CN105358573A - 抗壁磷壁酸抗体和缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗壁磷壁酸抗体及其抗生素缀合物,和使用它们的方法。

Description

抗壁磷壁酸抗体和缀合物
对相关申请的交叉援引
本申请要求2014年5月22日提交的流水号14/284,609的美国申请的优先权,它是依照37CFR§1.53(b)提交的非临时申请,要求2013年5月31日提交的流水号61/829,461的美国临时申请在35USC§119(e)下的权益,通过援引将其完整收录。
ASCII文本文件的序列表的提交
通过援引将ASCII文本文件上的下述提交的内容完整收入本文:计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名:P4960R2WO_PCTSequenceListing.txt,记录日期:2014年5月30日,大小:195,240字节)。
发明领域
本发明涉及缀合至利福霉素型抗生素的抗壁磷壁酸(“抗WTA”)抗体和所得抗体-抗生素缀合物在治疗传染病中的用途。
发明背景
致病性细菌是人和动物二者中疾病和死亡的一个实质原因。这些中突出的是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus；S.aureus；SA),它是全世界人中的细菌感染的首要原因。金黄色葡萄球菌能引起一系列疾病,从微小的皮肤感染到危及生命的疾病,诸如肺炎,脑膜炎,骨髓炎,心内膜炎,中毒性休克综合征(TSS),菌血症,和脓毒症。它的发病范围从皮肤,软组织,呼吸,骨,关节,血管内的到伤口感染。它仍然是医院感染的五个最常见原因之一,而且常常是术后伤口感染的原因。每年,美国医院中有50万左右患者发生葡萄球菌感染。
在过去几十年里,金黄色葡萄球菌感染正在变得越来越难以治疗,很大程度上是由于对所有已知的β-内酰胺抗生素有抗性的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现(Boucher,H.W.etal.,Badbugs,nodrugs:noESKAPE！AnupdatefromtheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica.Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica48:1-12(2009))。形势如此危急,以至于到2005年,MRSA感染据报告是单一传染剂所致死亡的首要原因--对美国超过1.5万例死亡负有责任(DeLeo,F.R.&Chambers,H.F.Reemergenceofantibiotic-resistantStaphylococcusaureusinthegenomicsera.TheJournalofClinicalInvestigation119:2464-2474(2009))。万古霉素,利奈唑胺和达托霉素已经变成用于治疗侵入性MRSA感染的抗生素选择(Boucher,H.,Miller,L.G.&Razonable,R.R.Seriousinfectionscausedbymethicillin-resistantStaphylococcusaureus.Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica51Suppl2:S183-197(2010))。然而,降低的对万古霉素的易感性和对利奈唑胺和达托霉素的交叉抗性也已经在MRSA临床株中有报告(Nannini,E.,Murray,B.E.&Arias,C.A.Resistanceordecreasedsusceptibilitytoglycopeptides,daptomycin,andlinezolidinmethicillin-resistantStaphylococcusaureus.Currentopinioninpharmacology10:516-521(2010))。随着时间推移,克服抗性所需要的万古霉素剂量已经上行到发生肾毒性的水平。如此,尽管有这些抗生素,来自侵入性MRSA感染的死亡率和发病率仍然较高。
虽然一般认为SA是细胞外病原体,但是往回至少50年的调查已经揭示它感染多种类型的宿主细胞(专职吞噬细胞和非吞噬性细胞二者)和在其中存活的能力(Gresham,H.D.etal.,SurvivalofStaphylococcusaureusinsideneutrophilscontributestoinfection.JImmunol164:3713-3722(2000)；Anwar,S.,Prince,L.R.,Foster,S.J.,Whyte,M.K.&Sabroe,I.TheriseandriseofStaphylococcusaureus:laughinginthefaceofgranulocytes.ClinicalandExperimentalImmunology157:216-224(2009)；Fraunholz,M.&Sinha,B.Intracellularstaphylococcusaureus:Live-inandletdie.Frontiersincellularandinfectionmicrobiology2:43(2012)；Garzoni,C.&Kelley,W.L.ReturnoftheTrojanhorse:intracellularphenotypeswitchingandimmuneevasionbyStaphylococcusaureus.EMBOmolecularmedicine3:115-117(2011))。这种兼性细胞内存留使得宿主免疫逃脱,宿主的长期建群,慢性感染状态的维持,而且有可能是常规抗生素疗法临床失败和之后复发的原因。而且,细胞内细菌对亚最佳抗生素浓度的暴露可促进抗生素抗性株的出现,如此使得这个临床问题更加尖锐。与这些观察结果一致,用万古霉素或达托霉素治疗具有侵入性MRSA感染诸如菌血症或心内膜炎的患者与大于50％的失败率有关(Kullar,R.,Davis,S.L.,Levine,D.P.&Rybak,M.J.Impactofvancomycinexposureonoutcomesinpatientswithmethicillin-resistantStaphylococcusaureusbacteremia:supportforconsensusguidelinessuggestedtargets.Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica52:975-981(2011)；Fowler,V.G.,Jr.etal.,DaptomycinversusstandardtherapyforbacteremiaandendocarditiscausedbyStaphylococcusaureus.TheNewEnglandjournalofmedicine355:653-665(2006)；Yoon,Y.K.,Kim,J.Y.,Park,D.W.,Sohn,J.W.&Kim,M.J.Predictorsofpersistentmethicillin-resistantStaphylococcusaureusbacteraemiainpatientstreatedwithvancomycin.TheJournalofantimicrobialchemotherapy65:1015-1018(2010))。因此,更加成功的抗葡萄球菌疗法应当包括消除细胞内细菌。
大多数今天的抗细菌剂在化学上是各种天然化合物的半合成修饰。这些包括例如β-内酰胺抗细菌剂,包括青霉素(由青霉属的真菌生成),头孢菌素,和碳青霉烯。还是自活的生物体分离的抗微生物化合物包括氨基糖苷,而其它抗细菌剂仅仅通过化学合成来生产,例如磺胺,喹诺酮,和唑烷酮。据此,根据化学/生物合成起源将许多抗细菌化合物分类入天然的,半合成的,和合成的。另一种分类系统基于生物学活性；在这种分类中,将抗细菌剂依照它们对微生物的生物学作用分入两大组:杀死细菌的杀菌剂和减缓或停止细菌生长的抑菌剂。
安沙霉素(ansamycin)是一类抗生素,包括利福霉素(rifamycin),力复平(rifampin),利福平(rifampicin),利福布汀(rifabutin),利福喷汀(rifapentine),利福拉齐(rifalazil),ABI-1657,和其类似物,抑制细菌RNA聚合酶且具有针对革兰氏阳性和选择性革兰氏阴性细菌的超常效力(Rothstein,D.M.etal.(2003)ExpertOpin.Invest.Drugs12(2):255-271；US7,342,011；US7,271,165)。
已经报告了用于预防和治疗金黄色葡萄球菌(包括MRSA)感染的免疫疗法。US2011/0262477关注细菌粘附蛋白Eap,Emp和AdsA作为疫苗用于刺激针对MRSA的免疫应答的用途。WO2000071585描述分离的对特定金黄色葡萄球菌株隔离群反应性的单克隆抗体。US20110059085A1提出一种基于抗体的策略,利用对一或多种SA荚膜抗原特异性的IgM抗体,尽管没有描述实际的抗体。
磷壁酸(TA)是在革兰氏阳性细菌(包括SA)的细胞壁内找到的细菌多糖。壁磷壁酸(WTA)是那些共价连接至细胞壁的肽聚糖(PDG)层的；而脂磷壁酸(LTA)是那些共价连接至细胞质膜的脂质的(Xiaetal.(2010)Intl.J.Med.Microbiol.300:148-54)。这些糖聚合物在不利条件下的细菌存活中和在其它基础细胞过程中发挥关键作用。已知的WTA结构在细菌物种间广泛变化。金黄色葡萄球菌TA由重复的多元醇磷酸酯亚单位(诸如核糖醇磷酸酯或甘油磷酸酯)构成。鉴于它们的结构多样性和可变性,认为WTA是抗体和疫苗的有吸引力的靶物(同上)。
抗体-药物缀合物(ADC),也称作免疫缀合物,是靶向化疗分子,通过将有力的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞,组合抗体和细胞毒性药物二者的理想特性(Teicher,B.A.(2009)Curr.CancerDrugTargets9:982-1004),由此通过最大化功效和最小化脱靶毒性而增强治疗指数(Carter,P.J.andSenterP.D.(2008)TheCancerJ.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。ADC包含经由接头单元共价附着至细胞毒性药物模块的靶向抗体。免疫缀合物容许药物模块靶向投递至肿瘤和其中的细胞内积累,而系统施用未缀合的药物可对正常细胞产生与试图消除的肿瘤细胞同样的不可接受水平的毒性(PolakisP.(2005)Curr.Opin.Pharmacol.5:382-387)。给定靶抗原的有效ADC开发取决于诸如靶抗原表达水平,肿瘤可及性(Kovtun,Y.V.andGoldmacherV.S.(2007)CancerLett.255:232-240),抗体选择(US7,964,566),接头稳定性(Ericksonetal.(2006)CancerRes.66(8):4426-4433；Doroninaetal.(2006)BioconjugateChem.17:114-124；Alleyetal.(2008)BioconjugateChem.19:759-765),细胞毒性药物作用机制和效力,药物加载(Hamblettetal.(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070)和接头-药物缀合至抗体的模式(Lyon,R.etal.(2012)MethodsinEnzym.502:123-138；Xieetal.(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtunetal.(2006)CancerRes.66(6):3214-3121；Lawetal.(2006)CancerRes.66(4):2328-2337；Wuetal.(2005)NatureBiotech.23(9):1137-1145；LambertJ.(2005)CurrentOpin.inPharmacol.5:543-549；HamannP.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents15(9):1087-1103；Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212；Trailetal.(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；SyrigosandEpenetos(1999)AnticancerRes.19:605-614)等参数的优化。
癌症疗法中的ADC的概念也已经扩展至抗细菌疗法,在这种情况中药物部分为抗生素,产生抗体-抗生素缀合物(AAC)。US5,545,721和US6,660,267描述经抗生素结合靶细菌表面的非特异性免疫球蛋白-抗生素缀合物的合成和其用于治疗脓毒症的用途。US7,569,677和相关专利预言性提出具有对细菌抗原(诸如SA荚膜多糖)特异性的抗原结合部分但缺少与细菌Fc结合蛋白(例如葡萄球菌蛋白A)反应的恒定区的抗生素缀合的抗体。
发明概述
本发明提供称作“抗体-抗生素缀合物”或“AAC”的组合物,其包含通过共价附着缀合至一或多个利福霉素型抗生素模块的抗体。
本发明的一个方面是一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含L链和H链,所述L链包含CDRL1,CDRL2和CDRL3且所述H链包含CDRH1,CDRH2和CDRH3,其中所述CDRL1,CDRL2和CDRL3和CDRH1,CDRH2和CDRH3分别包含表6A和6B中所示抗体4461(SEQIDNO:1-6),4624(SEQIDNO:7-12),4399(SEQIDNO:13-18),和6267(SEQIDNO:19-24)每个的CDR的氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链可变区(VH),其中所述VH在选自抗体4461,4624,4399,和6267VH序列SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32的VH区的长度上包含至少95％序列同一性。在一个实施方案中,此抗体进一步包含轻链可变区(VL),其中所述VL在选自抗体4461,4624,4399,和6267VL序列SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31的VL区的长度上包含至少95％序列同一性。在另一个实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL),其中所述VL在选自抗体4461,4624,4399,和6267VL序列SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31的VL区的长度上包含至少95％序列同一性。在任何前述实施方案中,所述序列同一性可以是96％,97％,98％,99％或100％。
在更加具体的实施方案中,所述抗体包含:
(i)SEQIDNO:25的VL和SEQIDNO:26的VH；
(ii)SEQIDNO:27的VL和SEQIDNO:28的VH；
(iii)SEQIDNO:29的VL和SEQIDNO:30的VH；或
(iv)SEQIDNO:31的VL和SEQIDNO:32的VH。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA(壁磷壁酸)单克隆抗体包含轻(L)链和重(H)链,其中:
(a)所述L链包含:
包含序列KSSQSVLSRANNNYYVA(SEQIDNO:1)的CDRL1,
包含序列WASTREF(SEQIDNO:2)的CDRL2,和
包含序列QQYYTSRRT(SEQIDNO:3)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYYMH(SEQIDNO:4)的CDRH1,
包含序列WINPKSGGTNYAQRFQG(SEQIDNO:5)的CDRH2,和
包含序列DCGSGGLRDF(SEQIDNO:6)的CDRH3；
(b)所述L链包含:
包含序列RSNQNLLSSSNNNYLA(SEQIDNO:7)的CDRL1,
包含序列WASTRES(SEQIDNO:8)的CDRL2,和
包含序列QQYYANPRT(SEQIDNO:9)的CDRL3；且
所述H链包含:
包含序列DYYIH(SEQIDNO:10)的CDRH1,
包含序列WINPNTGGTYYAQKFRD(SEQIDNO:11)的CDRH2,和
包含序列DCGRGGLRDI(SEQIDNO:12)的CDRH3；
(c)所述L链包含:
包含序列KSNQNVLASSNDKNYLA(SEQIDNO:13)的CDRL1,
包含序列WASIRES(SEQIDNO:14)的CDRL2,和
包含序列QQYYTNPRT(SEQIDNO:15)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYYIH(SEQIDNO:16)的CDRH1,
包含序列WINPNTGGTNYAQKFQG(SEQIDNO:17)的CDRH2,和
包含序列DCGNAGLRDI(SEQIDNO:18)的CDRH3；或
(d)所述L链包含:
包含序列KSSQNVLYSSNNKNYLA(SEQIDNO:19)的CDRL1,
包含序列WASTRES(SEQIDNO:20)的CDRL2,和
包含序列QQYYTSPPYT(SEQIDNO:21)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYWIG(SEQIDNO:22)的CDRH1,
包含序列IIHPGDSKTRYSPSFQG(SEQIDNO:23)的CDRH2,和
包含序列LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV(SEQIDNO:24)的CDRH3。
在任一前述实施方案中,所述抗体可以是缺少Fc区的抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是F(ab)或F(ab’)2。在一些实施方案中,所述抗体进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区,其中所述重链恒定区和/或所述轻链恒定区包含一或多个用半胱氨酸残基替代的氨基酸。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸替代A118C和/或S400C,和/或所述轻链恒定区包含氨基酸替代V205C,其中编号依照EU编号方式。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:149和/或所述轻链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:151。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:149且所述轻链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:150。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:148且所述轻链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:151。
一方面,任一前述实施方案的抗体结合WTAα。
另一方面,本发明提供一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含L链和H链,所述L链包含CDRL1,CDRL2和CDRL3和/或所述H链包含CDRH1,CDRH2和CDRH3,其中所述CDRL1,CDRL2和CDRL3和CDRH1,CDRH2和CDRH3包含图14中所示抗体每个的对应CDR的氨基酸序列(SEQIDNO:33-110)。另一方面,本发明提供一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含L链和H链,所述L链包含CDRL1,CDRL2和CDRL3和/或所述H链包含CDRH1,CDRH2和CDRH3,其中所述CDRL1,CDRL2和CDRL3和CDRH1,CDRH2和CDRH3包含图15A,15B,16A和16B中所示抗体(抗体6078,6078.v2HC-Cys,6078.v2LC-Cys,6078.v3HC-Cys,6078.v3LC-Cys,6078.v4HC-Cys,6078.v4LC-Cys,6078.v4HCLC-Cys,4497,4497.v8HC-Cys,4497.v8LC-Cys,和4497.v8HCLC-Cys)每个的对应CDR的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中,这些抗体结合WTAβ。
另一方面,本发明提供一种分离的抗WTA单克隆抗体,具体是抗WTAβ单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL),其中所述VL在Kabat位置1-107处在选自与图17A-1至17A-2中所示抗体6078,6263,4450,6297,6239,6232,6259,6292,4462,6265,6253,4497,和4487每个对应的VL序列的VL区的长度上包含至少95％序列同一性。在进一步的实施方案中,所述抗体进一步包含重链可变区(VH),其中所述VH在Kabat位置1-113处在选自与图17B-1至17B-2中所示抗体6078,6263,4450,6297,6239,6232,6259,6292,4462,6265,6253,4497,和4487每个对应的VH序列的VH区的长度上包含至少95％序列同一性。在任何前述实施方案中,所述序列同一性可以是96％,97％,98％,99％或100％。在所述抗体的一个更加具体的实施方案中,所述VH包含序列SEQIDNO:112且所述VL包含SEQIDNO:111。
另一方面,本发明提供一种分离的抗WTA单克隆抗体,具体是抗WTAβ单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL),其中所述VL在Kabat位置1-107处在选自与如图15A或16A中所示抗体(抗体6078,6078.v2HC-Cys,6078.v2LC-Cys,6078.v3HC-Cys,6078.v3LC-Cys,6078.v4HC-Cys,6078.v4LC-Cys,6078.v4HCLC-Cys,4497,4497.v8HC-Cys,4497.v8LC-Cys,和4497.v8HCLC-Cys)每个对应的VL序列的VL区的长度上包含至少95％序列同一性。在又一些实施方案中,所述抗体进一步包含重链可变区(VH),其中所述VH在Kabat位置1-113处在选自与如图15B和16B中所示抗体(抗体6078,6078.v2HC-Cys,6078.v2LC-Cys,6078.v3HC-Cys,6078.v3LC-Cys,6078.v4HC-Cys,6078.v4LC-Cys,6078.v4HCLC-Cys,4497,4497.v8HC-Cys,4497.v8LC-Cys,和4497.v8HCLC-Cys)每个对应的VH序列的VH区的长度上包含至少95％序列同一性。在任何前述实施方案中,所述序列同一性可以是96％,97％,98％,99％或100％。
在某个实施方案中,所述分离的抗WTAβ抗体是如下的,其中轻链包含序列SEQIDNO:115且具有改造的半胱氨酸的重链包含序列SEQIDNO:116。在另一个实施方案中,所述抗体是如下的,其中轻链包含序列SEQIDNO:115且具有改造的半胱氨酸的重链包含序列SEQIDNO:117,其中X为M,I或V。在一个不同的实施方案中,包含序列SEQIDNO:113的L链与SEQIDNO:117的Cys改造的H链变体配对；所述变体是如下的,其中X为M,I或V。
本发明提供的另一种分离的抗WTAβ抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含与SEQIDNO:120具有至少95％序列同一性的VH。在另一个实施方案中,此抗体进一步包含与SEQIDNO:119具有至少95％序列同一性的VL。在一个具体的实施方案中,所述抗WTAβ抗体包含轻链和重链,其中L链包含VL序列SEQIDNO:119且H链包含VH序列SEQIDNO:120。在一个还有更加具体的实施方案中,所述分离的结合WTAβ的抗体包含L链SEQIDNO:121和H链SEQIDNO:122。
抗WTAβCys改造的H和L链变体可以以任何下述组合配对以形成完整抗体,用于缀合至接头-抗生素中间体以生成本发明的抗WTAAAC。在一个实施方案中,L链包含序列SEQIDNO:121且H链包含序列SEQIDNO:124。在另一个实施方案中,所述分离的抗体包含SEQIDNO:123的L链和包含序列SEQIDNO:124或SEQIDNO:157的H链。在一个特定的实施方案中,本发明的抗WTAβ抗体以及抗WTAβAAC包含L链SEQIDNO:123。
还有另一个实施方案是与图13A和图13B的抗WTAα抗体每一个结合相同表位的抗体。还提供的是与图14,图15A和15B,图16A和16B,和图17A和17B的抗WTAβ抗体每一个结合相同表位的抗体。
在又一个实施方案中,本发明的抗WTAβ和抗WTAα抗体是缺少Fc区的抗原结合片段,优选F(ab’)2或F(ab)。如此,本发明提供抗体-抗生素缀合物,其中WTA抗体是F(ab’)2或F(ab)。
另一方面,本发明提供一种结合WTAβ的抗WTA单克隆抗体。
在一些实施方案中,分离的抗WTA(壁磷壁酸)单克隆抗体包含轻(L)链和重(H)链,其中:
(a)所述L链包含:
包含序列RASQTISGWLA(SEQIDNO:33)的CDRL1,
包含序列KASTLES(SEQIDNO:34)的CDRL2,和
包含序列QQYKSYSFN(SEQIDNO:35)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYDIN(SEQIDNO:36)的CDRH1,
包含序列WMNANSGNTGYAQKFQG(SEQIDNO:37)的CDRH2,和
包含序列SSILVRGALGRYFDL(SEQIDNO:38)的CDRH3；
(b)所述L链包含:
包含序列RASQTISGWLA(SEQIDNO:39)的CDRL1,
包含序列KASTLES(SEQIDNO:40)的CDRL2,和
包含序列QQYKSYSFN(SEQIDNO:41)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYDIN(SEQIDNO:42)的CDRH1,
包含序列WMNANSGNTGYAQKFQG(SEQIDNO:43)的CDRH2,和
包含序列SSILVRGALGRYFDL(SEQIDNO:44)的CDRH3；
(c)所述L链包含:
包含序列RASQFVSRTSLA(SEQIDNO:45)的CDRL1,
包含序列ETSSRAT(SEQIDNO:46)的CDRL2,和
包含序列HKYGSGPRT(SEQIDNO:47)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列NYDFI(SEQIDNO:48)的CDRH1,
包含序列WMNPNSYNTGYGQKFQG(SEQIDNO:49)的CDRH2,和
包含序列AVRGQLLSEY(SEQIDNO:50)的CDRH3；
(d)所述L链包含:
包含序列RASQSVSSSYLA(SEQIDNO:51)的CDRL1,
包含序列DASSRAT(SEQIDNO:52)的CDRL2,和
包含序列QKYGSTPRP(SEQIDNO:53)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYDIN(SEQIDNO:54)的CDRH1,
包含序列WMNPNSGNTNYAQRFQG(SEQIDNO:55)的CDRH2,和
包含序列ERWSKDTGHYYYYGMDV(SEQIDNO:56)的CDRH3；
(e)所述L链包含:
包含序列RASLDITNHLA(SEQIDNO:57)的CDRL1,
包含序列EASILQS(SEQIDNO:58)的CDRL2,和
包含序列EKCNSTPRT(SEQIDNO:59)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列NYDIN(SEQIDNO:60)的CDRH1,
包含序列WMNPSSGRTGYAPKFRG(SEQIDNO:61)的CDRH2,和
包含序列GGGYYDSSGNYHISGLDV(SEQIDNO:62)的CDRH3；
(f)所述L链包含:
包含序列RASQSVGAIYLA(SEQIDNO:63)的CDRL1,
包含序列GVSNRAT(SEQIDNO:64)的CDRL2,和
包含序列QLYTSSRALT(SEQIDNO:65)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列AYAMN(SEQIDNO:66)的CDRH1,
包含序列SITKNSDSLYYADSVKG(SEQIDNO:67)的CDRH2,和
包含序列LAARIMATDY(SEQIDNO:68)的CDRH3；
(g)所述L链包含:
包含序列RASQGIRNGLG(SEQIDNO:69)的CDRL1,
包含序列PASTLES(SEQIDNO:70)的CDRL2,和
包含序列LQDHNYPPT(SEQIDNO:71)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列YYSMI(SEQIDNO:72)的CDRH1,
包含序列SIDSSSRYLYYADSVKG(SEQIDNO:73)的CDRH2,和
包含序列DGDDILSVYRGSGRPFDY(SEQIDNO:74)的CDRH3；
(h)所述L链包含:
包含序列RASQGIRNGLG(SEQIDNO:75)的CDRL1,
包含序列PASTLES(SEQIDNO:76)的CDRL2,和
包含序列LQDHNYPPS(SEQIDNO:77)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列YYSMI(SEQIDNO:78)的CDRH1,
包含序列SIDSSSRYRYYTDSVKG(SEQIDNO:79)的CDRH2,和
包含序列DGDDILSVYQGSGRPFDY(SEQIDNO:80)的CDRH3；
(i)所述L链包含:
包含序列RASQSVRTNVA(SEQIDNO:81)的CDRL1,
包含序列GASTRAS(SEQIDNO:82)的CDRL2,和
包含序列LQYNTWPRT(SEQIDNO:83)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列TNDMS(SEQIDNO:84)的CDRH1,
包含序列TIIGIDDTTHYADSVRG(SEQIDNO:85)的CDRH2,和
包含序列NSGIYSF(SEQIDNO:86)的CDRH3；
(j)所述L链包含:
包含序列RASQDIGSSLA(SEQIDNO:87)的CDRL1,
包含序列ATSTLQS(SEQIDNO:88)的CDRL2,和
包含序列QQLNNYVHS(SEQIDNO:89)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYAMG(SEQIDNO:90)的CDRH1,
包含序列VVTGHSYRTHYADSVKG(SEQIDNO:91)的CDRH2,和
包含序列RIWSYGDDSFDV(SEQIDNO:92)的CDRH3；
(k)所述L链包含:
包含序列RASQSIGDRLA(SEQIDNO:93)的CDRL1,
包含序列WASNLEG(SEQIDNO:94)的CDRL2,和
包含序列QQYKSQWS(SEQIDNO:95)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYAMN(SEQIDNO:96)的CDRH1,
包含序列YISSIETIYYADSVKG(SEQIDNO:97)的CDRH2,和
包含序列DRLVDVPLSSPNS(SEQIDNO:98)的CDRH3；
(l)所述L链包含:
包含序列KSSQSIFRTSRNKNLLN(SEQIDNO:99)的CDRL1,
包含序列WASTRKS(SEQIDNO:100)的CDRL2,和
包含序列QQYFSPPYT(SEQIDNO:101)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SFWMH(SEQIDNO:102)的CDRH1,
包含序列FTNNEGTTTAYADSVRG(SEQIDNO:103)的CDRH2,和
包含序列GDGGLDD(SEQIDNO:104)的CDRH3；
(m)所述L链包含:
包含序列RASQFTNHYLN(SEQIDNO:105)的CDRL1,
包含序列VASNLQS(SEQIDNO:106)的CDRL2,和
包含序列QQSYRTPYT(SEQIDNO:107)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SGYYN(SEQIDNO:108)的CDRH1,
包含序列YILSGAHTDIKASLGS(SEQIDNO:109)的CDRH2,和
包含序列SGVYSKYSLDV(SEQIDNO:110)的CDRH3；或
(n)所述L链包含:
包含序列KSSQSIFRTSRNKNLLN(SEQIDNO:99)的CDRL1,
包含序列WASTRKS(SEQIDNO:100)的CDRL2,和
包含序列QQYFSPPYT(SEQIDNO:101)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SFWMH(SEQIDNO:102)的CDRH1,
包含序列FTNNEGTTTAYADSVRG(SEQIDNO:103)的CDRH2,和
包含序列GEGGLDD(SEQIDNO:118)的CDRH3。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在VH序列SEQIDNO:112的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,其中SEQIDNO:112第1位处的氨基酸Xaa为Q或E,且SEQIDNO:112第2位处的氨基酸Xaa为M,I或V。在一些实施方案中,所述抗体进一步包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:111的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:111的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在任何前述实施方案中,所述序列同一性可以是96％,97％,98％,99％,或100％。在一些实施方案中,所述抗体的VH包含序列SEQIDNO:112且所述抗体的VL包含序列SEQIDNO:111。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在VH序列SEQIDNO:120或SEQIDNO:156的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体进一步包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:119的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:119的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在任何前述实施方案中,所述序列同一性可以是96％,97％,98％,99％,或100％。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),其中所述VL包含序列SEQIDNO:119且所述VH包含序列SEQIDNO:120或SEQIDNO:156。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在选自VL序列SEQIDNO:158,SEQIDNO:159,SEQIDNO:160,SEQIDNO:161,SEQIDNO:162,SEQIDNO:163,SEQIDNO:164,SEQIDNO:165,SEQIDNO:166,SEQIDNO:167,和SEQIDNO:168的VL序列的长度上具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在选自VH序列SEQIDNO:127,SEQIDNO:133,SEQIDNO:134,SEQIDNO:169,SEQIDNO:170,SEQIDNO:171,SEQIDNO:172,SEQIDNO:173,SEQIDNO:174,SEQIDNO:175,和SEQIDNO:176的VH序列的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在任何前述实施方案中,所述序列同一性可以是96％,97％,98％,99％,或100％。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),其中:
(a)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:158的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:169的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(b)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:159的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:170的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(c)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:160的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:171的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(d)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:161的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:172的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(e)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:162的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:173的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(f)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:163的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:174的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(g)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:164的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:175的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(h)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:165的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:176的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(i)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:166的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:133的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(j)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:167的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:134的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或
(k)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:168的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:127的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),其中:
(a)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:158,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:169；
(b)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:159,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:170；
(c)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:160,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:171；
(d)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:161,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:172；
(e)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:162,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:173；
(f)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:163,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:174；
(g)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:164,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:175；
(h)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:165,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:176；
(i)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:166,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:133；
(j)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:167,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:134；
(k)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:168,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:127；
(l)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:113,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:114；或
(m)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:121,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:138。
在上文所述抗体的一些实施方案中,所述抗体是缺少Fc区的抗原结合片段。在一些实施方案中,所述抗体是F(ab)或F(ab’)2。在一些实施方案中,所述抗体进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区,其中所述重链恒定区和/或所述轻链恒定区包含一或多个用半胱氨酸残基替代的氨基酸。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸替代A118C或S400C,和/或所述轻链恒定区包含氨基酸替代V205C,其中编号依照EU编号方式。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:149和/或所述轻链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:151。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:149且所述轻链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:150。在一些实施方案中,所述重链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:148且所述轻链恒定区包含氨基酸序列SEQIDNO:151。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含序列SEQIDNO:114,SEQIDNO:116,或SEQIDNO:117,且所述抗体的轻链包含序列SEQIDNO:113；其中SEQIDNO:116或SEQIDNO:117第2位处的氨基酸Xaa为M,I或V。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含序列SEQIDNO:114,SEQIDNO:116,或SEQIDNO:117,且所述抗体的轻链包含序列SEQIDNO:115；其中SEQIDNO:116或SEQIDNO:117第2位处的氨基酸Xaa为M,I或V。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含选自SEQIDNO:139,SEQIDNO:140,SEQIDNO:141,SEQIDNO:142,SEQIDNO:143,和SEQIDNO:144的序列；且所述抗体的轻链包含SEQIDNO:113的序列。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含选自SEQIDNO:139,SEQIDNO:140,SEQIDNO:141,SEQIDNO:142,SEQIDNO:143,和SEQIDNO:144的序列；且所述抗体的轻链包含SEQIDNO:115的序列。
在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含序列SEQIDNO:146,SEQIDNO:147,SEQIDNO:157或SEQIDNO:124,且所述轻链包含序列SEQIDNO:121。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含序列SEQIDNO:146,SEQIDNO:147,SEQIDNO:157或SEQIDNO:124,且所述轻链包含序列SEQIDNO:123。在一些实施方案中,所述分离的抗WTA单克隆抗体包含重链和轻链,其中所述重链包含序列SEQIDNO:146,SEQIDNO:147,SEQIDNO:157或SEQIDNO:124,且所述轻链包含序列SEQIDNO:145。
在上文所述任何抗体的一些实施方案中,所述抗体不是IgM同种型。在上文所述任何抗体的一些实施方案中,所述抗体是IgG(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4),IgE,IgD,或IgA(例如IgA1或IgA2)同种型。在上文所述任何抗体的一些实施方案中,所述抗体是由细胞培养中的宿主细胞生成的。在一些实施方案中,所述宿主细胞为非人细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是原核的或真核的。在一些实施方案中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞(例如人或非人哺乳动物细胞)。在一些实施方案中,所述宿主细胞为CHO细胞。
另一方面,本发明提供一种药物组合物,其包含本文中公开的任何抗体和药学可接受载剂。
还有另一方面,本发明还提供一种分离的核酸,其编码本文中公开的任何抗体。仍有另一方面,本发明提供一种载体,其包含编码本文中公开的任何抗体的核酸。在又一个实施方案中,所述载体为表达载体。
本发明还提供一种宿主细胞,其包含编码本文中公开的任何抗体的核酸。在又一个实施方案中,所述宿主细胞是原核的或真核的。在一些实施方案中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞(例如人或非人哺乳动物细胞)。在一些实施方案中,所述宿主细胞为CHO细胞。
本发明进一步提供一种生成抗体的方法,其包括在适合于下述核酸表达的条件下培养包含编码本文中公开的任何抗体的核酸的宿主细胞；并回收由所述细胞生成的抗体。在一些实施方案中,所述方法进一步包括纯化所述抗体。
本发明的另一方面是一种抗体-抗生素缀合物(AAC)化合物,其包含本发明的抗壁磷壁酸(WTA)抗体,所述抗体通过肽接头共价附着至利福霉素型抗生素。在本文中公开的抗体-抗生素缀合物的一些实施方案中,所述抗壁磷壁酸(WTA)抗体结合金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中,所述抗壁磷壁酸抗体结合甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
在本文中公开的抗体-抗生素缀合物的一些实施方案中,所述抗体包含:i)SEQIDNO:99-104的L链和H链CDR或SEQIDNO:33-38的L链和H链CDR；或ii)配对的SEQIDNO:119或SEQIDNO:123的VL与SEQIDNO:120或SEQIDNO:156的VH；或iii)配对的SEQIDNO:111的VL与SEQIDNO:112的VH。
在一些实施方案中,所述利福霉素型抗生素为利福拉齐型抗生素。在一些实施方案中,所述利福霉素型抗生素包含附着至肽接头的季胺。在一些实施方案中,所述抗生素经附着至所述抗WTA抗体的改造的半胱氨酸的肽接头附着至所述抗体。所述改造的半胱氨酸可以在经修饰抗体的L或H链中。在一些实施方案中,所述半胱氨酸残基在L链中。在一些实施方案中,所述半胱氨酸残基在H链中。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物可包含如下的肽接头,它是金黄色葡萄球菌半胱氨酸蛋白酶可切割接头；此类接头包括葡萄球菌蛋白酶(staphopain)B或葡萄球菌蛋白酶A可切割接头。在一个实施方案中,所述金黄色葡萄球菌蛋白酶为内肽酶。在另一个实施方案中,所述接头为宿主蛋白酶可切割接头,优选人蛋白酶组织蛋白酶B可切割接头(例如val-cit二肽接头)。
抗体-抗生素缀合物化合物的一个例示性实施方案具有式:
Ab-(L-abx)p
其中:
Ab为抗壁磷壁酸抗体；
L为肽接头,其具有式:-Str-Pep-Y-,其中Str为延伸物单元,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元；
Abx为利福霉素型抗生素；且
p为1至8的整数。
在一个实施方案中,任何前述抗体-抗生素缀合物化合物包含2或4的抗生素抗体比(AAR)。
在一些实施方案中,所述抗体-抗生素缀合物化合物为式I的:
其中:
虚线表示任选的键；
R为H,C1-C12烷基,或C(O)CH3；
R1为OH；
R2为CH＝N-(杂环基),其中所述杂环基是任选用一或多个独立选自C(O)CH3,C1-C12烷基,C1-C12杂芳基,C2-C20杂环基,C6-C20芳基,和C3-C12碳环基的基团取代的；
或R1和R2形成五或六元稠合杂芳基或杂环基,且任选形成螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环,其中所述螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环是任选用H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,或OH取代的；
L为肽接头,附着至R2或由R1和R2形成的稠合杂芳基或杂环基；且
Ab为抗壁磷壁酸(WTA)抗体。
在这些实施方案的一些中,式I的抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中:
R3独立选自H和C1-C12烷基；
n为1或2；
R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且
Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S。
在这些实施方案的一些中,式I的抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中
R5选自H和C1-C12烷基；且
n为0或1。
在这些实施方案的一些中,式I的抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中
R5选自H和C1-C12烷基；
且n为0或1。
在这些实施方案的一些中,式I的抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中
R5独立选自H和C1-C12烷基；且
n为0或1。
在这些实施方案的一些中,式I的抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中
R3独立选自H和C1-C12烷基；且
n为1或2。
在一些特定实施方案中,式I的抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
在一些实施方案中,提供的是一种抗体-抗生素缀合物(AAC)化合物,其包含本发明的抗壁磷壁酸(WTA)抗体,所述抗体通过肽接头共价附着至利福霉素型抗生素,其中所述肽接头具有式:
-Str-Pep-Y-
其中Str为延伸物单元,共价附着至抗壁磷壁酸(WTA)抗体,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元,共价附着至利福霉素型抗生素。在这些实施方案的一些中,Str具有式:
其中R6选自下组:C1-C10亚烷基-,-C3-C8碳环,-O-(C1-C8烷基)-,-亚芳基-,-C1-C10亚烷基-亚芳基-,-亚芳基-C1-C10亚烷基-,-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-,-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-,-C3-C8杂环-,-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-,-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-,-(CH2CH2O)r-,和-(CH2CH2O)r-CH2-；且r为范围为1至10的整数。在一种变化中,R6为-(CH2)5-。在这些实施方案的一些中,Pep包含2-12个独立选自甘氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,赖氨酸,精氨酸,缬氨酸,和瓜氨酸的氨基酸残基。在一种变化中,Pep选自缬氨酸-瓜氨酸(val-cit,vc)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk)；GGAFAGGG(SEQIDNO:126)；tpm-cit；GPImeLFF(SEQIDNO:129)；缬氨酸-瓜氨酸-苯丙氨酸(val-cit-phe)；GGAFA(SEQIDNO:131)；和LAFG(SEQIDNO:128)。在这些实施方案的一些中,Y包含对氨基苄基或对氨基苄氧羰基。
在一些实施方案中,所述抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中Ab,Str,Y和abx如本文中定义的,且AA1和AA2独立选自氨基酸侧链。在这些实施方案的一些中,所述氨基酸侧链独立选自H,-CH3,-CH2(C6H5),-CH2CH2CH2CH2NH2,-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,-CHCH(CH3)CH3,和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2。在这些实施方案的一些中,所述抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
在这些实施方案的一些中,所述抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
其中R7独立选自H和C1-C12烷基。在这些实施方案的一些中,所述抗体-抗生素缀合物化合物为下式的:
本发明的另一方面是一种药物组合物,其包含本发明的抗体-抗生素缀合物化合物。
本发明的另一方面是一种治疗细菌感染的方法,其通过对患者施用治疗有效量的任何上述实施方案的抗体-抗生素缀合物化合物来进行。在一个实施方案中,所述患者为人。在一个实施方案中,所述细菌感染为金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中,所述患者已经诊断有金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中,治疗细菌感染包含降低细菌载荷。
本发明进一步提供一种杀死金黄色葡萄球菌感染患者的宿主细胞中的细胞内金黄色葡萄球菌但不杀死所述宿主细胞的方法,其通过施用任何上述实施方案的抗WTA-抗生素缀合物化合物来进行。提供另一种用于在体内杀死存留(persister)细菌细胞(例如金黄色葡萄球菌)的方法,其通过使存留细菌与任何前述实施方案的AAC接触来进行。
在另一个实施方案中,所述治疗方法进一步包括施用第二治疗剂。在又一个实施方案中,所述第二治疗剂为抗生素,包括一般针对金黄色葡萄球菌或具体针对MRSA的抗生素。
在一个实施方案中,与本发明的抗体-抗生素缀合物化合物组合施用的第二抗生素选自下述结构类别:(i)氨基糖苷；(ii)β-内酰胺；(iii)大环内酯/环肽；(iv)四环素；(v)氟喹啉/氟喹诺酮；和(vi)唑烷酮。
在一个实施方案中,与本发明的抗体-抗生素缀合物化合物组合施用的第二抗生素选自克林霉素(clindamycin),新生霉素(novobiocin),瑞他莫林(retapamulin),达托霉素(daptomycin),GSK-2140944,CG-400549,西他沙星(sitafloxacin),替考拉宁(teicoplanin),三氯生(triclosan),萘啶酮(napthyridone),雷得唑来(radezolid),多柔比星(doxorubicin),氨苄西林(ampicillin),万古霉素(vancomycin),亚胺培南(imipenem),多利培南(doripenem),吉西他滨(gemcitabine),达巴万星(dalbavancin),和阿奇霉素(azithromycin)。
在本文中的一些实施方案中,受试者中的细菌载荷已经在所述治疗后降低至检测不到的水平。在一个实施方案中,与治疗前的阳性血液培养物相比,治疗后患者的血液培养物是阴性的。在本文中的一些实施方案中,受试者中的细菌抗性是检测不到的或较低的。在本文中的一些实施方案中,受试者不响应甲氧西林或万古霉素的治疗。
本发明的另一方面是一种用于生成本发明的抗体或抗体-抗生素缀合物化合物的方法,其包括将利福霉素型抗生素缀合至抗壁磷壁酸(WTA)抗体。
本发明的另一方面是一种用于治疗细菌感染的试剂盒,其包含本发明的药物组合物和使用说明书。
本发明的另一方面是一种接头-抗生素中间体,其具有式II:
其中:
虚线表示任选的键；
R为H,C1-C12烷基,或C(O)CH3；
R1为OH；
R2为CH＝N-(杂环基),其中所述杂环基是任选用一或多个独立选自C(O)CH3,C1-C12烷基,C1-C12杂芳基,C2-C20杂环基,C6-C20芳基,和C3-C12碳环基的基团取代的；
或R1和R2形成五或六元稠合杂芳基或杂环基,且任选形成螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环,其中所述螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环是任选用H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,或OH取代的；
L为肽接头,附着至R2或由R1和R2形成的稠合杂芳基或杂环基；且具有式:-Str-Pep-Y-,其中Str为延伸物单元,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元；且
X为选自马来酰亚胺,硫醇,氨基,溴化物,溴乙酰胺基,碘乙酰胺基,对甲苯磺酸酯,碘化物,羟基,羧基,吡啶基二硫化物,和N-羟基琥珀酰亚胺的反应性官能团。
在式II的接头-抗生素中间体的一些实施方案中,X为
在一些实施方案中,式II的接头-抗生素中间体具有式:
其中
R3独立选自H和C1-C12烷基；
n为1或2；
R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且
Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S。
在这些实施方案的一些中,式II的接头-抗生素中间体具有式:
还提供的是一种杀死金黄色葡萄球菌感染患者的宿主细胞中的细胞内金黄色葡萄球菌但不杀死所述宿主细胞的方法,其包括施用本文中详述的抗WTA-抗生素缀合物。
要理解,可以组合本文中描述的各种实施方案的一种,一些,或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员会变得清楚明白。
附图简述
图1显示暴露于万古霉素或利福平逐渐杀死MRSA。万古霉素是以2μg/mL(空心正方形)和20μg/mL(实心正方形)测试的。利福平是以0.02μg/mL(空心三角形)和0.2μg/mL(实心三角形)测试的。
图2显示在万古霉素存在下受到感染的腹膜细胞能够将感染转移至成骨细胞。
图3显示革兰氏阳性细菌(诸如金黄色葡萄球菌)的细胞壁,有稳定细胞膜和提供附着位点的壁磷壁酸(WTA),脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN)鞘的卡通呈现。
图4显示壁磷壁酸(WTA)的化学结构和糖基修饰,在定义下详细描述。
图5显示抗体-抗生素缀合物(AAC)的药物活化的一种可能机制。AAC在哺乳动物细胞内部内在化后释放活性抗生素(Abx)。
图6A和6B汇总自单抗文库初级筛选对来自USA300或Wood46株金黄色葡萄球菌株的细胞壁制备物显示阳性ELISA结合的抗体的特征,如实施例21中描述的。在结合WTA的抗体中,4种是对WTAα特异性的,13种特异性结合WTAβ。
图7A显示一种体外巨噬细胞测定法,证明AAC杀死细胞内MRSA。
图7B显示与裸的,未缀合的抗WTA抗体S4497相比,50μg/mLthio-S4497-HC-A118C-pipBOR102在巨噬细胞,成骨细胞(MG63),气道上皮细胞(A549),和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)中对MRSA(USA300株)的细胞内杀伤。虚线指示测定法的检测极限。
图7C显示用接头-抗生素中间体LA-51和LA-54(表2)生成的AAC的比较。用单独的S4497抗体或以范围为10μg/mL至.003μg/mL的多种浓度用AAC:AAC-102或AAC-105(表3)调理MRSA。
图7D显示AAC杀死细胞内细菌但不损害巨噬细胞。
图7E显示自上文巨噬细胞细胞裂解,自巨噬细胞内部回收活的USA300。与用裸抗体处理的对照相比,自感染有用S-4497-AAC调理的细菌的巨噬细胞回收更少的(少10,000倍)活的金黄色葡萄球菌。
图8A显示thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102AAC在A/J小鼠中的腹膜内感染模型中的体内功效。通过腹膜内注射用MRSA感染小鼠,并通过腹膜内注射用单独的50mg/KgS4497抗体或50mg/Kg102AAC(HC-A114CKabat＝HC-A118CEU)处理。感染后2天处死小鼠,并评估腹膜上清液(细胞外细菌),腹膜细胞(细胞内细菌)或肾中的总细菌载荷。
图8B显示A/J小鼠中的静脉内体内感染模型。通过静脉内注射用MRSA感染小鼠,并用50mg/KgS4497抗体,50mg/Kgthio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102AAC或50mg/KgS4497抗体+.5mg/Kg游离利福霉素的简单混合物处理。灰色虚线指示每种器官的检测极限。
图9A显示thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102AAC在静脉内感染模型中的功效,通过滴定S4497-pipBORAAC。
图9B显示在静脉内感染模型中thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105AAC比thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102AAC更加有效,通过滴定。感染后30分钟以指定剂量施用S4497抗体,102AAC或thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基-pipBOR112AAC的处理。感染后4天处死小鼠,并通过涂板来测定每只小鼠的存活细菌的总数(合并2个肾)。
图9C显示在静脉内感染模型中thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105AAC比单独的S4497抗体或二甲基pipBOR7抗生素更加有效。通过静脉内注射用2x107CFUMRSA感染CB17.SCID小鼠。感染后1天,用50mg/KgS4497抗体,50mg/KgAAC105或0.5mg/Kg二甲基-pipBOR7(50mg/KgAAC中含有的抗生素的等效剂量)处理小鼠。感染后4天处死小鼠,并通过涂板来测定每只小鼠的存活细菌的总数(合并2个肾)。
图10A显示人血清中抗金黄色葡萄球菌抗体的流行度。金黄色葡萄球菌感染患者或正常对照含有大量的WTA特异性血清抗体,它具有与抗WTAS4497相同的特异性。较之对MRSA株TarM/TarSDKO(双重敲除)突变体(它缺少受S4497抗体识别的糖修饰)的结合,检查多种野生型(WT)血清样品对表达S4497抗原的MRSA的结合。
图10B显示在体外巨噬细胞测定法中在生理水平的人IgG(10mg/mL)存在下AAC对MRSA的USA300株是有效的。thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105在10mg/mL人IgG存在下是有效的。用单独的AAC或在10mg/mL人IgG中稀释的AAC调理MRSA的USA300株。感染后2天评估存活细胞内细菌的总数。
图10C显示一种体内感染模型,证明AAC在生理水平的人IgG存在下是有效的。组合的数据来自使用两种不同制备物thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105或112AAC进行的3项独立实验。用AAC处理的小鼠具有大于4-log的细菌载荷降低(Studentst检验p＝.0005)。
图11A显示一种体内感染模型,证明在用正常水平的人IgG重建的小鼠中AAC比当前的标准护理(SOC)抗生素万古霉素更加有效。用S4497抗体(50mg/Kg),万古霉素(100mg/Kg),thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105AAC(50mg/Kg),或用不识别MRSA的同种型对照抗体生成的AAC,thio-hu-抗gD5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR110AAC(50mg/Kg)处理小鼠。
图11B显示抗金黄色葡萄球菌抗体对自体内感染模型中的肾分离的USA300株的相对结合,如通过FACS测定的。S4497抗体识别金黄色葡萄球菌的细胞壁上经β-异头键连接至壁磷壁酸(WTA)的一种N-乙酰基葡萄糖胺修饰。S7578抗体结合经α-异头键连接至WTA的一种相似的N-乙酰基葡萄糖胺修饰。rF1抗体是识别在含有SDR重复的细胞壁锚定蛋白的一个家族上找到的糖修饰的阳性对照抗MRSA抗体。gD抗体是不识别金黄色葡萄球菌的阴性对照人IgG1。
图11C显示一种体内感染模型,证明在用正常水平的人IgG重建的小鼠中AAC,thio-S6078-HCA114C-LCWT-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR129比裸的抗WTA抗体S4497更加有效,依照与图11A相同的摄生法。用S4497抗体(50mg/Kg)或thio-S6078-HCA114C-LCWT-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR129AAC(50mg/Kg)处理小鼠。
图12显示一种生长抑制测定法,证明AAC对金黄色葡萄球菌无毒,除非接头受到组织蛋白酶B切割。左边显示一种示意性组织蛋白酶释放测定法(实施例20)。用组织蛋白酶B处理AAC以释放游离的抗生素。通过制备所得反应的连续稀释液并测定AAC能够抑制金黄色葡萄球菌生长的最小剂量,测定完整的较之用组织蛋白酶B处理的AAC的抗生素活性的总量。右上线图显示thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102的组织蛋白酶释放测定法,而右下线图显示thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105的组织蛋白酶释放测定法。
图13A显示四种人抗WTAα抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列比对(依出现次序分别为SEQIDNO:25,27,29和31)。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRL1,L2和L3标有下划线。
图13B显示图13A的四种人抗WTAα抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列比对。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRH1,H2和H3标有下划线(依出现次序分别为SEQIDNO:26,28,30和32)。
图14显示13种人抗WTAβ抗体的L和H链的CDR序列(SEQIDNO:33-110)。
图15A-1和15A-2显示抗WTAβ抗体6078(未修饰的)和它的变体v2,v3,v4的全长L链(轻链)的比对(依出现次序分别为SEQIDNO:113,113,115,113,115,113,115和115)。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRL1,L2和L3标有下划线。框显示接触残基和依照Kabat和Chothia的CDR残基。含有改造的Cys的L链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在这种情况中在EU残基编号205处)。关于变体命名,例如,v2LC-Cys表示含有改造入L链的Cys的变体2。HCLC-Cys表示H和L链各自含有改造的Cys。变体2,3和4具有H链开始中的改变,如图15B中所示。
图15B-1,15B-2,15B-3,15B-4显示抗WTAβ抗体6078(未修饰的)和它的变体v2,v3,v4(它们具有H链开始中的改变)的全长H链(重链)的比对(依出现次序分别为SEQIDNO:114,139-144和143)。含有改造的Cys的H链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在这种情况中在EU残基编号118处)。
图16A-1和16A-2显示抗WTAβ抗体4497(未修饰的)和Cys改造的L链的全长L链的比对(依出现次序分别为SEQIDNO:121,123,145和145)。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRL1,L2和L3标有下划线。框显示接触残基和依照Kabat和Chothia的CDR残基。含有改造的Cys的L链变体以恒定区结束附近的点框中的C指示(在这种情况中在EU残基编号205处)。
图16B-1,16B-2,16B-3显示抗WTAβ抗体4497(未修饰的)和它的有或无改造的Cys的v8变体(CDRH3位置96中的D变成E)的全长H链的比对(依出现次序分别为SEQIDNO:146-147,157和147)。含有改造的Cys的H链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在这种情况中在EU残基编号118处)。
图17A-1,17A-2,17A-3显示13种人抗WTAβ抗体的全长轻链的氨基酸序列比对(依出现次序分别为SEQIDNO:113,158-167,121和168)。可变区(VL)跨越Kabat氨基酸位置1至107。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRL1,L2和L3标有下划线。
图17B-1至17B-6显示图17A-1,17A-2,17A-3的13种人抗WTAβ抗体的全长重链的氨基酸序列比对(依出现次序分别为SEQIDNO:114,169-176,133-134,138和127)。可变区(VH)跨越Kabat氨基酸位置1-113。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRH1,H2和H3标有下划线。以星号标注的H链Eu位置118可以变成Cys用于药物缀合。以黑色突显的残基可以用不影响抗原结合的其它残基替换以避免脱酰胺,天冬氨酸异构化,氧化或N连接的糖基化。
图18A显示抗体4497突变体对金黄色葡萄球菌细胞壁的结合,如通过ELISA分析的。
图18B显示抗体4497和它的突变体(依出现次序分别为SEQIDNO:177,177,177-178,178-179,179-180,180和180)在突显的氨基酸位置和它们的相对抗原结合强度(如通过ELISA测试的)方面的比较。
图19显示抗体6078WT和突变体结合USA300的蛋白A缺陷株(USA300-SPA)的FACS分析的结果,如实施例23中描述的。突变体显示未受损的对金黄色葡萄球菌的结合。
图20显示50mg/kg游离抗体预处理在静脉内感染模型中无效。用2x107CFUUSA300感染前30分钟通过静脉内注射对Balb/c小鼠给予单剂媒介对照(PBS)或50mg/Kg抗体。处理组包括不结合金黄色葡萄球菌的同种型对照抗体(gD),针对壁磷壁酸β修饰的抗体(4497)或针对壁磷壁酸α修饰的抗体(7578)。每天两次通过腹膜内注射对对照小鼠给予110mg/Kg万古霉素处理(万古霉素)。
图21和图22显示针对壁磷壁酸β修饰或壁磷壁酸α修饰任一的AAC在使用用正常水平的人IgG重建的小鼠的静脉内感染模型中是有效的。用人IgG重建CB17.SCID小鼠,其中使用经过优化的剂量给药摄生法以在血清中产生恒定水平的至少10mg/mL人IgG,并通过静脉内注射用2x107CFUUSA300感染。感染后1天用仅缓冲液对照(PBS),60mg/Kgβ-WTAAAC(136AAC)或60mg/Kgα-WTAAAC(155AAC)启动处理。
图23A和图23B显示自2-硝基苯-1,3-二醇1合成接头-抗生素中间体51。
图24显示自TBS保护的苯并嗪并利福霉素4合成接头-抗生素中间体,MC-vc-PAB-二甲基pipBOR54。
图25A和图25B显示自(5-氟-2-硝基-1,3-亚苯基)二(氧)二(亚甲基)二苯9合成二甲基pipBOR7。
图26显示用于切割验证的FRET肽底物mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK(荧光素)(SEQIDNO:125)的结构,它含有根据REPLi蛋白酶活性筛选在P1,P2,和P3中最丰富的残基。保留来自REPLiFRET肽结构的侧翼Gly残基。N端上的硫醇反应性马来酰亚胺基团容许缀合至具有反应性半胱氨酸的抗体。在切割FRET肽后,淬灭效应丧失且观察到荧光的升高。
图27显示thioFABS4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR)(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)的结构,它是一种用于鉴定含有感兴趣蛋白酶的活性级分的工具化合物。将Mal-GGAFAGGG-DNA31(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)缀合至THIOFAB4497。THIOFAB含有一个反应性半胱氨酸。金黄色葡萄球菌蛋白酶切割Ala的C端的接头,释放Gly-Gly-Gly-(pipBOR)。
图28和图29显示当缀合至结合金黄色葡萄球菌的抗体(thio-S4497)时,Mal-K(tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(SEQIDNO:125)AAC在Wood46(图28)和USA300(图29)二者中受到切割；而当缀合至不结合金黄色葡萄球菌的抗体(thio-曲妥珠单抗)时不然。随时间测量与Wood46和USA300MRSA的对数期培养物一起温育的thioMAB4497mal-K(tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(SEQIDNO:125)的荧光强度。自图26的mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK(荧光素)(SEQIDNO:125)生成的thioMAB4497FRET肽缀合物在两种株中均显示荧光升高,指示实验接头受到金黄色葡萄球菌蛋白酶切割且MRSA的临床有关株USA300中存在该蛋白酶(图29)。细胞密度影响切割速率,更高细胞密度(108细胞/ml)的培养物中更早发生切割。同种型对照缀合物(thio-曲妥珠单抗)在任何条件中没有显示荧光升高。
图30显示两种为AAC中的葡萄球菌蛋白酶B切割经过优化的接头。接头为葡萄球菌蛋白酶B切割经过优化,包括P4和P1’的残基偏爱。使用来自REPLi筛选的数据设计接头。将QSY7添加至每种接头的C端以作为抗生素替代物起作用。
图31显示来自巨噬细胞测定法的结果,证明葡萄球菌蛋白酶可切割的AAC能够杀死细胞内细菌。将金黄色葡萄球菌的USA300株与单独的多种剂量(100μg/mL,10μg/mL,1μg/mL或0.1μg/mL)的S4497抗体,thio-S4497HCWT(v8),LCV205C-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC-192或thio-S4497HCv1-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)AAC-193一起温育以允许AAC结合细菌(图31)。温育1小时后,将经过调理的细菌补料至鼠巨噬细胞,并于37℃温育2小时以允许吞噬。吞噬完成后,用补充有50ug/mL庆大霉素的正常生长培养基替换感染混合物以杀死任何剩余细胞外细菌,并在2天后通过将巨噬细胞裂解物的连续稀释液在胰胨豆胨琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的总数。葡萄球菌蛋白酶可切割的AAC能够以与组织蛋白酶B可切割的AAC相比相似的效力杀死细胞内USA300。灰色虚线指示测定法的检测极限(10CFU/孔)。
图32显示来自巨噬细胞测定法的结果,证明葡萄球菌蛋白酶可切割的AAC能够杀死细胞内细菌。AAC经由抗体的抗原特异性结合将抗生素杀伤靶向金黄色葡萄球菌。选择金黄色葡萄球菌的Wood46株用于这项实验,因为它不表达蛋白A(一种结合IgG抗体Fc区的分子)。将金黄色葡萄球菌的Wood46株与10μg/mL或0.5μg/mLS4497抗体,含有组织蛋白酶B可切割接头的同种型对照-AACthio-曲妥珠单抗HCA118C-MC-vc-PAB-(二甲基-pipBOR)AAC-101,thio-S4497HCWT(v8),LCV205C-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC-192,含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的同种型对照-AACthio-曲妥珠单抗HCA118C-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”),或thio-S4497HCv1-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)AAC-193一起温育1小时以允许AAC结合细菌。为了限制AAC的非特异性结合,将经过调理的细菌离心,清洗一次,并在缓冲液中重悬浮,之后补料至鼠巨噬细胞。吞噬完成后,用补充有50μg/mL庆大霉素的正常生长培养基替换感染混合物以杀死任何剩余细胞外细菌,并在2天后通过将巨噬细胞裂解物的连续稀释液在胰胨豆胨琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的总数。含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的4497-AAC能够杀死所有检测得到的细胞内细菌,而同种型对照AAC显示没有活性。
图33和34显示葡萄球菌蛋白酶AAC在体内在鼠静脉内感染模型中有活性。用人IgG重建CB17.SCID小鼠,其中使用经过优化的剂量给药摄生法以在血清中产生恒定水平的至少10mg/mL人IgG。用4497抗体(50mg/kg),具有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的AAC-215(50mg/kg),或含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的同种型对照,抗gDAAC(50mg/kg)处理小鼠。在感染后第1天通过静脉内注射对小鼠给予单剂AAC-215。通过涂板来测定2个肾中(图33)或心中(图34)存活细菌的总数。
图35和36显示来自体外巨噬细胞测定法的thio-S6078AAC的结果。在图35中,thio-S6078.v4.HC-WT,LC-Cys-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC在处于或高于0.5μg/mL的剂量有效杀死细胞内细菌,抗生素载荷为2.0(AAC-173)或3.9(AAC-171)个二甲基pipBOR抗生素(LA-54)每个thio-S6078抗体。在图36中,thio-S6078.v4.HC-WT,LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR)在处于或高于0.5μg/mL的剂量有效杀死细胞内细菌,抗生素载荷为1.8(AAC-174)或3.9(AAC-172)个piperazBOR抗生素(LA-65)每个thio-S6078抗体。
图37和38显示在鼠静脉内感染模型中thio-S6078AAC的体内功效的结果。用人IgG重建CB17.SCID小鼠,其中使用经过优化的剂量给药摄生法以在血清中产生恒定水平的至少10mg/mL人IgG。用USA300感染小鼠,并用媒介对照(PBS),thio-S6078.v4.HC-WT,LC-Cys-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC(抗生素载荷为2.0(AAC-173)或3.9(AAC-171)个二甲基pipBOR抗生素(LA-54)每个thio-S6078抗体)(图37)和thio-S6078.v4.HC-WT,LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR)(抗生素载荷为1.8(AAC-174)或3.9(AAC-172)个piperazBOR抗生素(LA-65)每个thio-S6078抗体)(图38)处理。感染后第1天通过静脉内注射对小鼠给予单剂AAC,并在感染后第4天处死。通过涂板来测定2个肾中存活细菌的总数。用含有更低抗生素载荷的AAC处理将细菌负荷降低大约1,000倍,而用含有更高抗生素载荷的AAC处理将细菌负荷降低超过10,000倍。
发明详述
现在会详细提到本发明的某些实施方案,它们的例子以所附结构和式例示。虽然会结合列举的实施方案(包括方法,材料和例子)来描述本发明,但是此类描述并非限制性的,而且本发明意图涵盖所有备选,变更,和等同,无论它们是否是普遍知道的或收入本文的。在一或多篇收录的文献,专利,和类似材料与本申请不同或矛盾的情况中,包括但不限于定义的术语,术语使用,描述的技术,等等,以本申请为准。除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的常规理解相同的含义。本领域技术人员会认识与本文所述方法和材料相似或等同的许多方法和材料,它们可用于实施本发明。本发明绝非限于所描述的方法和材料。
通过援引完整收录本文中提到的所有出版物,专利申请,专利,和其它参考文献。
I.通用技术
本文中描述或提述的技术和规程是本领域技术人员普遍较好理解且使用常规方法常常采用的,诸如例如下述出版物中记载的广泛利用的方法:Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual3dedition(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel,etal.eds.,(2003))；theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.):PCR2:APracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.HamesandG.R.Tayloreds.(1995)),HarlowandLane,eds.(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,andAnimalCellCulture(R.I.Freshney,ed.(1987))；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；MethodsinMolecularBiology,HumanaPress；CellBiology:ALaboratoryNotebook(J.E.Cellis,ed.,1998)AcademicPress；AnimalCellCulture(R.I.Freshney,ed.,1987)；IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.MatherandP.E.Roberts,1998)PlenumPress；CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,andD.G.Newell,eds.,1993-8)J.WileyandSons；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.MillerandM.P.Calos,eds.,1987)；PCR:ThePolymeraseChainReaction(Mullisetal.,eds.,1994)；CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coliganetal.,eds.,1991)；ShortProtocolsinMolecularBiology(WileyandSons,1999)；Immunobiology(C.A.JanewayandP.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APracticalApproach(D.Catty.,ed.,IRLPress,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:APracticalApproach(P.ShepherdandC.Dean,eds.,OxfordUniversityPress,2000)；UsingAntibodies:ALaboratoryManual(E.HarlowandD.Lane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999)；TheAntibodies(M.ZanettiandJ.D.Capra,eds.,HarwoodAcademicPublishers,1995)；和Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology(V.T.DeVitaetal.,eds.,J.B.LippincottCompany,1993)。
本申请中使用的命名法基于IUPAC系统命名法,除非另外指明。除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的常规理解相同的含义,而且与Singletonetal.(1994)DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,2ndEd.,J.Wiley&Sons,NewYork,NY和Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immunobiology,5thEd.,GarlandPublishing,NewYork一致。
II.定义
在指出取代基的数目时,术语“一或多个”指自1个取代基至最高可能数目的取代的范围,即用取代基替换1个氢直至替换所有氢。术语“取代基”表示替换亲本分子上的一个氢原子的一个或一组原子。术语“取代的”表示指定基团携带一或多个取代基。在任何基团可携带多个取代基且提供多种可能取代基的情况中,取代基是独立选择的且不需要是相同的。术语“未取代的”表示指定基团不携带取代基。术语“任选取代的”表示指定基团是未取代的或用一或多个独立选自可能取代基的取代基取代的。在指出取代基的数目时,术语“一或多个”表示自1个取代基至最高可能数目的取代,即用取代基替换1个氢直至替换所有氢。
术语“壁磷壁酸”(WTA)表示经对N-乙酰基胞壁酸糖C6羟基的磷酸二酯连接共价附着至肽聚糖的阴离子含糖聚合物。虽然精确化学结构可以在生物体间变化,但是在一个实施方案中,WTA为核糖醇磷壁酸,其具有重复单元D-核糖醇的1,5-磷酸二酯连接和2位上的D-丙氨酰酯和4位上的糖基取代基。糖基基团可以是N-乙酰基葡萄糖胺基α(阿尔法)或β(贝塔),如金黄色葡萄球菌中存在的。醛醇/糖醇磷酸酯重复上的羟基是用阳离子D-丙氨酸酯和单糖(诸如N-乙酰基葡萄糖胺)取代的。一方面,羟基取代基包括D-丙氨酰和阿尔法(α)或贝塔(β)GlcNHAc。在一个具体方面,WTA包含下式的化合物:
其中波浪线表示重复连接单元或多醛醇-P或肽聚糖的附着位点,其中X为D-丙氨酰或-H；且Y为α(阿尔法)-GlcNHAc或β(贝塔)-GlcNHAc。
在金黄色葡萄球菌中,WTA经由N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)-1-P和N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)构成的二糖,接着是2或3个磷酸甘油酯单元共价连接至N-乙酰基胞壁酸(MurNAc)的6-OH。然后,实际的WTA聚合物由11-40个磷酸核糖醇酯(Rbo-P)重复单元构成。WTA的逐步合成首先由称作TagO的酶启动,而缺少TagO基因(通过人工删除该基因)的金黄色葡萄球菌株不生成任何WTA。重复单元可以经α-(阿尔法)或β-(贝塔)糖苷连接用D-丙氨酸(D-Ala)在C2-OH处和/或用N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)在C4-OH位置处进一步剪裁。根据金黄色葡萄球菌株或细菌的生长阶段,糖苷连接可以是α-,β-,或两种异头物的混合物。
术语“抗生素”(abx或Abx)包括特异性抑制微生物(诸如细菌)生长或杀死微生物(诸如细菌),但是在施用的浓度和给药间隔对宿主不致死的任何分子。在一个具体方面,抗生素在施用的浓度和给药间隔对宿主无毒。针对细菌有效的抗生素可以宽泛地分类为杀菌的(即直接杀死)或抑菌的(即阻止分裂)。抗杀菌抗生素可进一步细分为窄谱的或广谱的。广谱抗生素有效针对宽范围的细菌,包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌二者,相反,窄谱抗生素有效针对较小范围或特定科(families)的细菌。抗生素的例子包括:(i)氨基糖苷类,例如阿米卡星,艮他霉素/庆大霉素,卡那霉素,新霉素,奈替米星,链霉素,妥布拉霉素/妥布霉素,巴龙霉素,(ii)安沙霉素类,例如格尔德霉素,除莠霉素,(iii)碳头孢烯类,例如氯碳头孢,(iv),碳青霉烯类,例如厄他培南,多利培南,亚胺培南/西司他丁,美罗培南,(v)头孢菌素类(第一代),例如头孢羟氨苄,头孢唑林,头孢噻吩,头孢氨苄,(vi)头孢菌素类(第二代),例如头孢克洛,头孢孟多,头孢西丁,头孢丙烯,头孢呋辛,(vi)头孢菌素类(第三代),例如头孢克肟,头孢地尼,头孢托仑,头孢哌酮,头孢噻肟,头孢泊肟,头孢他啶,头孢布烯,头孢唑肟,头孢曲松,(vii)头孢菌素类(第四代),例如头孢吡肟,(viii),头孢菌素类(第五代),例如头孢托罗,(ix)糖肽类,例如替考拉宁,万古霉素,(x)大环内酯类,例如阿奇霉素,克拉霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,泰利霉素,大观霉素,(xi)单环β-内酰胺类,例如氨曲南,(xii)青霉素类,例如阿莫西林,氨苄西林,阿洛西林,羧苄西林,氯唑西林,双氯西林,氟氯西林,美洛西林,甲氧西林,萘夫西林,苯唑西林,盘尼西林,哌拉西林,替卡西林,(xiii)抗生多肽类,例如杆菌肽,粘菌素/可立其丁,多粘菌素B,(xiv)喹诺酮类,例如环丙沙星,依诺沙星,加替沙星,左氧氟沙星,洛美沙星,莫西沙星,诺氟沙星,氧氟沙星,曲伐沙星,(xv)磺胺类,例如磺胺米隆,百浪多息,磺胺醋酰,磺胺甲二唑,磺胺,柳氮磺吡啶,磺胺异唑,甲氧苄啶,甲氧苄啶-磺胺甲唑(TMP-SMX),(xvi)四环素类,例如地美环素,多西环素,米诺霉素,氧四环素/土霉素,四环素,和(xvii)其它,诸如胂凡纳明,氯霉素,克林霉素,林可霉素,乙胺丁醇,磷霉素,夫西地酸,呋喃唑酮,异烟肼,利奈唑胺,甲硝唑,莫匹罗星,呋喃妥因,平板霉素,吡嗪酰胺,奎奴普丁/达福普汀,力复平/利福平或替硝唑。
如本文中使用的,术语“WTA抗体”指结合WTA(无论WTAα或WTAβ)的任何抗体。术语“抗壁磷壁酸α抗体”或“抗WTAα抗体”或“抗αWTA”或“抗αGlcNacWTA抗体”可互换使用,指特异性结合壁磷壁酸(WTA)α的抗体。类似地,术语“抗壁磷壁酸β抗体”或“抗WTAβ抗体”或“抗βWTA”或“抗βGlcNacWTA抗体”可互换使用,指特异性结合壁磷壁酸(WTA)β的抗体。术语“抗葡萄球菌抗体”和“结合葡萄球菌的抗体”指能够以足够亲和力结合金黄色葡萄球菌(“Staph”或“S.aureus”)上的抗原,使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向葡萄球菌的抗体。在一个实施方案中,根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量,抗葡萄球菌抗体结合无关的,非葡萄球菌蛋白质的程度小于该抗体对MRSA的结合的约10％。在某些实施方案中,结合葡萄球菌的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤5nM,≤4nM,≤3nM,≤2nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M到10-13M,例如10-9M到10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗葡萄球菌抗体结合在来自不同物种的葡萄球菌中保守的葡萄球菌表位。
术语“甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌”(MRSA),或者称作多药抗性金黄色葡萄球菌或苯唑西林抗性金黄色葡萄球菌(ORSA),指对β-内酰胺抗生素,包括青霉素(例如甲氧西林,双氯西林,萘夫西林,苯唑西林,等)和头孢菌素有抗性的任何金黄色葡萄球菌株。“甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌”(MSSA)指对β-内酰胺抗生素敏感的任何金黄色葡萄球菌株。
术语“最小抑制浓度”(“MIC”)指抗微生物药会在温育过夜后抑制微生物可见生长的最低浓度。用于测定MIC的测定法是已知的。下文实施例18中描述一种方法。
本文中的术语“抗体”以最广义使用,并且具体涵盖单克隆抗体,多克隆抗体,二聚体,多聚体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和其抗原结合性抗体片段(Milleretal.(2003)J.ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠的,人的,人源化的,嵌合的,或衍生自其它物种的。抗体是由免疫系统生成的能够识别和结合特定抗原的蛋白质(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd.,GarlandPublishing,NewYork)。靶抗原一般具有众多结合位点,也称作表位,它们受到多种抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此,一种抗原可以受到超过一种相应抗体的识别和结合。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫学活性部分,即含有免疫特异性结合感兴趣靶或其部分的抗原的抗原结合位点的分子,此类靶包括但不限于癌细胞或生成与自身免疫病有关的自身免疫抗体的细胞,受到感染的细胞或微生物(诸如细菌)。本文中公开的免疫球蛋白(Ig)可以是除IgM以外的任何同种型(例如IgG,IgE,IgD,和IgA)和亚类(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)的。免疫球蛋白可衍生自任何物种。在一个方面,Ig是人,鼠,或家兔起源的。在一个具体实施方案中,Ig是人起源的。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型),例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白,由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端,每条重链具有一个可变区(VH),又称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3)。类似地,从N至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),又称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列,抗体轻链可归入两种类型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
抗体的“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在用于本文时,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位,除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外(例如糖基化的天然变异),此类变体一般以极小量存在。IgG1抗体的一种此类可能变体是对重链恒定区C末端赖氨酸(K)的切割。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性,而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。在它们的特异性之外,单克隆抗体的优势在于它们可以在未受到其它抗体污染的情况中合成。
术语“嵌合抗体”指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化抗体”指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个基本上整个如下的可变域,其中所有或基本上所有HVR(例如,CDR)对应于非人抗体的那些,且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地,人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(见例如Kindt等,KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外,可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如,Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
术语“高变区”,“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的区域。通常,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。在天然抗体中,H3和L3展示这六个HVR的最大多样性,而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xuetal.,Immunity13:37-45(2000)；JohnsonandWu,In:MethodsinMolecularBiology248:1-25(Lo,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,2003)。事实上,仅由重链组成的天然存在骆驼(camelid)抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的(Hamers-Castermanetal.(1993)Nature363:446-448；Sheriffetal.(1996)NatureStruct.Biol.3:733-736)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的,而且是最常用的(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(ChothiaandLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。关于抗原接触,参见MacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)。AbMHVR代表KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷,而且得到OxfordMolecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
HVR可包括如下“延伸的HVR”:VL中的24-36或24-34(L1),46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1),50-65或49-65(H2)和93-102,94-102或95-102(H3)。除非另外指明,HVR残基,CDR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是依照Kabat等,见上文编号的。
表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabatetal.,见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域汇编的编号系统。使用此编号系统,实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸,对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如,重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a,82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地,可变域的FR由4个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文中的目的,“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列,或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常,序列亚组是如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,亚组是如Kabat等,见上文中的亚组κI。在一个实施方案中,对于VH,亚组是如Kabat等,见上文中的亚组III。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中所描述的方法。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体,与不拥有此类改变的亲本抗体相比,此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
术语“表位”指抗原分子上受到抗体结合的特定位点。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体,且相反,参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞,嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞,随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞,而且是通过此机制杀死靶细胞所要求的。介导ADCC的主要细胞,NK细胞,只表达Fcγ(伽马)RIII,而单核细胞表达Fcγ(伽马)RI,Fcγ(伽马)RII和Fcγ(伽马)RIII。RavetchandKinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如US5,500,362或US5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynesetal.,PNASUSA95:652-656(1998)中所披露的。
“吞噬”指病原体被宿主细胞(例如巨噬细胞或嗜中性细胞)吞没或内在化的过程。吞噬细胞通过三种途径介导吞噬:(i)直接细胞表面受体(例如凝集素,整联蛋白和清除受体)；(ii)补体增强的–利用补体受体(包括CRI,C3b,CR3和CR4的受体)来结合和摄食经过补体调理的病原体；和(iii)抗体增强的–利用Fc受体(包括Fcγ(伽马)RI,Fcγ(伽马)RIIA和Fcγ(伽马)RIIIA)来结合经过抗体调理的颗粒,它们然后变成内在化和与溶酶体融合,从而变成吞噬溶酶体。在本发明中认为途径(iii)在将抗MRSAAAC治疗剂投递至受到感染的白细胞(例如嗜中性细胞和巨噬细胞)中发挥重要作用(PhagocytosisofMicrobes:complexityinActionbyD.UnderhillandAOzinsky.(2002)AnnualReviewofImmunology,Vol20:825)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447,依照EU编号系统--也称作EU索引,如Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中描述的)可以消除,例如在生产或纯化抗体的过程中,或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而,完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被消除的抗体群,无一K447残基被消除的抗体群,或者混合了有和无K447残基的抗体的抗体群。术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体,FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyeretal.,J.Immunol.117:587(1976)和Kimetal.,J.Immunol.24:249(1994))。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如GhetieandWard,ImmunolToday18(12):592-8(1997)；Ghetieetal.,NatureBiotechnology,15(7):637-40(1997)；Hintonetal.,J.Biol.Chem279(8):6213-6(2004)；和WO2004/92219(Hintonetal.))。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与FcRn的体内结合和血清半衰期,例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中,或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO2004/42072(Presta)记载了对FcR的结合得到改良或消除的抗体变体。还可参见例如Shieldsetal.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
可改变附着于Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的,双触角的寡糖,其一般通过N-连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wrightetal.(1997)TIBTECH15:26-32。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可以对IgG中的寡糖进行修饰以创建具有某些额外改善特性的IgG。例如,提供了有缺乏岩藻糖的碳水化合物结构(直接地或间接地)附着于Fc区的抗体修饰。此类修饰可具有改善的ADCC功能。参见例如US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体修饰的出版物的例子包括:US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazakietal.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnukietal.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripkaetal.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请公开文本号2003/0157108Al,Presta,L；和WO2004/056312Al,Adamsetal.,尤其是实施例11)和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnukietal.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.etal.,Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
“分离的抗体”指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％的纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,见例如Flatmanetal.,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的核酸”指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子,但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗WTAβ抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链的一种或多种核酸分子,包括单一的载体或分开的载体中的此类核酸分子,和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的,术语“特异性结合”或“对…...特异性的”指可测量且可再现的相互作用,诸如靶物和抗体之间的结合,其确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如,特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力,亲合力,更容易,和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。在一个实施方案中,抗体结合与WTAβ无关的靶物的程度小于抗体结合此靶物的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,特异性结合WTAβ的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗体特异性结合在不同物种间保守的表位。在另一个实施方案中,特异性结合可以包括但不需要排他结合。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,在用于本文时,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离,而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法,其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了关于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
在一个实施方案中,依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下,用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab,然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen,etal.(1999)JMolBiol293:865-881)。为了确定测定条件,用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被微量滴定板(DYNEXTechnologies,Inc.)过夜,随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Prestaetal.,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体,Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而,温育可持续更长时间(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后,将混合物转移至捕捉板以进行室温温育(例如1小时)。然后除去溶液,并用含0.1％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS洗板8次。平板干燥后,加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard),然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一实施方案,Kd是通过表面等离振子共振测定法使用-2000或-3000仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之,依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量,在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(EvaluationSoftwareversion3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chenetal.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法,结合速率超过106M-1s-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(astop-flowequippedspectrophometer)(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下,测量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通)的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”(on-rate,rateofassociation,associationrate)或“kon”也可如上所述使用-2000或-3000系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用,并且指已经导入有外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同,而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
如本文中使用的,术语“载体”指能够扩增与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数,包括对所比较序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而,为了本发明的目的,％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机软件由Genentech公司编写,而且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559),并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可以自Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码汇编。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,包括数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:分数X/Y乘100,其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数,且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会,若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等,则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照所述获得的。
术语“利福霉素型抗生素”表示具有利福霉素的结构或与利福霉素相似的结构的一类或一组抗生素。
术语“利福拉齐型抗生素”表示具有利福拉齐的结构或与利福拉齐相似的结构的一类或一组抗生素。
在指出取代基的数目时,术语“一或多个”指自1个取代基至最高可能数目的取代的范围,即用取代基替换1个氢直至替换所有氢。术语“取代基”表示替换亲本分子上的一个氢原子的一个或一组原子。术语“取代的”表示指定基团携带一或多个取代基。在任何基团可携带多个取代基且提供多种可能取代基的情况中,取代基是独立选择的且不需要是相同的。术语“未取代的”表示指定基团不携带取代基。术语“任选取代的”表示指定基团是未取代的或用一或多个独立选自可能取代基的取代基取代的。在指出取代基的数目时,术语“一或多个”表示自1个取代基至最高可能数目的取代,即用取代基替换1个氢直至替换所有氢。
如本文中使用的,术语“烷基”指1至12个碳原子(C1-C12)的饱和线性或支链单价烃根,其中烷基根可以是任选用一个或多个下文所述取代基独立取代的。在另一个实施方案中,烷基根是1至8个碳原子(C1-C8),或1至6个碳原子(C1-C6)。烷基基团的例子包括但不限于甲基(Me,-CH3),乙基(Et,-CH2CH3),1-丙基(n-Pr,n-丙基,-CH2CH2CH3),2-丙基(i-Pr,i-丙基,-CH(CH3)2),1-丁基(n-Bu,n-丁基,-CH2CH2CH2CH3),2-甲基-1-丙基(i-Bu,i-丁基,-CH2CH(CH3)2),2-丁基(s-Bu,s-丁基,-CH(CH3)CH2CH3),2-甲基-2-丙基(t-Bu,t-丁基,-C(CH3)3),1-戊基(n-戊基,-CH2CH2CH2CH2CH3),2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3),3-戊基(-CH(CH2CH3)2),2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3),3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2),3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2),2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3),1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3),2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3),3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)),2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3),3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3),4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2),3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2),2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2),2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2),3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3),1-庚基,1-辛基,等等。
如本文中使用的,术语“亚烷基”指1至12个碳原子(C1-C12)的饱和线性或支链二价烃根,其中亚烷基根可以是任选用一个或多个下文所述取代基独立取代的。在另一个实施方案中,亚烷基根是1至8个碳原子(C1-C8),或1至6个碳原子(C1-C6)。亚烷基基团的例子包括但不限于亚甲基(-CH2-),亚乙基(-CH2CH2-),亚丙基(-CH2CH2CH2-),等等。
术语“烯基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp2双键)的,线性的或分支的单价烃根,其中烯基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的,而且包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的根。例子包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2),烯丙基(-CH2CH＝CH2),等等。
术语“亚烯基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp2双键)的,线性的或分支的二价烃根,其中亚烯基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的,而且包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的根。例子包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-),亚烯丙基(-CH2CH＝CH-),等等。
术语“炔基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp三键)的,线性的或分支的单价烃根,其中炔基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的。例子包括但不限于乙炔基(-C≡CH),丙炔基或炔丙基(-CH2C≡CH),等等。
术语“亚炔基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp三键)的,线性的或分支的二价烃根,其中亚炔基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的。例子包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-),亚丙炔基(-CH2C≡C-),等等。
术语“碳环”,“碳环基”,“碳环环”和“环烃基”指作为单环环具有3至12个碳原子(C3-C12)或作为双环环具有7至12个碳原子的,单价的,非芳香族的,饱和的或部分未饱和的环。具有7至12个原子的双环碳环可以排列成例如双环[4,5],[5,5],[5,6]或[6,6]体系,而具有9或10个环原子的双环碳环可以排列成双环[5,6]或[6,6]体系,或者桥连体系诸如双环[2.2.1]庚烷,双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。螺模块也包括在此定义的范围内。单环碳环的例子包括但不限于环丙基,环丁基,环戊基,1-环戊-1-烯基,1-环戊-2-烯基,1-环戊-3-烯基,环己基,1-环己-1-烯基,1-环己-2-烯基,1-环己-3-烯基,环己二烯基,环庚基,环辛基,环壬基,环癸基,环十一烷基,环十二烷基,等等。碳环基基团任选是用一个或多个本文所述取代基独立取代的。
“芳基”指6至20个碳原子(C6-C20)的,通过从亲本芳香族环体系的一个碳原子除去一个氢原子而衍生的,单价芳香族烃根。有些芳基基团在例示结构中以“Ar”来代表。芳基包括包含与饱和的,部分未饱和的环或芳香族碳环环稠合的芳香环的双环根。典型的芳基基团包括但不限于自苯(苯基),取代的苯,萘,蒽,联苯,茚基,茚满基,1,2-二氢萘,1,2,3,4-四氢萘基,等等衍生的根。芳基基团任选是用一个或多个本文所述取代基独立取代的。
“亚芳基”指6至20个碳原子(C6-C20)的,通过从亲本芳香族环体系的两个碳原子除去两个氢原子而衍生的,二价芳香族烃根。有些亚芳基基团在例示结构中以“Ar”来代表。亚芳基包括包含与饱和的,部分未饱和的环或芳香族碳环环稠合的芳香环的双环根。典型的亚芳基基团包括但不限于自苯(亚苯基),取代的苯,萘,蒽,亚联苯,亚茚基,亚茚满基,1,2-二氢亚萘基,1,2,3,4-四氢亚萘基,等等衍生的根。亚芳基基团任选是用一个或多个本文所述取代基取代的。
术语“杂环”,“杂环基”和“杂环环”在本文中可互换使用,指3至约20个环原子的(其中至少一个环原子是选自氮,氧,磷和硫的杂原子,其余环原子是C),饱和的或部分未饱和的(即在环内具有一个或多个双键和/或三键)碳环根,其中一个或多个环原子是任选用一个或多个下文所述取代基独立取代的。杂环可以是具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-4个选自N,O,P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-6个选自N,O,P和S的杂原子)的双环,例如双环[4,5],[5,5],[5,6]或[6,6]体系。杂环记载于Paquette,LeoA.；“PrinciplesofModernHeterocyclicChemistry”(W.A.Benjamin,NewYork,1968),特别是第1,3,4,6,7,和9章；“TheChemistryofHeterocyclicCompounds,AseriesofMonographs”(JohnWiley&Sons,NewYork,1950至今),特别是第13,14,16,19,和28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。“杂环基”还包括杂环根与饱和的,部分未饱和的环或芳香族碳环或杂环环稠合的根。杂环环的例子包括但不限于吗啉-4-基(morpholin-4-yl),哌啶-1-基(piperidin-1-yl),哌嗪基(piperazinyl),哌嗪-4-基-2-酮(piperazin-4-yl-2-one),哌嗪-4-基-3-酮(piperazin-4-yl-3-one),吡咯烷-1-基(pyrrolidin-1-yl),硫代吗啉-4-基(thiomorpholin-4-yl),S-二氧硫代吗啉-4-基(S-dioxothiomorpholin-4-yl),氮杂环辛烷-1-基(azocan-1-yl),氮杂环丁烷-1-基(azetidin-1-yl),八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基(octahydropyrido[1,2-a]pyrazin-2-yl),[1,4]二氮杂环庚烷-1-基([1,4]diazepan-1-yl),吡咯烷基(pyrrolidinyl),四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl),二氢呋喃基(dihydrofuranyl),四氢噻吩基(tetrahydrothienyl),四氢吡喃基(tetrahydropyranyl),二氢吡喃基(dihydropyranyl),四氢硫代吡喃基(tetrahydrothiopyranyl),哌啶并(piperidino),吗啉并(morpholino),硫代吗啉并(thiomorpholino),噻烷基(thioxanyl),哌嗪基(piperazinyl),高哌嗪基(homopiperazinyl),氮杂环丁烷基(azetidinyl),氧杂环丁烷基(oxetanyl),硫杂环丁烷基(thietanyl),高哌啶基(homopiperidinyl),氧杂环庚烷基(oxepanyl),硫杂环庚烷基(thiepanyl),氧氮杂基(oxazepinyl),二氮杂基(diazepinyl),硫杂基(thiazepinyl),2-吡咯啉基(2-pyrrolinyl),3-吡咯啉基(3-pyrrolinyl),二氢吲哚基(indolinyl),2H-吡喃基(2H-pyranyl),4H-吡喃基(4H-pyranyl),二烷基(dioxanyl),1,3-二氧戊环基(1,3-dioxolanyl),吡唑啉基(pyrazolinyl),二噻烷基(dithianyl),二硫戊环基(dithiolanyl),二氢吡喃基(dihydropyranyl),二氢噻吩基(dihydrothienyl),二氢呋喃基(dihydrofuranyl),吡唑烷基(pyrazolidinyl)咪唑啉基(imidazolinyl),咪唑烷基(imidazolidinyl),3-氮双环[3.1.0]己烷基(3-azabicyco[3.1.0]hexanyl),3-氮双环[4.1.0]庚烷基(3-azabicyclo[4.1.0]heptanyl),氮双环[2.2.2]己烷基(azabicyclo[2.2.2]hexanyl),3H-吲哚基(3H-indolyl)喹嗪基(quinolizinyl)和N-吡啶基脲(N-pyridylurea)。螺模块也包括在此定义的范围内。其中2个环原子被氧(＝O)模块取代的杂环基团的例子有嘧啶酮基(pyrimidinonyl)和1,1-二氧-硫代吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。本文中的杂环基团任选是用一个或多个本文所述取代基独立取代的。
术语“杂芳基”指5,6,或7元环的单价芳香根,而且包括5-20个原子(含有一个或多个独立选自氮,氧和硫的杂原子)的稠环体系(其中至少一个是芳香族的)。杂芳基基团的例子有吡啶基(pyridinyl)(包括例如2-羟基吡啶基),咪唑基(imidazolyl),咪唑并吡啶基(imidazopyridinyl),嘧啶基(pyrimidinyl)(包括例如4-羟基嘧啶基),吡唑基(pyrazolyl),三唑基(triazolyl),吡嗪基(pyrazinyl),四唑基(tetrazolyl),呋喃基(furyl),噻吩基(thienyl),异唑基(isoxazolyl),噻唑基(thiazolyl),二唑基(oxadiazolyl),唑基(oxazolyl),异噻唑基(isothiazolyl),吡咯基(pyrrolyl),喹啉基(quinolinyl),异喹啉基(isoquinolinyl),四氢异喹啉基(tetrahydroisoquinolinyl),吲哚基(indolyl),苯并咪唑基(benzimidazolyl),苯并呋喃基(benzofuranyl),噌啉基(cinnolinyl),吲唑基(indazolyl),吲嗪基(indolizinyl),酞嗪基(phthalazinyl),哒嗪基(pyridazinyl),三嗪基(triazinyl),异吲哚基(isoindolyl),喋啶基(pteridinyl),嘌呤基(purinyl),二唑基(oxadiazolyl),三唑基(triazolyl),噻二唑基(thiadiazolyl),噻二唑基(thiadiazolyl),呋咱基(furazanyl),苯并呋咱基(benzofurazanyl),苯并噻吩基(benzothiophenyl),苯并噻唑基(benzothiazolyl),苯并唑基(benzoxazolyl),喹唑啉基(quinazolinyl),喹啉基(quinoxalinyl),二氮杂萘基(naphthyridinyl)和呋喃并吡啶基(furopyridinyl)。杂芳基基团任选是用一个或多个本文所述取代基独立取代的。
杂环或杂芳基基团可以是碳(碳连的)或氮(氮连的)键合的,在那里可能的情况中。举例而非限制,碳键合的杂环或杂芳基在吡啶的2,3,4,5或6位,哒嗪的3,4,5或6位,嘧啶的2,4,5或6位,吡嗪的2,3,5或6位,呋喃,四氢呋喃,硫代呋喃(thiofuran),噻吩,吡咯或四氢吡咯的2,3,4或5位,唑,咪唑或噻唑的2,4或5位,异唑,吡唑或异噻唑的3,4或5位,氮丙啶的2或3位,吖丁啶的2,3或4位,喹啉的2,3,4,5,6,7或8位,或异喹啉的1,3,4,5,6,7或8位处键合。
举例而非限制,氮键合的杂环或杂芳基在氮丙啶,吖丁啶,吡咯,吡咯烷,2-吡咯啉,3-吡咯啉,咪唑,咪唑烷,2-咪唑啉,3-咪唑啉,吡唑,吡唑啉,2-吡唑啉,3-吡唑啉,哌啶,哌嗪,吲哚,二氢吲哚,1H-吲唑的1位,异吲唑或异二氢吲哚的2位,吗啉的4位,和咔唑或β-咔啉的9位处键合。
“代谢物”指特定化合物或其盐在身体中经由代谢生成的产物。化合物的代谢物可以使用本领域已知的常规技术来鉴定,而且它们的活性可以使用诸如本文中所描述的测试来测定。此类产物可能源自例如所施用化合物的氧化,还原,水解,酰胺化,脱酰胺,酯化,脱酯,酶促切割,等等。因而,本发明包括本发明化合物的代谢物,包括通过如下过程生成的化合物,所述过程包括使本发明的式I化合物接触哺乳动物一段时间,该段时间足以生成其代谢产物。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式,使得容许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“无菌”配制剂没有活菌或者没有所有活的微生物及其孢子。
“稳定的”配制剂指在贮存后其中的蛋白质基本上保持其物理和化学稳定性和完整性的配制剂。本领域有用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术,综述见PeptideandProteinDrugDelivery,247-301,VincentLee编,MarcelDekker,Inc.,NewYork,NewYork,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)。可以在选定的温度对选定的时间段测量稳定性。对于快速筛选,可以将配制剂于40℃保持2周至1个月,那时测量稳定性。若配制剂要于2-8℃贮存,则一般配制剂应于30℃或40℃稳定至少1个月和/或于2-8℃稳定至少2年。若配制剂要于30℃贮存,则一般配制剂应于30℃稳定至少2年和/或于40℃稳定至少6个月。例如,可以使用贮存期间的聚集程度作为蛋白质稳定性的指标。如此,“稳定的”配制剂可以是其中少于约10％且优选少于约5％的蛋白质以聚集体存在的配制剂。在其它实施方案中,可以测定配制剂贮存期间聚集体形成的任何增加。
“等渗的”配制剂指具有与人血液基本上相同的渗透压的配制剂。等渗的配制剂一般会具有约250-350mOsm的渗透压。术语“低渗的”描述渗透压低于人血液的配制剂。相应地,术语“高渗的”用于描述渗透压高于人血液的配制剂。可以使用例如蒸气压或结冰(ice-freezing)型渗压计来测量等渗性。本发明的配制剂因添加了盐和/或缓冲剂而是高渗的。
“载剂”在用于本文时包括药剂学可接受的载剂,赋形剂或稳定剂,它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常,生理学可接受的载剂是pH缓冲水溶液。生理学可接受载剂的例子包括缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖醇,诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；和/或非离子表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分以外的,对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂,或防腐剂。“药学可接受的酸”包括在配制它们的浓度和方式无毒的无机和有机酸。例如,合适的无机酸包括氢氯酸,高氯酸,氢溴酸,氢碘酸,硝酸,硫酸,磺酸,亚磺酸,对氨基苯磺酸(磺胺酸),磷酸,碳酸,等。合适的有机酸包括直链和支链烃基的,芳香族的,环状的,环状脂肪族的,芳基脂肪族的,杂环的,饱和的,不饱和的,单羧酸的,双羧酸的和三羧酸的,包括例如甲酸,乙酸,2-羟基乙酸,三氟乙酸,苯乙酸,三甲基乙酸,叔丁基乙酸,邻氨基苯甲酸(氨茴酸),丙酸,2-羟基丙酸,2-氧丙酸,丙二酸,环戊烷丙酸,环戊烷丙酸,3-苯基丙酸,丁酸,丁二酸,苯甲酸,3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸,2-乙酰氧基-苯甲酸,抗坏血酸,肉桂酸,十二烷基硫酸,硬脂酸,粘康酸,苦杏仁酸(扁桃酸),琥珀酸,双羟萘酸(embonicacid),富马酸,苹果酸,马来酸,羟基马来酸,丙二酸,乳酸,柠檬酸,酒石酸,乙醇酸(羟基乙酸),葡糖酸(glyconicacid),葡糖酸(gluconicacid),丙酮酸,乙醛酸,草酸,甲磺酸,琥珀酸,水杨酸,酞酸,棕榈酸(palmoicacid),棕榈油酸(palmeicacid),硫氰酸,甲磺酸,乙磺酸,1,2-乙二磺酸,2-羟基乙磺酸,苯磺酸,4-氯苯磺酸,萘-2-磺酸,对甲苯磺酸,樟脑磺酸,4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸,葡庚糖酸,4,4’-亚甲基双-3-(羟基-2-烯-1-羧酸),羟基萘甲酸。
“药学可接受的碱”包括在配制它们的浓度和方式无毒的无机和有机碱。例如,合适的碱包括那些自无机碱形成金属形成的,所述金属诸如锂,钠,钾,镁,钙,铵,铁,锌,铜,锰,铝,N-甲基葡糖胺,吗啉,哌啶,及有机无毒碱,包括伯胺,仲胺和叔胺,取代的胺,环胺和碱离子交换树脂(例如N(R’)4 +,其中R’独立地为H或C1-4烃基,例如铵,Tris),例如异丙胺,三甲胺,二乙胺,三乙胺,三丙胺,乙醇胺,2-二乙基氨基乙醇,三甲胺,二环己基胺,赖氨酸,精氨酸,组氨酸,咖啡因,普鲁卡因,哈胺(hydrabamine),胆碱,甜菜碱,乙二胺,葡糖胺,甲基葡糖胺,可可碱,嘌呤,哌嗪,哌啶,N-乙基哌啶,多胺树脂诸如此类。特别优选的有机无毒碱是异丙胺,二乙胺,乙醇胺,三甲胺,二环己基胺,胆碱,和咖啡因。
本发明可用的别的药学可接受的酸和碱包括那些自氨基酸衍生的,例如组氨酸,甘氨酸,苯丙氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,赖氨酸和天冬酰胺。
“药学可接受的”缓冲剂和盐包括那些自上文所示酸和碱的酸和碱加成盐衍生的。具体的缓冲剂和/或盐包括组氨酸,琥珀酸盐/酯和乙酸盐/酯。
“药学可接受的糖”指在与感兴趣的蛋白质组合时显著阻止或降低蛋白质在贮存后的化学和/或物理不稳定性的分子。当配制剂意图要冻干,然后重建时,“药学可接受的糖”也可以称作“防冻剂”(lyoprotectant)。例示性的糖及其相应的糖醇包括:氨基酸,诸如谷氨酸或组氨酸单钠；甲胺,诸如甜菜碱；易溶盐,诸如硫酸镁；多元醇,诸如三氢的或更高分子量的糖醇,例如甘油(glycerin),葡聚糖(dextran),赤藓糖醇,甘油(glycerol),阿拉伯糖醇,木糖醇,山梨糖醇,和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；及其组合。别的例示性防冻剂包括甘油(glycerin)和明胶,及糖蜜二糖,松三糖,棉子糖,甘露三糖和水苏四糖。还原糖的例子包括葡萄糖,麦芽糖,乳糖,麦芽酮糖,异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的例子包括选自糖醇和其它直链多元醇的多羟基化合物的非还原糖苷。优选的糖醇是单糖苷,尤其是那些通过二糖(诸如乳糖,麦芽糖,乳果糖和麦芽酮糖)还原获得的化合物。糖苷侧基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的别的例子是葡萄糖醇,麦芽糖醇,乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的药学可接受的糖是非还原糖海藻糖或蔗糖。将药学可接受的糖以“保护量”添加至配制剂(例如冻干前),这意谓着蛋白质在贮存期间(例如在重建和贮存后)基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。
本文中感兴趣的“稀释剂”指药学可接受的(对于给人施用而言安全的且无毒的)且对于制备液体配制剂(诸如在冻干后重建的配制剂)而言有用的。例示性的稀释剂包括无菌水,注射用抑菌水(BWFI),pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水),无菌盐水溶液,林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。在一个备选的实施方案中,稀释剂可以包括盐和/或缓冲剂的水溶液。
“防腐剂”指能添加至本文中的配制剂以降低细菌活性的化合物。防腐剂的添加可以例如促进多次使用(多剂)配制剂的生成。潜在防腐剂的例子包括十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物,氯己双胺,苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基铵氯化物的混合物,其中烃基基团是长链化合物),和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香族醇(诸如酚,丁醇和苯甲醇),对羟基苯甲酸烃基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯),邻苯二酚,间苯二酚,环己醇,3-戊醇,和间甲酚。本文中最优选的防腐剂是苯甲醇。
“个体”或“受试者”或“患者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中,个体或受试者是人。
如本文中使用的,“治疗/处理”指设计用于在临床病理学的进程中改变所治疗个体,组织或细胞的自然进程的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,及免除或改善预后,均是本领域技术人员诸如医师可测量的。在一个实施方案中,治疗可以表示缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,减缓感染性疾病/传染病进展的速率,改善或减轻疾病状态,及免除或改善预后。在有些实施方案中,本发明的抗体用于延迟疾病的发生/发展,或用于减缓感染性疾病/传染病的进展。
如本文中使用的,“与……联合”指在一种治疗形态之外施用另一种治疗形态。如此,“与…….联合”指对个体施用一种治疗形态之前,期间或之后施用另一种治疗形态。
术语“吞噬体”指吞噬细胞中内在化的膜包裹的内吞容器。它可以通过直接的,抗体或补体增强的吞噬来启动。术语“吞噬溶酶体”指已经与一或多个溶酶体融合的内在化细胞容器。
传统上根据细菌的革兰氏染剂保持将它们分成两大组,革兰氏阳性的(Gm+)和革兰氏阴性的(Gm-)。革兰氏阳性细菌受到单个单位的脂膜束缚,而且它们一般含有较厚的(20-80nm)一层肽聚糖,其负责保持革兰氏染剂。革兰氏阳性细菌是那些通过革兰氏染色被染色成深蓝色或紫色的。相反,革兰氏阴性细菌不能保持结晶紫染剂,而是摄取复染剂(番红或品红)且表现为红色或粉色。革兰氏阳性细胞壁通常缺少在革兰氏阴性细菌中找到的外膜。
术语“菌血症”指血流中存在细菌,这最通常经由血液培养物来检测。作为感染的严重并发症(像肺炎或脑膜炎),在手术期间(尤其当涉及粘膜诸如胃肠道时),或由于进入动脉或静脉的导管和其它异物,细菌能进入血流。菌血症可具有严重的后果。针对细菌的免疫应答可引起脓毒症和败血性/感染性休克,其具有相对较高的死亡率。细菌还能利用血液传播至身体其它部分,远离初始感染部位引起感染。例子包括心内膜炎或骨髓炎。
“治疗有效量”指实现特定病症的可测量改善所需要的最小浓度。本文中的治疗有效量可根据诸如患者的疾病状态,年龄,性别,和重量及抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。在一个实施方案中,治疗有效量是在体内感染中有效减轻菌血症的量。一方面,“治疗有效量”至少是将自患者样品(诸如血液)分离的细菌载荷或菌落形成单位(CFU)相对于药物施用之前有效降低至少1个log的量。在一个更加具体的方面,降低为至少2个log。在另一个方面,降低为3,4,5个log。在还有另一个方面,降低为低于可检测水平。在另一个实施方案中,治疗有效量指在治疗期的过程里给予的与开始治疗受到感染的患者之前或之时的阳性血液培养物相比实现阴性血液培养物(即没有长出作为AAC的靶物的细菌)的一或多剂中AAC的量。
“预防有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然,由于预防剂量是在疾病之前或在疾病的早期,或甚至在暴露于感染风险升高的条件之前用于受试者的,因此预防有效量可低于治疗有效量。在一个实施方案中,预防有效量至少是有效减少,防止感染发生或从一个细胞传播至另一个细胞的量。
“长期”施用指与短期模式相反,以连续模式施用药物,从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗,而是本质上周期性的。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书,其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症,用法,剂量,施用,联合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
术语“手性”指分子具有镜像对映体不可重叠的特性,而术语“非手性”指分子可重叠于其镜像对映体上。
术语“立体异构体”指具有相同的化学结构,但是在原子或基团的空间排列方面有所不同的化合物。
“非对映异构体”指具有两个或更多个手性中心且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性,例如熔点,沸点,光谱特性,和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率的分析规程下分开,诸如电泳和层析。
“对映异构体”指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种立体异构体。
本文中使用的立体化学的定义和规则一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)McGraw-HillBookCompany,NewYork；及Eliel,E.andWilen,S.,StereochemistryofOrganicCompounds(1994)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork。许多有机化合物以旋光形式存在,即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述旋光化合物时,前缀D和L或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的标记,其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。对于指定的化学结构,这些立体异构体是相同的,只是它们互为镜像。一种特定立体异构体还可称作对映异构体,此类异构体的混合物通常称作对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称作外消旋混合物或外消旋物,它们可以在没有立体选择性或立体特异性的化学反应或工艺中存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对映异构体等摩尔混合从而没有旋光性的混合物。
术语“保护基团”指常用于使化合物上的其它官能团起反应的同时封闭或保护特定官能度的取代基。例如,“氨基保护基团”指附着至化合物中的氨基基团并阻断或保护氨基官能度的取代基。合适的氨基保护基团包括但不限于乙酰基,三氟乙酰基,叔丁氧羰基(BOC),苄氧羰基(CBZ)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)。关于保护基团及其用途的一般性说明参见T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,JohnWiley&Sons,NewYork,1991或更晚的版本。
如本文中使用的,术语“约”指本技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。本文中提到“约”数值或参数包括(且描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
如本说明书和所附权利要求中使用的,单数形式“一个/种”和“该”包括复数所指物,除非上下文另有明确说明。例如,提到一个/种“抗体”即提到一个/种至多个/种抗体,诸如摩尔量,而且包括本领域技术人员已知的其等同物,诸如此类。
III.组合物和方法
抗体-抗生素缀合物(AAC)
本发明的AAC化合物包括那些具有抗细菌活性,针对一些人和兽医革兰氏阳性,革兰氏阴性病原体(包括葡萄球菌)有效的。在一个例示性实施方案中,AAC化合物包括缀合(即通过接头共价附着)至利福霉素型抗生素模块的半胱氨酸改造的抗体。通过缀合至抗体来调控利福霉素型抗生素模块的生物学活性。本发明的抗体-抗生素缀合物(AAC)将有效剂量的抗细菌剂选择性投递至感染部位,由此可以实现更大的选择性(即更低的有效剂量)同时提高治疗指数(“治疗窗”)。
本发明提供新颖的抗细菌疗法,其致力于通过靶向逃脱常规抗生素疗法的细菌群体来预防抗生素逃脱。所述新颖的抗细菌疗法是用抗体-抗生素缀合物(AAC)实现的,其中将对在金黄色葡萄球菌(包括MRSA)上找到的细胞壁成分特异性的抗体化学连接至有力的抗生素(利福霉素衍生物)。经蛋白酶可切割的肽接头将抗生素连接至抗体,该肽接头设计成受到组织蛋白酶B切割,组织蛋白酶B是一种在大多数哺乳动物细胞类型中找到的溶酶体蛋白酶(Dubowchiketal.(2002)Bioconj.Chem.13:855-869)。AAC作为药物前体起作用,即抗生素没有活性(由于抗体的较大尺寸),直至接头受到切割。自显著比例的在天然感染中找到的金黄色葡萄球菌被宿主细胞(主要是嗜中性细胞和巨噬细胞)摄取,在宿主中的感染过程期间的一些点,以及在宿主细胞内部度过的时间给细菌提供显著机会来逃脱抗生素活性。本发明的AAC设计成结合金黄色葡萄球菌及在细菌被宿主细胞摄取后在吞噬溶酶体内部释放抗生素。通过这种机制,AAC能够在金黄色葡萄球菌受常规抗生素治疗较差的位置特异性浓缩活性抗生素。虽然本发明不受特定作用机制限制或限定,但是AAC经由三种潜在机制改善抗生素活性:(1)AAC将抗生素投递到摄取细菌的哺乳动物细胞内部,由此提高扩散入隔绝细菌的吞噬溶酶体较差的抗生素的效力。(2)AAC调理细菌–由此提高吞噬性细胞对游离细菌的摄取–并当细菌隔绝在吞噬溶酶体中时局部释放抗生素以杀死细菌。(3)AAC通过将抗生素连接至抗体而改善抗生素的体内半衰期(改善的药动学)。AAC改善的药动学能够在金黄色葡萄球菌集中的区域中投递足够的抗生素,同时限制需要系统施用的抗生素的总体剂量。这种特性应当允许AAC长期疗法,从而以最小限度的抗生素副作用靶向持久感染。
本申请描述新颖的缀合的抗WTA抗体治疗剂的生成和它们在治疗革兰氏阳性(Gm+)细菌感染(包括金黄色葡萄球菌感染)中的用途。这些抗体能够靶向逃脱常规抗生素疗法的Gm+细菌群体。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物包含通过肽接头共价附着至利福霉素型抗生素的抗壁磷壁酸β(WTAβ)抗体。
在一个实施方案中,所述抗体-抗生素缀合物具有式:
Ab-(L-abx)p
其中:
Ab为抗壁磷壁酸抗体；
L为肽接头,其具有式:-Str-Pep-Y-,其中Str为延伸物单元,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元；
abx为利福霉素型抗生素；且
p为1至8的整数。
可以经反应性接头模块缀合至一个抗体分子的抗生素模块的数目可受到通过本文所述方法引入的游离半胱氨酸残基的数目限制。式I的例示性AAC因此包含具有1,2,3,或4个改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.etal.(2012)MethodsinEnzym.502:123-138)。
抗壁磷壁酸(WTA)抗体
本文中公开的是结合在一些Gm+细菌(包括金黄色葡萄球菌)上表达的WTA的某些抗WTA抗体和缀合的抗WTA抗体。可以通过US8283294；MeijerPJetal.(2006)JMolBiol.358(3):764-72；LanttoJetal.(2011)JVirol.85(4):1820-33；和下文实施例21中教导的方法来选择和生成抗WTA抗体。本发明提供这些抗WTA抗体的组合物。
革兰氏阳性细菌的细胞壁由多个肽聚糖(PGN)鞘的厚层构成,它们不仅稳定细胞膜,而且提供许多位点可附着其它分子(图3)。这些细胞表面糖蛋白的一个主要类别是磷壁酸(“TA”),它们是在许多聚糖结合蛋白(GPB)上找到的富含磷酸的分子。TA分成两种类型:(1)脂磷壁酸(“LTA”),它们锚定至质膜且自细胞表面延伸入肽聚糖层；和(2)壁磷壁酸(WTA),它们共价附着至肽聚糖且延伸贯穿和超出细胞壁(图3)。在GPB中,WTA可以占细胞壁总质量的多达60％。结果是,它代表一种高表达的细胞表面抗原。
WTA的化学结构在生物体间有变化。在金黄色葡萄球菌中,WTA经由N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)-1-P和N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)构成的二糖,接着是约2或3个磷酸甘油酯单元共价连接至N-乙酰基胞壁酸(MurNAc)的6-OH(图4)。然后,实际的WTA聚合物由约11-40个磷酸核糖醇酯(Rbo-P)重复单元构成。WTA的逐步合成首先由称作TagO的酶启动,而缺少TagO基因(通过删除该基因)的金黄色葡萄球菌株不生成任何WTA。重复单元可以经α-(阿尔法)或β-(贝塔)糖苷连接用D-丙氨酸(D-Ala)在C2-OH处和/或用N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)在C4-OH位置处进一步剪裁(tailor)。根据金黄色葡萄球菌株或细菌的生长阶段,糖苷连接可以是α-,β-,或两种异头物的混合物。这些GlcNAc糖修饰由两种特定金黄色葡萄球菌衍生的糖基转移酶(Gtf)剪裁:TarMGtf介导α-糖苷连接,而TarSGtf介导β-糖苷连接。
鉴于MRSA的细胞内贮藏受到保护免于抗生素作用的显著证据,开发了本发明的新颖的治疗性组合物来预防这种抗生素逃脱方法,使用金黄色葡萄球菌特异性抗体将抗生素栓系到细菌上,使得当在体内细菌被宿主细胞吞没或以其它方式内在化时,它将抗生素一起带入宿主细胞中。
一方面,本发明提供抗WTA抗体,它们是抗WTAα的或抗WTAβ的。另一方面,本发明提供抗金黄色葡萄球菌抗体。例示性抗体是自来自金黄色葡萄球菌感染患者的B细胞克隆的(如实施例21中教导的)。在一个实施方案中,所述抗WTA和抗金黄色葡萄球菌抗体是人单克隆抗体。本发明涵盖嵌合抗体和人源化抗体,它们包含本发明WTA抗体的CDR。
为了治疗目的,用于缀合抗生素以生成AAC的本发明WTA抗体可以是任何同种型的,IgM除外。在一个实施方案中,所述WTA抗体是人IgG同种型的。在更加具体的实施方案中,所述WTA抗体是人IgG1的。
图6A和6B列出抗WTAα的或抗WTAβ的抗体。贯穿说明书和附图,以四位数(例如4497)命名的抗体也可以带在前“S”提及,例如S4497；两种名称指同一抗体,即野生型(WT)未修饰序列的抗体。抗体的变体以抗体编号后面的“v”指示,例如4497.v8。除非有说明(例如通过变体编号),所示氨基酸序列为原始的,未修饰的/未改变的序列。可以在一或多个残基处改变这些抗体,例如为了改善pK,稳定性,表达,可制造性(例如如下文实施例中描述的),同时维持与野生型,未修饰的抗体相比实质上大致相同或改善的对抗原的结合亲和力。本发明涵盖本发明WTA抗体具有保守氨基酸替代的变体。在下文中,除非另有说明,CDR编号方式依照Kabat且恒定域编号方式依照EU编号方式。
图13A和图13B分别提供四种人抗WTAα抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列比对。依照Kabat编号方式的CDR序列CDRL1,L2,L3和CDRH1,H2,H3标有下划线。
表6A:抗WTAα的轻链CDR序列。
表6B：抗WTAα的重链CDR序列。
每对VL和VH的序列如下：
4461轻链可变区
DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSRANNNYYVAWYQHKPGQPPKLLIYWASTREFGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYYCQQYYTSRRTFGQGTKVEIK(SEQIDNO.25)
4461重链可变区
QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPKSGGTNYAQRFQGRVTMTGDTSISAAYMDLASLTSDDTAVYYCVKDCGSGGLRDFWGQGTTVTVSS(SEQIDNO.26)
4624轻链可变区
DIQMTQSPDSLSVSLGERATINCRSNQNLLSSSNNNYLAWYQQKPGQPLKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAWYCQQYYANPRTFGQGTKVEIK(SEQIDNO.27)
4624重链可变区
QVQLQQSRVEVKRPGTSVKVSCKTSGYTFSDYYIHWVRLAPGQGLELMGWINPNTGGTYYAQKFRDRVTMTRDTSIATAYLEMSSLTSDDTAVYYCAKDCGRGGLRDIWGPGTMVTVSS(SEQIDNO.28)
4399轻链可变区
EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSNQNVLASSNDKNYLAWFQHKPGQPLKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLRAEDVAWYCQQYYTNPRTFGQGTKVEFN(SEQIDNO.29)
4399重链可变区
EVQLVQSGAEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRLAPGQGLELMGWINPNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSIATAYMELSSLTSDDTAVYYCAKDCGNAGLRDIWGQGTTVTVSS(SEQIDNO.30)
6267轻链可变区
DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTSPPYTFGQGTKLEIE(SEQIDNO.31)
6267重链可变区
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIHPGDSKTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWNSLKASDTAMYYCARLYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGVWGQGTTVTVSS(SEQIDNO.32)
本发明提供一种分离的结合壁磷壁酸(WTA)的单克隆抗体，其包含L链和H链，所述L链包含CDRL1，L2，L3且所述H链包含CDRH1，H2，H3，其中所述CDRL1，L2，L3和H1，H2，H3分别包含表6A和6B中所示抗体4461(SEQIDNO：1-6)，4624(SEQIDNO：7-12)，4399(SEQIDNO：13-18)，和6267(SEQIDNO：19-24)每个的CDR的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述分离的结合WTA的单克隆抗体包含H链可变区(VH)和L链可变区(VL)，其中所述VH在抗体4461，4624，4399，和6267每个的VH区序列的长度上包含至少95％序列同一性。在还有另一个具体方面，所述序列同一性为96％，97％，98％，99％或100％。
本发明还提供抗WTAβ抗体，其包含图14中所示的L和H链CDR序列。在一个实施方案中，所述分离的抗WTAβ单克隆抗体包含选自下组的CDRL1，L2，L3和H1，H2，H3：图14中的13种抗体每个的CDR。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗WTAβ抗体，其在13种抗体每个的V区结构域的长度上包含至少95％序列同一性。在还有另一个具体方面，所述序列同一性为96％，97％，98％，99％或100％。
在所述13种抗WTAβ抗体中，修饰6078和4497以创建如下的变体：i)在L和H链之一或二者中具有改造的Cys用于缀合至接头-抗生素中间体；和ii)H链中的第一个残基Q变成E(v2)或头两个残基QM变成EI或EV(v3和v4)。
图15A-1和15A-2提供抗WTAβ抗体6078(未修饰的)和它的变体v2，v3，v4的全长L链的氨基酸序列。含有改造的Cys的L链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在这种情况中在EU残基编号205处)。关于变体命名，例如，v2LC-Cys表示含有改造入L链的Cys的变体2。HCLC-Cys表示抗体的H和L链均含有改造的Cys。图15B-1至15B-4显示抗WTAβ抗体6078(未修饰的)和它的变体v2，v3，v4(它们具有H链的第一个或头两个残基中的改变)的全长H链的比对。含有改造的Cys的H链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在EU残基编号118处)。
6078轻链可变区(VL)
DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGIYYCQQYKSYSFNFGQGTKVEIK(SEQIDNO.111)
6078重链可变区(VH)
XX1QLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTsIsTAYMELssLRsEDTAVYYCARssILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVss(sEQIDNO.112)
其中X为Q或E；且X1为M，I或V。
6078轻链
DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGIYYCQQYKSYSFNFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.113)
6078半胱氨酸改造的轻链
DIVMTQSPSILSASVGDRVTITCRASQTISGWLAWYQQKPAEAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFGIYYCQQYKSYSFNFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNsQEsVTEQDsKDsTYsLssTLTLsKADYEKHKVYACEVTHQGLssPCTKsFNRGEC(sEQIDNO.115)
6078野生型全长重链
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTvDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(sEQIDNO.114)
6078变体(v2，v3或v4)全长重链
EXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO.116)
其中X可以是M，I或V。
6078变体(v2，v3或v4)，半胱氨酸改造的重链
EXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTLTSYDINWVRQATGQGPEWMGWMNANSGNTGYAQKFQGRVTLTGDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSSILVRGALGRYFDLWGRGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO.117)
其中X为M，I或V。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗WTAβ抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链包含与SEQIDNO：112具有至少95％序列同一性的VH。在另一个实施方案中，此抗体进一步包含与SEQIDNO：111具有至少95％序列同一性的VL。在一个具体的实施方案中，所述抗WTAβ抗体包含轻链和重链，其中所述L链包含SEQIDNO：111的VL且所述H链包含SEQIDNO：112的VH。在还有一个更加具体的实施方案中，所述分离的抗WTAβ抗体包含SEQIDNO：113的L链和SEQIDNO：114的H链。
6078Cys改造的H和L链变体可以以任何下述组合配对以形成完整抗体，用于缀合至接头-抗生素中间体以生成本发明的抗WTAAAC。未修饰的L链(SEQIDNO：113)可以与SEQIDNO：117的Cys改造的H链变体配对；所述变体可以是如下的，其中X为M，I或V。SEQIDNO：115的Cys改造的L链可以与下述各项配对：SEQIDNO：114的H链；SEQIDNO：116的H链变体；或SEQIDNO：117的Cys改造的H链变体(在这种型式中，H和L链均是Cys改造的)。在一个特定的实施方案中，本发明的抗WTAβ抗体和抗WTAβAAC包含SEQIDNO：115的L链和SEQIDNO：116的H链。
图16A-1和16A-2提供抗WTAβ抗体4497(未修饰的)和它的v8变体的全长L链。含有改造的Cys的L链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在EU残基编号205处)。图16B-1，16B-2，16B-3显示抗WTAβ抗体4497(未修饰的)和它的有或无改造的Cys的v8变体(CDRH3位置96中的D变成E)全长H链的比对。含有改造的Cys的H链变体以恒定区结束黑框中的C指示(在这种情况中在EU残基编号118处)。未修饰的CDRH3为GDGGLDD(SEQIDNO：104)；4497v8CDRH3为GEGGLDD(SEQIDNO：118)。
4497轻链可变区
DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQRPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDVAIYYCQQYFSPPYTFGQGTKLEIK(SEQIDNO.119)
4497重链可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGDGGLDDWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.120)
4497v8重链可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVss(sEQIDNO.156)
4497轻链
DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNVVYQQRPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDVAIYYCQQYFSPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.121)
4497v8重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWvHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTIIAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO.122)
4497-Cys轻链
DIQLTQsPDSLAVSLGERATINCKSSQSIFRTSRNKNLLNWYQQRPGQPPRLLIHWASTRKSGVPDRFSGSGFGTDFTLTITSLQAEDVAIYYCQQYFSPPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.123)
4497v8重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO.157)
(与SEQIDNO：122相同)
4497v8-Cys重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAYADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGEGGLDDWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO.124)
由本发明提供的另一种分离的抗WTAβ抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含与SEQIDNO：120具有至少95％序列同一性的VH。在另一个实施方案中，此抗体进一步包含与SEQIDNO：119具有至少95％序列同一性的VL。在一个具体的实施方案中，所述抗WTAβ抗体包含轻链和重链，其中所述L链包含SEQIDNO：119的VL且所述H链包含SEQIDNO：120的VH。在还有一个更加具体的实施方案中，所述分离的抗WTAβ抗体包含SEQIDNO：121的L链和SEQIDNO：122的H链。
4497Cys改造的H和L链变体可以以任何下述组合配对以形成完整抗体，用于缀合至接头-抗生素中间体以生成本发明的抗WTAAAC。未修饰的L链(SEQIDNO：121)可以与SEQIDNO：124的Cys改造的H链变体配对。SEQIDNO：123的Cys改造的L链可以与下述各项配对：SEQIDNO：157的H链变体；或SEQIDNO:124的Cys改造的H链变体(在这种型式中,H和L链均是Cys改造的)。在一个特定的实施方案中,本发明的抗WTAβ抗体和抗WTAβAAC包含SEQIDNO:123的L链。
还有另一个实施方案是与图13A和图13B的抗WTAα抗体每个结合相同表位的抗体。还提供的是与图14,图15A和15B,和图16A和16B的抗WTAβ抗体每个结合相同表位的抗体。
抗WTA抗体对WTA的结合受WTA上的GlcNAc-糖修饰的异头取向影响。分别由TarM糖基转移酶或TarS糖基转移酶经α-或β-糖苷连接在C4-OH位置处通过N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)糖修饰来修饰WTA。因而,用针对WTA的抗体对来自缺少TarM(ΔTarM),TarS(ΔTarS),或TarM和TarS二者(ΔTarM/ΔTarS)的糖基转移酶突变株的细胞壁制备物进行免疫印迹分析。对WTA上的α-GlcNAc修饰特异性的WTA抗体(S7574)不结合来自ΔTarM株的细胞壁制备物。反之,对WTA上的β-GlcNAc修饰特异性的WTA抗体(S4462)不结合来自ΔTarS株的细胞壁制备物。正如预期的,这两种抗体均不结合来自缺少这两种糖基转移酶的缺失株(ΔTarM/ΔTarS)和缺少任何WTA的株(ΔTagO)的细胞壁制备物。依照此类分析,已经将抗体表征为抗α-GlcNAcWTA单抗或抗β-GlcNAcWTA单抗,如图6A和6B中的表中列举的。
可以在抗体中的反应性位点处改造半胱氨酸氨基酸,它们不形成链内或链间二硫化物连接(Junutulaetal.,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornanetal.(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249；Shenetal.(2012)NatureBiotech.,30(2):184-191；Junutulaetal.(2008)JourofImmun.Methods332:41-52)。改造的半胱氨酸硫醇可以与本发明的具有硫醇反应性亲电子基团(诸如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)的接头试剂或接头-抗生素中间体反应以形成具有半胱氨酸改造的抗体(thioMab)和抗生素(abx)模块的AAC。抗生素模块的定位可以如此设计,控制,和知晓。可以控制抗生素载荷,因为改造的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或接头-抗生素中间体反应。改造抗WTA抗体,通过替代重或轻链上的一个位点来引入半胱氨酸氨基酸在对称的四聚体抗体上给出两个新的半胱氨酸。能实现接近2的抗生素载荷,而且缀合产物AAC接近均质。
在某些实施方案中,可能想要创建半胱氨酸改造的抗WTA抗体,例如“thioMAb”,其中抗体的一或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可及性位点处。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此放置在抗体的可及性位点处且可用于将抗体缀合至其它模块(诸如抗生素模块或接头-抗生素模块)以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，任何一或多个下述残基可以用半胱氨酸替代，包括轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。显示了抗WTA抗体的非限制性例示性半胱氨酸改造的重链A118C(SEQIDNO：149)和轻链V205C(SEQIDNO：151)突变体。可以如Junutulaetal.，2008bNatureBiotech.，26(8)：925-932；US7521541；US-2011/0301334所述来生成半胱氨酸改造的抗WTA抗体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的抗WTA抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链包含野生型重链恒定区序列或半胱氨酸改造的突变体(ThioMab)且所述轻链包含野生型轻链恒定区序列或半胱氨酸改造的突变体(ThioMab)。一方面，所述重链与下述各项具有至少95％序列同一性：
重链(IgG1)恒定区，野生型
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQIDNO：148)
重链(IgG1)恒定区，A118C“ThioFab”
CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQIDNO：149)
且所述轻链与下述各项具有至少95％序列同一性：
轻链(卡帕)恒定区，野生型
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR
GEC
(SEQIDNO：150)
轻链(卡帕)恒定区，V205C“ThioFab”
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRG
EC
(SEQIDNO：151)
本发明的AAC包括半胱氨酸改造的抗WTA抗体，其中野生型或亲本抗WTA抗体的一或多个氨基酸用半胱氨酸氨基酸替换。可以如此改造(即突变)任何形式的抗体。例如，可以改造亲本Fab抗体片段以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称作“ThioFab”。类似地，可以改造亲本单克隆抗体以形成“ThioMab”。应当注意，单位点突变在ThioFab中产生一个改造的半胱氨酸残基，而单位点突变在thioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基，原因在于IgG抗体的二聚体性质。对具有替换的(“改造的”)半胱氨酸(Cys)残基的突变体评估新引入的改造的半胱氨酸硫醇基团的反应性。
可以使用培养中的宿主细胞来生成本文所述抗体。可以用包含一或多种编码本文所述抗体的核酸的载体(表达或克隆载体)转化宿主细胞。可以在适合于生成抗体的条件下培养细胞，并且可以进一步纯化由细胞生成的抗体。对于生成抗体合适的细胞可以包括原核细胞，酵母细胞，或高等真核生物(例如哺乳动物)细胞。在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞(人或非人哺乳动物细胞)。在一些实施方案中，使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
可以培养哺乳动物细胞，而且培养(组织培养)中的哺乳动物细胞的扩增已经成为例行规程。哺乳动物宿主细胞系的例子可包括但不限于受SV40转化的猴肾CV1系(COS-7；ATCCCRL1651)；人胚肾系(293或为在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞；Grahametal.，J.GenVirol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK；ATCCCCL10)；小鼠Sertoli细胞(TM4；Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1；ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76；ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA；ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK；ATCCCCL34)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A；ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138；ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2；HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562；ATCCCCL51)；TRI细胞(Matheretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(HepG2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括骨髓瘤细胞系，诸如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如YazakiandWu，MethodsinMolecularBiology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，HumanaPress，Totowa，N.J.,2003),pp.255-268。
也可以利用棉,玉米,马铃薯,大豆,矮牵牛,番茄,浮萍(Leninaceae),苜蓿(M.truncatula),和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
对此目的合适的原核细胞包括真细菌,诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体,例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae),诸如埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli),肠杆菌属(Enterobacter),欧文氏菌属(Erwinia),克雷伯氏菌属(Klebsiella),变形菌属(Proteus),沙门氏菌属(Salmonella),例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium),沙雷氏菌属(Serratia),例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans),和志贺氏菌属(Shigella),以及芽孢杆菌属(Bacilli),诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P),假单胞菌属(Pseudomonas),诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa),和链霉菌属(Streptomyces)。其它优选的大肠杆菌克隆宿主有大肠杆菌294(ATCC31,446),尽管其它株诸如大肠杆菌B,大肠杆菌X1776(ATCC31,537),和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)是合适的。这些例子是例示性的,而非限制性的。
在原核生物以外,真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)是对于抗体编码载体合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母/啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae),或常用面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而,通常可获得多种其它属,种,和株且在本文中是有用的,诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主,诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis),脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424),保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045),威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178),瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500),果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906),耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans),和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces),诸如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌,诸如例如脉孢菌属(Neurospora),青霉属(Penicillium),弯颈霉属(Tolypocladium),和曲霉属(Aspergillus)宿主,诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
利福霉素型抗生素模块
本发明的抗体-抗生素缀合物(AAC)中的抗生素模块(abx)为利福霉素型抗生素或具有细胞毒性或细胞抑制性效应的基团。利福霉素是天然(通过细菌,地中海诺卡氏菌(Nocardiamediterranei),地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei))或人工获得的一组抗生素。它们是更大的抑制细菌RNA聚合酶的安沙霉素家族的一个亚类(Fujiietal.(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:1489-1492；Feklistovetal.(2008)ProcNatlAcadSciUSA,105(39):14820-5)且具有针对革兰氏阳性和选择性革兰氏阴性细菌的效力。利福霉素针对分枝杆菌特别有效,且因此用于治疗结核病,麻风,和鸟分枝杆菌复合物(MAC)感染。利福霉素型基团包括“经典的”利福霉素药物以及利福霉素衍生物利福平(力复平,CA注册号13292-46-1),利福布汀(CA注册号72559-06-9；US2011/0178001),利福喷汀和利福拉齐(CA注册号129791-92-0；Rothsteinetal.(2003)ExpertOpin.Investig.Drugs12(2):255-271；Fujiietal.(1994)Antimicrob.AgentsChemother.38:1118-1122)。许多利福霉素型抗生素共享抗性发生的有害特性(Wichelhausetal.(2001)J.Antimicrob.Chemother.47:153-156)。利福霉素最初是在1957年自地中海链霉菌(Streptomycesmediterranei)的发酵培养物分离的。发现了约7种利福霉素,名称为利福霉素A,B,C,D,E,S,和SV(US3150046)。利福霉素B是第一个商业上引入的,而且在1960年代在治疗药物抗性结核病中是有用的。利福霉素已经用于治疗多种疾病,最重要的那种是HIV相关结核病。由于多种类似物和衍生物可得,利福霉素已经广泛用于消除已经变得对常用抗生素有抗性的致病性细菌。例如,利福平因它的有力效果和预防药物抗性的能力而为人所知。它迅速杀死快速分裂的杆菌菌株以及“存留”细胞,它们长时间段保持生物学上无活性,这容许它们逃脱抗生素活性。另外,已经针对HIV阳性患者中获得的结核病使用利福布汀和利福喷汀二者。
式I抗体-抗生素缀合物中的抗生素模块(abx)为具有如下结构的利福霉素型模块:
其中:
虚线表示任选的键；
R为H,C1-C12烷基,或C(O)CH3；
R1为OH；
R2为CH＝N-(杂环基),其中所述杂环基是任选用一或多个独立选自C(O)CH3,C1-C12烷基,C1-C12杂芳基,C2-C20杂环基,C6-C20芳基,和C3-C12碳环基的基团替代的；
或R1和R2形成五或六元稠合杂芳基或杂环基,且任选形成螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环,其中所述螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环是任选用H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,或OH替代的；且
其中肽接头L共价附着至R2。
利福霉素型模块的一个实施方案是:
其中R3独立选自H和C1-C12烷基；R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S；且其中肽接头L共价附着至N(R3)2的氮原子。
利福平型模块的一个实施方案是:
其中
R5选自H和C1-C12烷基；且其中肽接头L共价附着至NR5的氮原子。
利福布汀型模块的一个实施方案是:
其中R5选自H和C1-C12烷基；且其中肽接头L共价附着至NR5的氮原子。
苯并嗪并利福霉素型模块的一个实施方案是:
其中R5选自H和C1-C12烷基；且其中肽接头L共价附着至NR5的氮原子。
本文中称作pipBOR,苯并嗪并利福霉素型模块的一个实施方案是:
其中R3独立选自H和C1-C12烷基；且其中肽接头L共价附着至N(R3)2的氮原子。
本文中称作二甲基pipBOR,苯并嗪并利福霉素型模块的一个实施方案是:
其中肽接头L共价附着至N(CH3)2的氮原子。
半合成衍生物利福霉素S或还原的钠盐形式利福霉素SV可以在数个步骤中转变成利福拉齐型抗生素,其中R为H或Ac,R3独立选自H和C1-C12烷基；R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S,如图9-11中例示的。可以制备苯并嗪并(Z＝O),苯并噻嗪并(Z＝S),苯并二嗪并(Z＝NH,N(C1-C12烷基)利福霉素(US7271165)。含有取代基的苯并嗪并利福霉素(BOR),苯并噻嗪并利福霉素(BTR),和苯并二嗪并利福霉素(BDR)类似物依照US7271165第28栏式A中提供的编号方案来编号,通过援引将其收录用于此目的。“25-O-去乙酰基”利福霉素表示一种利福霉素类似物,其中25位处的乙酰基基团已经去除。这个位置进一步衍生化的类似物称作“25-O-去乙酰基-25-(取代基)利福霉素”,其中衍生化基团的命名替换完整化合物名称中的“取代基”。
利福霉素型抗生素模块可以通过与US4610919；US4983602；US5786349；US5981522；US4859661；US7271165；US2011/0178001；Seligsonetal.(2001)Anti-CancerDrugs12:305-13；Chem.Pharm.Bull.,(1993)41:148中披露的方法类似的方法来合成,在此通过援引收录其每一篇。可以对利福霉素型抗生素模块筛选抗微生物活性,这通过使用标准MIC体外测定法测量它们的最小抑制浓度(MIC)来进行(Tomiokaetal.(1993)Antimicrob.AgentsChemother.37:67)。
肽接头
“肽接头”(L)是一种双官能度或多官能度模块,其共价附着至一或多个抗生素模块(abx)和抗体单元(Ab)以形成式I的抗体-抗生素缀合物(AAC)。AAC中的肽接头是由细胞内蛋白酶进行的切割的底物,包括溶酶体条件。蛋白酶包括各种组织蛋白酶和胱天蛋白酶。在细胞内部对AAC中的肽接头的切割可释放具有抗细菌效果的利福霉素型抗生素。
自切割AAC释放的活性抗生素的量可以通过实施例20的胱天蛋白酶释放测定法来测量。
抗体-抗生素缀合物(AAC)可以使用具有结合抗生素(abx)和抗体(Ab)的反应性官能度的接头试剂或接头-抗生素中间体来方便地制备。在一个例示性实施方案中,半胱氨酸改造的抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇能与接头试剂,抗生素模块或抗生素-接头中间体的官能团形成键。
AAC中的肽接头模块
一方面,接头试剂或接头-抗生素中间体具有反应性位点,其具有亲电子基团,对抗体上存在的亲核半胱氨酸是反应性的。抗体上的半胱氨酸硫醇与接头试剂或接头-抗生素上的亲电子基团是反应性的,形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
依照Klussmanetal.(2004),BioconjugateChemistry15(4):765-773第766页的缀合方法和依照实施例19的方案,半胱氨酸改造的抗体与具有亲电子官能团(诸如马来酰亚胺或α-卤代羰基)的接头试剂或接头-抗生素中间体反应。
在另一个实施方案中,接头试剂或接头-抗生素中间体的反应性基团含有硫醇反应性官能团,能与抗体上的游离半胱氨酸硫醇形成键。硫醇反应官能团的例子包括但不限于马来酰亚胺,α-卤代乙酰基,活化的酯诸如琥珀酰亚胺酯,4-硝基苯基酯,五氟苯基酯,四氟苯基酯,酸酐,酰基氯,磺酰氯,异氰酸和异硫氰酸。
在另一个实施方案中,接头试剂或抗生素-接头中间体具有反应性官能团,其具有对抗体上存在的亲电子基团反应性的亲核基团。抗体上的有用的亲电子基团包括但不限于吡啶基二硫化物,醛和酮羰基基团。接头试剂或抗生素-接头中间体的亲核基团的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。接头试剂或抗生素-接头中间体上的有用的亲核基团包括但不限于酰肼,肟,氨基,硫醇,肼,缩氨基硫脲(thiosemicarbazone),肼羧酸酯,和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供方便的位点,用于附着至接头试剂或抗生素-接头中间体。
肽接头可以包含一或多个接头构件。例示性接头构件包括肽单元,6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”),马来酰亚胺基丙酰基(“MP”),缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”),丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”),和对氨基苄氧羰基(“PAB”),N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”),和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“MCC”)。本领域已知多种接头构件,下文描述了其中一些。
在另一个实施方案中,可以用调控溶解性或反应性的基团取代接头。例如,带电荷的取代基(诸如磺酸根(-SO3 -)或铵)可提高试剂的水溶性和推动接头试剂与抗体或抗生素模块的偶联反应,或推动Ab-L(抗体-接头中间体)与abx或abx-L(抗生素-接头中间体)与Ab的偶联反应,取决于用于制备AAC的合成路线。
本发明的AAC明确涵盖但不限于用下述接头试剂制备的那些:BMPEO,BMPS,EMCS,GMBS,HBVS,LC-SMCC,MBS,MPBH,SBAP,SIA,SIAB,SMCC,SMPB,SMPH,sulfo-EMCS,sulfo-GMBS,sulfo-KMUS,sulfo-MBS,sulfo-SIAB,sulfo-SMCC,sulfo-SMPB,SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯),和二-马来酰亚胺试剂(诸如DTME,BMB,BMDB,BMH,BMOE,BM(PEG)2,和BM(PEG)3)。二-马来酰亚胺试剂容许半胱氨酸改造的抗体的硫醇基团以序贯或收敛方式附着至含有硫醇的抗生素模块,标记物,或接头中间体。除马来酰亚胺以外与半胱氨酸改造的抗体,抗生素模块,或接头-抗生素中间体的硫醇基团反应性的其它官能团包括碘乙酰胺,溴乙酰胺,乙烯基吡啶,二硫化物,吡啶基二硫化物,异氰酸根,和异硫氰酸根。
有用的接头试剂还可以经其它商业来源获得,诸如MolecularBiosciencesInc.(Boulder,CO),或依照Tokietal.(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchiketal.(1997)TetrahedronLetters,38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frischetal.(1996)BioconjugateChem.7:180-186；US6214345；WO02/088172；US2003130189；US2003096743；WO03/026577；WO03/043583；和WO04/032828中记载的规程合成。
在另一个实施方案中,AAC中的肽接头模块包含树状聚物型接头,用于经由分支的,多官能度的接头模块将超过一个抗生素模块共价附着至抗体(Sunetal.(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215；Sunetal.(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768)。树状聚物接头能提高抗生素对抗体的摩尔比,即载荷,它与AAC的效力有关。如此,在半胱氨酸改造的抗体只携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团的情况中,可以经由树状聚物接头附着多个抗生素模块。
在式IAAC的某些实施方案中,肽接头具有下式:
-Str-Pep-Y-
其中Str为延伸物单元,共价附着至抗壁磷壁酸(WTA)抗体,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元,共价附着至利福霉素型抗生素。此类接头的例示性实施方案记载于US7498298,通过援引明确收入本文。
在一个实施方案中,延伸物单元“Str”具有下式:
其中R6选自下组:C1-C10亚烷基-,-C3-C8碳环,-O-(C1-C8烷基)-,-亚芳基-,-C1-C10亚烷基-亚芳基-,-亚芳基-C1-C10亚烷基-,-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-,-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-,-C3-C8杂环-,-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-,-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-,-(CH2CH2O)r-,和-(CH2CH2O)r-CH2-；且r为范围为1至10的整数。
下文显示例示性延伸物单元(其中波浪线指示共价附着至抗体的位点):
肽单元“Pep”包含两或更多个天然存在氨基酸残基,包括20种主要氨基酸以及次要氨基酸(诸如瓜氨酸),它们是生物化学领域公知的。氨基酸通过它们的侧链来区分。肽单元如此包含两或更多个氨基酸侧链,包括但不限于-CH3(丙氨酸),-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2(精氨酸),-CH2C(O)NH2(天冬酰胺),-CH2CO2H(天冬氨酸),-CH2CH2CH2NHC(O)NH2(瓜氨酸),-CH2SH(半胱氨酸),-CH2CH2CO2H(谷氨酸),-CH2CH2C(O)NH2(谷氨酰胺),-H(甘氨酸),-CH2(咪唑基)(组氨酸),-CH(CH3)CH2CH3(异亮氨酸),-CH2CH(CH3)CH3(亮氨酸),-CH2CH2CH2CH2NH2(赖氨酸),-CH2CH2SCH3(甲硫氨酸),-CH2(C6H5)(苯丙氨酸),-CH2CH2CH2-(脯氨酸),-CH2OH(丝氨酸),-CH(OH)CH3(苏氨酸),-CH2(吲哚)(色氨酸),-CH2(p-C6H4OH)(酪氨酸),-CHCH(CH3)CH3(缬氨酸)。参见"OrganicChemistry"5thEd.JohnMcMurry,Brooks/Colepub.(2000)第1076-1077页。肽单元的氨基酸残基包括所有立体异构体,而且可以是D或L构型的。在一个实施方案中,Pep包含2-12个独立选自甘氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,赖氨酸,精氨酸,缬氨酸,和瓜氨酸的氨基酸残基。在一个此类实施方案中,氨基酸单元容许蛋白酶切割接头,由此推动在暴露于细胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)时自AAC释放抗生素(Doroninaetal.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。例示性氨基酸单元包括但不限于二肽,三肽,四肽,五肽,和六肽。例示性二肽包括:缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit),丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。例示性三肽包括:甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit),缬氨酸-瓜氨酸-苯丙氨酸(val-cit-phe),和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。别的肽接头包括GGAFAGGG(SEQIDNO:126)；tpm-cit；GPImeLFF(SEQIDNO:129)；和LAFG(SEQIDNO:128)。可以通过在两或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽接头。可以例如依照肽化学领域公知的液相合成方法来制备此类肽键(E.andK.(1965)“ThePeptides”,volume1,pp76-136,AcademicPress)。氨基酸单元可以在它们对于由特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶,组织蛋白酶B,C和D,或纤溶酶蛋白酶)进行的酶促切割的选择性方面设计和优化。
在一个实施方案中,间隔物单元Y包含对氨基苄基或对氨基苄氧羰基。“非自我牺牲”间隔物单元是如下的,其中部分或整个间隔物单元在酶促(例如蛋白水解)切割AAC时保持结合抗生素模块。非自我牺牲间隔物单元的例子包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。还涵盖对序列特异性酶促切割易感的肽间隔物的其它组合。例如,肿瘤细胞相关蛋白酶对含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的AAC的酶促切割会导致自AAC的剩余部分释放甘氨酸-甘氨酸-抗生素模块。在一个此类实施方案中,甘氨酸-甘氨酸-抗生素模块然后在肿瘤细胞中进行另一个水解步骤,如此自抗生素模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
间隔物单元容许在没有另一个水解步骤的情况中释放抗生素模块。间隔物单元可以是“自我牺牲的”或“非自我牺牲的”。在某些实施方案中,接头的间隔物单元包含对氨基苄基单元(PAB)。在一个此类实施方案中,对氨基苄基醇经对氨基苄基基团和抗生素模块之间的酰胺键,氨基甲酸酯,甲基氨基甲酸酯,或碳酸酯附着于氨基酸单元(Hamannetal.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一个实施方案中,间隔物单元为对氨基苄氧羰基(PAB)。
在一个实施方案中,抗生素在附着至肽接头的PAB间隔物单元时形成季胺,诸如二甲基氨基哌啶基基团。此类季胺的例子有接头-抗生素中间体(LA),来自表2的54,61,66,67,73,74,76,78,79,83,84。季胺基团可调控对抗生素模块的切割以优化AAC的抗细菌效果。在另一个实施方案中,抗生素连接至肽接头的PABC间隔物单元,形成AAC中的氨基甲酸酯官能团。此类氨基甲酸酯官能团也可优化AAC的抗细菌效果。PABC氨基甲酸酯接头-抗生素中间体(LA)的例子有来自表2的51,52,53,55,56,57,58,62,63,64,65,72,75,80,81,87。其它接头-抗生素中间体(LA)采用酰胺(59,69,70,71,77,82,85)或酚(60,68,86)基团。
自我牺牲间隔物的其它例子包括但不限于在电子上与PAB基团相似的芳香族化合物,诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(US7375078；Hayetal.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻或对氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时经历环化的间隔物,诸如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodriguesetal.(1995)ChemistryBiology2:223),恰当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(Stormetal.(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberryetal.(1990)J.Org.Chem.55:5867)。消除在甘氨酸处取代的含有胺的药物(Kingsburyetal.(1984)J.Med.Chem.27:1447)也是在AAC中有用的自我牺牲间隔物的例示。
对于AAC有用的接头-抗生素中间体
通过偶联利福霉素型抗生素模块与肽-接头试剂来制备式II和表2的接头-抗生素中间体(LA),如图23-25和实施例1-17中例示的。通过WO2012/113847；US7659241；US7498298；US20090111756；US2009/0018086；US6214345；Dubowchiketal.(2002)BioconjugateChem.13(4):855-869中记载的方法来制备接头试剂,包括:
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6
6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)己酰胺8
N-((S)-1-((S)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)-6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9
表2:接头-抗生素中间体(LA)
抗体-抗生素缀合物的实施方案
经蛋白酶可切割的肽接头,将S4497抗体连接至表3中称作pipBOR和其它的利福霉素衍生物。接头设计成受溶酶体蛋白酶切割,包括组织蛋白酶B,D和识别肽单元(包括缬氨酸-瓜氨酸(val-cit,vc)二肽)的其它(Dubowchiketal.(2002)Bioconj.Chem.13:855-869)。实施例1-17中详细描述了由抗生素和MC-vc-PAB接头和其它组成的接头-抗生素中间体的生成。接头设计成对PAB模块处的酰胺键的切割将抗体与活性状态的抗生素分开。
除了抗生素上的二甲基化氨基和接头上的氧羰基基团之外,称作S4497-二甲基-pipBOR的AAC与S4497-pipBORAAC相同。
图5显示抗体-抗生素缀合物(AAC)的药物活化的一种可能机制。活性抗生素(Abx)只在AAC在哺乳动物细胞内部内在化后释放。AAC中的抗体的Fab部分结合金黄色葡萄球菌,而AAC的Fc部分通过Fc受体介导的对吞噬性细胞(包括嗜中性细胞和巨噬细胞)的结合而增强细菌摄取。在内在化入吞噬溶酶体后,Val-Cit接头受到溶酶体蛋白酶切割,在吞噬溶酶体内部释放活性抗生素。
本发明的抗体-抗生素缀合物(AAC)化合物的一个实施方案包括下述:
其中AA1和AA2独立选自氨基酸侧链,包括H,-CH3,-CH2(C6H5),-CH2CH2CH2CH2NH2,-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,-CHCH(CH3)CH3,和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2；且包括下式:
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述:
其中:
虚线表示任选的键；
R为H,C1-C12烷基,或C(O)CH3；
R1为OH；
R2为CH＝N-(杂环基),其中所述杂环基是任选用一或多个独立选自C(O)CH3,C1-C12烷基,C1-C12杂芳基,C2-C20杂环基,C6-C20芳基,和C3-C12碳环基的基团替代的；
或R1和R2形成五或六元稠合杂芳基或杂环基,且任选形成螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环,其中所述螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环是任选用H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,或OH取代的；
L为肽接头,附着至R2或由R1和R2形成的稠合杂芳基或杂环基；且
Ab为抗壁磷壁酸(WTA)抗体。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述:
其中R3独立选自H和C1-C12烷基；n为1或2；R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述力复平型抗生素模块:
其中R5选自H和C1-C12烷基；且n为0或1。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述利福布汀型抗生素模块:
其中R5选自H和C1-C12烷基；且n为0或1。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述利福拉齐型抗生素模块:
其中R5独立选自H和C1-C12烷基；且n为0或1。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述pipBOR型抗生素模块:
其中R3独立选自H和C1-C12烷基；且n为1或2。
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的一个实施方案包括下述:
本发明的抗体-抗生素缀合物化合物的又一些实施方案包括下述:
AAC的抗生素载荷
抗生素载荷以p表示,即式I的分子中每个抗体的抗生素(abx)模块的平均数。抗生素载荷的范围可以为每个抗体1至20个抗生素模块(D)。式I的AAC包括缀合有一定范围,1至20个抗生素模块的抗体的集合或池。来自缀合反应的AAC制备物中每个抗体的抗生素模块的平均数可以通过常规手段表征,诸如质谱术,ELISA测定法,和HPLC。还可以测定AAC就p而言的数量分布。在一些情况中,p为某个值的均质AAC自具有其它抗生素载荷的AAC的分开,纯化,和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳等手段来实现。
对于一些抗体-抗生素缀合物,p可能受抗体上的附着位点的数目限制。例如,在附着为半胱氨酸硫醇的情况中,正如上文例示性实施方案中的,抗体可能只有一或数个半胱氨酸硫醇基团,或可能只有一或数个足够反应性的硫醇基团,由此可附着接头。在某些实施方案中,较高的抗生素载荷(例如p>5)可能引起某些抗体-抗生素缀合物的聚集,不溶性,毒性,或细胞通透性丧失。在某些实施方案中,本发明的AAC的抗生素载荷的范围为1至约8；约2至约6；约2至约4；或约3至约5；约4；或约2。
在某些实施方案中,缀合反应期间少于理论最大值的抗生素模块缀合至抗体。抗体可能含有例如不与下文讨论的抗生素-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基。通常,抗体不会含有许多可连接至抗生素模块的游离和反应性半胱氨酸硫醇基团；事实上,抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥存在。在某些实施方案中,可以在部分或完全还原条件下用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP))还原抗体以生成反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中,对抗体进行变性条件以揭示反应性亲核基团(诸如赖氨酸或半胱氨酸)。
可以以不同方式控制AAC的载荷(抗生素/抗体比,“AAR”),例如通过:(i)限制抗生素-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量,(ii)限制缀合反应时间或温度,和(iii)部分或限制性的用于半胱氨酸硫醇修饰的还原性条件。
要理解,在超过一个亲核基团与抗生素-接头中间体或接头试剂,接着抗生素模块试剂反应的情况中,所得产物是AAC化合物的混合物,其具有一或多个抗生素模块附着至抗体的分布。可以通过对抗体特异性且对抗生素特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的抗生素的平均数。可以通过质谱术来鉴定混合物中的个别AAC分子,并通过HPLC(例如疏水相互作用层析)来分开(参见例如McDonaghetal.(2006)Prot.Engr.Design&Selection19(7):299-307；Hamblettetal.(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Hamblett,K.J.etal.,“Effectofdrugloadingonthepharmacology,pharmacokinetics,andtoxicityofananti-CD30antibody-drugconjugate,”AbstractNo.624,AmericanAssociationforCancerResearch,2004AnnualMeeting,March27-31,2004,ProceedingsoftheAACR,Volume45,March2004；Alley,S.C.etal.,“Controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates,”AbstractNo.627,AmericanAssociationforCancerResearch,2004AnnualMeeting,March27-31,2004,ProceedingsoftheAACR,Volume45,March2004)。在某些实施方案中,可以通过电泳或层析自缀合混合物分离具有单一载荷值的均质AAC。本发明的半胱氨酸改造的抗体能够实现更加均质的制备物,因为抗体上的反应性位点主要受限于改造的半胱氨酸硫醇。在一个实施方案中,每个抗体的抗生素模块的平均数在约1至约20的范围中。在一些实施方案中,范围选择和控制为约1至4。
制备抗体-抗生素缀合物的方法
式I的AAC可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应,条件,和试剂通过数种路线来制备,包括:(1)抗体上的亲核基团与二价接头试剂反应经共价键形成Ab-L,接着与抗生素模块(abx)反应；和(2)抗生素模块上的亲核基团与二价接头试剂反应经共价键形成L-abx,接着与抗体上的亲核基团反应。用于经后一种路线制备式I的AAC的例示性方法记载于US7498298,通过援引将其明确收入本文。
抗体上的亲核基团包括但不限于:(i)N端胺基团,(ii)侧链胺基团,例如赖氨酸,(iii)侧链硫醇基团,例如半胱氨酸,和(iv)抗体是糖基化的情况中的糖羟基或氨基基团。胺,硫醇,和羟基基团是亲核的且能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键,接头包括:(i)活性酯,诸如NHS酯,HOBt酯,卤代甲酸酯,和酰基卤；(ii)烃基和苄基卤,诸如卤代乙酰胺；(iii)醛,酮,羧基,和马来酰亚胺基团。某些抗体具有还原性链间二硫化物,即半胱氨酸桥。通过用诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)等还原剂处理,使得完全或部分还原抗体,可以将抗体制成反应性的用于与接头试剂缀合。每个半胱氨酸桥会如此形成理论上两个反应性硫醇亲核体。可以经由修饰赖氨酸残基将别的亲核基团引入抗体,例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)反应,导致胺转变成硫醇。可以通过引入1,2,3,4,或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体抗体)将反应性硫醇基团引入抗体。
本发明的抗体-抗生素缀合物也可以通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基基团)与接头试剂或抗生素上的亲核基团之间的反应来生成。接头试剂上的有用的亲核基团包括但不限于酰肼,肟,氨基,肼,缩氨基硫脲,肼羧酸酯,和芳基酰肼。在一个实施方案中,修饰抗体以引入能够与接头试剂或抗生素上的亲核取代基反应的亲电子模块。在另一个实施方案中,可以氧化糖基化抗体的糖(例如用高碘酸盐氧化试剂)以形成醛或酮基团,其可以与接头试剂或抗生素模块上的胺基团反应。所得亚胺Schiff碱基团可以形成稳定的连接,或者可以还原(例如通过硼氢化物试剂)以形成稳定的胺连接。在一个实施方案中,糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠任一的反应可在抗体中产生羰基(醛和酮)基团,其能与抗生素上的恰当基团反应(Hermanson,BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中,含有N端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体能与偏高碘酸钠反应,导致醛生成,代替第一个氨基酸(Geoghegan&Stroh,(1992)BioconjugateChem.3:138-146；US5362852)。此类醛能与抗生素模块或接头亲核体反应。
抗生素模块上的亲核基团包括但不限于:胺,硫醇,羟基,酰肼,肟,肼,缩氨基硫脲,肼羧酸酯,和芳基酰肼基团,它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键,接头包括:(i)活性酯,诸如NHS酯,HOBt酯,卤代甲酸酯,和酰基卤；(ii)烃基和苄基卤,诸如卤代乙酰胺；(iii)醛,酮,羧基,和马来酰亚胺基团。
表3中的抗体-抗生素缀合物(AAC)通过缀合所描述的抗WTA抗体和表2中的接头-抗生素中间体,并依照实施例24中描述的方法来制备。通过体外巨噬细胞测定法(实施例18)和体内小鼠肾模型(实施例19)对AAC测试功效。
证明AAC杀死细胞内MRSA的体外分析
体外实验确认AAC只在抗体和抗生素之间的接头受到适宜酶(诸如组织蛋白酶B)切割之后释放活性抗生素。将MRSA在常规细菌生长培养基和多至10μg/mLAAC中培养过夜。MRSA与S4497-pipBOR或S4497-二甲基-pipBORAAC一起温育没有导致对细菌生长的抑制,除非用组织蛋白酶B预处理AAC以释放活性抗生素。利用鼠腹膜巨噬细胞的一项体外测定法确认了AAC释放活性抗生素并杀死在吞噬性细胞内部的MRSA(实施例18)。一种AAC包含抗体rF1,其结合一个细胞壁相关蛋白家族,缀合至利福霉素衍生物。用多种剂量的rF1-AAC或等效剂量的单独的抗体,单独的利福平或抗体和游离的利福平的混合物任一处理金黄色葡萄球菌(Newman株)以允许抗体结合细菌(调理),并温育1小时后将经过调理的细菌补料至巨噬细胞(图7A)。
图7A显示一种体外巨噬细胞测定法,证明AAC杀死细胞内MRSA。将金黄色葡萄球菌(Newman)与单独的rF1抗体,单独的游离的利福平,以与在AAC中找到的相同的抗体对抗生素比组合的rF1抗体加游离的利福平的简单混合物,或rF1-AAC一起温育1小时,并添加至鼠巨噬细胞。将巨噬细胞于37℃温育2小时以允许吞噬。吞噬完成后,用补充有50μg/mL庆大霉素的正常生长培养基替换感染混合物以抑制细胞外细菌生长,并在感染后2天通过涂板来测定存活细胞内细菌的总数。
感染巨噬细胞2小时,去除并用含有庆大霉素的培养基替换感染以杀死未被巨噬细胞摄取的任何剩余细胞外细菌。2天后,裂解巨噬细胞,并通过在琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的总数。分析揭示用AAC处理导致细胞内细菌数目与用以与在AAC中找到的相同的抗体对抗生素比组合的rF1抗体加游离的利福平的简单混合物处理相比降低超过100倍(图7A)。
MRSA能够侵入多种非吞噬性细胞类型,包括成骨细胞和各种上皮和内皮细胞类型(GarzoniandKelly(2008)TrendsinMicrobiology)。MRSA能够感染成骨细胞细胞系(MG63),气道上皮细胞系(A549)和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的原代培养物。图7B显示50μg/mLS4497-pipBORAAC102在巨噬细胞,成骨细胞(MG63),气道上皮细胞(A549),和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)中的MRSA(USA300株)细胞内杀伤,其中裸的,未缀合的抗体S4497不然。这些细胞类型有可能表达比专职吞噬性细胞(诸如巨噬细胞)要低的总体水平的组织蛋白酶B,然而用50μg/mL处理的MRSA在内在化入所有三种这些细胞系后被有效杀死。虚线指示测定法的检测极限。
实施体外分析以比较连接抗体与抗生素的接头中有变异的生成的AAC的活性。在巨噬细胞细胞内杀伤测定法中S4497-二甲基-pipBORAAC比S4497-pipBORAAC更有力。滴定S4497-pipBORAAC和S4497-二甲基-pipBORAAC以测定在我们的巨噬细胞细胞内杀伤测定法中的最小有效剂量(图7C)。用至少2μg/mLAAC处理可能是实现最佳细胞内细菌清除所必需的。
图7C显示用pipBOR51较之二甲基-pipBOR(diMe-pipBOR)54生成的AAC的比较。用单独的S4497抗体或用AAC:S4497-pipBOR102或S4497-二甲基-pipBOR105(以范围为10μg/mL至0.003μg/mL的多种浓度)调理MRSA。这些数据揭示对于这两种AAC,以超过2μg/mL测试AAC时发生最佳杀伤,活性的剂量依赖性丧失在0.4μg/mL变得明显。S4497-二甲基-pipBORAAC105的总体杀伤水平显著优越。用更高剂量的S4497-二甲基-pipBORAAC105处理消除细胞内细菌至低于检测极限,而且使用亚最佳剂量.4μg/mLAAC观察到超过300倍的杀伤。
图7D显示AAC杀死细胞内细菌且不损害巨噬细胞。将金黄色葡萄球菌的USA300株与50μg/mLS4497抗金黄色葡萄球菌抗体(抗体)或50μg/mLthio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105AAC一起预温育1小时以允许抗体结合细菌。以10-20个细菌每个巨噬细胞的感染复数将经过调理的细菌添加至鼠腹膜巨噬细胞,并于37℃温育2小时以允许吞噬。吞噬完成后,去除游离的细菌,并将巨噬细胞在补充有50μg/mL庆大霉素的正常生长培养基中培养2天以杀死非内在化细菌。在培养期结束时,通过检测释放入培养物上清液的胞质乳糖脱氢酶(LDH)来评估巨噬细胞的存活。将自每个孔释放的LDH的总量与含有通过将洗涤剂添加至孔来裂解的巨噬细胞的对照孔比较。测量用洗涤剂,未感染的巨噬细胞,用经S4497抗体预调理的USA300感染的巨噬细胞或用经thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105AAC预调理的USA300感染的巨噬细胞处理的孔中巨噬细胞细胞裂解的程度。
图7E显示自上文巨噬细胞细胞裂解自巨噬细胞内部回收活的USA300。裂解巨噬细胞,并将细胞裂解物的连续稀释液涂板以清点存活细胞内细菌的数目。
图9显示一种生长抑制测定法,证明AAC对金黄色葡萄球菌无毒,除非接头受到组织蛋白酶B切割。左边显示一种示意性组织蛋白酶释放测定法(实施例20)。用组织蛋白酶B处理AAC以释放游离的抗生素。通过制备所得反应的连续稀释液并测定AAC能够抑制金黄色葡萄球菌生长的最小剂量,测定完整的较之用组织蛋白酶B处理的AAC的抗生素活性的总量。右上线图显示thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102的组织蛋白酶释放测定法,而右下线图显示thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105的组织蛋白酶释放测定法。
抗体-抗生素缀合物的体内功效
建立了小鼠中的一种体内腹膜炎模型来测试AAC的功效。在这种模型中,通过腹膜内注射(I.P.)MRSA来感染小鼠,并在感染后2天监测腹膜液和肾中的细菌载荷。自腹膜收获的细菌可以作为自由漂浮的细胞外细菌或在腹膜细胞(主要是募集至感染部位的嗜中性细胞和巨噬细胞)内部内在化而被找到。虽然在这种模型中鉴定的细胞外细菌看来对抗生素处理敏感,但是细胞内细菌显示出不响应多种临床相关抗生素(包括力复平)的处理(Sandbergetal.(2009)AntimicrobialAgentsChemother)并因此看来是卓越的用来测试我们AAC的功效的靶物。
图8A显示S4497-pipBORAAC102的体内功效。A/J小鼠中的腹膜内感染模型。通过腹膜内注射用5x107CFUMRSA感染小鼠,并通过腹膜内注射用50mg/Kg单独的S4497抗体或50mg/KgS4497-pipBORAAC102处理(方案11-2032A)。感染后2天处死小鼠,并评估腹膜上清液(细胞外细菌),腹膜细胞(细胞内细菌)或肾中的总细菌载荷。
用USA300感染A/J小鼠,并在感染后30分钟施用50mg/KgS4497抗体或S4497-pipBORAAC102任一。2天后,处死小鼠并监测腹膜洗出液和肾中的细菌载荷。为了区分细胞外和细胞内细菌,温和离心腹膜洗出液以分开含有细胞外细菌的上清液和腹膜细胞。在收获时用溶葡萄球菌素处理腹膜细胞以杀死任何污染性细胞外细菌并裂解以清点细胞内细菌的总数。虽然用单独的抗体处理的小鼠容纳腹膜洗出液中的105至106CFU细胞内和细胞外细菌二者和肾中的104至106个细菌,但是用S4497-pipBORAAC处理的小鼠清除感染至低于检测极限。这些数据揭示了虽然AAC设计成在吞噬溶酶体内部释放活性抗生素,但是观察到对MRSA的细胞内和细胞外池的卓越清除。既然AAC没有直接杀死细胞外细菌,那么AAC处理也清除这些细菌的事实提示要么显著比例的细胞外细菌在感染期间的一定时间被细胞摄取,要么AAC能够增强对细胞外细菌的摄取,由此提高细胞内的细菌的相对比例,在细胞内细菌被AAC有效杀死。
还检查了AAC在一种静脉内感染模型中的功效。在这种模型中,在感染后不久金黄色葡萄球菌被循环中的嗜中性细胞摄取,使得在感染后几分钟内在血液中找到的细菌大多与宿主细胞有关(Rogersetal.(1956)J.Exp.Med.103:713-742)。通过静脉内注射用2x106CFUMRSA感染A/J小鼠,然后在感染后30分钟通过静脉内注射用50mg/KgAAC处理。在这种模型中,感染的首要部位为肾,而且小鼠形成到感染后2天时可检测的大脓肿且在处理缺失下长达30天未能清除。用50mg/KgS4497-pipBORAAC102处理清除所有测试小鼠中的感染(图8B)。
图8B显示A/J小鼠中的静脉内感染模型。通过静脉内注射用2x106CFU感染小鼠,并用50mg/KgS4497抗体,50mg/KgS4497-pipBORAAC102或50mg/KgS4497抗体+.5mg/Kg游离利福霉素的简单混合物处理。感染后30分钟通过IV注射投递处理,并在感染后4天收获肾。灰色虚线指示每个器官的检测极限。用50mg/Kg单独的S4497抗体或50mg/KgS4497抗体加0.5mg/kg游离利福霉素(50mg/KgAAC中存在的抗生素的等效剂量)的简单混合物处理的对照组是无效的。
在A/J小鼠中的静脉内感染模型中体内比较用pipBOR和二甲基-pipBOR抗生素模块生成的AAC的功效。感染后30分钟以范围为50mg/Kg至2mg/Kg的多种剂量施用S4497-pipBORAAC102(图9A)或S4497-二甲基-pipBORAAC105(图9B),并在感染后4天检查肾以测定总细菌载荷。图9A显示通过滴定S4497-pipBORAAC102得到的pipBORAAC102在静脉内感染模型中的功效。通过静脉内注射入尾静脉用2x106CFUMRSA(USA300株)感染7周龄雌性A/J小鼠。图9B显示通过滴定S4497-二甲基-pipBORAAC105得到的二甲基-pipBORAAC105在静脉内感染模型中的功效。感染后30分钟以所示剂量施用S4497抗体,AAC102或AAC105处理。感染后4天处死小鼠,并通过涂板来测定每只小鼠的存活细菌的总数(合并2个肾)。
两种AAC在最高剂量50mg/Kg均是有效的,然而S4497-pipBORAAC102在更低剂量只是部分有效。S4497-二甲基-pipBORAAC105在10mg/Kg以上的剂量产生完全细菌清除。后续实验指示一致的细菌清除需要15mg/Kg以上的剂量。图9A和9B显示在静脉内感染模型中thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR105AAC比thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR102AAC更加有效,指示102和105之间氨基甲酸酯(51)和二甲基哌啶基(54)结构差别的影响。
感染后30分钟用AAC处理小鼠。为了更好地复制寻求治疗的MRSA患者中有可能发生的条件,确定AAC是否有效清除已建立的感染及连接抗生素与抗金黄色葡萄球菌抗体提供胜过单独的抗生素处理的确切优势。为此,比较AAC与等效剂量的抗生素二甲基-pipBOR的功效。
图9C显示通过静脉内注射用2x107CFUMRSA感染的CB17.SCID小鼠(方案12-2418)。感染后1天,用50mg/KgS4497抗体,50mg/KgS4497二甲基-pipBORAAC105或0.5mg/Kg二甲基-pipBOR抗生素7(50mg/KgAAC中含有的抗生素的等效剂量)处理小鼠。感染后4天处死小鼠,并通过涂板来测定每只小鼠的存活细菌的总数(合并2个肾)。50mg/KgS4497-二甲基-pipBORAAC处理在感染后1天给予时显然是有效的,而用单独的等效剂量的二甲基-pipBOR处理未能清除感染。
AAC处理在人抗体存在下是有效的且优于当前标准护理(SOC)万古霉素处理
S4497抗体是自衍生自金黄色葡萄球菌感染患者的B细胞克隆的。这引起了正常人血清或MRSA感染患者中存在的血清可能含有会与我们的AAC竞争结合的抗MRSA抗体的担忧。为了解决这一点,测试衍生自正常健康供体和一组MRSA患者的人血清以评估与AAC识别相同抗原的抗MRSA抗体的总体水平。开发了一种基于ELISA的测定法,其使用来自MRSA的细胞壁制备物。为了限制这些测定法中对细胞壁制备物的非抗原特异性结合,利用蛋白A的基因有缺陷的一种MRSA菌株。蛋白A结合IgG抗体的Fc区。检查多份野生型(WT)血清样品对表达S4497抗原的MRSA(图10A,WT)的结合,与对缺乏受S4497抗体识别的糖修饰的MRSA株TarM/TarSDKO(双重敲除)突变体的结合比较。图10A显示人血清中抗金黄色葡萄球菌抗体的流行度。金黄色葡萄球菌感染患者或正常对照含有大量的与抗WTAS4497具有相同特异性的WTA特异性血清抗体。
使用较好地结合受S4497识别的相同抗原的一种单克隆抗体生成一条标准曲线。通过比较血清样品中的结合水平与自用于生成标准曲线的抗体获得的信号,评估自正常健康供体或MRSA患者衍生的血清样品或自正常血清分离的总IgG制备物中存在的抗MRSA抗体的水平(图10A)。正常人血清含有10-15mg/mL总IgG(Manzetal.(2005)AnnuRev.Immunol.23:367)。对不同血清样品中抗MRSA反应性的分析揭示了多至300μg/mL的这些抗体是对受S4497识别的相同抗原潜在反应性的且因此有可能与AAC竞争结合。
使用S4497抗体来生成AAC,因为它具有包括很高的在MRSA上的结合(估计50,000个结合位点每个细菌)的特性。甚至在人血清中找到的竞争性抗体存在下,仍然可能有足够数目的AAC能够结合MRSA。为了直接测试这一点,在补充有10mg/mL人IgG的缓冲液中滴定S4497-二甲基-pipBORAAC(图10B,+IGIV),并在巨噬细胞细胞内杀伤测定法中测量细胞内杀伤的水平。
图10B显示一种体内感染模型,证明AAC在生理水平的人IgG存在下是有效的。用MRSAUSA300株进行的体外巨噬细胞测定法显示S4497-二甲基-pipBORAAC105在10mg/mL人IgG存在下是有效的。将MRSAUSA300株用单独的AAC或在10mg/mL人IgG中稀释的AAC于37℃在摇动中调理1小时。将经过调理的细菌直接添加至鼠腹膜巨噬细胞,并温育2小时以允许吞噬。感染后,在补充有庆大霉素的完整培养基中维持巨噬细胞培养物,并在感染后2天评估存活细胞内细菌的总数。这些数据揭示了虽然人IgG在较低剂量确实抑制AAC杀伤,但是使用10μg/mL(在体内容易实现的抗体浓度)以上的剂量实现了卓越的杀伤。正常血清IgG能降低105AAC的功能性效果。既然AAC的最大巨噬细胞细胞内杀伤活性可能需要高抗原结合和有效的与FcR的相互作用(为了调理吞噬)二者,预先存在的血清抗体可能竞争对WTA的结合且相应形成的免疫复合物竞争对巨噬细胞上的FcR的结合。
为了确认在体内AAC在竞争性人抗体存在下会是有效的,修饰体内感染模型以生成在血清中表达正常水平的人IgG的小鼠。通过每天给药高度浓缩的人IgG(IGIV),用10mg/mL人IgG重建缺乏T细胞和B细胞二者且因此在血清中不具有抗体的CB17:SCID小鼠(Bosna&Carroll(1991)AnnRevImmunol.9:323)。初步研究确认了称作SCID:huIgG的这些小鼠确实在血清中具有持久水平至少10mg/mL人IgG且这些小鼠与未处理对照相比对MRSA感染同等易感。用MRSA感染SCID:huIgG小鼠,并在感染后1天用S4497抗体或S4497-二甲基-pipBORAAC(50mg/Kg)任一处理。感染后4天,评估肾中的细菌载荷(图10C)。
图10C显示来自使用2种不同制备物thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基-pipBORAAC105或112进行的3项独立实验的组合数据。使用优化成在血清中产生恒定水平至少10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法,用人IgG重建CB17.SCID小鼠。用S4497抗体(50mg/Kg)或S4497-二甲基-pipBORAAC(50mg/Kg)处理小鼠。用AAC处理的小鼠具有大于4-log的细菌载荷降低(Studentst检验p＝.0005)。与用S4497抗体对照处理的小鼠相比,用S4497-二甲基-pipBORAAC处理的小鼠中的细菌载荷要低平均超过10,000倍,指示AAC甚至在高水平的竞争性人抗MRSA抗体存在下显然是有效的。
比较AAC的功效与万古霉素处理(MRSA感染的当前标准护理处理)的功效。图11A显示一种体内感染模型,证明在用正常水平的人IgG重建的小鼠中AAC比当前标准护理(SOC)抗生素万古霉素更加有效。使用优化成在血清中产生恒定水平至少10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法,用人IgG重建CB17.SCID小鼠。用S4497抗体(50mg/Kg),万古霉素(100mg/Kg),S4497-二甲基-pipBORAAC112(50mg/Kg),或一种用不识别MRSA的同种型对照抗体生成的AAC,thio-hu-抗gD5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-二甲基pipBORAAC110(50mg/Kg)处理小鼠。在感染后第1天通过静脉内注射给予接受AAC的小鼠单剂AAC。每天两次通过腹膜内注射给予接受万古霉素处理的小鼠抗生素注射。在感染后第4天处死所有小鼠,并通过涂板来测定每只小鼠的存活细菌的总数(合并2个肾)。
如果在感染后30分钟启动处理,万古霉素处理在我们的鼠静脉内感染模型中有效治疗MRSA感染。当感染后超过1天启动处理时,每天两次给药100mg/Kg万古霉素未能清除感染,而且只能将细菌载荷降低约50倍(图11A)。惊人地,感染后1天单剂S4497-二甲基-pipBORAAC处理能够清除大多数小鼠中的感染。令人惊讶地,用不识别金黄色葡萄球菌的人IgG抗体生成的对照AAC(gD-AAC)处理在这种模型中具有一些功效。gD抗体不经由它的抗原结合位点识别金黄色葡萄球菌,然而该抗体能够结合在金黄色葡萄球菌上找到的蛋白A。
图11C显示一种体内感染模型,证明在用正常水平的人IgG重建的小鼠中AAC,thio-S6078-HCA114C-LCWT-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR129比裸的抗WTA抗体S4497更加有效,依照与图11A相同的摄生法。使用优化成在血清中产生恒定水平至少10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法,用人IgG重建CB17.SCID小鼠。用S4497抗体(50mg/Kg)或thio-S6078-HCA114C-LCWT-MC-vc-PAB-二甲基pipBOR129AAC(50mg/Kg)处理小鼠。
相对于抗MRSA抗体对自受感染的肾分离的MRSA的结合,FACS分析显示高浓度的gD抗体在自体内感染分离的细菌上的染色产生低水平的对金黄色葡萄球菌的结合(图11B)。通过静脉内注射用MRSA感染小鼠,在感染后3天取出受到感染的肾并匀浆。用Alexa-488标记抗MRSA或对照抗体,并以介于0.08μg/mL和50μg/mL之间的浓度范围测试。S4497抗体识别金黄色葡萄球菌的细胞壁上经β-异头键连接至壁磷壁酸(WTA)的一处N-乙酰基葡萄糖胺修饰。S7578抗体结合经α-异头键连接至WTA的一处相似的N-乙酰基葡萄糖胺修饰。rF1抗体是识别在含有SDR重复的细胞壁锚定蛋白的一个家族上找到的糖修饰的阳性对照抗MRSA抗体。gD抗体是不识别金黄色葡萄球菌的阴性对照人IgG1。尽管gD抗体的总体结合水平比用S4497抗体获得的显著更低(根据FACS分析评估低至少30倍,图11B),但是用gD-AAC看到的有限功效指示在体内甚至低水平的AAC在MRSA上的结合足以产生看来与对万古霉素观察到的CFU降低等同的功效。
上文数据清楚地证明AAC能够杀死细胞内MRSA,而且S4497-pipBOR和S4497二甲基-pipBORAAC在体外和在体内均有效限制MRSA感染。本发明的AAC通过杀死哺乳动物细胞内部的细菌起作用并由此提供一种独特的治疗剂,其更加有效地杀死对万古霉素处理有抗性的细菌群体。
图20显示50mg/kg游离抗体预处理在一种静脉内感染模型中是无效的。用2x107CFUUSA300感染前30分钟通过静脉内注射给予Balb/c小鼠单剂媒介对照(PBS)或50mg/Kg抗体。处理组包括一种不结合金黄色葡萄球菌的同种型对照抗体(gD),一种针对壁磷壁酸β修饰的抗体(4497)或一种针对壁磷壁酸α修饰的抗体(7578)。每天两次通过腹膜内注射给予对照小鼠110mg/Kg万古霉素处理(万古霉素)。感染后第4天处死所有小鼠,并通过涂板来测定肾中存活细菌的总数(合并2个肾)。虽然万古霉素预处理清除所有测试小鼠中的感染,但是针对金黄色葡萄球菌细胞壁的抗体的预处理对细菌载荷没有影响。
图21和22显示针对壁磷壁酸β修饰或壁磷壁酸α修饰任一的AAC在一种使用用正常水平的人IgG重建的小鼠的静脉内感染模型中是有效的。使用优化成在血清中产生恒定水平至少10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法用人IgG重建CB17.SCID小鼠,并通过静脉内注射用2x107CFUUSA300感染。感染后1天用仅缓冲液对照(PBS),60mg/Kgβ-WTAAAC(136AAC)或60mg/Kgα-WTAAAC(155AAC)启动处理。在感染后第4天处死小鼠,并通过涂板来测定肾(合并2个肾,图21)和心(图22)中存活细菌的总数。β-WTAAAC处理导致肾中的细菌载荷与用媒介对照处理的小鼠相比降低100,000倍。α-WTAAAC处理导致肾中的细菌载荷降低平均9,000倍。
至今,仍然不确定为什么当前可用抗生素在杀死细胞内细菌贮藏方面常常是无效的。抗生素失败可能是因为它们在细胞内部没有达到足够浓度,这或是因为它们没有进入细胞内细菌贮藏驻留的吞噬溶酶体隔室,或是因为它们可能遭受自哺乳动物细胞去除抗生素的流出泵的活性。抗生素可能因在吞噬溶酶体内部找到的苛刻条件而受损,包括低pH,为了杀死吞噬的细菌而专门释放的还原剂和氧化剂。或者,抗生素失败可能是因为细菌上调防御机制或不能在吞噬溶酶体内部分裂并因此使得瞬时对抗生素不敏感。抗生素抗性的这些机制的相对重要性对于不同病原体和对于每种抗生素会有所不同。在作为游离抗生素测试时,我们的AAC的抗生素构件pipBOR和二甲基-pipBOR事实上在杀死细胞内MRSA方面比利福平更加有效。将这些抗生素连接至抗体提供真实的剂量依赖性功效升高,这在体内是明显的(图9C)。在这种情况中,AAC胜过单独的抗生素的改良功效很可能是由于它调理细菌的能力与AAC的改良药动学的组合。大多数游离抗生素在体内快速清除且要求以高浓度的抗生素反复给药以在血清中维持足够的抗生素浓度。相反,由于该分子的抗体部分,AAC在血清中具有较长的半衰期。既然AAC只在结合金黄色葡萄球菌且与细菌一起转运入吞噬溶酶体的局限空间之后释放抗生素,那么它们在大多数抗生素失败的小生境中特异性浓缩小剂量的抗生素。因此,在靶向受到保护的细胞内细菌储藏以外,AAC还可能通过将抗生素的释放限制于最需要它的部位而推动使用更加有力但可能证明作为单一药剂使用时毒性太高的抗生素。
图35和36显示来自thio-S6078AAC的体外巨噬细胞测定法的结果。将金黄色葡萄球菌(USA300NRS384)与50ug/mL未缀合的S6078抗体和50μg/mL,5μg/mL,0.5μg/mL或0.05μg/mLAAC一起温育1小时以允许抗体结合细菌。将所得经过调理的细菌补料至鼠巨噬细胞,并于37℃温育以允许吞噬。2小时后,去除感染混合物并用补充有50μg/mL庆大霉素的正常生长培养基替换以杀死任何剩余细胞外细菌。在2天后通过将巨噬细胞裂解物的连续稀释液在胰胨豆胨琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的总数。在图35中,thio-S6078.v4.HC-WT,LC-Cys-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC在0.5μg/mL或以上的剂量有效杀死细胞内细菌,抗生素载荷为2.0(AAC-173)或3.9(AAC-171)个二甲基pipBOR抗生素(LA-54)每个thio-S6078抗体。在图36中,thio-S6078.v4.HC-WT,LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR)在0.5μg/mL或以上的剂量有效杀死细胞内细菌,抗生素载荷为1.8(AAC-174)或3.9(AAC-172)个piperazBOR抗生素(LA-65)每个thio-S6078抗体。
图37和38显示来自thio-S6078AAC在一种鼠静脉内感染模型中的体内功效的结果。使用优化成在血清中产生恒定水平至少10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法用人IgG重建CB17.SCID小鼠。用USA300感染小鼠,并用媒介对照(PBS),thio-S6078.v4.HC-WT,抗生素载荷为2.0(AAC-173)或3.9(AAC-171)个二甲基pipBOR抗生素(LA-54)每个thio-S6078抗体的LC-Cys-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC(图37)和thio-S6078.v4.HC-WT,抗生素载荷为1.8(AAC-174)或3.9(AAC-172)个piperazBOR抗生素(LA-65)每个thio-S6078抗体的LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR)(图38)处理。在感染后第1天通过静脉内注射给予小鼠单剂AAC,并在感染后第4天处死。通过涂板来测定2个肾中存活细菌的总数。含有较低抗生素载荷的AAC的处理将细菌负荷降低大约1,000倍,而含有较高抗生素载荷的AAC的处理将细菌负荷降低超过10,000倍。
用于抗体-抗生素缀合物的葡萄球菌蛋白酶B可切割接头
蛋白酶可切割接头在本文中描述为受到葡萄球菌蛋白酶B(一种分泌性金黄色葡萄球菌内肽酶)切割。为了设计受金黄色葡萄球菌细菌特异性切割的接头,使用一种FRET肽文库来表征金黄色葡萄球菌培养物上清液的蛋白酶活性。自此筛选鉴定出一种独特的底物特异性。使用此底物,自培养物上清液纯化负责活性的酶并鉴定为葡萄球菌蛋白酶B。基于此鉴定,生成了一种葡萄球菌蛋白酶B优化接头并连接至哌嗪并-利福霉素:
哌嗪并-利福霉素是一种有力的利福拉齐样抗生素。所得AAC已经在MRSA感染的体外和体内模型中证明功效,提供一种靶向MRSA感染的新颖机制。葡萄球菌蛋白酶B是一种分泌性半胱氨酸蛋白酶,来自内肽酶的木瓜蛋白酶家族(CAS注册号347841-89-8,Sigma-Aldrich#S3951,Filipeketal.(2005)J.Biol.Chem.280(15):14669-74),而且已经进化成具有独特的底物特异性,P2位置优选大型芳香族侧链。葡萄球菌蛋白酶B的表达受作为葡萄球菌蛋白水解级联(SCP)一部分的agr(或辅助基因调节器)群体感应系统控制(Janzon,L.andS.Arvidson(1990)TheEMBOjournal9(5):1391-1399)。Agr调控分泌性蛋白酶和金黄色葡萄球菌的其它毒力因子(包括金色溶素(aureolysin),V8,和葡萄球菌蛋白酶A)的表达(Shaw,L.,E.Golonkaetal.(2004)Microbiology150(Pt1):217-228)。由于它降解宿主结缔组织以及提升数种免疫系统蛋白质的能力,葡萄球菌蛋白酶B已经暗示是一种有力的毒力因子(Imamura,T.,S.Tanaseetal.(2005)Journalofexperimentalmedicine201(10):1669-1676；Potempa,J.,A.Dubinetal.(1988)Journalofbiologicalchemistry263(6):2664-2667；Ohbayashi,T.,A.Irieetal.(2011)Microbiology157(Pt3):786-792；Smagur,J.,K.Guziketal.(2009)；Biologicalchemistry390(4):361-371；Smagur,J.,K.Guziketal.(2009)；Journalofinnateimmunity1(2):98-108；Kulig,P.,B.A.Zabeletal.(2007)；Journalofimmunology178(6):3713-3720)。葡萄球菌蛋白酶B作为重要毒力因子的作用使之成为蛋白酶介导的抗生素释放的一种有吸引力的靶物。
鉴定受金黄色葡萄球菌蛋白酶切割的底物
为了鉴定容易受金黄色葡萄球菌内肽酶切割的底物,将来自Wood46株金黄色葡萄球菌的过夜培养物的上清液与一种商品化的FRET肽文库一起温育。Wood46株具有组成性有活性的agr基因座,因此Wood46株展现与野生型相比升高的蛋白酶表达。FRET肽文库快速内肽酶概况分析文库或PepSetsTMREPLi(Mimotopes,Victoria,Australia)由512个孔组成,96孔板格式,每个孔有8种内部淬灭的发荧光肽。肽在切割后发荧光,容许实时监测蛋白水解活性。每种肽具有一个三肽可变核心,侧翼为任一侧上的一系列甘氨酸残基和C端为了溶解性的另外两个赖氨酸残基。将来自Wood46培养物的上清液添加至文库,并将板于37℃温育过夜。通过LC-MS(AgilentQ-TOF)分析显示荧光升高大于15倍的孔(总共512个孔中的12个)以确定切割产物。基于频率将切割位点排序(表4)。在头等命中中,观察到一种底物特异性样式,具体是P2位置对Phe和Tyr的大型疏水性侧链的偏爱。
表4:受Wood46分泌性蛋白酶切割的REPLi序列的氨基酸偏爱。每个位置处的丰度(％)
残基 P4 P3 P2 P1 P1’ P2’
G 71.4 50.0 0.0 28.6 35.7 100.0
I/L 21.4 7.1 0.0 0.0 7.1 0.0
A/V 0.0 14.3 0.0 50.0 28.6 0.0
N/Q 7.1 7.1 0.0 0.0 7.1 0.0
S/T 0.0 14.3 0.0 14.3 0.0 0.0
F/Y 0.0 0.0 100.0 0.0 21.4 0.0
K/R 0.0 7.1 0.0 7.1 0.0 0.0
显示最大荧光升高的孔的FRET肽中存在的氨基酸残基在每个位置处的丰度。REPLi肽含有序列MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys(SEQIDNO:132),其中Xaa,Yaa,和Zaa有所变化。表中存在的甘氨酸残基代表可变核心侧翼的Gly残基。虽然Gly残基在数个位置是最丰富的,但是它们对认识底物特异性的帮助很小。在设计接头时,偏爱给予来自可变核心的氨基酸。自表忽略未在任何头等命中的氨基酸。
在体外受MRSA蛋白酶切割的FRET底物的设计和缀合
根据REPLi筛选,使用P1,P2,和P3的具体信息,使用受到切割的肽中最频繁的残基设计并合成一种肽。该肽具有序列GGAFAGGG(SEQIDNO:126),切割预期在GGAFA(SEQIDNO:131)和GGG之间。使用固相合成来合成该肽,掺入荧光染料四甲基罗丹明(TAMRA)和荧光素作为FRET对(图26),添加马来酰亚胺基-丙-酸至N端以容许缀合至抗体半胱氨酸残基。将所得mal-FRET-肽,马来酰亚胺基-丙(MP)-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)缀合至半胱氨酸改造的thioMab抗体,thio-S4497。还将mal-FRET-肽缀合至半胱氨酸改造的抗Her2thioMab曲妥珠单抗(一种非结合对照)。
将thio-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)FRET缀合物和非结合对照FRET缀合物thio-曲妥珠单抗-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)与Wood46(图28)和野生型,USA300(图29)的对数期培养物一起在胰胨豆胨培养基(TSB)中温育,细胞密度108个细胞/ml和107个细胞/ml。所有孔的MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)终浓度为2μM。于37℃随时间监测荧光,激发λ495nm/发射λ518nm。在Wood46和USA300二者中均对4497-mal-FRET-肽缀合物观察到荧光升高,指示FRET肽受到金黄色葡萄球菌蛋白酶切割,而且该蛋白酶存在于这两种株中。接头单元MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)在缀合至结合金黄色葡萄球菌的抗体时在Wood46和USA300二者中均受到切割。由于它与潜在治疗性抗体-抗生素缀合物(AAC)会靶向的MRSA临床株的相关性,在USA300中验证对这种模型接头的切割是至关重要的。thio-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)FRET缀合物在这两种株中均显示荧光升高,指示该接头受到金黄色葡萄球菌蛋白酶切割,而且该蛋白酶存在于MRSA临床相关株USA300中。细胞密度影响切割速率,更高细胞密度的培养物中更早发生切割。非结合对照thio-曲妥珠单抗-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)缀合物在任何测试条件中均没有显示荧光升高。
基于在基于细胞的测定法中受到切割的底物,制备接头-抗生素中间体LA-59(表2)并缀合至抗体以形成抗MRSA重链,半胱氨酸改造的thio-S4497(AAC-113)和thio-S4462(AAC-114),和抗HER2轻链thio-曲妥珠单抗(AAC-115)(表3)。GGAFAGGG(SEQIDNO:126)连接的AAC在与来自Wood46过夜培养物的浓缩上清液一起温育时展现比FRET-肽要好的切割速率,指示该接头-抗生素对于未知感兴趣蛋白酶是一种更好的底物。在GGAFAGGG连接的(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)AAC(AAC-113,AAC-114,AAC-115)中丙氨酸和甘氨酸之间的预期位点发生切割。这种接头-抗生素(LA-59)对于该抗生素并非优化的投递系统,因为在切割后释放GGG-利福霉素而非游离利福霉素。虽然这种接头-抗生素的治疗潜力可能不确定,但是它受到蛋白酶有效切割的能力使它成为一种有用的工具化合物来鉴定含有活性感兴趣蛋白酶的级分。将接头-抗生素中间体LA-59缀合至thio-S4497抗体的Fab部分(Scheer,J.M.,W.Sandovaletal.(2012).PloSone7(12):e51817)。半胱氨酸改造的Fab抗体("thioFAB")具有一个反应性半胱氨酸,能够实现一个硫醇反应性化合物的位点特异性缀合。thioFABS-4497与超过thioFAB3倍摩尔过量的LA-59在50mMTRISpH7.5,150mMNaCl中于室温反应1小时。通过在PBS中渗滤将过量的LA-59与AAC分开。使用所得缀合物thioFABS4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR)(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)(图27)作为工具化合物来鉴定活性级分,通过LC-MS分析检测对接头的切割。
为了葡萄球菌蛋白酶B的有效切割优化接头
接头-抗生素中间体LA-59,MC-GGAFAGGG-(pipBOR)(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)具有为P1,P2,和P3位置优化的底物残基。使用来自REPLi筛选的结果,设计并合成两种新接头,为P4掺入残基偏爱(图30)。使用固相合成来合成马来酰亚胺基-丙-Leu-Ala-Phe-Ala-Ala(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)和马来酰亚胺基-丙-Leu-Ala-Phe-Gly-Ala(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”)。异亮氨酸和亮氨酸是REPLi筛选中在P4中最频繁的残基(不管甘氨酸)。只选择一种残基(亮氨酸)以限制合成的接头的数目。在P1位置交替Ala和Gly以检查对可切割性的影响。还包括P1’中的一种残基,Ala。将(呫吨9-[2-[[4-[[(2,5-二氧-1-吡咯烷基)氧]羰基]-1-哌啶基]磺酰基]苯基]-3,6-二(甲基苯基氨基)-NHS酯,氯化物,CAS注册号304014-12-8,LifeTechnologies)添加至两种接头的C端以充当抗生素替代物(图30)。掺入容许在不消耗费钱费力的抗生素的情况下评估这些接头的可切割性。
将实验性mal-肽-QSY7接头缀合至THIOFABS4497以评估这些接头的可切割性。如先前所述实施缀合。在pH7.2对所得THIOFABS4497接头-QSY7缀合物评估葡萄球菌蛋白酶B,葡萄球菌蛋白酶A,和人组织蛋白酶B的可切割性(表5)。像葡萄球菌蛋白酶B一样,葡萄球菌蛋白酶A是金黄色葡萄球菌的一种分泌性半胱氨酸蛋白酶,来自蛋白酶的木瓜蛋白酶家族。它的结构与葡萄球菌蛋白酶B相似,但是具有更宽的底物特异性(Filipek,R.,M.Rzychonetal.(2003).TheJournalofbiologicalchemistry278(42):40959-40966)。组织蛋白酶B,一种哺乳动物半胱氨酸溶酶体蛋白酶,也是内肽酶的木瓜蛋白酶家族的一个成员。认为它切割本专利中描述的其它AAC接头中使用的缬氨酸-瓜氨酸接头。
表5:葡萄球菌蛋白酶和人组织蛋白酶B对经过优化的接头的切割
表5显示来自葡萄球菌蛋白酶A,葡萄球菌蛋白酶B,和组织蛋白酶B对缀合至thioFAB的经过优化的接头的切割的数据。最终的接头-抗生素MP-LAFG-哌嗪并-利福霉素(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)受到所有三种蛋白酶的有效切割。葡萄球菌蛋白酶的切割导致释放游离利福霉素。组织蛋白酶B的切割释放Phe-Gly-哌嗪并-利福霉素(实施例26)。
释放游离抗生素的葡萄球菌蛋白酶B可切割接头的设计和缀合
根据测试的实验性接头的切割测定法,选择mal-LAFGA(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”)用于抗生素附着。在蛋白质水解切割时实现游离抗生素释放需要进一步优化这种接头。为了实现这一点,将P1’中的Ala用p-氨基苄基(PAB)或p-氨基苄氧羰基(PABC)替换。将哌嗪并-利福霉素添加至这种接头的C端以完成接头-抗生素中间体LA-88MC-LAFG-PAB-(二甲基氨基-3-吡咯并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)和LA-104,MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)。在P1位置中的Gly之后切割后,PAB和PABC基团设计成自我牺牲,释放游离抗生素。缀合LA-88以形成thio-S4497-v8-LCV205C-MC-LAFG-PAB-(二甲基氨基-3-吡咯并BOR)AAC-163(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)(表3)。缀合LA-104以形成AAC-193,AAC-215,和AAC-222。于pH7.2和pH5用葡萄球菌蛋白酶A,葡萄球菌蛋白酶B,和组织蛋白酶B对AAC193实施切割测定法。选择这些pH值来模拟血浆(pH7.2)或吞噬溶酶体微环境(pH5)。葡萄球菌蛋白酶B在pH5和7.2均实现100％切割。葡萄球菌蛋白酶A在pH5显示100％切割而在pH7.2显示64％切割。
用PABC替代P1’基团中的Ala改变组织蛋白酶B切割接头的位置。在受到组织蛋白酶B切割后,释放Phe-Gly-PABC-(哌嗪并BOR)。作为一种治疗剂,组织蛋白酶B对这种接头的潜在切割最有可能会在巨噬细胞的溶酶体隔室中发生。在这些情形下,包括葡萄球菌蛋白酶B在内的其它蛋白酶可能进一步加工FG-PABC-哌嗪并-利福霉素以解放游离抗生素。
将接头-抗生素中间体MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)LA-104缀合至thioMABS4497以评估所得AAC(AAC-193,AAC-215,AAC-222)的体外和体内功效。还通过将LA-104缀合至thioMAB抗Her2和thioMAB抗gD(均为同种型对照)生成两种对照缀合物。轻链连接的thioMAB4497MP-LAFG-PABC-哌嗪并-利福霉素缀合物(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)AAC-215具有1.6的药物对抗体比(DAR),正如thioMAB抗gD对照缀合物。thioMAB抗Her2mal-LAFG-PABC-哌嗪并-利福霉素(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)缀合物具有1.5的DAR。
使用一种FRET肽文库筛选金黄色葡萄球菌培养上清液以鉴定容易受到分泌性蛋白酶切割的底物。这项筛选的结果显示压倒性多数的测量的蛋白酶活性可能要归于金黄色葡萄球菌的一种分泌性半胱氨酸蛋白酶,即葡萄球菌蛋白酶B。优化设计成受葡萄球菌蛋白酶B切割的肽接头,并鉴定出一种释放游离抗生素的有效切割底物。所得接头还受到金黄色葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶A和人蛋白酶组织蛋白酶B(也均为半胱氨酸蛋白酶)切割。
当缀合至结合金黄色葡萄球菌的抗体时,所得AAC在体外和在体内均显示功效。MRSA的内源内肽酶提供靶向MRSA感染和以疾病特异性方式释放有效载荷的一种机制。这种接头受到金黄色葡萄球菌的分泌性蛋白酶切割的能力容许靶向人嗜中性细胞中存在的以及宿主血浆/组织中胞外存在的MRSA。这种双重靶向可能能够在细胞内和细胞外感染位点二者处释放高浓度的抗生素。
葡萄球菌蛋白酶A和B表达在人嗜中性细胞上调,而且认为是重要的毒力因子(Burlak,C.etal.(2007)Cellularmicrobiology9(5):1172-1190),使得它们成为蛋白酶介导的抗生素释放的有吸引力的靶物。人组织蛋白酶B也切割该接头,呈现释放的一种备选途径。观察到的AAC的功效有可能是来自金黄色葡萄球菌和宿主二者的涉及抗生素或抗生素模块释放的多种蛋白酶的结果。受到一类蛋白酶切割的一种血清稳定性接头提供可能战胜细菌的抗性突变的一种释放机制。
用抗体-抗生素缀合物治疗和预防感染的方法
本发明的AAC作为有效针对多种人和兽医革兰氏阳性细菌的抗微生物剂是有用的,包括葡萄球菌(Staphylococci),例如金黄色葡萄球菌(S.aureus),腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)和模仿葡萄球菌(S.simulans)；李斯特氏菌(Listeria),例如单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)；肠球菌(Enterococci),例如粪肠球菌(E.faecalis)；链球菌(Streptococci),例如肺炎链球菌(S.pneumonia)；梭菌(Clostridium),例如艰难梭菌(C.difficile)。
持久的菌血症可源自进入宿主细胞的内在化。虽然并未完全了解,内在化的病原体能够通过在宿主细胞内部存活而逃脱免疫识别。此类生物体包括金黄色葡萄球菌(S.aureus),沙门氏菌(Salmonella)(例如伤寒沙门氏菌(S.typhi),猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)和肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)),军团菌(Legionella)(例如嗜肺军团菌(L.pneumophila)),李斯特氏菌(Listeria)(例如单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)),布鲁氏菌(Brucella)(例如流产布鲁氏菌(B.abortus),马尔他布鲁氏菌(B.melitensis),猪布鲁氏菌(B.suis)),衣原体(Chlamydia)(肺炎衣原体(C.pneumoniea),砂眼衣原体(C.trachomati)),立克次氏体(Rickettsiaspp.),志贺氏菌(Shigella)(例如弗氏志贺氏菌(S.flexneri)),和分枝杆菌(mycobacteria)。
在进入血流后,金黄色葡萄球菌能在几乎任何器官中引起转移性感染。在疗法开始之前的约三分之一的病例(Fowleretal.(2003)Arch.Intern.Med.163:2066-2072)和疗法开始之后的甚至10％的患者(Khatibetal.(2006)Scand.J.Infect.Dis.,38:7-14)中发生继发性感染。感染的标志是大量的脓,组织破坏,和脓肿形成(它们均含有大量的嗜中性细胞)。虽然如果在48小时内消灭菌血症的话只有约5％的患者形成并发症,但是如果菌血症持续超过三天的话该水平升高至40％。
虽然一般认为金黄色葡萄球菌是分泌毒素的细胞外病原体,但是有证据表明它能在内皮细胞,角质形成细胞,成纤维细胞,和破骨细胞内部存活(Alexanderetal.(2001)Appl.Microbiol.Biotechnol.56:361-366；Garzonietal.(2009)TrendsMicrobiol.17:59-65)。嗜中性细胞和巨噬细胞是宿主对细菌感染的先天免疫应答的关键成分。这些细胞通过吞噬而内在化金黄色葡萄球菌,这可以通过抗体,补体,或宿主凝集素诸如甘露糖结合蛋白(其能同时结合病原体和嗜中性细胞,巨噬细胞,和其它专职吞噬细胞)而增强。如先前提到的,金黄色葡萄球菌不仅在溶酶体环境中存活,而且实际上可以作为用于在宿主中形成持久性的机制进行开拓。
本发明的抗体-抗生素缀合物(AAC)对于治疗细胞内病原体(包括那些在吞噬溶酶体中驻留的)具有显著的治疗优势。在一个实施方案中,病原体被内在化入白细胞的细胞中,而且细胞内成分是吞噬溶酶体。在完整AAC中,抗体可变区结合细菌上的细胞表面抗原(调理)。不受任一理论限制,在一种机制中,通过AAC的结合细菌细胞表面的抗体成分,吞噬细胞被吸引至细菌。抗体的Fc部分结合吞噬细胞上的Fc受体,推动吞噬。在AAC-细菌复合物被吞噬后,在与溶酶体融合后,AAC接头通过暴露于吞噬溶酶体酶而受到切割,释放活性抗生素。由于受到约束的空间和相对较高的局部抗生素浓度(约104每细菌),结果是吞噬溶酶体不再支持细胞内病原体的存活(图5)。因为AAC本质上是无活性的药物前体,所以抗生素的治疗指数可以相对于游离(未缀合)形式延长。抗体提供病原体特异性靶向,而可切割接头在对病原体的细胞内定位特异性的条件下受到切割。效果可以是直接作用于经过调理的病原体以及在吞噬溶酶体中共定位的其它病原体二者。在一个具体的方面,病原体为金黄色葡萄球菌。
抗生素耐药性指引起疾病的病原体抵抗抗生素和其它抗微生物剂的杀伤作用的能力,而且在机制上不同于多药抗性(LewisK(2007)."Persistercells,dormancyandinfectiousdisease".NatureReviewsMicrobiology5(1):48-56.doi:10.1038/nrmicro1557)。而是说,这种形式的耐药性是由称作坚持者的一个微生物细胞小亚群引起的(BiggerJW(14October1944)."Treatmentofstaphylococcalinfectionswithpenicillinbyintermittentsterilization".Lancet244(6320):497-500)。这些细胞就经典含义而言不是多药抗性的,而是耐受能杀死它们的遗传相同同胞的抗生素处理的休眠细胞。这种抗生素耐药性是由不分裂或极慢分裂的生理状态诱导的。当抗微生物剂处理未能根除这些坚持者细胞时,它们变成复发慢性感染的储库。本发明的抗体-抗生素缀合物拥有杀死这些坚持者细胞和阻抑多药耐性细菌群体出现的独特特性。
在另一个实施方案中,本发明的AAC可用于治疗感染,不管病原体在其中存活的细胞内隔室。
在另一个实施方案中,AAC还可用于通过抗体介导的调理而靶向浮游生物或生物膜形式的细菌(例子:金黄色葡萄球菌(S.aureus),肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia),大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli),鲍曼不动杆菌(A.baumannii),铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)),导致被专职吞噬细胞内在化。当吞噬体与溶酶体融合时,会在吞噬溶酶体的酸性或蛋白质水解性环境中自AAC释放足够高浓度的游离抗生素以杀死吞噬的病原体。
用本发明的抗体-抗生素缀合物(AAC)治疗感染的方法包括治疗细菌性肺感染,诸如金黄色葡萄球菌肺炎或结核病感染,细菌性眼感染,诸如沙眼和结膜炎,心,脑或皮肤感染,胃肠道感染,诸如旅行者腹泻,骨髓炎,溃疡性结肠炎,肠易激综合症(IBS),克罗恩氏病,和一般性的IBD(炎性肠病),细菌性脑膜炎,和任何器官(诸如肌肉,肝,脑脊膜,或肺)中的脓肿。细菌感染可以在身体的其它部分中,像尿道,血流,伤口或导管插入部位。本发明的AAC对于涉及生物膜,植入物或庇护部位(sanctuarysite)(例如骨髓炎和人工关节感染)的难以治疗的感染,和诸如医院获得性肺炎和菌血症等高死亡率感染是有用的。可以治疗来预防金黄色葡萄球菌感染的薄弱患者组包括血液透析患者,免疫受损患者,重症监护室患者,和某些手术患者。另一方面,本发明提供一种杀死,治疗,或预防动物(优选哺乳动物,最优选人)中的微生物感染的方法,其包括对该动物施用本发明的AAC或AAC药物配制剂。本发明的特征进一步在于治疗或预防与此类微生物感染有关或机会性源自此类微生物感染的疾病。此类治疗或预防方法可包括口服,表面,静脉内,肌肉内,或皮下施用本发明的组合物。例如,在手术或插入IV导管之前,在ICU护理中,在移植医学中,伴随癌症化疗或在癌症化疗后,或承载高感染风险的其它活动,可以施用本发明的AAC来预防感染的发作或蔓延。
细菌感染可以是由具有活性和无活性形式的细菌引起的,而且以足以治疗活性和无活性,潜伏形式的细菌感染二者的量和持续时间施用AAC,该持续时间比治疗活性形式的细菌感染所需要的要长。
分析各种革兰氏阳性细菌找到了在所有金黄色葡萄球菌(包括MRSA和MSSA株)以及非金黄色葡萄球菌株诸如腐生葡萄球菌和模仿葡萄球菌上表达的WTAβ。WTAα(α-GlcNAc核糖醇WTA)存在于大多数但非所有金黄色葡萄球菌上,而且还存在于单核细胞增生李斯特氏菌。WTA不存在于革兰氏阴性细菌上。因此,本发明的一个方面是一种通过施用治疗有效量的本发明抗WTAβ-AAC来治疗感染了金黄色葡萄球菌或腐生葡萄球菌或模仿葡萄球菌的患者的方法。本发明的另一方面是一种通过施用治疗有效量的本发明抗WTAα-AAC来治疗感染了金黄色葡萄球菌或单核细胞增生李斯特氏菌的患者的方法。本发明还涵盖在医院设置(诸如手术,烧伤患者,和器官移植)中,一种通过施用治疗有效量的本发明抗WTAβ-AAC来预防金黄色葡萄球菌或腐生葡萄球菌或模仿葡萄球菌感染的方法。
由本领域熟练医师确定需要治疗细菌感染的患者可以早就已经但并非需要诊断他/她感染的细菌的种类。由于具有细菌感染的患者可以很快恶化,以小时计,因此可以在入院时对患者施用本发明的抗WTAAAC以及一种或多种标准护理抗生素,诸如万古霉素。当诊断结果变得可得且指示感染中例如金黄色葡萄球菌的存在时,患者可继续用抗WTAAAC治疗。因此,在治疗细菌感染或具体是金黄色葡萄球菌感染的方法的一个实施方案中,对患者施用治疗有效量的抗WTAβAAC。在本发明的治疗或预防方法中,可以作为唯一的治疗剂或与其它药剂(诸如下文描述的那些)联合施用本发明的AAC。本发明的AAC在临床前模型中在MRSA治疗方面显示对万古霉素的优越性。可以测量AAC与SOC的比较,例如通过死亡率的降低。会通过多种可测量因素对所治疗的患者评估对AAC治疗的响应性。临床医生可能用来评估他们的患者的改善的体征和症状的例子包括下述:白血球计数的正常化(若在诊断时升高的话),体温的正常化(若在诊断的时候升高(发烧)的话),血液培养物的清除,伤口的目测改善(包括更少的红斑和排脓),使用呼吸机的患者中呼吸机要求的降低(诸如要求更少的氧或降低的通气速率),完全脱离呼吸机(若患者在诊断的时候使用呼吸机的话),使用更少的药疗来支持稳定的血压(若在诊断的时候要求这些药疗的话),提示末梢器官衰竭的实验室异常(诸如升高的肌酸酐或肝功能测试)的正常化(若它们在诊断的时候是异常的话),和放射学成像的改善(例如先前提示肺炎的胸部x射线显示消退)。在ICU中的患者中,可以至少每天一次测量这些因素。密切监测发烧,正如白血球计数(包括绝对嗜中性细胞计数)以及“左移”(爆发的出现,指示响应活动性感染而升高的嗜中性细胞生成)已经消退的证据。
在本发明的治疗方法的语境中,如果根据本领域熟练医师的评估,至少两项或更多项前述因素与治疗开始之前或之时或在诊断的时候的数值,体征或症状相比有显著的可测量改善的话,认为具有细菌感染的患者得到了治疗。在一些实施方案中,3,4,5,6或更多项上述因素有可测量改善。在一些实施方案中,可测量因素的改善为与治疗之前的数值相比的至少50％,60％,70％,80％,90％,95％或100％。通常,如果患者的可测量改善包括下述的话,可以认为患者完全治疗了细菌感染(例如金黄色葡萄球菌感染):i)没有长出最初鉴定的细菌的重复血液或组织培养物(通常数次)；ii)发烧正常化；iii)WBC正常化；和iv)鉴于患者所具有的预先存在的共发病,末梢器官衰竭(肺,肝,肾,血管崩溃)已经完全或部分消退的证据。
剂量给药
在任何上述方面,在治疗受到感染的患者时,AAC的剂量正常情况下是约0.001至1000mg/kg/天。在一个实施方案中,以范围为约1mg/kg至约100mg/kg,通常约5mg/kg至约90mg/kg,更具体10mg/kg至50mg/kg的AAC剂量治疗具有细菌感染的患者。可以每天一次(例如单剂5至50mg/kg/天)或更不频繁地(例如单剂5,12.5,或25mg/kg/周)给予AAC。可以在2天上分拆一剂,例如某日25mg/kg和次日25mg/kg。可以每3天一次(q3D),一周一次至隔周一次(qOW)给患者施用一剂,持续1-8周。在一个实施方案中,一周一次经IV给患者施用本发明的AAC,持续2-6周,伴有标准护理(SOC),用来治疗细菌感染(诸如金黄色葡萄球菌感染)。治疗长度会由患者的状况或感染的程度决定,例如持续时间对于不复杂的菌血症为2周或对于伴有心内膜炎的菌血症为6周。
在一个实施方案中,AAC以初始剂量2.5至100mg/kg施用连续1至7天,接着每1至7天一次以维持剂量0.005至10mg/kg施用一个月。
施用路径
为了治疗细菌感染,可以以任何前述剂量静脉内(i.v.)或皮下施用本发明的AAC。在一个实施方案中,静脉内施用WTAAAC。在一个具体的实施方案中,经i.v.施用的WTAAAC为WTA-βAAC,更具体地,其中WTA-β抗体选自具有图14,图15A,图15B,图16A,和图16B中公开的氨基酸序列的抗体。
组合疗法
在治疗患者的医师确定为适宜时,可以与一或多种另外的(例如第二)治疗剂或预防剂联合施用AAC。
在一个实施方案中,与本发明的抗体-抗生素缀合物化合物组合施用的第二抗生素选自结构类别:(i)氨基糖苷；(ii)β-内酰胺；(iii)大环内酯/环肽；(iv)四环素；(v)氟喹啉/氟喹诺酮；(vi)和唑烷酮。见:Shaw,K.andBarbachyn,M.(2011)Ann.N.Y.Acad.Sci.1241:48-70；Sutcliffe,J.(2011)Ann.N.Y.Acad.Sci.1241:122-152。
在一个实施方案中,与本发明的抗体-抗生素缀合物化合物组合施用的第二抗生素选自克林霉素,新生霉素,瑞他莫林,达托霉素,GSK-2140944,CG-400549,西他沙星,替考拉宁,三氯生,萘啶酮,雷得唑来,多柔比星,氨苄西林,万古霉素,亚胺培南,多利培南,吉西他滨,达巴万星,和阿奇霉素。
这些别的治疗剂或预防剂的别的例子有抗炎剂(例如非类固醇抗炎药(NSAID；例如地脱普洛芬(detoprofen),双氯芬酸(diclofenac),二氟尼柳(diflunisal),依托度酸(etodolac),非诺洛芬(fenoprofen),氟比洛芬(flurbiprofen),布洛芬(ibuprofen),吲哚美辛(indomethacin),酮洛芬(ketoprofen),甲氯灭酸盐(meclofenamate),甲芬那酸(mefenamicacid),美洛昔康(meloxicam),萘丁美酮(nabumeone),萘普生钠(naproxensodium),奥沙普秦(oxaprozin),吡罗昔康(piroxicam),舒林酸(sulindac),托美丁(tolmetin),塞来考昔(celecoxib),罗非考昔(rofecoxib),阿司匹林(aspirin),水杨酸胆碱(cholinesalicylate),双水杨酯(salsalate),和水杨酸钠和镁(sodiumandmagnesiumsalicylate)和类固醇(例如可的松(cortisone),地塞米松(dexamethasone),氢化可的松(hydrocortisone),甲泼尼龙(methylprednisolone),泼尼松龙(prednisolone),泼尼松(prednisone),曲安西龙(triamcinolone))),抗细菌剂(例如阿奇霉素(azithromycin),克拉霉素(clarithromycin),红霉素(erythromycin),加替沙星(gatifloxacin),左氧氟沙星(levofloxacin),阿莫西林(amoxicillin),甲硝唑(metronidazole),青霉素G(penicillinG),青霉素V(penicillinV),甲氧西林(methicillin),苯唑西林(oxacillin),氯唑西林(cloxacillin),双氯西林(dicloxacillin),萘夫西林(nafcillin),氨苄西林(ampicillin),羧苄西林(carbenicillin),替卡西林(ticarcillin),美洛西林(mezlocillin),哌拉西林(piperacillin),阿洛西林(azlocillin),替莫西林(temocillin),头孢噻吩(cephalothin),头孢匹林(cephapirin),头孢雷定(cephradine),头孢噻啶(cephaloridine),头孢唑林(cefazolin),头孢孟多(cefamandole),头孢呋辛(cefuroxime),头孢氨苄(cephalexin),头孢丙烯(cefprozil),头孢克洛(cefaclor),氯碳头孢(loracarbef),头孢西丁(cefoxitin),头孢他唑(cefmatozole),头孢噻肟(cefotaxime),头孢唑肟(ceftizoxime),头孢曲松(ceftriaxone),头孢哌酮(cefoperazone),头孢他啶(ceftazidime),头孢克肟(cefixime),头孢泊肟(cefpodoxime),头孢布烯(ceftibuten),头孢地尼(cefdinir),头孢匹罗(cefpirome),头孢吡肟(cefepime),BAL5788,BAL9141,亚胺培南(imipenem),厄他培南(ertapenem),美罗培南(meropenem),氨曲南(astreonam),克拉维酸盐(clavulanate),舒巴坦(sulbactam),三唑巴坦(tazobactam),链霉素,新霉素,卡那霉素,巴龙霉素(paromycin),艮他霉素/庆大霉素,妥布拉霉素/妥布霉素,阿米卡星(amikacin),奈替米星(netilmicin),大观霉素(spectinomycin),紫苏霉素/西索米星(sisomicin),地贝卡星(dibekalin),异帕米星(isepamicin),四环素,氯四环素/金霉素,地美环素(demeclocycline),米诺霉素(minocycline),氧四环素/土霉素(oxytetracycline),美他环素(methacycline),多西环素(doxycycline),泰利霉素(telithromycin),ABT-773,林可霉素(lincomycin),克林霉素(clindamycin),万古霉素(vancomycin),奥利万星(oritavancin),达巴万星(dalbavancin),替考拉宁(teicoplanin),奎奴普丁(quinupristin)和达福普汀(dalfopristin),氨苯磺胺(sulphanilamide),对氨基苯甲酸(para-aminobenzoicacid),磺胺嘧啶(sulfadiazine),磺胺异唑(sulfisoxazole),磺胺甲唑(sulfamethoxazole),酞磺胺噻唑(sulfathalidine),利奈唑胺(linezolid),萘啶酸(nalidixicacid),奥索利酸(oxolinicacid),诺氟沙星(norfloxacin),全氟胺(perfloxacin),依诺沙星(enoxacin),氧氟沙星(ofloxacin),环丙沙星(ciprofloxacin),替马沙星(temafloxacin),洛美沙星(lomefloxacin),氟罗沙星(fleroxacin),格帕沙星(grepafloxacin),司帕沙星(sparfloxacin),曲伐沙星(trovafloxacin),克林沙星(clinafloxacin),莫西沙星(moxifloxacin),吉米沙星(gemifloxacin),西他沙星(sitafloxacin),达托霉素(daptomycin),加雷沙星(garenoxacin),雷莫拉宁(ramoplanin),法罗培南(faropenem),多粘菌素,替加环素(tigecycline),AZD2563,或甲氧苄啶(trimethoprim)),抗细菌抗体(包括针对与AAC所靶向的抗原相同或不同的抗原的抗体),血小板聚集抑制剂(例如阿昔单抗(abciximab),阿司匹林(aspirin),西洛他唑(cilostazol),氯吡格雷(clopidogrel),双嘧达莫(dipyridamole),依替巴肽(eptifibatide),噻氯匹定(ticlopidine),或替罗非班(tirofiban)),抗凝血药(例如达肝素(dalteparin),达那肝素(danaparoid),依诺肝素(enoxaparin),肝素,亭扎肝素(tinzaparin),或华法林(warfarin)),解热药(例如醋氨酚(acetaminophen)),或降脂剂(例如考来烯胺(cholestyramine),考来替泊(colestipol),烟酸,吉非贝齐(gemfibrozil),普罗布考(probucol),依泽替米贝(ezetimibe),或他汀诸如阿托伐他汀(atorvastatin),罗苏伐他汀(rosuvastatin),洛伐他汀(lovastatin),辛伐他汀(simvastatin),普伐他汀(pravastatin),西立伐他汀(cerivastatin),和氟伐他汀(fluvastatin))。在一个实施方案中,与金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林抗性株和甲氧西林敏感株)的标准护理(SOC)组合施用本发明的AAC。通常用萘夫西林或苯唑西林治疗MSSA,而且通常用万古霉素或头孢唑林治疗MRSA。
可以在施用AAC的14天,7天,1天,12小时,或1小时内施用这些别的药剂,或者同时施用。别的治疗剂可以存在于与AAC相同或不同的药物组合物中。当存在于不同药物组合物中时,可以使用不同施用路径。例如,可以静脉内或皮下施用AAC,而可以口服施用第二药剂。
药物配制剂
本发明还提供含有AAC的药物组合物,和使用含有AAC的药物组合物治疗细菌感染的方法。此类组合物可进一步包含合适的赋形剂,诸如药学可接受赋形剂(载剂),包括缓冲剂,酸,碱,糖,稀释剂,助流剂,防腐剂等等,它们是本领域公知的且在本文中有描述。本发明的方法和组合物可以单独或与用于治疗传染病的其它常规方法和/或药剂组合使用。一方面,本发明还提供包含至少一种本发明抗体和/或至少一种其抗体-抗生素缀合物(AAC)的药物配制剂。在一些实施方案中,药物配制剂包含1)本发明的抗体和/或其AAC,和2)药学可接受载剂。在一些实施方案中,药物配制剂包含1)本发明的抗体和/或其AAC,和任选的2)至少一种别的治疗剂。
包含本发明抗体或AAC的药物配制剂通过将具有期望纯度的抗体或AAC与任选的生理学可接受载体,赋形剂或稳定剂(《Remington'sPharmaceuticalSciences》,第16版,Osol,A.编,1980)混合来制备成水溶液或冻干剂型或其它干燥剂型的形式供贮存。可接受的载剂,赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,并且包括:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵,苄索氯铵；酚,丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸或赖氨酸；单糖,二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖类,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物配制剂一般是无菌的,易于通过无菌滤膜过滤来实现。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶状药物投递系统中(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳剂,纳米颗粒和纳米胶囊),或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明抗体或AAC的固体疏水聚合物的半透性基质,该基质是定型产品的形式,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯,水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)),聚交酯(美国专利No.3,773,919),L-谷氨酸和γ-乙基L-谷氨酸酯的共聚物,不可降解的乙烯-乙酸乙烯,可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子达100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当所封装的抗体或AAC在体内长时间维持时,它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换的分子间S-S键形成,那么可通过修饰巯基,自酸性溶液冻干,控制含水量,使用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
可以以任何合适形式配制抗体以投递至靶细胞/组织。例如,抗体可以配制成脂质体,即由各种类型脂质,磷脂和/或表面活性剂构成的,可用于对哺乳动物投递药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似,脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备,诸如Epsteinetal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688；Hwangetal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030；US4,485,045；US4,544,545；WO97/38731；US5,013,556中描述的。
可用包含磷脂酰胆碱,胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器,产生具有期望直径的脂质体。可如Martinetal.(1982)J.Biol.Chem.257:286-288中所述,将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体缀合。任选在脂质体中包含化疗剂(Gabizonetal.(1989)J.NationalCancerInst.81(19):1484)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中,本文中提供的任何抗体可用于检测生物学样品中MRSA的存在。在用于本文时,术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物学样品”包括例如血液,血清,血浆,组织,痰,抽吸物,拭子,等。
在一个实施方案中,提供了在诊断或检测方法中使用的抗WTA抗体。在又一方面,提供了检测生物学样品中WTA的存在的方法。在某些实施方案中,该方法包括在容许抗WTA抗体结合WTA的条件下使生物学样品与抗WTA抗体接触,如本文中所描述的,并检测是否在抗WTA抗体与生物学样品中的WTA间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中,使用抗MRSA抗体来选择适合用抗MRSA抗体治疗的受试者,例如其中MRSA是一种用于选择患者的生物标志。
在一个例示性实施方案中,体内使用抗WTA抗体来检测(例如通过体内成像)受试者中的MRSA阳性感染,例如为了感染诊断,预后,或分期治疗,确定适宜的治疗过程,或监测感染对治疗的响应的目的。本领域已知用于体内检测的一种方法是免疫-正电子发射体层摄影术(immuno-PET),如记载于例如vanDongenetal.(2007)TheOncologist12:1379-1389及Vereletal.(2003)J.Nucl.Med.44:1271-1281。在此类实施方案中,提供了一种用于检测受试者中的葡萄球菌阳性感染的方法,该方法包括将经过标记的抗葡萄球菌抗体施用于具有或怀疑具有葡萄球菌阳性感染的受试者,并检测所述受试者中所述经过标记的抗葡萄球菌抗体,其中检测到所述经过标记的抗葡萄球菌抗体指示所述受试者中的葡萄球菌阳性感染。在某些此类实施方案中,经过标记的抗葡萄球菌抗体包含与正电子发射体缀合的抗葡萄球菌抗体,诸如68Ga,18F,64Cu,86Y,76Br,89Zr,和124I。在一个具体的实施方案中,正电子发射体是89Zr。
在又一些实施方案中,诊断或检测方法包括使固定化至基片的第一抗葡萄球菌抗体与要测试葡萄球菌存在情况的生物学样品接触,使该基片暴露于第二抗葡萄球菌抗体,并检测该第二抗葡萄球菌抗体是否结合至该第一抗葡萄球菌抗体和该生物学样品中的葡萄球菌之间的复合物。基片可以是任何支持性介质,例如玻璃,金属,陶瓷,聚合物珠,载玻片,芯片,和其它基片。在某些实施方案中,生物学样品包括细胞或组织(例如活检材料,包括癌性或潜在癌性的结肠直肠,子宫内膜,胰腺或卵巢组织)。在某些实施方案中,第一或第二抗葡萄球菌抗体是本文所述任何抗体。在此类实施方案中,第二抗WTA抗体可以是本文所述抗WTA抗体S4497,S4462,S6978,S4487,或自它们衍生的抗体。
可依照任何上述实施方案来诊断或检测的例示性病症包括MRSA阳性感染,使用诸如免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)等测试来进行。在一些实施方案中,葡萄球菌阳性感染是根据检测葡萄球菌mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定法表达葡萄球菌的感染。在一些实施方案中,所述RT-PCR是定量RT-PCR(FrancoisPandSchrenzelJ(2008)."RapidDiagnosisandTypingofStaphylococcusaureus".Staphylococcus:MolecularGenetics.CaisterAcademicPress；MackayIM,ed.(2007))和实时PCR(“Real-TimePCRinMicrobiology:FromDiagnosistoCharacterization.CaisterAcademicPress)。
在某些实施方案中,提供了经标记的抗壁磷壁酸(WTA)抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光,发色,电子致密,化学发光,和放射性标记物),及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块,诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P,14C,125I,3H,和131I,荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物,罗丹明(rhodamine)及其衍生物,丹酰,伞形酮,萤光素酶,例如,萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456),萤光素,2,3-二氢酞嗪二酮,辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,葡糖淀粉酶,溶菌酶,糖类氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联),乳过氧化物酶,或微过氧化物酶,生物素/亲合素,自旋标记物,噬菌体标记物,稳定的自由基,等等。在另一个实施方案中,标记物是正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga,18F,64Cu,86Y,76Br,89Zr,和124I。在一个具体的实施方案中,正电子发射体是89Zr。
在临床上,MRSA感染的症状与甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的症状相似,而且包括脓肿和蜂窝组织炎。通常,脓肿伴有一定面积的中心性坏死。疖也是常见的,特别是在MRSA爆发的背景中。由于进展至坏死中心的一般发红,损害还可能错误报告为蜘蛛咬伤。另外,感染可表现为脓疱病,毛囊炎,深位脓肿,脓性肌炎,骨髓炎,坏死性筋膜炎,葡萄球菌中毒性休克综合征,肺炎和脓毒症。严重的全身感染在具有注射药物使用,糖尿病或其它免疫受损疾患历史的人中更加常见。
用于MRSA感染的标准治疗选项包括保守的,机械的选项,诸如:(i)温浸泡和敷布,(ii)切开和引流,和(iii)去除引起感染的外来装置(例如导管)。对于更加严重的感染,尤其是那些展示蜂窝组织炎的,开出抗生素(Abx)处方。对于轻度至中度感染,抗生素包括甲氧苄啶-磺胺甲唑(TMP-SMX),克林霉素,多西环素,米诺霉素,四环素,力复平,万古霉素,利奈唑胺。通常,治疗方案进行5-10次,在治疗期期间和之后有周期性复查和评估。
别的治疗选项包括去定居(decolonization),尤其是在患者经历复发性感染或他们处于MRSA爆发正在进行的环境的背景中。去定居指去除栖息于患者鼻孔的菌群的规程。这是经由在两个鼻孔内充分表面应用2％莫匹罗星软膏5-10天和用4％葡萄糖酸氯己定表面清洁5天进行的。
制品
在本发明的另一方面,提供了一种制品,其含有可用于治疗,预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋,等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断病症的组合物,并且可以具有无菌存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或AAC。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外,制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中组合物包含本发明的抗体或AAC；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页,其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外,制品可以进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲液,诸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,Ringer氏溶液或右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料,包括其它缓冲液,稀释剂,滤器,针,和注射器。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,根据上文提供的一般描述,可以实施各种其它实施方案。
实施例1:MC-vc-PAB-pipBOR51
在乙醇溶剂中用钯/碳催化剂在氢气下氢化2-硝基苯-1,3-二醇1以给出2-氨基苯-1,3-二醇2,作为盐酸盐分离(图23A和23B)。在二氯甲烷/四氢呋喃中用叔丁基二甲基甲硅烷基氯和三乙胺单保护2给出2-氨基-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧)酚3。于室温在甲苯中用氧化锰或氧气通过氧化缩合使利福霉素S(ChemShuttleInc.,Fremont,CA,US7342011；US7271165；US7547692)与3反应以给出TBS保护的苯并嗪并利福霉素4。4与哌啶-4-胺和氧化锰的反应给出哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)5。
于室温(RT)在DMF(0.4ml)中混合哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)5(0.02mmol)和4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6(0.02mmol)。对此添加2.5个当量的N,N'-二异丙基乙基胺。将溶液搅动1至约12小时并通过LC/MS来监测。完成后,用DMF稀释溶液,注射到HPLC上,并在酸性条件下纯化以给出MC-vc-PAB-pipBOR51。M/Z＝1498.9。产率40％。
实施例2:MC-fk-PAB-pipBOR52
在实施例1的规程之后,将6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-((S)-5-胍基-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧戊-2-基氨基)-1-氧-3-苯基丙-2-基)己酰胺12转变成4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)-5-胍基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯13。
于室温(RT)在DMF(0.4ml)中混合哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)5(0.02mmol)和13(0.02mmol)。对此添加2.5个当量的N,N'-二异丙基乙基胺。将溶液搅动1至约12小时并通过LC/MS来监测。完成后,用DMF稀释溶液,注射到HPLC上,并在酸性条件下纯化以给出MC-fk-PAB-pipBOR52。M/Z＝1545.8。产率32％。
实施例3:MP-vc-PAB-pipBOR53
在实施例1的规程之后,将6-(2-(2-(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酰胺基)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)己酰胺14转变成4-((17S,20S)-1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-异丙基-8,15,18-三氧-20-(3-脲基丙基)-3,6-二氧-9,16,19-三氮二十一酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯15。
于室温(RT)在DMF(0.4ml)中混合哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)5(0.02mmol)和15(0.02mmol)。对此添加2.5个当量的N,N'-二异丙基乙基胺。将溶液搅动1至约12小时并通过LC/MS来监测。完成后,用DMF稀释溶液,注射到HPLC上,并在酸性条件下纯化以给出MP-vc-PAB-pipBOR53。M/Z＝1644.8。产率57％。
实施例4:MC-vc-PAB-二甲基pipBOR54
N,N-二甲基哌啶-4-胺与TBS保护的苯并嗪并利福霉素4的反应给出二甲基哌啶基苯并嗪并利福霉素(二甲基pipBOR)7(图24)。
或者,在四氢呋喃/甲醇溶剂中用钯/碳催化剂在氢气下氢化(5-氟-2-硝基-1,3-亚苯基)二(氧)二(亚甲基)二苯9以去除苄基基团以给出2-氨基-5-氟苯-1,3-二醇10。于60℃在乙酸乙酯中在铁氰化钾或在空气中通过氧化缩合使商品化的利福霉素S或利福霉素SV钠盐(ChemShuttleInc.,Fremont,CA)与2-氨基-5-氟苯-1,3-二醇10反应以给出氟苯并嗪并利福霉素11。用N,N-二甲基哌啶-4-胺置换氟给出二甲基pipBOR7(图25A和25B)。
在N,N-二甲基甲酰胺(6mL,77mmol,44,5700mg)中吸收依照WO2012113847；US7659241；US7498298；US20090111756；US20090018086；US6214345；Dubowchiketal.(2002)BioconjugateChem.13(4):855-869中的规程制备的6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)己酰胺8(1.009g,1.762mmol,1.000,1009mg)。对此逐滴分部分(在1小时里添加一半,于室温(RT)搅动1小时,然后在另1小时里添加另一半)添加亚硫酰氯(thionylchloride)(1.1equiv.,1.938mmol,1.100,231mg)在二氯甲烷(DCM)(1mL,15.44mmol,8.765,1325mg)中的溶液。溶液保持黄色。作为在0.5mLDCM中的溶液小心地逐滴添加另0.6个当量的亚硫酰氯。反应保持黄色,而且于室温密封搅动过夜。通过LC/MS来监测反应至88％产物苄基氯9。作为在0.3mLDCM中的溶液逐滴添加另0.22个当量的亚硫酰氯。当反应接近92％苄基氯9时,给反应鼓泡N2。浓度降低0.3M至0.6M。作为0.6M溶液在冰箱中保存产物N-((S)-1-((S)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)-6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9并就这样使用。M/Z591.3,产率92％。
在烧瓶中,将N-((S)-1-((S)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)-6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9(0.9mmol)冷却至0℃,并添加二甲基哌啶基苯并嗪并利福霉素(二甲基pipBOR)7(0.75g,0.81mmol,0.46,750mg)。用另1.5mLDMF稀释混合物以达到0.3M。暴露于空气搅动30分钟。添加N,N-二异丙基乙基胺(3.5mmol,3.5mmol,2.0,460mg),并将反应暴露于空气搅动过夜。在4天过程里,4次添加0.2个当量的N,N-二异丙基乙基胺碱,同时暴露于空气搅动反应,直至反应看来停止行进。用DMF稀释反应,并分数批在HPLC(20-60％ACN/FA.H2O)上纯化以给出MC-vc-PAB-二甲基pipBOR54。M/Z＝1482.8,产率32％。
实施例5:MC-vc-PAB-单甲基pip,去乙酰基BOR55
在实施例1的规程之后,使N-甲基哌啶-4-胺和TBS保护的去乙酰基,苯并嗪并利福霉素与氧化锰反应以给出单甲基哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)16。
使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6和16反应以给出MC-vc-PAB-单甲基pip,去乙酰基BOR55。M/Z＝1456.5,产率26％。
实施例6:MC-vc-PAB-单甲基pipBOR56
在实施例1的规程之后,使N-甲基哌啶-4-胺和TBS保护的苯并嗪并利福霉素4与氧化锰反应以给出单甲基哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)17。
使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2，,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6和17反应以给出MC-vc-PAB-单甲基pipBOR56。M/Z＝1471.0,产率25％。
实施例7:MC-vc-PAB-pip,去乙酰基BOR57
在实施例1的规程之后,使哌啶-4-胺和TBS保护的去乙酰基,苯并嗪并利福霉素18与氧化锰反应以给出哌啶基,去乙酰基苯并嗪并利福霉素(pip去乙酰基BOR)19。
使哌啶基,去乙酰基苯并嗪并利福霉素19(0.02mmol)和4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6(0.02mmol)反应以给出MC-vc-PAB-pip,去乙酰基BOR57。M/Z＝1456.6,产率13％。
实施例8:MC-vc-PAB-利福布汀58
在实施例1的规程之后,使去异丁基利福布汀20(0.02mmol)和4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6(0.02mmol)反应以给出MC-vc-PAB-利福布汀58。M/Z＝1389.6,产率21％。
实施例9:MC-GGAFAGGG-pipBOR(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)59
在实施例1的规程之后,在标准酰胺键形成条件下使马来酰亚胺肽21与哌啶基苯并嗪并利福霉素(pipBOR)5偶联以给出MC-GGAFAGGG-pipBOR(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)59。M/Z＝1626.0,产率13％。
实施例10:MC-vc-PAB-rif60
在小管形瓶中,将0.05mL通过实施例4的规程制备的N-((S)-1-((S)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)-6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9的0.6M溶液冷却至0℃,添加1个当量的苯并嗪并利福霉素22,并将混合物搅动5分钟。对此0℃溶液添加K2CO3(15eq),并用0.05mLDMF清洗管形瓶的侧壁。于室温将反应暴露于空气搅动1-4小时。当所有9消耗时,过滤掉固体,并用DMF稀释收集的滤出液。HPLC纯化给出MC-vc-PAB-rif60。M/Z＝1356.9,产率11％。
实施例11:MC-vc-PAB-二甲基pip,去乙酰基BOR61
在实施例4的规程之后,使N-((S)-1-((S)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)-6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9与二甲基哌啶基,去乙酰基苯并嗪并利福霉素(二甲基,去乙酰基pipBOR)23反应以给出MC-vc-PAB-二甲基pip,去乙酰基BOR61。M/Z＝1440.66。
实施例12:MC-vc-PAB-piperazBTR62
在实施例1的规程之后,使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6与哌嗪并苯并噻嗪并利福霉素(piperazBTR)24反应以给出MC-vc-PAB-piperazBTR62。M/Z＝1483.7。
实施例13:MC-vc-PAB-piperaz,去乙酰基BTR63
在实施例1的规程之后,使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6与哌嗪并,去乙酰基苯并噻嗪并利福霉素(pipBTR)25反应以给出MC-vc-PAB-piperaz,去乙酰基BTR63。M/Z＝1441.6。
实施例14:MC-vc-PAB-piperaz,去乙酰基BOR64
在实施例1的规程之后,使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6与哌嗪基,去乙酰基苯并嗪并利福霉素(去乙酰基pipBOR)26反应以给出MC-vc-PAB-piperaz,去乙酰基BOR64。M/Z＝1441.6。
实施例15:MC-vc-PAB-piperazBOR65
在实施例1的规程之后,使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6与哌嗪基苯并嗪并利福霉素(哌嗪基BOR)27反应以给出MC-vc-PAB-piperazBOR65。M/Z＝1482.7。
实施例16:MC-vc-二PAB-二甲基pipBOR66
在管形瓶中,在DMF(55equiv.,116mmol,55.0,8.5g)中吸收4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯6(1.56g,2.11mmol,100mass％),并于室温搅动。对此混浊黄色混合物添加(4-氨基苯基)甲醇(PAB,1.1equiv.,2.33mmol,1.10,286mg)和1-羟基苯并三唑(0.37equiv.,0.782mmol,0.370,106mg),接着是N,N'-二异丙基乙基胺(1equiv.,2.11mmol,1.00,276mg)。将反应搅动2小时,并通过LC/MS来监测。添加另1个当量的N,N'-二异丙基乙基胺(Hunigs碱)和100mg(4-氨基苯基)甲醇。于室温将反应密封搅动过夜。逐滴添加约0.5L二乙醚以沉淀出产物。倾倒出醚,在DMF中再溶解固体,并分数批直接在HPLC上纯化以给出4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-(羟基甲基)苯基氨基甲酸酯28(0.435g),总体分离产率28％(M/Z:722.5),其具有结构:
在实施例4的规程之后,使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-(羟基甲基)苯基氨基甲酸酯28与亚硫酰氯反应以给出4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-(氯甲基)苯基氨基甲酸酯29,分离产率47％(M/Z:740.4),其具有结构:
在实施例4的规程之后,使4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-(氯甲基)苯基氨基甲酸酯29与二甲基哌啶基苯并嗪并利福霉素(二甲基pipBOR)7反应以给出MC-vc-二PAB-二甲基pipBOR66,产率5％(M/Z:1632.1)。
实施例17:MC-vc-PAB-甲基piperazBOR67
在实施例4的规程之后,使N-((S)-1-((S)-1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧-5-脲基戊-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁-2-基)-6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9与甲基哌嗪并苯并嗪并利福霉素(甲基piperazBOR)30反应以给出MC-vc-PAB-甲基piperazBOR67。M/Z＝1454.68。
实施例18:细胞内MRSA针对抗生素受到保护
这个实施例提供MRSA能在体内在细胞内存活的证据。在感染中,细胞内MRSA针对抗生素处理(诸如SOC万古霉素)受到保护且能够存活,使得感染能够自一个细胞转移至另一个细胞。
细胞外细菌的MIC测定:如下测定细胞外细菌的MIC,制备抗生素在胰胨豆胨培养基中的连续2倍稀释液。在96孔培养皿中一式四份生成抗生素的稀释液。自指数式生长的培养物取得MRSA(USA300的NRS384株),并稀释至1x104CFU/mL。于37℃在抗生素存在下将细菌摇动培养18-24小时,并通过读取630nm光密度(OD)来测定细菌生长。作为将细菌生长抑制>90％的抗生素剂量测定MIC。
细胞内细菌的MIC测定:对隔绝在小鼠腹膜巨噬细胞内部的细菌测定细胞内MIC。以4x105个细胞/mL的密度在24孔培养皿中分配巨噬细胞,并以10-20个细菌每个巨噬细胞的比率用MRSA(USA300的NRS384株)感染。在补充有50μg/mL庆大霉素的生长培养基中维持巨噬细胞培养物以抑制细胞外细菌的生长,并在感染后1天将测试抗生素添加至生长培养基。添加抗生素后24小时评估细胞内细菌的存活。用补充有.1％牛血清清蛋白和.1％Triton-X的Hanks缓冲盐水溶液裂解巨噬细胞,并在含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水溶液中生成裂解物的连续稀释液。通过在含5％脱纤维蛋白绵羊血的胰胨豆胨琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的数目。
腹膜巨噬细胞的分离:自6-8周龄Balb/c小鼠(CharlesRiverLaboratories,Hollister,CA)的腹膜分离腹膜巨噬细胞。为了提高巨噬细胞的产率,通过腹膜内注射1mL巯基乙酸盐培养基(BectonDickinson)来预处理小鼠。在水中以4％的浓度制备巯基乙酸盐培养基,高压灭菌,并在使用前陈化20天至6个月。巯基乙酸盐处理后4天通过用冷的磷酸盐缓冲盐水清洗腹膜腔来收获腹膜巨噬细胞。在24孔培养皿中以4x105个细胞/孔的密度在补充有10％胎牛血清和10mMHEPES,不含抗生素的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中分配巨噬细胞。将巨噬细胞培养过夜以允许贴壁至板。还利用这种测定法来测试非吞噬细胞类型中的细胞内杀伤。自ATCC获得MG63(CRL-1427)和A549(CCL185)细胞系,并在补充有10mMHepes和10％胎牛血清的RPMI1640组织培养培养基(RPMI-10)中维持。自Lonza获得HUVEC细胞,并在EGM内皮细胞完全培养基(Lonza,Walkersville,MD)中维持。
用经过调理的MRSA感染巨噬细胞:自NARSA仓库(Chantilly,Virginia)获得MRSA的USA300株(NRS384)。一些实验利用金黄色葡萄球菌的Newman株(ATCC25904)。在所有实验中,在胰胨豆胨培养基中培养细菌。为了评估AAC的细胞内杀伤,自指数式生长的培养物取得USA300,并在HB(补充有10mMHEPES和0.1％牛血清清蛋白的Hanks平衡盐溶液)中清洗。在HB中稀释AAC或抗体,并与细菌一起温育1小时以允许抗体结合细菌(调理),并以10-20个细菌每个巨噬细胞的比率(每孔250μLHB中4x106个细菌)使用经过调理的细菌感染巨噬细胞。临感染前用无血清DMEM培养基预清洗巨噬细胞,并通过于37℃在具有5％CO2的增湿组织培养温箱中温育以允许吞噬细菌来感染。2小时后,去除感染混合物,并用正常生长培养基(DMEM补充有10％胎牛血清,10mMHEPES,并以50μg/ml添加庆大霉素以防止细胞外细菌生长)替换。在温育期结束时,用无血清培养基清洗巨噬细胞,并在补充有0.1％Triton-X的HB中裂解细胞(裂解巨噬细胞但不损害细胞内细菌)。在一些实验中,在培养期结束时通过使用LDH细胞毒性检测试剂盒(产品11644793001,RocheDiagnosticsCorp,Indianapolis,IN)检测释放入培养物上清液的胞质乳酸脱氢酶(LDH)来评估巨噬细胞的存活力。收集上清液,并立即依照制造商的说明书进行分析。在补充有0.05％Tween-20(用于破坏细菌聚集体)的磷酸盐缓冲盐水溶液中生成裂解物的连续稀释液,并通过在含有5％脱纤维蛋白绵羊血的胰胨豆胨琼脂上涂板来测定存活细胞内细菌的总数。
MRSA感染腹膜细胞的生成:通过腹膜注射用1x108CFUUSA300的NRS384株感染6-8周龄雌性A/J小鼠(JAXTM小鼠,JacksonLaboratories)。感染后1天收获腹膜洗液,并于37℃将受到感染的腹膜细胞用50μg/mL在补充有0.1％BSA的Hepes缓冲液(HB缓冲液)中稀释的溶葡萄球菌素处理30分钟。然后将腹膜细胞在冰冷的HB缓冲液中清洗2次。将腹膜细胞在补充有10mMHepes和10％胎牛血清,和5μg/mL万古霉素的RPMI1640组织培养培养基中稀释至1x106个细胞/mL。将来自原发性感染的游离MRSA于4℃在磷酸盐缓冲盐水溶液中保存过夜,作为未提交嗜中性细胞杀伤的细胞外细菌的对照。
感染自腹膜细胞转移至成骨细胞:自ATCC(CRL-1427)获得MG63成骨细胞细胞系,并在补充有10mMHepes和10％胎牛血清的RPMI1640组织培养培养基(RPMI-10)中维持。在24孔组织培养板中分配成骨细胞,并培养至获得汇合层。在实验当天,将成骨细胞在RPMI(无补充物)中清洗一次。在完全RPMI-10中稀释MRSA或受到感染的腹膜细胞,并在临感染前以5μg/mL添加万古霉素。以1x106个腹膜细胞/mL将腹膜细胞添加至成骨细胞。用0.1％Triton-x裂解细胞的一份样品以测定在感染的时候活的细胞内细菌的实际浓度。通过将细菌的连续稀释液在含有5％脱纤维蛋白绵羊血的胰胨豆胨琼脂上涂板来测定所有感染的实际滴度。
在4孔玻璃腔式载玻片中分配MG63成骨细胞,并在补充有10mMHepes和10％胎牛血清的RPMI1640组织培养培养基(RPMI-10)中培养直至它们形成汇合层。在感染当天,用无血清培养基清洗孔并用受到感染的腹膜细胞的悬浮液或在补充有5μg/mL万古霉素的完全RPMI-10中稀释的MRSA的USA300株感染。感染后1天,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞,并于室温在含有2％低聚甲醛的PBS中固定30分钟。将孔在PBS中清洗3次,并于室温用含有0.1％皂苷的PBS透化30分钟。
免疫荧光:通过用20μg/mL家兔抗葡萄球菌20920(abcam,Cambridge,MA),接着用抗家兔罗丹明(JacksonImmunoResearch,711-026-152)染色来鉴定MRSA。用霍乱毒素β亚基-生物素(Invitrogen,Carlsbad,CA),接着用链霉亲合素Cy5(BDBiosciences,SanJose,CA)染色腹膜细胞的细胞膜。通过抗CD11bAlexa488克隆M1/70(BDbiosciences)的共染色来确认霍乱毒素对腹膜细胞的结合。用ProlongGoldwithDAPI(Invitrogen,Carlsbad,CA)封固载玻片。使用LeicaSPE共焦显微镜观看载玻片。作为一系列Z-堆栈收集图像,并汇编以生成显示的最大投射图像。
金黄色葡萄球菌在哺乳动物细胞内部的存活提供可存活小生境,允许在抗生素疗法存在下的持久感染。金黄色葡萄球菌能够感染多种哺乳动物细胞类型(包括嗜中性细胞,巨噬细胞,成骨细胞和上皮细胞)和在它们内部存活(Garzoni,C.andW.L.Kelley(2009)TrendsMicrobiol17(2):59-65)。为了直接测试细胞内MRSA是否针对抗生素受到保护,对多种临床批准的抗生素比较它们杀死在标准细菌生长培养基中培养的细胞外MRSA的能力与它们杀死隔绝在鼠巨噬细胞内部的细胞内MRSA的能力(表1)。为这项分析选择鼠腹膜巨噬细胞,因为这些细胞代表一种遗传正常的原代细胞类型,它是针对金黄色葡萄球菌的先天免疫应答的一种天然成分。分析确认了这些细胞在体外容易感染和培养。MRSA能够在感染巨噬细胞后在细胞内存活多至6天(Kubica,M.,K.Guziketal.(2008)PLoSOne3(1):e1409)。为了测试抗生素的细胞内效果,用MRSA感染巨噬细胞,并在庆大霉素(已知在吞噬溶酶体内部无活性的一种抗生素,原因在于该抗生素较差的细胞摄取)存在下培养(Vaudaux,P.andF.A.Waldvogel(1979)AntimicrobAgentsChemother16(6):743-749)。感染后1天(在庆大霉素以外)以选择成包括临床上可实现的血清水平(在表1中以血清Cmax显示)的剂量范围将测试抗生素添加至培养培养基。这项分析揭示,尽管细胞外MRSA在液体培养中对低剂量的万古霉素,达托霉素,利奈唑胺或利福平的生长抑制高度易感,但是所有4种抗生素未能杀死相同的隔绝在巨噬细胞内部的细胞内MRSA株。引人注目地,甚至据报告是用于治疗细胞内感染诸如结核病的最佳抗生素之一的利福平在实验的时间和剂量范围上产生最小限度的细胞内MRSA杀伤。
表1:数种抗生素的最小抑制浓度(MIC)
上述数据确认了细胞内细菌在它们隔绝在细胞内部的时间期间针对抗生素受到保护。然而,不认为MRSA真的是细胞内病原体,因为它不能通过直接的细胞至细胞转移来感染邻近细胞,而且大多数受到感染的细胞最终会裂解,释放细胞内细菌。因此,仍然可能的是细胞内池,一旦释放,会不可避免地暴露于细胞外抗生素,至少是瞬时的,即使细菌立即被邻近细胞摄取。巨噬细胞对游离MRSA的摄取需要15至90分钟(未显示的数据),提示如果细菌能够抵抗对抗生素的短暂暴露,那么它能通过相继地自垂死的细胞移动至新的宿主在细胞内小生境中保持受到保护。为了确定对抗生素的短暂暴露是否足以杀死MRSA,测试了万古霉素(用于MRSA感染的当前标准护理治疗)和力复平。自活跃生长中的培养物取得MRSA,并在正常生长培养基中稀释至1x106个细菌/mL。以代表2倍和10倍预期最小抑制浓度(MIC)之间的两种剂量添加抗生素。在30分钟和5小时之间的多个时间取出样品,并通过离心和稀释来去除抗生素。通过在琼脂板上涂板来测定培养物中存活细菌的总数。
图1显示万古霉素和利福平对活跃分裂中的MRSA的杀伤时间的比较。将MRSA在TSB培养基中在抗生素存在下培养5小时。在指定时间,取得培养物的样品,并通过离心来去除抗生素。在每个时间点通过涂板来测定存活细菌的总数。以2μg/mL(空心正方形)和20μg/mL(实心正方形)测试万古霉素。以0.02μg/mL(空心三角形)和0.2μg/mL(实心三角形)测试力复平。这些数据(图1)揭示,虽然这两种抗生素均能够有效抑制细菌生长,而且到5小时时观察到可存活细菌损失100倍,但是细菌是在5小时观察期里逐渐杀死的且90％的细菌在抗生素处理的头2小时期间保持可存活,允许充足的时间供宿主细胞潜在摄取。
对MRSA的细胞内储存测定在万古霉素存在下感染到允许性细胞内小生境的转移。金黄色葡萄球菌能在成骨细胞内部存活,而且已经在具有骨髓炎(已知其中的慢性金黄色葡萄球菌感染抵抗抗生素治疗的一种疾患)的患者中观察到金黄色葡萄球菌的细胞内储存(ThwaitesandGant(2011)NatureReviewsMicrobiology9:215-222；Ellingtonetal.(2006)J.OrthopedicResearch24(1):87-93；Bosseetal.(2005)J.BoneandJointSurgery,87(6):1343-1347)。开发了一种使用成骨细胞细胞系MG63的体外测定法,因为这种细胞系据报告能够容纳细胞内金黄色葡萄球菌(GarzoniandKelly(2008)TrendsinMicrobiology)。这种测定法确认了MRSA能够感染MG63细胞,而且在体外长达6天能自受到感染的MG63细胞回收可存活细胞内细菌。为了生成细胞内金黄色葡萄球菌池,自通过腹膜注射MRSA受到感染的小鼠收获腹膜细胞(图2)。
图2显示在万古霉素存在下感染自受到感染的腹膜细胞转移至成骨细胞。为了生成细胞内金黄色葡萄球菌池,用MRSA感染A/J小鼠并在感染后1天取得受到感染的腹膜细胞。已经报告了类似生成的细胞容纳能够在体内感染模型中转移感染的可存活细胞内细菌(Greshametal.,JImmunol2000；164:3713-3722)。受到感染的腹膜细胞由主要是嗜中性细胞和巨噬细胞和大约10％的容纳细胞内细菌的细胞的混合物组成。用溶葡萄球菌素处理细胞以去除细胞外细菌并在补充有5μg/mL万古霉素的生长培养基中悬浮。裂解用于感染的腹膜细胞的一份样品以测定在感染启动的时间可存活细胞内MRSA的精确剂量,并且还在含有万古霉素的培养基中稀释多种剂量的游离细胞外MRSA用于比较。然后将腹膜细胞(细胞内MRSA)或游离细菌(细胞外MRSA)添加至MG63成骨细胞单层并培养4小时(空心条)或1天(实心条)。通过将细胞裂解物在琼脂板上涂板来测定每个孔中存活细胞内细菌的总数。与细胞外MRSA对照相比,细胞内MRSA针对万古霉素受到保护。用3x104个细胞内细菌感染的孔在感染后1天产生8,750个细胞内细菌(感染剂量的约三分之一),而细胞外细菌被有效杀死,因为用相似剂量的游离MRSA感染在感染后1天只产生375个细胞内细菌。
免疫荧光显微术也证明感染自腹膜细胞转移至MG63成骨细胞。用MRSA感染后1天自小鼠收集腹膜细胞并用溶葡萄球菌素处理以杀死任何污染性细胞外细菌(细胞内感染)。自活跃生长中的培养物取得游离MRSA并在PBS中清洗(细胞外感染)。通过在琼脂板上涂板来确认细胞内和细胞外感染样品中可存活细菌的总数,并且将这两种样品在补充有5μg/mL万古霉素的培养基中悬浮,之后立即添加至在腔式载玻片中培养的MG63成骨细胞的汇合层。感染后1天,清洗MG63细胞以去除细胞外细菌,透化并用抗金黄色葡萄球菌抗体(以鉴定细胞内MRSA)和优先结合腹膜细胞膜的霍乱毒素染色。用DAPI共染色所有细胞核以确认MG63单层是完整的。通过共焦显微术来检查载玻片。
用腹膜细胞感染的孔含有MG63细胞的汇合单层,而腹膜巨噬细胞在MG63层的上方清楚可见。许多巨噬细胞清楚地受到MRSA感染,这作为单色图像中的红色细菌簇或覆盖图像中的白色颗粒是可见的。在受到感染的巨噬细胞以外,还观察到只与MG63细胞有关的细菌的清楚的例子。这些受到感染的MG63细胞在用游离MRSA感染的孔中也是可见的。用游离MRSA感染要求高得多的接种体来在MG63细胞中实现相似水平的感染。
上述结果确立了游离MRSA和细胞内MRSA均能够在万古霉素存在下存活和感染MG63细胞。在这些条件下来自细胞内感染的细菌比游离细菌显著更好地能够幸免于万古霉素处理。用3x104CFU细胞内细菌感染在感染后1天产生8.7x103CFU细胞内细菌。用相似剂量的游离细菌感染在感染后1天只产生375个细胞内细菌,指示细胞内细菌比游离细菌要好多达20倍能够幸存。与4小时相比,感染后1天收获孔时所有感染剂量回收更多的细胞内细菌(1.5至6倍)。既然万古霉素在添加至游离MRSA时完全抑制生长(图1),那么这些数据提示MRSA肯定在某个时间复制了,尽管持续暴露于培养培养基中的万古霉素。虽然MRSA在鼠巨噬细胞内部没有显著复制(我们未发表的观察结果),但是金黄色葡萄球菌能够逃脱吞噬溶酶体和在非吞噬性细胞类型的胞质内复制有可观的证据(Jarry,T.M.,G.Memmi,etal.(2008)CellMicrobiol10(9):1801-1814)。总之,上述观察结果提示,甚至在持续暴露于万古霉素下,游离MRSA也能感染细胞且细胞内MRSA能自一个细胞转移至另一个细胞。这些观察结果揭示了在持续抗生素疗法存在下能发生的感染维持和甚至传播的一种潜在机制。
实施例19:体内感染模型
腹膜炎模型。通过腹膜注射5x107CFUUSA300来感染7周龄雌性A/J小鼠(JacksonLaboratories)。感染后2天处死小鼠并用5mL冷的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)冲洗腹膜。如下所述将肾在5mLPBS中匀浆用于静脉内感染模型。将腹膜洗液在台式离心机中于4℃以1,000rpm离心5分钟。收集上清液作为细胞外细菌,并收集含有腹膜细胞的细胞团粒作为细胞内级分。将细胞于37℃用50μg/mL溶葡萄球菌素处理20分钟以杀死污染性细胞外细菌。分析之前将腹膜细胞在冰冷的PBS中清洗3次以去除溶葡萄球菌素。为了对细胞内CFU的数目计数,在含有0.1％Triton-X的HB(补充有10mMHEPES和.1％牛血清清蛋白的Hanks平衡盐溶液)中裂解腹膜细胞,并在含有0.05％Tween-20的PBS中生成裂解物的连续稀释液。
静脉内感染模型:使用7周龄雌性小鼠进行所有体内实验,而且通过静脉内注射入尾静脉来进行感染。用一剂2x106CFU感染A/J小鼠(JacksonLab)。用一剂2x107CFU感染Balb/c小鼠(CharlesRiverLaboratories,Hollister,CA)。对于检查竞争性人IgG的作用的研究(SCIDIVIG模型),使用优化成实现恒定血清水平>10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法用GammaGardS/DIGIV免疫球蛋白(ASDHealthcare,BrooksKY)重建CB17.SCID小鼠(CharlesRiverLaboratories,Hollister,CA)。如下施用IGIV,初始剂静脉内30mg/小鼠,接着是6小时后第二剂腹膜内注射15mg/小鼠,和后续连续3天每天一次给药腹膜内注射15mg/小鼠。第一剂IGIV后4小时通过静脉内注射用在磷酸盐缓冲盐水中稀释的2x107CFUMRSA感染小鼠。对于研究的持续时间,感染后6至24小时开始用每天两次腹膜内注射100mg/Kg万古霉素处理接受万古霉素的小鼠。在磷酸盐缓冲盐水中稀释实验性治疗剂(AAC,抗MRSA抗体或游离二甲基-pipBOR抗生素),并在感染后30分钟至24小时以单次静脉内注射来施用。在感染后第4天处死所有小鼠,并在5mL磷酸盐缓冲盐水中收获肾。使用GentleMACSDissociatorTM(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)将组织样品匀浆。通过将组织匀浆物在PBS.05％Tween中的连续稀释液在含有5％脱纤维蛋白绵羊血的胰胨豆胨琼脂上涂板来测定每只小鼠(2个肾)回收的细菌的总数。
实施例20:组织蛋白酶/胱天蛋白酶释放测定法
为了对用组织蛋白酶B处理后自AAC释放的活性抗生素的量定量,将AAC在组织蛋白酶缓冲液(20mM乙酸钠,1mMEDTA,5mML-半胱氨酸)中稀释至200μg/mL。参见:Dubowchiketal.(2002)Bioconj.Chem.13:855-869第863页,为了这种测定法的目的通过援引而收录。以10μg/mL添加组织蛋白酶B(来自牛脾,SIGMAC7800),并将样品于37℃温育1小时。作为对照,在单独的缓冲液中温育AAC。通过添加10倍体积的细菌生长培养基,胰胨豆胨培养基pH7.4(TSB)来终止反应。为了评估活性抗生素的总释放,在96孔板中在TSB中一式四份生成反应混合物的连续稀释液,并以2x103CFU/mL的终密度将金黄色葡萄球菌的USA300株添加至每个孔。将培养物于3℃摇动温育过夜,并通过使用读板仪读取630nM处的吸光度来测量细菌生长。
实施例21:抗WTA抗体的生成
抗体生成,筛选和选择
缩写:MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)；MSSA(甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌)；VISA(万古霉素中间体抗性金黄色葡萄球菌)；LTA(脂磷壁酸)；TSB(胰胨豆胨培养基)；CWP(细胞壁制备物)。
使用保留抗体重和轻链关联对的SymplexTM技术(Symphogen,Lyngby,Denmark)自来自金黄色葡萄球菌感染后患者的外周B细胞克隆人IgG抗体,如US8,283,294:“Methodforcloningcognateantibodies”；MeijerPJetal.,JournalofMolecularBiology358:764-772(2006)；和LanttoJetal.,JVirol.85(4):1820-33(Feb2011)中描述的；使用浆细胞和记忆细胞作为重组全长IgG全集的遗传来源。通过转染哺乳动物细胞来表达个别抗体克隆,如MeijerPJ,etal.,MethodsinMolecularBiology525:261-277,xiv.(2009)中描述的。7天后收获含有全长IgG1抗体的上清液,并在初级筛选中用于通过间接ELISA来筛选抗原结合。生成了对来自USA300或Wood46株金黄色葡萄球菌株的细胞壁制备物显示阳性ELISA结合的单抗文库。随后在200ml瞬时转染中生成抗体并用蛋白A层析(MabSelectSuRe,GELifeSciences,Piscataway,NJ)纯化用于进一步测试。对于更大规模的抗体生成,在CHO细胞中生成抗体。将编码VL和VH的载体转染入CHO细胞,并通过蛋白A亲和层析自细胞培养培养液纯化IgG。
表7:用于分离抗体的抗原的列表
CW#1和CW#3在生成ELISA包被物时总是混合在一起。
图6汇总通过ELISA对抗体的初级筛选。在用USA300细胞壁制备物混合物(铁耗尽的:TSB,比率为96:4)筛选时分离所有(4569除外)。在初级筛选中所有GlcNAcβ(6259除外),SDR,和PGN(4479)单抗对PGN和WTA也是阳性的。通过筛选与USA300CW混合物的结合完整发现了所有GlcNAcα。通过对Wood46CWP的筛选发现了4569(LTA特异性的)。
使用离体流式细胞术自文库选择抗WTA单抗
对这个文库内的每种单抗查询三项选择标准:(1)单抗结合MRSA表面的相对强度,作为会有益于高抗生素投递的相应关联抗原高表达的指标；(2)单抗结合自极其多种受到感染的组织分离的MRSA的一致性,作为关联抗原在感染期间在体内在MRSA表面稳定表达的指标；和(3)单抗对一组临床金黄色葡萄球菌株的结合能力,作为关联表面抗原表达保守性的指标。为此,使用流式细胞术来对文库中所有这些预先选择的单抗的培养物上清液测试与来自多种受到感染的组织和来自不同金黄色葡萄球菌株的金黄色葡萄球菌的反应性。
对文库中的所有单抗分析它们结合来自用MRSAUSA300感染的小鼠的受到感染的肾,脾,肝,和肺；和来自在家兔心内膜炎模型中用USA300COL感染的家兔的心或肾内的MRSA的能力。抗体识别来自多种受到感染的组织的金黄色葡萄球菌的能力提高治疗性抗体在广泛多种不同金黄色葡萄球菌临床感染中有活性的概率。在收获器官后立即分析细菌,即不进行亚培养,以防止由体外培养条件引起的表型变化。我们先前观察到数种金黄色葡萄球菌表面抗原在体外培养期间表达时在受到感染的组织中丧失表达。针对此类抗原的抗体会不太可能是治疗感染有用的。在对多种受到感染的组织分析这个单抗文库期间,对多种抗体确认了这项观察结果,它们对来自培养物的金黄色葡萄球菌细菌显示显著结合,但是不结合来自所有测试的受到感染的组织的细菌。一些抗体结合来自一些但非所有测试的受到感染的组织的细菌。因此,在本发明中,我们选择能够识别来自所有测试的感染条件的细菌的抗体。评估的参数为(1)相对荧光强度,作为抗原丰度的度量；(2)阳性染色的器官的数目,作为抗原表达稳定性的度量；和(3)单抗对一组临床金黄色葡萄球菌株的结合能力,作为关联表面抗原表达保守性的指标。相对于针对无关抗原的同种型对照抗体(例如抗疱疹病毒gD的IgG1单抗:5237(下文提到),测定测试抗体的荧光强度。针对WTA-β的单抗不仅显示最高的抗原丰度,而且显示非常一致的对来自所有测试的受到感染的组织的和上文描述的MRSA的结合。
另外,我们测试了这些单抗结合在TSB中在体外培养的下述金黄色葡萄球菌株的能力:USA300(MRSA),USA400(MRSA),COL(MRSA),MRSA252(MRSA),Wood46(MSSA),Rosenbach(MSSA),Newman(MSSA),和Mu50(VISA)。发现抗WTAβ单抗而非抗WTAα单抗与所有这些株是反应性的。分析对不同株的结合指示WTAβ比WTAα更加保守且因此更加适合于AAC。
实施例22:具有针对金黄色葡萄球菌上的壁磷壁酸的特异性的抗体的表征。
i)确认单抗的WTA特异性
通过将40mg形成团粒的金黄色葡萄球菌株与1mL补充有30％棉子糖,100μg/ml溶葡萄球菌素(CellSciences,Canton,MA),和无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Pleasanton,CA)的10mMTris-HCl(pH7.4)于37℃温育30分钟,生成来自金黄色葡萄球菌野生型(WT)株和缺少WTA的金黄色葡萄球菌突变体株(ΔTagO；WTA缺无株)的细胞壁制备物(CWP)。将裂解物以11,600xg离心5分钟,并收集含有细胞壁成分的上清液。对于免疫印迹分析,在4-12％Tris-甘氨酸凝胶上将蛋白质分开,并转移至硝基纤维素膜(Invitrogen,Carlsbad,CA),接着用所示针对WTA的测试抗体或用针对PGN和LTA的对照抗体进行印迹。
免疫印迹显示针对WTA的抗体结合来自WT金黄色葡萄球菌的WT细胞壁制备物,但是不结合来自缺少WTA的ΔTagO株的细胞壁制备物。针对肽聚糖(抗PGN)和脂磷壁酸(抗LTA)的对照抗体较好地结合这两种细胞壁制备物。这些数据指示测试抗体针对WTA的特异性。
ii)测定单抗对MRSA表面的结合程度的流式细胞术
使用下述方案通过流式细胞术分析来自受到感染的组织的完整细菌上的表面抗原表达。对于来自受到感染的小鼠组织的细菌的抗体染色,给6-8周龄雌性C57Bl/6小鼠(CharlesRiver,Wilmington,MA)静脉内注射PBS中的108CFU对数期生长的USA300。感染后2天收获小鼠器官。如TattevinP.etal.,Antimicrobialagentsandchemotherapy54:610-613(2010)中先前所述建立家兔感染性心内膜炎(IE)。给家兔静脉内注射5x107CFU静止期生长的MRSA株COL,并在18小时后收获心赘生物。感染7x107CFU静止期后18小时一天两次静脉内给予30mg/kg万古霉素处理。
为了裂解小鼠或家兔细胞,使用gentleMACS细胞离解器(Miltenyi)将组织在M管(Miltenyi,Auburn,CA)中匀浆,接着在含有0.1％Triton-X100(Thermo),10μg/mLDNA酶I(Roche)和完全迷你蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的PBS中于室温温育10分钟。使悬浮液通过40微米滤器(BD),并用补充有0.1％无IgG的BSA(Sigma)和10mMHepes,pH7.4的不含酚红的HBSS(HB缓冲液)清洗。接下来将细菌悬浮液与HB缓冲液中的300μg/mL家兔IgG(Sigma)一起于室温(RT)温育1小时以封闭非特异性IgG结合。将细菌用2μg/mL一抗染色,包括rF1或同种型对照IgG1单抗抗疱疹病毒gD:5237(NakamuraGRetal.,JVirol67:6179-6191(1993)),接下来是荧光抗人IgG二抗(JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA)。为了能够区分来自小鼠或家兔器官残骸的细菌,使用20μg/mL小鼠单抗702抗金黄色葡萄球菌肽聚糖(Abcam,Cambridge,MA)和荧光染料标记的抗小鼠IgG二抗(JacksonImmunoresearch)实施双重染色。清洗细菌并通过FACSCalibur(BD)进行分析。在流式细胞术分析期间,自双重荧光图针对单抗702阳性染色对细菌进行门控。
iii)测量对金黄色葡萄球菌的结合亲和力和MRSA上的抗原密度
表8显示MRSA抗体结合Newman-ΔSPA株的平衡结合分析,和细菌上的抗原密度。
表8
MRSA抗体 特异性 平均KD,nM(n＝2) 抗原密度,平均位点/细菌
4497 b-WTA 2.5 50,000
4462 b-WTA 3.1 43,000
6263 b-WTA 1.4 22,000
6297 b-WTA 1.1 21,000
7578 a-WTA 0.4 16,000
rF1 SDR-glyco 0.3 1600
在下述测定法条件下使用放射性配体细胞结合测定法推导KD和抗原密度:DMEM+2.5％小鼠血清结合缓冲液；于室温(RT)溶液结合2小时；并使用400,000个细菌/孔。
抗体6263像6078,因为它们的序列非常相似。除了CDRH3中的第二个残基(R对G)以外,所有其它L和H链CDR序列是相同的。
实施例23:工程化改造WTA抗体突变体
总而言之,克隆出每种抗WTAβ抗体的VH区并连接至人H链伽马1恒定区并将VL连接至卡帕恒定区以作为IgG1表达抗体。在一些情况中,如下所述在某些位置改变野生型序列以改善抗体稳定性。然后生成了半胱氨酸改造的抗体(ThioMab)。
i.将可变区连接至恒定区
将自上文人抗体文库鉴定的WTAβ抗体的VH区连接至人γ1恒定区以生成全长IgG1抗体。L链为卡帕L链。
ii.生成稳定性变体
改造图14中的WTA抗体(特别见图15A,15B,16A,16B)以改善某些特性(诸如避免脱酰胺,天冬氨酸异构化,氧化或N连接的糖基化)并在氨基酸替换后测试化学稳定性以及抗原结合的保持。使用QIAprepSpinM13试剂盒(Qiagen)自在大肠杆菌CJ236细胞中生长的M13KO7噬菌体颗粒纯化编码重或轻链的克隆的单链DNA。通过遵循Kunkel,T.A.(1985).Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA82(2):488-492中描述的方法学的位点特异性诱变,通过寡核苷酸定点诱变使用具有下述序列的5’磷酸化合成寡核苷酸来突变编码抗体的克隆:
5’-CCCAGACTGCACCAGCTGGATCTCTGAATGTACTCCAGTTGC-3’(SEQIDNO:152)
5’-CCAGACTGCACCAGCTGCACCTCTGAATGTACTCCAGTTGC-3’(SEQIDNO:153)
5’-CCAGGGTTCCCTGGCCCCAWTMGTCAAGTCCASCWKCACCTCTTGCACAGTAATAGACAGC-3’(SEQIDNO:154)；和
5’-CCTGGCCCCAGTCGTCAAGTCCTCCTTCACCTCTTGCACAGTAATAGACAGC-3’(SEQIDNO:155)(IUPAC代码)。
使用经过诱变的DNA转化大肠杆菌XL1-Blue细胞(AgilentTechnologies)并在含有50μg/ml羧苄西林的LuriaBroth板上涂板。个别挑取菌落并在含有50μg/ml羧苄西林的液体LuriaBroth培养基中生长。对微量制备DNA测序以确认突变的存在。
对于抗体6078,VH中的第二个氨基酸met(met-2)倾向于氧化。因此,将met-2突变成Ile或Val以避免残基氧化。由于改变met-2可能影响结合亲和力,因此对突变体通过ELISA测试对葡萄球菌CWP的结合。
发现CDRH3“DG”或“DD”基序倾向于转化成异天冬氨酸。抗体4497在CDRH3位置96和97中含有DG(见图18B),并为了稳定性进行改变。CDRH3对于抗原结合一般是至关重要的,所以对数种突变体测试抗原结合和化学稳定性(见图18A)。突变体D96E(v8)保留对抗原的结合,与野生型抗体4497相似(图18A；图18B),而且是稳定的且不形成异天冬氨酸。
葡萄球菌CWPELISA
为了分析6078抗体突变体,将由1X109个细菌/ml组成的经过溶葡萄球菌素处理的USA300ΔSPA金黄色葡萄球菌细胞壁制备物(WT)在0.05M碳酸钠pH9.6中1/100稀释并在4℃过夜温育期间包被到384孔ELISA板(Nunc；Neptune,NJ)上。用PBS加0.05％Tween-20清洗板并在2小时与PBS加0.5％牛血清清蛋白(BSA)温育期间封闭。这个和所有后续温育是于室温伴有温和摇动实施的。在样品/标准品稀释缓冲液(PBS,0.5％BSA,0.05％Tween20,0.25％CHAPS,5mMEDTA,0.35MNaCl,15ppmProclin,(pH7.4))中稀释抗体样品,添加至经过清洗的板,并温育1.5-2小时。在1小时与在测定法缓冲液(PBS,0.5％BSA,15ppmProclin,0.05％Tween20)中稀释至40ng/mL的过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(Fcγ)F(ab')2片段(JacksonImmunoResearch；WestGrove,PA)温育期间检测板结合的抗金黄色葡萄球菌抗体。最后一次清洗后,添加四甲基联苯胺(KPL,Gaithersburg,MD),显色5-10分钟,并用1M磷酸终止反应。使用微量板读数仪于450nm读板,以620nm为参照。
iii.生成Cys改造的突变体(ThioMab)
通过如先前教导的和下文描述的在预定位置将半胱氨酸引入H链(在CH1中)或L链(Cκ)以容许将抗体缀合至接头-抗生素中间体,生成全长ThioMab。然后将H和L链克隆入分开的质粒,并将H和L编码质粒共转染入293细胞,其中它们表达和组装成完整抗体。也可以将H和L链二者克隆入相同的表达质粒。通过表达cys突变体链和野生型链的期望组合,生成具有2个改造的Cys的IgG1,每条H链中一个或每条L链中一个,或者各自具有改造的Cys的2条H链和2条L链的组合(HCLCCys)。
图15A和15B显示6078野生型抗体和具有HCCys和LCCys的组合的突变体抗体。还对6078突变体测试它们结合来自过夜培养物的蛋白A缺陷型USA300金黄色葡萄球菌的能力。根据如图19中所示来自FACS分析的结果,突变体抗体与6078WT(未改变的)抗体相似地结合USA300；突变体中的氨基酸改变没有削弱对金黄色葡萄球菌的结合。gD是非特异性阴性对照抗体。
实施例24:抗WTA抗体-抗生素缀合物的制备
通过将抗WTA抗体缀合至接头-抗生素中间体(包括来自表2的那些)来制备表3的抗壁磷壁酸抗体-抗生素缀合物(AAC)。在缀合之前,依照WO2004/010957(通过援引收录其教导用于此目的)中描述的方法学使用标准方法用TCEP部分还原抗WTA抗体。依照例如Doroninaetal.(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784和US2005/0238649A1中描述的方法学使用标准方法将部分还原的抗体缀合至接头-抗生素中间体。简言之,将部分还原的抗体与接头-抗生素中间体组合以容许接头-抗生素中间体缀合至抗体中还原的半胱氨酸残基。淬灭缀合反应,并纯化AAC。测定每种AAC的抗生素载荷(每个抗体的抗生素模块平均数),对于改造有单个半胱氨酸突变体位点的抗壁磷壁酸抗体为约1至约2。
还原/氧化ThioMab用于缀合:将在CHO细胞中表达的全长,半胱氨酸改造的单克隆抗体(ThioMab-Junutulaetal.,2008b,NatureBiotech.,26(8):925-932；Dornanetal.(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249；Shenetal.(2012)NatureBiotech.,30(2):184-191；Junutulaetal.(2008)JourofImmun.Methods332:41-52)用含有2mMEDTA的50mMTrispH7.5中的约20-40倍过量的TCEP(盐酸三(2-羧基乙基)膦)或DTT(二硫苏糖醇)于37℃还原3小时或于室温还原过夜(Getzetal.(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80；SoltecVentures,Beverly,MA)。在10mM乙酸钠pH5中稀释还原的ThioMab并加载到HiTrapS柱上,并用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。或者,通过添加1/20体积的10％乙酸来酸化抗体,用10mM琥珀酸盐pH5稀释,加载到柱上,然后用10个柱体积的琥珀酸盐缓冲液清洗。用50mMTrispH7.5,2mMEDTA洗脱柱。
用15倍摩尔过量的DHAA(脱氢抗坏血酸)或200nM硫酸铜(CuSO4)水溶液处理洗脱的还原的ThioMab。链间二硫键的氧化在约3小时或更长时间里完全。环境空气氧化也是有效的。将再氧化的抗体透析入20mM琥珀酸钠pH5,150mMNaCl,2mMEDTA并冷冻保存于-20℃。
缀合Thio-Mab与接头-抗生素中间体:使去封闭,再氧化的thio-抗体(ThioMab)与50mMTris,pH8中的6-8倍摩尔过量的表2的接头-抗生素中间体(来自DMSO储液,浓度20mM)反应,直至反应完全(16-24小时),如通过反应混合物的LC-MS分析测定的。
然后在用20mM琥珀酸钠pH5稀释后将粗制抗体-抗生素缀合物(AAC)应用至阳离子交换柱。用至少10个柱体积的20mM琥珀酸钠pH5清洗柱,并用PBS洗脱抗体。使用凝胶过滤柱将AAC配制入含有240mM蔗糖的20mMHis/乙酸pH5。在用赖氨酸C内肽酶处理之前和之后通过UV光谱术(用于测定蛋白质浓度),分析性SEC(大小排阻层析)(用于聚集分析)和LC-MS来表征AAC。
以0.75ml/min的流速在含有0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾pH6.2中使用ShodexKW802.5柱实施大小排阻层析。通过280nm处吸光度洗脱峰面积的积分来测定AAC的聚集状态。
使用AgilentQTOF6520ESI仪器实施LC-MS分析。作为一个例子,将使用这种化学生成的AAC用Tris,pH7.5中的1:500w/w内切蛋白酶LysC(Promega)于37℃处理30分钟。将所得切割片段加载到加热至80℃的1000A,8umPLRP-S柱上并用5分钟里30％B至40％B的梯度洗脱。流动相A:含有0.05％TFA的H2O。流动相B:含有0.04％TFA的乙腈。流速:0.5ml/min。通过280nm处的UV吸光度检测来监测蛋白质洗脱,之后进行电喷射离子化和MS分析。通常实现未缀合的Fc片段,残余的未缀合的Fab和抗生素-Fab的层析解析。使用MassHunterTM软件(AgilentTechnologies)解卷积获得的m/z谱以计算抗体片段的质量。
实施例25:作为负责切割的蛋白酶的葡萄球菌蛋白酶B的鉴定和纯化
将来自Wood46的3升过夜培养物的上清液浓缩,并使用TFF(10kDa)缓冲液交换入50mM磷酸钠pH7。将样品加载到QSepaharoseFF上,并使用50mM磷酸钠pH7中的0-300mMNaCl梯度通过层析将蛋白质分开。通过与图27的thioFABS4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR)(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)一起温育并通过LC-MS分析评估在预期位点对接头的切割来鉴定活性级分。合并活性级分,并补充硫酸铵至2M的浓度。通过疏水相互作用层析在苯基Sepharose上使用50mMTriSpH7.5中的2-0M硫酸铵梯度进一步纯化蛋白质。再次,使用工具化合物鉴定活性级分。合并这些级分,并在50mM乙酸钠pH5.5中的MonoQ上使用0-1MNaCl盐梯度进一步纯化。如上鉴定来自这个层析步骤的活性级分,合并,并应用至PBS中的大小排阻层析。通过SDS-PAGE鉴定并测定活性级分以含有单一感兴趣蛋白质。
表征自QSepharose纯化富集的活性级分以鉴定负责活性的蛋白酶的类别。发现蛋白酶受到N-乙基马来酰亚胺抑制,指示该酶很可能是一种半胱氨酸蛋白酶。回顾金黄色葡萄球菌的已知的分泌性半胱氨酸蛋白酶之后,鉴定出葡萄球菌蛋白酶B具有与在REPLi筛选观察到的特异性相似的底物特异性(Kalinska,M.,T.Kantyka,etal.(2012).Biochimie94(2):318)。购买纯化的葡萄球菌蛋白酶B(Sigma-Aldrich),并与来自图27的thioFABS4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR)(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)一起温育。发现葡萄球菌蛋白酶B在与自Wood46上清液纯化的活性蛋白酶相同的位点切割接头。将葡萄球菌蛋白酶B和自培养物上清液纯化的活性蛋白酶与Alexa488C5马来酰亚胺(Invitrogen,LifeTechnologies,ThermoFisherScientificInc.)一起温育以标记活性位点半胱氨酸。在SDS-PAGE上运行样品以将蛋白酶鉴定为葡萄球菌蛋白酶B。有或无AlexaFluor488,在SDS-PAGE凝胶上与纯化的葡萄球菌蛋白酶B一起运行来自SEC纯化的活性级分。
还通过蛋白质组学质谱术分析自Qsepharose纯化富集的活性级分。在SDS-PAGE上运行10μg活性级分B11,B12,和C02和10μg活性级分1,2,3,和10μg无活性级分。切下条带,并进行过夜胰蛋白酶消化。通过LC-MS/MS分析经过消化的样品,并将串联质谱结果提交使用Mascot搜索算法的数据库搜索。葡萄球菌蛋白酶B是活性级分中存在的半胱氨酸蛋白酶的头等命中。自溶素(它也是一种半胱氨酸蛋白酶)也表现为头等命中,在无活性级分,阴性对照中存在的独特肽中具有最高丰度,因此将自溶素忽略在考虑之外。对来自QSepharose纯化的活性级分的质谱蛋白质组学分析显示高丰度的葡萄球菌蛋白酶B。针对金黄色葡萄球菌蛋白质过滤Trestle数据,并根据活性级分1中肽的数目分等级。
自Wood46金黄色葡萄球菌培养物上清液纯化活性蛋白酶。将细胞于37℃在3升TSB中培养过夜。通过以10,000xg离心10分钟来去除细胞。收集上清液并通过两个0.22μm滤器。接下来,将它浓缩并使用具有10kD膜的TFF缓冲液交换入50mM磷酸钠pH7。将样品浓缩10倍至300ml体积。将样品加载到QSepahroseFF(GEHealthcareBiosciencesAB)上,并使用50mM磷酸钠pH7中的0-300mMNaCl梯度通过层析将蛋白质分开。合并活性级分,并补充硫酸铵至2M的浓度。通过疏水相互作用层析在苯基Sepharose(GEHealthcareBiosciencesAB)上使用50mMTriSpH7.5中的2-0M硫酸铵梯度进一步纯化蛋白质。合并活性级分,并在50mM乙酸钠pH5.5中的MonoQ(GEHealthcareBiosciencesAB)上使用0-1MNaCl盐梯度进一步纯化。如上鉴定来自这个层析步骤的活性级分,合并,并应用至PBS中的大小排阻层析(Zenix-150,SepaxTechnologies)。
为了鉴定含有我们感兴趣的活性蛋白酶的级分,将来自每份级分的100μl转移至96孔板,将其与25μgTHIOFAB4497mal-GGAFAGGG-DNA31(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)一起温育。对来自每个层析步骤的级分分析活性,并不管蛋白质浓度使用100μl。将样品于37℃温育过夜,随后通过LC-MS进行分析以鉴定其中发生蛋白酶切割接头-抗生素的级分。自QSepharoseFF层析合并的活性级分经测量具有14mg/ml的总蛋白质浓度。将200μg合并物在PBS中稀释至2mg/ml,并在有或无终浓度0.1mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM,Sigma)的情况下温育。将样品于室温温育1小时。将25μgTHIOFAB4497mal-GGGAFAGGG-DNA31(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)添加至两种样品,并于37℃温育2小时。在2小时时,通过LC-MS分析样品以鉴定是否发生蛋白酶切割接头-抗生素。不管蛋白质浓度,将约50ul来自SEC的活性级分与0.1mMAlexaFluor488C5马来酰亚胺(Invitrogen)一起温育1小时进行标记。用纯化的蛋白酶实施切割测定法,即5uMthioFAB缀合物与50nM蛋白酶在终体积100ul中温育。在PBSpH7.2,4mML-Cys,2.5mMEDTA或100mM柠檬酸钠pH5,100mMNaCl,4mML-Cys,2.5mMEDTA任一中实施测定法。将样品于37℃温育2小时。在2小时时,通过用1％TFA1:1稀释来淬灭切割反应。随后在LC-MS上运行样品以测定百分比接头切割。通过对切割的和完整的种类的A280层析图积分来测定百分比切割。在接头的C端添加的发色团模块或抗生素添加显著的疏水性,使得具有完整的接头的thioFAB和具有切割的接头的thioFAB在基线解析。
对于富集级分的蛋白质组学分析,将10μg自Q(GEHealthcareLifeSciences)纯化富集的活性级分加载到4-12％Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)上。切下整个凝胶道,并自顶端至底端分成11条带。将凝胶条带用50％乙腈/50mM碳酸氢铵脱色,用二硫苏糖醇(50mM终浓度)于50℃还原30分钟,并用碘乙酰胺(50mM终浓度)于室温在黑暗中烷基化30分钟。然后将样品用50mM碳酸氢铵中的0.02μg/μl胰蛋白酶(Promega)于37℃消化过夜。将经过消化的样品注射到100μm内径毛细管柱(NanoAcquityUPLC柱,100μmx100mm,1.7μm,BEH130C18,WatersCorp)上,在NanoAcquityUPLC系统(WatersCorp)上通过毛细管反相层析分开。在含0.1％三氟乙酸的水中加载样品,并以1.00μl/min用2-90％缓冲液B的梯度(其中缓冲液A为0.1甲酸/2％乙腈/98％水,缓冲液B为0.1％甲酸/2％水/98％乙腈)洗脱,总分析时间45分钟。将肽直接洗脱入LTQ-OrbitrapXL(ThermoFisher)质谱仪,并使用ADVANCE源(Michrom-Bruker)离子化,喷射电压1.4kV。使用如下方法获取质谱数据,该方法包括Orbitrap中分辨率60,000M/ΔM,m/z400的一次完全MS扫描(375-1600m/z),接着是在贯穿线性离子阱中的LC梯度而重复的一个周期中在完全MS扫描中检测到的头8种最丰富的离子的碰撞诱导的离解(CID)。针对由金黄色葡萄球菌蛋白质和常见实验室污染物构成的串接靶物-诱饵数据库Uniprotver2010_12,将串联质谱结果提交使用搜算算法2.3.02版(MatrixSciences)的数据库搜索。以胰蛋白酶特异性,半胱氨酸氨基甲酰基甲基化(+57.0215Da)和甲硫氨酸氧化(+15.995Da)的可变修饰搜索数据,规定容许2次错误切割,20ppm前体离子质量,和0.5Da片段离子质量公差。使用线性判别算法(LDA)过滤肽谱匹配至假发现率(FDR)1％。
实施例26:thioFabFRET肽和AAC的葡萄球菌蛋白酶切割
将5μMthioFAB4497MP-LAFGA-QSY7(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”)和thioFAB4497MP-LAFAA-QSY7(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)(图30)与50nM蛋白酶一起在PBSpH7.2,4mML-Cys,2.5mMEDTA中于37℃温育2小时。在2小时时,通过用1％TFA1:1稀释来淬灭切割反应。随后在LC-MS上运行样品以测定百分比接头切割。所有测试的蛋白酶均切割这两种接头,尽管程度和位置不同(表4)。葡萄球菌蛋白酶A和葡萄球菌蛋白酶B在相同位点处切割接头:MP-LAFG↓A-QSY7(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”)和MP-LAFA↓A-QSY7(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)。葡萄球菌蛋白酶B在测试ID浓度对两种接头均实现100％切割。组织蛋白酶B在这些条件下也对两种接头均实现100％切割,尽管切割位点是混合的。组织蛋白酶B专门在MP-LAFG↓A-QSY7(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”)处切割mal-LAFGA-QSY7(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”),但它在MP-LAFA↓A-QSY7(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)和MP-LAFAA↓-QSY7(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)两者处切割mal-LAFAA-QSY7(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)。受到葡萄球菌蛋白酶A切割的MP-LAFAA-QSY7(以SEQIDNO:136公开的“核心肽”)为23％,而对mMP-LAFGA-QSY7(以SEQIDNO:135公开的“核心肽”)的切割为38％。
将5μMAAC-193与50nM蛋白酶一起在PBSpH7.2,4mML-Cys,2.5mMEDTA或100mM柠檬酸钠pH5,100mMNaCl,4mML-Cys,2.5mMEDTA任一中于37℃温育2小时。在2小时时,通过用1％TFA1:1稀释来淬灭切割反应。随后在LC-MS上运行样品以测定百分比接头切割。优化接头-抗生素受到所有测试的蛋白酶有效切割。在被葡萄球菌蛋白酶A和葡萄球菌蛋白酶B切割后,游离哌嗪并利福霉素释放。葡萄球菌蛋白酶B在pH5和7.2均实现100％切割。葡萄球菌蛋白酶A在pH5显示100％切割而在pH7.2显示64％切割。
实施例27:抗体-抗生素缀合物,thio-S4497LCv8-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)AAC-215在体外抑制金黄色葡萄球菌
在10μL含有100μg/mLthio-S4497LCv8-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)AAC-215或thio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PABC-(piperazBOR)AAC-126的HB缓冲液(补充有0.1％牛血清清蛋白的Hanks平衡盐溶液)中悬浮1x108个静止期Wood46细菌。后者使用缬氨酸-瓜氨酸(vc)组织蛋白酶B可切割接头来投递相同的抗生素。
1小时后,通过添加90μLHB或90μL组织蛋白酶B(含有10μg/mL组织蛋白酶B的20mM乙酸钠,1mMEDTA,5mML-半胱氨酸pH5)将样品稀释10倍,并于37℃另温育3小时。通过测定AAC与细菌一起温育是否能够抑制随后细菌生长来推断活性抗生素的释放。将细菌/AAC悬浮液直接点到胰胨豆胨琼脂板上,并在于37℃温育过夜后显现细菌生长。活性药物自与MC-LAFG-PAB-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)接头-抗生素中间体缀合的AAC释放。
在没有AAC的情况下温育的细菌生长良好,而且不受组织蛋白酶B处理影响。用含有组织蛋白酶B可切割接头缬氨酸-瓜氨酸(vc)的AAC-126处理的细菌在单独的HB缓冲液中温育后生长良好,但是在用AAC-126+组织蛋白酶B处理后未能生长,指示酶处理是释放活性抗生素所需要的。相反,与含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头LAFG(SEQIDNO:128)的AAC-215一起温育的细菌在与单独的HB缓冲液一起温育后未能生长,提示该细菌悬浮液含有足以自葡萄球菌蛋白酶可切割接头AAC释放活性抗生素的酶活性。
实施例28:抗体-抗生素缀合物,thio-S4497HCv1-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO：128公开的“核心肽”)AAC-193在巨噬细胞测定法中杀死细胞内MRSA
将金黄色葡萄球菌的USA300株与多种剂量(100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL或0.1μg/mL)的单独的S4497抗体，thio-S4497HCWT(v8)(SEQIDNO：137)，LCV205C-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)(以SEQIDNO：128公开的“核心肽”)AAC-192，或thio-S4497HCvl-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)AAC-193一起温育以允许AAC结合细菌(图31)。
S4497HCWT(V8)446aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFNSFWMHWVRQVPGKGLVWISFTNNEGTTTAY
ADSVRGRFIISRDNAKNTLYLEMNNLRGEDTAVYYCARGDGGLDDWGQGTLVTVSSASTK
GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：137)
温育1小时后，将经过调理的细菌补料至鼠巨噬细胞，并于37℃温育2小时以允许吞噬。吞噬完成后，用补充有50μg/mL庆大霉素的正常生长培养基替换感染混合物以杀死任何剩余细胞外细菌，并在2天后通过将巨噬细胞裂解物的连续稀释液在胰胨豆胨琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的总数(图31)。葡萄球菌蛋白酶可切割的AAC能够以与组织蛋白酶B可切割的AAC相比相似的效力杀死细胞内USA300。灰色虚线指示测定法的检测极限(10CFU/孔)。
实施例29：AAC经由抗体的抗原特异性结合将抗生素杀伤靶向金黄色葡萄球菌
选择金黄色葡萄球菌的Wood46株，因为它不表达蛋白A(一种结合IgG抗体Fc区的分子)。将金黄色葡萄球菌的Wood46株与10μg/mL或0.5μg/mLS4497抗体，含有组织蛋白酶B可切割接头的同种型对照-AAC，thio-曲妥珠单抗HCA118C-MC-vc-PAB-(二甲基-pipBOR)AAC-101，thio-S4497HCWT(v8)，LCV205C-MC-vc-PAB-(二甲基pipBOR)AAC-192，含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的同种型对照-AAC，thio-曲妥珠单抗HCA118C-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO：128公开的“核心肽”)或thio-S4497HCv1-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO：128公开的“核心肽”)AAC-193一起温育1小时以允许AAC结合细菌(图32)。为了限制AAC的非特异性结合，将经过调理的细菌离心，清洗一次，并在缓冲液中重悬浮,之后补料至鼠巨噬细胞。吞噬完成后,用补充有50μg/mL庆大霉素的正常生长培养基替换感染混合物以杀死任何剩余细胞外细菌,并在2天后通过将巨噬细胞裂解物的连续稀释液在胰胨豆胨琼脂板上涂板来测定存活细胞内细菌的总数(图32)。含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的AAC,AAC-193,能够杀死所有检测得到的细胞内细菌,而同种型对照AAC显示没有活性。巨噬细胞测定法证明葡萄球菌蛋白酶可切割AAC能够杀死细胞内细菌。抗体-抗生素缀合物thio-S4497LCv8-MP-LAFG-PABC-(哌嗪并BOR)(以SEQIDNO:128公开的“核心肽”)AAC-215在MRSA感染模型中在体内是有效的。
使用优化成在血清中产生恒定水平至少10mg/mL人IgG的剂量给药摄生法用人IgG重建CB17.SCID小鼠。用4497抗体(50mg/kg),具有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的AAC-215(50mg/kg),或含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的同种型对照,抗gDAAC(50mg/kg)处理小鼠。在感染后第1天通过静脉内注射对小鼠给予单剂AAC-215。在感染后第4天处死所有小鼠,并通过涂板来测定2个肾中(图33)或心中(图34)存活细菌的总数。在测试的8只小鼠中的6只中,用含有葡萄球菌蛋白酶可切割接头的AAC-215处理降低细菌载荷至低于检测极限,而同种型对照AAC显示有限的活性。虚线指示测定法的检测极限(333CFU/小鼠)。
实施例30:金黄色葡萄球菌的生长和蛋白酶活性概况分析
将金黄色葡萄球菌株Wood46(ATCC10832)在胰胨豆胨培养基(TSB)中于37℃摇动培养过夜。将培养物以10,000xg离心10分钟。收集上清液并通过两个0.22um滤器。
金黄色葡萄球菌蛋白酶活性概况分析:使用TFF(MilliporePelliconXLCassetteBiomax10kDa)将150ml培养物上清液浓缩并缓冲液交换入磷酸盐缓冲盐水(PBS)至终体积38ml,最终总蛋白质浓度为1mg/ml。使用快速内肽酶概况分析文库或REPLi(Mimotopes,Victoria,Australia)对Wood46上清液实施蛋白酶活性测定法。该文库由3375种内部淬灭的发荧光肽组成,96孔格式,排列成512个组。文库肽含有序列MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys(SEQIDNO:132),其中MCA对应于7-甲氧基香豆素-4-乙酸(荧光供体)而DPA对应于Nb-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基丙酸(荧光受体)。在5ul50％乙腈(Sigma)中溶解含有5nmolFRET肽的孔。将50μl(微升)浓缩的Wood46上清液和50ulPBS添加至每个孔。将板于37℃温育,并在0,30,60,140,和170分钟时进行荧光测量。在TecanSaphire2上获得荧光数据,激发波长320nm/发射波长400nm。以F终/F始计算终点荧光强度倍数变化。
通过使用ESI源用AgilentQ-TOF实施的LC-MS来测定底物切割位点。注射来自每个孔的10ul,并使用Agilent1260HPLC系统在WatersXbridgeOSTC182.5um柱(4.6x50mm)上通过反相层析分开。以500μl/min用2-90％缓冲液B的梯度(其中缓冲液A为0.05％三氟乙酸/99.95％水,缓冲液B为0.04％三氟乙酸/99.96％乙腈)洗脱样品,总分析时间20分钟。将肽直接洗脱入Q-TOF质谱仪。基于比较观察分子量与每个可能位点处的切割所对应的计算质量来指派切割产物。
实施例31:马来酰亚胺基FRET肽接头的合成
使用PS3肽合成仪(ProteinTechnologies,Inc.)通过标准Fmoc固相化学来合成图26的马来酰亚胺基FRET肽,(MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)。使用0.1mmolFmoc-Lys(Boc)-Rink酰胺树脂(Novabiochem)来生成C端甲酰胺。在第一个N端残基处添加Fmoc-Lys(Mtt)-OH(Novabiochem)以在去除Mtt基团后容许别的侧链化学。在通过含3％三异丙基硅烷(TIS)的二氯甲烷中的1％TFA的连续三次30分钟清洗去除Mtt基团后将荧光受体5(6)-羧基四甲基罗丹明或TAMRA(Novabiochem)附着至树脂上的这个侧链胺。容许反应行进20小时。在这个步骤之后,通过DMF中的20％哌啶去除末端Fmoc基团,并通过HBTU与马来酰亚胺基-丙酸(BachemAG)偶联。通过在95:2.5:2.5三氟乙酸(TFA)/TIS/水(v/v/v)中于室温温和摇动2小时,自树脂切除TAMRA标记的中间体肽。过滤切割溶液,并在氮流下蒸发以去除TFA。将在水和乙腈的混合物中溶解的粗制中间体提交进一步纯化,用来自Phenomenex的Jupiter5μC4柱(5μm,10mmx250mm)进行的反相HPLC。冻干后,然后使纯化的中间体与10个当量的NHS-荧光素(ThermoScientific)在50/50磷酸盐缓冲盐水(PBS)/二甲基甲酰胺(DMF)(v/v)中反应20小时以在C端赖氨酸处标记游离胺。然后如上所述纯化并冻干FRET肽。通过LC-MS分析并确认所有反应混合物和终产物。
接头的固相合成:在PS3肽合成仪(ProteinTechnologies,Inc.)上使用标准Fmoc固相化学来合成描述的所有接头。对所有接头使用0.1mMFmoc-氨基酸-Wang树脂(Novabiochem)以生成C端羧基。如上所述纯化接头。通过使纯化的接头与1.1倍摩尔过量的QSY7胺,1.1倍摩尔过量的HATU,和2.2倍摩尔过量的DIEA在DMF中于室温反应过夜来实现QSY7胺(Invitrogen)附着。然后如上所述纯化接头-QSY7种类。通过LC-MS分析并确认所有反应混合物和终产物。
实施例32:基于细胞的FRET切割测定法
在TSB中以过夜培养物的1:200稀释度接种Wood46和USA300的培养物(0.1ml用于20ml)并于37℃摇动温育。培养菌株至指数生长期,并以108个细胞/ml和107个细胞/ml的细胞密度在胰胨豆胨培养基(TSB)中涂板。以FRET肽终浓度2μM将thioMABFRET肽缀合物添加至孔。将板于37℃温育,并随时间监测荧光210分钟,激发波长495nm/发射波长518nm。
浓缩的活性上清液对thioFABFRET肽和thioFABmal-GGAFAGGG-DNA31(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)的切割:将与MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(荧光素)(以SEQIDNO:125公开的“核心肽”)或MP-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-(pipBOR)LA-59(以SEQIDNO:126公开的“核心肽”)缀合的thioFABS4497与已经如上所述加工的浓缩的Wood46上清液一起温育。将thioFABS4497和上清液在PBS中以毫克级别(25μgthioFABS4497与25μg蛋白质上清液)1:1混合。将样品于37℃温育2小时。在2小时时,通过用0.1％TFA1:1稀释来淬灭反应。通过LC-MS分析样品以测定切割和切割产物的量。
虽然出于清楚理解的目的,前述发明已经通过例示和例子较为详细地进行了描述,但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过述及明确地完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

Claims (107)

1.一种分离的抗WTA(壁磷壁酸)单克隆抗体,其包含轻(L)链和重(H)链,
其中:
(a)所述L链包含:
包含序列KSSQSVLSRANNNYYVA(SEQIDNO:1)的CDRL1,
包含序列WASTREF(SEQIDNO:2)的CDRL2,和
包含序列QQYYTSRRT(SEQIDNO:3)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYYMH(SEQIDNO:4)的CDRH1,
包含序列WINPKSGGTNYAQRFQG(SEQIDNO:5)的CDRH2,和
包含序列DCGSGGLRDF(SEQIDNO:6)的CDRH3；
(b)所述L链包含:
包含序列RSNQNLLSSSNNNYLA(SEQIDNO:7)的CDRL1,
包含序列WASTRES(SEQIDNO:8)的CDRL2,和
包含序列QQYYANPRT(SEQIDNO:9)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYYIH(SEQIDNO:10)的CDRH1,
包含序列WINPNTGGTYYAQKFRD(SEQIDNO:11)的CDRH2,和
包含序列DCGRGGLRDI(SEQIDNO:12)的CDRH3；
(c)所述L链包含:
包含序列KSNQNVLASSNDKNYLA(SEQIDNO:13)的CDRL1,
包含序列WASIRES(SEQIDNO:14)的CDRL2,和
包含序列QQYYTNPRT(SEQIDNO:15)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYYIH(SEQIDNO:16)的CDRH1,
包含序列WINPNTGGTNYAQKFQG(SEQIDNO:17)的CDRH2,和
包含序列DCGNAGLRDI(SEQIDNO:18)的CDRH3；或
(d)所述L链包含:
包含序列KSSQNVLYSSNNKNYLA(SEQIDNO:19)的CDRL1,
包含序列WASTRES(SEQIDNO:20)的CDRL2,和
包含序列QQYYTSPPYT(SEQIDNO:21)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYWIG(SEQIDNO:22)的CDRH1,
包含序列IIHPGDSKTRYSPSFQG(SEQIDNO:23)的CDRH2,和
包含序列LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV(SEQIDNO:24)的CDRH3。
2.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在选自SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,和SEQIDNO:32的VH序列的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求2的抗体,其进一步包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在选自SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:31的VL序列的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
4.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在选自SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,和SEQIDNO:31的VL序列的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求3的抗体,其中所述抗体包含:
(i)包含序列SEQIDNO:25的VL和包含序列SEQIDNO:26的VH；
(ii)包含序列SEQIDNO:27的VL和包含序列SEQIDNO:28的VH；
(iii)包含序列SEQIDNO:29的VL和包含序列SEQIDNO:30的VH；
或
(iv)包含序列SEQIDNO:31的VL和包含序列SEQIDNO:32的VH。
6.权利要求1-5任一项的抗体,其中所述抗体是缺少Fc区的抗原结合片段。
7.权利要求6的抗体,其中所述抗体为F(ab)或F(ab’)2。
8.权利要求1-7任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区,其中所述重链恒定区和/或所述轻链恒定区包含一或多个用半胱氨酸残基替代的氨基酸。
9.权利要求8的抗体,其中所述重链恒定区包含氨基酸替代A118C,和/或所述轻链恒定区包含氨基酸替代V205C,其中编号依照EU编号方式。
10.权利要求1-5任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含:包含氨基酸序列SEQIDNO:149的重链恒定区和/或包含氨基酸序列SEQIDNO:151的轻链恒定区。
11.权利要求1-5任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含:包含氨基酸序列SEQIDNO:149的重链恒定区和包含氨基酸序列SEQIDNO:150的轻链恒定区。
12.权利要求1-5任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含:包含氨基酸序列SEQIDNO:148的重链恒定区和包含氨基酸序列SEQIDNO:151的轻链恒定区。
13.权利要求1-12任一项的抗体,其中所述抗体结合WTAα。
14.一种分离的抗WTA(壁磷壁酸)单克隆抗体,其包含轻(L)链和重(H)链,
其中:
(a)所述L链包含:
包含序列RASQTISGWLA(SEQIDNO:33)的CDRL1,
包含序列KASTLES(SEQIDNO:34)的CDRL2,和
包含序列QQYKSYSFN(SEQIDNO:35)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYDIN(SEQIDNO:36)的CDRH1,
包含序列WMNANSGNTGYAQKFQG(SEQIDNO:37)的CDRH2,和
包含序列SSILVRGALGRYFDL(SEQIDNO:38)的CDRH3；
(b)所述L链包含:
包含序列RASQTISGWLA(SEQIDNO:39)的CDRL1,
包含序列KASTLES(SEQIDNO:40)的CDRL2,和
包含序列QQYKSYSFN(SEQIDNO:41)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYDIN(SEQIDNO:42)的CDRH1,
包含序列WMNANSGNTGYAQKFQG(SEQIDNO:43)的CDRH2,和
包含序列SSILVRGALGRYFDL(SEQIDNO:44)的CDRH3；
(c)所述L链包含:
包含序列RASQFVSRTSLA(SEQIDNO:45)的CDRL1,
包含序列ETSSRAT(SEQIDNO:46)的CDRL2,和
包含序列HKYGSGPRT(SEQIDNO:47)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列NYDFI(SEQIDNO:48)的CDRH1,
包含序列WMNPNSYNTGYGQKFQG(SEQIDNO:49)的CDRH2,和
包含序列AVRGQLLSEY(SEQIDNO:50)的CDRH3；
(d)所述L链包含:
包含序列RASQSVSSSYLA(SEQIDNO:51)的CDRL1,
包含序列DASSRAT(SEQIDNO:52)的CDRL2,和
包含序列QKYGSTPRP(SEQIDNO:53)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYDIN(SEQIDNO:54)的CDRH1,
包含序列WMNPNSGNTNYAQRFQG(SEQIDNO:55)的CDRH2,和
包含序列ERWSKDTGHYYYYGMDV(SEQIDNO:56)的CDRH3；
(e)所述L链包含:
包含序列RASLDITNHLA(SEQIDNO:57)的CDRL1,
包含序列EASILQS(SEQIDNO:58)的CDRL2,和
包含序列EKCNSTPRT(SEQIDNO:59)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列NYDIN(SEQIDNO:60)的CDRH1,
包含序列WMNPSSGRTGYAPKFRG(SEQIDNO:61)的CDRH2,和
包含序列GGGYYDSSGNYHISGLDV(SEQIDNO:62)的CDRH3；
(f)所述L链包含:
包含序列RASQSVGAIYLA(SEQIDNO:63)的CDRL1,
包含序列GVSNRAT(SEQIDNO:64)的CDRL2,和
包含序列QLYTSSRALT(SEQIDNO:65)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列AYAMN(SEQIDNO:66)的CDRH1,
包含序列SITKNSDSLYYADSVKG(SEQIDNO:67)的CDRH2,和
包含序列LAARIMATDY(SEQIDNO:68)的CDRH3；
(g)所述L链包含:
包含序列RASQGIRNGLG(SEQIDNO:69)的CDRL1,
包含序列PASTLES(SEQIDNO:70)的CDRL2,和
包含序列LQDHNYPPT(SEQIDNO:71)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列YYSMI(SEQIDNO:72)的CDRH1,
包含序列SIDSSSRYLYYADSVKG(SEQIDNO:73)的CDRH2,和
包含序列DGDDILSVYRGSGRPFDY(SEQIDNO:74)的CDRH3；
(h)所述L链包含:
包含序列RASQGIRNGLG(SEQIDNO:75)的CDRL1,
包含序列PASTLES(SEQIDNO:76)的CDRL2,和
包含序列LQDHNYPPS(SEQIDNO:77)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列YYSMI(SEQIDNO:78)的CDRH1,
包含序列SIDSSSRYRYYTDSVKG(SEQIDNO:79)的CDRH2,和
包含序列DGDDILSVYQGSGRPFDY(SEQIDNO:80)的CDRH3；
(i)所述L链包含:
包含序列RASQSVRTNVA(SEQIDNO:81)的CDRL1,
包含序列GASTRAS(SEQIDNO:82)的CDRL2,和
包含序列LQYNTWPRT(SEQIDNO:83)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列TNDMS(SEQIDNO:84)的CDRH1,
包含序列TIIGIDDTTHYADSVRG(SEQIDNO:85)的CDRH2,和
包含序列NSGIYSF(SEQIDNO:86)的CDRH3；
(j)所述L链包含:
包含序列RASQDIGSSLA(SEQIDNO:87)的CDRL1,
包含序列ATSTLQS(SEQIDNO:88)的CDRL2,和
包含序列QQLNNYVHS(SEQIDNO:89)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列DYAMG(SEQIDNO:90)的CDRH1,
包含序列VVTGHSYRTHYADSVKG(SEQIDNO:91)的CDRH2,和
包含序列RIWSYGDDSFDV(SEQIDNO:92)的CDRH3；
(k)所述L链包含:
包含序列RASQSIGDRLA(SEQIDNO:93)的CDRL1,
包含序列WASNLEG(SEQIDNO:94)的CDRL2,和
包含序列QQYKSQWS(SEQIDNO:95)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SYAMN(SEQIDNO:96)的CDRH1,
包含序列YISSIETIYYADSVKG(SEQIDNO:97)的CDRH2,和
包含序列DRLVDVPLSSPNS(SEQIDNO:98)的CDRH3；
(l)所述L链包含:
包含序列KSSQSIFRTSRNKNLLN(SEQIDNO:99)的CDRL1,
包含序列WASTRKS(SEQIDNO:100)的CDRL2,和
包含序列QQYFSPPYT(SEQIDNO:101)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SFWMH(SEQIDNO:102)的CDRH1,
包含序列FTNNEGTTTAYADSVRG(SEQIDNO:103)的CDRH2,和
包含序列GDGGLDD(SEQIDNO:104)的CDRH3；
(m)所述L链包含:
包含序列RASQFTNHYLN(SEQIDNO:105)的CDRL1,
包含序列VASNLQS(SEQIDNO:106)的CDRL2,和
包含序列QQSYRTPYT(SEQIDNO:107)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SGYYN(SEQIDNO:108)的CDRH1,
包含序列YILSGAHTDIKASLGS(SEQIDNO:109)的CDRH2,和
包含序列SGVYSKYSLDV(SEQIDNO:110)的CDRH3；或
(n)所述L链包含:
包含序列KSSQSIFRTSRNKNLLN(SEQIDNO:99)的CDRL1,
包含序列WASTRKS(SEQIDNO:100)的CDRL2,和
包含序列QQYFSPPYT(SEQIDNO:101)的CDRL3；
且所述H链包含:
包含序列SFWMH(SEQIDNO:102)的CDRH1,
包含序列FTNNEGTTTAYADSVRG(SEQIDNO:103)的CDRH2,和
包含序列GEGGLDD(SEQIDNO:118)的CDRH3。
15.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在VH序列SEQIDNO:112的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,其中SEQIDNO:112中第1位处的Xaa为Q或E,且SEQIDNO:112中第2位处的Xaa为M,I或V。
16.权利要求11的抗体,其进一步包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:111的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
17.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:111的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
18.权利要求15的抗体,其中所述VH包含序列SEQIDNO:112且所述VL包含序列SEQIDNO:111,其中SEQIDNO:112中第1位处的Xaa为Q或E,且SEQIDNO:112中第2位处的Xaa为M,I或V。
19.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在VH序列SEQIDNO:120或SEQIDNO:156的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
20.权利要求17的抗体,其进一步包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:119的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
21.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在VL序列SEQIDNO:119的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
22.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),其中所述VL包含序列SEQIDNO:119且所述VH包含序列SEQIDNO:120或SEQIDNO:156。
23.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL),其中所述VL包含在选自VL序列SEQIDNO:158,SEQIDNO:159,SEQIDNO:160,SEQIDNO:161,SEQIDNO:162,SEQIDNO:163,SEQIDNO:164,SEQIDNO:165,SEQIDNO:166,SEQIDNO:167,和SEQIDNO:168的VL序列的长度上具有至少95％序列同一性的序列。
24.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含重链可变区(VH),其中所述VH包含在选自VH序列SEQIDNO:127,SEQIDNO:133,SEQIDNO:134,SEQIDNO:169,SEQIDNO:170,SEQIDNO:171,SEQIDNO:172,SEQIDNO:173,SEQIDNO:174,SEQIDNO:175,和SEQIDNO:176的VH序列的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
25.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),其中:
(a)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:158的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:169的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(b)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:159的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:170的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(c)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:160的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:171的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(d)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:161的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:172的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(e)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:162的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:173的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(f)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:163的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:174的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(g)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:164的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:175的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(h)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:165的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:176的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(i)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:166的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:133的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
(j)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:167的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:134的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或
(k)所述抗体的VL包含在VL序列SEQIDNO:168的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列,且所述抗体的VH包含在VH序列SEQIDNO:127的长度上具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
26.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),其中:
(a)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:158,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:169；
(b)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:159,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:170；
(c)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:160,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:171；
(d)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:161,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:172；
(e)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:162,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:173；
(f)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:163,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:174；
(g)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:164,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:175；
(h)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:165,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:176；
(i)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:166,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:133；
(j)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:167,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:134；
(k)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:168,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:127；
(l)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:113,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:114；或
(m)所述抗体的VL包含VL序列SEQIDNO:121,且所述抗体的VH包含VH序列SEQIDNO:138。
27.权利要求14-26任一项的抗体,其中所述抗体是缺少Fc区的抗原结合片段。
28.权利要求27的抗体,其中所述抗体为F(ab)或F(ab’)2。
29.权利要求14-28任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区,其中所述重链恒定区和/或所述轻链恒定区包含一或多个用半胱氨酸残基替代的氨基酸。
30.权利要求29的抗体,其中所述重链恒定区包含氨基酸替代A118C,和/或所述轻链恒定区包含氨基酸替代V205C,其中编号依照EU编号方式。
31.权利要求14-26任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含:包含氨基酸序列SEQIDNO:149的重链恒定区和/或包含氨基酸序列SEQIDNO:151的轻链恒定区。
32.权利要求14-26任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含:包含氨基酸序列SEQIDNO:149的重链恒定区和包含氨基酸序列SEQIDNO:150的轻链恒定区。
33.权利要求14-26任一项的抗体,其中所述抗体进一步包含:包含氨基酸序列SEQIDNO:148的重链恒定区和包含氨基酸序列SEQIDNO:151的轻链恒定区。
34.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含序列SEQIDNO:114,SEQIDNO:116,或SEQIDNO:117,且所述抗体的轻链包含序列SEQIDNO:113；其中SEQIDNO:116或SEQIDNO:117第2位处的氨基酸Xaa为M,I,或V。
35.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含序列SEQIDNO:114,SEQIDNO:116,或SEQIDNO:117,且所述抗体的轻链包含序列SEQIDNO:115；其中SEQIDNO:116或SEQIDNO:117第2位处的氨基酸Xaa为M,I,或V。
36.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含选自SEQIDNO:139,SEQIDNO:140,SEQIDNO:141,SEQIDNO:142,SEQIDNO:143,和SEQIDNO:144的序列；且所述抗体的轻链包含SEQIDNO:113的序列。
37.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含轻链和重链,其中所述抗体的重链包含选自SEQIDNO:139,SEQIDNO:140,SEQIDNO:141,SEQIDNO:142,SEQIDNO:143,和SEQIDNO:144的序列；且所述抗体的轻链包含SEQIDNO:115的序列。
38.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含重链和轻链,其中所述重链包含序列SEQIDNO:146,SEQIDNO:147,SEQIDNO:157或SEQIDNO:124,且所述轻链包含序列SEQIDNO:121或SEQIDNO:123。
39.一种分离的抗WTA单克隆抗体,其包含重链和轻链,其中所述重链包含序列SEQIDNO:146,SEQIDNO:147,SEQIDNO:157或SEQIDNO:124,且所述轻链包含序列SEQIDNO:145。
40.权利要求14-39任一项的抗体,其中所述抗体结合WTAβ。
41.一种抗体,其与权利要求1-40任一项的抗体结合相同表位。
42.权利要求1-41任一项的抗体,其中所述抗体是在细胞培养中的宿主细胞中生成的。
43.权利要求42的抗体,其中所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
44.一种组合物,其包含权利要求1-43任一项的抗体和药学可接受载剂。
45.一种分离的核酸,其编码权利要求1-41任一项的抗体。
46.一种载体,其包含权利要求45的核酸。
47.一种分离的宿主细胞,其包含编码权利要求1-41任一项的抗体的核酸。
48.一种生成抗体的方法,其包括在适合于所述核酸表达的条件下培养权利要求47的宿主细胞；并回收由所述细胞生成的抗体。
49.一种抗体-抗生素缀合物化合物,其包含权利要求1至43任一项的抗壁磷壁酸(WTA)抗体,所述抗体通过肽接头共价附着至利福霉素(rifamycin)型抗生素。
50.权利要求49的抗体-抗生素缀合物化合物,其中所述抗体包含:i)L链和H链CDRSEQIDNO:99-104或L链和H链CDRSEQIDNO:33-38；或ii)配对的VLSEQIDNO:119或SEQIDNO:123与VHSEQIDNO:120或SEQIDNO:156；或iii)配对的VLSEQIDNO:111与VHSEQIDNO:112。
51.权利要求49或50的抗体-抗生素缀合物化合物,其中所述抗壁磷壁酸(WTA)抗体结合金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。
52.权利要求51的抗体-抗生素缀合物化合物,其中所述抗壁磷壁酸(WTA)抗体结合甲氧西林(methicillin)抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
53.权利要求49-52任一项的抗体-抗生素缀合物,其中所述利福霉素型抗生素为利福拉齐(rifalazil)型抗生素。
54.权利要求49-53任一项的抗体-抗生素缀合物,其中所述利福霉素型抗生素包含附着至肽接头的季胺。
55.权利要求49-54任一项的抗体-抗生素缀合物,其中所述肽接头附着至所述抗壁磷壁酸(WTA)抗体的半胱氨酸或改造的半胱氨酸。
56.权利要求49-55任一项的抗体-抗生素缀合物,其中所述肽接头为金黄色葡萄球菌内肽酶或半胱氨酸蛋白酶可切割接头。
57.权利要求56的抗体-抗生素缀合物,其中所述肽接头为葡萄球菌蛋白酶(staphopain)B或葡萄球菌蛋白酶A可切割接头。
58.权利要求56的抗体-抗生素缀合物,其中所述肽接头为人蛋白酶组织蛋白酶B可切割接头。
59.权利要求58的抗体-抗生素缀合物,其中所述肽接头为val-cit二肽接头。
60.权利要求49的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
Ab-(L-abx)p
其中:
Ab为抗壁磷壁酸抗体；
L为肽接头,具有式:-Str-Pep-Y-,其中Str为延伸物单元,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元；
abx为利福霉素型抗生素；且
p为1至8的整数。
61.权利要求60的抗体-抗生素缀合物,其中p为2至4。
62.权利要求49的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式I:
其中:
虚线表示任选的键；
R为H,C1-C12烷基,或C(O)CH3；
R1为OH；
R2为CH＝N-(杂环基),其中所述杂环基是任选用一或多个独立选自C(O)CH3,C1-C12烷基,C1-C12杂芳基,C2-C20杂环基,C6-C20芳基,和C3-C12碳环基的基团取代的；
或R1和R2形成五或六元稠合杂芳基或杂环基,且任选形成螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环,其中所述螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环是任选用H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,或OH取代的；
L为肽接头,附着至R2或由R1和R2形成的稠合杂芳基或杂环基；且Ab为抗壁磷壁酸(WTA)抗体。
63.权利要求62的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
其中
R3独立选自H和C1-C12烷基；
n为1或2；
R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且
Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S。
64.权利要求62的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
其中
R5选自H和C1-C12烷基；且
n为0或1。
65.权利要求62的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
其中
R5选自H和C1-C12烷基；且
n为0或1。
66.权利要求62的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
其中
R5独立选自H和C1-C12烷基；且
n为0或1。
67.权利要求62的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
其中
R3独立选自H和C1-C12烷基；且
n为1或2。
68.权利要求62的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
69.权利要求49的抗体-抗生素缀合物化合物,其中所述肽接头具有式:
-Str-Pep-Y-
其中Str为延伸物单元,共价附着至抗壁磷壁酸(WTA)抗体,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元,共价附着至利福霉素型抗生素。
70.权利要求69的抗体-抗生素缀合物,其中Str具有式:
其中R6选自下组:C1-C10亚烷基-,-C3-C8碳环,-O-(C1-C8烷基)-,-亚芳基-,-C1-C10亚烷基-亚芳基-,-亚芳基-C1-C10亚烷基-,-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-,-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-,-C3-C8杂环-,-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-,-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-,-(CH2CH2O)r-,和-(CH2CH2O)r-CH2-；且r为范围为1至10的整数。
71.权利要求70的抗体-抗生素缀合物,其中R6为-(CH2)5-。
72.权利要求69的抗体-抗生素缀合物,其中Pep包含2-12个独立选自甘氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,赖氨酸,精氨酸,缬氨酸,和瓜氨酸的氨基酸残基。
73.权利要求72的抗体-抗生素缀合物,其中Pep选自缬氨酸-瓜氨酸(val-cit,vc)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk)；GGAFAGGG(SEQIDNO:126)；tpm-cit；GPImeLFF(SEQIDNO:129)；缬氨酸-瓜氨酸-苯丙氨酸(val-cit-phe)；GGAFA(SEQIDNO:131)；和LAFG(SEQIDNO:128)。
74.权利要求69的抗体-抗生素缀合物,其中Y包含对氨基苄基或对氨基苄氧羰基。
75.权利要求49的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
其中AA1和AA2独立选自氨基酸侧链。
76.权利要求75的抗体-抗生素缀合物,其中所述氨基酸侧链独立选自H,-CH3,-CH2(C6H5),-CH2CH2CH2CH2NH2,-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,-CHCH(CH3)CH3,和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2。
77.权利要求75的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
78.权利要求75的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
79.权利要求78的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
80.权利要求75的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
81.权利要求80的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
82.权利要求75的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
83.权利要求82的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
84.权利要求75的抗体-抗生素缀合物,其具有式:
其中R7独立选自H和C1-C12烷基。
85.权利要求75的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
86.权利要求85的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
87.权利要求75的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
88.权利要求87的抗体-抗生素缀合物化合物,其具有式:
89.一种药物组合物,其包含权利要求49-88任一项的抗体-抗生素缀合物化合物,和药学可接受载剂,助流剂,稀释剂,或赋形剂。
90.一种用于生成权利要求49-88任一项的抗体-抗生素缀合物化合物的方法,其包括将利福霉素型抗生素缀合至抗壁磷壁酸(WTA)抗体。
91.一种抗生素-接头中间体,其具有式II:
其中:
虚线表示任选的键；
R为H,C1-C12烷基,或C(O)CH3；
R1为OH；
R2为CH＝N-(杂环基),其中所述杂环基是任选用一或多个独立选自C(O)CH3,C1-C12烷基,C1-C12杂芳基,C2-C20杂环基,C6-C20芳基,和C3-C12碳环基的基团取代的；
或R1和R2形成五或六元稠合杂芳基或杂环基,且任选形成螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环,其中所述螺或稠合六元杂芳基,杂环基,芳基,或碳环基环是任选用H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,或OH取代的；
L为肽接头,附着至R2或由R1和R2形成的稠合杂芳基或杂环基；且具有式:-Str-Pep-Y-,其中Str为延伸物单元,Pep为2-12个氨基酸残基的肽,且Y为间隔物单元；且
X为选自马来酰亚胺,硫醇,氨基,溴化物,溴乙酰胺基,碘乙酰胺基,对甲苯磺酸酯,碘化物,羟基,羧基,吡啶基二硫化物,和N-羟基琥珀酰亚胺的反应性官能团。
92.权利要求91的抗生素-接头中间体,其中X为
93.权利要求91的抗生素-接头中间体,其具有式:
其中
R3独立选自H和C1-C12烷基；
n为1或2；
R4选自H,F,Cl,Br,I,C1-C12烷基,和OH；且
Z选自NH,N(C1-C12烷基),O和S。
94.权利要求93的抗生素-接头中间体,其具有式:
95.权利要求93的抗生素-接头中间体,其具有式:
96.一种治疗细菌感染的方法,其包括对患者施用治疗有效量的抗体-抗生素缀合物化合物来进行,所述抗体-抗生素缀合物化合物包含通过肽接头共价附着至利福霉素型抗生素的抗壁磷壁酸(WTA)抗体。
97.一种治疗细菌感染的方法,其包括对患者施用治疗有效量的权利要求49-88任一项的抗体-抗生素缀合物。
98.权利要求96或97的方法,其中所述患者已经诊断有金黄色葡萄球菌感染。
99.权利要求98的方法,其中所述患者中的细菌载荷通过所述治疗而降低。
100.一种杀死金黄色葡萄球菌感染患者的宿主细胞中的细胞内金黄色葡萄球菌但不杀死所述宿主细胞的方法,其包括施用权利要求49-88任一项的抗WTA-抗生素缀合物。
101.权利要求100的方法,其中存留(persister)细菌细胞被杀死。
102.权利要求96-100任一项的的方法,其中所述患者为人。
103.权利要求96-102任一项的的方法,其进一步包括施用第二治疗剂。
104.权利要求103的方法,其中所述第二治疗剂为抗生素。
105.权利要求104的方法,其中所述抗生素选自下述结构类别:(i)氨基糖苷；(ii)β-内酰胺；(iii)大环内酯/环肽；(iv)四环素；(v)氟喹啉(fluoroquinolines)/氟喹诺酮(fluoroquinolones)；和(vi)唑烷酮(oxazolidinones)。
106.权利要求104的方法,其中所述抗生素选自下组:克林霉素(clindamycin),新生霉素(novobiocin),瑞他莫林(retapamulin),达托霉素(daptomycin),GSK-2140944,CG-400549,西他沙星(sitafloxacin),替考拉宁(teicoplanin),三氯生(triclosan),萘啶酮(napthyridone),雷得唑来(radezolid),多柔比星(doxorubicin),氨苄西林(ampicillin),万古霉素(vancomycin),亚胺培南(imipenem),多利培南(doripenem),吉西他滨(gemcitabine),达巴万星(dalbavancin),和阿奇霉素(azithromycin)。
107.一种用于治疗细菌感染的试剂盒,其包含:
a)权利要求89的药物组合物；和
b)使用说明书。
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