на С-кінець лінкерів, надавали значну гідрофобність, так що піки (пісгАВ з інтактними лінкерами та ІпіогАВ з розщепленими лінкерами дозволяються на рівні базової лінії.
Для протеомного аналізу збагачених фракцій десять мікрограмів збагачених активних фракцій після очищення на 0 ЗерпагозефФ (СЕ Неайпсаге Пе Зсіепсез) наносили в 4-1290 Біс-
Трис гель (Ге Тесппоїіодіе5). Гелеві доріжки вирізали цілком і розрізали зверху вниз на 11 смуг.
Від фарбування смуг гелю позбувалися в 5095 ацетонітрилі/ 50 мМ бікарбонаті амонію, білки відновлювали дитіотреїтолом (кінцева концентрація 50 мМ) протягом 30 хвилин при 50 "С й алкілували йодацетамідом (кінцева концентрація 50 мМ) при кімнатній температурі в темряві протягом 30 хвилин. Зразки далі піддавали розщепленню 0,02 мкг/мл трипсину (Рготеда) в 50
ММ бікарбонаті амонію при 37 "С протягом ночі. Зразки після обробки трипсином наносили на капілярну колонку з внутрішнім діаметром 100 мкм (колонка МапоАсдийу СВЕРХ, 100 мкм х 100 мм, 1,7 мкм, ВЕНІ130 С18, Умаїег5 Согр) і розділяли за допомогою капілярної зверненої-фазової хроматографії, використовуючи систему СВЕРХ МапоАсдийу (Умаїег5 Согр). Зразки наносили в 0,195 трифтороцтовій кислоті у воді та елюювали градієнтом 2-9095 буфера В (де буфер А являє собою 0,195 мурашиної кислоти/ 295 ацетонітрилу/ 9895 води, і буфер В являє собою 0,195 мурашиної кислоти/ 295 води/ 9895 ацетонітрилу) при 1,00 мкл/хв із загальним часом аналізу 45 хвилин. Пептиди елюювали прямо в мас-спектрометр ГТО-Огрігар ХІІ (ТпегтоРівпег) й іонізували, використовуючи джерело АОМАМСЕ (Міспгот-ВгиКег) з напругою при електророзпиленні 1,4 кВ. Мас-спектрометричні дані одержували, використовуючи метод, що включає одне повне М5 сканування (375-1600 іп/7) на приладі Огрйгар з дозволом 60000 М/АМ при т/2 400 з наступною індукованою зіткненнями дисоціацією (СІО) 8 найбільш представлених бо іонів у повних М5 скануваннях за цикл, що повторюється протягом градієнта І С у лінійній іонній пастці. Тандемні мас-спектрометричні результати підтверджували пошуком у базі даних з використанням алгоритму пошуку Мазхсої» версії 2.3.02 (Маїгіх 5сіепсе5) проти складової бази з цільових білків і свідомо помилкових (неіснуючих) білків, Опіргої версія 2010 12, що включає білки 5. ашеивз і звичайні лабораторні забруднювачі. Використовували наступні параметри пошуку: специфічність використовуваного ферменту: трипсин, варіабельні модифікації: карбамідометилювання цистеїну (ї457,0215 Да) і окислювання метіоніну (ї15,995 Да), можливі 2 розщеплення в невірних сайтах, помилка визначення маси іона прекурсору 200 мільйонних частин, і точність визначення маси фрагментного іона 0,5 Да. Збіги спектрів пептидів перевіряли з використанням лінійного дискримінантного алгоритму (ГА) з імовірністю хибнопозитивної ідентифікації, рівної 1905.
Приклад 26. Розщеплення стафопаїном ШіогАВ ЕКЕТ пептидів і ААС. 5 МКМ пісгАВ 4497 МР-ІЇ АБСА-О5У7 («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 135) і
ТШіоБАВ 4497 МР-ІЇАБАА-0О5У7 («коровий пептид» наведений в 5ЕБО ІЮО МО: 136) (Фіг. 30) інкубували з 50 нМ протеази у РВ5, рН 7,2, 4 мМ І-Сув, 2,5 мМ ЕДТА протягом 2 годин при 37 "б. Через 2 години реакцію розщеплення зупиняли розведенням 1:1 195 ТФО. Зразки далі були проаналізовані за допомогою І С-М5 для визначення відсотка розщеплення лінкера. Всі тестовані протеази розщеплювали два лінкера, хоча й у різному ступені та у різних сайтах (Таблиця 4). Стафопаїн А і стафопаїн В розщеплюють лінкери в тому самому сайті: МР-
ІАГОГА-О5У7 («коровий пептид» наведений в ХЕО ІО МО: 135) і МР-І АЕАХА-О5У7 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮО МО: 136). Стафопаїн В досягає 10095 розщеплення обох лінкерів у тестованій концентрації. Катепсин В також досягав 10095 розщеплення для обох лінкерів у цих умовах, хоча сайти розщеплення були змішаними. Катепсин В розщеплював та!1І- АЕСА-О5У 7 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 135) винятково в МР-І АЕС А-О5У7 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 135), тоді як таІ-|Ї АРЕДА-О5У7 («коровий пептид» наведений в 5ЗЕО ІО МО: 136) катепсин В розщеплював як в МР-І АЕАХА-О5У7 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 136), так і в МР-І АЕДАХУ-О5У7 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 136).
Розщеплення стафопаїном А МР-І АГДА-О5У7 («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 136) склало 2395, тоді як розщеплення МР-І АЕСА-О5У7 («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 135) склало 3895.
Зо 5 МКМ ААС-193 інкубували з 50 нМ протеази або у РВ5 з рН 7,2, 4 мМ І-Суз, 2,5 мМ ЕДТА, або в 100 мМ цитрату натрію з рН 5, 100 мМ Масі, 4 мм Г-Сувз, 2,5 мМ ЕДТА протягом 2 годин при 37 "С. Через 2 години реакцію розщеплення зупиняли розведенням 1:1 195 ТФО. Зразки далі були проаналізовані за допомогою І С-М5 для визначення відсотка розщеплення лінкера.
Оптимізований інтермедіат лінкер-антибіотик ефективно розщеплювався всіма тестованими протеазами. При розщепленні стафопаїном А і стафопаїом В вивільнявся вільний піперазинорифаміцин. Розщеплення стафопаїном В склало 10095 як при рн 5, так і при рН 7,2.
Розщеплення стафопаїном А склало 10095 при рН 5 і 6495 при рН 7,2.
Приклад 27. Кон'югат антитіло-антибіотик тіо-54497 | С м8-МР-ІЇ АРС-РАВС-(піперазиноВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128) ААС-215 інгібує 5. ашгеив іп Уго. 1х108 бактерій Ууоса46, що перебувають у стаціонарній фазі, суспендували в 10 мкл буфера
НВ (збалансований сольовий розчин Хенкса з додаванням 0,195 бичачого сироваткового альбуміну), що містить 100 мкг/мл тіо-54497 І С у8-МР-Г АРа-РАВС-(піперазиноВвокК) («коровий пептид» наведений в 5БО ІЮ МО: 128) ААС-215 або тіо-54497-НОС-А1180-МО-мсо-РАВС- (піперазвок) ААС-126. В останньому використаний лінкер валін-цитрулін (мс), розщеплюваний катепсином В, для доставки того ж самого антибіотика.
Через 1 годину зразки розбавляли в 10 разів додаванням 90 мкл НВ або 90 мкл катепсину В (10 мкг/мл катепсину В в 20 мМ ацетаті натрію, 1 мМ ЕДТА, 5 мМ І -цистеїну з рН 5) та інкубували при 37 "С протягом додаткових З годин. Про вивільнення активного антибіотика судили за тим, чи інгібує інкубація ААС з бактеріями подальший ріст бактерій. Суспензії бактерій/ ААС вносили прямо у планшети з триптичним соєвим агаром і візуалізували ріст бактерій після інкубації протягом ночі при 37 "С. Активний лікарський засіб вивільняється з ААС, кон'югованого з інтермедіатом лінкер-антибіотик МСО-І АРС-РАВ-(піперазиноВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128).
Бактерії, які інкубували без ААС, росли добре, і на них не чинила впливу обробка катепсином В. Бактерії, оброблені ААС-126, що містить лінкер валін-цитрулін (мс), розщеплюваний катепсином В, росли добре після інкубації у буфері НВ як такому, але їхній ріст придушувався після обробки ААС-126 -- катепсин В, що свідчить про те, що обробка ферментом була необхідна для вивільнення активного антибіотика. На противагу цьому, ріст бактерій, які інкубували з ААС-215, що містить лінкер ГАЕРО, розщеплюваний стафопаїном (ЗЕО ІЮО МО: 128), бо придушувався після інкубації з буфером НВ як таким, що припускає, що бактеріальна суспензія мала ферментативну активність, достатню для вивільнення активного антибіотика з ААС, що містить розщеплюваний стафопаїном лінкер.
Приклад 28. Кон'югат антитіло-антибіотик тіо-54497 НО м1-МР-І АРС-РАВС-(піперазиноВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128) ААС-193 знищує внутрішньоклітинні МК5А в аналізі з макрофагами.
Штам СзАЗОО 5. ашгеиз інкубували з різними дозами (100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл або 0,1 мкг/мл) антитіла 54497 як такого, тіо-54497 НО М/1Т (м8) (ЗЕО ІО МО: 137), Г.С М2050-МО-мс-РАВ- (диметилрірВвок) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128) ААС-192 або тіо-54497 НС м1-МР-ГАБа-РАВС-(піперазиноВвОмК) ААС-193, щоб відбулося зв'язування ААС з бактеріями (Фіг. 31). 54497 НС УЛ (м8) 446 амінокислот
ЕМОІМЕ 5200 СІМ ОРОС 51 ВІ 5 С5А 5аЕ ЗЕМ 5ЕМУ МНУУ МО МУРОа Каї МІ 5ЕТ ММЕ ТТ
ТАУ
Ар5 Уа АРІ ЗА ОМА КМТ І МІ ЕММ МА СЕО ТАМ УМО Аа расіІро Ммсао сті МТМ 55А
ЗК
СРО МЕР АР ЗБК 55 СТ АД аСІ МКО МЕР ЕРМ ТУ5 МУ/М5 БА 520 МНТ ЕРА МО 5504 5
Ї 55 ММ МРБ 551 ТО ТМ СММ МНК РОМ ТКМ ОКК МЕР КО ОКТ НТО РРО РАР ЕІ сааР МЕ
ІГЕР РКР КОТ І МІ 5В8Т РЕМ ТСМ ММО М5Н ЕОР ЕМК ЕММУ ММО МЕ УНМ АКТ КРА ЕЕО УМ5 тУВ
МУ5МІТ МІН ОЮМ І Ма КЕМ КОК У5М КАЇ. РАР ЕК ТІ5 КАК СОР ВЕР ОМУМ ТІ Р РОВ ЕЕМ ТКМ
ОМ5ІТСІМК ОЕМ РБО ІАМ ЕМЕ 5МО ОРЕ ММУ КТ РРМ 05005 ГРІ УК І ТМ ЮК ВМО рам
МЕ СЗМ МНЕ АГН МНУ ТОК 5І БІР ОК (ЗЕО ІО МО: 137)
Після 1 години інкубації опсонізовані бактерії додавали до мишачих макрофагів та інкубували при 37 "С протягом 2 годин, щоб пройшов фагоцитоз. Після завершення фагоцитозу суміш для інфікування заміщали на нормальне середовище для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для знищення будь-яких позаклітинних бактерій, що залишились, і визначали
Зо загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, через 2 дні, роблячи посіви серійних розведень лізатів макрофагів на чашки з триптичним соєвим агаром (Фіг. 31).
Розщеплюваний стафопаїном ААС міг знищувати внутрішньоклітинні ОБАЗО0О з аналогічною активністю у порівнянні з ААС, що розщеплюють катепсином В. Сіра пунктирна лінія означає межу виявлення для цього аналізу (10 КУО/ямку).
Приклад 29. ААС чинить спрямовану антибактеріальну дію на 5. ашеив за допомогою антиген-специфічного зв'язування з антитілом.
Був вибраний штам Ууоод46 5. аштеив, оскільки він не експресує білок А, молекулу, що зв'язується з областю Ес антитіл (905. Штам Ууоод46 5. ашеиз інкубували з 10 мкг/мл або 0,5 мкг/мл антитіла 54497; ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом і містить розщеплюваний катепсином В лінкер, тіо-трастузумаб НС А118С-МО-мо-РАВ-(диметил-рірВОВ)
ААС-101; тіо-54497 НО М/Т (м8), Сб М20560-МО-мо-РАВ-(диметилрірВОК) ААС-192; ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом і містить розщеплюваний стафопаїном лінкер, тіо-трастузумаб НС А118С-МР-І АРС-РАВСО-(піперазиноВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128); або тіо-54497 НО м1-МР-І АРС-РАВС-(піперазиноВОК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮ МО: 128) ААС-193 протягом 1 години, щоб відбулося зв'язування
ААС з бактеріями (Фіг. 32). Для обмеження неспецифічного зв'язування ААС опсонізовані бактерії центрифугували, однократно промивали та ресуспендували у буфері перед додаваннм до мишачих макрофагів. Після завершення фагоцитозу суміш для інфікування заміщали на нормальне середовище для росту з додаванням 50 мкг/мл гентаміцину для знищення позаклітинних бактерій і загальну кількість внутрішньоклітинних бактерій, що вижили, визначали через 2 дні, роблячи посіви серійних розведень лізатів макрофагів на планшети з триптичним соєвим агаром (Фіг. 32). ААС, що містить розщеплюваний стафопаїном лінкер, ААС-193, міг знищувати всі внутрішньоклітинні бактерії що виявляють, тоді як для ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом, активність не була показана. Аналіз із макрофагами продемонстрував, що розщеплювані стафопаїном ААС можуть знищувати внутрішньоклітинні бактерії. Кон'югат антитіло-антибіотик, тіо-54497 | б м8-МР-ІЇ АРС-РАВО- (піперазиноВоОкК) («коровий пептид» наведений в 5ЕО І МО: 128) ААС-215 ефективний у моделі інфекції МА5А /лп умо.
Мишам СВ17.5СІ0 вводили людський ІдсС, використовуючи режим дозування, бо оптимізований для досягнення константного рівня людських ІдсС у сироватці крові, що становить, щонайменше, 10 мг/мл. Мишей обробляли антитілом 4497 (50 мг/кг), ААС-215 із розщеплюваним стафопаїном лінкером (50 мг/кг) або анти-д00 ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом і містить розщеплюваний стафопаїном лінкер (50 мг/кг).
Мишам вводили однократну дозу ААС-215 через 1 день після інфекції шляхом внутрішньовенної ін'єкції. Всіх мишей умертвляли на 4 день після інфекції та визначали загальну кількість бактерій, що вижили, в 2 нирках (Фіг. 33) або в серці (Фіг. 34), роблячи посіви.
Обробка ААС-215, що містить розщеплюваний стафопаїном лінкер, знижувала бактеріальне навантаження до рівня нижче межі виявлення в 6 з 8 тестованих мишей, тоді як для ААС, що містить контрольне антитіло з тим же самим ізотипом, була показана обмежена активність.
Пунктирна лінія означає межу виявлення для аналізу (333 КУО/миша).
Приклад 30. Вирощування 5. ашгеиз і визначення профілю протеазної активності.
Штам У/осд46 біарпуюсоссив ашгеив (АТОС10832) культивували протягом ночі при 37 "С у триптичному соєвому бульйоні (Т5В) з перемішуванням. Культури центрифугували при 10000 х д протягом 10 хв. Супернатант збирали та пропускали через два 0,22 мкм фільтри.
Профіль протеазної активності 5. ашеив: 150 мл супернатанту культури клітин піддавали концентруванню та заміні буфера на фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5) до кінцевого об'єму 38 мл з кінцевою загальною концентрацією білка 1 мг/мл, використовуючи ТЕЕ (МіПіроге
РейПісоп Хі Саззеце Віотах 10КкОа). Аналіз протеазної активності супернатанту Умооа46 проводили, використовуючи бібліотеку Карій Епаореріїдазе Ргоййпуд | іргагу або РЕРІЇ (Мітоїорев5, Місіогіа, А!йФбігаійа). Бібліотека складається з 3375 флуорогенних пептидів із внутрішньомолекулярним гасінням флуоресценції в 96-ямковому форматі, організованих в 512 груп. Пептиди бібліотеки мають послідовність МСА-Сп1у-Сту-Сіу-Хаа-Уаа-7аа-Сту-Стіу-ОРА-Г ув-
Гуз (ЗБО ІО МО: 132), де МСА відповідає 7-метоксикумарин-4-оцтовій кислоті (донор флуоресценції), і ОРА відповідає Ме-(2,4-динітрофеніл)-І -2,3-діамінопропіоновій кислоті (акцептор флуоресценції). В ямки, що містять 5 нмоль ЕКЕТ пептидів, додавали 5 мкл 5090 ацетонітрилу (Зідта) для розчинення пептидів. У кожну ямку додавали 50 мкл (мікролітрів) концентрованого супернатанту М/оод46 і 50 мкл РВ5. Планшети інкубували при 37 "С і вимірювання флуоресценції проводили через 0, 30, 60, 140 ї 170 хвилин. Флуоресценцію вимірювали за допомогою Тесап Зарпіге?, екстинкція АЗ20 нм/ емісія А400 нм. Кратність зміни
Зо інтенсивності флуоресценції в кінцевій точці розраховували як Кінцева/Е початкова.
Сайти розщеплення субстрату визначали за допомогою ІС-М5 на Аодйепі О-ТОЕ, використовуючи джерело Е5І. 10 мкл із кожної ямки інжектували та розділяли зверненою- фазовою хроматографією на колонці УМаїег5 Хрбгійде ОТ С18 2,5 мкм (4,6 х 50 мм), використовуючи систему ВЕРХ Адіїепі 1260. Зразки елюювали градієнтом 2-9095 буфера В (де буфер А являє собою 0,0595 трифтороцтову кислоту/ 99,9595 води, і буфер В являє собою 0,0495 трифтороцтову кислоту/ 99,9695 ацетонітрил) при 500 мкл/хв протягом 20 хвилин аналізу. Пептиди елюювали прямо в О-ТОЕ мас-спектрометр. Продукти розщеплення визначали, грунтуючись на порівнянні спостережуваних молекулярних ваг з розрахованими вагами, що відповідають розщепленню в кожному можливому сайті.
Приклад 31. Синтез малеїмідо ЕКЕТ пептидного лінкера.
Малеїмідо ЕКЕТ пептид (МР-Іу5(ТАМНАА)-СТу-Спу-АІа-Рпе-АїІа-СтТу-сту-Сспу-Гув(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮ МО: 125), показаний на Фіг.26, синтезували стандартним методом твердофазного синтезу з використанням Еітос, використовуючи пептидний синтезатор
РБЗ (Ргоївіп ТесппоЇодіе5, Іпс.). Для одержання С-кінцевого карбоксаміду використали 0,1 ммоль Етос-І уз(Вос)-КіпКк амідної смоли (Момабріоспет). До першого М-кінцевого залишку додавали Етос-І уз(МЩ-ОН (Момаріоспет), що дозволило вводити додаткові бічні групи після видалення групи МЕ. Акцептор флуоресценції, 5(6)-карбокситетраметилродамін, або ТАМКА (Момабіоспет), приєднували до цього аміну бічного ланцюга на смолі після видалення групи МЕ за допомогою трьох послідовних З0-хвилинних промивань 195 ТФО в дихлорметані з 3905 триізопропілсиланом (ТІ5). Реакція протікала протягом 20 годин. Після цієї стадії кінцеву Етос групу видаляли 2095 піперидином в ОМЕ ії здійснювали зв'язування з малеімідо-пропіоновою кислотою (Васпет АС) за допомогою НВТО. ТАМКА-мічені проміжні пептиди відщепляли від смоли сумішшю 95:2,5:2,5 трифтороцтової кислоти (ТФО)/ГІЗ/води (об'єм/об'єм/об'єм) протягом 2 годин при кімнатній температурі й обережному перемішуванні. Розчин для відщеплення фільтрували та випаровували у потоці азоту для видалення ТФО. Неочищені інтермедіати, розведені в суміші води й ацетонітрилу, піддавали подальшому очищенню за допомогою зверненої-фазової ВЕРХ на колонці Чдиріег 5 мкм С4 (5 мкм, 10 мм х 250 мм) від Рпепотепех.
Після ліофілізації очищені інтермедіати далі вводили в реакцію з 10 еквівалентами МН5З- флуоресцеїну (Тпепто Зсіепіййс) у суміші 50/50 фосфатно-сольовий буферний розчин (РВБЗ)/ 60 диметилформамід (ОМЕ) (об'єм/об'єм) протягом 20 годин, щоб позначити вільний амін С-
кінцевого лізину. ЕКЕТ пептид далі очищали та ліофілізували, як описано вище. Всі реакційні суміші та кінцеві продукти аналізували й підтверджували за допомогою І С-М5.
Твердофазний синтез лінкерів. Всі описані лінкери синтезували з використанням стандартного методу твердофазного синтезу з використанням Етос на пептидному синтезаторі
РЗЗ (Ргоївіп Тесппоїодіев5, Іпс.). Для всіх лінкерів для одержання С-кінцевого карбоксилу використали 0,1 мМ смоли Ванга Етос-амінокислота (Момабіоспет). Лінкери очищали, як описано вище. Приєднання О5У7 аміну (Іпмігодеп) здійснювали реакцією очищених лінкерів з молярним надлишком (в 1,1 раз) 205У7 аміну, молярним надлишком (в 1,1 раз) НАТИШ і молярним надлишком (в 2,2 рази) СІЕА в ОМЕ протягом ночі при кімнатній температурі. Лінкер-
О5У7 далі очищали, як описано вище. Всі реакційні суміші й кінцеві продукти аналізували та підтверджували за допомогою І С-М5.
Приклад 32. Клітинні аналізи розщеплення з використанням ЕКЕТ.
Культури УМоса46 і О5АЗОО інокулювали 1:200 розведенням нічних культур (0,1 мл в 20 мл) в Т5В та інкубували при 37 "С з перемішуванням. Штами культивували до експонентної фази росту та висіювали при щільності 108 клітин/мл і 107 клітин/мл у триптичний соєвий бульйон (Т58). Кон'югат ТпіомМар ЕКЕТ пептид додавали в ямки в кінцевій концентрації ЕКЕТ пептиду 2
МКМ. Планшети інкубували при 37 "С і вимірювали флуоресценцію протягом 210 хвилин, екстинкція Л495 нм/ емісія А 518 нм.
Розщеплення (ШіоБАВ ЕКЕТ пептид і ІпісобАВ таІ-Я4С:АРАСИас-ЮОМАЗІ («коровий пептид» наведений в 5ЕБО ІЮ МО: 126) концентрованим активним супернатантом: І(іобАВ 54497, кон'юговане або з МР-І уг(«ТАМАА)-Спу-Спу-АІа-Рпе-АІа-СтТу-Сту-спту-І у(флуоресцеїн) («коровий пептид» наведений в ЗЕО ІЮО МО: 125), або МР-СІу-СІу-АІа-Рпе-Аїа-СТу-сту-сту-(рірвов) ГА-59 («коровий пептид» наведений в 5ЕО ІЮО МО: 126), інкубували з концентрованим супернатантом
УмМоод46, що був оброблений, як описано вище. ІпіогАВ 54497 і супернатант змішували 1:1 у міліграмах (25 мкг (ШіоБАВ 54497 із супернатантом, що містить 25 мкг білка) у РВ5. Зразки інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Через 2 години реакцію зупиняли розведенням 1:1 0,195
ТЕА. Зразки аналізували за допомогою І С-М5 для визначення ступеня розщеплення та продуктів розщеплення.
Незважаючи на те, що даний винахід був описаний у деяких деталях за допомогою
Зо ілюстрацій і прикладів з метою ясності розуміння, описи та приклади не повинні бути витлумачені як обмежуючі об'єм даного винаходу. Розкриття всієї патентної та наукової літератури, цитовані в даному документі, спеціально включені в даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 СЕМЕМТЕСН, ІМС. «120» АНТИТІЛА ПРОТИ ТЕЙХОЄВИХ КИСЛОТ КЛІТИННОЇ СТІНКИ ТА ЇХ КОН'ЮГАТИ «1305 РАлаБбОВК2О-МО «1405» «141» «1505 14/284,609 «1515 2014-05-22 «150» 61/829,461 «1515 2013-95-31 «1605 150 «1705 РабепЕТп версія 3.5 «21851 «7115 17 «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4800» 1 бує зегобег біп бег Уаї Гей бег Агв АТа Абп о Абп Азп Туєс Тує Ма1 1 5 12 15
А1а «-2185 2 «2115 7 «2125 РЕТ «713» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 2
Тер АтТа бек Тпг Аг 61 Рвпе 1 5.
«218» з «2115» З «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 З б1й бій Ту Туг Те бек Аге Аг ТАг 1 5 «2105 4 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2285 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 4
Авр Тугє Туг Меє ніх 1 5 «210» 5 «2115 17 «2122 РЕТ «213Уу Штучна Послідовність «2205» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005» 5
Тер Ше Азп Рко Гуз бег бІ1у б1у ТБ о Азп Ту АТа б1п Ас Ре бій 1 5 16 15 е1у «210» 6 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність
«221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 6
Авр Суб б1у бег бІу б1у Геш Аг Авр РНе 1 5 18 «2105 7 «2115 16 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «два» 7
АгЕ бего Ап бій Абпо Ге їей бег бек бег Азп Азп Азп Туго беч Ата 1 5 16 15 «2105 8 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 8
Тер Аза бег Те Аге о б1й 5ег 1 5 «21805 З «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка- Опис Штучнеї Послідовності: синтетичний пептид" «480» 5 біп біп Туг Туг АТа Азп Рго Аге Те 1 5
«2105 10 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 19
Ар Туг Туг Ше Нів 1 5 «2105 11 «2115 17 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4805 11
Тер ІТ1е Азп Рго Ап о Тпг бІу біу Те Тус с Тує АТа біп Гуз. Рпе Аге 1 5 10 15
А5р «2105 12 «2115 10 «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «400» 12
А5р Суз біу Ага б1у о1у Гей Аг Ар Пе 1 З 18 «2105 13 «211» 17 «2127 РЕТ
«2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 13 уз бег Д5п біп Абп о Маї Гей А1їа бег о бег Азп А5зро Гуз А5п Туг Гей 1 5 10 15
А1а «2105 14 «2115 7 «2125 РВТ «213» Штучна Послідовність «2285 «221» джерело «2235 /примітка-" "Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 14
Тер Аїа бег ІТе.Аге О1И0 бег 1 5 «210» 15 «2115 9 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005» 15 бІп біпоТук Туб ТА Ап Рго Абе ТАг 1 5 «210» 16 «2115 5 «2125 РТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «100» 16
Ар Туг Туб Пе Нів 1 5 «2185 17 «2115» 17 «2125 РАТ «213» Штучна Послідовність «220У «221ТУ джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 17
Тер Ше Абп Рго Азп ТП бТ1у біу Те Азп Тут АТа біп Гує Рпе біп 1 5 18 15 с1у «210» 18 «211» 16 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 18
Ар Су біу Ап Аїа б1у Гей Агв Ар Ше 1 5 19 «2195 19 «2115 17 «2125 РВТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка- Опис Штучнеї Послідовності: синтетичний пептид" «480» 19
Гуз бег бег біп Азп о Уаї Гей Туг бег обег А5зп Ап Гуз Аб5поТугс Гей 1 5 19 15
Аїа «2105 20 «2112 7 «2125» РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 20
Тер Аза бе Тс Аге бід 5ег 1 5 «2185 21 «2115 10 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 21 бій біб Тук Туг Тбе бЗег Рго Рго Тур: Те 1 5 128 «2105 22 «2115 5 «2125 РТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «400» 22 зег Тує Тер Те 01у 1 5 «2105 23 «2115 17 «2122 РЕТ
«2135 Штучна Послідовність «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 23
Пе Ше Ні Рго біу Азр бек Гу5 Таб АгрЕ Туг бек Ргрго 5ег. Ре біп 1 5 18 15 о1у «2105 24 «2115 29 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-" "Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 24
Ген тує Суб бег. ту б1у бег Суб Туг.5ег А5р АгЕ АТа РПе бег 5ег 1 5 10 15
Гей б1у АтТа біу б1у Туг Туг Туг Туг бТ1у Меє сту Уаї 28 25 «2105 25 «211» 115 «2125 РВТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4ада» 25
Ар Іїе бій Меж Те с1й бег Рго Ар бег Гей А1іа Уаї Зег Ген 01у 1 5 10 15 бі Асе А1а Тег о І1е Азп Су5з Гуз бек бег біп бег Маї Гей бек АгЕ за
А1а А5п о Абй Ап Тує Ту Маї АТа ТгроТус біп Ні Су Рго біу біп де 45
Рго Рго Гуз Ге Гей І1є Тує Тер Атїа его Ти Аг бій Рпе біу Уаї
БО 55 ва
Рео А5р Абе РПе бек 01у бек бІт1у 5ег бІ1у Те Абр Рпе ТНе Геи Те 65 708 75 ва
ІТе Ап 5ег еп біп о А1їа бій Азр Маї А1а Маї Тує Тут Су5 біп біп 85 90 95
Тут Туг Тис бег Аг Абе Тг Рпе біу біп біу ТПг Гуз Ма! вії Ше 180 195 110
Гуз «21ах 26 «211» 119 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «14005 26 біп Уаї б41п Гец Маї біп 5ег сІТу Аїа бій Маї Аге Гуз Рго бІу АТа 1 5 10 15 б5ег Уаї Гуз Маі 5ег Суз Гу5 АТа бег біу Туг 5ег Рпе Тіпг Ар Туг 28 25 за
Туг Мес Ні Тер Маї Аге біп Аїа Рго б1іу біп бІу Гей б14 Тгр Меє 35 40 45 о1у Тер І1е Азп Рго Гуз бе бІі1у бІу Те АбзпоТуг АТїа біп Абе Рее ба біп 91у Асв Ма1 Тис Меї Тиг б1іу А5р. Тпг о бес І1є бег А1а АТїа Тугс 65 79 75 во
Ме А5р це Атїа бес о їеу ТПгобег Абр Азр ТНг АТїа Маї Тук Туг Суб 85 аа 95
Ууаї Гуз Абр Су б1іу бег б1у б1у Гей Аге Ар Ріпе Тер с1у 10 01У 1ї20 185 пе
Таєс Те о Уаї Те Маї 5ег 5ес 115 «2105 27 «211» 112 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400527.
А5р Ше біп Меє Те біп 5еє Рго Авр бег Ге бег Маї бег беу б1у 1 5 16 15 бій Ася АТа ТиПг о І1е Азп Суб АгеЕ бег о Абп біп Абп Гей їей беє 5ег 28 25 за зег АзпоАбЗп Абп Тус Ген АТа Тер Туг біп біп Гує Рго б1у бій Ргро 4е 45
Гей Туз Гесп Ге Те Туг Тер Аїа 5ег Тпг Аге бій 5ег бІу Уа1ї Рго 50. 55 во
Авр АсЕ Ре бек бІ1у бе біу бек біу Тиг Азр Рпе Те Гей Топ ІТе 65 70 75 во зег бБег їеу біп Азїа біш Азр Уаї Ата Маї Туг Туг Суз сІп бій Туг 85 98 а5
Тук Аїа А5п Рго Абе Те Рпе б1у біп біу Тйгогу5 Уаї бІч Пе Гу5 186 185 116 «2105» 28 «211» 113
«2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний поліпептид" «4005 28 біп Уаї бІп Гео біпобіп без Арв Уаі 01 Маї Ту5 Асв Рро об1у Те 1 5 18 15 5Зег Маї Гуз Маї 5ег Суз Ту Тиг обег о1у Тут Тис оРпе 5ег. А5р Туг 28 25 за
Тугє І1е Ні Тер Маї Аге Геч Аїа Рго бТ1у біп б1іу Геч бі) ГСеч Меє до а5 сІ1у Тер ІТе Азп Рго Доп Тпгб б1у бт1у Тс оТубс Туб Атїа біп Гуз РБе 58; 55 ва
Аге Азр о Агр оМаї Те Меї Тиг оАев Ар Те бе ІТ1е АтТа ТБ о А1Та Тусє 65 79 75 ве
Ген б1ч Ме бе обег о їец Те бег о Абр Ар Таг АТа Маї Тус Тує Сув 85 9а 95
АТа Гуз Авр Суб біу Агв б1у 01у Гей Аг Азр ТТ1е Тер б1у Рго 01Уу 160 195 па
Тиг Мес Уаї Тис Уві бег 5ег 115 «2105 29 «2115 113. «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4909» 29 ої ІТе Маї Гей Те б10 бег Рго Ар обег Геч АТа Уві бег Ге ШУ 1 5. 18 15 бі Абе АТа Тис ІТе Ав Суз Гуз 5ек А5побіп Ап Уаї Ген АТа 5ег 28 25 за зег Абп Ар Гуз Аєп о Туг Геї Аза Тер Ре біп Ні Гуз Ргро сО1у б1іп 35 408 45
Рго Гей Гуз еп Гей 112 Ту" Тер Аїа бек І1е Аг 01 бег 51у Маї 5а 55 ва
Рго А5р о АсрЕ Ре 5ег о б1іу 5ег бІу бек біу Тйг Абр Рпе Тнг Ген ТНг 65 78 75 5О
І1е бек бер Ге Аге АТа бі Азр Уаії Аїа Маї Туг Туг Суб біп біп 85 за 35
Тує Тує: ТигоАвп Рго Аев Те Рпе біу бій б1у Тис ув Маї сії РНе 188 185 119.
Ап «219» з0 «211» 119 «212У РКТ «213» Штучна Послідовність «220У «221» джерело «223Уу /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «ой» 38 бій Уаї біп Гей Маї біп бег б1у Аїа біш Маї Гу5 Гуз Рго бІу Тек 1 5 18 15 бег Маї Гує Маї бек Суб Гу АТа бег біу Туг Тег Рбе Тиг А5р Туг за
Туг Ше Ні Тер Маї Аге їец АТа Рго б1у біп бІіу Гей 0Т0 Гем Мет 46 45 б1у Тер ІТ1е Азп Ргео Аби Те б1у 61у Таб Абзп Тук АТа біп Суб РБбе
50: 55 во біп сту Аге Маї Те о Мес Те о Аге Ар о ТИг 5ег ІТе АТа ТАг о АТа Туг 65 78 75 80
Меє бій Гей бег 5ес Їейп Тпе о5еє Азр Ар Тпг АТа Маї Тує Тує Сув 85 96 95
АТа Гуз Азр Суб б01у Азп Аза б1іу Гей Аге Азр ТТ1е Тер б1у Яа1п ШУ 186 1985. 110
Тапе Те Маї Те Маї 5ег 5ег 115 «2105 31 «211» 114 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «да» 31
Азр Ше біп Ге Те біп 5ег Рго Абр о бег о Гец АТїа УМаї 5ег Ге Фу 1 5 18 15 бій Аге А1їа Тпг ІТе Аб5п Суб Гуз 5зегобес бІп Ап УМаї Гей Туг 5ег 29 25 30 бег А5п о АЗп Гуз АЗп о Туг Сей АТа Тер Туг біп бій Гу5 Рго б1у біп да 45
Рго Рго Гує Гей Тец Пе Тус Тер АТа бЗег ТНе Аг 010 бег 01у Маї 50. 55 ве
Рго Ар Аге Рпе бег б1у бег б1у 5ег бІ1у ТАг-о Ар Ре Тиг о Гец ТНе 65 78 75 ве
І1їе6 бе бе Їєц біп АТа бій Ар Уаї Аїа Маї Туг Туг Суз біп б1п 85 за 95
Туг Туг Тиг о бег Рго Рго Туб Те Ре б1у біп бІ1у Тиг о Губ5 Сей бі 190 185 116
Пе би «2180» 32 «211» 138 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220У «221» джерело «293У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «005 32 бІш Уаї б1іп Сеш муаї біп бес б1у АТа б1іц Маї Гу Гу5 Рго біу би 1 5 16 15 5зег Гей Гуз ТТе б5ег Суз Туз 01у бег б1у Ту 5ег Рне Тис 5ег Туг 20 25 за
Тер Те біу Тгр Маї Асв бій Меї Рго біу Гуз б1у ей сій Тер Меє 35 до 45 бІу Те І1е Ні5 Рго біу Авр бег Гу Тс Агре Туг бег Ргро 5ег Ре єв біп бІіу біп УМаї Тс Те бег Атїа Ар Гу 5ег ІТе бег Тр оАТа Туг 65 708 75 во
Гей біп Тер Азпобег о їей цуз АТа бег о Азр Тс АТїа Меї Туг Туг Су» 85 9а 95
АТтїа Аге ем Туг Су5 бег б1іу б1у бег Суб Туг 5ег Абр Ага АТа Ріе 1926 195. 1189 бег бегоїеи б1у Азїа б1у бІ1у Туг Туг Тує Туг бІ1у Меж бт1у мМаї Тер 115 120 125 о1у біп біу Тиб Тис Маї Те Маї бег 5ег 136 135
«21805 33 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 33
АсЕ Аїа бег біп Тие І1е бек б1у Тер Гец А1а 1 5 19 «2105 за «2115 7 «2125 РВТ «213» Штучна Послідовність «2285 «221» джерело «2235 /примітка-" "Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» за4
Гуз Аїа 5ег Тпге Гей 01и 5бег 1 5 «2105 35 «2115 9 «2122 РЕТ «213Уу Штучна Послідовність «2205» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 з35 бІп біп оТук губ бек Туг бег Ре Авп 1 5 «210» 36 «2115 5. «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» зб б5ег тує Ар ТІе Авп 1 5 «2185 37 «2115 17 «2125 РАЕТ «213» Штучна Послідовність «220У «221ТУ джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «414005 37
Тер Мес А5п АТа Ап о 5ег б1у с Азп Тс о1у Туг АТа біп Гу5 Рпе біп 1 5 16 15 с1у «210» 38 «2115 15 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» зв бег бег Пе Сей Маї Ага біу А1їа Ге бІ1у Аге Туг Рпе А5р ГГ єм 1 5 10 15 «2195 39 «2115 11 «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка- Опис Штучнеї Послідовності: синтетичний пептид" «4805 33
Агв А1а бег біп Те Іїе 5ег о1у Тер Геи А1а 1 5 18
«2105 40 «2115 7 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 40
Гуз Аїа бег ТИ" Гей бІМ 5ег 1 5 «2105 41 «2115 9 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4805 41 бІіп б1іп Тугє Гуз 5егоТуг бег РНе Ап 1 5 «210» 42 «-211» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дра» 42 зег Туг Аєр ІТе Авп 1 5 «2105 43 «211» 17 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2295» «221» джерело
«2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «ава» аз
Тер Меє Азп А1Та Ап о бег біу Ап Те б1у Ту" АТа біп І уз Ре б1п 1 5 16 15 щу «210» 44 «2115 15 «212» РЕТ «213у Штучна Послідовність «2205 «221у джерело «2237 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дао» 44 5ег бег Ше їеч Ма1ї Ага б1у А1їа Ге б1у АгЕ Туг Рипе Ар Сем 1 5 19 15 «2180» 45 «2115 12 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «228У «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «два» 45
Аге Аїа бег біп Ре Уаі бек Аге ТпПгобег Геу Аа 1 5 19 «2105 46 «2115 7 «2125 РТ «213» Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «ах 46 оІй Те бег бег Аге АТа Тиг
1 5 «2105 47 «2115 З «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 47
Ні5 Гуз Туг біу бег б1у Рго Аге Тиг 1 5 «2105 48 «2115 5 «275125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дао» 45
Ап Туг о Авр Рпе ІЇТе 1 5 «218» 49 «2115 17 «212» РЕТ «213Уу Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «да» 49
Тер о Меє Ази РРО А5побег Тубє Ап Те сту Тугє б1у біп Гуз РБе СІЙ 1 5 4е 15 1у «2105» 50 «211» 18
«2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «4005 50
Аїа Ма1ї Аге 6б1у біп еп їен бе б1Шш Тус 1 5 16 «2105 .51 «211» 12 «212У РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 51
Др Ата бег бій бек Уаї бегобег бБег Ту Геч АтТа 1 5 18 «2105 52 «211» 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «а80» 52 дер Аза бег б5ег Аге АЗа ТПг 1 5 «210» 53. «2115 9 «212» РВТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка- Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «40805 53 біп Суз Тус біу бек Тиг Рро Аве Реоо 1 5 «2105» 54 «2115» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4800» 54 5ег Тут Азр ІІ1е Авп 1 5 «2105 55 «7115 17 «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 55
Тер Меє Азп Рго Абп о бег бІу Абп ТВге о АбпоТубєб АТа біп Асе Рпе бІп 1 5 18 15 о1у «21805 56 «211» 17 «2125 РКТ «2135 Штучна Послідовність «220» «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 56 бій Аге Тгр о бег Гуз Авр Тис об1у Ні Туб Туг Тус Туг бі1у Ме Ар 1 5 19 15
Уаї
«21805 57 «211» 11 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 57
Агв Аїа бег Ге Азр 112 ТП Авп Ні Сем АтТа 1 5 18 «2105 58 «2115 7 «275125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «аО» 58 бій АТа 5ег І1е Геш біп бег 1 5 «2105 59 «2115 .9 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2285 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «ада» 59 біш Гує Суб Ап обег ТИг о Рго Ас Те 1 5 «219» 60 «2115 5 «2122 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2285»
«2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пегітид" «4005 60
Авп Туг Азр ІТ Авп 1 5 «2185 61 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дав» 61
Тер Меє Ап Рго бек бег б1у Абе Тис о сТу Туг Аїа Рго Гуз Рбе Аге 1 5 16 15 се1у «2105» 62 «211» 15 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «4005 62 біу біу (1у Туг Туг Азр бег бег б1у Ап Туг НІ5 Іїе бек біу Гей 1 5 18 15
Ар Уаї «2105 63 «2115 12 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело
«2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «два 63
Агре Атїа бег біп бе Маї біу Аза ІТе Туг їеи Аїа 1 5 12 «2180» 64 «2112 7 «2125 РВТ «2135 Штучна Послідовність «220У «221» джерело «293У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дво» 64 сІ1у Уаї 5ег А5п Ага Азїа ТНг 1 5 «2105 55 «211» 18 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пелтид" «во» 65 бій Ге Тугб Тйб бек 5ег Агре Аїа Геч ТАе 1 5 10 «21805 66 «2115 5 «2125 РКТ «2135 Штучна Послідовність «2205» «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 66
АТа Туг Аї1а Меє Авп 1 5 «2185» 67
«211535 17 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 67 5зег ІШШе Тиг Гуз Абп 5Зег А5р 5ег Ге Туг Туг АТа Ар бег Маї Гу 1 5 18 15 сіу «2105 68 «2115 19 «25125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дао» 68
Гей АтТа А1а Аге ІТе Ме А1їа Тиг Ар Тус 1 5 10 «218» 69 «2115» 11 «2125» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «ада» 69
Аге АТїа 5ег бій б01у Іе АгЕ А5п С1іу Гец о1у 1 5 46 «210» 70 «2115 7 «212» РКТ «213» Штучна Послідовність «2285»
«2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пегітид" «4005 70
Рго АТа бек Те Ге бім бег 1 5 «2185 71 «2115 З «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «аа» 71 ес біп Ар Ні Ази Туг Ргсо Реб Те 1 5 «2105 72 «2115 5 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 72
Туг Туг 5ег Ме Те 1 5 «2105 73 «2115 17 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «49005 73 5зег ІТте Ар бег бег бег Аге Туг еп Туг Туг А1а Авр бег МУаї Су 1 5 їв 15 оту «2105 74 «2115 18 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 74
Авр б1у Азр Ар ІІТе Ге бег Маї Туг Аге біу бек біу Аге Рго РНе 1 5 18 15
А5зр Туг «2105 75 «211» 11 «2125 РКЕТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пелтид" «во» 75
АгеЕ АтТа 5ег біп бІу І1е6 Аге Азп біу Сей Шу 1 5 10 «2105 76 «2115 7 «2125 РКЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205» «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «49005 76
Ро АТа 5ег ТпгоГеу бІи 5есг 1 5 «2185 77
«2115 5 «212» РКЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 77
Геч б1п Ар Ні Абзп Туг Рро Рго бег 1 5 «92105» 78 «2115 5 «2125 РВТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 78:
Тує Туг 5ег Меє ІТе 1 5 «210» 79 «211» 17 «212» РВТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «йа0» 79 бБег І1е Азвр бег бе бег АгЕ Туг Агв Тує Тук Те А5р бек Уаї Гу 1 5 16 15 св1іу «2105 50 «2115 18 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205»
«2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пегітид" «4005» ва дер біу Ар Авр Т1е їен бег Уаї Тут б1п б1у бек б1у Аге Рго Рпе 1 5 18 15
Азр Туг «2105 81 «211» 11 «212У РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «двох Ві
Аг Ата 5ег бій 5ес Уаї АгЕ Тпг Ап Уа1ї Аа 1 5 та «2105 82 «211» 7 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «цао» 82 біу Аза бег Тпг Аге о АТа б5ег 1 5 «218» 83. «2115 9 «212» РВТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка- Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «408» 83 беч біп Туг Ап Те Тер Ргео Абе Те 1 5 «210» 84 «2115» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «во» 84
Таес Азпо Ар Меє бег 1 5 «2105» 85 «27115 17 «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дах» 85
Те І1їе І1е б1у ІТ1е А5р Азр Те Те Ні Туб АТа Ар 5ег Маї Аге 1 5 18 15 о1у «21805 86 «211» 7 «2125 РКЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «49005» 86
А5п о бег б1у ІТе Ту 5ег Рпе 1 5 «219» 87 к2115 11 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 57
АгсЕ Аїа бег біп Абр ТІ1е б1у бег 5ек Гец. А1а 1 5 168 «210» 88 «2115» 7 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 55
АТтїа Тезе Тпе Сей біп 5ег 1 5 «210» 859 «211» 9 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «1005 89 бІп біп о Гец АбпоАбй Туг о Уаї Ні бег 1 5 «2105 90 «211» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид"
«двох 90
А5р Туг о Атїа Ме 1у 1 5 «2105 91 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220У «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 91
Уаї Маї Тпе бІ1у Ні5 бег Туг дДре Тис Ні Туг АТа Азр бег Уві Гу 1 5 10 15 о1у «2105 92 «2115 12 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 92
АгЕ ІТ1е Тер 5ег Туг біу Ар Азр 5ег Рпе Ар Маї 1 5 16 «210» 93 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «480» 93
Агв Аїа бег біп бег ЇТе біу Ар Аге Гей АїТа 1 5 18
«2185 94 «2115 7 «2125 РЕТ «2135» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 94
Тер АтТа бег Азп Ге бій -1у 1 5 «2105 95 «2115 8 «2125 РКЕТ «2135 Штучна Послідовність «2285 «221у джерело «2235» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дао» 95 біп бій Туг їубє бег о біп Тер бег 1 5 «2105 96 «2115 5 «212» РКТ «213» Штучна Послідовність «22805» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «доа» 96 5ег Туг Ата Меж Авп 1 5 «218» 97 «211» 16 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид"
«41005 97 тус Ше бег 5ег Те бі Те ТІїе Тут Ту АТа Авр бБег Ма! буб5 Є1у 1 5 19 15 «2105 98 «21125 15 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2935 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дво» 98
Авр АгЕ Ге Маї А5р Уа! Рго Ген бес бег Рго Азп бег 1 5 18 «2185 99 «2115 17 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 99 бує зегобег біп бег Те Рпе Аг Те ес Аг: Авп о Гу5 А5зп о Гей Гей 1 5 18 15
АБ
«21905 188 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «ла» 1680
Тер Аїа 5ег Тпе Ас Губ5 5ег 1 5
«21805 101 «2115 9 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «48005 191 б1й біп Ту Рпе бег Рго Рго Туг Таг 1 5 «2105 182 «211» 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2285 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 182 5зег РНе Тер меж ніх 1 5 «212» 183 «2115 17 «2122» РЕТ «213Уу Штучна Послідовність «2205» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 193
Рпе Тйг о Абп Ап о б10 б1у Те оте ТАБ о АТа Тує Ата Азр бек МУаї Агре 1 5 10 15 е1у «210» 164 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність
«221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «414005 194
О1у Ар с01у 61у Сей А5р Ар 1 5 «21805 185 «2115 11 «2125У РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дао» 105
Ав АТа бег біп Ре Тпг Ази Ні Ту Бей Авп 1 5 76 «210» 106 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «оо» 186 уаї А1а бег Абп о Гем с1п 5ег 1 5 «2105 1867 «2115 9 «2125 РВТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка- Опис Штучнеї Послідовності: синтетичний пептид" «400» 187 біп біп бег Туг Аг Тс Рго Туг Те 1 5
«2105» 108. «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 198 б5ег бІ1у Туг Туг Ав 1 5 «2105 189 «2115 16 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4805 189
Туг Ше Ге 5ег біу АТа Ні Тпг Авр о І1е їу5 АТа 5ег Їеи оТу 5ег 1 5 10 15 «210» 118 «2115 11 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «дова» 119 зе біу Маї Туг 5ек Гу5 Туг о бег Гец Ар Маї 1 5 7е «21905 111 «2115 1807 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело
«2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «два» 111
Азр Тїе Уаї Меє Ти" обіп бес Рго б5ег ІТїе еп бек АТа б5ег Маї 61у 1 5 12 15
ДАвр Аги Уаї Тпг ІТе Те Суз Аг А1їа б5ег о біп Тис ІТе бек щу Тгр за
Ген Аза Тер Туг бТ1п бій Гуз Рго А1їа 610 Аза Рго Суб Геш Гец Те де 45
Туг Гу5 АТїа бег ТИг Ге бі бег біу Ма! Рго бег Аге Рпе бег б1Уу 5а 55 бо бег б1у бек б1у Тис бІ1и Рпбе Те Гей Тис Те бес бек Гец б1п Рго 65 76 75 БО
Др дер Ре б1у І1е Туг Туг Суз біп бій Туг Гу бег Туг 5ег Ріе 85 за 95
Азп Рпе б1у б1п біу Тег Гу Маї біш Пе Гуз 160 125 «2105 112 «211» 124 «2125 РЕТ «213у Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «2205 «221» ВАРІАНТ «22251 «223» Хаа - б1п або 510 «2205» «221» ВАРІАНТ «222У 2 «223» Хаа - Меє або І1їе або Маї «40ах» 112
Хаа Хаа бій Сен Уаї біп бег біу Аза біз Маї Су5 Гуз Рго біу АТа 1 5 16 15 бег Маї бух Маї бек Суб біш А1а бег б1у Туг Те Гей Тиг бег Тусє 28 25 зе
А5р І1їе Азп Тгр Маї Аге б1п Аїа Тйг біу б1п Ту Рго бі Тер Мес 35 40 45 оту Тер Мебс Ап АТа Ап бег 01у Ап Те б1у Туг Аїа біп Гуз Рре
БО 55 ва біп с1у Аге Маї Тйб о їеши Тибос1у Абро Те бег о ТТе 5ес Тис о АТа Тує 65 78 75 во
Меє 01 Ге бег о бег Ге Аге бег бі А5р Тег АТа Ма! Тує Туг Суб 85 90 95
Аза Аге 5ег о бег І1е Ге Ма1 Агро біу А1їа Ген сІу Аве Туг Рпе Авр 160 185 110
Ге Тер б1у Агв біу ТНг о Ге Маї Тиг Маї 5ег 5ег 115 1206 «21805 113 «211 214 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221». джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 113
Ар ТТе Маї Меє Тис о біп бег Рго бег Т16 Ге 5ег АТа бег Маї с1у 1 5 18 15
Азр Аге Маї ТК оІ1е Те Суб Агв АТа б5ег б1іп Тг Т1е бег 01у Тер зе
Геч Аїа Тгр Туг біп біп Гу5 Рго АТа бі АТа Рго (уз Сей Їец ІТе ча 45
Туг Суз Аїа бек ТиИг Гей бі) бег біу Маї Рго б5ег Агд Ре 5ег б1у 5а 55 ба бег б1у 5ег 01у ТиИг біш Рпе Те Те Тис ТТе бек бег Ген біп Ргро 65 7а 75 86
А5р А5р Рпе бІ1у І1е Туг Туг Сух біп біп Ту Гу 5ег Туг бег Рпе 85 90 95
Азп Ре б1у б1іп с1у Тйгб оСуз Маї 561 ІТе Гуз Ав Те УМаї АТа АтТа
180 105 1186
Рго бе Уаї Рпе ІТе Ре Рко Ргро 5ег Авр 01 бій Гей Тузобек Шу 115 120 125
Тиг АтТа его Маї Маї Су5 Се Сей Ап Азп Рпе Туг Рго Аге 61 Аїа 136 135 149
Гує Маї 51п Тгр Суб Ма! Ар Азп АтТа Ге б1п бег О1у Аб5п бег біп 145 150 155 т6а бій бег Маї Те бій біп Аєр бег Гуз Авр о бег ТиИг Туг бегоГСец 5ег 165 170 175 бек ТИгб Ге Таб Сец беб Гуз АТа АвроТуб бій Суб Ні Суб Маї Туг 180 185 198
АТта Суз бій Маї Ти Ні бій б01у Гей 5ег бе Рго Маї ТигоГСу5 б5ес 195 20806 205
Рпе Ап Аг біу 01 Суб 218 «219» 114 «211» 453 «2125 РТ «213» Штучна Послідовність «220» «221У джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «005 Т14 біп мес бій Геш Уа! б1й 5ег б1у А1а бій Уаї Гуз Гуз Рго с1у Аїта 1 5 18 15
Зег Маї Гу5 Уаї Зег Суз 01 Аїа зег б1у Туг ТВг Се Тис о5ег Туг 268; 25 зо
Азр І1е А5п Тер Уаї Аге б1п Аза Тс о б1у бТп б1у Рго оїм Тер Меє да 45 бІу Тер Мес А5п АТа Азп бег біу АзпоТие б1у Тус АТа б1п. Су Ре 5а 55 ва біп б1у Агро Маї Те ей Тве біу АД5р Тс бег Т1е бег Таб Аза Туг 65 70 75 во
Мес б1іч Гей бег бег Гей Агя бег бі Азр Те АТа Уаї Тус Тук Сув 85 ав 95
А1їа Аге б5ег бег Іїе Гей Ма1ї Аг б1у А1а їей 0Т1у Аг Тук Ре Ар 180 185 110
Ген Тер. б1у Аг біу Те Ге Уа! Тийг Уві бБег 5ег Аїа 5ег ТИг Гу 115 126 125 біу Рго 5ег Уаї Рпе Рго Ген АТа Рго 5ег бек Гу5 бек ТИг 5ек 01У 130 135 140
Сіу тпг о Аїа АТа Гбец б1у Суб цей Маї су Др Тус Ре Рго бій Рео 145 158 155 168
Уаї Те Маї 5ег Тер Абпобег біу А1а Гей Тпгобесг біу Маї Ні5 ТНг 165 170 175
Ре Рго АтТа Уаї Сем біп бег 5ег бі1у їеч Тугобег Геи бег бег Уаї 188 185 1959
Уаї Тпг Маі Рго б5ег 5егобег Ге біу Тпг б1іп Тйг Туєб Ше Су5 Авп 195 290 295
Уаї Абпо Ні губ Роб бе А5п Те ОСує Маї Абро Гуз Губ ма! 01 Рго 216 215 220
Гуз бе Сує Дер губ ТВ Ні ТП Су Рго Рго Су Рго АТа Рго 01 225 230 235 240
Ген Ге с1у ту Рго бег Ма! Рпе Гец Рпе Рго Рго їу5 Рго Гу А5р 245 25 255
Тиго Сен Меї ІТїе бек Аге Тиг о Рко 01 Уаї Те оСуз Маї Ма1ї Маї Ар 268 265 270
Уаї 5ег Ніб5 біч Ар Рго оїц Уаї (у5 Рпе Азп Тер Туг Маї Азр С1у 275 289 285
Уаї бій Маї Ні Абп Атїа Гуз ТНг Оу Рго Аг 01 б1и біп Туєб Авп 290 295 зав 5ег Тег Туг Аге Маї Маї 5ег Уаї Сеш Те Маї Сей Ні б1й Ар Тер 05 з10 з1і5 28
Ге Абп б1у Гуз бій Туг Гу Су» Гуз Уаії 5егоАбп Гуз Аїа Геи Рго 325 330 335
АТа Рго ІТе біц Гуз Те ІТе б5ег їу5 Ада Гуз біу біп Рго АгЕ би зад за5 з5О
Рго біп Маї Туг Тпге Ге Ргро Рго 5ег Аге бім бли Меє Те був Ап 355 зве 365 біп Маї бек ге Тиг о Суз Сем Маї губ б1у Ре Туг Рго 5ег Азр Пе 370 375 зва
Атїа Маї біш Тер оТи бе Аб5п біу біп Рго 610 Аб5п Азп Туб Гуз Тс 385 з9е 395 лав
Те оРгро Рго Уаї Гей Ар о 5ег о Аб5р б1у 5ег Рпе Рпе Гей Туг 5ег Її уз 405 410 415
Ге Те Уаї Ар Гуз б5ег АгеЕ Тгр біп біп б1у Азп Маї Рпе 5ег Суб 420 425 430 б5ег Уа1 Мек нів бі АтТа Геч Ні Аби Ні тує Тс бій ГСує бек Ге 435 44о 445 бЗег Ге 5ег Ргро с1у аб5е «2105 115 «911» 214 «2125 РЕТ «9135. Штучна Послідовність
«221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 115
А5р ІТе Маї МеєЄ Те біп бек Рго 5ег І1їе Сец бег АТа бег Маї 01У 1 5 18 15
Авзр Аге Маї Тиг о ІТе Тис Суб Асв АТа бек біп Те Ге 5ес а1у Тгр 208 25 за
Гей Аїа Тер Тує бІ1п бій Гу5 Рго Аза бій Аза Рго Гуз Ге Гей Пе де 45
Тус цуз Атїа бек Тк Ге бій бег сту Маї Рго бег Аге Рре бег бу ба бЗег біу бег бі1у Те біш Рпе Тиб Ге Тиб ІТе бег о бег їецд о біп Рго 65 78 75 ве
А5р Азр о Рпе біу Т11е Туг Туг Сув біп біп Тук (ув бБег Туг 5ег Рпе 85 9а 95
А5п Рпе 51у біп біу Те Гуз Маї біш І1е Гуз Аг Тс Ма! Ата Аа 180 195 118
Рго 5ег Ма1ї Рпе ІТїе Рне Рго Рго 5ег А5р бІТй б1п Сеу Суз 5ег С1Уу 115 120 125
Тис АТа бег Маї Маї Су5 Сем Гец Дд5п Абп Ре Туг Рго Аге б1й АТа 139 135 140
Гув Уаї б1п Тер губ Маї Абр А5зп АТа Гей б1побег б1у Абвп 5ег б1п 145 1586 155 169 бій бек Маї Тиг бій біподер бег їуб5 А5р бе Тс Туг Зег о їец 5ег 165. 178 175 б5ег Ти Се Тс Ге бегогуз5 АТа Азр Туг 610 Гує Нів Гуз Маї Туг 186 185 190
А1а Су бій Маї Тие Ні біп біу їей бес о бег о Рго Суз ТНг о Гу5 5ег 195 208 205
Рпе АзпоАсв б1іу ім Су 216 «210» 116 «211» 453 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «2205 «221у ВАРІАНТ «2225 2 «2235 Хаа - Мет або І1е або Ууаї «400» 116 біЧ Хаа б1п Ге Маї біп бег б1у АТа біш МУаї Суб Су5 Рго бТу АтТа 1 5 19 15 зег Маї Гуз Маї 5егоСу5 910 Аїа 5ег б1у Ту Тр еп Те о 5ег Туг 28 25 зо
Азр ІТе Ап Тер Ма1! Аге біп А1їа Те об1у біп бІу Рго бі Тер Меє за 45 бІу Тер Меє Абп Аза Азп о бег бІ1у А5п Те б1у Ту А1їа 610 Гуз РЛе ве сіп б1іу Абв Уаї Те Гей Твг обТ1у А5роТпг 5ег І1е беєг Тс Аїа Туг 65 70 75 во
Мет бій Гей 5егобег Ге Абе бег біс Ар ТНг Аїа Маї Тус Туг Суб 85 за 95
АТа Аге бег 5ег Іїе Гей Маї Аге біу Аїа Ге біу Аге Туг Рпе Ар 1860 185 119
Гец Тер о б1у Аере о1у Те Ге Маї Ти Маї 5есбег А1їа бег Того Гуз 115 120 125 о1у Рго бег Уаї Рие Рго гей А1а Рго бег бек ув бе ТИР 5ег О1У 136 125 1да с1у тТие Аїа АТа Геп СсІу Суб5 Гей Маї Гуз А5р о Тук Рпе Рго б1и Рго 145 158 155 166
Маї Те Маї 5ег Тер Абзп б5ег б1у АТа Гей Ти о5еєб біу Маї Ні ТАг 165 170 175
Рпе Рго Азїа Маї їей біп бег бег бі1у їеи Туг 5ек їен бег 5ег Маї 186 185 1930
Маї Тис Маї Рго бег бег бег ен біу ТИг біп Тиг Туг Ше Сув5 Авп 195 208: 205
Маї А5п Ні Су Рго 5ег А5п Тс оСГуз Маї Азр Гуз Гу Ма1ї 010 Ресо 218 215 220
Гуз 5егоСу5 Ар Гу5 ТИг Нів Те Суб Рсо Рго Суз Рго Аїа Рго біц 225 238 235 240
Геш Ге сту б1у Рго бег Маї Рпе іеи Рпе Рго Рго Губ Рго Гуз Авр 245 258 255
Те ЇемоМебс ІТе бег Аве ТИг о Рго бій Маї Те Суз Маї Маї Уаї Авр 260 265 279
Ууаї бег Ні5є бій Абр Рго біш Маї у Ре Абп Тер Туг Маї Абр 01У 275 280 255
Уаї бій Маї Ні5 А5поАТа Гуз Тис о їу5 Рго Аге бІш бій бій Тує Авп 290 295 зва. бег Тис Туг Аге Маї Маї бег Уаї Геч Те Маї Гей Ні 012 А5р Тер за5 з1ід 315 329
Гей Азп о біу Гуз бій Туг Суб Суз Туз Маї бег о Азп Гуз АТа Гей Рго 325 зза 335
Атїа Рго Іїе бій Гуз Тйг о ІТе 5ег 1їу5 Аза Гуз бІу біп Рго Аге ЇМ здо за5 зва
Бго біп Маї Тут Тег Гей Рго Рго бег Аге бій бій МеєЄ Тег Гу5 Авп 355 зва 365 біп Маі бег еп Типг о Су5 Гей Маї Су5 біу Рпе Туг Рго 5ег Ар ІТе 370 375 зво
АтТа Маї біш Тер бі бек А5п б1у бТ1п Рго СТ Аб5п Абзп о Туг губ ТАе 385 з9аа 3а5 4оо
ТВг о Реро Рко Маї Гец Аб5р бек Ар о1у бег Рпе Рпе гГеу Ту бег Гу 405 щ18 415 йеч Таб Уаї Аєр цу бес Абе Тер б1іп б1п біу Азп Уаї Рее беє Суб до 425 430
Фег ма1ї Меї Ніє бічш А1Та Гец Ні Ап Ні Туг Тиг о бій губ бег Гец 435 ада 445 бе Сец 5ег Рго с1у 450 «21605 117 «2115» 453 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «22805 «2215» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «2205» «2215 ВАРІАНТ «2225» 2 «223» Хаа - Межї або І1е або Уаї «дод» 117 бій Хаа б1п Гей Маї біп бег б1у Аїа бі Маї Гу5 Гуз Рго оТ1у АТа 1 5 18 15 бег Маї Гуз Маї бег Суз бі Аїа бег СТ1у Туг Те Геч Тпг бек Туг 29 25 за
Ар ІТе Абп Тер Маї Ас бій АТа Те б1іу б1п б1у Рго б1й Тер Меж з5 40 д5 бі Тер Межї Азп АТа Абп бег б1у Азп Тис б1у Туг Аїа біп Сує Ріе во біп б1у Аве Маї Тис Гей Те б1у АброТйб бе ІТе бек ТАиг А1а Туг 65 78 75 80
Меє бій їеи бего5ес ей Ага 5ес бій Абр Те АТа Маї Туг Тук Сув 85 90 95
Ата Дре бег бег Ії Ге Маї Аге біу Аїа Ге б1у Аге Туг Ре Ар 180 195 116
Ген Тер 61у Аг біу Те о Ге Маї Тис Маї бег бек Суб бе ТЕГ Гу 115 120 125 б1у Рго бек Маї Рпе Рго Гец АТа Рго 5ег бег о Гує бек Тиг б5ег 01Уу 1306 135 140 о1у Тпг Аза Аза ем біу Су5є Семи Маї Гуз Азр Туг Рпе Рго б1ц Рго 145 158 155 169
Уаї Ти" Маї бег Тер А5п 5ег бІ1у Аїа Ге Тпг обег 01у Уаї Ні Тег 165 176 175
Рпе Рго Аїа Маї Гем біп.обег бег біу Ге Туг бек Ге 5ег 5ег Уаї 189 185. 198
Уаї тТЬг Уаї Рго бег бек о бег Ген біу Тег 018 Те Тут Ше Суб Авбп 195 28а 285
Уаї Ап Ні Туз Рго бег А5й ТипгоГу5 Уаї А5ро губ Гу Маї біч Рго 216 215 229 бує бек Су5 Ар Гу Те Ні Тиб Суб Рго РгооСу5 Рго Ата Рго б 225 230 235 246
Гей Ге б61у сі1у Рко бег Ма1ї Рпе Гей Рпе Рго Рго Гуз Рго уз Ар 245 250 255
Тие Се Меж 116 баг де Тс Рго бі Маї ТигоСух Маї Ма1 Маї Ар 260 265 270 уаї бег нів бі А5р Рго б1и Маї Гуз Рпе Абп Тер Туг Маї Авр 01Уу 275 288 285
Уаї бі Уаї Ні5 Абп дІа Гу Те Гуз Рго Асе 01 бі СбІп Тугє Ап 298 295 зов 5ег Тйг Туг Аге УМаї Уаї бег Уаг Сей Тае Маї цей Ні біп А5р Тер 05 з19 315 320
Іеч Ап б1у Гуз біш Тус Гуз Су Гуз Уаї 5ег А5п Ту5 Ата Гец Рго зв5 зза 335
АТа Рго Т1їє біш Сує5 Тг Іїе бег о Гу5 АТа Суб біу біп Рго Агрф б1и зав за5 35а
Рго біп Маї Тує Те Гей Рго Рго 5ег Аге о біш бій Мебє Те їув5 дп 355 зво з65 б1іп Маї бек Гей Те Суб (ей Маї губ б1у Ре Туг Рго бег Абр Пе 370 375 380
Аїа Уаї бій Тер 61 бек ДА5п біу біп Рго бій А5п Аб5п Туг о сув ТВ 385 398 395 дав
Ти Рго Рго Уаї це Аб5робег Абр б1у бек Рне Рпе Геп Туг бе Гу 495 410 415 еп Тие Маї Абр Гу зег Аге Тер біп біп б1у Азп Маї Рпе 5ег Су 420 425 430 зег Маї Меє Ні5 бій АТа Гей Ні Абп Ні5 Тугс Те біп Гу5 5ег г ец 435 лад 445 5ег цеч бек Рго о1у 4509
«2105 118 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 1185 сі1у б1Ш с1у 61у Гей Ар Ар 1 5 «2105 119 «2115 113 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 119 дер Ше бій Ге Тис бій бег Рго А5р 5ег Іїеи АТа Уаї бек Геми С1Уу 1 5 10 15 бій Аге Аза Те ІТе А5п Суб Суб его бес біп бег Те Рпе Аге Таг 28 25 за 5ег АгЕ Азп суб Азп Гей Ге Азп Тер Туг біп біІп Аге Рго б1у біп 35 да 45
Рго Рго Аг Сей Геч ІТїе Ні Тер Аїа 5ег ТПг Аге Гуз бег біу Маї 5а
Рго Ар Аге Рпе бег біу бек б1іу Ре б1у Тег АброРБе Тиб Сей Те 65 79 75 во
І1е Тпгобег Іец біп АТа 011 Ар Маї Аїа ІТїе Тус Тук Су5 біп оп 85 з9а 95
Туг Рпе бег Рго Рго Туг Тиг Ре біу б1п 61у Те Суз Гец бі) ТТе 166 185 пе
Гу «2105 120 «2115 116 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220У «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «два» 1206 бі Маї біп Гей Маї біш бег біу б1у б1у Геи Ма! біп Рго б1у Шу 1 5 10 15 бег Гей Агв Геш бек Суб бек. АТа бЗег б1у Ре бек Рпе Азп о бег Рне 38
Тер Меє Ніє Тгр Маї Аге с1й Маї Рго с01у уз бІу цем Уа! Тер Пе зег Рпе Те АбпоАбп обі бТу Те Тс Те АТа Тугб АТа Азр о б5ег МУаї 5а 55 ба
Агв поту Аге Рпе Іїе ТІ1е бег Аге Азр о Азп АТа ув А5п Тис Геч Туг 65 798 75 во
Сем бій МеєЄ Азп о Азп Гей Аге б1у біч А5р ТП АТа Маї Ту Туг Су» 85 99 95
А1їа АсЕ 01у Ар сту б1у Гей Азр Абр Тер бІ1у бій с01у ТВг Ген Маї 188 185 116
Тие Ууаї 5егє бе 115 «219» 121 «211» 220 «212У РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205
«2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 121
Авр Т1е біп це ТПпгобіп бек Рго Ар бе Гей АТа Уаї бек їечи С1У 1 5 16 15 бій Аге АТа Тег ІТе Доп Су5 Гуз бек бе бій бег Те РНе Аге ТНг за зег АгЕ Азп Суб Ап Гей Геч Азп Тер Тус біп біп Асе Рго обіу біп до 45
Рго Рго Агв їемо Гей І1е Ні Тер АТа бег Тпг Ася уз бег бІу Маї 5а 55 бо
Рго АзроАге РпПе бек бІіу бег 01у Рпе біу ТТГ оА5р Рпе ТПг Гей Те 65 78 75 во
ІТе Тис бег Гей бій АТа бій Ар Маї Аїа Іїе Туг Тук Су5 біп Сс1п 85 за а5
Тус Ре б5ег Рго Рго Туг Те Ре б1у б1іп б1у Те Гуз Те бій Пе 180 185 116
Гу5 Асе Ти: Уаї Аза АТа Рго бег Маї Рпе Те Рпе Рго Рго б5ег Авр 115 120 125 бі біп Гей уз 5ег біу ТПпг Аа бег Ма! Маї Су5 ей Гей Ап Аз 138 135 140
Ре Туг Рго Аге біш АТа губ Ма! біп Тер Гуз Маї Авр Азп Аїа Гец 145 156 155 169 біпо бек б1у А5п бег біп бі 5ег Маї Тис бій біп Абр бес Гу Ар 165 170 175 5ег ТйгоТуг бег Ге бек о б5ег Те Ген Те Ге бес Гуз Аїа АБр Туг 186 155 190 бій Суб НІ Гу Маї Туг АТа Сух бІи Маї Тие Ні бій оту Геч 5ег
195 280 205 бег Рго ма! Те Гує 5ег Ре Азп АгеЕ с1у 01 Сув 216 215 220 «2105 122 «211х 445 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220У «221ТУ джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 122 біи Ма! біп Ге Маї бі бег о біу біу б1у ей Маї біп Рго 5біу Шу 1 5 16 15 5зег Гец АгеЕ Ген обег Сує 5ег Аїа бег бІу Рпе 5ег Рпе А5п о 5ег Рре за
Тгр Меє Ні Тгр о Маї Агро біп Ма! Рго б1у уз біу Гей Маї Тер Пе 4о 45 5Зег РНе Те Аб5поАбп біо біу Таге Тас Те АТа Тугб АТа Азробег Маї ва
АгеЕ б1уУ Агре Рпе Іїе І1е 5ег Агр Ар А5п АТа їу5 Азп ТАг оГем Туг 65 70 75 во
Ге бій Меє А5п Азп о їец Аге бІ1у бій Азр Тиг о АТїа Маї Туг Туг Суб 85 99 95
АТа Асе б1у бій б1у б1у Гей А5р Азр Тер б1у б1п б1у ТАге Сен Маї 1й82 185 116
Тиг Уаї бег бег А1їа бег Тег Гуз б1у Рго бек Уаї Ре Рго Гец А1а 115 126 125
Рго бегобесг (уз бег Тс обес бі1у б1у Те АТа Аїа Гей о01у Су5з Гей 136 1535 148
Уаї Гуз Ар Тус Ре Рго 510 Рго Уаї Таг Маї б5еє Тер Азп бег Щ1У 145 150 155 160
АТа Їеч Тиг обег о біу Маї Ні Те Ре Рго Аїа Уаї Гец б1іп. 5егє бег 165 1706 175 біу Ге Тук бег Ге бег о бег Маї Ма! Те Уаї Рго 5ег бег бег Гей 189 185 196 біу Те б1іп Таг о Тує Те Суб Ап Маї Абзп Ні Гує Рро бек Ап Тпг 195 2006 205
Гуз Маї Ар Гуз Гуз Маї бій Рго Гу б5ег Суб Ар оГуз ТВге Ні5 Те 210 215 220
Суб Рго Рго Су Рго АТа Рго 01 Ге ге бТ1у б1у Рго 5ег Маї Рпе 225 230 235 240
Геч Ре Рго Рго Гу5 Рго Гуз Ар ТИг без Меє І1е 5ег Агре Тег Рро 245 258 255 бі Маї Тпг Суб Маї Маї Маї Аб5р Маї 5ег Ніб5 біч Ар Рго бій Уві 266 265 278 ув Ре Ап Тер о Туєс о Маї Азробіу Маї бої Ма1ї Ніб5 А5п Аза Гує Те 275 288 285
Гуз Рго Аге біш біц біп Ту Аб5п бег Тпг о Тус Асе Маї Маї 5ег Уаї 220 295 зо
Гей Те Маї Гей Ні5 бій А5р Тер Гей сАзп бІ1у Гуз б1ц Тує Гу Сув за5 зів зі 320
Їує Маї бе Авп Гу5 АТа Гей Рго Аїа Рго Тї1е бі їу5 Тиге І1е 5ег 325 338 335
Гуз АТїа Суз бІу біп Рго Аге біш Рго біп Уаі Тує Те Геч Рго Рго зла за5 350 бБег Аге 61 бій МеєЄ Тиг Гуз А5зпобіп Маї бег Гей Тиг о Су5 Гей Маї 355 зве з65
Гу б1у Рпе Туг Рго 5ег Авр ІТе АТа Маї біч Тер б1и бек Азп 1у 378; 375 зве
Я Рео бі Абп Ап Тус Суб Те Те Рго Рго Уаї Ге Азр о бег Ар 385 зав за5 лад біу бБег Рпе Рпе Ге Туг о бег о їу5з Сем Те УМаї Авр Суб 5ег Аге Тер 485 410 415 біп біп біу Азп Уаї Ре 5егоСу5 бег Уа! Меї Ні бІ1ц Аїа (ем Ні5 420 425 430
ДА5п Ні Тугб Тпг бій Гуз 5Бег Гей 5ег Гей 5ег Рго о1у 435 440 445 «218»: 123 «2115 220 «212» РТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4а0» 123
Азр І1е біп Ге Те б10 бек о Рго А5р о бег Гей Аза УМаї бег і ви 1у 1 5. 19 15 бій Агсв АїТа Те І1е Аб5п Суб Гуз бег 5ег біп 5ег І1е Рпе Аге Тпг зе бег АгЕ А5п Гуз А5п Гей Геш Ап ТероТує 0124 біп Абе Рсо 6б1у 610 д5
Рго Ргбо Аве Ге Ге Те Ні Тер АТа 5ег Тиг ОАЕ Сує бег сту Маї 58 55 ва
Рго Д5р Аг Рпе бег 01у бег бі1у Рпе сту Те Азр Ріпе Тпгб оїеч Те 65 7а 75 во
Т1е Те обер Гео б1п Аїа бі Ар Маї АТа ІТе Туг Туг Су5 б1п бІл
85 за 35
Тут Рпе бек Рго Рго Туг Те Рпе біу б1п с1у Те Суз Тем. 1 Пе 120 185 116
Гуз ДрРЕ Ти" Маї Аза Аїа Рго 5ег Уаї Рне І1е Рпе Рго Рео бег Авр 115 122 125 бІч біб Ге Губ5 бек б1у Те Аза бег Маї Ма1! Суб їец Ге Абп Ап 138 135 140
Рпе Туг Рго Аге бІш Аїа їу5 Уаї бій Тер Гуз Маї Азр Азп о АТїа Гей 145 15090 155 160 бІп бег б1у А5п бег біп бій бег Маї Таб бій бій Аб5р бег уз Авр 165 176 175 бзег ТргоТуг 5ер Сей бегобес Тйг Ге Те Гей бег Гуз АТа Ар Туг 188 185 198 сій їуз Ні у Маї Тук АТа Суз біш Ма! Те Ні біп б1у Ге 5ег 195 280 205 бек Ргро Маї Тир оГу5 5ег Рпе А5п Аге б1у сШ Суб 218 215 228 «210» 124 «211» 444 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 124 біш Уаї біп Гецп Уаї їй бек біу б1у бІу Ге Уаї бій Рго б1у О1у 1 5 10 15 бек Гей АгЕ Гей бек Су бек АТа бег о біу Рпе 5ег Рпе Азп обег Ре за
Тер Меє Ні5 Тер Уаї Агя біп Маї Рго о01у Гуз біу Се Маї Тер ІТе де 45 зес Рпе Тпг о Авбп Абп о бій 51у Те Те Те Атїа Ту АТа А5робег Маї
БО 55 ва
АгЕ б1у Аге Рпе ІТ1е Іїе бек оАгеЕ А5р Азп А1а Гув5 Ап ТНе Ген Туг 65 78 75 89
Ген бій Меж АбподДеп Ге Аге б1у бій Абр Те АтТа Уві Тугє Тук Суб 85 90 95
АТа АгЕ б1у біц б1у 01у Ген А5р А5р Тгр б1у віп б1у Тиг Гей Маї 180 105 110
Те Уаї 5ег бек Суб бег Тбе Гуз б1у Рго бек Маї Рпе Рго Гей А1Іа 115 122 125
Рго зегобег Гу5 5ег ТИго5ег с1у б1у Тиг АТа АТа Гей сіу Сув Гем 132 135 140
Уа1ї Гуз Абр Тук Рпе Рго біц Рго Маї Тиг Маї 5ег Тгр Азп обег 01у 145 156 155 166
А1їа ей Тир обег б1у Ма1ї Ніб5 Ти Ріре Рго А1їа Маї цей сбІТп 5ег бег 165 1708 175 б1іу Гей Туг 5ег Ге 5ег б5Бег Ма! Маї Тпг Маї Рго бег бБег 5ег Теи 180 185 199 бі1у тре бів Те о Туб ІТе Суз Азй Маї Депо Нів Гуз Рго 5ег Аби Тис 195 280 205
Гуз Маї А5р Гуз Гу Уаї бій Рго Гу5 бег Суз Абр Гу Тис Ні тис 218 215 220
Суб Рро Ркго Суб Рго АТа Рго бій Ге Ге біу б1іу Рго бес Уаї Ріє 225 230 235 240
Сем РнНе Рео Рго Гуз Рго Гуз Азр ТВг Гей Меб І1е бег Аге Тиг о Ресо 245 250 255 біш Маї Тис Суб Маї Ма! Маї Ар Маї бек Ні біш Ар Рго би Маї 268 265 276
Гуз Рпе Ап Тгр Туг Уаї Ар б1у Маї бїш Маї Ніє Авп Аїа Гу5 Те 275 280 285
Муз Рго Аг бід бТи б1п Туг Абп бег Те Туг Аг Уві Маї 5ег Уаї 230 295 зев
Ге Те Уаї Гей Ні біп Ар Тер Геч біу Ту5 оТи Туг Ту5 Су Гу 805 з10 з1і5 з29
Ууаї 5ег Ап Гу» АТа Гей Рго Аїа Рго Іїе бій Гуз Тпг оІ1е 5ег Гу 325 33 з35
Атїа уз б1у біп Рго Агро бі Рго біп Маї Туг ТпгоГец Рго Ргео бег зав за5 350.
Аге біш біш Меє Тиго1їуз Ап о біп Ма! его їеми Тпгобуз Гец Уаї Гу 355 зво з65 б1іу Ре Туг Рго зег Ар І1е АТа Уа1ї бі Тер бішч б5егс Азп бІТ1у бІп 370 375 зво
Рго бій Абп Ап о Тує Гуз Тг Те Рго Рго Маї Сей Ар 5ег А5р 61у
З85 396 395 4ов 5Зег Рпе Рпе Гей Туг бег о Гуз Ге ТпгоМаї Азро Гуз 5ег АгЕ Тер біІп де5 4та 415 бІй б1у А5п Уаї Рие бек Сує 5ег о Уаї Мет Ні 610 АТа Сец Ні Авбп 420 425 430
Нія Тує Тиг біп Гує бег Гео бег Ге бег Рго б1у 435 440 «2105 125 «911» 19 «2125. РЕТ «9135 Штучна Послідовність
«221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «2205 «221» МО БЕ5 «222» (1)..(1) «223У Гу5(ТАМКАХ «220У «2215 МО КЕ5 «222» (18). (10) «223У Гуз(флуоресцеїн) «4005 125
Гуз б1у 61у Аїа Рпе Аїа біу біу б1у Суб 1 5 716 «5105 126 «2115 8 «2125 РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «аво» 126 сІу б1у АТ1а Рне Атїа б1у е1у 61у 1 5 «2105 127 «2115 448 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 127 біп Меє біп Ге біп бІш бек біу Рго с1у Ге Маї Су5 Рго 5ек біши 1 5 16 15
ТОпго ге бег Ген бег Су 5ег Уаї бег б1у Аїа бег Аїа его бег С1Уу за
Тус Туг Аз Тер Ма! Аге біп Тпг Рго б1у бІ1у сту це 01 Тер Ше до 45
АТїа Тугс ІТ1е Геу бег о біу АТа Ні5 Те Ар І1е Гуз АТа 5ег Гем 01Уу 5а 55 ва 5зег АгЕ Маії Аїа Ма1ї бег Маї Авр Тис бег Гу Абп о біп Маї Тие Гей 65 706 75 за
АгЕ іеи 5ег б5ег Маї ТНг АтТа Аза А5р ТНеоАїа Тпг Туг Туг Су5 Аа 85 98 95
Аге 5ег бІіу Маї Туг бек їу5 Туг бег Се Азр о Маї Тер Ту біп б1у 188 195 116
Таес Те Уаї Те Уа! 5егобег АТа бе ТиИг оту бІу Рко бек Маї РНе 115 1206 125
Рго Геш А1їа Рго 5ег бег Гуз бег Те бег біу біу Те АтТа Аїа геп 130 135 140 біу Су5х Гей Уаї Гуз Авр Туг Ріпе Рго бі Рго Маї Те Уаї бег Тер 145 156 155 160
Ап бег біу Аїа це Те бег біу Ма1ї Ні Те Рпе Рго А1їа Уаї Гец 165 170 175 біп 5ег б5ег б1у Гей Туг 5Зег Ге бегозег УМаї Маї Тпе Уаї Рго 5ег 189 185 199 зе» 5зес Гей б1у Тиг обІй Те Туб Пе Суб Абп Маї Абп Ні Гує Рго 195 228 205
Зег д5п ТНгоїубє Уаї АзроСув уз Маї бій Рго Гуз бег Сує Авр Гуз 218 215 220
Те Ні5 Те Суб Ргро Рго Суб Рго Аза Рго біш Гей Сей оту 01у Рго 225 230 235 246
Зег Ма1ї Рне Гей Ре Рго Рго Суб Рео Гуз Ар Те Сем Меї Те бег 245 250 255
Аве Тие Рго бій Маї Таб Суз Маї Маї Маї Азр Уаї бег Нів бім Авр 260 265 270
Рго бім УМаї Су5 Ре Азп ТгроТугб Ма! Азр біу Маї б10 Уаї Нів Авзп 275 280 285
А1тїа Гу Те Суб Рго Абе 011 бі бій Туг Авп о бег ТиИг Тук АгЕ Маї 290 295 зво уаї бег Маї Ге) ТпгоМаї Ген Ні біп Ар Тер о Геч Ап бІу Гу бІи 305 з10 315 320
Туг Туз Суб Гуз Маї бег Ап Гуз АТа ге Рго А1а Рго Пе б ув 325 ззе 335
Тигс Ше бег Гу Аїа Гу С1у біп Рго Агя ої Рго б1їп Маї Туг Те зао за5 з5а
Ген Рго Рго бег Аг с0Т1и бій Меє ТПг Гуз Ап о бІп Уаї бек Гец Трг 355 зво 365
Су5 Гей Маї Гуз б1у Рне Туг Рго бег А5р ІТТе Аїа Уаї ої Тгр б1ц 378 375 зво 5ег Азп біу біп Рго біш Азп Ап Тут Гуз Те ТА Рео Рго Уві Теи 385 зав 395 дао
Дер 5зег Азр б1у бег Рпе Ре Ге Туб бек їуз Гей ТАгбо Уа1 А5р Гуз 4еа5 418 415
Фе Агро Тер біп б1іп сІ1у деп Уа! Ре бег Суз 5еїг Уаї Меї Ніб би 420 425 439
АТа ем Ні Аєп Ні Туг Тиг біп уз бег Гец 5ег Ген бег Рго біу 435 440 445 «2105 128 «2115 4
«2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний пептид" «лада» 128
Ге АТа Рпе б51у 1 «2105 129 «211» 6 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «2205 «2215 МО0 ВБЕ5 «222» (33..(33 «223» Пе(те) «400» 129 біу Рго ІШе Ге Ріє Рне 1 5. «2105 130 «2115 6 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4005 139 сС1у Рго ІТїе Гбеч Рне Рпеє 1 5 «210» 131 «2115 5 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність к2205
«221» джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид"
«48005 131 біу с1у Аїа Рпе А1а
1 5
«210» 132
«2115» 11
«212» РТ
«2135 Штучна Послідовність
«2205
«221У джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид"
«2205
«2215 МО КЕ5
«2225 (4)..(6)
«2235 Будь-яка аміно кислота
«220»
«2215 МО0 ВЕ5
«222» (93..(9)
«223» ОРА
«400» 132 бтіу б1у 01у Хаа Хаза Хаа с1у б1у Хаз Гу Гу
1 5 18
«210» 133
«2115 4598
«2125 РАТ
«2135 Штучна Послідовність
«220»
«221» джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовностії синтетичний поліпептид"
«480» 133 біи Маї б1іп Се УМа1ї б1п бег о біу б1іу Абр Ге Маї бій Рго сїу С1у
1 5 18 15
5ег Гей Аг Ге бегоСу5 АТа Аїа 5ег б1у Рпе Тпг Рпе 5ег Ар Туг
28 25 за
АТїа Мет б1у Тгр Ма1 Аг біп Аза Рго б1у ух біу Сем бі Тер цей 35; 40 45 зег Маї Уаї Те біу Ніє 5ек Туг Аге Тйг Ні Ту АТа Авр о 5ег Маї 5О 55 ва
Гу5 б1у Агв Ре ІТїе І1е бек. Агв А5р Абзпобег Гуз Азп Те Ге Рне 65 708 75 8
Сей біп Меє Азпобег Ге Аге А1їа бій А5р Те АТа Уаї Туг Туг Суб 85 90 95
АТїа Гуз Агв Іїє Тер бег о Туг бІ1у А5р А5р бег Рре Азр Маї Тгр С1у 180 195 110 біп с1у Тс Те Маї Таб Маї бег о бег Аїа 5ег ТПг Гуз б1у Рго 5ег 115 1286 125
Маї Рпе Рго Гей АТа Рго 5ег бек у бег Тигобес б1у біу Тпг АТа 130 135 140
Аїа Гец с1у Суз Сей Маї їу5 о Азр Тук Рпе Рго б1и Рго Уаї Тиг Маї 145 156 155 162 бек Тер А5п бек біу АТа Гецп Те 5ег біу Ма1ї Ні5 Тбе Ріпе Рго АтТа 165 170 175
Уаї Сеч біп 5ег бег біу Сем Туг 5ег Гей бег об5ег Маї Ма! Тиг Уаї 1889 185 190
Рго б5ег 5ег бек їв б1у Те біп Ти" Тує ТІе Суб Абп Ма1ї А5п Нів 135 290 295 уз Рго 5ег о Д5п ТИ Гуз Маї Ар Гу5 бух Маї бій Рео Гуз 5ег Су» 2710 215 220
Ар о Гу5 Те Ні Те Су5 Рго Рго Су5 Рго Аза Рго бій Геу це б1у 225 230 235 240 бІу Рго 5егУМаї Ре Гей Рпе Рко Рго Гуз Рео Гуз Азр Те Гей Ме
245 250 255
І1е Бе Ав ТІ о Рго бі Маї Те Суз Ма1ї Маї Уа) Авзр Ма! бег Нів 260 265 270 бІй Ар Рго бій Маї Гу Ре А5п Тер оТує Маї Ар б1у Маї бій Ма! 275 282 285
Ніб5 АзпоАїа Гує Те Гуз Рго Асв бій ої 610 Туг Ап о5ег Те Туг 238 295 зво
Аг Маї Маї бег Маї Ге Тео Уаї бе Ні5 біп Абр Тер Геч Авп о1у оа5 318 315 320
Гуз біш Туг Туз Суб Суб Маї 5ег Ази Гуз АТа Ге Рго Атїа Рго ІШе 325 з3зо 335 ої Ту5 Тис Т1е бек уз АТа Гу5 01у бій Рго АгЕ 01 Рго біп Маї зай 345 350
Ту тн Ге Рго Рго бек Агев СТИ бій Мес Те о ГСу5 Абп біп Маї 5ег 355 зве 365
Гей Таие Су5 Ге МУаї Гуз с1у Ріре Туг Рго бег Азр І1е АТа Ма1 би 370 375 зва
Тер бі 5ег Ап обіу біп Рго бІу Ап о Азп Ту бує Те Те Рго Ргсо 385 зов 395 дав
Уаї Сем Ар бег Азр біу 5ег Рпе Ре Пец Туг бег Гуз Сей Тег Уаї ав 410 415
Авр Туз бЗег Аге Тер бій біп 01у Абп Уаї РБе б5ег Суз 5ег Маї меж 420 425 436
Ні біш Аза Гемш Ні АзпоНів Туг Те б1й Гу5 ек 1ецп бег їец бек 435 440 4д5
Рго 0Іу 45а
«210» 134 «211» 450 «2125 РКЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 134 бій Маї біп Гей Маї біп бек біу б1у с1т1у Маї Ма! б1п Рго 51у б1у 1 5 10 15 бЗег Гей АгЕ Гецозег Су АТасАїа бег б1у Рпе Тс Рпе бего5ег Туг за
АТа Меє Абп Тер Маї Асе бІ1п АТа Рго с1у уз б1у ем Сїш Тер Маї ле 45
Зег Тут І1е бег бе ІТе бій Тиг І1е Туг Туг А1а Авр бек Маї Ту 5а 55 6О біу Агя РНе ТПг о І1е бег Агяе Авр Абп АТа Гу5 Абп бег і! еи Тує Ге 65 79 75 во біп Меє Абп бег Гей АгеЕ А5ро сої А5р Те АТа Маї Тугс Тугс Суз АТа 85 98 95
АгЕ А5р Аге Гей Маї А5р Маї Рго Ге бег б5ег Ро Азп 5ег Тер б1у 180 185 110 оіп сту ТС Гей мМаї Те оМа1ї бе бег Аза бек ТНе Гуз О1у Рео 5ег 115 120 125
Ууаї Рпе Рго їей Атїа Рго бек бе Гу б5ег ТВ об5ег б1у с1у Тйг АТа 138 135 140
АТїа їеч сіу Су5 Ге Уаї Гу5 Авр Тукє Рпе Рго бі Рго Маї Те Маї 145 159 155 166 бег Тер А5п бе б1іу АТа Сец ТПпгобег біу Маї Ні5 Тиг Рпе Рго Аїа 165 1798 175 уаї Гец бій бег бе» біу Гец Тут бек Гей бЗег бег уаї Маї Тиг Маї 188 185 196
Ро 5ег бего бек Гей б1у Тс біп Те Тук Ше Сує Авп Ма1ї Абп Ні 195 280 205
Муз Рго 5ег Абзп о Тс Гуз Ма1 Азр їуб5 Гуз Маї 10 Рго ІГув5. бег Суб 218 215 220
Авр о Гу5 Те Ні ТпбоСуз Рго Рго Суз Рго АТа Рго 51 Геу Геч 01у 225 239 235 240 біу Рго бег Маї Рпе Ге Рпе Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТАг Геч Мет 245 258 255
Т1е бек Аге Тек Рго бі Маї Те о Суз Маї Маї Маї Аєр МУаї бег Ні 260 265 276 бішШ Дер Рео біш Маї уз Рпе Абп ТгроТуг Маї Ар біу Уаї біч Маї 275 280 285
Ніб Азп Аза Гуз ТНг о Гуз Рго Аге бій бій б1п Туг Азп 5его Тс Туг 298 295 зва
АгЕ УМаї Маї бек Уаї Сем Тит оМаї Ген Ні бІп о Азр Тер Сем Азп б1у 305 310 315 320
Гуз бій Тугв Гуз Суз уз Маї 5ег Азп Гу5 АТа Гей Рго АТа Рго ІТе 325 зза 335
І Гуз Те 112 бек губ А1Та уз 01 біп Рго Абе 10 Рго біп Уаї здо 345 358
Тут Те еп Рго Рео его Аге бій бТн Межє Тс оГу5 Азп бій Уаї 5ег зва 265
Меп Те Суб Гей Маї уз бІіу Рпе Туг Рго 5ег Ар ІТе АТїа Ма! бі 370 375 зве
Тер бій бег Ап бІ1у біп Рго бій АзподДбоп Туб о Суз Тс Те Рго Реб 385 зав 395 дай
Маї Їем Азр бег Азр біу бег Ре Ре Гей Туг о бег Гуз Гео Те МУаї да5 10 415
Азр Гуз бег Аге Тгр б1п 51п б1у Азп Маї Рпе бег Суб бек Маї Меє 420 425 4аза
Ні 010 АТа Гец Ні Авп Ні Тує Тис біп Гуз бек Гей бек Гей 5ег 435 дао 445
Рго о01у 45а «210» 135 «2115 5 «212» РТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка- "Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 135
Гей АТа Рне сІ1у Аа 1 5 «210»: 136 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «4995 136
Їеч АТа Ріе Ата Ата 1 5 «2105. 137 «211» 446 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність
«221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «49005 137 біш Маї бій Ге Маї бі бек бІ1у б1у сту Ге Маї біп Рго б1у Шу 1 5 16 15 бЗег Ген АгЕ іец бек Суб бег А1Зїа бек оТ1у Рпе бег Ріпе Абп бег Ріє 28 25 за
Тер Меє Ні5 Тгр Маї Аг біп Ма! Рго б1у Гуз 01у Гей Маї Тер Це до а5 5ег Рпе Тс деп Ази 010 біу Те Тс Тле АТа Тук о АТа Ар о бег Маї ба
АгЕ 01у Аге Рпе І1їе ІТ1е бес.Агев Аб5р Ап АТа Гуз Ап Тс Гбеч Туг 65 78 75 во
Їеи 61 Меє Аоп оАбп оїеи Аге о1у бій Абр Те Аза Маї Тугс Тук Суб 85 9а 95
АТа Аге с1у Д5р біу б1у Ге А5р А5р Тер б1у біп б1у Те Ген Уаї 180 105 118
Те Уаї бег о бег Аїа 5ег Тиб був біу Рго 5ег Маї Рпе Рго Геч АтТа 115 120 125
ВБго бег бег іїуз 5ег Тиг бег бІу біу Тпг АТа Аїа їеи б1іу Су5 ем 138 135 140
Уаї Суб Авр Туг Ррпе Рго бі Рго Уаї Те Уаї бег Тер Авп 5ег 01Уу 145 158 155 168
Аїа Геш Тиг обег біу Маї Ні Тег Рне Рго АТа Уаї еп біп бег 5ег 165. 170 175 бІу Те Туг бег Ге бе бе Маї Маї Тиг Маї Рго 5ек 5ег. бег Те 1859 185 132 бі Тк біп Те Ту т11е Суз А5п Маії Ап Ні Ту5 Рго бе Ап ТНг 195 2688 205
Гуз Маї Азр Гуз Гув Уа! бТи Рго Гуз 5ег був Авр губ Ти ОоНів Те 216 215 220
Суб Рго Рго Суб Рго АТа Рго о10 Ген Сен о1у бІТІу Рго бег Маї Рне 225 230 235 240
Ген Рпе Рго Рго Гу Рго Гу Абр Те Сем Меє ІТе бепг АгРе Таг Рго 245 258 255 біш Маї Тис Суб Маї Маї Ма! Ар Маї бег Ні5 бІ1ц Азр Рго біц Маї 260 265 270
Гу Рпе Ап Тер о Тус Уаї Ар 01у Маї бі Маї Ні5 Ап АТа губ ТНге 275 288 285 мує Рго Аге бій бій біп Тус Абп бег ТПг Туг Агсе Ма1 Уаї бег Маї 290 295 зей
Гей Тие Маї Ген Ні5 б1п А5р Тер Тез Азп б1у Гуз бІ1И Туг Суб Суб 3а5 316 315 320
Гуз Ма1ї 5ег Азп оГу5 АТа Гей Рго АТа Рго Т1е сої їу5 Тг Те бек 325 зза 235
Гуз Аа Гуз б1іу біп Рго Аге бі Рго біп Маї Туг ТПпг Гей Рго Реро зай 345 з5а зег Аге б1и бій Меж ТИПй Гу5 Абп бІп Маї бек Ген ТАг оСуз Геи Маї 355 збо 365 вує біу Ре Туг Рго бег Ар І1е АТа Уаї 01 Тер біч бек А5п Ту 370 375 380 біп Рго бій Ази А5зп Тубв гу Те Те Рго Рео Уаї Гей Ар бег Ар 385 з9а 95 400 б1у бек Рпе Рпбе Гей Туг бе Гуз Ге Те Маї А5р Гуз бег Аг Тер
405 А1о 415 біп сТй Ту Ази Маї Ре бе Суб 5ег Маї Мес Ні бТи АТа Гей Ні 420 425 430
Азп о Ні Туг ТНе біп Гуз бек Ге бек Гей бег Рго б1у Ту 435 44а да5 «2105 138 «211» 445 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «дво» 138. біч Маї б1іп Ген Маї бІи 5ек о1у біу сТ1у Ге Маї бІп Рео соту 1у 1 5 16 15 б5ег Геп Аг Ге бего Суб бег Аїа бек с1у Рпе 5ег Рпе Азп Зек РПпе за
Тер Меє Ні5 Тер Маї Аге біп Ма! Рго б1у Гуз б1у Гей Ма! Тер І1е 4а 45 бег Рпе Тиг Абпо Аза бі б1у Те Тпгб Тпг АТа Тубс Аїа Авро5ег Уаї 508 55 во
Агв б1у Аге Рпе І1е Іе бег Аге Абр Абп о АТта Гуз Азп Тпг о Ге Туг 65 708 75 во
Геч біш Ме А5поАзп Ге Аре б1у біш Абр ТВгоАТа Маї Туг Туг Суб 85 98 95
А1їа Асе б1у Азр б1у б1у Ге Ар Авр Тер б1у біп б1у Тис Геу Маї 1860 185 110
Те Маї бег бек Аїа бе Тис Гуз біу Рго бег Ма1ї Рпе Рго Гей АТа 115 126 125
Рго его бер Гуз бек ТИг о бего біу бІу Тис Аїа АТа Ге бТу Су бец 1360. 135 140 уаї Туз Азр Туг Ре Рго б1іш Рго Маї Тис Маї бег Трр Дб5побегк 01у 145 150 155 168
АтТа ем Тс о бегобіу Маї Ніє Те Рпе Рго АтТа Маї Гей біп бег бег 165 176 175 б1у Гей Туг бег Гей 5егобег Уа! Маї Те Ма1ї Рго бег бек бег Гей 180 185 180 біу ТБгобіп Те Туєб Те Суб Ап Уаї Ап Ні Гуз Ргро бег оА5п Те 195 2006 205
Гуз уа1ї Абр уз Суб Уаї бІТш Рео Гуз 5ег Суб Ар Гу Ти Ніє Те 219 215 229
Су5 Рго Рго Суз Рго Аїа Рго біш Гей Сеу о1у сту Рео чЗег Уаї Рпе 225 230 235 240
Ген Рпеє Рго Рго Гуз Рго Гуз Ар ТПг Се Ме ІТе бег Аре ТАг Рго 245 250 255 бі Ма1ї Таб Суз Маї Маї Уа! Абр'Маї бег Ніб5 010 Азр Рго б1ц Маї 2606 265 279 уз Рпе Ап ТероТуб Маї Ар біу Маї бі Уаї Ні5 Ап АТа Гуз Те 275 280 285
Гуз Рго Агв бій бі) бій Тук Аза бек Тапе туго Аге Маї Ма! 5ег Уа1 298 295 зав
Ген Ти Ма! Ге пі5 бІй Азр Тер Се Абп б1у Суз бій Тус губ Су за5 316 315 320
Ку Маї 5ег Абп Туз АТа Гец Рго АТа Рго Ге бій їу5 Те Пе 5ег 325 330 335
Гу5 А1їа Гуз біу б1іп Рго Аге бі Рго бІіп Маї Ту Тпго Бей Рго Рео зав 345 350 бек Абе бій бі Меє Те Гуз Ап біп Маї 5ег Ген ТигоСуб5 цец Маї 355 зба 365
Гуз б1у Рпе Тут Рго бег Абр І1е Атїа Уа! б1їи Тер бїи бег Ап 01У з70 375 зве біп Рго бій Ап о Азп Тув Гує Те Те Рео Рго Уаї їеи Авробег Авр 385 з9а за5 дев біу 5ег о Рпе Ррбе Гей Туг 5ег Гу» Се Тис Уа! Абр Гуз 5ег Агв Тгр 405 416 415 біп біп біу А5п Ма! Ре 5ег Суз бег Ма! Меб Ні5 010 АТа Гей НІ 420 425 4аза
Асп Ні Туг ТП о біп Гує бек рем бег Гбеу 5ег Рго с1у 435 де 445 «210» 139 «2115 453 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 139 бій Меє. біп Ге Уаї біп 5ег біу АТа бій Маї Гу Гуз Рго б1у АТа 1 5 18 15 бег Уаї Гуз Маї бе Суб біш Аза бе" біу Туг Тиг Ген Тег 5ег Туг зо
Авр Т1е Абп Тер оМаї Аг біп Ада Тигр о б1у б1й біу Рго сич Тер Меє да 45 оту Тгр МеєЄ Азп А1їа Ап бег біу Азп Тс сту Туг АтТа біп Гуз РПе
Ба 55 ве біп б1у Аге Маї ТНг Ге Тлк о б1у А5р Тагобеб І1е бес Тс АТа Тує
65 79 75 ва
Ме сім Гей бек бек Гей Агро 5ег ої Ар Тйг о АТа Маї Туг Туг Су 85 за 95
АТїа Дре бек бег І1їе Гей Маї Аге С1у Аїа Се с1у Аге Ту Ріе Ар 180 185 16 еп Тер о1у Ага б1у Те о Ге Уаї Те Маї бе обег Суб 5ег Те Гу 115 120 125 біу Рго бег Уаї Рбе Рго Геч АТа Рго бе бег Гуз бег Тг о бег Оу 130 135 140 стІ1у Тип Аза АТа Ге бІ1у Суб Ге Маї Гуз АзроТук Рпе Рго бій Рго 145 159 155 160
Уаї тис оМаї 5ег Тер Азп бег б1у АТа Ге Тиге бег с1у Маї Ні ТНг 165 176 175
Рпе Ро Аїа Маї ем бІіп бег бег сІу Ге Тук б5ес Гец бег о 5ег Уаї 188 185 190
Уаї Тпг оУаї Рго бег 5егобег о Їєи біу Тс біп о Тпг Туг І1е Суб деп 195 280 205
Уаї Ап Ні Гу5 Рго б5ег Азп Те оїуз Уаї А5р Гуз Гуз Маї ІЧ Рго 216 215 220 уз бБег бух Ар Гуз Те оНів Те оСув Рго Рго Су Рго Аїа Рго Їй 225 230 235 240
Мей Ген б1у сту Рго бек Маї Рпе Ге Рпе Рго Рго Ссуб5 Рго Гув5 А5р 245 259 255
Ти Гем Меє Ге бег Ага Тигб Рго бТи Маї Те оСуз Маї Маї Маї А5р 260 265 278
Маї бег Ні 61 А5р Рго бі Маї Гуз Рпе Ази Тер Туг Ма1ї Ар бБ1Уу 275 280 285
Уаї бі Маї Ні5 Аєп Аза уз ТИг Туз Рго Аге бїм бі біп Тує Азп 296 295 зев 5зег Тс оТуг Ага Ма! Уаї бек Уаї Гей ТйгеоУаї Те Ні5 Сіп Аб5р Тгр за5 з16 315 320
Їен Азп ЯТу їу5 ОТ Тук Іу5 Суз Гу Маї бег о Абп їу5 Ата Її ец Рго 325 330 335
АТїа Рго Т1е бій Гуз Те Іїе 5ег їу5 Аїа Гуз бІу бІп Рго АгеЕ бі1ш з4о 345 з5а
Рго біп Маї Туг Тпйг Ге Рго Рго 5вег Аг бій бі Межє Тиг Гуз Азп 355 зве з65 біп Уа! 5ег Ге Те Суб Сем Уаї Гуз біу Ре Туг Ргро 5ег Ар ІТе 878 375 зва
АТа Маї б1и Тер бій 5ег Абзп бі1у біп Рго сІТи Азп Ап Туб ГСу5 Тое 385 зов 395 400
Те Рго Рго Маї Ген Авзр о 5ег Абр б1іу бег Рпе Рпе Гей Туг о бег Гу 405 410 а15
Гей Тек о Маї Ар Гу бек Аг Тер бій бій 51у Азп Маї Рпе бег Суз 4208 425 за бег Маї Меє Ні5 бій Аїа Гей Ні Ап Ні Туг Тис бій Гуз бег Гей 435 448 445 зег Гецч 5ег Рго 01Уу 450 «210» 146 «2115. 453 «212» РКЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215 джерело «223 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний полілептид"
«400» 146 бі Ме бій Ге Маї бій бег б1у АтТа біш Маї Гу5 Гу5 Ргро с1у АТа 1 5 18 715
Зес Маї Суб Ма! бек Суб бій А1їа 5ег бІу Туг Тс Ген Те бег Туг 29 25 зе
Ар І1е А5п Тер Маї Ас б1й АТа Тс оту бій оту Рго б1чЧ Тер Меє оіу Тер Мет Азп Аїа Азп 5ег о біу Аз Те біу Туг Аїа бій Гу5 Рре ва бІіп б1у Асе Маї Тс оГеу ТБг? о бІ1у Ар Тс 5ег ІТїе бег ТАгоАїТа Туг 65 78 75 БО
Ммеє біо еп бег бег Ге АгЕ бек бі А5р Те АтТа Маї тує Тук Су» 85 90 95
Аза Аге бегобег Те ем Маї Аге б1у АТа Гей бІу Агв Туг Рпе Др 160 195 116
Геп Тер б1у Аг біу Тис оїеп Ма! ТПгоУаї бегобесг АТа 5ег ТПг Гу 115 128 125 бІ1у Рго 5ег Уа! Рпе Рго Гей Аїа Рго бег бег Гуз бег Тиг о5зег О1у 130 135 140 біу Те Аїа Аїа Ге б1у Суб Ге Маї Суб Авр о Туг Рпе Рго бій Рго 145 156 155 160 уаї тре Уаї бек Тер о Аб5по5ес бу АТа Ге Тис о бег б1у Маї Ніє Тиг 165 178 175
Рпе Рго Атїа Уаї еп біп б5ег б5ег с01у Гей Тук 5ег Гец б5ег 5ег Уаї 189 1855 130
Уаї Те Маї Рго бек 5ег б5ег Їецу б1у Тпг бій Тис Тугб Ше Сув Авп 195 280 295
Уаї Азп Ні Гуз Рго бег Абп Те Гуз Маії Азр Гуз Гуз Маї б1и Ргео 216. 215 220
Гуз бег Суз Авр Гу Тиг Ні Те Суз Рго Рго Суз Рго Діа Рго 61 225 236 235 240
Меп Гем с1у б1у Рго бе о Уаї Ре Сей Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз А5р 245 2598 255
Тиг Гей Меї І1е бек Аге Тиг оРго бі Маї Тиг оСу5 Ма! Уаї Уаї Авр 260 265 270 уаї бег Ні5 біц А5р Рго біш Уаї Гу5 Ріє Азп Тер Туг Маї А5р с1у 275 2806 285
Маї бтіш Маї Ніб А5п АТа Гуз Тис Гуз Рго Аг бІТи б1И бій Туг деп 290 295 390 бек ТИг о Туг АгЕ Маї Маї 5ег Уаї Гей Те Маї Сем Ні біл Азр Тер 305 з16 315 3209
Ген Азп б1іу Гуз 010 Тук Гуз Суз Ту5 Маї бек Абзп їу5 АТа Гец Рго 325 ззо 335
А1їа Рго І1е б1ц Гу Те ІТІе бег 1у5 АТа Туз о01у б1й Рго Ага 1 зав за5 з5а
Рго біп Маї Туг Тие ГецоРго Рго 5ег Аге бій бішШ Меє ТНг о уз Авп з55 зво 365 бІй Маї бес іїеи Тиг Суб їеи Маї Гуз б1у Ре Туг Рго 5ег А5р І1е зв З75 зво
А1їа уаї бі Тер біц 5ег Азп б1у бІп Рго бій Аб5п Ап о Тус губ ТАг з85 з90 395 4оо
Ти Рго Рко Уаї Гей Абзр бег Д5р б1у бек. Рпе Рпе Геу Тугє б5ег Гу 4а5 416 415
Гец ТгоМаї Ар Гуз б5ег Аге Тер о біп бІіп б1у Азп Маї РНе бег Су 428 425 азе бег Уаї Меж Ні бі Атїа Гец Ні Абп Ні Туг Те біп 1у5 бег Гей 435 дда 445
Зес їеч бег Рго 01у 4509 «210» 141 «211» 453 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «220У «221У джерело «2923» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «доахУ 141 бІй ІТ1е біл Гей Маї біп бег б1у АТа біц Маї Гує Гу5 Рго б1у Аа 1 5 18 15
Бег Маї Гу Маї 5ег Су бій Аїа 5ег б1у Туг Тис Се Трго5ег Туг за
А5р Те Абп Тер Ма! Аге б1йа4 Аза Тйг бт1у біп оту Рго Ти Тер Мес 4а 45 оту Тер МеєЄ Азп о А1Та Ап обег б1у Ап Тис б1у Туг АТа 610 Гу5 Рпе 59. 55 бо біп біу Аге Маі! Тпг Сей ТпгобІу дер Тис обег Т1е бег Тпг Ата Туг 655 79 75 во
Меє ої Ге бек бек Геи АгЕ б5ег бі) Абєр ТП Ата Маї Туг Туг Суб 85 90 95
АТїа АгеЕ бегобес Т1е Геш мМаї Аг б1у А1їа Гей біу Аг Туг Рпе дА5р 166 185: 110
Меп Тер б1у Ас б1у Те оїеи Ма! ТОг о Уаї бег бек Сув бег ТПг Гу 115 126 125 б1у Рго 5ег Уаї Рпе Рго Гей АТа Ро 5ег о бег Гу 5ег Тис 5ег Оу
136 135: 140; біу Ттпе Аїа АТа Гей о біу Суз Гей Маї Гу Азр Ту Рпе Рго 01и Рго 145 156 155 166
Уаї Те Маї бег Тер Ази б5ег б1у АТа Ге Тпгобег 01у Маї Ні ТНг 165 176 175
Рпе Рго Аіїа Уа! Геч б1п бег бег біу Ге Ту" б5ег Гец 5ег о бег МУаї 188 185 130
Уаї Тис Маї Ресо бес бег обег Ге біу Тс обіп Те Туб Те Су5 Авп 195 200 205
Уаї Ап Нібє Гуз Рго 5его Ази Те Туз Уаї Азр о Гуз Гу Ма! 610 Рго 210 215 220 муз 5егоСув АвроГує Тиб о Ніє Тк Суб Рго Рео Сує Рго АТа Рго 1 225 230 235 240 бГеч їеу с1у біу Рго бек Уа! Рпе Геи Рпе Рго Рго Гуз Ргро Гу5 Авр 245 258 255
Те Гей Меє ІТе 5ег Аг Те оРго бій Уаї Тпе Сує Уаї Маї Маї А5р 260 265 279
Уаї 5ег Ні ОТ Ар Рго біч Уаї Гу5 Рпе Азп Тер Туг Маї Азр б1у 275 288 285
МУаї біш Маї Ні Ап Аїа Гу Тис Гу Рго Аге бій бій біп Туг Авп 230 295 зво бег Тис Туг Абе Маї Маї бек Маї Гей Тис Маї Сей Ні б1п о А5р Тер 385 з16 15 320.
Гей Азп 01у їуб5 от Туг Гуз Суз Гу5 Маї 5ерсА5п Гуз Аїа Геч Рго 325 зза з35
АТа Рго ІШе бій Гуз Те Ше 5зег Туз АїТа Гу біу б1іп Рго Агв БЦ задо 345 350
Рго біп Ма! Тугс Те Ге Ргро Рго бег Аге бі Ти Меї ТП Гу А5п 355 зва 365 біп Маї бек цей Таг Сух їеи Ма! Гуз оТу Рпе Тус Рго 5ег Авр Пе з76 375 зво
Ата Маї бій Тер б1й бег о Аєпос1у бій Рео 61 Ап Азп Ту Гуз Те з85 заа 95 4ва
Тиг о Рго Рго Уаї Геч Ар б5ег Азр біу б5ег РНе Рпе Гей Туг бег І ув 4а5 410 415
Їем Тпе Маї Ар Гуз бег Аге Тер біп біп біу Абп Маї Рпе бег Су» 420 425 азе бе Маї Ме Ні бі АТа Ген Ні Ай Ні5 Туг ТИг обіп їу5 бер ей аз5 440 445 5зег Гей 5ег Реро б1у 45а «2105. 142 «211» А5З «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221»: джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «во» 142 бі) ЛІе б10й Геш мМа1ї бІй 5есг б1у А1а бій Маї Су Гуз Рко б1іу Аїа 1 5 19 15 зег Уаї їу5 Маї 5ег Суб бі Аза 5ег б1у Тує ТПгР Гей Тиг 5ег Туг 29 25 зо
Авр Т1е А5п Тер о Маї Агро біп Аза Те б1у біп о1у Рго бІч Тер Меє 35 да 45 б1у Тер Мет Ап АТа Азпобек біу Азп Тг бІу Туг АТа біп Гуз Рре ва біп б1у Абе Маї Те їеи Те б1у А5р Те 5ес Пе бег Таб АТа Туг 65 79 75 а
Ме бій Геу бегобег Ге Аг о бег біш Абр Те АТа Маї Тує Тус Сув 85 90 95
А1їа Аге бег бег ІТе Гей Ма1ї Аг б1у А1а їеи 01у Аг Туг РНе Ар 186 185 116
Гени Тер. бІіу Аге біу Те Ге Уаї Тпеб Уа! 5ег 5ег АТа 5ег Трг Ту 115 120 125 біу Рго б5ег Маї Рпе Рго Гезч Аїа Рго 5ег 5ег Гуз бек ТАг обег бІ1у 136 135 140 стіу Тпг о Аїа Аїа бец б1у Суб цей Маї су Др о Тус Ре Рго бі Рео 145 159 155 160
Уаї Тиг Маї бек Тер Авп бег б1у АТа Геи Тип бег біу Ма1ї Ні Тпг 165 170 175
Ріе Рго Атїа Уаї Семи біп о бег бег біу Се Туг бег Гей бег бег Уаї т8е 185 190
Уаї Тпг Уаі- Рго б5ег 5его5ег Ге біу Тпг б1іп Тпг Туб Ше оСув Авп 195 200 295 уаї А5п Ні5 (ув Рго бег Ап ТпгоЇу5 Ма1ї Ар Гуз Гу Маї бій Рго 210 215 220
Гуз 5зес Суб Ар Гу Те ОНів Те о Сує Рго Рго Суб Рго АТа Рго 01у 225 230 235 246 меч Гец біу б1у Рго бег Ма1ї Ре Геи Рпе Рго Рго (ух Рго Цу5 Д5р 245 259 255
Те Гепш Меї ІТїе бек Агя Тис Рго бімш Маї Ти оСув Уаї Уа! Маї А5р 268 265 279
Уаї бег Ні бій Авр Рго бій Уаї Гуз Рве Азп Тер Туг Маї Ар Щ1У 275 280 285
Маї біш Маї Ні Авп Аїа (ув Те Гуз Рго Аве бі бі біп Тує Авп 2938 295 зео зег Те Туг Ага Уаї Маї бек Маї Гей Тис Уаї Сей Ні бІп о Абр Тер 05 319 15 з20
Ген Азп бо1у губ 1 Тук Гуз Суб5 губ Маї 5ег Абп Гуз АТа Гей Рго 325 ззо 335
АТа Рго ІТе біц Гуз Те ІТе б5ег їу5 Ада Гуз біу біп Рго АгЕ би здо з45 350
Рго бІп Маї Тує Тлг о їец Рго Рго бег Аге бТш бТи Меж Тпго губ деп 355 збе 365
Стїп Уаї 5ег еп Тиг Суб Тен уаї Гу5 б1у Ре Тус Рго чего Ар Пе 378 375 зва
Атїа Маї біш Тер оТи бе Аб5п біу біп Рго 610 Аб5п Азп Туб Гуз Тс 385 з9е 395. 406
Те Рго Рго Маї ГСеш А5робег Аб5р б1у бег Ре Рпе Сей Тугє 5ег Гу 405 410 415
Ге Тип Маї Азр Гуз 5ег АгеЕ Тер біп біп сІу А5п Маї РЕе. 5ег: Су» 420 425 430 бе Ма1ї Меє Ні5 бі АтТа Гей Ні Ап Ніє Тус Тпг бій Гує бег Геи аз5 дда а45 бек Ге бег Рро 01у 458 «210х 143 «9115» 453 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205
«2215 джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 143 бій Маї біп Сем Маї біп б5ег біу Азїа бій Маї Гуз Гу5 Рго о1у Аза 1 5 18 15 5зег Маї Гуз Маї 5ег Сбуз 610. АТа 5ег бІіу Туг Те Ге Тис бег Туг 28 25 зе
А5р ІТе Ап ТгроУаї Аге біп Аза Тйг о1у біп Ту Рго бі Тер Меє до 45 с1у Тер" Мебї Азп А1їа Ап 5ег 01у Азп Те біу Туг Аїа біп Гу5 Ріе за 55 ва біп бІ1у Аге Уаї Тк Гей Ти б1у А5р Тас бег Т16 бег Тіпг А1та Ту 65 78 75 во
Меж бій Ге бего5ег о іїеи Абе бег бій Абр Тиб АТа Ма1ї Ту Тує Суз 85 за 95
АТа Агв 5ег бег І1е Ге Маї Аге бі1у А1їа Ге б1у Аг Туг РНе Авр 180 185 116
Ген Тер б1у Аг бІ1у Тпг Гей Уаії Тс Маї бегоб5ек Суз бес о Таг Гу 115 120 125 б1іу Рго 5ег Маї Рпе Рго Ген Аїа Рго 5ег 5ег Гу5 5ег Тйг 5ег о1у 130 135 140 б1і1у Те АТа АТа сеї б1у Суб Ге Уаї Гуз Ар Тус РВе Рго сі Рго 145 156 155 166
Уаї Тис Маї бек Тер Абп бег б1у АТа це Тиг о бег біу Маї Ні Тиг 165 170 175
Рпе Рго АтТа Маї Ге біп бег бег Ту еп Туєс бБег Ге 5ег бег Маї 186 155 198
Уаї Те Маї Рго 5ег бе бек ее оТ1у Тйг біп Тре Тус Те Суб Авп
195 280 205
Уаї Азп Ні Гуз Рго бег Ази Те о їуз Маї Азр Туз Суз ма! о1и Рго 216 215 228
Гу5 5ег Суз Абр о цу Те Ні Тпг о Суз Рго Ргро Су5 Рго АТа Рго б1и 225 230 235 240 еп Ген с01у бІ1у Ресо бек Маї Рпе Гей Ре Рго Рго Гїу5 Рго Гуз Авр 245 250 255
Те Ге Меє ТІїе бес Асе Типг Рго бій Ма! Тпг Суб Маї Уаї Уаї Авр 260 265 270
Ууаї бег Нібє 101 д5р Рго бій Маї їу5 Ре Азп Тер Туг Маї Авбр 01У 75 280 2855
Маї б1ц Маї Ні Абп А7а | уз Те Іу5 Рго Ак бі б1ї б1іп Туг Ав 298. 295 зай бек Ти Туєг дге Уа! Маї б5егоУМаї Гей Тис Маї Сей Ніє б1іп А5р Тер за5 з16 315 328
Гей Ап б1у Гуз би Тує Гу5 Суз Гуз Маї бег Азп Гу5 АТа Гей Рго 325 ззо 335
Аїа Рго Іе бІш Гу5 Тис о ІТ1е 5ег їу5 АТа Гу» Ту біп Рго АгеЕ бІц зао за5 з50
Рго біп Маї Туг Тпг о Ген Рго Рго бег Асв бій бій МебЄ Тпг Гу Азп з55 зво 365 біп Уаї бЗег Ге ТиПг Суз Се Маї Гуз бТ1у Рре Туг Рго 5ег Азр Ше 370 375 зве
АТїа Уаї 61 Тер 50 бе Азп біу б1п Рго бій сА5п о Азп Тув Гу Таг 385 зав 395 лав
Те Бго Рго Уаї Гей Абр бек Азр СТу бег Рпе Ре еп Туг бег Гу 405 109 415
Ген Тпе о Маї Ар Гуз бег Аге Тер біп б1п біу Абп Маї Рре бег Суз 420 425 430 зег Маї Меє Ніє біш Аїа Ге Ні Асп Ні Тук Те біп їу5 5ег і ей 435 да 445 5зег Геи бег Рго б1у 450 «2105» 144 «211» 453 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221У джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 14 бі Маї б1п Сей Маї біп ес 01у АтТа бТи Маї Су5 Гу5 Рро сту Аа 1 5 16 15 5ег Маї Гуз Маї бег о Су5 біш Аїа бег о с1у Туг Тр Гей Тигр о бег Туг зо
Азр ІТе Ап Тер о Уаї АгеЕ бій АТа ТВг о біу б1іп б1у Рго 61 Тер Меє да 45 о1у Тер МеєЄ Ап Аза А5п б5ег о1у Ап Тпг бІу Туг АТїа бІіп Гує РНе во бІп б1у Абе Маї Те Ге Те обІт1у Ар оТВг бек Т1е бег ТБ АТа тус 65 78 75 во
Ме біш їеи бе б5ег Гео АсеЕ бег біш Ар ТТН: АТа Уа! Туг Туг Суб 85 за 95
Аїа Аг бег бе Ше еп Уаї Аг 01у АТа Те сТ1у Аге Туг РНе Авр 180 185 116
Мен Тер б1у Аге б1у Тиг Сец Маї ТПг о Маї бегобег Аза бег Тиг Гуз 115 120 125 б1іу Рго 5бег Маї Рпе Рго Гец Аїа Ргро бег 5ег ув бег Тип" Зег С1У 130 135 140 оТ1у Тпб Атїа АТїа Гей б1у Суз Ге Маї Гуз А5р Туг Рбе Рго оїм Рго 145 156 155 168
Уаї Тне Уаї бек Тер Азп 5ег бі1у Аз1а Гец Тпгобеє 01у Маї Ні ТАг 165 1706 175
Рпе Рго А1а Ма! Ге біп 5ег бег б1у Сем Туг бек Гец бего5ег Уаї 1809 185 190 уаї Тг Уа)! Рго 5вг о бегбег їв біу Те бій Тс Туг ІТе Су5 А5п 195 2006 205
Маї да Ні Гуз Рго бег о Азп Те Туз Уаї Ар о Гув Гуз Уаї бій Рро 218 215 228
Іуз бегоСуз Ар Гу Те Ні Те Су5 Рго Рго Суб Рго Аїа Рго б1и 225 238 235 24а
Ген Се біу б1у Рго бек Маї Рпе Ген Рпе Рго Рго Туз Рго Су Ар 245 2508 255
Те Тей Меї ІТе 5ег Аге ТИг Рго бій Уаї Тис Суз Маї Маї Ма! Авр 260 265 270 уаї бег Ні бій А5р Рго біш Маї їу5 Рпе Ап Тер Туг Маї Абвр бІу 275 280 285
Уаї бій Ма! Ні5 А5п АТа Гу Те Гу Ргро Аг б1и 01 б1п Ту: Ап 296 295 зов бек Те Туг Агя Маї Маї бес Маї Гей Те Маї Гей Ні бІй Авр Тер за5 18 315 329
Мей Азп бІ1у Гу5 бТіи Туг Гуз Суб Гуз Маї бег о Азп Гуз АТа Гей Рго 325 330 335
А1їа Рго Іїе бій Гуз Те Ге бес Гуз АТїа Гуз ОТ1у бій Рго Агсе бі1ц зао 345 з5е
Рго біпоУаї Туг Тиг Тео Рго Рго бего Аг бі СІ Меє Тиб Гу Авп 355 зва з65 біп Уаї бек Ге Те Суз тей Маї Гує б1у Рне Туг Рго бег Авр І1е зуд 375 зве
Атїа Маї бій Тер б 5егоАбп б1у бій Рго ОТ Аб5п о Абзп Тук Гув Таг з85 з9а 395 ло
Ти Рго Рго Уаї Сей Ар 5ег Ар біу 5ег Рпе Ре Геч Туг 5ег Гу 495 410 415
Мен Те Маї Ар оСув бег Ася Тер біп бій сту А5зп Маї Ре 5ег Суб 420 425 430. бек Маї Меє Ні бій АТа бе Ні Аби Ніє Туг Тпгс о Оїп Гує бег Гем 435 аде 445 бЗег Гей бег Рго о1у 4509 «2105 145 «211». 220 «2125 РВАТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «до» 145
Ар ІТ1е бій Сей Тиг о біпобес Рго Дер б5ег Гей АТїа Уа! бе о Геч 01У 1 5 16 15 бій Агсе А1та Таб оІї1е Абпо Суб Гу бег о бег бІп о бег ІТе Рпе ре Тис за бегоАгеЕ Авп Гуз Абп Тей Гей Ази Тер Туг бІп біп Абе Рго о1у б1п ла 45
Рго Рго АгЕ Ге Геч Іїе Ні Тер Азїа бес Тиг Агв Гуз бег б1у Маї 5а 55 бо
Рго Абр Асв Рпе б5ес біу бег біу Рпе бІу ТПпге Абр Рпе Те оГеу Те 65 70 75 89
ІТїе Те бек Гей біп АТа біс Азр Маї Аїа Т1е Тує Туг Сув5 б1іп біп 85 90 95
Туг Рпе бег Рго Рго Тут Тпг Ре біу біп бІу ТПг Гуз Ге бі Це 180 195 110
Гуз АгЕ Тйг Маї Аїа АТїа Рго бег Маї Рпе Іе Рбе Рго Рро бег Авр 115 120 125 бій біп Гей Гуз бег б1у ТИС Аїа бег Уа! Маї Сує Гей Гей Ап Авп 136: 135 140
Рпе Туг Рго Аг бій АТа Гу5 Маї біп Тер Гуз Маї Азр'Азп Аза І ец 145 150 155 160 біп бег б01у Аб5п 5ег бів біо бе Уа1ї Те б1у бій Абр бег Гуз Авр 165 176 175 бек Те Туг бек Ге бек обег Те Гей Тис оГеу о б5ег цу АТа Авр Туг 188 185 199 бій цу Ні ух Маї Туг АТта Сух бій Ма! Тпг Ні бій біу Гей 5ег 195 290 205 зе Рго Суб Ти о Гу5 бек Рібе Азп Агро біу би Су 216 215 220 «210» 146 «2115. 445 «212» РТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215» джерело «223 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид"
«400» 146 бі Маї бій Гец Маї бі бег біу біу б1у Геч Маї біп Рго с1у 0Ш1у 1 5 186 75
Зесг їеч Аг Гей беє Суб бег А1їа 5ег бІу Рпе бе Рпе Абпобег Ре 28 25 зе
Тер МеєЄ Ніє Тер Уаї Аге бІй УМаї Рго соту уз бТу Ге Маї Тер Пе 4о 45 5ес Рпе Тс Азп Азлобіи б1іу Тйг Те Те Аїа Туг АТа А5р 5ег Маї 5а 55 ва
Аге біу АгЕ Рпе Іїе І1е б5ег о Аге Ар оАбп о АТа у Азп ТИг о Гей Тур 65 78 75 БО беч біц Меє Ап Ап Ге Ас б1у бій Ар Тг АтТа Маї Тус Туг Су» 85 90 95
А1їа Аге б1у А5р б1у б1у Сеш Абр Авр Тгр б1у біп б1у Тйг Сем Маї 1862 195 119
Те Маї бе бег о Аїа бек ТПго Гуз біу Рго бек Маї Ріпе Ргро Гец АТа 115 1206 125
Рго бего5ег Туз б5ег Тйгоб5ег бі1у бі1у Тпг Аї1а А1а Геи 01у Сув5 їеи 130 135. 140
Уаї уз Ар Туг Рпе Рго Бім Рго Маї Те Маї 5ег Тгр Азп 5ег біу 145 156 155 160
А1Та Гей Те бек б1у Уаї Ні Те Рпе Рго АТа Маї се б1п бег бег 165 178 175 біу Гєи Тугєб бег їв бе 5ег Маї Уаї Те Маї Рго бек бег б5ег Ге 186 1855 130 біу Те біп Тис Тує ТІе Суб Ап Уаї Ап Нів Гу5 Рго бег Азп Тис 195 280 295
Гуз Маї Азр Гуз Гуз Маї бій Рко Гу5 бек Суз Ар о Гу5 Те Нів: Тог 216. 215 220
Сув Рго Рго Суз Рго Аїа Рго бій Гей Гей біу б1у Рго 5ег Маї Рпе 225 230 235 240
Гей Рпе Рго Рго Гуз о Рго Гуз о Авр Тс Сей Меє Т1е 5ег АсеЕ ТНе Рго 245 258 255 ста Маї ТиИг Суб Маї Маї Ма1 Авр Маї бег Ні5 5610 Абр Рго бій Маї 260 265 270
Гуз Рпе Азп ТероТус Маї Ар обіу Уаї бі мМа1ї Ні Азп АТа Гу ТНе 275 280 285
Гуз Рго Ас бі біш бій Тус Або о бес ТВе Туб Агро Маї Маї 5ег Маї 290 295 300
Ге Тег Маї Гем Ні бІ1п Авр Тер Гей Абп о біу Гув ої Тук зує Суб 385 з16 315 320
Гуз Маї бег Азп Гуз АТа Гей Рго А1їа Рго Ге бі їу5 Те Ше 5ег 325 ззо 335
Гу5 Аїа Суб б1у 610 Рго Аге бі Рко бій Ма1! Тує Те Гей Рго Рго зав за5 з5а 5ег АгеЕ біц бі Мет Тиг Гуз А5п бій Уаі бег Сей ТНе Суз Ге Маї 355 збо з65
Гуз сту РБе Туг Рко бек А5р Пе АТа Маї 61 Тер б1ц бег Ап С01У зЗ7в З75 зво бій Реб бі Абп Ай Тує Гуз ТИР ОТие Бго Рро уаї їей Абр бег Ар з85 з90 за5 4до бІіу бек Рпе Рпе Ге Туг бек їу5 Гей Тис Маї Ар губ 5ег АгеЕ Тер 4а5 410 415 біп біп б1у А5п о Уаї Рпе бег Суб бег Уа! Мет Ні біц Аїа Геци Ні 420 425 азо
Авп Ні Туг Те б1п (ув бего Гей бег Гецпоб5ег Рго 01у 435 440 445 «2105 147 «211» 445 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2935 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «005 147 бі Уаї бЇп їемшм Маї бій б5ег біу біу 5їу Ге Маї біп Рго 51у б1у 1 5 18 15 5ег о Геп Агв Ге зекоСу5 бег Аїа бег б1у Рпе бег Ре Азп 5ег Рре 29 25 за
Тер Меє Ні5 Тер Уаії Асв б1іп Маї Реро б1у Гуз Ту Гей Уа! Тер Пе 46 45 зег Рпе Тиг Аб5поАбп бі б1у ТВге Те о Тае АТа Тук АТа Азробеє Маї бо
Асв Ту Агб Рпе І1е І1е бег о АгеЕ А5р о Аб5п АТа Суб Азп Те Сен Тус 65 70 75 80 ей бій Меж Азп о Абп Гей Абе о с1у бій Азр Тс АТа Маї Туг Туг Су» 85 90 95
АТа Агв с01у бі біу б1у Гей Ар А5р Тер б1у біп с1у Те Геч Маї 180 185 116
Те Уаї 5ег бек Суб бек Тигоїуз бт1у Рго бег Маї Рпе Рго Геу АТа 115 126 125
Рго бек бег уз б5ес Тагобег біу біу Тпг АТа Аа є біу Су5 Те 136 135 140 уаї Сувє А5р Туб Рпе Рго 010 Рго Маї Тис Маї бег Тер о Абп бег Ту
145 150 155 169
АЗіа їеи Тс бег біу МаЗі Ніє Те Ре Рго Аїа Уа!Ї Гей біп бег 5ег 165 176 175 б1у Ге Туг бек Геи бег бек Уа1ї Маї Тис Ма! Рго 5ег 5ек бег Гей 180 185 190 б1у Те с1п ТагоТує Ше Суз Ап Маї Азп Ні Суб Рго 5его АбпоТпг 195 280 205
Гуз Маї Авр цу Гує Маї! біш Рго уз бег Су5 Авр Гуз Те оНі ТАг 218 215 220
Су5 Рго Рго Суб Рго АТа Рго сої бе Се б1у б1у Рго 5ег Уаї РНе 225 238 235 240
Геч Рпе Рго Рро Гує Рго Гуз А5р Тс огечз Меж 116 бе Агсе Те Рео 245 256 255 бі Маї Те Суз Ма! Маї Маї Ар Уа! бег Ніб 61 Авр Рго с1у Маї 269 265 278
Гуз Рпе Азп Тер оТус Маї Азр Сіу Маї бі Маї Ні Д5п АТа Гу Трг 275 288 285
Гуз Рго Аге бІи бій біп Туб А5зп о бес Те Ту о Аге Уаї Маї 5ег Уаї 296 295 зо
Мен Тйг о Маї Гей Ні5 біп Ар Тер Гей Абп б1у Суб бій Тугсб цуз Су» 3а5 з16 315 з26 уз Маї! бег Ап Гу АТа Гей Рго АТа Рко Т1е бій Су5є Те 11е бек 325 зза 335
Гуз А1їа ув бІу б1йп Рго Аге бій Рго б1п Маї Тує Тпг Гей Рго Рео з40 за5 з5о зе Аг бій бій Меє ТПгогу5 Азп б1п Маї 5ег Їєеи Тис Су Гєи Маї 355 зва 365
Іу5 біу Рпе Тус Рго 5ег Ар І1е Аїа Маї бі Тер оїи 5ег Азп біу з7а 375 зве бІп Рго бій АбпоАЗп о Туб Туз Те Тео Рго Рго Маї Гей Азр обег Авр 385 зав за5 чад б1у бег Рпе Рпе Сей Туг бег Гуз Ге Те Маї А5р ув бег АгеЕ Тер 4еа5 Але 415 біп біп біу Аєп Уаї Рпе б5ег Су б5ег Уаї Меє Ні 61 Аїа Геч Ні 4208 425 430
Азп Ні Туг Те бій Гу5 бег Ге бев Сеу бек Ргро б1у 435 дае дд5 «21805» 148 «211» 330 «2125 РЕТ «213 Ното зарієпь «498» 148
АТїа беє Те Гуз б1у Рго бег Маї Рпе Рго Ге АТа Рго бег о 5ег ув 1 5 12 15 бе Таиг о 5ег біу б1іу Тис АТа АТа Гей біу Суз Ге Маї Гув Ав5р Туг зо
Рпе Рго бі Рго Маї Тпг о Маї 5ег Тер А5п бе бІіу АТа Гей Тпг 5ег да 45 біу Маї Ні Тк Рпе Рго Аїа Ма! Гей біп бег 5ег біу цей Туг 5ег 5а 55 во їеи бес 5ег Маї Маї Те Маї Рго бЗег 5ег бег Гей 61у Те бій Те 65 7а 75 во
Туг ІТе Суб Азп о Маї АбпоНіб Гу Ро бег Азп о ТИР Гуз Маї Ар Гу 855 9а 95
Гуз Ма! 610 Рго Гуз бег Сує Ар Ту5 ТНг о Ні Тс Сув Рго Рго Суб 186 195 118
Рго А1їа Рго 510 Геч Ген біу б1іу Рго бе Маї Ре Сеш Рре Рго Рго 115 126 125
Гуз Рго губ Авр Тс їен Меє І1е бег Аве ТП оРго оТи Маї Те Су 130 135 140
Уаї Маї Увдї Ар Маї бек Ніб 010 Азр Рго 010 Маї Гу5 Рне Авп Тгр 145 1508 155 160
Туг Маї Ар б1у Маї бій Маї Ні Ап АТа Гу5 Тиг Гуз Рго АгеЕ б1ч 165 179 175 бі біп Тугс Ап о бег Тпб о Туг Аге Маї Маї 5ег Маї Геу ТАг Уаї І ем 180 185 190
Ніє біп о Азр Тер Сей Ап б1у Гуз біш Тує Гу5 Суз Гуз Уаї бег Авп 195 2806 205 муз АТа Ге Рео Аїа Рго Т1е 610 їу5 Тиб ІІе бег суб АТа Гуз О1у 210 215 229 біп Рго Аге бій Рго біб Маї Тує Те Гео Рго Рго бе Абе б1и 010 225 230 235 2406
Межє тре о Гує Азп о біп Маї бег о їєеи Те Суб еп Маї Гу5 б01у Рпе Тус 245 259 255
Рго бег Ар Іїе Аїа Ма! бій Тер б1и бег Абп біу бій Рго біш Авзп 26а 265 270
Авп о Туг Гу5 Те Таб оРео Рго Маї Гей А5р бег Абзр біу бе Рпе РНе 275 280 285 меч Тує б5ег Ту Гео Твг оМаї Дер Гуз бег АгЕ Тер б1іп б1п б01у Ав 298 295 00
Маї Рпе бег Су5 бер Маї Мет Ніб5 бїш АТа Гей Ніб5 дД5п Ні Туг Тиг за5 з1й 315 326 біп Гуз бегоГей бег Гей бек Рго С1у Гуз
325 330 «21805 149 «211» 330 «2125 РЕТ «2135 Ното зарієпв «100» 149
Суб 5ег Тег Гу бІіу Рго б5еє Уві Рпе Рго Гей АтТа Рго бег о бег Її ув 1 5 18 15 5Зег Тгобег біу Ту Тпг АзЗа АТа Ге о1у Суз Гео Маї Гуз А5р Туг за
Рпе Рго бІіш Рго Маї Тпг Ма! бег Тгр о Азпобег о біу АТа Гео Тс 5ег до 45 с1іу Уаї Ні5 Те Рпе Рго АтТа Уаї Гей біп бег бег 01у ей Тує 5ег 5а 55 ва
Гей бег бе Маї Маї Тиб о Маї Рго бе бес бегоїейп б1у Ти б1йп Тис 65 70 75 ве
Туг ІТе Суз Ап. Маї Авп Ні5 Гуз Рро бек Абзп ТПг Гуз Маї дер Гу» 85 9а 95
Гуз Маї бій Рго Гує бег Суб Азр Гуз Тиг Ні ТАг о Суз Рро Рго Суб 180 195 па
Рго АТа Рго біш бе Гео біу о01у Рго бег Уаії Рпе Ге Рпе Рго Рго 115 120 125
Гуз Рго їу5 Авро Те Ге Меб Ше бег Ася ТИб Рго бі Ма1! Те Суб 139 135 140
Уаї Маї Уаї Ар Маї бек Ніє 01 Азр Рго бій Маї су5 Рпе Ап Тер 145 158 155 160
Тус Маї Ар б1у Маї бій Маї Ні Азп АТа Гуз ТР ОГу5 Рго Аге 01 165 179 175 біз бІйп Тур Аби 5ес Те Тук Асе Маї Уаї беб Уаї Гец Тис Маї Ге
180 185 190
Ні біп дер Тер Гем Аб5п с1у Гу5 біш Туг їує Суб Му Ма1ї бек Абп 195 28а 295
Гу5 АТа Гец Рго Аза Рго Іїе б10 їуб5 Те І1е бег їу5 АїТа Гуз 01Уу 216 215 229 бІіп Рго Агв біц Рео 610 Ма1ї Туг Те Геу Рго Рго бег АгЕ б1ц 01 225 230 235 248
Меє Тег о Суз Ап біп Ма! 5ег Ге Тйг оСуз еп Ма1і Гуз б1у Ре Туг 245 250 255
Рго бег о Азр ІТїе АтТа Уаї біш Тер сТ1и бе Азп б1у бІіп Рео б10 Ав 260 265 278
Авп Ту Гує Тис Таб Рго Ро Маї Ге Азр бек Аб5р о б1у бег Ре РНе 275 288 285 беч Тук бе ув Ге Те Уаї А5р Гу5 бег АгЕ Тер б1п б1п о б1у Авбп 290 295 896
Уаї Рпе 5ег Суб бег Маї Меї Ні5 бій Аза Ге Ні5 Д5п Ні5 Туг ТНг 3еа5 з16 315 329 біп Су» бек Ге 5ег Гей бе Рго б1у Гу зза «2105 150 «-2115 187 «2125 РКТ «2135 Ното зарієпь «ц0о5. 150
Аг ТИг оУа1ї АТа АТа Рго бес Уаї Рпе І1е Ріе Рго Рго бег Абр СИ 1 5 18 15 біп Те Гуз бег б1у ТПг.АТа 5ег Маї Маї Су5з Ге Ген АзпоАвп Рпє 28 25 за
Туг Рго Ага б1и А1а їу5 Ма1ї бій Тер Гуз Маї Азр Азп Аза Гей сл з5 40 д5
Зек біу Ап бег б1іп бій бе Маї Те 01 бій Авр бег Гу Авр. 5ег 50 55 во
Тс Тук бек Ге бего5ес Те Сей Таб о Сеу б5ег Гу АТа АвроТує 610 655 70 75 во
Гу Ніб Гуз Маї Тук АТа Сух бі Маї Те Ні бІіп б1у Гей бег 5ег 85 96 95
Рго Ма! Тис Суб бег Рпе Абп Аг біу 01 Су 180 195 «2105 151 «2115 187 «2125 РТ «2135 Ното зарієепь «400» 151
АгЕ Те Маї АТїа Ача Рго бе Маї Рпе Іїе Рпе Рго Рго 5ег А5р 01 1 5 18 15 бІп Ген Гуз бек сту ТПг о Азїа бег Ма! Маї Су5 Гей еп Ап йд5п Рпе 38
Туг Рро Аге бТШ АТа їу5 Маї бІп Тер Гуз Маї Авр Азп АТа Ген оп да 45 бег біу Ап бег біп бій бег Маї Те бі біп А5р бег Гу Ар 5ег 58 55 бо
Те Туг бек Гец бе бе Те оїец Ти" сей бек гу5 АТа А5р о Туг 01 655 78 75 во
Гу Ніє їу5 Маї Туг АтТа Суб бі Ма1ї Те Ніє біп б1у Ген 5ег 5ег 85 98 95
Рго Су5 Тапг Гуз б5ес Ре Азп Агд бі1у и Су 186 185 «21805 152
«2115 42
«212» ДНК
«213» Штучна Послідовність
«220»
«221» джерело
«2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний олігонуклеотид"
«4005 152 сссавасєвс ассавствра їстстрРаате бастссавтї вс 42
«2105 153
«211» 41
«212У ДНК
«2135 Штучна Послідовність
«2205
«2215 джерело
«223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний олігонуклеотид"
«4005 153;
ссавасєрса ссавствсас стстраатєвї астссавттр с 41
«2105 154
«2115 61
«212» ДНК
«2135 Штучна Послідовність
«220У
«221» джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний олігонуклеотид"
«400» 154 ссавввстсс ствЕССссСам Стрісаарсс Сазсиксасс ЕсСттеЕсасає гаагарасає во с ві
«210» 155
«2115 52
«212» ДНК
«213» Штучна Послідовність
«2205
«221» джерело
«223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний олігонуклеотид"
«48005 155 сстрвЕсСсеса вІсСвЕтссаавс сстсстссас стстЕвесаса єСааватараса с 52 «2105» 156 «211» 116 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 156 бій Ма! біп Гей Маї бі 5ег біу б1у б1іу Ге Маї біп Рго біу Шу 1 5 10 15 бЗег Гей АгЕ Гецозег Суз 5ег о Аїа 5ег бі1у Рпе 5ег Рпе Абпоб5ег РПе 28 25 за
Тер Меє Ніє Тгр Маї Аге с1й Маї Рго с01у уз бІу цем Уа! Тер Пе до 45
Зег Ре ТИйг о Азп доп бі С1у Тигс Таб Тис Аза Туг АТа дер бег Маї ва
АгЕ 01у Аге Рпе І1е І1е бег Агро А5р Азп АТа Гуз Абп Тс о Гем Туг 65 70 75 во
Сем бій МеєЄ Азп о Азп Гей Аге б1у біч А5р ТП АТа Маї Ту Туг Су» 85 90 95
Аїа Аге б1іу бій бІіу б1у Гей Азр А5р Трр б1у біп біу Тпг Гей Маї 160 195 116
ТАг Уаї беб бек 115 «2105 157 «211» 445 «212» РТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «223 /примітка- "Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «А00» 157 біш мМаї біп Ге Маї бій бе» б1і1у біу с1у ем Маї біп Рго Ту 6Є1у 1 5 16 15 5зег Ген АгБ Гей б5ег Су5 бег А1Та бе бІу Рне бег Рпе Ап. обег Рне 29 25 за
Тер Меє Ні Тер Маї Агя бій Маї Рго сту уз боТу їеи Маї Тер Те 5ег Рпе Тпгс о Абп о Азп бі 1іу Тс Те Те Аза Туєс АТа Ар о б5ег Уа! 5а 55 ва
Аге бІ1у АгЕ РпПе І1е ІТе бег АгЕ Ар Азп АТа Гуз Аби ТПгоГеци Туг 65 78 75 Бо ен бій Меє Абп о Абп Ге Аг б1у бій А5р Те АтТа Маї Тус Туг Су 85 з9а 95
А1їа дер б1у 610 біу б1у цей Ар дер Тер біу бій Сб1у ТигБ Геу Маї 180 185 116
Те Маї 5ег бег Аїа бек Те оГуз5 б1іу Рго 5ег Уаї Рпе Рго Гей АТа 115 120 125
Рго бег 5ег уз бег Тис о бег бІу б1у Тпг Аїа Аза Сбеч б1у Суб Те 130 135 140
Уаї цу Ар Туг Рпе Рго бі Рго Уаї Тпг Маї 5ег Тгр Ап 5ег Оу 145 156 155 166
АТта цеч Те 5ес біу Уаї Ніє ТП Ре Рго АТа Маї Ге бій бег 5ег 165 179 175 біу Геш Туг бег Ге 5ег бБег Уаї Маї Тпсе Уаї Рго 5ег бег бек Гей 188 1855 1930 біу Те біп Тйг Туг Те Су Аби Маї Абзп Ні губ Рго бек Авп о Таге 195 200 205
Гу5 Ма1ї1 Ар Гуз Гу Маї бімш Рго Туз ес Суз Ар Гуз ТНгОНів ТНге 216 215 220
Суб Рго Рго Су5 Рго Ача Рго бі Гей бе біу бТу Рго 5ег Маї Ріє 225 230 235 240
Ген Рпе Рго Рго цу Рео 1у5 Авр Тис Сем Мес Т1еє бег Аге ТВг Рро 245 250 255 бій Маї ТигоСу5 Маї Ма! Маї Ар Маї бег НІ5 бій Азр Рго біц Маї 260 265 270
Муз Ре Ап Тер оТуг Уа! Дер біу Маї бі Маї Ні Азп АТа Гу5 Тиг 275 250 285
Гуз Рго Аг бі бі біп Туг Абп о бег Тпб о Туг Асе Уаї Маї бег Маї 298. 295 зай
Мем Те о Маї Гей Ні біп Ар Тер Гей Аба б1у Гуз бій Туб Гу5 Суб 305 з16 315 з2а
Гуз Ма1ї бег Ап Гух АТа Те Рго АТа Рго І1е 610 |їу5 Тс І1е бег 325 ззо 335
Гуз АТа Гу5 б1у 010 Рго Аге бІй Рко бій Ма1ї Тує Те Сеч Рго Рго зао 345 з5а бег. АгеЕ бі 012 Мет Тис Гуз Ап біп Уаї бек Геи ТПг Су5 Ген Уаї 355 зво 365
Гуз біу Рпе Туг Рго бек Ар І1е АТа Маї бін Тер бій б5ег Азп 01у 370 375 зво біп Рго 61 Аби Ап о Тує Суб Таге Те Рго Рго Уаї Гей Ар бег А5р 385 з98 395 4о0 б1у бек Рібе Ріпе Гей Тугоб5ег Гуз Ге Тигб Маї Ар Гуз бег Агрв Тер 4а5 410 А15 бій біп б1у Аби Маї Рпе 5ес Суз бег Маї Меє Ні5 б1ш АТа їец Ні д2а д25 430
Авп Ні Туг Те б1іп Гу бе Гей бек Ге беп Рго 1у 435 дда 445 «210» 158 «2115» 214 «2125 РКТ «2135 Штучна Послідовність «220» «221У джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 158
А5р ІІе біп Ге Тйгс о біп бег Рго бег Іїе Гео бег Аза бег Уаї б1Уу 1 5 16 15
Ар Аге Маї Те Пе ТПг Суб Ася Аїа бег біп ТиИг 11е бек оту Тер за
Ген Ата Тер Туг біп біп Гу5 Рго Аїа б1ш АТа Рго Гу5 Гей Ге Пе 4о 45
Туг Гуз А1а бек ТПб Ге бій бег біу Уаї Рго бег Аге Рпе бег 01у 58 55 ва б5ег біу б5ег біу Тис бі Рпе Тс о Гесє Тпгб Ше бе бег ви біп Ргро 65 70 75 во
А5р Авр Ре бІ1у Т1е Туг Туг Суз біп біп Туг Су5 бег Туг Зег Ріє 85 99 95
Авп Рпе б1у біп. сту Тео губ Уаї бій т11е у Аге Те Уаї Аза АТа 1866 185 16
Рго зе МУаї Рпе Ге Рне Рго Рго зег Аєр 010 біп Ге Гуз 5ег 1у 115 126 125
Те АТа бег УМаї Маї Суз Гей Ге Азп Азп Рпе Туг Рго Агв со1ч Аа 130 1535 148
Гуз Маї бій Тер Гуз Маї Ар Ап АТа Гей бій бек біу Азп бег біп 145 158 155 166
СІ бег УМаї Тег біч біп Азр о бег Гу5 Азр бег Тис Туг 5ег.Геи бег 165 178 175 зег Те Сен Таб о Гец бЗес оїуз Аза АброТує бі Сув5 Ні Гу Маї Туг 186 185 196
А1тїа Суб бій Маї Те Ніз б1йп б1у Ген бег бег Рго Ма! Тк Гув 5ег 195 2806 2805
Рпе Ап оАге біу бій Суб 210 «210 159 «2115 215 «212У. РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка- "Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 159 сої Пе Маї Гей Те бій бег о Рго біу Тиг Сей бег Гей 5ес Рго б1у 1 5 18 15 біч АгЕ АТа ТП бе бес Суб Агро АТа б5ег о біп Рпе Ма! 5ег о АгеЕ Тпг за бег Геч Ата Тгр Рпе біп біп Гуз Рго біу біп Рго Ргб Аге Гец 1 еи 4о 45
ТТе Тус бі Ти обес бек Ага Аза Тиг о біу ТТе Рго Азр Аге Ре 5ег 58 5З во о1у бег біу бек 6І1у Те Авр Рпе Тпг о Се Те І1е бе Аге сви сш 65 70 75 ве
Рго біш Азр Рпе А1а Меє Туг Туг Суб Ні Туз Ту біу бег 01у Рго 85 90 95
АгЕ ТпПгоРМпе б1у бІп бу Тип оГу5 Маї 51 Маї їу5 АгЕ Тиг Уаї АтТа 188 185 110 діа Рго бек Уа! Рпе Ше Рпе Рго Рго 5ег А5р І бІп їеи Гу бег 115 128 125 біу Тис АТа 5ег Маї Маї Суб Гей Гес Азп А5п Ріє Туг Рго Аге 010 139 135 146
А1ТІа Гуз Маї біп Тер Суз Ма! Авр Абп АТа Гей біп 5ег бІ1у Авп 5ег 145 150 155 160 біп бі 5ег Маї Те бі біп о Абр бек Суз А5зробег Таг о Туг 5ег | ен 165 176 175 5ег бег Тр оГСе Тс оїей бес Гуз АТа Азр Туг бІ1ц Гу5 Ні Гуз Маї 1809 185 198
Туг Ата Суз 610 Ма! Тик Ні5 б1іп сту Гей бек 5ег Рго Маї ТПг Гуз 195 260 205 5ес Рпе Азп АгЕ п01у ЇМ Су 210 215 «2105» 160 «211» 215 «212» РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 166 бій ТАсе тп гей Те бій бев Рго б1у Тс ей бек Гей бег Рго 01у 1 5 16 15 б1шШ Аг Аза Тс Гей бего Су» АгЕ АТа 5ег бІ1п 5ег МУаї 5ег 5ег 5ег 29 25 за
Тує Гей Ата Тер Туг біп.бІп Гуз Рго б1у біп АТа Рго Гу5 Уаї Гей ла 45
Пе Туг Ар АТа бег бе Агро Аїа Тис с01у ІТе Рго Ар Аге Рпе 5ег 5а 55 ва
О1у бег біу бег біу Тпг Ар о Ре Тс гей Те Пе бег Аге Сем бій 65 70 75 во
Рго бій А5р Рпе АТа Уаї Туг Туг Суз біп Гу Тук 0Ту бег Тиг Рго 85 за 35
АгЕ Рго Рпе СІу біп б1у Тпг Гує Уа! бім І1е їу5Аге ТИг Уаї АТа 180 185 116
АТа Рго бег Ма! Рпе Ше Рпбе Рго Рго 5ег Азр бі б1іп Ге Гуз 5ег 115 120 125 сту Тпг о Аїа бег маї Уаї Суб це гец Абп о Ап РНе Тук Рго Асе б 138: 135 140.
Атїа їу5 Маї біп Тер їуб5 Ма! Абр А5п АТа їемш біп бег біу Азп бег 145 1598 155 168 біп бій бес Уаї Те бід біп Абр бег Гуз Авробег Те Тує бег Ге 165 179 175 бег бег ТНг Гей Тис Ге обег о Гу5 АТа Ар Тугє бій Су Ні5 ГСу5 Маї 189 185 т8а
Туг АТа Су5 бій Маї Тиг Ні» біп б1у Гей бек бе? Рго Уаї Тиг Гу 195 298 295 5ег Рбе Ази Аге О1у бІчЧ Су 218 215 «2105 161 «2115» 214 «2125 РКТ «2135 Штучна Послідовність «220У «221» джерело «223» /примітка- Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «аа» 161
Ар МУа1 Маї Меє Тие бій беб бек бе б5ег їв бе АТїа бег Уаї 01У 1 5 10 15
Авзр Аге Маї Те Іїе Тпг Суб Агв АТа бек Гей Азр ІТ1е Таб о Абп НІіб5 за еп АТа Тер Туг бІп бІ1й Гуз Рго б1у 01 Гей Рго їу5 Гей Ге Ше
Туг бічш Аїа 5ег ІІїе Ге бій 5ег біу Ма! Рго бег Аг Рпе бег 01Уу за 55 ва зе бІ1у бек б1у Тк Азр Ре ТАг оБбец Тле 1Те бег бег їей біп Рго 65 78 75 о бі Ар уаї Аїа Те Тут Туб о Сує біш Гуз Суб Ав бег ТИпг о Рго Аее 85 за 95
Таг Рпе сіу біп о б1іу Тс о1у5 Маї біш ІІе (їу5 Аг Те Маї Аза Аїа 180 185 116
Рго 5ег Маї Рпе І1е Рпе Рго Рго 5ег Азр бій біп Гей Гуз бег С1У 115 120 125
Те Атїа 5ег Уаї Маї Сує Гбец Гео Азп Азп Рпе Туг Рго Аге бід АТа 130 135 1419 муз Маї біп Тер Гує Ма! Ар. А5зп АТа Гей біп бе біу Аб5п 5ег біІп 145 156 155 166 бій бен Уаї Тиеб б10 біп о А5р бе їу5 Абр 5ег Те Туг бег Геу 5ег 165 1708 175 бег Таб Гей Таб Се бего Гуз А1їа АероТуг бІТи Гу НІб губ Маї Тук 188 185 199
АТа Суб бій Маї Те Ні біп б1у Гей бег бег Рго Маї Тие Гу5 бег 195 200 205
Рпе Азп о Агев б1у біч Су» «2105 162 «2115 216 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220У «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний подіпептид" «4005 162 бі ІТе Маї Мес Тпгобіп бег Ргро бі1у Тс Гей бес Їеи бег Рго Шу 1 5 16 15 біш Абе АтТа Те Гей бег о Суз Абр АЗа бег бій 5ег Ма! С1у Аїа Пе за
Тує їец Аїа Тер Туг біп б1й бій Рго б1у Агр Ата Рео Тс Зеу ей
Ре Туг б1у Маї 5ек Аб5п Аге АТа Тпиг о біу І1е Рго А5р Аг Рпе 5ег ва
Су5 б5ег с1у бег б1у Тег А5р Ріпе Тс о Сеу тб оТТе бег Аге Гем би 55 70 75 во
Рго бій Азр Рпе А1їа Уаї Ту Туг Суз біп Гем Туг Те 5ег о 5ег Агре 85 99 95
А1їа гей Те Рипе сту б1у б1у Те Туз Маї бі Т1е Гу Ар ТПпг Маї 1686 195 118
АТа Ата Рго бег Ма! Ре ІТе Рпе Рго Рго 5ег:Азр бій со1йп Гени Гуз 115 120 125 5ек бІ1у Тпг АТтТа 5ег Уаї Уаї Су5 Гей Гей Ап о А5Зп Ре Туг Рго Агр 130 135 146 от АТа Гуз Маї б1п Тер Гуз Ма! Азр Азп АТїа беч біб бег бІ1у Авп 145 156 155 166
Бек біп б01и бе Маї Те б10 бій Абр обег о їу5 А5р бБег Те Туг 5ег 165 178 175 беш бег бек Те Гей Тпг Гей обес Гуз АТа Аєр Туг би ув Ні Гу 1806 185 196 уаї Тугб А1а Суб Ти Маї Те Ні5 біп о01у їей бег о б5ег Рго Маї Тіг 195 290 205
Гуз бег Ре Азпй Аге б1у с1и Су» 2108 215 «2105» 163 «2115 214 «2125 РТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221»: джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 163 бій Те Маї Гей Тис бій бес Рго б5ег о бес о Геу бег АТа бег МУаї О1Уу 1 5 19 15
Ар Аге Маї Тйг І1е Те Суб Аге АТа бег біп с1у Іч11е Абе Абп 01У 209 25 за
Гей б1у Тер Туг біп біп Тпйг Рго біу Гу5 АТа Рго Су5 Ге Ген ТІе до 45
Тут Рго А1їа бек Тис о Геи бій б5ег біу Маї Рко бег Аге РНе бег 01у 58 55 бо бег б1у 5ег Ар дДрЕ А5р. Ре Те Ген ТБг о Ії1е Те бег Тен бій Рео 65 78 75 зо бІтІи Азр Рпе АТа Те Тує Тугб Суб Ге біп Аб5р Ні5 Ап Тує Рго Рго 855 за 95
Те Рпе б1у бій 01у Тийг Сує Маї бІш Іе їу5 АгеЕ Тиг Маї А1а АтТа
180 105 1186
Рго бе Уаї Рпе ІТе Ре Рко Ргро 5ег Авр 01 бій Гей Тузобек Шу 115 120 125
Тиг АтТа его Маї Маї Су5 Се Сей Ап Азп Рпе Туг Рго Аге 61 Аїа 136 135 149
Гує Маї 51п Тгр Суб Ма! Ар Азп АтТа Ге б1п бег О1у Аб5п бег біп 145 150 155 т6а бій бег Маї Те бій біп Аєр бег Гуз Авр о бег ТиИг Туг бегоГСец 5ег 165 170 175 бек ТИгб Ге Таб Сец беб Гуз АТа АвроТуб бій Суб Ні Суб Маї Туг 180 185 198
АТта Суз бій Маї Ти Ні бій б01у Гей 5ег бе Рго Маї ТигоГСу5 б5ес 195 20806 205
Рпе Ап Аг біу 01 Суб 218 «219» 164 «211» 214 «2125 РЕТ «213Уу Штучна Послідовність «220» «221У джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «02» 16а
Авр Ше біп Меї Те о бІп бес Рго бе" обер Ге 5ег Аза бег МУаї 01У 1 5 18 15
Авр Аг Маї Те ІТе Те Суб Аге АТа 5ег б01п. 01у Пе Абе Абп б1у 28 25 зо
Се б1у Тер Туг біп б1п ТТ1е Рго бІу Гуз АТа Рго Гуз Ген Гец Те да 45
Туг Рго Аїа 5ег Ти Гей бій б5ег бІу Маї Рго б5ег Аге Рпе 5ег б1у ва 5Зег біу 5ег Авр Аге Ар Ре Тпг о Гец Тис о І1е Те бес о їеи о біп Рео 65 72 75 ва бі Ар. Рпе АТа Те Туг Тусб Суб бе біп Д5р Ні А5п Туб Рго Рго 85 за 35 5ег Ре бег біп бІу Тео Гуз Маї бІш ІТе Гуз Агя Тиг Маї А1а Ата 180 185 110
Рго бег Ма! Рпе І1е Рпе Рго Рго 5ег А5р бі бЇїп Гей Гув5 бег б1у 115 120 125
Те Аза 5ег Уаї Ма1ї Суб Ген Ге А5п о Абп Ре Туг Рго Аг би АІа 130 135 140 уз Маї біп Тер Гуз Маї Азр А5п АТа Гец СбІп о бес б1у Ап бег бІп 145 158 155 169 бій бе Маї Тигб бій б1п Абр обег Ту5 Ар бег Тис Туг бег о Гец бег 165 170 175 бе Те Се Тає Сем бек Гу5 Атїа Азр о Туг 019 Гуз Ніб5 Гуз Маї Туг 1658 185 138
Атїа Суз бі Маї Те Ні біп б1у Гей 5ег бек Рго Маї Тиг о їу5 5ег 195 29а 205
Рле Азпо Аг О1у б1и Су 216 «2105 165 «211» 214 «2125. РТ «213у Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид"
«двох 165: дер Те біп Меб Тиг обіп б5егоРго АТїа Тпеоїеу бег Уаї бек Рго біу 1 5 16 15 бій Тис оМаї Те Се бег Су5 Агв АїТа 5ег бій бек Уаї Аге ТНК Ап за
Уаї Аїа Тер Туг Аге Ніз ув Аїа б1у б1п АІа Рго Ме І1е Геи Маї 460 45 зег бБіу Аїа 5ег Тис Аг Аїа 5ег біу Аїа Рго Аїа Аге Рпе 5ег Оу 5а 55 ва бек біу Туг біу Тис бі Рпе Тийг о їез Те І1е Те бег Геу біп бег 78 75 во бій Ар Ре АТа Ма! Тут Туг Суз Ге біп Туг Азп Тийг Тер Рсо Агсєе 85 9 95
Те Рре біу бІіп о біу Тйб оГуз Маї бій Маї губ АгеЕ Тис Уаї Ата Аїа 160 195 116
Рго 5ег Маї Рбе Те Ре Рго Рго 5ег Азр бі біп еп Суб 5ег 01у 115 126 125
Те АТа бег Уаї Маї Су5 Гей їеп Азп Аза Рпе Туг Рго Аге Січ АТа 130 135 140 муз Маї біп Тер Гує Ма! Ар. А5зп АТа Гей біп бе біу Аб5п 5ег біІп 145 156 155 160 біш бег Уаї Те бі біп А5р бегоїу5 Абр б5ес Тис Туг бек оГец б5ег 165 179 175 бег Те Се Те Се бе Гуз Аза Ар Туг бІТй Суб Ні Гує Уаї Тугє 180 155. 190
АТа Суб бій Маї Тис Ніб5 біп б1у Гей бег бе Рго Маї Тие Гу5 5ег 195 200 295
Рпе А5п Аг б1у 10 Су
«2105» 166 «2115» 214 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 166
Азр Маї Маї Меє Тиг бій 5ег о Рго бег Ре Ге бег АТа бег Уаї СТу 1 5 18 15
А5р АгЕ Маії Таг Гей Те Суз Аге АтТа 5ег о біп Ар І1е 61у 5ег 5ег за
Сен АТа Тгр Туг біп б1й Абе Рго Сіу Гуз АТа Рго Азп Гей беу ІТе до 45
Туг діа Тис о бег Тиг оїеу біп бег біу Маї Рео 5ег Агр Ріє бек 01У ва зег біу Рпе б1у Те обі Рпе Тис о Гей Те І16е бег ТБг ово б1іп Рго 65 70 75 ве бі Азр Рпе АТа Тис ТугоТуг о Суз біп біп Гей Абп Ап Туг Маї Ні 85 за 95 бек Рпе біу Рго біу Тиеб Суб Ге бій ТІ1е Гуз Ася Те Маї Аза Аїа 180 185 116
Рго бЗег Уаї Рке Те РбБе Рго Рго 5ег Абр бІТч сб1п Ге Гує б5ег 01У 115 126 125
Тие Аїа бег Уаї Уаї Суз Геч ей Авзп Авп Рпе Туг Рго Аге б1ч АїТа 130 135 140 бу5 Маї біп Тер Гу Маї Авр Абп АТа Ге б1п бек 01у Азп бег бІп 145 156 155 166 б бег Маї Те бІй біп Азробес Гуз Ар о бег ТОе Тубс бев Сей бег 165 170 175 зег Те оГемш Те огГей бег Її уз Аза Ар Туг бій Туз Ні ух Маї Туг 180 185 196
Ата Суз біч Маї Те Ні 51п б1у Гей бег обего Рго Уаї Тис Гуз бег 195 280 205
Рпе АзпоАге 61у СШ Су 218 «2105» 167 «2115» 213 «2125 РЕТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «2215»: джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «аа» 167 бТи Те тТве Гей Тис бій бев Рго бек Те Ге бег Аза 5ег Маї с1У 1 5 19 15
А5р Аге Маї Тйг І1е Тиг Су5з Аге Аїа бег біп 5ег І1е бІ1у А5р АгЕ за
Ме АТа Тер Туг біп бій Су5 Рго біу Гу5 АТа Рго Гуз Маї Геч Ше до 45
Туг Тер А1а бек А5п Геи бі со1у біу Ма! Рго 5ег АгеЕ Рпе 5ег б1у 5о 55 во
Те о1у 5ег біу Тиг бій Ре АТа Ге Тпг їТїе 5ег б1у Гемц б1й Рго 65 7а 75 во
Авзр А5р Ге АТа Тиг о Тує Ту Суз бІп о бій Тут Гуз 5ег б1п о Тер 5есг 85 за 95
Рпе сту біп біу Те губ Маї 610 ІТїе Гу АгеЕ Тйг Маї Аїа Аїа Рго 100 185 119 б5ег Маї Рпе Іїе Рипє Рго Рго 5ег Авр бій біп Ген Су5 бек БІу ТНг 115 128 125
Аїа 5ег Уаї Маї Суб ем Геш Азп Ап Рпе туго Рго Аге сти АТа Гу 130 135 140
Маї біп Тер Гу5 Ма1ї А5р Ап Аза Ген б1іп бег б1у Азпобег о біп б1и 145 1508 155 1608: 5зег Маї Тпг бій біп А5р бег Гуз Ар 5ег ТПг оТус б5ег Гєи 5ег 5ег 165 170 175
Тие Ген ТВг о їем бегоГуз Аїа Ар Туг бі Гу5 Ні Туз Ма! Туг АтТа 180 185 190
Су5 бі Маї Тпг о Ніє біп б1у Гей бег 5ег Рго Маї Тиг оГуз бег РНе 195 280 205
Ап АгЕ 1у 01 Су 210 «2105. 168 «211» 214 «212» РЕТ «213» Штучна Послідовність «220» «221»: джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «во» 168
Авр ч11е біп Гец Те бій бес Рго 5ег обег Ге бег Аза бег Уаї 01У 1 5 19 15
Ар Аге Уаї ти І1е Те Сує Аг АТа 5ег бій Рпе Ти Абп Ні Туг 29 25 зо
Ге Авп Тер Тук біп Ні Гуз Рго бт1у Ага Аіа Рго губ Ге Ме Пе да 45 бег Ма1 Аїа бек Ап Ге біп б5ег б1у Маї Рго бег Аге Рпе Тиг б1у ва бег бій бег б1у Ти Авр Ре Тис Ге Тис Пе бек 01у Тен біп Рро 65 79 75 ва о1ї А5р Ре Аїа Тис Тус Тус Су5 біп біп бег Туб Асв Тиг Рго Туг 85 906 95
Те Рне 01у біп о б1у 5ек Аге Гей біш Меє у Аге Тиг Маї А1їа АтТа 1886 185 1160
Рго бег Уа! Рпе ІТе Рпе Рго Рго 5ег А5р бій бІп Гец Гуз б5ег 01у 115 120 125
Тпе АТїа бег УМаї Маї Суб Геч Ге Ап оАЗп Рпе Туг Рго АгЕ б5іц АТа 136 185 140 цуз Маї біп Тер Суб Уаї Ар А5п Аїа Пец біп бег біу А5побег б1п 145 1509 155 160
СІЧ бег о Маї Тпе о біч біп А5р бег їу5 Ар 5ег ТпгоТує бег о Геу бег 165 170 175 бег Тео Ге ТАго Гей бек Гух АТа Авр Туг 61 Гув5 Ні Гуз Маї Туг 188 185 190
Атїа Су5 бі Маї Тис Ні біп б1у Гей 5ег бек о Рго Уаї Тиг о Су5 бег 195 288 205
Ре Азп о Аге б1у бій Сув 210 «210» 1695 «211У 453: «2125. РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223Уу /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «або» 169 біп Маї біп Ге 010 біп бек б1у АТїа 019 Ма1ї Гуз Суб Рго б1у АтТа
1 5 10 15
Зег Уаї Гу Маї бек Суб бли АТа бег бу Туг Таб Гей ТАг бек Туг 29 25 зе
Авр ІТїТе Абп Тер Уаї ДАгев б1п. А1Та Те б1у біп о1у Рго бІй Тер Меє 46 45 б1у Тер Меї Азп АТа Абп о бегобіу Абп Те б1у Тук АТа бій Гуз Ріе 5а 55 ве біп бІ1у Аге Маї Те Ге Тиб б1у Ар Те бег о ІТе 5ег ТНг о АТїа Туг 655 70 75 о
Меє сій Ге бек бек Гей Ар о бег б10 Ар Тег А1ї1а Уаї Туг Тує Су 96 935
А1їа б1іу бег бе ІТе Гей Маї Аге біу Аїа Гей сту Агр Туг Рпе дер 180 1985 тла
Мей Тер 51у Ага С1у Тпгогбей Маї Тйг Ма! бегоб5ес АТа бек Те Гуз 115 120 125 б1у Рро 5ег Уаї Рбе Рго Гей АТа Рго бег бег Гу5 бек ТП о бег О1у 130 135 146 о1у Тпг АТа АТа Ге бІу Суб Гео Маї Су А5р Туг Рпе Рго біц Рго 145 1560 155 160
Маї Тиг Маї бег Тгр Авп 5ег б1у АТа Ге Тиб о 5ег біу Маї Ні Тие 165 178 175
Рпе Рго АтТа Маї Сей біп бег 5ег.отїу цецп Туг бег Гей бег бег Маї 1850 185. 190
Уаї Тае Маї Рго бег бер беє еп 01у Тпгобіп Таб Туг Іїе Су5 Авп 195 290 285
Маї д5п Ні Іубє Рро 5егоАбп ТйгоТуз Маї Абро Гуз Гуз Маї б1и Рго 210 215 220
Гу5 бег Суб ДА5р Гу Те Ні Те Суз Рго Рго Су Рго АТа Рго бій 225 230 235 240
Гей Гей 61у біу Рго бБег Маї Рпе еп Ре Рго Рго Гуз Рго Гу А5р 245 256 255
ТНг Геш Межї ІТе бек Ас Те оРго біц Уаї Те Суз Маї Маї Маї А5р 2606 265 278
Ууаї бек Ні біш Ар Рго біш Уаї Гуз Рпе Азп Тгр Тує Маї Азр о1у 275 256 285 уаї біч Маї Ні5 Ап о АТа їує Тиг оГу5 Рго Аге 61 61 біп Тує Азп 299 295 за бе Ти Туг Аге Маї Уаії бег Маї сечу Тпе Маї Сем Ні5 біп Ар Тер за5 З10 315 329
Ген Азп о б1у Гуз бій Тує Суз Суз Гуз Ма1! бек. А5зп бує АТа (ем Рго 325 з3а 335
АТтїа Рго Іїе бі Гу5 Те о І1е бек їу5 А1їа Гуз бІу б1п Рго Аге 01ц зав за5 з5а
Рго біп Маї Тук Тег Гей Рго Рго 5ег Агя ОТ ОТ Меє Тис Гу Ап 355 зво 365 біп Маї бег іеи Тиг Су Ге Маї Суб біу Ре Туг Рго бег Ар І1е 376 375 зво
А1їа мМаї біти Тер бі бек А5зп біу бій Рго бін Абп А5п о Тує Гуз ТАг 385 зай 395. дов
Тиг о Рго Рго Маї Гей Абр.бег А5р б1у 5ег Ре Ре Гей Тут бек ув 405 419 415 беч Те оМаї Ар Гуз бегоАгеЕ Тер б1п біп б1у Абп Маї Ре бег Су 426 425 430 5ег Ма1ї Меє Ніб5 б1ч АЗа Ген Ні Абзп Ні Туг Те біп Суз бег Гей
435 лада да5 зег їец 5ег Рго б1у 45а «2105 170 «211х 4458 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «220У «221ТУ джерело «223» /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «4005 170 бі Маї біп Ге Маї біп бег біу АТа бі0 с Уаї Маї Гуз Рго б5іуУ АТа 1 5 16 15 5зег о Гец губ Маї 5ег Суб 1ує Аїа бег бІу Туг ТІе їТїе Пе А5п Туг за
Азр Ре Т1є Тгр Ма! Агр біп Аїа Тис б1у б1іп біу Рго Сїш Тгр Меє 4а 45 біу Тер Межє АбпоРго Азп о бего Туг Абпо Те б1у Туг б1у біп Гуз Ріе ва бій б1у Аве Уа! Те Меї Тис Тер Абробес ес Меї бег ТНге АТа Туг 65 70 75 во
Межї бій Ге бег обег бе Те о 5ес Аза Ар ТАг АТа Маї Туг Туг Суб 85 99 95
А1а Асе А1їа Маї Аге о1у біп Сей ем обег бі Тує Тер с1у біп 01Уу 166 185 1186
Тиб Їец Маї Тие Маї бегобенг АТа 5ег ТНг о Гує б1у Рго бег Маї Ріє 115 126 125
Рго Сем Аїа Рго 5ег бегоГу5 5ег ТПгобег б1у б1у Тиг А1їа Аза ГГ ец 130 135 148 бІу Суз Гєеи Уа1! Гу5 Азр Тус Рпе Рго бі Рго Маї Тис Маї бег Тер 145 150 155 166
Аб5п бег біу Аїа ей Тиг обег біу Маї Ні5 Те Рпе Рго Діа Маї Гей 165 176 175 біп бек бег б1у Гей Туг бек Гей бег бег Уаї Уаї Тпе Маї Рго 5ег 180 185 196 5ег бег Геу б1у Те бІп ТВг о Тує І1е Суз А5п о Маї Азп Нів Гув5 Рго 195 286 205 бЗег АзпоТйгс Гу Маї А5р Гуз Гуз Маї бій Рго Гуз 5егс Суб Абр Гу» 216 215 220
Те Ні ТБе Су5 Рго Рго Суз Рго АТа Рго бІш Ге Гей сту 01у Рго 225 230 235 240 бек Маї Рбе гейш Ре Рго Рго Гуз Рго губ Авр Тис Ге Мес Пе бег 245 2508 255
Аге Те Рго бТи Маї Тиг Суз Маї Уаї Маї Ар Уа1! 5ег Ні бій Ар 266 265 278
Рго бій Маї Гу5 Рпе А5поТер Туб о Маї Авр б1у Ма! бі Маї Ні Ап 275 288 285
АТа Гує ТНг Гуз Рго Аге бімш бій бій Туг Абпо5ес Те Туг Аге Уаї 230 295 зе
Уаї 5ес Маї Гей Тиг о Уаї Геи Ні б1й Азр Тер Ген Ап о1у Гуз 1 зав зіб з15 320
Тут Гуз Суб ув УМаї 5ег Ази 1у5 Аїа Геу Рго Аїа Рго І1е б1ц Гу: 325 338 335
Тиб о Т1е 5ег їу5 АТа туз -1у біп Рго Агв біш Рго бІ1й Уаї Туб Те зала за5 з50
Гей Рго Рго бег Аге бій бій Меж Те о Су5 Азп о біп Маї бег Гец Тс 355 зба з65
Су Ге Ма1ї Гуз б1у Рпе ТугоРко 5ек Азр ІТе Ата Уаї с1и Тер 61 з7а 375 зво
Зес А5п о біу біт Рго бій Абп о Аб5п о Тук Гу5 Те Тис Рго Рео Маї Гей з85 зав за5 4до:
Азр бек Абр 6І1у бек Ріпе Ріпе Гец Туг бег Туз Гей Те Маї Авр Ту 485 410 415 5ег АгЕ Тгр біп біп б1у Абп Уаї Рпе бек Сує бег Уаї Меє Ні5 01 420 425 430
АТа Гей Ні5 Ап Ні Тує Тргобіп губ бЗес Геп о5ег Ге бес Рго с1у 435 а4о ад5 «218»: 171 «2115 455 «212У РЕАТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «223у /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «ва» 171 бІй Маї біп Гей бій 010 5ег б1у Атїа біш Маї Суб Гуз Рго с1у АТа 1 Бі 19 15 б5ег Уаї Гуз Маї 5ег Су5 Аг. АтТа 5ег біу Туг Тпге Рпе ТНго5ег Туг 20; 25 зе
Азр Ше А5п Тер Маї Аг біп Аза Рго б1у б1п б1у Ген б1ш Тер Мей 4о 45 с1у Тер Меж Ап оРео Абпобес б1у деп Тиб Ап о Тує АТа бій Аге Рене 58 55 ва біп б1у Аг Гей Те Меб Таб оїу5 Азп ТИг бер І1е Абзп о Тпг о А1Та Тує 65 78 75 во меє бІп Гей бек б5ег Гей АгЕ 5ег. 01Ии Дер ТИг АТа Маї Тук Туг Су
85 за 95
Азіа те об1й Аге Теробег Ту Азр Те с1іу Ні Тує Туг Тує Тує 61у 188 185 116
Ме Ар Ма! Тер біу біп б1у Те Те Уаї Те Маї 5его5ес Аа б5ег 115 129 125
Те Гуз с1у Рго бек Ма1ї Рне Рго Гецп А1Та Рго бек бег Гу бек Тиг 130 135 148 5ег біу б1у Тг АТа А1іа Геч о біу Сув5 Сем Маї Сгу5 Азр Туг Ре Рго 145 158 155 169 бій Рео Маї Те Маї бе Тер Азп о 5ег б1у АТа Геу ТАйг 5ег біу Маї 165 1706 175
НІє Те Ре Рро Аїа Уа1ї сем бій бег бег біу Геї Туг бег Геч 5еїг 188 185 198
Зег Уаї Маї Те Ма! Рго бег 5ег бек їеи б61у Те біп Тс Туг Пе 135 206 285 сСуз Азп оМаї А5п Ні Гуз Рго б5ег Ап о ТИг Гуз Маї А5р Гуз Гу Маї 2106 215 228
І Рго Суз бег о Сує Дер. Гу Тег Ні Тс Суб Рго Рго Су Рго Аїа 225 230 235 2406
Рго біш Гей Гей біу біу Рго бег Уаї Рпе Гей Рібе Рго Рго цу Ргро 245 250 255 вуз Авр Тис Їец Меж ІТїе бег АгеЕ Тиб Рго бій Уа! ТпгоСує Уа! Маї 268 2655 278
Маї Ар Уаї 5ес Ні бІШ А5р Рго Ти Маї їу5 Ре Азп Тер Туг Маї 275 280 285
Авр о біу Маї бій Маї Ні5 Абєп АТїа Гуз ТПг Гуз Рго АгЕ 11 010 61 290 295 зав
Туг Ап бег Те Ту Асе Ма! Маї бег Ма! Се Тас Уаї Сеч Ні біп 305 з19 315 320
А5р Тер Гей Азпобіу губ бій Туг Гуз Суб Гу5 Маї бег Азп Гу АтТа 325 330 335
Геч Рго Аза Рго Іїе бі 1у5 Те ІТе бес Гуз Аіїа Гу5 б1у біп Рро зав за5 з5е
АгЕ бі Рго біп Уаї Ту Тпг Гей Рго Рго 5ег. Аге бій бій Мет Тиг 355 зво 365
Муз Ап о біп Маї б5ег Гей Те Суб Ге Маї Гуз біу Ре Туг Рго 5ег з7а 375 зво
Авр ІТе Аїа Уаї бій Тер біш бек Аби б1іу біпоРео 01 А5поА5п Ту
З85 зов 395 4089:
Муз Те Тис Рео Рго Маї Тей Абєр бег Азр с1у 5ег Ре Рпе Геи Туг 4085 419 415 5ес Туз Ге Тг оУаї Авроїуз 5ег о Аге Тер б1п б1п біу Ап МУаї Рее 420 425 430 бе Суб бер Ма! Меї Ні5 сбІшШ АТа Гей Ні5 Азп Ніб5 Туг Тис біп ув 435 чав 445 бег Сем бег Їеи бег Рго бІу 450 455 «2105 172 «2115 456 «212» РКТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «дра» 172 біп Ма! біп Ген біп біп бЗег біу Аїа б1и Маї Гуз Аге Рго б1у АїТа 1 5 16 15 бег Маї Гу5 Маї бек Суб біц А1а б5ег б1іу Туг Те Уа! бег Авп Тусє 28 25 за
Авр Ше Азп Тер Маї Ас біп Аза Те боту біп о1у Ге 011 Тер Мет 408 45 б1у Тер Мет Абп о Рго 5ег бег о біу Аге Те 01у Тук АТа Рго Гуз Ріе 5а 55 ва
Аге б1у Аге Маї Тис Меє Тпг Аг 5ег ТНе о 5ег ІТе 5ег ТНг Аза Туг 65 76 75 ва
Меж бі цен бег бек Їеи ТВг бе? бій А5р Те Аїа Уаї Тугс Туг Су 85 зе 935
АТа дев біу Б1У б1у Туг Тук Ар бег бег б1у Ави Туг Ніє ї1є бег 190 195 119 б1у Ген Ар Уаї Тер б1у біп с1у Те ТпгбоУаї Тис Уа! бег бег Аа 115 120 125 зе Тпг о Суз біу Рго бек Ма1ї Ре Рго Гей Аїа Рго б5ег бек Гуз бег 139 135 149
Те бБег біу біу Тг Аїа АТа ей б1у Су5 Гей Уаї Гуз Азр Туг Ре 145 158 155 160
Рго бій Рго Маї Тис омМаї 5ег Тер А5п 5ег бІі1у Аїа Гео Те 5ег б1у 165 178 175 уаї Ні5 Те Рие Ріо АТа Уа! Ге б1п бек бек б1у Гей Туг 5ег Ге 88 185 199
Зег бек УМаї Маї Тйг Маї Рго бег бег 5ег Ге б1іу Тіг бТїп Тег Тугб 195 290 295
Те Сує Абп Маї Аєп Ні Гує Ргро бек А5п Те оГуб5 Маї Авр Гу Гу 216 215. 220
Уаї СІ Ргб Гуз бек Су Авр Гу5 Тие Ні ТАг о Суз Рго Рго Су Ргро 225 238 235 240
АТа Рго бій ей Гей біу біу Рго бег Маї Ре Ге Ре Рго Рго Гуз 245 258 255
Рго Гу А5зр Тйг Гей Мет ІТе бег Аг Тис Рго бій Уаї Тиг о Суз Маї 260 265 270 уаї Маї Абєр Маї бек Ні5 б1йп Авр Рго бі Маї Гує Ре Ап Тер Туг 275 286 285 уаї Азр біу Маї бій Маї Ніє А5п Аза Гуз Тпб о Гує Ргео Агсе бі би 299 295 зо біп Тут Абп о 5ег Тис Тук Аре Уаї Маї 5ег Ма! Ге Те Маї Гей Ні 3а5 з10 315 320 стіп о А5р Тер Гей дей бІ1у Гу5 біш Туг Суб Суб Гуз Маї чего Аби Гу 325 зза 335
А1а Геш Рго А1їа Рго І1е бій Гуз ТПг Пе бег о їув5 Аїа Гуз б1у б1п задо 345 з5а
Рго Аге 611 Рего б1п Маї Туг Тс Теми Рго Рго бег Аг ої бі Меє 355 зво 365
ТНе Гуз Ап біп Маї бе Геш ТНгоСуз Ге Маї Суз б1у Рре. Туг: Рго 370 375 зво бе Ар 112 АТа Маї біш Тер біш бек оАзп бІ1у б1іп Рго б1й А5п Абп зв зав 95 лоб
Тут Гуз Таб Тис оРго Рго Маї Гей Абр б5ег А5р о б1іу бек Рпе Рне ей 4а5 А18 415 туг бек Гу Гей Те Маї А5р о Гу5 бек Аге Тгр б1п бІ1й оту Ап Маї 420 425 азо
Рпе бег Суб бег Уаї Меє Ні бі Аїа Ге Ні Азп Ні Туг Тиб біп 435 лада 445
Гуз 5Зего Гей бег Гей бег Рго б1у 45а 455 «2105 173 «211» 448 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2935 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «д0о» 173 біп тІТїе Те Гем Гуз бі б5ег о біу біу б1у Се ІТе Гуз Рго в1у Су 1 5 18 15 5ег еп Ав Ге зекоСу5 Аїа ТПг обег б1у Рне Рго Рпйе бег А1Та Туг 29 25 за
АТа Меє Ап Тер Уаії Асе біп Аїа Рго б1у Аге 01у Геч Ти Тер Маї 46 45 зег бек І1е Те губ Азп 5ег Абр 5ег Гей Туг Туг АТа Азр 5ег Маї во
Гу5 61у Аге Рпе Те І1е бег Акр Ар Азп Ата о1у Азп бег Гей Туг 65 70 75 80 ей біп Меж Ап обег Гей Аге Уаї бій Ар Тс о Аїа Маї Туг Туг Су» 85 90 95
АТа Тпг Сей АТа Аїа Ас о 11е Межє АтТа ТНе Азр о Тує Тер 01у біп 0Ш1у 160 185 118
Те їец Маї Те Уаї бег бег АТа бек Тпг Гуз біу Рго бег Уаї Ріе 115 126 125
Рео Гей АТа Рео бег бего Гуз 5ег ТПг о бег бІу б1у Тиг Аїа Ата Геи 130 135. 140 б1у Суб Гей Маї Гу Абр Туг Рпе Рго бі Рго Маї Тис Маї 5ег Тер
145 150 155 169
Ай бе" біу АТа Ген Тиг бек бІ1у Ма1ї Ні5 ТайгоРаєЄ Рго АТа Уаї Геи 165 1706 175 біп бег бек біу Сей Тугс бег Сей бе о бес Маї Маї Тпг Маї Рго бег 180 185 196 5зег 5ег Ген бІ1у Тс о б1п Те Туг Ще Суз Абп Маї Ап Нів Гуз Рго 195 280 295 5ег Ази ТагоСу5 Маї Д5р о Гбує Гуз Маї бі Рго Гуз бег Суб Ар Гуз 218 215 220
Те Ні5 Те Суб Рго Ро Суз Рго АЗїа Рго бій Ге бе б1у біу Рго 225 230 235 240 5ег МУаї Рпйе Гей Рпе Рго Рго Гу Рго Гуз Авр Тиг Ге Мебс Те 5ег 245 256 255
АгЕ Тиг Рго бі Ма! Те Сух Маї Уаї Маї Азр Ма! бек Ніє б1и Авр 266 265 278
Рго 01и Маї Гуз Рре АбпоТер Туг Ма! Ар бІу Маї бій Маї Ні Ап 275 280 285
Атїа Гу5 Тиг Гуз Рго Аге біч бі біп Туг Абзп о 5есг ТАг о Тубєб Аге Уаї 296 295 зо
Уаї бег Маї Гей Тиг Маї Сей Ні біп Азр Тер Гей Азп біу Су5 Їй 3а5 зів 315. 320
Туг Сбуз Суз Ту5 Маї бег о Авп (ух АТїа Сей РгосАтїа Рго Ше біч Гув 325 з3за 335
Типе Тте бБег їу5 Ата Суб Ту біп Рго Агеб біш Ро біп Маї Тує ТНге зай за5 350
Ген Рго Рго Зег Аге бі бі Мет ТБг Туз Азп біп Маї б5ег Гєи Тег 355 зва 365
Су5 Геч Уаї Гуз с1у Рпе Туг Рго бег А5р І1е Аїа Маї біЧ Тер С1Ий зд 375 зва 5ег Абзп о б1у біп Рго бін депо АЗзп Тут Гуз Те Те Рго Рго Маї Гей 385 зав за5 чад
Авр бег о А5зр б1у б5ег Рпе Рпе Гей Туг беє Гувє Геп Тйг о Маї Ар Гу 4еа5 де 415 5ек Агв Тгр біп сій б1іу Абп Уа! Рпе бег Су 5ег Уаї Мес Ні бІч 420 425 430
АТїа Гем Ні Доп Ні Туг Тпг о бІп Гуз бег Ге бег Ге бег Рго С1у 435 дае 445 «2185 174 «211». 456 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205» «221» джерело «223 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «400» 174 бі Маї біп Гей Маї 510 бег бІу б1у б1у ей Маї Гу5 Рго б1у би 1 5 18 15 бег Гец Аге Гей бег Су5 АТа Аїа 5ег о біу Рпе 5ег Рпе А5р Туг Туг зе бек Мек Т1е Тер о Маї Асе бІіп Алла Рго с1у Туз с1у Гей оТш Тер МУаї з5 да 45 тек бег Іе Ар обег бег бек АгеЕ Туг Гей Тує Ту АТа А5р 5ег Уаї 5а 55 во
Іїуз Ту Агя Рпе Тс Тіе бег Аге Ар А5п АТа біп Аб5побег Геи Тусє 65 78 75 ва
Гей біп МеЄ бек б1іу Геч Аге Ма!ї 510 Ар Тпг Аїа Ма1ї Туг Туг Суб 96 85
А1а Ате Ар б1у АзроАзр І1е Гей б5ег Маї Туг АгрЕ С1у бек 0Іу Аге 188 185 116
Рго Рпе Азр Тут Тер о біу б5іп 61у Те Гес Маї Тис Маї бег бег Аа 115 129 125 5ег ТТН Гуз 61у Рго бек Ма1ї Рпе Рго еп АТа Рго 5ег бек Гуз бег 130 135 140
Те бег бі1у бІ1у Тис АтТа Ада Ге біу Су Теп Уа1і Гуз Ар Тує Рпе 145 1596 155 169
Рго біш Рго Уаї Тег оМаї 5ег Тер А5п 5ег біу АТїа Сем Те о5ег О1Уу 165 178 175
Маї Ні Тис Рре Рго АТа Уаї Се біп бег бег біу еп Тук 5ег Ген 188 185 158 бе Зег Ма1 Маї ТигоМаї Рго бег беє бег о їеи біу Те біп Тйг Туг 195 298 205
І1е Сух5 Абп Маї Ап Ні Гуз Рго бБегоАзп Тпг оГує Ма1ї Авр Гу Гуз 218 215 220 уаї бІіи Рго Іїу5 бег Суз Ар Гу5 Те Ні Таб оСув Рго Рго Сув Рго 225 230 235 246
Аїа Рго бі Гей Гей біу біу Рго 5ег Ма1 Рає Ге Рпе Рго Рго Гу 245 250 255
Рго Гу А5р Тйг оГеи Меб Т1е бек о Агв Тпе Рго бій Маї Те Су Уаї 260 265 270
Маї Маї Ар Уаї 5ег Ні 010 Ар Рго бі Маї Гу Рпе Ап Тер Туг 275 280 285
Ма1ї Азр бІ1у Маї 61 Маї Ні5 Ап Аїа уз Тпг Гу Рго Аге бі бі 298 295. зев біп Тур Аби 5ег Те Тус Аге Уаї Уаї 5ег Маї Гей Тис Маї Цей Ні 905 з10 315 320 ста А5р Тер Гео Ап о біу Гуз бій Туг Гуз Суз Туз Уаї 5ег Азп Гуз 325 ззо 335
АтТа ей Рго АТа Рго І1е 5104 їу5 Те І1е бег Гуз АТа Гуз 1у біп зо за5 358
Рго Аге 010 Рго бІп Уаї Тугс Таб Сей Рго Рго бек Аг 61 51 Меє 355 збе 365
Тпе Гуз Ап біп Уа! бекїєеи Те Сує Сей Маї Су5 о1у Рпе Туг Рго з7а 2375 зве 5зег А5р Т1їе АтТа Маї бТїи Терооїй бег о Абп бІу біп Рго б1ц. Аби деп 385 з9а 395 лег
Тує тує Те Те о Рео Рго Маї Гей Дер 5ег А5р о бту бек Рпе Ре Ге 405 а18 415
Туг 5ег Гуз Гей Тиг Маї Ар Гуз бег о Агя Тер бІп бІп с1у й5п Уві 428 425 аза
Ре бег Суб бе Уаї Мебє Ніб бій АТа Гей Ні Абл Ні Туг Тиг бІп 435 але 445
Муз бе Гей бег Ге 5ег Рго біу 450 455 «210» 175 «2115 456 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «2205 «2215. джерело «223Уу /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний поліпептид" «доро». 175 біп Маї біп Ген біп біп б5ег б1у бтІу с1у Геш Маї Азп Рго б1у с1й 1 5 10 15 б5ег Геч АгЕ Ге бе Су5 АІа Аза бег б1у Ре 5ег Ре Абп о Туг Туг зе 5ег Меє Іїе Тер Маї Аге б1п АТа Рго бІу їу5 СТУ Гей СТ Тер Маї 4о 45 5зег зег І1е Абр бек бег бе оАгеЕ Туг АгЕ Туг о Тує Тпг о Абробес Маї 5а 55 ве
Гуз бБіу Аге Рпе Тис о ІТе бег Аг Ар Азп Ада біп Ап о бегоГец Туг 65 76 75 во ем біп Меє бег АЗїа Ге Аге Уа! біш А5р Тпг Аїа Маї Туг Туг Су 85 9а 95
Ата Аг Ар біу А5р Азр І1е Гей бег Уаї Туг біп б1у 5ег біу Аге 180 195 118
Рго Ріе Авр Туг Тер бІіу біп б1у Тиг (є Маї Твг о Маї бе бег ДІа 115 120 125 зе Те о Суз біу Рго 5ег Маї Рпе Рго (ей АТа Рго 5ег 5ег Гу5 5ег 130 135 146
Те бБег біу бІ1у Те Аза АТа Гей б1у Суз Ге Маї Гуз АзроТуг Рпе 145 156 155 160
Вгое бій Рго Маї Тпе Маї бег Тер Азп бег б1іу Аїа Ге Тиг 5ег о1у 165 179 175
Уаї Ніє Тег Рпе Рко АТа Маї Ге біп бег б5ег 01у Гец Тує 5ег Гей 186 185 199 5ег бе Маї Уаї Тиг оУаї Рго 5ег бег 5ег Гей біу Тпг ста Те Тує 1935 200 205
ІТе Суз Азп Маї Ап Ні Гу Рго бег А5п ТИПгоГу5 Маї Авр Гуз Туз 218 215 229
МУаї бій Рго Гує бер Суб Ар Гуз Тс Ні Тпг о Суз Рго Рго Суб Рго
225 238 235 240
Аїа Рго 610 Се гемо біу б1у Рро 5ег Уа! Рпе Сей Рпе Рго. Рго | ув 245 258 255
Рго Гуз Ар Те Сей Меє ІТе.бег Агв Те Ргро б1їй Маї Ти Сув5 Маї 260 265 270
Ууаї Маї Ар Маї 5ек Ні 51 Ар Рго 51ц Ма! Гу5 Рпе Ап о Тгро Туг 275 280 285
Ууаї Ар біу Маї біи Маї Ніє А5п Аза Гуз ТПгоГу5 Рго Аге біч 61 238 295 заго бій Туг Ази бек Тс о Туг Ас Маї Маї бег Маї Геу Те Маї Гей Нівб 305 з1д зі5 320 біп Азр о Тер Гей Абпоо1у у» 6Тш Туб Гуз Сує бує Ма1ї бег Аби Гуз 325 зз3а 335
Аїа їеу Рго А1їа Рго ІІе бімш їу5з Те Іе бек Гу5 Аїа Гу5 01у бІп зав за5 зва
Рго Аг бій Рго біп Маї Тупг Те Гей Рго Рго бег Аг боти бі Меє 355 збо 365
Те уз Азп бІп Маї бегоГеу Те Суз без Маї бу5 біу Рне Туг Рго 370 375 зво бег. А5р Те АТа Маії біш Тер біш бег Азп б1у біп Рго їй Азп Азп 385 зав 395 доб
Туг був Те Те Рбо Рго Уаї Гей Авроб5ес Авр.обіу 5ег Ре Рпе Гей 405 а10 415
Туг беб губ Геч Тис Маї Ар Гуз бек АгЕ Тгр б1п сіп б1у Азп Маї 420 425 43зо
Рпе бек Суб бег Маї Меб Ні бі Аїа Гей Ні5 Ап Ні Тує Тиг бій 435 440 да5
Гуз бег' це 5ег Гей бег Рго б1у 459 а55 «2105 176 «211» 445 «2125 РКТ «2135» Штучна Послідовність «220У «221» джерело «223У /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний подіпептид" «а00У 176 біп Уаї біп Ге біп біп б5ег біу біу б1у Ге бі біп Рго біу б1у 1 5 10 15 бег Гец Ас І1е бек Суб Аза. А1їа бег бІ1у Рпе Те Рпе А5поТре Абп за
Авр Меє Зег Тгр Маї Агв Сс1п Аза Рго б1іу тує бІу Мем б1іп Тер Маї 5ег Те о І1е ІІе бІіу І1е Ар Ар Таг ТБе Ні Туг АТа Ар бег Маї ба
Агв п1у Аге Рпе Тс о Маї бек Аге Азр о Те ее Гу5 Аб5п Меб Маї Туг 55 70 75 во
Гей біп МеєЄ А5п о б5ег Ге. Аге Маї біч А5р ТиИг АТа Іеи Туг Туг Су 85 за 95
Маї губ Ап бег б1у Пе тус бес Ре Тер бІу бій 01у Ти Геч Маї 180 185 118
Ти Ууаї бес бек Атїа бег ТП їу5 б1у Рго 5ег Уаї Рпе Рго Гей АїТа 115 126 125
Рго бек 5ег о їуз 5ег Тйгоб5ег біу б1у Тс АТа АТа Ге с1у Су Геи 130 135 148
Уаї Суз Азр Тут Рпе Рго бій Рго Маї Тиг Маї бег Тгр Азп о 5ег б1у 145 156 155 166 діа Гецп Тйгобег біу Уаї Ні Ти: Ре Рго Аїа Уаї це б1п бег 5ег 165 178 175
О1у Ген Тук 5ег Гей б5ег 5ег Ма! Маї Тиг Маї Рго бег 5ег бег Гей 1806 185 190 б1іу Те о б1іп ТагоТує ТТ1е Суб Азп Маї Азп Ні Гує Рго бек Ап Тиг 195 280 205
Гуз Маї Авр Гу Гуз Маї сій Рго Гуз. бек Суб Ар Гуз ТИГР оНів ТАг 218 215 228
Суз Рго Рго Су Рго АТа Рго бі Гєм Сей біу бІу Рго 5ег Уаї РНе 225 230 235 240 бе Рпе Рго Рго Суб Рго Гуз Абр ТИг Се Меє ТІТе 5ег Аге Те Рго 245 250 255 біш Уаї Тис Су Маї Маї Маї Ар Ма! бег Нібє бі Ар Рго біч Маї 260 265 278
Суб Рпе Азп Тер Туг Маї Азр біу Маї бі Маї Ні5 Азп Аїа Суб Тиг 275 288 285
Гуз Рго Аге біч бій біп Туг Ап 5ег Те Туб Аве Маї Ма! 5ег Уаї 290 295 зео без Тиб Маї Гей Ні бій Ар Тер Ге Абп бі1у Гуз бій Туг Гуз Суб 305 з16 зі15 320
Гуз Уа1 бег Ап Гуз АТа Гей Рго АТа Рго ІТе б10 Гує Те Пе 5ег 325 3за 335 муз А1їа цу б1у біп Рео Аг бій Рго б1іп Уа1ї Тує Те Гей Рго Рго зав з45 3506 бег АгЕ бІ1и бТїи Меє ТигоГуз Авп біп Маї бег їєш Те о Суз Гей Маї 355 зво 65
Гуз біу Рне Тує Рго бег Азр І1е АТа Уаї біч Тер бІти бек Азп б1У
З7В. 375 зва б1п Реро бій Ап Ап о Туг Гуз Те ТВе Рго Рго Уаї Гей дзробеє Авр 385 з9б 395 лад біу Зек Ре Ре Ге Туг бек Іїу5 Гей Те Уаї Абр Гуз бег о АгеЕ Тер 485 де 415 біп біп б1у А5поМаї Ре 5ег Су5 5ег Маї Меж Ні б1и АТа Ген Нів 420 425 430
ДА5п Ні Тугб Тпг бій Гуз 5Бег еп 5ег Гей 5ег Рго о1у 435 до 445 «210 177 «2115 7 «212У РТ «2135 Штучна Послідовність «2205 «221» джерело «2235 /примітка- Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «400» 177
АТїа Аге б1у Ар б1у 1у Гец 1 5 «210» 178 «2115 7 «2125 РТ «213» Штучна Послідовність «220» «221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: сИНтТетичний пептид" «4005 178
АТа АгеЕ б1у Азр Ата о1у Ге 1 5 «2105. 179 «2115 7 «212У РЕТ «2135 Штучна Послідовність
«221» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «414005 179
А1а Аге с1у бій біу 01у І еи 1 5 «2105 180 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна Послідовність «22805 «2215» джерело «2235 /примітка-"Опис Штучної Послідовності: синтетичний пептид" «два» лво
А1а Аге б1іу Аза с1у 01у І ги

Claims (5)

1 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Сполука кон'югата антитіло-антибіотик, що включає виділене моноклональне антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (МУ/УТА), причому анти-М/ТА моноклональне антитіло включає легкий (І) ланцюг і важкий (Н) ланцюг, де: І. ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КЗБОБІРАВТЗАМКМІ ІМ (ЗЕО 10 МО: 99), СОК 12, що включає послідовність УУАЗТЕКЗ (5ЕО 10 МО: 100), ії СОК ІЗ, що включає послідовність ООМЕЗРРУТ (ЗЕО ІЮ МО: 101); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗЕМ/УМН (ЗЕО ІО МО: 102), СОК Н2, що включає послідовність ЕТММЕСТТТАМАОЗМКО (5ЕБЕО ІЮО МО: 103), ії СОК НЗ, що включає послідовність СЕС ОО (5БО ІО МО: 118), причому моноклональне антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки зв'язується з Єїарпусоссив ацгеиз і ковалентно приєднане до антибіотика типу рифаміцину за допомогою розщеплюваного протеазою пептидного лінкера.
2. Сполука кон'югата антитіло-антибіотик за п. 1, що містить анти-М/ТА моноклональне антитіло, яке включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН включає амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН 5ЕО ІЮ МО: 156.
3. Сполука кон'югата антитіло-антибіотик за п. 1, що містить анти-М/ТА моноклональне антитіло, яке включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де Мі включає амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9595 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ ЗЕО ІЮО МО: 119.
4. Сполука кон'югата антитіло-антибіотик за п. 1, що містить анти-М/ТА моноклональне антитіло, яке включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ) і варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МІ. включає послідовність ЗЕО ІЮ МО: 119, а МН включає послідовність 5ЕО ІЮ МО: 156.
5. Сполука кон'югата антитіло-антибіотик за п. 1, що містить анти-М/ТА моноклональне антитіло, яке включає легкий ланцюг (ІС), причому ІС включає амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 145, і важкий ланцюг (НС), причому НС включає амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 157.
6. Сполука кон'югата антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 1-5, що містить анти-МТА Зо моноклональне антитіло, де константна область важкого ланцюга включає амінокислотну заміну А118С і/або константна область легкого ланцюга включає амінокислотну заміну М205С, де нумерація наведена відповідно до нумерації БО.
7. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик, що включає моноклональне антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (МТА), де анти-МУТА антитіло включає легкий (І) ланцюг і важкий (Н) ланцюг, де: Ї ланцюг включає СОК 11, що включає послідовність КЗБОБІРКТЗАМКМІ ІМ (5ЕО ІЮ МО: 99), СОК 12, що включає послідовність МЛА5ТККЗ5 (ЗЕБО І МО: 100), і СОВ ІЗ, що включає послідовність ООМУЕБ5РРМУТ (5ЕБО ІЮ МО: 101); ії Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗЕМУМН (5ЕБО 10 МО: 102), СОК Н?, що включає послідовність ЕТММЕСТТТАМАЮЗМУКО (5ЕБЕО ІО МО: 103), і СОК НЗ, що включає послідовність СЕСІЇ ОО (ЗЕО ІО МО: 118) або СОС БО (ЗЕО ІЮ МО: 104), де моноклональне антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки зв'язується з бїарпу!юсоссих ашцеиве і ковалентно приєднане до антибіотика типу рифаміцину за допомогою розщеплюваного протеазою пептидного лінкера.
8. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де анти-М/ТА антитіло зв'язується з мітицилін- стійким бїарпуІососсиз ашгеив (МА5А).
9. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 7-8, де антибіотик типу рифаміцину являє собою антибіотик типу рифалазилу.
10. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 7-9, де антибіотик типу рифаміцину включає четвертинний амін, приєднаний до пептидного лінкера.
11. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 7-10, де пептидний лінкер приєднаний до цистеїну або введений методами генної інженерії цистеїну анти-М/ТА антитіла.
12. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 7-11, де пептидний лінкер являє собою лінкер, розщеплюваний ендопептидазою 5. ашгеиз або цистеїновою протеазою.
13. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 12, де пептидний лінкер являє собою лінкер, розщеплюваний стафопаїном В або стафопаїном А.
14. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 12, де пептидний лінкер являє собою лінкер, розщеплюваний людською протеазою катепсином В.
15. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 14, де пептидний лінкер являє собою дипептидний лінкер маї-сії.
16. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, що має формулу: АБ-( -арх)р, Зо де: АБ являє собою антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки; Ї являє собою пептидний лінкер, що має формулу: -ЗИ-Рер-у-, де Зіг являє собою сполучну частину; Рер являє собою пептид, що складається з двох- дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер: арх являє собою антибіотик типу рифаміцину; і р являє собою ціле число від 1 до 8.
17. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 16, де р являє собою від 2 до 4.
18. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, що має формулу І: т ре -- й й зи дхЙой щи нщк. Поу рон кон Зх Ж опе І Ден зе ру НО, я чор ве А 7 и и де: пунктирні лінії означають необов'язковий зв'язок; Е являє собою Н, С1-С:ігалкіл або С(О)СН:; А! являє собою ОН; В? являє собою СНАМ-(гетероцикліл), де гетероцикліл необов'язково заміщений однією або декількома групами, незалежно вибраними з С(О)СНз, С1-Сігалкілу, С1-Сіггетероарилу, Со- Сгогетероциклілу, Св-Сгоарилу та Сз-Сігкарбоциклілу;
або С ї К2 утворюють п'яти- або шестичленний конденсований гетероарил або гетероцикліл, і необов'язково утворюють спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, де спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне арильне або карбоциклільне кільце необов'язково заміщене Н, РЕ, СІ, Вг, І, Сі--Сігалкілом або ОН; Ї являє собою пептидний лінкер, приєднаний до НВ? або конденсованого гетероарилу або гетероциклілу, утвореного ЕК! і Б; і АБ являє собою антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/УТА).
19. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 18, де формула вибрана з групи, що складається 3: а) ие а. ще ІЗ у ка кн чі де прот, ик В ! М | | " й Бе Еш шо ТОН ; ХВ Її ве і щі щ Й хЖ ой г Ще сяк, о ом й ж є І й Ж. Не я - й р в й де ВЗ незалежно вибраний з Н і С./-С:галкілу; п являє собою 1 або 2; В" вибраний з Н, Е, СІ, Вг, І, С1-Сігалкілу і ОН; і 2 вибраний з МН, М(С:-С:ігалкілу), О і 5; Б) ЕЙ: ж Му й Я м І Го семи ще щі СН В йно яд За ще ОК Ко се яенон шея щоб Ї «
б. ша той а Дж ооюююкюткют де В? вибраний з Н і С:-С:галкілу; і п являє собою 0 або 1; с)
ді шо ш н з дл Хом К те т тр» ж (ту М тей ОН нин и лу: ле ев ц Й й ери НО, Др Н | Я де В: вибраний з Н і Сі-С:галкілу; і п являє собою 0 або 1; а)
0. ще й а й й до й Е он ії | их ці а ! М вні ; ї Ше х бер » та охх З вт : 7 зр й о НО кт ше що но в Вс дн одне дя я сх : я Я Й м й де В? незалежно вибраний з Н і С1-С:галкілу; і п являє собою 0 або 1; е) ОО, я ! й що «4 ря ї ! й ко га у он ЕВ ру | Фіз! : АХ 4 ко і АВ сна й Ве ах ши де ВЗ незалежно вибраний з Н і С1-С:галкілу; і п являє собою 1 або 2; і
15. У о пи о те У ї сек х Ей б ди о Й К ії) ех он Ще ре що Я но сток, М ой У ре очок, о га ще З з ко ший? щік у Ї ши м я : як ск з Я В М я тогти х З но як їй ши й д Ф Х й не еко ЕЙ Д тез дин (Се ой ай Г й я Кон
20. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де пептидний лінкер має формулу: -ЗИ-Рер-у-, де Зіг являє собою сполучну частину, ковалентно приєднану до антитіла проти тейхоєвих кислот клітинної стінки (М/ТА); Рер являє собою пептид, що складається з двох-дванадцяти амінокислотних залишків, і У являє собою спейсер, ковалентно приєднаний до антибіотика типу рифаміцину.
21. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 20, де 5іг має формулу: о Я то й і і смккдня ще синь п лялжжнжня бю Кг і 2 де КУ вибраний з групи, що складається з Сі-Сіоалкілену-, -Сз-Свкарбоцикло, -О-(Сі-Свалкілу)-, - арилену-, -С1-Сіоалкіленарилену-, -арилен-С:і-Сіоалкілену-, -С1-Стіоалкілен-(Сз-Свкарбоцикло)-, - (Сз-Свкарбоцикло)- Сі-Сіоалкілену-, -Сз-Свгетероцикло-, -С1-Сісалкілен-(Сз-Свгетероцикло)-, - (Сз-Свгетероцикло)- С1-Сіосалкілену-, -"СНСНегО);- і --НаСН2гО)-СНе-; і г являє собою ціле число в діапазоні від 1 до 10.
22. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 21, де БЄ являє собою-(СН?г)-.
23. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 20, де Рер включає від двох до дванадцяти амінокислотних залишків, незалежно вибраних із гліцину, аланіну, фенілаланіну, лізину, аргініну, валіну та цитруліну.
24. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 23, де Рер вибраний з валін-цитруліну (ма!-сії, мс); фенілаланін-лізину (ЖК); ОСАБАСОО (ЗЕО ІЮ МО: 126); їрт-сі; СРІте ЕЕ (З5ЕО ІЮ МО: 129); валін-цитрулін-фенілаланіну (маІ-сй-рпе); ОБАБА (5ЕО ІЮ МО: 131) і САБО (5ЕО ІО МО: 128).
25. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 20, де М включає пара-амінобензил або пара- амінобензилоксикарбоніл.
26. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, що має формулу: АД че ра зх АВ-8И--М7 т Во зи Ю й н о вда де АА1 і АА2 незалежно вибрані з бічних ланцюгів амінокислот.
27. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, де бічний ланцюг амінокислоти незалежно вибраний з Н, -СНз, -СНа(СеН5), -«СНаСнНг.СнНгСНеаМН», -«СНаСНа.СнНаМнОе(МН)МН», -СНСН(СНз)СНз Коо) і -СНЄСНаСнНаМнНессмМН»».
28. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу:
й Н о КОЖ ях сА- 8-7 г в а ше ше М ЕЕ: Г нм ох мн,
29. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу: ми ші г А В о і іє ї а і не що ши а і р я ра ВХ де ту Ш- а ей й М В ке Я -й і й і ; й т АДе
30. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу: р м Ж и сонний о В о А и и МИ т ит в Н еще НУ як Е о мн.
31. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу:
а. рев ав Шк | ше ше о і Кк я дь яти ораан и й - А ж З о Я 0 АН
32. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 31, що має формулу: НУ о У но С так у Їх | Її ї ! я . АБ дра чо ч вк сх М Зк, і і М х ня о по ин нки осн,
33. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу:
со
В А. с а и / о М'н о (С ро арх / ; | І ; ! М ' І ! ! М ЖК К де аа й Ку й Ада М
34. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 33, що має формулу: що 0: г ча х ран ре у ; д о Н о С о еанх т ; ї а їх і В зх х «! й й . ж НК
35. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу: во ? ' ву ж ди ди М дея о в м ка З Ге В її З ЙО до й де В" незалежно вибраний з Н і С/-С:галкілу.
36. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу: зл й і Н Ба 4 г у» . ши де гу М дя ин А, Бе КН ре щ ЖАКА А, НО . й чех й І і ни ше дня Й Б АМЕ г с прут 7 ве Ше щи ст г п що що щИ ; у Аюєтю, пф ен ши ей й в а й Ї : й й за і
37. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 36, що має формулу:
Св - | Зв во Ко КУ як г, зн ника зок и ми чис юн о виш як: Но ичя о ще це г : х й х ч дет ей ше м ГУ К я о ї но Шк ех їй ке и й » А Кит чи ши в й сви НУ н і Х й Й 1 же мн
38. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 26, що має формулу: иа су Її. ле шк он ши Сх За я Г- и м 7 ери жує о НО. А, а ЗИ І ЩА і г -е ее я я ні Г4е АХ ге г ї б вч ТЕ г й і с. З 5 Я В і м й ї І дае І КЕ: ср ГЯ тур ри мови є ко Б я Х в у й
5 .
39. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 38, що має формулу: о в у-й що їв пух ! і Її щі (х й М є о я щи ше КА Як Же с ; що 7 то та НО ий ге | Б і на а. І і о й н ЕЗ: ЇГ й ша - Ше й ко: тр М ї Ми» ей я ! шш ше МН он. де Ар являє собою анти-М/ТА антитіло, де анти-М/УТА антитіло включає легкий (Г) ланцюг і важкий (Н) ланцюг, де: і! ланцюг включає СОЖК 11, що включає послідовність КЗБОБІРКТОАМКМІ М (ЗЕО І МО: 99), СОК 12, що включає послідовність МАЗТККЗ (ЗЕО ІЮ МО: 100), їі СОК ІЗ, що включає послідовність ООУЕЗРРУТ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 101); ї Н ланцюг включає СОК НІ, що включає послідовність ЗЕМИМН (ЗЕО ІЮО МО: 102), СОК Н2, що включає послідовність ЕТММЕСТТТАМАОЗМКО (5ЕБЕО ІЮО МО: 103), ії СОК НЗ, що включає послідовність СЕС ОО (ЗЕО ІЮ МО: 118) або СОС БО (ЗЕО ІО МО: 104).
40. Фармацевтична композиція, яка включає сполуку кон'югат антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 1-39 і фармацевтично прийнятний носій, глідант, розріджувач або ексципієнт.
41. Спосіб одержання сполуки кон'югат антитіло-антибіотик за будь-яким із пунктів 1-39, який включає кон'югування антибіотика типу рифаміцину з анти-М/ТГА антитілом.
42. Інтермедіат антибіотик-лінкер, що має формулу ІІ: Кен шия о Її є Ше д У ї зо е ж ов а но ВШ хе | ; Ту і і. шо х. і Ж пннесннях ша. ЩО НО, я я не а і ще па бо ЩІ де: пунктирні лінії означають необов'язковий зв'язок; Е являє собою Н, С1-С:ігалкіл або С(О)СН:; А! являє собою ОН; В? являє собою СНАМ-(гетероцикліл), де гетероцикліл необов'язково заміщений однією або декількома групами, незалежно вибраними з С(О)СНз, С1-Сігалкілу, С1-Сіггетероарилу, Со- Сгогетероциклілу, Св-Сгоарилу та Сз-Сігкарбоциклілу; або С ї Кг утворюють п'яти- або шестичленний конденсований гетероарил або гетероцикліл, і необов'язково утворюють спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, де спірозчленоване або конденсоване шестичленне гетероарильне, гетероциклільне, арильне або карбоциклільне кільце, необов'язково заміщене Н, РЕ, СІ, Вг, І, Сі--Сігалкілом або ОН; Ї являє собою пептидний лінкер, приєднаний до К? або конденсованого гетероарилу або гетероциклілу, утворених КЕ! і Кг; і має формулу: -БІ-Рер-уУ-, де Зіг являє собою сполучну частину; Рер являє собою пептид, що складається з двох- дванадцяти амінокислотних залишків; і У являє собою спейсер; і Х являє собою реакційноздатну функціональну групу, вибрану з малеїіміду, тіолу, аміно, броміду, бромацетамідо, йодацетамідо, п-толуолсульфонату, йодиду, гідроксилу, карбоксилу, піридилдисульфіду та М-гідроксисукциніміду.
43. Інтермедіат антибіотик-лінкер за п. 42, де Х являє собою: хм вач ! ЖЕ у в! Шк Я, г т або а .
44. Інтермедіат антибіотик-лінкер за п. 42, що має формулу: Зо ря | о. ть й | 0-- де дей А їй со ШІ С; ха що. ни скол о З х. Жов й Бони Ж зе ЕІ на ра Знру че ув шк ФІ де ВЗ незалежно вибраний з Н і Сі-С:галкілу; п являє собою 1 або 2; В" вибраний з Н, Е, СІ, Вг, І, Сі-Сігалкілу і ОН; і 2 вибраний з МН, М(С:-Сігалкілу), О і 5.
45. Інтермедіат антибіотик-лінкер за п. 44, що має формулу, вибрану з групи, що складається 3: а) в "йо | | «я оно | зи ду жде і. Щк . т сх у й ОН Фі й я о о го НО, І що р нм Хе (СН -еї 10) с зв, . рай ! й т ї ї ї ен ки о айве (г о ще Си е ро М ж шен Но чу о о, Фі і п щи ш- г Ві т о Сх й А г СУ , ; ГУ Я о її Я Ки з З х Кв пра а и щ де М ши В ная ш-о у ма З ем се М І я
46. Спосіб знищення внутрішньоклітинного Єгарпуососси5 ашгеив у клітинах-хазяїнах пацієнта, інфікованого біарнпу!ососсиз ашшеив, без знищення клітин-хазяїнів, який включає введення сполуки кон'югата анти-М/ТА-антибіотика за будь-яким із пунктів 1-39.
47. Спосіб за п. 46, де знищуються персистуючі бактеріальні клітини.
48. Спосіб за п. 46 або п. 47, який додатково включає введення другого терапевтичного агента.
49. Спосіб за п. 48, де другим терапевтичним агентом є антибіотик.
50. Спосіб за п. 49, де антибіотик вибраний з структурних класів, що включають (їі) аміноглікозиди; (ії) бета-лактами; (ії) макроліди/циклічні пептиди; (їм) тетрацикліни; (м) фторхіноліни/фторхінолони; й (мі) оксазолідинони.
51. Спосіб за п. 49, де антибіотик вибраний з групи, що складається з кліндаміцину, новобіоцину, ретапамуліну, даптоміцину, 5К-2140944, 0(03-400549, ситафлоксацину, тейкопланіну, триклозану, нафтиридону, радезоліду, доксорубіцину, ампіциліну, ванкоміцину, іміпенему, дорипенему, гемцитабіну, далбаванцину й азитроміцину.
52. Набір для лікування бактеріальної інфекції, який включає: а) фармацевтичну композицію за п. 40; і р) інструкції із застосування.
53. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де анти-М/ТА антитіло включає варіабельну область легкого ланцюга (МІ), де Мі включає амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9555 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МІ ЗЕО ІЮО МО: 119.
54. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де анти-МТА антитіло включає варіабельну область важкого ланцюга (МН), де МН включає амінокислотну послідовність, що має щонайменше 9555 ідентичність послідовності за довжиною послідовності МН 5ЕО ІЮ МО: 156.
55. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де анти-М/ТА антитіло включає МІ і МН, де МІ. включає послідовність зЕО ІЮ МО: 119, а МН включає послідовність БЕО ІЮ МО: 156.
56. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де анти-М/ТА антитіло включає легкий ланцюг (С), причому І С включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 145, і важкий ланцюг (НС), причому НС включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 157.
57. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 7, де константна область важкого ланцюга анти- М/ТА антитіла включає амінокислотну заміну А118С і/або константна область легкого ланцюга Зо включає амінокислотну заміну М205С, де нумерація наведена відповідно до нумерації ЕО.
58. Сполука кон'югат антитіло-антибіотик за п. 39, де АБ являє собою анти-М/ТА антитіло, де анти-М/ТА антитіло включає МІ і МН, де МІ включає послідовність 5ЕО ІЮ МО: 119, а УН включає послідовність ЗЕО ІЮ МО: 156, і де р являє собою ціле число, що дорівнює 2.
ФІГ. і зей Чесефез ВИТИОТЮТНКА «ее узпсо 2 мкгми зневннній еннн ДИСІ О ДИКГРУМЕ -е - На 002 мкм ЗЕНОВ ар ей На бо МКМ З дн « шВПВ-Я но пон е з ОВ Кв ро їКх їй я М с: пива є Я Е0В-- шин Ши - - З ша -- мох й З Й З 4 не Час взаємели витніпотика ігодинн
Н.У ККУ; Ген ДУ о данланнннаннин і - : се Ж орто на, Ши: ЗО титрування вільного МА, й з са ж т т 7 п г Я ОКО Н І Н З й ОХ Маю ці Ка ке шк і Ц се вс нин петКЖАІ ан се ААКАКАН Мокій тав ес око ВМО р НО жкулетура остеобластів МОВІ УЗ ме з знкоМІну т сн виш Щщ КР Здго ктни херез З години! 1 рн Н й ! ЗО Заеоклиюв чвркм і день ! ОЮгІ : ех їх Загальна кетькість С то щ- : й ЗЕ ВО. о КО щі вилізеннх КОБ нжямиу ОС ще п | т о ги Ту МХ І ща ше 1 МК ОХ ЗКОХ ко КК ж ОБ ЩЕ дк І хх ху "ех ч ЗБК Внутрийвньоклітннва ЗХ? дже зх тане інфекція КІВ КО. тестя ЗО КК оо Доза при зараженні вільним я. жнлеюе Б НА Тейхоєві хнслоти клітинної стнкні М ІА о І рнн- т, по аа ел у Ко ч ; ще лей СХ ТЕ б У у ; б г ак Ше с Ме ит З ов АК ре о. мя НЕ вач ман реко жи і . т бен ща КЕ, с п ЗБпотенхоєвокислатнії ТА п м «АС е маш яти Ал Шо 200 У МА ь й я ще сов кл З що лет ов уми Он чо т вЕВОСУЧач ви ма КЕНЕ о Й фс ! о ИН Н а ОО ще Є І У Е Що щ Во їх Я с. й - і о КО ссрююу Же ди» вс ся оку Вк СЕ х Воя пронаан пед енд : Тептидоглікан о вда й, а, основана веМа ще ОО як ; щщ СМ З ОВ; ДОВ о. ТА я ДЕ й і Беж С ША, ПО о дн дно о дн і рю ПВ ОХ р вн КК он в о в нс В по . ША пане а вид в те - ШИ і с х певне ее ПО ПЕ ВЕН ЗІ ЯН ІН В НН ЕЕ НЕННИ ЕЕ З КК ВАНН ПИШНИЙ ПЕПІИШИИШИИИИИИКИ КИ ПИ ШИПИ ТИХ У Н і НІ ан І ; К Н ї : Н : і Н Н Н Я НО Н ; ї мемеранн ще і В іт вня Ко Ева ! Ек нс ско кс ня сн вив г. 4 окт В - Ос Ую Тмаланіно | БУ З хо Бкажанкя, ; нав 0 т рвавсоу СЕМАЄ фосфех | ще ; о гу М ЩО пиши ши ше по шш Що - Е ем 4 : я й що І Я везе я Ме р о о лертенці 3 ре ГЕН Ї с - Я ре й да пишне ТУ Ж мук її. ї є фей. | ва ни ни Б пи ж: Б зни ін у Ж ТВО би за ОТО он г кА Ноя й Я вх вв У КЕН: Ге - Н де ру У | дет Кк шт х дей є до тх КІ як є : й ! 5 й с ї он Море ї В к В ; ої п: сне и й мк сь ше в Й що я - З ск. Ку га па БЕ З жооехтвієнт 00 Ме, це о Ше ЕК Молифіканії паче отв нукрами Ще МНає як «о й Кк ші к Кн у. ; С па КОН дея х ух вав Си Б в'язок у, х, з-ЗВ'ЯЗОВ у КО ях Ки " ся
ФІ. й да І щу ща до - ще 5 с їх ВА тк, . 0. І І Б " 1 Опосередкованні опсонізацією фатоннтоз Знищення ок чий МК се Е Гн ще дну, п сені Ше ню ДЯ ях ри Ящик: з КО Ша каш з. Я 4 т Ся - ЯДЩЕ ою У і пава АС ДИСІ Я св Ї У нн х це цк ув св и и М ши І пп я ОН, КН КУ с й ? і Єва. а Є Я сет ЗЕ ск їй ке АХ Хвв й В, / х Со Я се ж. су йба КЗ Знищення бактерій. які о ка ЩЕ ідей М ж х Я я що БА уННЕлЕ ДИ ЗНІНЮТИКА у дк Я "тини - у хе кни й Жникнення дії р й дит ВНТНОІЮТНКІВ Бвнни ай я. » я кт її Кк - пиши НЯ В КЕ с я в ДЕД у Кт (3 Знищення фапоцнтованих бактерін не ее ФВ КУ «З ТОЖ Вин Я зв'юднихз ДАЄ о В, ААУ, КО СЯ се пе -- ККУ «в ев п ЕН вро МеВ Я дання З міннннми
«ФІГ. А АлАААААААААААААААААААААААААААА АЛЛА А ТАЛА А А АЛ А АААА А АЛ АЛ ААА А А А А А А А А А пр Аа А А Аа А А Аа А Аа Аа Аа іме І То сБусякж? Н сені, а пі вейюжввм | І тяєрело Й , ; Амінтю фо АЯтнрен о НуСМАЄ КЕЧТОМОЇ озретулвхх о Деко укерело За'язувивня з покриттям пре верхонному скроніцку з АЗС А, К сявтвяз іклітих й роти І Ко бавзехтю: 1 ння нон нн нн нн нн вони мання МАК А и ун оо ооо ні он а оман чан БУ дл дет р ва КУ і ВВР ПАРЄ С НВАЖИ стмолязрах фу препархт. пи? не мстить залі ТИВ У відвокений ЗБ а ТА їла Мі З ЗО ЗМ ТА РОМ КІЗ спеомомарна фхса с рюзомоту що ве мостінсе сазізи ЗВ у вілноєртвн ЗО АЖ «А Вете Н ке ї кас УР ТУХ ЦІБАЛКЮ стеніовлрих фозх (препаряту пкне мбстють зкліо: ТОВ У віпвогєвей З5:1 І помело мимо о аа пила пиннннннвни зипнннннннннннн пиннвюв ванни пива т пу ли Титул АТ Ии ТТ І ЯКЕ А й Н З р оБато ШУ РОМ АК КАХМНІ птоопезуез фозх прецирхє пконемиюкків хецою ТИВ У кідесюеную СЯ она аа оо ПЕ НО ОН Ода ОД аа п в о и о о и ІМ ЖхлА бета ' ЗЕ І МЕ ВОМУ ТТ, СМ ВИМ степіомарюиа фах дрепяєвх, по ме зстить зяпіто: ТВ х відасттенні 25О3у пече чани чн ОЧНІ ПЕ ча о и УЧ ПИЧУЧИ НИ ПИ И ОД и ИН по ол нн промо пупи ин пно у че нииининннни 52 Я два тором УЮ ОР ОБВАС ІУХМУЧТА ТИ К УК С ВАХІО схмпонарна фата бирейвуат, ме містку талоумо: 13 ж відчопуєння З І В А сет і : а КЯ Е БАС КОМА М НКАУ) сзатюнорма фата Птресорот пихвемістить зал: 1ЗБ у віжки ЗК Іа КУ тк Н ке 1 пах РОТА МИЛЕ СИ МВА скархмивнорюа фазніруепярах пуєбкеммктить мишею: ЕМВ У юдасюевнс я НЯ ТА. бета ' З | ва ЕОМ ТУ У НВР. стазнонярня йххба зюриюарат. пи) я хистихе зали І ЗЕ у відношення ОБ КУ их с ЦІ З | ВЕУ ІМТ АТТИЕ СУК ОВАХЦО сюнронориа фах пурепярох, вх» де хістить зишею: ТВ У відтканевом 25:45 і БЕ УТА до Н Ся ЖИВА стаціовхрвх фаза препарат. ших несоствіх залізо ЗВ у відношенні бу І Км МА бета Н З 1 ие. ВМО СКАЗ стюнонярна фкса спра. шо ек містите залами; 158 у візкомеені бою) Б А дет і хх || Вже РОМЕМТА ПК СИ ОЛАЙЛОЙ стоювхрвя фозх (прелорях о хек ун оялисо ТВ у хека ОХ Н Н Н І К ! Н І січки ех ре ши КІ . ; г світ н ВНИМ А зак Кк ро САКАЖК стибсвоурна фозя спрепорят, нроже місптитв залізо 158 у водякацевні 5-4. ЗВАНІ ЩА клю! 0 ня Щи ВО ЖМВИ | СДЦЄАЖЮ стомехнорно фо пореожрат, оо не зісіють яхті ТОВ у кіднуютекеї ТЯ У вання повне о у нн поомавн попланннннни моло повинне чани МДУ чи МР ЧИ Р и . г. . а Е - - тт ту З ТА вон | З ЗАВ СУК НВАЖК стадзоюарня фозв (препорят, шко че устите залізо КУА у відзюуюнні 4, |! НА ХВ. альфа | КО ие ПОЛА. стюціонорна Зято сопепяруг, пі немістють зхлио: ТОВ у відюпенн Ж паттттіттттття В ітттттттттттт ення енттітттфеттттіттлттто фанти нттттттт и оттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттття гоя прощ сх ух - ярих тро Ма Ефес неви вн кине ни зни пипноннвнннвнн помане осн Море Мине ни ов о пром рові р офі фо нн ні фе "ол ня, они ЯВИ Ку | НУК віхка т З в АПК КО ЕАУК ставусвзрну фах іпрепорят, шо не міствтя гальки ЗВ у відикацпенні УК овен ик ан Ми кни попа нина мине проте ту и Мр и чит і ми и и а м оо и о и ор и поро у а Боас вкла З | ха РА РОК УУТАЦТІ СХ БА ЖК, спопонарня фа пребхурют що не ктить хлію: ТВ х відношенні Зо) ! на ЗІЛНОБІлЕК. Мі поз я ІВ СУ НЕАКІ старувховх фаза препарат, пил ие містить заліз ТВ у вудисапенні Я) па НКУ І тах дн СИНОМ р УК ТА С З ВВ Сію спюмоварна фе ТВ І КЗ ОК ' ЩО СХ Щи ВОК КАМЮ стапіонарна бяза с бренхрат, що незстить зяліо: ТВ у відношенні За
Е.В РАЛВОС - плазмоблаєти З пвазматичні клітини МВС - В-клітини пами я -
ФІ. ТА з « 5 Х т горе: : дя з АналіззмакрофФфагамніюв унго тд ок а -- кни - х ММ в ; за ся х Го зеофкто г же ее готи кжкжужжу кт лук М спід я БУ се. ОКУНЯ в ЕХ ЕВ: в НИ се го яд ВО ее КЕКВ ЕХ КЕ Ну око Ме ТО ЕК ВЕ їх БУ ЕЛ Зо ее Я МК щу Зо Пк Іо МИ ОК р я КК М Е м ЖЕ: Со Ах КК УВ о КА КІ оЯ Б СУ У Ж я ОН НА и: оо я А І косу к ОК І умо ЗДК т ОО: В МОЯ КОМ Кх ДМА: чАх Ро І А КУ М З ГКУ КК Я Уа КУЗОВ ШО дл ВКМ ОА ВК ОО БО Кк цу КІМ ЯЗ ВЕБ КТК ЗК ОК ше МО ВОК КУ МВВ ТИ КУ ТЕКУ ах УКВ ТК ОН ПОКИ Я ЖУК -к МТК ПМ Я ОН ВО ех ОВ КеЯ Е КО м в Му А КА о и ер ТНК: І 0 шщ Б Б к Б, За В ПА ОО В КОМ КО в Ж : ПОН КОН А В Ох: ТК ЕК ХК КА Мк чаЗ КБ я В ОВТ В КН Ко Мк Кх 45 рову її й т з і моя ж ща Й ГК НЕ ЕН 65 10 пи БЕ Антитіло г Ж 2 ж 2 Карна - ча и. Е пика їз й шт с б 65 о Я ОБР ДЮ 1 Мр Обл питноютик Же Кулех, що Гм он Ен м мух ЗК КОКО рю ТОМ ХК Кя ВОІВ оо Кк КК он г ОК З Б од ОВК ов а ех ча СК з я Шк се ШК З. ОМАЗ УКТІ рифампшщни КМ ща що с. 3 щ- У і й гущі х рюоФфамтиния ТАМ
В.В х ска ж я. тов Аналізз макрофятами й УМко Уа У м туї ше Ве ек я ох же кот з, КЕ Во ПЕС к, зах У Я ОО с З ЗК Ін СМ З - у ТОК КАНОЕ Гея Ко ММ но ж руй СМ пе БОЛАВ а МК щ Ка о о о З КУ Хо я - З (В п нн ВОК вва Он ку: А КОМ ВОК . МЕ БОМ ох і З і Кок во ВО КЕ ЕМ Ох ГК ЯН А ше п ОЗ ЕК ОХ КК Ге: дя ЖИ ККИкЯ я 2 - - Ру о Ї й ХЕ Ще 5 Ежй Ж ЕВ ї ща 5 Ей ря ще ш « ж ке с вй щ «о щ « щ- я 2 Ех гі «Е їч- р. їх» г їв т с й хх З Е о- т - Я в їй їй ща в їх що Ж щі ак ина СІК ре з хви мч У знк макрофагн мав Аа ЕС НО м яв ее: ах ка Бе З5Ох яр. ВАК КИЯ ведонех СОТ Е из о НК Ка ТЕМ. хо БЛЕК ВКИМУ лк ее Со каіне мін в КО т ВОНО Ех я зе ок -й ВЕ а ОК ОК ак о С о Я М ще як КОНКУ Ки КО ПОС То доля ВОДОЮ я МОКІЯ ОІВ я до ШЕ о ве МКК: І 7х ОКУ МОНЕ КК ВЕУ ГИ я їж ОО МУ и ОН КЕ М, МОМ КА іш У А Ки КК А Я ДЕ КЕ КІ ДІ В КН В КОМИ я У с ВУС и А о ВХ ОК К АК ОККО я о Ех 0. Б ВАК КЯ ВА ЕК КВ КВ СКК І в шо ун З у КО ЕМО ЕВОЦІА о, КЕ ООН І - Ще сек» З вк с ки і В щі т я шко се же В я КК. Я ОО КУ зррлюрк ще Ух ве Же ж З ще в ШКО СОМ КТ КЕ що шо ЩО що Оу є - ж Зону КО че в Мих х. о с «У що 5 КИ їв и УКВ ОХ я т АК КК мужня ЕК нм Ж я пох ж тяж я» озону ЦІ ши зе ск коду сз тю -ЗАЯЗУ-НОСАЗІАС- та АНУСА - жк сих п ж так Зк сі я Е МС УРА НОВОЮ 0 МОм АВ: лиметнц р ВОК дх Зх Гак : Ї ее й 5 ААС ЗОБА нижче межі виявлення З КБ енкУ
ФІГ. се Е Б язку и ЕМО вом песо ко по Лізовані Назаражені Заражені Звражені детергентаом макросаги ПВА Бас в макрофаги антІнтіло ААС ФНОТЕ Вилілення живих з. вигейх із макрофагів З ЗХ МИ ак пек ах 1 ПМК ХК МКК СЕ х с о ооо. гади ХХ СХ ОХ Ех ЯНА КЯ я о ть (1110000) антитіло Ас
Н.А и ци Левв 7 щоЯ Шок й ддяннння : ; «юки» Перитонезальний за ий, ЦІ нирки Н і шик, і
Кв. обробка через За хв зо з 1 єї і еФ чу й Ії, Е їх БОШ. - З У З З с: шосе Му шк ем м: В Ко З і - - З В з пре ПИ ПФК НОЯ за а Я У 1д-ень гц з я ка: Що Ге Са) Ф о і « о Е р е - З ш «у - Би - Бк | т Кк ш - ш - ; В щ- -- Гн ї- м ; - ке що їх Се Ф ; Ж со ї -Е Ж 5 З - Ж в З жо: ще НИ щу Фі З к З ; с СЕ Перятовевльняй Нернтанелльні нирки супернатанут зплітни
ФІГ. 5 я Ше к Й ше и День нку нн ІНН о ни жука «к «У кі ІЗ З І Щщк З МАБА : сСюрозва через ЗА ХВ витрВипньовення я ОК БІ за ве Шк: що г А -
па. -й- а е ШИ і Я Е по зу - а ї- ІЗ не скдтмде ча ВВЕ оннронннннннннанння фено м КІ Бе: ш що ко ЯН що Е а ЖОВ Кз я шо Ж Ку о --Е - ; со те - й КО ще що я сяк) чу
ФАХ ші Й чук Є і ; День а: ши: ІЙ, ЦІ; Нирки МЕБА Жнутріцнвовенко СЮробка через ЗОхВ р-значення з тесту Міанна-Уїтні х порівнянні з групою 97 ме чо о5015 зо ! а ях зп З НВ; еще з го: ге; - Бу нь. я га; роз де К 5 ту ши ще | І. о их що до» е сну а ш Кіа хек мрекх ен Б в ! ЧО щі аз. пт о рент нн ня ДЮ ен с нн нн нн яння няня ВАЗ: В й Доза для антитіл т - пом в щі лікування а 15 АС ПИЙ імкгкгі ФеТГ.ов НЕД: щи День З н м жинккннннннккннннннккнннижтінх Яні , Ннорхн і і МА ? януТрИпИивОВЕННО пмронка через З0хв р-значення з тесту Манна Уітні ух порівнянні з групою 72000 мг 1993 «в: Фе гри 10 й - і з х зи с. ей хх В Є яв г шу КІ КЗ щ ча » тх уки ех умеутвих - я а ве Оу із я і жо ку рен А уриевонннннннннкрнннниннннннниннккннниюуннккк ик кутю жк режжннккння т се га ї; ЩО 10 й : доза лля ДЕТЕТІЛО ннннетюнсенотссеноюннннн пів ща Двметни 10 ДАЄ пий імжт ж
Ос рана Й й М Цень З пл Шк секнккикиккикикиккижжни и ОСА й ах Б "ті ні; Ї Нирки і МивА м внутрішньовенно бробка через ЗОхв БУК я ш «т? г Ки - м ще 5 в З Ж я що МЕ з рсев Я «І МУ оз пу ККЗ їй ти Е тА Кк ним ее кни ; яНтТиТІіЛе Аме о0одісьнуй ра ки к Кам пк ж МОБААС антибіотик Диметил - ж .1аА3 -к се пе пу ів 0 50 | ОТУТ ся ес -щ-- ке Я СМ Н нний с сосок за па Я зи вай КОКОЯ Го гато Тато що У т - КО панам Еш пт КОЯ 8 ОО НюМ о. Мт ее Н Б оорююк Уофко МІ отакі Ди ОКИхня ОМ м СВ ЕОУ З що ТЯ ГК М: п. Я ау ДК ЖУЖИМОЯ мя КО ЩО М с КО УК КО с . КК сер ЕХО я УЖ я КОЖ о Ярдая ВО 55 Б лУНЯ ке к Кос НЯ З Я РКО і хплте к тк Сктнщеннй сим й сиренатка сироватка пн КЗ Я коло вогі пієнта 1нКх ке ннк я вх деревого пвиєнта я ібаттасакй щ люБОора донера. НОВ МОООпОз в о о Щошех, 4 г БО ккжаажажажача аа аТьннн на ча аа ааанаааааааанн нини и ко БВ ТАНК: З г що ЗУ ТЕКУ Та Б ПЕ М Мак ЛУО не Я " НЕ МЕ КК. ПЕЖО В КО У ДО НОВ ке ах СК КИ ВУ. ще КК ОК ст 5 З з ЗОВ 2 ме дДинтитіцо димеТНя Диметна 105 АС БАЗ ОБ ААС С ЛО мими ВУЙИ
ХЕ в підтримка 10 ме мл теє ц є Її і і. Її Щі І Ше а: День 4 ІЇЇ ІЙ, Ниркн хро А --к7 - МНЗА Обробка через і день веюв Ще пт Щі то - з о шо: з Ще 8 о Е 5 че о не о п що х оо Е: ТЗ о « пр й зв. пн но ск» ВИНИ Антнтшю Диметня КН ТОБ АС шві. А Ка підтримка 10 мал ще КИ. ; у Чень Я Я і нн нин нн нд нин Й - -С7 іі ич Нирки Ії Я оороєкя СГАСС во антитьюо) МЕЗА 0 4 009 о вацкоміцинОоМм пед сві реа Я афо 77777 тнт 1085 ії Фа В ре Я пе | о їїх Кен - ди зн я ПИШН дО Ж «Аа синя нн НІ ЕКО! 4 ді я 4 й пн Антнтшо оУвдпсо о лнметня ді) иа Я К ни КЕ, кеВ 15 АС Я АС
ЕГО Ів -Ф-4497 Бета -- 778 Альфа 10000 ' Кк - ТЕ ні 1 1--90 -е--а2 шу Я і ве:
я. 001000 й т щвоО01000: я роя в ШК «з кох їх я ай С КК я 2 дн ма ком - Б р -х -Щх щ- В Е 7, В м Я У Я ан же. БА 00 Я ; ш В и 5 гу вв х м . З во ; Ї е сх лк а ге - м й : : ; п 0 1 10 0 Кенцентозція антнтілімкгіалі ФІ ОТІЄ ЧУ підтримка рівня 10 мг/мл ту, День 4 Що й Ж шк СЯ Її Я Нирки НЕ щі сорооки АС або антитіла! МКБА Ннрки Серце це Лашген я й «аз ше і НИ щі ОН бо - ше; : щ се опор» ЕК Я 55 а іш 7-2 вх 2о щоб М : при І З щи нин хх м 322 фон ру вв : ЕЕ: де скосв ж : ї- ЧА Антитіла ААС Автитию А Антитіне А БАНІ 129 ща 155 5лащІ ти ес ЕН Я рин ЖК Схема аналізу вивільнення під т І " " Ше чі , дією катепсних Я Резуельтяти аналізу вивільнення під дією І: Й Й І катепсину х інтактний ЛА Ї днтйиувнк о певне без фермента ніс жди 01»- Каїсонв В ні фл - катенснн кн Ше: о аа - ке І г тк х т КЗ СД Б хв вв чи ве п є о есе тету оесеросровогоюсо кава с в Е аз пз і 1 а їх т Кз: г ше очи не -- 3 шк ПИ ВЧНИНК т : Ся вн НИ х Р! х У шк зв я о нн МЕ МИ нгрування обпойлених Ка ж з Тніх ї Ва св 1 КЕ: хатепенвом ВААС БВ Ї Е що . і мкгмя АДЄ (од) значення мінімальної лаз, яка існує Низначення м дазв, гм, і ріст З. ерене М я 7 як ра а ж ФІГ А Пидкресленіпослідавності СПК ВІДПОВІДНО ДО снстеми Ка Варівйельна заласть легкого ланцюга о ни УЧ ШОВК КИ В Бумерація за Ка ої у 3 405 БОРОЖ б ОМОр;ОЮ Бомоеб еІ 05 0035. У) ВМО М ун ЇВ; йТо 27 25 0 За ЩІ: 32 а ЗВО 48 з га ш ж вв тон ххх хакі свквВ он у м в кВ чну Я а с: ж я в оров б 3 У В ЛЮ ХА т Б й т В Коб я 6 о- 5 я З ВЕ ВЕвачя ще 5 Її 95 У ток ЕВ 5 АХ ВЧТ кА Вт? АВ В Вк аАНЕ т ві У т б в в бої хх» Бк Ії 8528 У їн :ххххА ВХ КеІП2ІТІТІІІ Іст ІІІ Іст : РАНО В Сов ! ОБ Це Нонна: «БОМ Ка Нумерація за Мабаг ти 2352 42 31 485 36 3Б дО Ба ОМ ОЗ 5 58 55 565259 50 о бр 63 ой 65 обі обо НОВ МОВО ТЕЛЕ га «ді а БЕ с 5 Б В кКіІ 0 ру каАКУ ВХ б З 5 вт: наих яд З 5 8 в 5 вк 5 Ж кт хх 5 БУ во РЕ ВЇ З Б 758 кер ШИ ше З НЕ ЗБЕ ЗЕ ЗЕ З В ВЕН ВИ В ДЕ В В п З В В З А З М В ВС В ДИ ЗМИВ Я Що? З в ях во Б Р ВЖК Б І 5 Аг ВВ УРоВЕ В полі винний й.
ШОВ пек есеМШШЩ Соні Спа пиття пр Тісерація ха Кофмк 53 нфоКІ ВО ВІ 84 Ві СЕ ДЛ КЖ ПУ ЗІ ЗИ пута я Вб Зо? ща вежах пов ЧВОони ен Ре ДЕ в З ЗК З ШИ МЕНА ХО З З У З: У а ЗВ З В По М и З ЗИ НИ ЗИ човст ав вт ач хата. втулок т шт ях Ко УВЕ ш ЕЕ Ми ЕН ЗВ В З Як З НЕ З ЗЕ СІ о ЗНО З ват о аа У У усю ту р ж ВВ ек Б І пі 2 індкреслені послі "Ввід ослідевнасті С Взрізбельна об еВ, Ві азелаєти в. відповізна вт вІжкого лав днодо снетеМм ще .цв паншюга ми Кабаї Нумеркці зюерння за - ня за Кара ! ях М НЕ ЕНН: «г хв т ль . ак Бі ТБ Ой З : ять сти т КЕ ЕЕ ок тв аж ис бОВО ВІ ку г в фа тк хкс гроза Т-КЛКА попа ча» тя в Й Ж ВЕ ГА ОВО МО 2 2 25 ес що вжи вк ВАТ 7 ГУМІНеКУ з І СТ5 ІК ВЕУ ІСВЖНІ Кава нин Ні КОН: ГЕ ЗШЕ КУ ТУ ОВЕС ЗЕ СВА НІ У КеВа н | х Кк Кок гі зро лЕ і я г одикднвщ тя хХ вип ях т В В хх ок 5, у заз умерація за К. КМ НИ - Сопі ЖБК ка ха тн: Ж КЗ МОЯ яра. Ессен сх ду в я ОО жОт ої Зк 8 З вив шо ре | Се З Улижяя ку дах я їй як ав М. В НЕХЕВНВВ и т КЕ т Н тож к У нь хх ТЕ РЕЗЕЯ; а ше: з Конні т Біт дб г шив ер соя их пня МК КВ Кох дощу а м 2 5 жи ЧИ У хоч ЗВ чі ва і де т чНЕх ЩЕ Кк вип кох Б Ибжа ОВ ОМ Мона по ко ше чі ОВ жи хх 5 нм ми а в ниж б БбКРЯВ БА т в Ех У й я вх хх з 5 7315 Не песен нн т буква ках з ном пе умерація за Ко те вісь 55 в я ик ТЕ ТВ МОБ ВІ Ж Банах. НИ шиття 3 Ва ЕЕ УНН ої т В ЗА БОЖУ 2 Ж пом петрятннння шжтнжннняя вання йеоц Мт: 5 7.5 АХ Ве Ти. пФЕмж Я: В Ї піші оеговввевве ев ДЕН мож т АЖ хх я г: пово мкВ фГлш-н- пентннтннння вну а вія ж ж их т ож 45 ж В ЖК ОК МОМ І питних 2.8 У шк х хів з кг ДЕ хх 55: шов с -- шення ВВЕ ЧУ: бра 5 ОХ я ТЕ 5 4: ска Ві помом щоб З: ФРІ пд 3 Тева тити кА В х Ж х хх ЧИ ЧЕ» КЕ де зі я пе Не т та На піт тет ахкх дощ Ж: т 35 в вка У кв КІВ о Не-КаїЕ ЗКВ. петнтнннння пня кох 4 ЖЕ Ах НИ подо хв я НМ НХЕ. пом ши птттттттннтя теннннннняя Нумервці 1:24 чт жк ЖЕ З ях НИ пох ЕМ опа Що Ко: ВК нн пентнннння ша умервнія за Кл ВВ їх во зяа І Воріки при пи ех манна сн СКАВК ОТ СТ м 55: й х ї не зник РЕ І вщІЄ птттттттттттнях пітттттнту зм УВУ Я 5 Ми . М . ЗА гм. тм імя пиляння ' рег АВ ака хх я и прим; п рук ке и : зви г з4т17 зт не! кінні 111 не : й ще НК по 3353: хе лвт жов Мн КЛИН я ока я СО по т її 8 тва и 3 се ог оно соя Бої го я БЖ 5 В з 28755 ее: пооосеосюто з кі: й о» х в за ме З пра : Метеор ох ої ко вш5 й т нання Ох кої ї х сккнжкнннжкя АНА рантитію о скнжкнкжжнкККнККиХ т І ше вдЕ оо у т нин і дамо т сок ще ук скккжккжкжкнкко го Код ЕОМ ха русин СБОоОА сонника І я ВДВС З КАБЕВ й нев с пкжжккжнкня ФУТ : Ки птн сккжкжжекя Б вищо мя ВЕС МОЗ) ОПУКЕУВЕМ 18 вні спккжжжкжкжккю : ПЕ ев ЩА: Ву КАТЕ чу Ве їй М диню соЕ пиннннннннннння 7 ес сет КАДНЕВ їх ОО СКЗ) й пиминлф на пиши Р УК ТУ шини ВЕС Х Кк У ОМ КОЮ даті скккнжккннннкню Бдннх Ей Ай наш ГОСУКОУВЕМ ЗЕСНО МОСЯЙ ЧТАМОМТОУАОК ее ря гом БОБ КО, БЕФЮ КОЖ ВИМ БОЮ сотенявкнов ВВС Й І РАБОТА ЕВ не ВОЗИ ж (БИ УЮОАИ Щ УАД ще -. з М ІНК ОХ У щО КУ 7 З УМГУКОАСОЇ тет Бодя ЗЕ ша А поса КуБУвиМ ЗЕ моя ДЛИМАМВОМТОУ, (ЕЙ каш пи Во ЕВ ЕНО ТІ сен Жов п бяд пев ю Ма п етАОККОс нЕих МО Є х 7 БАшОоВ ПОЛК. ЕВ ке ития ТУ ОІВ Р злий СП МАХ Фр го і КАВЦИМН 41252 як НК Я БОЮ М. вт а ЗВУКО фитня етно з БЕ у ОКУвотТРАЄ ЕЛ МО КУМНеМоу зерня Еб КОАЦІКУРОЇ Гр (ЗЕ ВОМ БА НЕО Р УВІ ЗО Нео в мох - БЮ ЯКО. ре ее Н Е и ЕМО Мои втрІН МДЕ Коса уки вЕшюно і НАВОБУСАМА Ей ДО еоменЕви ЕОМ ння й АВ ВЕК Кт (БЕСИЮ МО А ване они 7 ЕОМ, МНЕ МОСА ТМ АС -ЕС ее ни рваве лЕВЕ НВ Ел КУМО о ки ТЕКИ зомтМАСВНОЮ ВЕ НОю й кет ЕВ ще Те есте ЕС МО прошкеи От ЕНФЕКОТОНАНЧЕ Бади їщеОю пе ваша пром, ДОБИ юЮВОвО МАКЕВСОКТЕУАРКЕНЕ Енжакотоніу емо ; де АкооН РАБ ПІШКИ НМА АХУАММ ше БО ЗОКТетАРКННЄ. ад ЕК ЗКУ і КАВОСІВ пф ЗЕ т дме В ами пев повне і ка | Оох пики ет Аж же еВ ОваНУвКІ 5 ВЕЛО КОЄЮ ЗИкнВоМ спе, постуововніве У ре им ее се МЕ Одо з ач ЗІ ТО ИН преси нн Є. їх 7 зриде р а АБННВ я Бест ТИ аю Запиши тони зару І Те ПАМ. ча о Ж, с тя Не пе . іпттнттятнт ТІЛУ» ХА: піттинх х. сек; ДУМ 4 ВЕМИ КЕ КС петтнтнн ОБО че дж ки ! ААНМАТЕ -------- Кедр БОЮ А пон КИ т ЕЗеКИВ ВК ЕВБАТУАЮВУКО їз м -- ПУ У ни що тида ПОТ КК ЕНН УМ питних ІЗЕО М МУКУ ЯвЕв МКК І ВАЗОН ретеяннтння ПО ЩІ я не ї м ст Ек (5 оду ! КАМ В ОБО ра) МАВ ЕМО У нх повогвуувсвенено як ВО сдлитдтнх а Не р Поттадттлних ТІ Фе. УМеУМу у пен їх поле тури раз ВА КУТ) ен ак МОМ кот пвеСНО а ТОБ вою І ВАКОЗЮИК й БО що кт уник ЯКО в етно МК г й по поклооя ! ЕОМ ва нев есе ЕКО ПІШОВ НУАОМЯ п ко ХЩ пдх таке І оре тм ту по «В ої ТНУАТЕ очи ТО Як перу, р Кещо Я МАБМЕНЄ Е зон ЕВ в нання нка р ке й Н ООН - гешг НІМ Ге ОБО ЕОЮ ДЕ ИМЯ нн Ко кОжаОЕ ТАК ІББО ШЕ МОСІ ГаСУКаСУуВ ІЕС МОУ А БНЕУВІНТАВ ми зеттнннннннння Ба їЇ3чю ЩО. ЗІ АВТ зар чЕО МО 5 ЖИ НЯ НОУКТНТАЮВУКО С ІЗЕСНО МОНЕ І ІЗ С3Ни коки д АЦТЕКЕ Піни Ка ЗАМ ЗЕСНО Мега ПАДЗУКИУ ЕС КОЮ і ВАФЕНЯНО ВЕОШ МО КЕ МОБ ЗЕОНО ВО ЕВ МОВ йо ЕЕ ЕЕ ЗЕ НЯ М ни нави ! ов еоноя т ОКО КВК ПУТАЮЕ ЗЕ СЗЦОВЕМ пня НО НООЄ, вне они БЕН Р БОЮ МКАВАКО 5 МО. ; ПеТчІ о кжЕцвтня ТЕБЕ КН я ши пЕупуві " БОЮ щи КИ ї8Ба ДК У ЕТНМЕВТТТА, - пи ик ВЕаНя за ОК ВД дид єї их Ми АТАГЕА ЕС МО: се ПеЕО НОВ?) сто ШИ щеою Мо АОвне сос 2 МОЮ т; ач АС АХІ н я т хх Я ї : У ЕЕСНО МКК НЯ БК ІВЖя заосоо 5253 пе ІОЕ ТВА ЗЕ 253 мет аКоНо КА пани БК: маєстахісамі КО МО: рано птн МОН акисамі СЕ МО кеоА р е їх
"ПВ. як БУ ; те От т ок БТ ЕЩШОМО: У -- і ТУ КУЗЯ що чт. і5а-ї Нідюреєслені послідовності СІК візповідна ло системи Каває легжий ланнюзг п ІсбиСтесСомаХ ГОСТ в І МЕ КЕ Кава) Е ПумервнівзакКают р; з яз з ВІ сопе ес»нЗанипаввОпинииванваининК и Й з г у Кк їх б жов в її їх 5 Кк В У Б Б КУТІ т скА ОВНА Я; хв шуВеНо сю МІ тт 28251: АЗОТ сКкКаАотТІВогяБАаАУ ЕВ АЕ БНВО в їх тн т п 8 Б я їх Зх вх ЗВ БУРЕ КОВІ Вих ока МЕС Б І: ху жк х па Фк Її З З А В 5 в ВУ Ії т ск: ставка ЗИ ся БІ т нт от ВА ВтопкУуУтТІТСОВАВ:тТІїІанйьк Кк кВАХ а ов пі Ук 5 в Ххав У тІУитваА жнив ях ех вки. МИВУСКУую пої хо в ж обов В Ж ЕЕ У в'я в У й вБ'Ю У Б І т с в Ал б ж ливо ши п і У Її 5 в б5ї хх ЗАЗ кУі:кА ТУ: аУНЬХУ сх МОУ Усю. ше о сх ЗМНИНИ ГОЖНА ТУ сна: С Нумераціяза Жараї 3 ох ЯМ ОБ ОНОМ я З З БО ЗК НО КО В б БУ ДК АКБ ВЕ ЕХ ЗР ТЕ 2: БОЇВ ТЯ 25 РОБ аб ВІ Во ЗОН Б з хв ока вх: вет кто ВиБеНоУ я У ЖК ов І жк В 5 т МЕ В б т пов Кк В я ас я в Її ХОР Б Б т 1 58 Б ОВО п в кис в хх КІ 5 8 КЕ БУХ КЕ вої хі Вк ооЕ а о ов ВИ ВЕ ВЕ В В МЕ З В Я и ЗВ В З З В ВЕ В ВЕ ЗЕ ВИ В З В ВИ А ЗИ В З З В В ЗЕ ВУС й г КЕ Ь вії каз її ЕЕ ВУ вита вовБевЕВьї І: мВ мНносуя 5 У Кк ЕІ АЗОВ ЕБІХ ЕВ ос Ед мне МЕЗЕ МЕ ЗМ НИ ЗШ ЗК ЧЕ ЗИ ЗВ ТИ М З НЕ ЗИ З М ВИ ВЕ ЗД В В З ЗИ НН СЕ СЕ ЗЕ НКУ шия нОссь а г ж ьї їх ьо: 855805: УТІ в: і ФОМІН щІКі1А. ад | Я Константи збласль. нумерація БТ Куєсраніяза Жаби о зом ж КОМ ОВОЧ ЮОБ ОВ ОМ ОВ ОН Ж м овФВО род офі ве де МЕ ОФЯ Ме БЕН ОВО ВЬОПЕНОПРНО ЕВ ОО Ж НЕ ЩНК її 1 с 535 Я ХХ БОБ ОВ В кб» 1 5 Ж ТОБІ Ж В т хх хво: лож І Во Кк ОВ о 5 р ЗИВхеНОє г 5 пос а р в я БЖ ЕТ Я Ж У ЮТ Вт яВв о ж ВхВЕ В Ех Екок ви хВИНИ З ВИК В ОП Ж Ви ЗЕ ВИ ВИ ПД В ВЕ ЗЕ В ЗВ З ЗК З В НЕ МИ І В З ЗМ Є ЗО ЗИ З ВИ М З ВХ
БП. Ії15А Нумершця за Кайає Бош шОМ я обом ОБ ох 36 моя Бош БрІН І КЧЯМ ВР ее пли мо ПІ 3 М Ое дТ НВ б БУ Б Ма ЗМІНІ ШЕ ла о: ІНШИМ З ПИ о о ВЕ ВЕ В ВЕ ЕС с ЗЕ ЗВ ЧИ ЗВ ПИ В НЕ З В ПЕ СО В В З В ЗЕ Не хви: ЗЕ З ЯМ З: МА: ЗНО и МИ ЗЕ ЗВ І НЕ со З ЗО Є ЧИ: ВИ МЕ НО НО в С ЗО с В ЗЕ ЗМ ВЗ Ех МИ Ж ЗМ В М М З В В ЗИ З ЗИ СП я ЗБ ЗЕ ЗНО ЧИ Ь З В ХЕ У п п З В М В и в З МКУ ОЗ Би Фу сЗН З М Є З З М ЗВ З І Є З ЗВ НЕ ЗЕ ЗМ НН ЧЕ З З ПЕ ЗЕ ЗВ ЗІ З с ЗЕ ЗЕ ЗВ З З СИ Епуочераціяза БО би ПЕОМ ВЕ ПРІб ПВ Я ІБ ІНВ ПІНИ ВЕ ВІВ Не НТ ОВО БО ВІ У ОпІож ІІ Ма рова в ЗМ ЗНО НЕЮ На ЩІ 25 3 т 55 5 Бк: ал ах я 52355855 Кок в ВЕ Ве в З З В І В В В НО У ВЕ В НО ВВ В ЗЕ ЕВ ПЕ ЗМ ВЕ ПВ ЗЕ НЕ Масу 3 т 5 5 БІ ХХ їв ЮК кох 55 53 их ек ЗВ а КН ЗЕ НН ЕВ ВВ В ЗЕ В ЗЕ НИ НЕ ЗЕ ЗЕ МИ І ЗЕ ЗЕ З І А ВЕ Є ЗІ З В СПЕ ВУХ е ка ке З УНее е МНе В НИ ВВА І ЗВ ЕН ОА І В В ЧИ КН ВИК ЗМ У ЗИ З СМ З З ЗВ З ЗЕ ЕЕ Нв ке ВЕДЕ МЕ М ШЕ ЗЕ ЗЕ ЗЕ Я ЗИ З І З В: ЗИ У Ви ЗВ З ЧО ЗВ В З п п НЕ З НЕ В З В п п ЗВ Ва ка ТК ек ЕЕ НА НЕ ЗЕ ННИ З Н ІНЕ З В УП З З В ВЕ ЗИ В ЗЕ КИ НЕ В У ЗВ В ЗЕ МЕ С В С сна ссую а 8 т лу кое НИМ З І В ЗЕ У М УМ ЗЕ ЗНЗ З З ПИ Є ИН ЗИ ИН З З І З а М В З В У Нучзераціяза БІО МО ОСИ ЗМ Па ТН БМВ МЕТИ ЗБОЮ МІ ПРІМ ВУ БО БІ НК МО М М 1 дом Вб Бе об: З ре МИ Може 2еОМЯ ца мЕ щи 2мОТ М КА вв еВ УВО В ВЕ Я У В З І ЗИ ЗВ В я Хе Я ЗЕ З В НИ ЗЕ В З НЕ ЗНЗ Масові 3 о ь 55155585 85 55 У ІК ок вк и ВЕ НИ и В ВЕ ПН НЕ В ВЕ ЗЕ НІ ЧК ЕН В В Ве НЕ З ВИ ЧИ З З МЕЖ: Вт УчМоссую їх хо в то я в я вх 5 5853 М У БЖ В я в ков т Я 5 5 8 5 КІВ ж З 55 Влас: 23 21 ж ь Р я 1 1 1 8 Кох 3 5 ХК В її А В У її 3 03:33 55955: шив ссую їх 5 5 25 5 в: 5 1 1 51.5 Б БВ Б ЇЇ їх а хх У їй 3 553 5 З ІЗ З Ка ее в І УВК НИ ЗИ ВИ У З В В У З ВЕ З З ВИ З В В В В В ЗМ З В ВЕ ВИ ЗЕ ВЕ ВН В ЧИСЬ НУ БНеомеряицяза БИ ОМРІМ МОЯ КВ їх 5 оживе вх В ЗМЕН Я ВВ Я ув Е х х па НносуЮ я ох: ин сух З ИН ою хх 88 Вин Оує 5
Фенпоїхв-ї Важкий ланцюг РО ДКН.
Ко Кумерая за Каб 3 5 3 Ж 5 503 В 515 моБаз об аьІ) 81558313 3 25 36 3 33 25503: 35 33 ще 33 6 37 ВОЗИ НН Ю ЩІ з ва ьу пах хв хо ква хх кг каУ наль вВівлх ШЕУ МОЯн В В в б У ФопоБ А Ж З в я 5 8 У Кк ж ЗК в Б б г жов їх З 5 В ІВ В У й нд я тя ів о б т о я п ХЕ У Кк Хв Є У ХУ сват тв УЕА ТО ВУС су в 116 0 з 5 5 о АЖ З ХК БР б А 8 я ХУ що ж А я я ХХ Я І 7 8 У В І 5 5 ХХ Вб ох 7 шИвАНС щока в КВ в а в З Кк р в АХ хх У вав УТ їв хек БИЖЯНОТУує в іо в У с 5 Б АВ 9 Хо В Б В В ХХ ко во КА доп Х т В б Ж В го КОЖ Кк Опоя 6 ПВС увів ка о У сх пА Ж Ж КВТ ВоКкА КС КІВВІ КУА ШІ КВ я то 6 У й о БЕ ТЗ ХК рапії я У Кт вАВОУЬТВІВІЕУВОТ СК не Стюдів!. Нумерзня заКабаи: зії 45 85 18 5 З 5і 25525 51 3556 5 ЗБ 55 Нф ЗР БІ І БК Б Б) 5 БВ ФІ 1) ХР КОТ 25 7 УВО НЕ ВЕ Вха 0 с Р Ен скит вкнсвх ку и:вВВїІЗхА ХУ БЕН й сов в б В по вою я я б рт а о кв п дової лов Ж по 5 В їв т хх мов в ох Минко п с вк ЕЕ Б В о Б вх же сорт от ах ков тт тп вт АТ НАВ Є Носю о Р ЕВнОоВНнХх Ії Іво У ОІВ: тАї ВХ БНВО бо? хви ка хво ковахтьховіїв її АХ ВЕБ НЕ НОСЮ а пов ов в Ж п Ж ж кох М в В в ж вх доб обов й б но У т пов я до х 8 хх В я Мої оо до в жна ких ва орто тав;ІВІкхяь ах яИВУНИ СКУ 0 а РК Б В З У Кк В хх 5 В т вх ва хх Б од В У т БТ З ВХ 8: 5 Я ях Жь З ФІОІхНІ СОБІ сов Е . ! БОВ НУ Сов ! ше І СПК НЯ: КВ Е ета Нумерація за Кох: со ве до З ОЖ йОФР ОМ ЖОВ НОЮ ВО МОМ ОЗ З БІ МОМ А Ме ВМОЖМ МА ВИ я дю мб ЗЕ БВ НЯ ЗВ НО ЗХ ЗЕ УННИе ЗЕ НЕ и о З ЗМ НЕ МЕ У М ПЛ ЧИ В НИ З ЗИ М ЗЕ З З СМ З ВИ и З У с В З В МЕ ос в І ННЕ З ВАК УНН НЕ І В І ЗД и З ПЕ М В З п ПИ З а М З В З в В НЕ ВИ ЕЕ НУК Кк тво ЗЕ НЕ З ес ВО Зо М М ВА ЗЕ В В В С З: ПИ ЗІ НЕ З НО ЗИ ЗМ ЗВ ЗМ В ТЕ З ЗМ З ЗВ НЕ З не ек ВІН НЕК ЗІ НН З В НВ УНН МЕ З МИ В НВ ЗМ ПД КИ ЗЕ ВИ ЗЛЕ С ТИ В З В ВЕ ЗИ ВЕ ВЕ Я хек ВК Ве ЗМЕН ЗИ СМ М В З М ЗЕ ЗМ ВЗН МЕ Я В ВИ МИ У ИН З п п З З а ПИ НЕ ВИ В ЕЕ Ба вне ЕНН ЩЕ ПИ НЕ ЩЕ З ЯН ЗЕ КЕ ЧЕН ЗЕ В З З и З З ЗІ З В В п М ЗВ В МКУ хе кою ТУ НЕ И ЗЕе ІВ ВИ ЗМ ІН о ЗО ЗЕ ЖЕ ВО З З ВЕ З ЗМ З М ЗЛ В ІС В З М С В НИ ее ве З НК З Не ЗНО Ве З Ве ВЕ В ДЕ ДЕ ДЕ ВИ ДЕ З ДА ЗД В В В оре в НН НН рення Брумермня за БО сор оц прі ом опочоВ БІО БЬЛНОря Ін ЦИ НЕО ВЕ І БЕ НІ Зб НЕ ці нР Енея нем ІІІ ПЕ БЕ НЕ ОВ 5 УНе З Я ВЕ С В ВЕ ЗИ ЗМ НА НЕ З ЗИ ВИ В З В ЗИ В ЗВ НЕ оо ПИ З З В В ВВ ЗИ З В З М З ооо ско В ЗІ ЖЕ ЗЕ ЗМ ЗЕ НИ ЗК УМИСНЕ ВИ ЗИ ЧИ З ПИ В З В І п я З У У В ЗВ и и зв с Я М З ПЕ ПЕ ЗИ ПВ І С ВЕК ЯН ПЕВ З З М ЗЕ ЗЕ ЗД ЗИ ЗИ ВЕ В З З Є М З ЗВ З Не за З ВИ В З У ЗЕ Ов ол р М УНЕ ШІ ЖЕ ЛИШ ЗИ ЗЕ М ВИ З В В З СП М ЗИ В З ЗИ ЗВ ВН З М З ЗА М В В ВМ ЕН ою же ж че МЕНЕ І В ВЕ НЕ У НЕ В ЗВ В ВН З З З В З КИ ЗМ НЕ В В ЗИ З В З ЗВ УНН се кое Те ЗВ ВЕ Не ЗВ І ИН ЧЕ ЗИ НВ ЗЕ НИ КВ ПЗВ З и п и З ЗИ ЗВ В А З С З З М НЕ Мао т 5 3 кт 51515352 1735 БЕЕТІТІВЕВ: Еко а сне ЩЕ У МИР ЗЕ Я НВ ЗНА КЗ У ЗМ ЗНА З М ПНО ПЕ ка Ме и В ЗВ и В В ВЕ В В З Я Ліузмернтхм а Б! му ро ни Ве БЕ Ме омою ПНР НЕ ЯТ МЕ ОДРУМ БЖ ОН ОМ) М; РОЇ БРОЖжО ЦЮ ще БМ МІН І МЕ Ме Мб МВОУ М ЖИ ЗІ ХО Я а її т у во т ря т о В 5 5 Б я 43 хх р вх відь Ух Кк Ух ие НОлУ я 17 5 о доуУ БЖ В ОБ А Я хх 3 8 1 ЕЕ У 5 У 5 ло у ві БЕ сті роде о І НН ПН ЗЕ УНІ НИ З А І У З ВИС ПИ ЕН ЗИ п ЗП І З З Пи З МЕ ВЕ Джо в В МН и І Я с ЗВе ЗИ З ЗИ М ЗИ В КЕ В ЗИ НИ З З Хо З В З В З ЕН Вс В В НЕ ЗЕ ем В о: М МИ ЗНО І НЕ З З ШЕ ВИК З І ВИ В С З ПЕ ПИ З З ЗІ З п В ВС В З В В В В М ЗМ вже З МЕМ НЕ ІЕМ В ЗВ У М З З М НМ З НИ В ЗЕ З М З ВЕ ЗКУ М ВЕ УП Ве ПИ ЕН ПОМ І вн ЯМ З ІЗ и ЗК В ЗВ З У І п п І М п и ЗМ пи зи М ЗИ В ЗИ ЗДО В р и З ЗНМ ЗЕ У р вен М ВИ ЗМ ЗЕ В М І М В ЗВ З ПІБ С В НВ НИ А В п З ПИ НИ З ПИ МИ Я З В ВО У З З
«ФГ. 188-3 Нумерашія за Бі М Ой Де ХВ ОО В ЯН пи Ін Ме я МІВ пе мі см ха Ма со МУ їм Об їй М опи? ВО Ка ЯН ОВ КОН М дон хв ЗБ З ж 2 2 5 5 5 У 5 5 3. х Б З 3 їх в 5 т 5 її 2 5 5 г г Зк шгУхї сах МЛН х 5 З: Бо я со ж 5 У 5 231 її 85 5 5 в Ж 5 ков В ж 5: 125551 око ково ІМ ЧЕ СВ ЗИ ЗА І ЗЕ ЗИ ІНЕ З ЧЕ НИ ЗВ В З В КЕ ЗНЄ ЗИ З І З І п в ЗВ З М В ЗИ МДУ а ШНЕК ЗНУ З НИ ПВ Я ЗВ З В З НЕ ЯДе З В с Є З В В З ВВЕ В В З З У Я а в Ше Уе У я З Ше В НК си В І ЗЕ З НН З НН НЕ НИ В ДЕ З А З НЕ с З М В ЗЕ МВ ННОе Я їх 2 5 5 68 хв І хг 56 СЕ в: гів: 50 лов я 5 в т; в гг: 35 с 5 55 55528555 ЗИВИНОСАВ Я Ко» Ко Ж ох б хх ЕЕ т 5 св Я кг кв є вок ххх 5555 5 Нумержшяза БИ 5 ОМ) ОВ Ме сЯ МО Б БІО ме Ба МІК МЕ ОВКОМО БЕКОН ЗА ОЩЯ с ГІ ЇЙ ПЗ ОБІНЗНІВІМ ВО ЩО ВІЯ МІ ЖОЮ т.е ЗІ иЕ ЧІ ЗЕ ЗЕМ І У ЗК У З З З а З З п НИ Є ПИ пи п м в ЗМ З и и ЗЕ НЕ в М З БИБЖНС В Б КОї т Її 5 Ж 5 8 ВВ БО Є г фо я вк 5 ХЕ В ОЇ ЕЕ 95 5 553 5 с Б ха екс Не Че АН У ЗИ І МЕ ЗНЗ я В З В МИ В З ПИ ЗИ В ПЕ НЕ ПИ З ЗИ У ВЕ З В М З З У ЗЕ ЗВ ИН кОек км че нн не и М У НЕ п І ЗВ НЕ В В З и З НН В НЕ З З З ЧЕ НК З А НИМИ ЗНА НИ ЗЕ ки ВИК ВАН и не нич З З ЗВ ЗІ В В З З В ПИ М В В З ЗІ с З С ВЕ ЧИ ЗМ З ЗНИЗУ ВИЗ МУ Я 2 2 їх 1 2 З ЕЕ Ж В Я З 5 5 т 5 Ж 5 їх 5 5 ЖЕ В Ох ої ЗЕ З Я 5 28 ВХ ос касо ЗЕ УНН ВИ НК М ЗВ З ВЗН З І З В В ВИ ВЕН НН НЕ МИ В о З З З З З ВИ СМ В З ЗВ ВИ СЕН ен вн и НИ НЕ МАО В ВН В НЕ ЕВ ВК ЗВ З З В В З НЕ п В З ВИЗ ЗИ В ЗНЗ ЗВ ЗК Нумераюя а БІ 0 ОО ЗМО 10 МІЯ ме ж міо мо МЕС) нів ще ж ми Ве МОм Зм МО 93 Зв паї МІ пами НІК нь Ха Ще ЕОТАННЕ ЗНАВ УМ З З З З ЗО З: ПЕ не С З У СНО З З ПИ ЗИ З СВ и ЗИ АН ЗВ Я ЗБ а В о З В Я З НЕ ЕВ Бе в: І и ЗИ ЗЕ І НОВЕ в Я НЕ З ЗЕ, с НИ НС З ЗМИВ Зв СНО НЕ З НВ НЕ ЗК НЕ ЕНН ВО ЕЕ 7 хх т Ж ж ж я т З 2: з 5 тт 5 її тт їх 0 в їх 3 ххх КІВ Баш ето НЕ СІ УНК НЕ АН Я ЗВ ВН М НН ЗЕ ВЕ З НЕ З З Є З ЗА ЗІ А З У ЗХ ЗМ ЗМ ве в ІН З В І І З ВЕ ЗВ ЗВ НЕ З МВВ З З В Я ЗИ ИН ЗЕ и ЗИ є ЗА М З З З ВИ З ЗЕ пев в НЯ ВИ М З Я: НО НЕ З В ЗЕ ЗА ЗВ МВ ЗНУ З ЗЕ НЕ З НЕ З ЗІ З НЕ ЧЕН ЗИ ШЕ М ЗЕ ЗБ НЕННЯ Ов ШЕ Сл ЗИ Я ЗШ СВ І МИ: ВЕ ЗВ НЕ ВИ З З З ПИ и З В ЧК КЕ З ВИ М В ЕВ ОКО ква с З ОРІ ЗВ В Я ШЕ ЗО У М М ЗИ З З В З НЕ З В В З ЗИ З Я ВЕ в В М Ж З НЕ: "РІГ. І5В-Я Ірллєраціжза БИ ОМ ОО ЗОЗ М Мо МЕ БИ Мо ОІ МУЗИ ВІЛ Дуз ЗИ Ма ЗО УМ ОЗ ЛК Ох ВУ С БІДЕ М ВН МОМ ОМ ЗЕ КЕ УТ З ТИ ВЗ МУ І ни ЧИ ЗІ ЗЕ Я В СПЕ З Я Є З В ЗИ У ЗА На и З зн ПИ ЗМ ЕН ЗВ ЗИ ЗИ Ка вки УМ и В Мк В МИ ЗВ У ЧИ ЗЕ ВЕ А ВЕ ЗВ В В А З и ЗІ З В ЧИ Є ЗД ВЕ З ЗИ А ДЕ В У В У дя НОСюя к З г ВЕ Я ВІ 5 5 Ба хв: ух 2855 р 8 Ех ВВ Тк 95525 ок І НЕ І НЕ ЧА НЕ НЕ Я ЕН: ЗВ З В и З НЕ я и З З З З Є ЗЕ М ЗВ З НЕ В У НС В ЯВНО Кк т: 5 її її 55 ЖК 2235535 55 хх ЕВ» хх ох ке В АН Не я ее М НЕ: А НЕ А НВ А З ИН НУ ЕН ЗК В ПЕ В А ШЕ ШИВННСОСУЯ ях в ох в 5 2: 5 хх 3 5 п 3 В Ж хі: вк Ко: я Її Б І ХК 0285 су я 5 Нумераищівза БО Ух и поко унОоЇй Ух ще Ме МЕНІ В Я ЖІ ЗМІ МО СВО МО ЗО Маю НІЖОК ВЕН І КЕ пе ДІ ДЕН ВО РО Б Є В Б ОК У ж Ж хх 5 5 5 ВОВК Я КЕ Кт твоя х по ФВ У ре ие І І В НН ВЕ А В З ЗЕ ЗВ ПЕ Не ЗЕ З Ь УЕ З В З З п ЗМ З В З с ДИ М осн в ІК ЗЕ ІНН ЕН НН УНН А ЕН НЕ ЗК В З АН В НА НО НЕ МЕ З В с НН ВОВНОЮ КР 1 55 5 РЕ т т ев З аву кт Ух? аз 23555 СБС екв В І ЗІ ПИ ЗВ У ВЕ ЗЕ НІ ЗЕ ПИ В СВ ВЕ М З Я З З М З ПН НЕ З ж В ВЗ В М З ЗЕ ОН І МОЖ т 1 В 5 В ра т Ж ОК Ж 5 5 Ж 5 БВ БОЮ кою їх 5 7 3 51855113 ква ее, НИ І ВЕ КЕ ЕЕ ВВ МЕ З ВЕ ЖК ВЕ З З ЗИ В З НЕ З В ПИ В ПЕ В ВЕ В В З В МИ В Нумеранін о Б з рі бреріфак ост ам ре ЮК Мами БЕ ВЕ Є 45 ЯМ ОКОЮЕ За кіз; мУвео я ЖУК Ж ФВ в 6 5 5 ж 5 5 т рів тах 58:55 ВИЯВ ж Ж Х 8 0 У 3 5 кт 8 т хх Ж: кт її 55 оо ак ЗІ ЯН НЕ У ПА пи НЕ ЗЕ п З и З ЧИН ЗЕ НЕ З ЗИ ИН з ПИ З пи УМ ЗЕ ВИД ЕНЕ ВА НОсю ХХ я 5 р б 5 є В В в я 2 5 УК Я хх КОЖ оВ ої з й Ж 8 я 18 НБс Ж ВЕ ЯН УНЕ З З НМ ЕЕ З ЗИ З ЗВ о З З ЗМ НЕ В З В МЕ З ЗІ ЗІ СИ А У МЕ КК хе В У У ЗЕ З ЗМ ВЕ М ЗМ Є ЗМ ЗМ З М З ЗМЕН З ЗВ З у В НИ З В НЕ ША: еп вк СИ ЗІ НЕ У ПИ ДЕ З З ПМ ЗИ В В ЧЕ ЗК Є ЗІ М а З З ПИ ЗМ ЗИ ЗМ НД ЗРК ЖНИВ Кк Я т ху пох В в хг 5 У ЖК вх с я в кот зх 5 хх
Я. 16А- ТПілке ет послідовності СІВ. вілповідно ле системи ВІЗНЯї Тілюреслень послідовності СЕМ, вілповіжное до системи Кіа Легкий ланцюг ПОВНІ. Сомасї Тож р АТ СОХі1- Спека Сокіл вовж Піумермняза Жар 5 3 5 5 ж 7 8 51: КЕ Б 2435 3541 3812 2023 2833 54 2 З Оу За ВО гро Ж ЯКУ ЗО ЗО ОЗИМІ т ЗВ схем ВО ши М: НЕ ИНЕ щЕ ЖЕ ЗЕ ДВ І ЗЕ З ЗИ ЗЕ ДИ ЗЕ ЗИ З и ЗИ Ше В В З В В ТИ В ЗИ З М З МВ ИН Вовк ІННИ ЗІ «НН З Я ЩЕ ЗВ ВЕ НЕ ЗЕ ЗИ ЗИСК М М В НЕ М М В З ЗИ З Зм ЗЕ СЕ У Мах в Р ьо й ЕВ В в ах 0: ХА ТІНІ у їв тк кижььних Кон Еа в кН МИ М а еВ ЗЕ ЗМИВ ВИН З В НЕ В ОД В ЕК о ЕК ЗИ ДІ ДИ В НО НЕ А В ЛИС В ШК й Ше й кими. І опе с сопе і -- 5 ТТ т ли ЩО ОТТО ОСОКЕ?- Спо Бумераноя за Кара ЗОВ 3 441 15 43534 55 ОТ 48 25 УК 55 5 РЕ хв пт Нео І БІ З Я 65 55 б мо 55 Ло 7 т т3 35 в зе з ах? ат ін нахжхкваткивкяї ях кл ввів ЯКІВ поп ов б 3 ков кВ З ї 8 Б А В ОТ Зв Я й ож в ВожК ох 58 до ж вот вх З ті Зуєв по ж г іо й в хх в І А ЖАВ Вон У З в З ло ЕТ ЕК ВЕК КО НВ З ДИ ЗК Я ЯК НИ М МНЕ В А А С В ВНІ Як З З НН Я НИ З НА МЕ ЗИ НЕ НЕ Є І ази ОбОВія-сюва КОБОНІЯ ков Контактна опластв. нумерація БО Кумерація за Мабає ота 5 ВІ БІ Б 25 ПЕТЯ ВО І БА оо ТОК ОВ М івЕ ах МО Б 16 ЦО НЕ ОК МЕ СІЯ НІНА ПІН НТЦВ НН 1 НО СА ЖАКА сват ВЕТЕ о в ВЖЕ ІБ ВТ У А хів г ях АВ ВУвіх свої кЕруУ ко жі кі хі кВ У їх кВ т КІ г милом 0» ЕВ ХХКпОоОЮЕВРУ ЕВ п В ЕВ І ХУ хв г мак осж бак авта У сватквоВЕтквВ о вки І КК В т У д В ВВ т ЕЕ Її В
ФК. зва умереніх за БІ с опиапід сві ііі ов ІІІ В ми Ве Ом ці м М ж ви па Ні Нумерація зв БИ щопхамід сім ідамо в ріг ом піл тім моно ОО І о ме ші ДЖЕ і В по МІ І, З з з 53 5 5: х в 555: 55 ре в чн НИ Не ВИ ЧІ НН НИ и З о У а и с З зак о НЕ ЗЕ а ше зм п с с КМ М ЧИ З НКУ я кола пос стае І М ВИ З ВЕН ЗЕ ПИ ЗЕ ЗЕ З З В я ТИ ЗІ ЗЕ М М З ВИ ЗИ З З сх М З В ЗНИК У НЄ ЗМІ родео: ВИК ВИ НЕ УНН КН НЕ В З В В ЗВ ЗИ З ПИ с п ПИ В с ВЕ З М МИ СМ ЗВ З ЗМ ЗИ У ак ННЯ меж нн и кн ще НН и нн си НН ЧИ М пи НН НЯ у ом не и ее У о з, п ЯН ЧНУ НН НЕ веж ек кв я З ЗЕ МЕ М М М М В ЗД В ПИ В В В З ВИ ВИ НИ З В В ЗВО В С ЗМ МЕ З ВЕ ВЕ ЗЕ Нумераціязх ЕС сп) мі ме ж мем ІН ОМ І ТМ зе МЕ р ОЛЯ МО СМ ОВО ЗО ЗМО Ве ЕОМ Не БО ОВ НІ ОЦ і Ве Ма БЕ ОЗ Ж ВІ НЕ МО ЗК КД и НК НЕ У І ЗМ ЗЕ ЗИ З ПИ НЕ У и З ЗИ ие ЗИ ЗХ З: ПЕ ЗИ ЗИ о и З НЕ ПЕ З З ТО і, Нв ме М З ЗЕ С З М У З З З п о в п ПИ З З В ЗИ М З В З В ЗЕ З З В З ПЕ ве я ЗИ І НИ І ПК Пс В ЗВАНИЙ М а МИ ЗАМ З Я З М ВО КЕ В В В В З: со МНК: М ІН І ЗЕ НИ ЧИ З М ПИ с ПИ ЗВ В ПЗВ З ЗМ З З Є ВО З З З с Ж в УВС ВЕС УМ З НЕ ЗН Нумераціжза й ху жу; МЕ ож; Ме МОУ Мі СВ т їх я вк ил кг МИ УМІя 8 5 8 В КВ лок АБ го х 8 в оК Кт ово
«г. 1658-ї Важкни ланпюг ОБ НЕ Асад ГвомНесСвомів! КУ МІ» Кана Неумерлююжай МяБай ог 01 505 в В. 8 ДВОМ 393 БТ ЗЕ 0 ВОІВ га 2 ту КР ХУ ЛЮ ТК Ме ЗИ В За 25 ЗБ ОЗ ЗК 532 ЗЖ кох пу тв я тс в 5 5 й й с Б хв У й СЕ М В в ях ххх В кв У ковка Косми о ННЯ дом йо шою зт мод ясно мод дою дош що мон МИМО КО я ше шк в м с В З ЗИ ДМ НЕ СИ З М В В НО ЗЕ ЗІ ЗИ ВИ ЗМ В А НЕ В С МЕ с В В Ж Ж У р я В ле вх тд яд тв А ВАЛА ЕВ пвх Ки МНН хх У поь т хх З пк коу Б В 8: 3 В КВ 5 в В В В ж Кох 85 5 ВЕ Б Кк ВК хх ВОМ Ох т р нь ьльсьз ьсьсьсььсьсьь й Ї СОМ МО Кебві ФБНумесронія за Кабаї 85 МОої5 341 З 25 ЗЕ МОХ ба 53 5 5 СМ; КОМУ кВОпІ б БІ МОЮ МТ М МО ТЕ ЖІ ЧЕ ОТ2 ЛО 95 ТУ 7 75 ОО В) ВУ БУВ МЕ ох в оз ж хх Вот я Ж окт вот в ово в оВ о КВ Кк к х 8 Вп 8 Хв Кв Кох Мед вк сь я ок З Кк хх хх 58 т тт й ва» вх БО Ві Б ект ьЬхБ Ек Овни Х З ОТ Ж І пов т Кох оЕ пот т т А Жоя З 5 ТВ З 5 х 1 8: В 8 5 я ХХ Ж хв я інв В ло я ж вв Ж от Во хо хх т в код» я у кл 6 Ж: 5 вх А Кок ОМ кої Її ВК 5 ї ДЛ КАК НК НН ЛИ ЖИ НЯКЯ ША НУ сема ПСО Ні. Ка Константна сластв, нумератя БО Нумермия за Боні се МОЩОФ б гомо Ж мом дон от су тп ме У Я БО Ще КОМІ мом пеоні М) БІ ОПФ оф З Же КОКО» ке Де Ше и З ЗВ У са В У ЧИ З ЗИ НИ ПЕ і НИ З В З о ДІ В и З В В З п и ко З З ВИНУ кое КВ ВК НИ ЧЕ ЩЕ ЗИ ОМ НЕ НЕ ВЕ ЯЗ с З п З с а п З З ЗМ ВН пи І з и З З ЗИ ока кВ Те Ве ШЕ ЗЕ НЕ В ВК МВ НЕ З ЗВУКИ НЕ НВ ВЕ У ЗМ М З В З А І З З З УА З В В З З З У Бо Уи ех КВК І ВЕ ЗВ В-ВО СВК НЕ З НЕ В НО З В З В М ПИ У З ЗВ 7 сте детсттттсттсттосттстя т
ЯН. 168-2 Нумераніяза БО БЕ І СОКІВ ІБІБІБЛНІВІВ ВО НІНО НВ БИ НЕ РІВНО ОН ІМ прп он в Нв а а ЕС НЕО Ж а 55555 3 кр 2 585 ВЕУ хвої хх ЗЕРНО ях г хх 88 5 35 55 55 5 В 27 8 ВЕ ТТ Ж КЕ 5 Ж я ХХ 5 5 3 5 5 сх Кен І ще Б ЯН М Шк ЗЕ В ВЕ І: М и З ЗП У В З З п МЕ МЕ А Ен и У «М УН вер и ех о ; З ВИ У І Я Ж З МИ Я ЗМ З М З ЧИ ЗЕ ВО о З З Не СИ ЗК В В А В З В А М ПД З ДИ З ЕН БНиолеранія за БІ ОРЕОЛ ОП ОЛИВИ МЕМ ЕМ ме СМ Фо НА ВУ мл Це МО ЦЕ пе а МО по ми БеО р оре зи Мо ще с Бе хи ДОМИ МОМ М я КЕ Ме ЛИ Ж ЕТ ЕТ 5 5 Кк 35 585 5 5 ж КЕ в В хх хв КЕ З г ххх Воло ФВ І В ПІБ ЯН В ВЕН В ВИ З У ЗИ п ЗЛ З ЗВ З У З ЗИ С З І С З ПЕ З В С В З НЕ ЧИ Сезам ЗВ ВЕ В ЗВ ЗЕ Ж ВИ В ЗВ З В У В п З З З М З ЗИ ЗВ ЗК Я ЗВ ЗВ ЧИ ЗВО НЕ З ВЕ И с и сс ЗйЕ ЗМ ЗИ ТИ М ВИ ШК ПИ ВИ МЕ МА З І ЗО ЗВ ЗИ ЗЕ З НИ А З ЗВ З М І ЗВ п Є з НЕ З Нумераіяжза БОС ПІ Шен РІ неп і те МІВ МОЖНО еле В ПВ ЗИ ВЕН ме Нео др мх КУ 5 її юю т жов кв св ко кот вк ВВ г 5 т хх а вв ОВ 5 Ж КВ Хв: все ЗИ ОМ УВК ШЕ ЗИ ЗМ СВ В НЕ І з З З ЗЕ М З ЗВО зи се ЗЕ ЗИ В ЗІ М ВВ ЗА ЗМО ЗМК НА МНЕ ЗНУ перук ко ЖЕ МЕН Ж НИ ЗА НЕ и Б В С Не В В В З В В В п с НН З НЕ А НН ЗИ ЗИ воно ска вах ВЕ Ж ЗИ В ЖЕНЕ ЗЕ МА СИС В В ВИ ЕВ В ЗВ НИ ВЕ ВЕ З З З п в М М В ВЕ Нумеретя я БИ ме ДВІ ЕВ НІ І ІВ ОК НОВІ ІВ ФІ ЗНО ІІІ РІВ ФВ ІВ ОО ВОЛО МИ БІБ ІН НЕ ВІН о ізн їв СОМ ВІН А ІЕЕ УМ А Я ЗИ НЕ ЗИ В ЗВ В В В ЗИ МЕ ЗД В В З ЗМ С З С В З МО З ЗЕ Я ово вк ЗВ ИВЕ ІНК НК НЕ М ЗЕ ЗК ОНЕУ В В сн НЕ ЗШ ЗИ В ЗВ У З НО З ЧИ З УК У о ЗЕ ПИ ЗЕ сер о кю ЗВ Е УВЕНИВи ЗНЕ В УА ЖЕ ЗИ ВЕ КИ ЖЕ ЗЕ ВИ В МИ ВИ ЗВ з ЕН З В З В З ВИ ЗЕ Я МЕ ЗМО М ЗИ НЕ БА ее ВЗН М ТИ ЗМ МЕ ВИ З В За ВИМ ВИ НЄ ПИ ЗВ А ЗЕ В З В З З З В С СИ З М ЗЕ З ЗМ УМ В НУ БНучерашя з БІГ ОК В: ЛЕБО ВЕН МИ ЗМ ОМ Ме МЕ ИМ МуЛЯ МІ МЕ КІ І МЕ ХІМ ХРАМ МО ОЗ МУХМ ЖЕ меж ЖІ с: В ВЗН І ОН З В В ЗА ЗНО А В ЗВ З ЗИ З В З З З З ЗВ З В ЧИ З З З ЯМ ЗИ М ЗМ З З ЗІКА ХХ КОМІ й кох т 3 хв 95 855 5 85 5: 5 85 т Ж сх у. 8 ххх: 7815 Ех око вка о ВИ УВІ МК М З ПИ НИ В ЗВ ВИ ЗЕ ЗМ НВ НА З З З ВЕ УВЕСЬ Є НЕ ЗМ с о ЗМ В В УМ НИ Бек ек в І МИ МЕ ЖЕ З МЕ ВИ ЗИ В В ЗИ З ВИ а З Я ЗМ В З ЗИ ЗЕ СНИ з В в з ХЕ З п З п З ЗМ НЕ: Біумерація а БІ в орто оп ов р мі ЗИ Ве МЕ Ко ЕМО Ко З БЕ Ж; МОВО ВВ ЖІ З ЗОМ З МУ Ж ще б 23 УМ 33; БУХ ЗНА ПЕРІ ЯЮ Ж ЕХ фс ок ії кт 5 їх 53 815 5 вхо 3 в її жк я в вії СУ ЗЕ У В НИ Я ЗВ І НЕ ЗВ З В В З З В З ЗМО ЗК ЗП З М НОВ З с В З М З З ПИ ЗМ В В: А окк ве и жи Не КУН ЗВ І ЗНО З В З З ЗЕ ЗО В В З ЗЕ ЗО В с З В ЧИ І В З ВЕ НВ НЕ Ов ЕЗнеок о ж ЗЕ ЗИ З ЗЕ ЗИ ЗВ Ж ЗМ В В В В НЕ В М В В В ЗЕ ЗВ А З В ВА ОВ ЖЕ З ВИ М М ЗЕ МЕ
«В.о їв Нумерашщеза БИ ЖК ОВ Ка МИ МЕ МИ МО мн УМ ІК А ВЕЛИ ПЕ ЯМ ЖИ Ж Я Кі М Зв КОМІ І мово Ма б Код ее ли и ЗВ ПИ ЗЕ А ЗВ М МН НЕ а ЗЕ В ЕН ЗЕ ЗК НЕ З НН З З В У З о З ЗЕ СЕ ЕТ НОВ ж БЖ Ж Б Ж й а В ОБ Я 5 7 4 З РОЮ Я 1 505 5 5 б я 8 КУ ж я ко Зх кВ Зх 55 рехкв я о с ВИ ж ЗИМИ З МЕ З ВЕ М ЗЕ ЗМ НЕ ЗМ НВ ЗР М В ЗВ ВИ ВИ М ВИН М п п З ЗИ НИ ЗЕ ЗЕ З М В С сота В ВИ В В ЗИ ЗЕМ НИ В З З ЗМ ЗЕ ЗЕ ЗВ ЗИ З В В С с ЗИ с В В ЗМ З и З п З В ЗЕ З З НЕ Нумервшяза БО сю цім ші ме ще Бе ПІЗМ НІ І ЖАВ ШТ я Б ВІ по ву ЯН МНН М ЗВО НЕ В І ЗЕ ЗИ МЕ МЕП У З ВЕ В З ЗИ ВЕ А З ЗА КУ НІНО У її вс т хх Ж ЕЕ Я 5 5 я В т ях по БОБ ЮК ково г МИУНОя Ж Р в 2 й ж В ж ВАТ 8 Ж 5 т б ж 5 ВОК А В ОВ г вом но У Ех и М М З МИ ЗИ В ДЕ ЗМ ЗО ВИК ЗЕ ВИ МЕ Я МЕС В ВИ ЗЕ Я
ФІГ. ІЇТА-Ї ТНдкресленіпостідоввості СЮК відповідно до снетами Краї Легкий ланцюг ПООВт бепасі ! ОБ СВО п ЖОВ БІТ то 5 вт 53 УВУ ТІВЕВІ Я. я я ях ?ІЯеВкАч о вн ве ВВ в В в ВА ВН В ЗИ В В НЕ З ВИК В Не В У На Мч СІ Ве З Ве З Ме В ВЕ о З В ЗВ В ВВ ЕВ ВЕ В ИН З о о ЕН ЗЕ св т в т тов 55358505 3: 44 т5аЕБва ОБ ІМС и У ЗВ ВЕ А ЗУ КУ ВЕ ВЕ ПЕ М ВИК и В и а М А з п п о о п п п ЗИ У У ЗМ Я ШІ ж їх ж вк вл М нм ВАЖКЕ ЯКО як пБІТКАКУ ОБ ж в Я 5 т в Я кВ ОВ В В А Ж по Я Я ВР 2 В 5 у юяіюу» у З БВ М в я Ой вії по т 08 п в 8 6 я з ях пвх т вав Кі... хо. ВІ Ех дв б У? Кене Не В В и ж ЗВ Шк и ВЕ З З ЕН З ВЕ В З В НЕ НН НН НН о ЗК ВЗ хо ВЕ ЗЕ. СН ВА ЗЕ ОЛЕНИ ВИ В З С ВИ Ва ЗМ З ЗАВ ЗИ ЗВ З ПИ ПИ В а По ЕВ Ве сви М ри з ть 05 58950555 Іо БЕБвБАТУ З в р авт в ог вн в а т 558 наївна і вх т БЕЖ КАК Х ЩА вка вт ав мив ва ау КУТІВ У у, В щиті МАВ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ. і СОКів опи Я Нечеранія за КаВає о сх ло зх г т шани пи ДИН вн люк акт пінкне нн п и УВК ЕК У Я ЖК ЗМК Сак ние ЗЕ УМ З С ТАЗ В ВО СВ Я В УМ ОХ В МУ Я и З КМ ЗНИК ЗИ кВ ЗК Я ЧЛ СК ЗК ИН АЖ з в хо» х ВА І Кох 0 1 ж я 5 В З ВЕ ВК В 5 Б б ВІК я до я й 5 6 Ж ЕВ т кож; Ж ВО Кг ох ЕВ М В В КЕН ЗД НИ В З СИ В ВЕ МЕНЕ ВВЕ ШЕ ЗМ ЗИ З З ЗП З З М ОВ З НЕ Я НЕ СЯ А о в ков в о т 5 вв ОР ОХ Ку хх 5 ка ва І в БЕ хв ї и В ие ие ин си зи З ЯК г пах м в вот кож БО ЖІ ІЗ 8 пов В т в Б ОВО хх по я 5 бо ж ЕЛ рЕЖТЬ 2 сб кв шов МК вою М ЕЕ А Ва дп в ки в хх 8 хх Вл лк тк ще 5 й З 5 БАХ В В ЕХ пух АЖ ВБИВ кв я В ях ВВ На в б т в б ж А в Кк в ох їх А 5 А З ЖЕ ЖК й Ж Р В ЖК т я й 5 її о я в Кк й вт Б ву де й й 1 з й А вх В ЕЕ Її 287 5 В В її В В Б Вт 3 я в ях я в а а кової ОЗ хо я хх Ж ВВ 5 в ков й ож хх дов й я от в ОЖ я ов є ж кВ А дог сітку віта" вових кеВ о ах от ЕК ЬГгВУЕ а со ж т шок А ОВ Кох В ої ЖК З м шов ж Я жов док я в Ж я Ох в лож Кк А І В г опа ас: ввь іх вка ввукта вл їв тіІї АТ й я хх в п тах вк Кк їх В У яп Вб рив о я Ват акти р тітка ттьтьнн Я
ФІ. і37А-2 Я СІЯ Споюта - - ше Бкосєураця за Коб 5 Кк оз в м х БЕ ВМ ЕМ що М БІВ З Оп) БЕБЛабБИФЕ ПИТИ МЕЛЕ Ук В НЕ ЗІ ЧИ З ПИ М кН ЗНА ВИ З З ЗМ З с ЗМ п с У З Я ЕН НИ НЕ НЕ УН Е Е ВЕС ге х І Р Я НМ Ь ЗК ЧИ ВИ В В М ЗНА В В У У Пе ЗИ ЗИ У чи ЗЕ В ЗВ ЗВ ЗМ З о ЗЕ ЗИ КЗ ІНЕ ВИНИ НИ У ЯН У ДН ЩО ПН М З З З З В В З С З З З З В З З В В ЗВ ВИ В В ПОЛУ БУ тр Е І І Ф НН и и зм НЕ ІН НН У ЧИ В З ВИ В НЕ ЧЕ В ЗВ гео: си зв Кк З У: ЗЕ НН З Зв ОН У З НС с З НПВ ЕЕ М ВИ З У НЕ В З Ух КВ о в В В З ВВ В В ЗП А З З В З З В З В З ПИ В ИН В МЕЧ ВЕ ЕЕ З Кс ЗІ ЗИ ЗЕ М ТИ Я ПИ В З ЧИН НА ЗИ ЗИ А ЗП с ЗІ М п З В ПИ п с З М ЗИ ЗВ ФО З З ВН У его у ЗИ І ИН І ЗЕ НЕ З НВ З НЕ ПИ З На З с ЗИ З Не І З ПО ЧИ З В У В ДЕ Ве З СМ У со НЕ Я У В я и В Не НЕ и НИ в ЗЕ НИ Є Пе В ВЕ ВИ ЗЕ НИ В МН гі З З В ЗИ ЗИ ЯН МИ В ен З ЗЕ ЗМ ВИ ЗІ З ЗЕ М З З ВЕ ПИ З З ТЕ ЗВ У НВ В в МНН ша 5 5 2 5 їх тт 55 КОЮ ж 1 5 Я У Іа 57 5 р» суДН о В І ЗНА НВ не ЗВ НЕ СН І Не ЗІ В ВИ З З с ЗО Є З ЧИ НЕ В ЕЕ НИ НЕ ЗЕ З ЧЕ З В ЕН См ММ Не МИ Не НЕ З ЗД З ЗВ ВЕ В НН ВЕ ЗВ ОЗ БНумераня за БО опо Ме ін хм мі Бе ПОЕМ В БЕ БЕН ЧР Пе мі ВОНО МЕ ЧУ НК БИ БИУНМ Бе М ММ НО В МВ Р 5 б: 1 ою їх 3 її 5 як В 5 У т її кВ У 195 жк 5 5 пк: 18555: сх зх З Я е З З о В Ек В а НИ ЗМ З З З З ЗМ З В З У ЗИ ВИ ЛЬ В ЕН ЗМУ ЩЕ її в в: їз Кн у г її з 05538538: 5 го з Ин м М ПЕ ЧИ З ПУ ЗИ У З ПО СИС З ЗМ З М І ЗИ НЕ ЗИ НЕ ЗВ ЗИ ЗД А Ви З НИ ННІ ср УНН НА НЕ ЗНЗ В НЕ НК о УВК З ПИ В У и с З З з З п З п с ЗЕ З СВО З Ь ЗВ УНИ ЗМ НИЗУ Ус МЕ ВИНИ ще З ЗМ М З ЗВ о В ЗМ ЗВО З о п ЗА НО п СЕ ЗМ ЕЕ ЗЕ СЕ МК НЕ М ЗЕ Н ее: ІІ НИ ВЕ ЗЕ ЗІ кН ВИ УНН ВИ ЗМ УВО ЗЕ Я о ЗО ЗИ ИН ЗМ ЗМК В З С НО З ЗИ МА СНИ се ие І ИН НЕ ЗЕ У ВВ НН З З З НЕ и ВО З Я НВ З В З ЗИ Ва З З В З У З В ЕК ХОЧЕ ЗИ МЕ НН НН «ВЕ Я ЗЕ З А ВЕ о п о ЗБ се З З З В В ЧИ НЕ ЗМ У ЗВ НЄ ЗА ПЕ М ЗЕ ВИ ИН Ерх СУМ І ВАНЬ ЕЕ я ЗЕ НЕ а М ЗЕ З З ВН З ЗВ М З ЗИ В ЗЕ З ЗИ ЗМ З сс ЗЕ С В В М ЕН Ера ВИ НН ВИ ЗЕ НЕ З ЕК В І ЗД В В З В У З ЗМ М І З ЗІ НИ З З В и З В ЗА У ПИ ВЕ ВЕ ЗМ Я хх Зоя кю а фо жк шо Хв вх КЗ їх 5 5 5 3 хх У Фк 22 пк В В єї: 5 пов 5 4 5 5 5 я Ж жо У їх Ж 5 хх ох я 3 5 у 5 КТ жах
ФГ. 1тА 43 БНумераціязо БО бо нудшів Без неп ск тя ПІКІВ МО ОМ ще Ж ПІІ НЕ ро ІМ МБО ВТ НЯ МО Яи Во Ха ВЕК З У З 5 В в хх кВ кВ Ж КОВО 85 3 св У я йо ге скан ІВ ПИ В З ЗИ МИ ЗМ Я З а З І З З У по З п У У ЗМО с З А А Не З ЗМ ВЕ ЗМ З УП І ЗЕ ВЕНИ ре ЗВ нИ Из У З ЗМ ЗМ З З З ПЕ З В В с З п З ТИ ЗИ с З с и ЗНА ВО З З ие з В ЗВ НН ЩІ ло 5 5 5 8 й ж б ов т 8 ж 5 Кк 8 я ВОВК В ОяЯ ж 809 ХХ жор Ж Тс ЕЕ Ж ОР к 5 5 У ВО В Ук НИ В ІК В З ЗЕ ЗЕ ЗВ Я НЕ ПН В ЗМ КИ ЗИ ЗИ ЧИ ЗІ ЗО ЗИ З З ЗИ ЗМ В З ЗЕ УМИСНЕ ЗЕ З НЯ Я се: ТИ І ВИЗ МЕ ЗИ ВИ ЯН ЗМ Ще ЗМ В З В А В В З З ЧЕ З С З З НИ ЗЕ В З ЗМ З З МИ М З ВЕУ БО ху 8 7 5 5 5 Ж В 85 5 85 КВ я 555 КК хо ж т св УТ В ав хз пог СЕ НЕ ВИ І ЗИ СПИ ЗМ В ЗЕ В ЗП В В В ЗІ В М За У З М и В ЗО ВИ Я В З З З п З В В вух сс В М І В МЕ ЗИ З МЕ ЗИ В ЕЕ ВИ ЗЕ МСЕ ЗМ З ЗЕ ЗЕ ЗЕ З ЗИ В ЗИ ЧЕ ВЕ В В ПИ В В С ЗИ З ЗИ А ух: ІК НЕ ЗИ І ВИ ЗЕ НЕ НО В З НИ а ПИ З Лк ВЗ ЧЕ ЗМ З СЕ З У В ЗЕ ТИ ДИ с А М Є МИ ого ВЕ М У З ЗИ З З М М З З ПЕ В МВ З В В З ПЕ З З З ЗЕ З В ЗИ В З ЗИ З В В З ВА нт НЕ ПИ І З З СЕ З ЗИ В ПИ В КИ ЗМ ВВ С З В З ЗИ ПЕ С ВО Є МО У ВЕ З ЗИ З З о В ЗЕ З НС: Я З з 5 5 5 хх в 3.7 85 55355 54 122535: Нумераєюязя БО моде жом же Ме ТИ ІВ ЗИ Щи з я т 4 8 я 5 ж ЕТ п: З ІЕЕ ЗЕ І І НК В НУ ре ЗІР ІЕЕ М І ШЕ НИ НО Я КОВІ З ж 5 ж оз у ков я г БІВ З 5 5 5 5 5 хв БЕ» 3 5 3 5 З 8 Б Я Ж г Ж? з 7 5 35 В Бк У ке І НЕ СПИ З ПН З НЯ вт В ЩЕ ЗИ В МЕ Я Ух з В ЗИ МИ ВИ МИ ЕК УН ЗЕІ сх Р І ІНВ У ШЕ ІН З ННЯ хе ЛИ З НЕ СПЕ Я НЕ ЗИ НЯ те З ЗВ МЕНЕ ЗИ МИ ЗЕ ЗМЕН ж х Аміноюнелота У положенні 205 за ЕІ позвачена зірочкою, може бути заміщена на сту для коБІогації з лікарським засовам
ФІГ ОітНА Важкий ланиваг ПЛЕН: Сопідлі : - - їж Н-Кещо Нумермцх за Ка о; у з роб ов ої ВОЗ РОЇ ПФ МОЗ НО ЦЕЮ 7 б зам ЗОЗ БЕ УВО МІФ Я ЗАЗ З За 6 ЗВ ЗБ ІІ ВИН ско в у сп аз В У Зк вах уко кА В рве ох ВІ пу б я вв п КВ І В ЕВ Кк всей вають «Фу ь у я ва У УКР ьЬх тихої ІІ» ов ШТ б чо еп: ХЕ под хтУЕраах вах Вт а ПО Б У й ох о о 8 как у 8 х вк З ав хх У вс В З т ХВ ВУ В І кб У ЕКО ов то: почи да ї Я б ж жд п б їх Ж В п л.о8 5 В В х сх т В лов в т в 5 Її х ях кв о З Во БЕ в У бу вх 85 хх КР Вь каска Ввававвтхнк Іква ЗБЕ й У в а 8 вах 5 Ж ро в я ж я и З б АК 23 КЗ В БК Я В ЖІ ОК У КОБЮ ОЇ Си ее КЗ І МЕ В В ЗВ ЗИ М: ЗЕ ЗИСК ЗИ ДЕ НЕ М В ЗЛ В В ЗО З В ЗИ В ЕЕ МИ ЗК ШНБ їх У 0 У п я б с в в хх а в 3 55 я ь в с А В В б У т 8 В З В хх Ж В о АВ жа хх У п б У дб дп о у зо т 8 8 пс ха цтва ЧУ в У б Б Б З 0 5 5 Б т 3 В б 5 В Б я В Ж с о5 Кв по Ж Б ОВ Я 5 5 ІВ КОЖ З В й 5 ВО А? вок ко п п х З Квт Бета СЕК НЕ. - сопена Я Бумервнія а Кабат 45 у ХХ 458? З МОВ ЗІ ЗК Зр5 ВІ ОМ ЗЕ ВІ ЗО ЗОБІ ВО 53-04 КУ БИ БРВ БИ УВО МОЗ 24 15 У С7І З8 29 ЩО ЗЕ БР. 8я ЩІ бос ЕЕ Ж ха ТЕ З БІК о ЕЕ т п хх акт бо ВУ ть КІ1ШВТА АВ ЦЗ с б ов ж ж ко ІВ х дів зі кока їх АВ КУ З т вх т в Ж 3 ЕХ В: охота у ох в АБ й пог в ж В пік я р 8 КІ окт куки я т вух ЕВ а ЩО? са у Кб в аяя хх хів іа Б У вав тах ІЗ б з 5 Ж Б КО КВ 5 5 5 ЧЕТ п ХО» ВЕ» В ТТ ВЕ 5 І та Вк Ве з б Б ж Ж З я кт. Х ЕЛЕ Я 6 ЕТ Ж я а ях ка ДК т 1 БВ В КА Є Б Б ої дом ЩО хо опоМ ож б Ж я я ТІВ що Ж я В У їх Б Я жів ТУ Кк У В Ко її 8 КБ Ж я ох я У М ОВ «АВ кв ох а в У З т: 1 Б 55 Ше тя я дов ву бо Кк Ко В КБ Б Кк Ж Кк У Ж в ов ок Віа Кк В І Кк Ж хх 8 ж 5 т с в я Х Б 2 но У Зі ВІ 5 0 Б ОВОТ т в Б БК Ж Ж КОТ Вот дод Ж х ШЕЗ хв о ж ж т 8 У я. ВХ КОХ 1 Ж т вІф ВІ 5 в вОВ Її 5 ЕВ ВК А Кк Ж хо ж в вк х ЗВУ Ж ст т Ж ог но в ж Ж хо Ж а от ж хо ях дів віх 8» КОКО ОТ Ох В ВВ Б й 8 хх у 5 5 В 5 дм аепувнІзіїв, ОАЕ ахВТАУЗЕБХКОоУуУ хх ЗКІТІІТІІТІІТІТІТІІІ ІІІ ІІІ ІІІ І р. Ів Нумерація зх КЯКаї зом М МОНО МОф в Я: МОМ 0 5 Я ЯК ОФО Ж 1Мх Жж ПМе ЗМХ ЗВ ІОВ ди МВ НОВ ВО ВО ВИОМеОМО ВЕ МЕНІ МІ НО г УВЕ ние е МВ ЯН В сн ЗН КІ Б НЕ ІН З І а З ВЕ МИ В С ев ВН ЗНО. МЕ НВ НЕ З ВИ З НЕ В ЕН и В З п В ХЕ З З СВ ЗЕ ЗП САН БІ З ПИ ВЗ ВЗН ЗЕ З ПН СІВ М М В СЛОН ПН и п о В НЕ ДЕ З НИ З НН: ЩУИ я її ков ж лот кот я хо? ВО ж Х ВІК: Її 5. 875 хо ВИ, В ж В я 8: 5 кт Се М МИ З В М Я М В З ЕЕ З З ВІ п ВОД В ЗВ ЗИ ЗИ І ЕЕ п НЕ и МЕ З В ШЕ ЗИ В о ВИ око я кв о я 8 я 3 В 18307003 ВЕ Ва її кое и ни ЗМ М КЕ З І Е ЗИ НЕ ВО ЗЕ ВИ З з З В З п З З п З В Я З в ж М ЛЬ СН, аа в г охот ков б вм вх г кола я в віт їх Її ОЖ 1 0 5 5 ВОЗ в В я ло дв т вок хх ре Уж У и ЗВ НЕ З ПеНН ВЕ В ЗК ЗБЕ ЗЕ ДВ НН п о п З В З с ПО НН: ов НН ВК В В В В В В В ЗВ НС В Я ВИС З п о п о п о З З ЕН В ЕЕ: ух ни Нв НЕ ШК Ме п Шк НН КЕ ВЕ а НН НН З и ЗЕ ЗМ НЕ В З и МС со БУД ЗЕ и ПИ НЕ З Не зе У НИ ПОН А ЧІ НН ДЕ УА НЕ: ПІБ І ПУЕ Я с ЗЕ ЗНЗ ТИ ЗНЕ НИ в М В ПИ п ЗВ С В НЕ І НЕ НН А А ВИ В З НЕ ВНЗ БНумераця за Кави оз сп ви БЕРУ Ів КІВ ім ме ші 0? ШВОМ що ДИ ОІВ 5 Вам ов; ВІ оч ВИ БОННІ В ре ж ем ТС НЕ НЕ НВ НЕ З З ЗВ З М В В М В В п п В п ЗИ З З ЗИ В В ЗВ ЗЕ У З ВС З НИ В З НЕ В В З В ВИ ВИ В В З З НМ и ЗВ Пе В п І Ме п З ЯВИ М Я ВВ З В В ВЕЛИ З 5 5 8 Ж у 5 хо ух Р У 3 553335 г зн п п п пи є ЗИ п ЗМ м пен МИНЕ У: М м А НЕ МЕ НЕ НИ НВ ДЕ ВВ З ЕЕ ВЕ ЗВ МЕ М А І В о с З ПИ о В Є ЗЕ с В З З ЗВ Не З т нн М УНН ЗУ З ВЕ ЗИ ЗЕ ПД НН ЗЕ В ПК З З п В З І З сн ЧЕ З ЧИ: В З ВЕ СП о В ВУ Ех УМ Я ЕВ ЗД З ЗМ М Р ЗК У ЗИ З ЗИ В В З ПИ а З М З и З ЧИ ЗЕ ЗМ З З Ви м КН Го» НИ УНН ВЕ ЗМ ВЕ ЗИ ЗМ ЗК ВЕ ЗИ ЧИ В В М НИ В ЗЕ У п п КИ а КИ З ЗИ СМ НЯ ЗМЕН В М МИНЕ ВА ж: ль ПН І а М В З о п в и ак рРише шш нн ни нн пи, и М ЧИ п І п, с а З НИ КЗ кеВ УНЕ МЕНЕ НЕ Ж З М ЗМ ЕЕ ЗИ З НЕ МИ В В З я І З З ЗМ я КИ ЗЕ ЗМИВ В З В М У ЕУ стаз В ЗЕ В З ЗВ Е : ЗИ Е У У ЗВИК З В В З и Є ЗЕ З п п пи т ЗМ п З НН СВ И пу шк ВВ ЕН ЗИ В ЗЕ ЗМЕН ЧК ЗІ НЕ ЗВ НЕ М ЗВ НИ ПИ о З ЗИ НИ З З ЗЕ с СЕ НЄ ЗВ НИ ЗМО В ЕК ел МЕ МИ ЗЕ З З М ЗИ З МЕН З З З ЗИ В ВЗ З І С З ЗИ В С ЧИ З З: В Є В СД В В ЕЕ: Б зт ж и ЗМ З ВЕ З НЕ ЗІ ПИ З ЗИ ЗИ В В З І о ЗІ ЧИ НЕ ЗЕ ЗО МИ ЗМ ЗМ М А В Я я. ат Нумераштя за БК! упозшю піомі па мим і Ви с ІКТ Я дяді ММ НЕСЕ У НЕ Ж МК ОТИ БЕ ТЯ УТ БИ ІТ 0 о пер ОО Бе о млосш МОВ хх Б ВН м а й ПОЕТ Лю ШО ма ос НВО БО ОК СМ ТОЮ Км КОШТ КОН м о око си ще ЗНИЗУ ни НО НИ пи ан ен Ома МмОЕк тю БОБУ Ж 8 сої т в в я КОБЮ ОХ ше ж з в з п п з п з Я в ще й зве НИ З З А ЗВ я СП ЗІ НИ З З В ЕЕ: В лин ше хх ЗМК и З и о не о ВО В ПИ о ; ни и пн а з з з п з М и пи с а с бо ве и п І ЗМ ЗВ З ЗМ ЗЕ ПИ ТУДИ М Зв МИ ЗІ п З З Я 7 м сни У У ЕН в р НУ а о и п п Б в Ж 5 ії пк: У 4 м р Не ач з ВИ и З З п ЗМ и ЕХ Ди ОТОЖ их ПІВ Ж 5 513 5 їх 8 5 з що у 5 М то о 5 " ж ни и: І па п В М м п Сн У БО жо кох ще жне НЕ Я ПН п Не и с НЕ ЩО то БухуУши ни ши не ши и и НА НЕ НЕ мона «ем 8 її 5 т 5 25352571: Б ро ли и и М В ПИ В З п В п пи п п п пе 7 не ее в нн в п М о п п п п п п п п п коса я 5 ж я ж вової Вт хх том 1 й Щі й о М мл ни а а У бат ж в 5 в т т 5 Б з в 5 з вд Бл ни ни ИН В В С А З В В дай кох ни ж в п НН НЕ НК А У НЕ УЕУЕ мА ЯМУ в 8 25 1 т 5 8 У Ж І Кк? вк ж ьо хі маш І и и пи І З М З М З В ЗЕ и В ЗНУ о й 7 КНР УНІАН ЕН ЗП З ЗІ НН А НН НО НК Мо шок ВІНа ж ожоя її її кв з вок у вк ту у вх ее З НИ З НЕ З з З З ЗЕ З ЗВ З и З ЗИЧУ В оо: ОД ще ПРІ ВЕ ВИ З В І НЬ З В п А М М ПИ ЕХ Во ся т ккх кое Звич с а в с ВШ ЯМ ІН ЗНУ яд восхой с не и З и п а пе а п и п в М М Я 4 кох я ж є а ж я тов в 5 1 вл 5 БУ 8 Ж 5 У Б оков ков ж за ЕЕ А ХО А НЕ З В СТ І в ши Ін ли ЕЕ ПИ ПВ ех нич нн а и З А НН Ше У и ЗИ и З НИ ОН З о пе З В З А НЕ не КН ОО? НИ З ЗМ ЗБЕ ЗИ ЗЕ З В З п З З и пи п з З ЗК кан А не зх ви НЕ НЕ НА З п В М ПИ С В НО Мумермня я БМ ЖЕ хи М жов мож пЬНЕ Нац их і МУКИ ВО ОВ стек ооаг й бив МЕМ м ВУ ТУ» ІА У СХ ст5 ОО ЇМО ВОМ ІН І М ЖІ шк в пивВ нив в ння ВВ О МО МОЖ 2 МЕ БІ ле ХК ОМ КВ КО ЗО не виш нина в а р о В о З ЗИ «МЕ НА ЗМ с о ЗЕ НИ НЕ Яд їй і. я ОХ АК Ех ин чн и и и и - 7 ЕВ КО 5 ЯЗ жк ж їж п я т 5 т Кк З 5 х Ми жоя в т йо: В г В од в б В 1: б 5 ох ї в дя сю оховох воВ оф от дя 5 55 5 БО Б 1166 ОО Ж От ж ОСОБ г кУстн ше ни Не І НЕ в т ж ж Б С В А В Ба ВОМУ кої хх ї : ЗВ У НЕ УНН НЕ Іо и З ПИ о З и вх А веоУ и нн в и и НН НО Е 7 НИ: коп ов В ВОЮ І Б дош ов щої 5, пед ос тов ою о дов т : І Бк УПР ІНЕ НЕ ни НЕ: йон хх Бе3А кв и и и м а В ЧИ НН НЯ т з ЕК і 5 п 5 в УК: иа ше в м НЕ а п В п ІН І ЗИ ЗЕ ЗВ В ЯНВ ЗК ЗВ У СН ве " Ко жо Кк ХВ ги не сн З На и ен НЕ хз ГІВ док п чн п а Я пр жом З я ж ОВО вою ої жк В В вх хо о вени ви и ВЕД НН ЗІ В С В МЕ НЕ ЕН нн п А І В НЯ: Беж и и НЕ ШИ нини НЕ ЧЕ ПАНЕ НК А НН их Ж Ж ОТ 0 Б 5 Хв ХВ БЕ 5 55 кл.
Од хо ОТО ев чи и не не Не М НО ИН НЕ З п и З : ЗБЕ 5555 хх з кох ок їх б. 5 Х З ж її 8 5 5 ЕВ у їй ОТ ККУ х ВОВ В 5 Б 5 Кх 5О53 Ж 5 з 8 її 53 хх Ох п чн а НН У о МЕ М ШЕ возі: зІ їв Рв? Ії ее и ЕЕ ни хх З хз ж ЕЕ хх У р: х 5 у М : й вх В Б 55 пах: Яйну ж т й 5 їв дод т у М 5 КЖХ нен нн І и з а ИН ії? ж їз її хат КУ: з ккІ ВЕ кг и НН Бк кі х Ф ЕН ; І ІН п З НЕ с ЗВ Не ЗИ А З Я СН - й ще ІС. 7тв-Я Бумератя 7 двросрмиж ік зв я заксмя я умератія за БІЛ зримо во вони же же маже о Мі ОО . де К й Й км І ме Мт Ти мам ІМ Ом о їм ма 0 ОМ; Бо тЖИ ж ФО пас я кі зі 5вБКІВ І Бої мом оеое о вРОПІ Мун мес ле Ба ЦО дм ж вв и нн а В в о В и п Б п п п о п о гм 7 ях БЕХ Не ЗИ ЗНИК НУ т ам 7, ї їй й Ох Гх 8 х ЯЗ ж ох в її п пок В їх во У їв її її хз ВЕ т Ж кутах по В я ше м М не п ИН У ЗЕ З о УА ЗЕ п З панно Я ж Ж коток в цу кох ЧИ Б» г хг 5 5 У т т: св ж сн п п З п п в и п С В С ЕЕ фезя хх 55135555 55 нич ж и а п В СУ За и З и т 7 Й ОБ ЇУ х їх ТУ У х ке Е й У 8 з хх: 5 ху хв гі ох ШЕ МЕ ЖЕ ЗЕ ПЕЛЕХ М В НЕ М ЗЕ В В В ВИ М А В ПЕ ж МИ НЕ В ВЕ ВИНИ ВИ ОТАК ж 2: 3 Ії т: п Он а ни Ен ПИ и НН НН З З З З З ЗВ Н а ши п и с бос воно во: й Й 8 У Ек їх хх: сУШКУ шо с ге зе а и У ЗП З З п чи З и ПИ п ЗЛ З УМ Не ЧИ ЧИ Ох зо ЗЕ УН Зе і НН А З НЕ ЗЕ З В З ЗК ши ви НН А з хх? тт вх хи и ЕЕ ВЕ ж ЖК В В В В ХВ З М З З: ПИ З ПА В ЕЕ те тя з ж пт 55 7525555 ОА М І НК м ИН НУ я й г и зн п С З п З се з З ЗКУ т во гово й р в МБО; 5 зх БІ 85 183 М ЕВ ов я жк ще Ви п и о п В ЕЕ хо кі кігті я 55 тії ре МЕ НЕ Ме ВИ А В ЗВ С В ВВ З ПР о В В: я ков і т. ік Оу ше 1 ЕІ: ААУ в оз з 5 хх т поті кі. ж Ще З и п и ПИ а ПВ З но М З УМ и З З С ВЕС й ій КОКО Кк МН ие и Не и У п спи І У З ЕН н ОЇ т ж КТ УТ ВХ АЯВІ 5 їз у мк ти и и З и ни У НИ В У о п и с и о З НЕ М ЧЕ МН хол їх ме и ще В С о я и З п и се з НЕ З сг ж и М В В В и ве не З п З В З В З В п то У и а в п п п З В В У : ОБ ОЖ Я В ОХ Ж Тож І п св 5 Нумепеція за БТІ жо іп ук Ім ЦО ОО НО КОЛЕ І ЗМК За в и лу: ВЕ но У ЗНО ЮК Во щи Мі дае ОЗМмОВІ НО це В Марі ин в: ЗЕ НИ Ж НЕ В В ЕН в В М В ОСС ПВА В хакі хх : : 85 і ЕН НИ Як І ЗИ НЕ НЕ НЕ кореня МАЕ виш нинанни нини нини ши ши ш ши шини шини й вої хх вот - тої киш: ІН У Їх ту НА ЧНО б я в у ак їх кох з ЕВ А БЕ ВЕ БЕІ У ХТЯВ У І в я В Я рія іа йо ож а ж вої ох Ме кож Ох ото 1. я в нок ов ої тову вк п ше ЕН М ВЕ З В В З НЕ З М М ЕН же НЕ ЗИ НИ: ЗМ НЕ З ДЕ УМ ЧЕ ЗЕ ЗНЕУ оо ояжо їж до я о ЕН І нн п НИ ЗИ НЕ я НЕ З кої вх Фе ЕЛІТІ 12 13 31 152821 с Ка пезе я я хх Б 5 Ж В Б а її 5 тт вх : ; Ех з НИ ЗЕ ЯН В ЗЕ ЕНЕ НЕ З МЕН одер в яю м она» СИ ен Я ох т хо ов ото м шини винни нини нини нн нн нн в Не и В сою з 14 тов х ух ЕВ у й тії 1 55 У ЕІ їх пек БВ У Б ЖЕ Б В Ж Б ЕЕ її її 3 5 хх 55 І: В ик є я У й і зе че ЗЕ и Я се З а и зе Я пу : зе кт ох От хх я й ве 25 їх Я й пої оз хо Р х 5 Ж Б ОВ Вот фс х В 5 У й в : ! МЕ Не НИ ЗЕ З В ЗМ ЗЕ А ВЕ ЗУ з 3» В хо Кох жк 5 ох ї. 3 4 5 пн а ше мам ва ЕЕ ЩА ж ж ж а ВЕ Б й її я вої Ко ЯК Вот в оя В 5 8 85 п 58 о т вк ж у х їх То жи з ке ИН и о и ПИ и а У мож ду тах Оля 5255 Б Я їх 5 ї З Б В Б пор 5 дл 1 кої ж г ох хх 2255525 Кк ху, ІЗ що ж хо у мине Еш и кож їх їх х я 7 от хв осз - 445 Б ва 5 у в ВЕ І хі Кз пан о ен 5 в ж Я ух ект У 5: ме ме З З а Не ПН ЗИ ЗЕ и о си о З п З п З и з З ЗАМ ЗЕ ршши 44ХУ в її ЕІ В ЕВЕВ ІІ: В УїУ т в її к 5 я В ж х 5 її т їх 5 їх є ах 5 х пн ни нн нн нн п й кох ни и ши и ни и ЕЕ п НЕ В ЕЕ
ФІГ:О37В-я Ніумераніяза БО вівса ІМ ЗИМІ міні Я б У ОЖа с мя БО2М ЗО ЗОМБІ БЕ да КО Но ДЕН МИСІ ХВ Б В х ту т ог ох ЖЕ 5 1 Ж ЖЕ ЖК Я 5 ОБ кот в 51 ХХ Ж г ОВ дж Ж ж В ог жк Кк а 5 17 т БЗ Б ко 5 в: ЕК злої ї 3 5 ж В в 5 їх В хз В 5 Б ВР я вх ЯК я в мою вої ж фот о 5 34 5 асо я в як ЕЕ т їх КЕ ХК В З ох яв г ЧУ 5 5 тов Ето 5 5 їж В ої їх 4 БО ВОВК О5 хр БОЮ КО БОЖ ж ж КОЖ Юд З к 5 тгї охо п в ЗЕ и З В ЗИ Не Я ЗНА З ВО НИ З З ЗП В КЕ З З с ЗЕ ЗВ МЕ З ЕС з КАМИ І ев УНР УНН Ж У в А І У У В НН а п З ИН з НИ НЕ І ЗИ НЕ НИ З НЕ ЗНА ННЯ охо: ее ж З НИ ЧИ Ве НЕ ЗЕ З З НЕ НЕ ЗЕ ВЕ НИ НН ЗІ ЗЕ З ПИ п ПИ Є З З ЗИ ЗВ НЕ З ЗВ НИ М з їі 2 5: ко 13544585 її: т: а5 71 МБ 5 їі г їх, вк ї3 їв Фк; т т 5 Ва Б іл вух Ух: ро де ВЕ на ЗК І НЕ В АК З НН А НЕ УК З ЗВ З ИН ПИ ЗД В ЗИ М ЕН ЕЕ 5 55: хЖК 5 я 85 855 т 5 58:35: в ЗІ ПН І ВИ ее З ОВ Я ЗВ НИ ВИ ВЕ п п З В ПВ ПИ ЗИ в З в В ТЕ ФК З В ЗВ ЗЕ Я БесуВЕ и ти ТІ ЗИМИ НЕ ЗМ ЗНА АК У М МИНЕ ЖК НИ В З У З З З А З НН НЕ З ЗИ М ЗНЗ З НЕ НЯ БНумераня за БО ОМ ожм мкм ше Ж ПІД МО КО МО ВУЗУ ЕОМ 3 Мб оби З ОХ) ШКО б с ЗК бе щРЯХ Ме Я Я ев ХУ КОЮ Б ЗгЗВЕ ЕЕ НЕ Я ЗЕ ПК НИ НВ А В ЗИ ЖК ВЕ З Вс По НЕ СЕ УС З М З с М М ЗИ ВИ ЗВ З Я о сени І ЗЕ ЗИ ЗД яв І ЗЕ В АН п ЗЕ ЗІ З ЧИ ЗИ У р З п п В НЕ З З МЕ ЗВ УНН МИ хх їх б ху кв В Ії Кк З Ж я я з 5 5 У ВОЮ З ую т ї кок 5 5 3 5 5 їо5 У хх В хв БА т я я т у ков в б ок оЖ ж ОВ Ж 5 ж во в хх вх тя ява кв вл хх екв не и ни З и М Р НК в НК НЕ І НЕ НН ПН А НУ Я ку ен МАГ Ми В З ЗИ В З ВЕ ВЕ и ВО В В З М и З З ЗВ З ВО В ВИ З НО ЗЕ ЗВ НВ ШОВ т жоя її 8 оз в 1 хо Ж 5 8 5 В у її в ко я у М б 5 Ж Ех їх р ВЕ Еш Ше МВ М МЕ З МИ ЗВ З В В ВЕ В В В З ПИ З ЗИ ЧИ ; З НИ ЗНА З М ВИ ПИ З НЕ ШЕ НИХ «ща їх ху Її 5 Зв га Я 5 її 5 8 КО я 3 їв 5 а КІ 5 5 хх 5 у її 5815 КІ ха я хі т т 2:78 охо ЗЕ Ши о ЯН В ЗНЗ В В ВЕ З С В НИ З В З п З З ЗИ Не З ЗИ У и З ЕН МЕНЯ се зД ВИ З Ше ЗИ В І ЗНа и ВК НИ З ЕН НЕ ВЕН ЗМ З З ЧЕ ЗИ З НН М З З НЕ М НИ З З НЕ НЯ Сех зІ еВ М М ПО З З ЗВ ЗВ З: ВЕ ВО М З ЗО ЗІ В У п З я З ЗЕ В В В ЧИ З и ЗЛ МЕ НВ Я
«ФР, ЕтВ-й Нумериняза БО С пра М Це Ма НК ДІ ПЕ А МІ По ЯН ЗМ МЕ у МЕ Ява М 3 ОКУ БРОБВ БЕ ОП ЯЖ бе оо ЗК де м БТ т у ж ек я оз гів я їв ав Її та ї 3:55 БЮ т т в Кк 5 В ж фо 5 5 т ж 5 с 5 у 5 ВЕ Ж ХА 5 Б Ж Я З т й 5: 55: Ба поло тн Ж З ІН ЗИ ТИ І МЕ ЗНО ЗЕ ОВ З НВ З М НН З З З Є: ПО І НВ З НЕ УЗ ВЕ МЕ ВИ ЖЕ СЕ М ВН У У НВ Не З В В ЗВ З Не п З з З З п ГО ЗИ З в В Кк пе ВИСТУ я п В ЗЕ ЗВ НИ З п п Є Є В о З ЗВ ЗЕ ЗЕ НМ З з 5 5 з В 5 в 5 фОЖ її ж Я 28555 5 вх 5 03 КЗ я У 3 хх в 5 У 558 5 з вії: їй ку: ЕЕ Ії В В її 75585255: же ми ШЕ МЕРЕ З ИН ІК ЗВ З ЗК НИ ВИ МЕ ЗХ УМ ЗЕ ИН их ЗІ З ЗИ с Р ЗЕ З УНН ЯВИ Я У БЕ я ж Ж о бо ОТ Б КЕ 25 9 БЕ У 5 я Я З ХК 5 ьо Б 5 5» 5 ж її ж а в 5 хх ж 5 5 8 КБ в 3535 ах 5 КЕ о8 я Б Б З ст У В В МЕ УК НЕ Е ЗБЕ Р М ВВ ЗЕ З ВИ В В ЗИ З В З ЗИ ЗИ ЗЕ СПИ М В В с НЕ ЗЕ ки Д ВШЕСВИ З: З С М З о: ЗІ НЕ ВИ ВЕНИ В ЗИ ЗІ ВИ ЗЕ З МЕ І НО З В НЕ С ета не ВЕ ЖЕ ЗИ ЗИ ВИК КВ ЗВ В ЗИ В З ВИ ЗВ З В ЧИ и В В З: ЗИ В У З ЗА НЕ У
«ФІГ. І18А за дет жен х Е До | еф РИ ! Го ше нев ОР СВІТ й Тор СВ «й й ік жк КЕ: я у 1-43 С а у, -я «Я х 559 55 | І ху
148. кхофвохн ДЯ 58 Б; в. шк жи ИН й і ре Б сондюх ЯВИ СВІ Я, ой щ - 1-44 СБ Ж МЕ ха пе у іо Е ЖЕ тк шшшшшшшншншншнжнтнлнлнлнл2лщННТНТНФШ: й Х й ій ЩЕ од З ; й ї? Ко ч ко х щі я й Кок сі у. М ру - УМ ї. є Е Не І ки ск их с КК СИ Й хай МУ ух ся да І г ї г - й СД ж ВХ й пи мо ЕК и А ; Ц! тя жо й Я л й їх ша. - й зх т. Кл х ; ех ий ж ра Ши Й - її ко ше 0 і їо нею Конпентрашія гнг/мчл) «ФІГ. 188 вен ши шини шини шини шишш м | | 31 СЕ 1 Я / І В о | Шо я | ій | шишш ОНИ ШЕ Шк Е 5 | ша
1. д ЕІ | ГЕ В. мій | СО іх м
Б. Тестування мутантів 5075 назв'язування ПА МЮ-5РА шко іЇлефіпитннй за білком АД ж 10005 й ронейня БО В БУМ ней ДО РЦМНЯТОг2 В ; сяк БІО ш а ВТ НС Оу Е ЖАН СуУє 0о--жндо в--ой - з-ан УЗ НС Сув ст гл ючи їй р с си сб о ПЕ не у ВХ Ку Я з Ек я шва Кк с Ея ее уд ЦО ув ес ШК --узіссув 00 Й у хх і сд-удіСб був и - й й Кд 28 й і "б же ай ще щ й сх я х х Б я - сх й вий т нний ек К сх е яр: зк печію Вр иевкя м ж жо їй ЗХ лини ж хо вла я пеееея в сере спот ефрнн ж ох дяляжию хфнннне ХК жест ки -Е
-
х. щи щ - с їх ее їм с а
- в. хо я гу 2 і я ЕК: са Фо КЗ т йно а щ г ш
ВІР. 20 1 о і С 1 в -»? о перу а . ві о вай й з чат а в ге ще я ч а о я 1 в 5 обу щ е ще х : О о 4 де 5 ; я і За чі ще п внявлекня 1 де г з з Е ЗЕ ІЗ вас щи й ваз НІЙ ща; ЗО Взнкомічпинн с ж Уа ; й ЩЕ о 25 4 - - 3 нку - з е о х З них : фест -------вевфвКвайф--------Єбн-- Межа -82- : внявлення ВУ ТАС 155 АС низ а о 15 й
Не. З д З мк я Ей г щ ат дос о ях, і Й й Е внявлення во 15 АС 155. ААС
І.А ЕН ок Св» - «ЗА о «МН В ХХ ЖК, дея вх й Ен й Еш Еко га ск в Ї р невшє Й ду ТВЯ-СІ, ТЕА і фу ви ЧИ ши Є 5 ОН Ї ; с ДОМ НЕ ( ий. З я З зак ї тр К. - ху З ПТ ях оо ЛШ т і І ж и: : ї й 7 С ит вч я : в А Ко жк ді тВщо Ще Кк що ни Кк ця вет і І ку тн ай КЕ Н м І ко я ме б ям, і. ДН КО 5 З ООН а ан а | Ї М лк; х я, - ! ; зі й те зеенююмеюювоюювооосу вия у гу ху сх г НО, Я з, і ; і е м я: ж - ГА т Ї й Не в А т 7 ек ані та : Т І В й р й Май ки Рифамінни З
І. НЕ ! ж А г! : ж: ї НЯ : очи : а, важ те ку : Ї ща ов Ї й зе я о я и. ми що де ї : хе ни и Де і р че А СКУ : кН Ї Ж Ї і ет з нак в и їх Н І п. : Ме А І м т | : Х ка деки НВреев - я 8 по ? з ме в нь й : їх З ВІ п ши шк а З о дитин А шт В. А бах ве 2-ї Ше : ІЙ сах о ся їх з я М мк М дб М. : ЗУ В У т я я х. : З о те : 1 5 кі : 8 МА пеню нако
ГО Я ак п ходить й г Що ІЙ бр де» ша пе ше дон о ОМ с вав! г: Я пт т МИ ша й зе р Но, В с, Зоя ї , ях Зрриту ж Н -о Й Сі 7 ях як - ач ши а й ! о ме ке бут ра ж ка АК ще НІ н В ЕЗ щ 9 лк вась Ї у уй щі ден, ук й й о й но 8 рр бу аа чи ке а ше шр 7 Г сер ВА як з сен,
ФІГ. ІА ОВ он "МО ре «МН. 7 Ку діа тА их м Су й на раю Зв Я ! пен НН ШИ Н кра ие Ша рах ТЕ Дмесн шк шт е ще й й . ей ах ОВ в он о б, й х ї х ; | г тв од ; у 4 дан, Ши сх ї7 и З те хх / І здав фр о йо Море тур Ор часке Б Е у. НО ж а ця щ м Ін я що у Н Щ зн 4 в трон т в она -р Н | : : й ї сх. НО Ко шу НО І «х КО х по зх, КР, я ит ау мая я нн й 7 Не ІМ ) М рен нн ох. ДА і Н Н ра и ра я Ї і ятріева сі тиВаміцннУ МУ Вибзміцнн 5 Натрієва сіль рифаміцнну Зх
ФІ. ІЗ ж ш ак бука Її се таз й Е. а че Ї ! я т СЕ о Авра ше: ; п мий я на т орех ай Ї т ій ня зерши їх» : Н : х й : ле ещя й Ї ї шо с ши ИН НИ г вину що шив фе ие од Но ик, шення Яр гу ще: соди ее тр вок , ше сте те й Мой Ж : й й 7 Басай
ЧІ. зе ЕКЕ: стурстрат для підівердження розщенлення я тапки тугу «ТАМ ВА МР-К Тан ОС АКАСОСК С Влуореснетні г и й -О Те ві Сай розщенлення Ж МН м я ще -й а С ; п ї , сажу У Я ЕІ кі г її вв х її Го: з їй в (4 Га) й них Н А дк нн ще Но шо, дови нм тур бек ит м те М чи МН КО 5 В нд її в КН в і св са : і й м м ль їй он ся : З х су х як, ще я се АВ паз АГ М ТУ ЄНУ де І й у с хо о Фпуоргеценн
ФІ. яко 2 роя ІЗ У пов си ух і С » по сЯ - я Ку ж Ошшнея с в п ИН її ДУХ ОО нн м аде ОЯ СОВИ НВ НН хи Я раки і: Ух А. я МОЖ У хо ен З х уже Ж КУ ж ее ЖЖ ра І; жх Же Са ї рак ОК КН с у ск Ж й У с й Я жкм ил КЗ -Ш еЕ Ве че Же що я роя ї су : ж ї х ЖЖ са в: р с ї режи й ї оМ ЕН реозае нн
«БІК. 28 Можно ї | : : ! Н | ! ї ! : ї : : : ! : : а ! Н Й : В ! | яд ! ! й ! : І ! Е хг , ринв и а а па я о а а о и п и А ИН І ! : І : Я ! : І : у : ! і |! : - : жк я ; Ши ве.
и. шк
КЕ. ! й і ше КЕ ! : і : 5 «В : Я ' : Її а : гі ' ж й. шк у шк ! ; й ' : й : ! : - і д : Е : й, І НЕ : 150 нин нн ну нн пи ; і ! Кн : Ав, я ія ! «й ! : ак дк Її Я шия : ра: Моя ЩЕ ду й де ЕН ОКА «ДЯ ! : Ди ВЕ КОТУ се оо во ово о в : : : Не ща но 150 20 Часіхвилинні шеф ня ТІ МА МР апа юсАРАВСОКІФлуоресцеїні ; 4 В . : ЕБЕТ пнептня. 107 клітннлмл ші фею ті «ЗАД ОАМА КО Тата САРА ВСОК флуоресцеїні ЕВЕТ пентня; 10 клітннімл
ФР. 29 ЦвАЗОЮ а і ! СУ ; «В : ' Ку ; : 5 5 З ЧА о от нн нн я ши ВЕН ' о І. : ! ГО щ ше І ; КО: ше ! ВЕ ; в ше : ті : : в У. : ж | є ши ож | «В й. а : р сх : й аЕф осв | доб й ї Я ке М; Н ї Кен --ї М де косе НИ дивна а : СИ по: 100 ; : : а во їо ч5о 200 Час іханлинмі - 8 тіо-трастузумаб «МР ТаТН ОО ОАКАССОК(Флуореснеїні ЕВЕТ пептид, 10? клітин/мл св Тіо-трастузумає «МРАК Тато ОАБАСОСОКіІФлуореснпеїні ЕВЕТ пептнл, 10 клітнн/ма
Но в. де і к М с в К І у ї ! МЕ АРААВУ? щи що ще сан на ша с пе а о - у а 5. 2 р се : Н : ПОН з зах Б я ке ; і М о: й маше шк ее з М ак ! Н Пе У с чі в й р ї М В ї Н МН житт пор ой Бе и що. мли в: роя й о. х їв Точна вата: ГА с РО і ся
! |. З х и їх еру МЕМ АРВАОВУ? | ! ни яд Ша рай З ях ій Ї й г ак й п « Бо се . Я їх ; о » я ге ди Е Й НЯ і я Я М М дитя Ми Мети ; М н ї ня ОМ т п тд Ну М й і М ци З « ще
(з. т т г хв З ! а Мак я Ге ій ; Ов а щ і є й. А щ ізха - й Точна вага: 13562 вірі Кузь нрЮОоДСВІИННННН НИ 109000 - п І НК нн НО У КУДИ
Я. кА НЯ ЗБК ОК, ВИК КМ КК КЕ Би кндях ПН секс имя ЗК р КЕ Б М: ще Я В КАК МЕ В км в у А Кок Зоя У ТО т У і Ме Ен ен Я З : 00 ЗО0О0 чо ке ее в Ом пеня шин як ак ЕК НУ ке БО Я Я КАК МНК ВО - КВ ж: й с ХИТ КК ВК В сестнея ЗУКЯ 3 КНЕУ ЗК ое ее я КАН А З г КК Я ие ВИС БЕЖ ВАКАУХ Ен Се КУ РУ МХ за ВХ пе о Ох С ши кое о ТЕМ СЕ; ЕКО Я ок в ку ши ни ПН В Кн ЗОН ОО Я Б У ВОК КБУ КВ о 5. їх ст де -- --Оо75и Ге діт. я у й ее «- Я кох сей що І ОО що МЖгаМя хх «а х- с - т - КЕ ОЖеЕ Ж а ша ра 2 о. их ще З мо ? дААСАМа ААС-Т (й З . РозшеплюванняЯ Розшщеплюваннй катепснном В і стафопаїном то г. 45 ї ЦК, -- зрос КК КК ВК НиКНК з ; ї7 пу З ; МЕН Зно Ї : З : ХА М з х 9 КРУК итжліжжлкя в ЗК В ВУ дососрогчу У Е васоганоо: В я Я Я УКВ ЖУК ЕВ в В зуечиу Я З Я ВХ ВВ І СЯ ОКХ В ш ЯЗ Б Му В ВО В М: ке - З У АСВ ВХ ЖИВ ДК РІК В щ яру Я КК Я КА о КУМ ДЯ З -о00 ШОВ ОКО оон СН. що ее Зі ВО ОВО ШИ: - Я Я КБ ВІ Кия ПНЯ КО В й Я Бо КІ В НН: ще 1 МеВ БІ НО т МОЯ Я Я ду Я М М Во ЖК | ника ОК З Ь ем З КЕ ТВ --- В В К---Я залах ЕК В --- Е Інк в ЗВ ЕС не ОО о ШИ ко У ЖИВ ВК ЖОВ ВОК в ЗУ В з Ку ее КК ОВ Б СОЯ Я В З і ВЕ сок ЗК БО м МАЯ В ЗИ ТО Дж ОХ Ко а В 35-4 ОК ДОК ВД ВОК вн А вьве Ко ОНИ нини уч ЕКО кое ОКУ ВО: ому ВОНИ ий МКК 5 Й МИ Х ки загнати ше ою: Я ЖК Кох хни 5 Уее, Хо жан е її ж; ї Как й 5 . В их до ах 13 5 що 6 ГЕО: ЕН: ж ШИЯ МА ЕВ сх А гу КапольшІй ходи яки КантІпальний З де ях 4497 | Моштрольий ААС-1О | Кснтетнй / дАС-ТОЗ Х МАСА БЕ ОГО Зв во ДАК отаро З де й у Браеплюваннй 7 і Вдозшенлюваннй гамокО КНтНиУ 3 - самого мВотилУу В зщеплювання У 7 Зкатевснном » ВУ в З З стафонаїном
ФІГ. 33 т. 5 м Нирки 191 з «А Ь а 8 їм Е о. ще г а я кі З З - й з 1967 й Яні де ; з м я ев х НО В Я ЩІ ОН | г ту с Й жо ло їм 23 АЙ МК КИ Х це НО Н Я шококоп ях й их ту Ех пр ге слу дь ААСГАТІВ Контроль того самега мвзсетннНу Розпіеплюванній сквфепином ААдС аг. я 1084 Серце ще Я е о Шини зи ве ко ї Пе - в дк су й в 104 ях й - й - з шо 1055 й ші це шини З Ши р ач 5. А ек Кк слацу де дев Кентроль того самого ізатину Розтеплюваний ААС
ФІГ. 45 шо Аналі:з макрофагами Мі УНгО СЕНМН о я ее т ї МО Я: В бе ах о о їх сода о КОВО ТО і: 5 КОМА МУК й й Я КО у шо се Я МК ВА п о ЖОВ КО, 0: п ср вва ВЕТВЬ МЖК с Ж ши ниж шо. КИ ПЕВ Кия КЛ КАН рням плям яко о п в я зай и 1. не НО пе ши я" о ае Я а а ЖК НЕ В 5 па ке ек й й ї 7 ЗВ КАС ИЄ сх ТЯ ААС-173 АдС-17 чім АВ ПАв «2.0 ЗАВ 3. що 7 КОЖ ха ІА й ЧІ ПАК ха В ж. Анатзз макрофагами М Уго ТКС ЗЕ 77 ЕХ: як Як ЯКУ УВА М: ун ЗОВ ЕВ ВО Я ЕЕ, п ко ОВЕН ОКА і ПН ЕЕ шо А о КИЕВ То реа ВХ ЛО я ЗВ ЕХО УК АКТИ Я З ВЕЖІ АК МХИТИ флгхтя ВУ Ж Ах я - с я т ї ЗО І; м: ВИ АК ща я 5 05 Доза; їх - я МЕР Гл Ж ЕІ ; ЯН я зав ААС-17Я ААС-172 Я Як : ИН й - 5 ше Моє АВ ПАК 18 ПАК хх 35
ФІ.
Я . 1083 - З Модель Я ІСНУ о УТу є 138 диметна Пров АС сте и: а о ! ! іо ай З 2 щи вк МИНА ве се З з й - ; Нв : ш щд . а зд фо яю тт т хо я кути мов З де Е я Те жику дк ще од що вва ААСЯ й су ААС-1 ПАЗА г ш- й ля лк ЗОЗ
ЗВІГ. 58 і Модель ЗЄС КУ їоУтуУЮ піперазВОК АС чн Ен |: ее |: а, й к пшЕ що й СЯ ; Е Ж 1093 ш - : ш шо чий. ах Ве: нн - ї й і ще в п ш ва
ЕФ с . є вва ААС-174 АС ПАК 16 ПАН
UAA201511604A 2013-05-31 2014-05-30 Антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югат UA120088C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361829461P 2013-05-31 2013-05-31
US201361829466P 2013-05-31 2013-05-31
PCT/US2014/039113 WO2014193722A1 (en) 2013-05-31 2014-05-22 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
US14/284,609 US20140356375A1 (en) 2013-05-31 2014-05-22 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
PCT/US2014/040324 WO2014194247A1 (en) 2013-05-31 2014-05-30 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120088C2 true UA120088C2 (uk) 2019-10-10

Family

ID=51989438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201511604A UA120088C2 (uk) 2013-05-31 2014-05-30 Антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югат

Country Status (30)

Country Link
EP (2) EP3004162B1 (uk)
JP (2) JP6469094B2 (uk)
KR (1) KR20160015227A (uk)
CN (2) CN105358573B (uk)
AU (2) AU2014273939B2 (uk)
BR (1) BR112015029838A2 (uk)
CA (1) CA2910029A1 (uk)
CL (1) CL2015003496A1 (uk)
CR (1) CR20150626A (uk)
DK (1) DK3004162T3 (uk)
EA (1) EA201592078A1 (uk)
ES (1) ES2793174T3 (uk)
HK (1) HK1220982A1 (uk)
HR (1) HRP20200812T1 (uk)
HU (1) HUE050451T2 (uk)
IL (1) IL242175B (uk)
LT (1) LT3004162T (uk)
MA (1) MA38686A1 (uk)
MX (2) MX369022B (uk)
MY (1) MY177774A (uk)
PE (1) PE20160715A1 (uk)
PH (1) PH12015502636A1 (uk)
PL (1) PL3004162T3 (uk)
PT (1) PT3004162T (uk)
RS (1) RS60256B1 (uk)
SG (1) SG11201509839TA (uk)
SI (1) SI3004162T1 (uk)
UA (1) UA120088C2 (uk)
WO (1) WO2014194247A1 (uk)
ZA (1) ZA201507977B (uk)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2687044C2 (ru) 2013-05-31 2019-05-06 Дженентек, Инк. Антитела против стеночной тейхоевой кислоты и их конъюгаты
CA2931798C (en) 2013-12-16 2023-06-27 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
EP3082875B1 (en) 2013-12-16 2020-11-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
PL3191502T3 (pl) * 2014-09-11 2021-11-08 Seagen Inc. Ukierunkowane dostarczanie substancji leczniczych zawierających aminę trzeciorzędową
JP6751393B2 (ja) 2014-12-03 2020-09-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗体リファマイシン抱合体及びその使用
EP3226909A1 (en) * 2014-12-03 2017-10-11 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
KR20170086536A (ko) 2014-12-03 2017-07-26 제넨테크, 인크. 항-스타필로코커스 아우레우스 항체 리파마이신 접합체 및 이의 용도
JP2018524295A (ja) * 2015-06-15 2018-08-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体及び免疫複合体
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2016363013B2 (en) 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
MX2018010491A (es) 2016-03-04 2018-11-09 Genentech Inc Proceso para la preparacion de un conjugado anticuerpo-rifamicina.
KR20190005998A (ko) * 2016-05-18 2019-01-16 젠맵 비. 브이 항체 및 감염성 질환의 치료에서의 그의 사용 방법
EP3464280B1 (en) 2016-06-06 2021-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
US11389543B2 (en) 2017-09-08 2022-07-19 Seagen Inc. Process for the preparation of tubulysins and intermediates thereof
EP3829648A1 (en) 2018-07-27 2021-06-09 Promega Corporation Quinone-containing conjugates
WO2021195716A1 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 Monash University Antibiotic conjugates
GB202214756D0 (en) * 2022-10-07 2022-11-23 Univ Oxford Innovation Ltd Product

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB877732A (en) 1958-08-12 1961-09-20 Lepetit Spa The antibiotic rifomycin, its components and methods of preparing same
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4610919A (en) 1985-06-14 1986-09-09 Fiber Bond Corporation Binder for fibrous padding
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
JP2544375B2 (ja) 1986-07-14 1996-10-16 鐘淵化学工業株式会社 アルキル置換ベンゾキサジノリフアマイシン誘導体
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
CA1304363C (en) 1988-11-01 1992-06-30 Takehiko Yamane 3'-hydroxybenzoxazinorifamycin derivative, process for preparing the same and antibacterial agent containing the same
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5545721A (en) 1992-12-21 1996-08-13 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for the prevention and treatment of sepsis
US6660267B1 (en) 1992-12-21 2003-12-09 Promega Corporation Prevention and treatment of sepsis
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5981522A (en) 1995-09-01 1999-11-09 Kaneka Corporation Treatment of disease caused by infection of Helicobacter
JP3963976B2 (ja) 1995-12-08 2007-08-22 株式会社カネカ クラミジア感染症治療剤
US6322788B1 (en) * 1998-08-20 2001-11-27 Stanley Arthur Kim Anti-bacterial antibodies and methods of use
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
AU5867100A (en) 1999-05-03 2000-12-12 Medarex, Inc. Human antibodies to staphylococcus aureus
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
WO2003043583A2 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20040119010A1 (en) 2002-11-01 2004-06-24 The Regents Of The University Of Colorado Quantitative analysis of protein isoforms using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry
AU2003298770A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-23 Biosynexus Inc Wall teichoic acid as a target for anti-staphylococcal therapies and vaccines
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
WO2005020894A2 (en) 2003-08-22 2005-03-10 Activbiotics, Inc. Rifamycin analogs and uses thereof
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
KR101520209B1 (ko) * 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
KR20070006698A (ko) 2003-12-23 2007-01-11 액티브 바이오틱스 인코포레이티드 리파마이신 유사체 및 그의 용도
EP1718667B1 (en) 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CA2614436C (en) 2005-07-07 2016-05-17 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
WO2007096703A2 (en) * 2005-08-11 2007-08-30 Targanta Therapeutics Inc. Phosphonated rifamycins and uses thereof for the prevention and treatment of bone and joint infections
US7547692B2 (en) 2005-12-14 2009-06-16 Activbiotics Pharma, Llc Rifamycin analogs and uses thereof
JP5669397B2 (ja) 2007-03-01 2015-02-12 シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ 同族抗体をクローニングするための方法
CA2683568A1 (en) 2007-05-08 2008-11-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
AU2008312457B2 (en) 2007-10-19 2014-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-TENB2 antibodies and antibody drug conjugates
AU2009246510B2 (en) 2008-05-12 2014-02-13 Strox Biopharmaceuticals, Llc Staphylococcus aureus-specific antibody preparations
EP2324041A4 (en) 2008-08-13 2012-06-13 Targanta Therapeutics Corp PHOSPHONIZED RIFAMYCINS AND ITS APPLICATION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF BONE AND JOINT INFECTIONS
JP2012504660A (ja) 2008-10-06 2012-02-23 ユニバーシティ オブ シカゴ 細菌ｅａｐ、ｅｍｐおよび／またはａｄｓａタンパク質に関連する組成物および方法
AR077756A1 (es) * 2009-07-15 2011-09-21 Genentech Inc Anticuerpos especificos para bacterias gram-positivas
CA3220104A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US10294270B2 (en) 2011-02-25 2019-05-21 Lonza Ltd Branched linker for protein drug conjugates
KR20150024315A (ko) * 2012-05-07 2015-03-06 재단법인 목암생명공학연구소 포도상구균 감염 예방용 백신 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014194247A1 (en) 2014-12-04
HUE050451T2 (hu) 2020-12-28
CN105358573B (zh) 2020-10-30
KR20160015227A (ko) 2016-02-12
RS60256B1 (sr) 2020-06-30
EP3004162B1 (en) 2020-03-11
HK1220982A1 (zh) 2017-05-19
MX369022B (es) 2019-10-25
PL3004162T3 (pl) 2020-07-27
IL242175B (en) 2020-02-27
JP6469094B2 (ja) 2019-02-13
CR20150626A (es) 2016-01-29
MX2015016405A (es) 2016-04-11
SI3004162T1 (sl) 2020-07-31
ZA201507977B (en) 2017-01-25
AU2014273939B2 (en) 2019-09-19
HRP20200812T1 (hr) 2020-08-07
JP2016525343A (ja) 2016-08-25
JP2019054801A (ja) 2019-04-11
CA2910029A1 (en) 2014-12-04
AU2019279986A1 (en) 2020-01-16
PH12015502636A1 (en) 2016-03-07
ES2793174T3 (es) 2020-11-13
MA38686A1 (fr) 2017-10-31
CL2015003496A1 (es) 2016-12-23
PT3004162T (pt) 2020-05-27
MY177774A (en) 2020-09-23
CN112430266A (zh) 2021-03-02
CN105358573A (zh) 2016-02-24
AU2014273939A1 (en) 2015-11-26
EP3381939A1 (en) 2018-10-03
SG11201509839TA (en) 2016-01-28
EA201592078A1 (ru) 2016-04-29
EP3004162A1 (en) 2016-04-13
MX2019012708A (es) 2019-12-16
PE20160715A1 (es) 2016-08-01
LT3004162T (lt) 2020-06-10
BR112015029838A2 (pt) 2017-09-26
DK3004162T3 (da) 2020-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA120088C2 (uk) Антитіло проти тейхоєвих кислот клітинної стінки та його кон'югат
US9895450B2 (en) Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
US10570192B2 (en) Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
JP6742314B2 (ja) 抗黄色ブドウ球菌抗体リファマイシン複合体及びその使用
TWI692483B (zh) 抗壁磷壁酸抗體（ａｎｔｉ-ｗａｌｌ ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及結合物
JP6751393B2 (ja) 抗ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗体リファマイシン抱合体及びその使用