TWI834674B - 藉由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（mam）之實驗室之間和/或儀器之間差異性之系統及方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用於經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）分析之實驗室之間和/或儀器之間差異性之系統及方法。在各個方面，多個基於MAM的儀器各自具有檢測器和由不同儀器模型或不同組設置限定的不同儀器條件。每個基於MAM的儀器接收對應樣品和作為校準物的參考標準品。每個基於MAM的儀器經由其檢測器檢測其對應樣品的樣品同種型和該參考標準品的參考標準品同種型。該基於MAM的儀器與（多個）處理器相關聯，該（多個）處理器經由對應MAM迭代來確定與該等樣品同種型相對應的校正因數和樣品豐度值。該等校正因數基於該參考標準品，並且該等樣品豐度值基於該等校正因數。可以根據該等基於MAM的儀器中的每一個的校正因數來減小該等樣品豐度值的方差值。

Description

藉由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）之實驗室之間和/或儀器之間差異性之系統及方法
本揭露內容總體上涉及經由執行時間強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間和儀器之間差異性。
生物治療開發通常包括監測（多個）治療分子的某些屬性，其中，這種屬性被標識為用於測量產品安全性和功效目的的關鍵品質屬性（CQA）。質譜分析法（MS）可以用於測量質量屬性的測定中。通常，MS係指電離化學物種並且基於離子的質荷比來對離子進行分類的分析型技術。以這種方式，MS設備可以測量樣品內分子的質量。在多肽屬性的情況下，使用質譜分析法實現了使用更少的分析來評估更多的質量屬性。
MS可以用於藉由實施多分析物/屬性或所謂的多屬性方法（MAM）使用紫外（UV）數據和質量數據兩者來監測翻譯後修飾（PTM）（包括糖基化譜）和/或賦形劑。MAM使用MS數據以及屬性的自動識別和相對量化的組合（Rogers, RS等人, 2015, Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics[用於生物製劑的表徵、質量控制測試和處置的量化質譜分析多屬性方法的開發],mAbs 7:5, 881-890）。由於效率和品質控制的益處，MAM被越來越多地與MS一起使用，例如為品質屬性分析提供增加的選擇性、靈敏度和靈活性。MAM係指可以在單個分析中量化多個產品屬性和過程屬性（例如，品質屬性/CQA）的分析方法。例如，通常將基於MAM的測定靶向監測下游過程，但是該等測定也被越來越多地用於對批（例如，樣品）釋放進行品質控制測定。
例如，基於蛋白水解消化然後係蛋白水解肽（肽係藉由蛋白水解產生的較大多肽的片段）的液相層析法（LC）分析/MS分析的MAM程序可以用於量化治療性蛋白的各種品質屬性。該程序利用由質譜檢測器提供的分辨力並且可以使用蛋白水解肽的每種同種型（包括經修飾形式和未經修飾形式）的MS強度進行定量。
將質譜分析法與MAM結合可能會帶來挑戰，因為MS程序通常需要訓練有素的分析者和重要的實驗室基礎設施。具體地，基於質譜分析法的MAM分析的主要挑戰係在實驗室中使用的製備樣品和那些實驗室中的不同儀器的觀察到的高度差異性。例如，樣品製備的差異性可能源自以不同方式製備樣品的不同實驗室分析者，這就導致了所製備樣品之間的差異。例如，在接收到樣品之後，實驗室分析者通常執行複雜的程序（例如，蛋白水解消化）以製備用於注射的樣品。由於程序的複雜性，即使原始樣品係一致的，所製備樣品也可能是相當可變的。由於樣品製備程序的長持續時間，因此其可以引入改變各種屬性的豐度的修飾。該等人工修飾導致MAM結果的不準確性和變化。實驗室分析者在樣品製備過程中的不同的消化效率也會促成實驗室之間的差異性。差異性也可能源自使用不同設置或執行不同操作模型的實驗室儀器。目前，為了確保可再現的屬性測量，不僅所有分析實驗室都必須使用類似的儀器模型，而且還必須將儀器調整至相同的條件。然而，將實驗室限制為特定模型也可能會遏制實驗室升級其設備以利用最新進展。
基於MS-MAM的分析的挑戰還源自在常規MAM程序中使用的假設和方法。例如，在常規MS-MAM程序中，基於具有以下假設的經修飾的肽和未經修飾的肽的MS響應（例如，峰面積）來確定每種屬性的豐度（例如，肽中胺基酸殘基的不同修飾狀態）：(1)未經修飾的肽和經修飾的肽在實驗室之間具有可再現的回收；(2)未經修飾的肽和經修飾的肽具有相同的MS響應因數；以及(3)人工誘導的屬性變化可以忽略不計。
由於該等假設，常規MAM程序取決於多個所需條件，包括(1)消化效率在實驗室之間係可再現的；(2)MS儀器條件係完全相同的；以及(3)由不同實驗室執行的樣品製備引入最少量或恒定量的人工修飾。然而，實際上，由於樣品製備程序、分析者習慣、儀器、試劑品質等的變化，很難滿足該等所需條件。肽回收也可能波動，這導致附加的差異性。
滿足所需條件的附件挑戰包括MS儀器模型或儀器設置方面的差異。例如，維護一個實驗室儀器的方式可能不同於維護第二實驗室儀器的方式。另外，跨不同實驗室的含有不同變體的肽的響應因數可能不同。滿足所需條件的進一步挑戰包括樣品製備程序、分析者習慣、設備品質和試劑品質以及儀器條件的變化。另外，人工引入的修飾量可能有所不同。
因此，常規基於MS的MAM方法在實驗室之間和/或儀器之間差異性方面缺乏穩健性。
另外，基於質譜分析法的多屬性方法（MAM）的主要挑戰係分析者與儀器之間的其高度差異性。對於可再現的屬性測量，所有分析實驗室不僅需要類似的儀器模型，而且還必須將儀器調整至相同的條件。考慮到新的層析技術和質譜技術的快速發展，這帶來了巨大的長期挑戰。另外，在樣品製備期間在消化效率和人工修飾（例如，氧化、脫醯胺化、Asp異構化和片段化）方面的差異也會促成實驗室之間的差異性。必須解決該等挑戰以確保MAM在例如cGMP環境中的長期成功。
因此，需要經由執行時間信號強度校準來減小基於MS的多屬性方法（MAM）的實驗室之間和/或儀器之間差異性的系統和方法。
如本文所描述的，揭露了用於經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間和/或儀器之間差異性的系統和方法。如針對各個實施方式所描述的，該等系統和方法可以用於藉由將參考標準品中的測得的或已知屬性豐度（例如，每種品質屬性的參考標準品豐度值）用作校準物來確定樣品中的屬性豐度（例如，每種品質屬性的樣品豐度值）。這種新技術增加了實驗室之間和/或儀器之間效率並且允許減小實驗室和/或儀器之間的差異性。例如，因為通常會收集參考標準品數據進行MAM分析，所以這種新技術不需要分析者或實驗室進行額外工作或需要最小量的額外工作。這係因為，對於典型的MAM程序，參考標準品與樣品並行分析以實現其他目的，例如，系統穩定性和同一性目的。另外，將參考標準品用作校準物係進一步有益的，因為在參考標準品中，大多數品質屬性在標準品的整個壽命內保持不變，並且因此可以以獨特的方式將參考標準品用作校準物以校正儀器或樣品製備程序之間的差異。
在本文所描述的各個實施方式中，描述了用於經由執行時間信號強度校準來減小MAM分析的實驗室之間和/或儀器之間差異性的系統和方法。例如，對於一些實施方式，這種系統和方法可以包括第一基於MAM的儀器，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器。該第一基於MAM的儀器可以具有由(1)第一儀器模型或(2)第一組設置中的至少一項限定的第一儀器條件。該第一基於MAM的儀器可以被配置成接收第一樣品和參考標準品。該第一基於MAM的儀器可以被進一步配置成經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型。
該等系統和方法可以進一步包括與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器。所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器可以被配置成經由第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數。該第一組校正因數可以基於該參考標準品。所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器可以被進一步配置成確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數。
該等系統和方法可以進一步包括第二基於MAM的儀器，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器。該第二基於MAM的儀器可以具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置。
在各個實施方式中，該第二儀器條件可以不同於該第一儀器條件。
該第二基於MAM的儀器可以被配置成接收第二樣品和該參考標準品。該第二基於MAM的儀器可以被進一步配置成經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型。
該等系統和方法可以進一步包括與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器。所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器可以被配置成經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數。該第二組校正因數可以基於該參考標準品。所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器可以被進一步配置成確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數。
基於為每個儀器確定的該等校正因數，可以減小該第一基於MAM的儀器與該第二基於MAM的儀器之間的測量結果差異性。例如，可以基於該第一基於MAM的儀器的該第一組校正因數和該第二基於MAM的儀器的該第二組校正因數來減小該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值。
在另外的實施方式中，揭露了用於在多個時間段內經由執行時間信號強度校準來減小基於MAM的儀器的差異性的系統和方法。在這種實施方式中，基於MAM的儀器在第一時間段內可以接收第一樣品和參考標準品。
該基於MAM的儀器可以經由檢測器在該第一時間段內檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型。
可以將一個或多個處理器配置成經由第一MAM迭代在該第一時間段內確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品。
該一個或多個處理器還可以被配置成經由該第一MAM迭代並且在該第一時間段內確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值。該第一組樣品豐度值可以基於該第一組校正因數。該基於MAM的儀器在該第一時間段內可以具有由第一組設置限定的第一儀器條件。
該基於MAM的儀器在第二時間段內可以被配置成接收第二樣品和參考標準品。
該基於MAM的儀器可以在該第二時間段內經由該檢測器檢測來自該第一樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型。
該一個或多個處理器可以被配置成在該第二時間段內經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品。
該一個或多個處理器還可以被配置成經由該第二MAM迭代並且在該第二時間段內確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校樣品豐度值。該第二組樣品豐度值可以基於該第二組校正因數。該基於MAM的儀器在該第二時間段內可以具有由第二組設置限定的第二儀器條件。
該基於MAM的儀器在該第一時間段內的該第二儀器條件可以不同於該基於MAM的儀器在該第二時間段內的該第二儀器條件。
基於針對每個時間段確定的該等校正因數，可以減小該基於MAM的儀器在該第一時間段與該第二時間段之間的該等MAM迭代之間的測量結果差異性。例如，可以基於該第一基於MAM的儀器的該第一組校正因數和該第二基於MAM的儀器的該第二組校正因數來減小該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值。
如本文中進一步描述的，例如關於圖4a、圖4b、圖5a和圖5b，對各種同種型的分析表明，當與現有的基於MAM的程序相比時，應用本文所揭露的系統和方法使實驗室之間和/或儀器之間差異性（例如，中間精度RSD）減小兩至三倍。利用所揭露的系統和方法，不再需要實驗室或儀器之間或在不同時間段執行的MAM迭代之間的一致儀器模型。同時，實驗室之間的細微消化程序變化以及藉由自動化進行的改變不會顯著影響不同實驗室、儀器或者在不同時間段執行的MAM迭代之間的測定結果。
該等新系統和方法還為其他儀器，如用於選擇反應監測的三重四極儀器提供了另外的機會，因為利用該等所揭露的系統和方法，不再需要不同肽同種型之間的一致響應因數。
另外，相比常規方法，所揭露的系統和方法具有顯著優勢，因為該等新系統和新方法藉由執行時間信號強度校準大大減小了實驗室之間變化。如本文所描述的該等新系統和方法有效消除了MAM使用一致設備/儀器的要求，這在當前MAM工作流程中係個主要問題。此外，當需要準確量化品質屬性時，該等新系統和方法適用於任何基於MAM的應用。另外，因為在生物製藥工作流程中參考標準品通常與樣品並行分析，所以分析者不需要進行附加工作。
根據上文並且利用本文種的揭露內容，本揭露內容至少因為申請專利範圍敘述了以下內容而包括電腦功能的改進或其他技術的改進：例如，可以藉由利用同一樣品（例如，（多種）蛋白水解肽的同一樣品）並且將參考標準品用作校準物來減小運行MAM程序的基於MAM的儀器之間的差異性從而改進（多個）基於MAM的儀器。也就係說，本揭露內容描述了電腦本身的運行或任何其他技術或技術領域的改進，因為該等系統和方法減小跨MAM的儀器的差異性。與先前技術相比，這種情況得到改善，至少係因為常規的MAM過程需要由於樣品製備程序、分析者習慣、儀器和試劑品質的變化而很難滿足的條件。
本揭露內容涉及其他技術或技術領域的改進，至少係因為即使基於MAM的儀器具有不同的儀器模型或具有不同組設置，甚至係跨實驗室，也可以校準基於MAM的儀器。
本揭露內容包括利用或藉由使用特定機器，例如基於MAM的儀器來應用獨特的改進。
本揭露內容包括除生物治療劑開發或研究領域中的眾所周知的、日常的、常規的活動之外的具體特徵，和/或增加了使本揭露內容集中於特定的有用應用--例如，經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間和儀器之間差異性--的非常規步驟。
另外，為了克服如本文所描述的挑戰，描述了用於將參考標準品中的測得的屬性用作校準物來校準樣品中的屬性豐度的新校準系統和方法。在參考標準品中，大多數品質屬性在該標準品的整個壽命內保持不變並且因此可以充當用於校正儀器或樣品製備程序之間的差異的校準物。由於在典型的MAM方法中通常收集參考標準品數據，所以不需要分析者進行附加工作。來自大量屬性的測試數據表明，該方法大大地減小了儀器之間差異性。利用這種方法，不再需要一致的儀器模型和樣品製備程序。因此，消化程序的變化、現代儀器的進步將不會顯著影響測定結果。該等新系統和新方法還允許校準其他儀器，如用於選擇反應監測的三重四極儀器，因為不再需要不同肽同種型之間的一致響應因數。
如本文所描述的，開發了基於對蛋白水解肽的LC-MS分析之後的蛋白水解消化的多屬性方法以量化用於治療蛋白質的各種品質屬性。該等方法利用由質譜（MS）檢測器提供的分辨力並且使用蛋白水解肽的每種同種型（包括經修飾和未經修飾的形式）的MS強度進行定量。由於該等方法對每種臨床相關的品質屬性的高度特異型，所以這種方法已在生物製藥行業中獲得了大量關注。
對於本領域的普通技術人員來說，根據以下對已經藉由說明的方式示出和描述的較佳的實施方式的描述，優點將變得更加明顯。如將認識到的，本發明實施方式可以具有其他和不同的實施方式，並且可以在各個方面對其細節進行修改。因此，附圖和說明書將在本質上被視為係說明性的而非限制性的。
相關申請的引用
本申請要求（2018年6月8日提交的）美國臨時申請案號62/763,110以及（2018年10月16日提交的）美國臨時申請案號62/746,323的權益。前述臨時申請中的每一個的全文藉由引用併入本文。
圖1展示了根據本文所揭露的各個實施方式的包括質譜儀（MS）102的示例基於MAM的儀器100。如本文所描述的，MAM可以用於同時分析分子（例如，蛋白質或同種型）的多種性質或屬性（例如，品質屬性）。為了測量單個分子的性質或屬性，質譜儀102可以接收分子或肽的樣品110，如本文所描述的同種型的樣品或同種型的參考標準品。質譜儀102可以將接收到的分子樣品轉換成離子，從而使得可以過濾和標識樣品分子的電離形式。
通常，質譜儀包括離子源、質量分析器和檢測器。例如，對於離子源114，通常藉由添加一個或多個質子將分子或肽的小型樣品（例如，樣品110）電離（151）為陽離子。質量分析器116根據離子的質量和電荷對該等離子（例如，離子152）進行分類和分離。檢測器（例如，檢測器140）測量經分離的離子，並且可以經由具有一個或多個處理器的計算設備（例如，計算設備142）來記錄和顯示結果，例如經由圖表或其他報告。該一個或多個處理器可以是基於MAM的儀器100的一部分或單獨的計算設備（例如，計算設備142）的一部分。
離子152可以由檢測器140電子地檢測，其中，離子152具有不同的強度並且因此產生由檢測器140檢測到的不同的或變化的離子強度（例如，信號）。可以在計算設備142中讀取、存儲和/或分析由檢測器140檢測到的離子152，例如其中，檢測到的離子可以生成電子資訊（例如，離子讀數的峰面積等）。因此，如本文所描述的，基於MAM的儀器100可以生成關於離子強度的資訊。可以經由二維（2D）圖表、曲線圖或記錄來顯示離子強度，例如其中，這種圖表的質譜的y軸可以表示離子的信號強度。通常，質量-電荷（m/z）值係在圖表、曲線圖或記錄的x軸上測量的，其中，「m」係指分子的或原子的質量數並且「z」係指離子的電荷數。
另外，可以根據從MS資訊生成的對離子強度/信號的分析來確定響應因數。響應因數可以等於由分子或同種型（例如，如由離子152確定）產生的離子強度信號與產生信號的分子或同種型的量的比率。例如關於表1，本文進一步描述了響應因數（例如，k ）和離子強度（例如，Ii ）。
應理解的是，可以以各種方式完成經由質譜儀對分子（例如，同種型）的電離。雖然以這樣的一種方式描繪和描述了圖1的質譜儀的實施方式，但是應理解的是，任何質譜儀或用於執行質譜分析的方法可以用於本文所描述的系統和方法。例如，質譜儀102可以包括或基於Orbitrap、TOF（飛行時間）和/或基於單級子或三級子、四極子的質譜儀器中的任何一種。
計算設備142可以包括一個或多個處理器和/或用於讀取、存儲或分析分子、同種型、參考標準品、離子或本文所描述的其他資訊的一個或多個電腦記憶體。計算設備142的該一個或多個處理器和/或一個或多個電腦記憶體還可以用於實施關於經由執行時間信號強度校準來減小MAM分析的實驗室之間或儀器之間差異性的本文所描述的功能、方法、流程圖或其他特徵中的任何一種。另外或在替代方案中，如本文所描述的，基於MAM的儀器100可以包括計算設備142的一個或多個處理器和/或一個或多個電腦記憶體，該一個或多個處理器和/或一個或多個電腦記憶體還可以用於實施關於經由執行時間信號強度校準來減小MAM分析的實驗室之間或儀器之間差異性的本文所描述的功能、方法、流程圖或其他特徵中的任何一種。如圖1中所展示的，計算設備142可以直接（例如，硬連線電纜，如通用序列匯流排（USB）電纜）或經由電腦網路（私人的或者公用的，如經由互聯網）通信地耦合至基於MAM的儀器100，並且可以通信地耦合至質譜儀102的部件中的任何一個，包括例如離子源114、質量分析器116和/或檢測器140中的任何一個。
具體地，基於MAM的儀器100或者計算設備142可以是可以包括一個或多個處理器以及一個或多個電腦記憶體的計算設備。記憶體可以包括一種或多種形式的易失性和/或非易失性記憶體、固定和/或卸除式存放裝置器，如唯讀記憶體（ROM）、電子可程式設計唯讀記憶體（EPROM）、隨機存取記憶體（RAM）、可抹除電子可程式設計唯讀記憶體（EEPROM）和/或其他硬碟驅動器、快閃記憶體、MicroSD卡等。記憶體可以存儲能夠促進如本文討論的功能的作業系統（OS）（例如，Microsoft Windows、Linux、Unix等）。記憶體還可以存儲機器可讀指令，包括一個或多個應用、一個或多個軟體組件和/或一個或多個應用程式設計介面（API）中的任何一個，其可以被實施為促進或執行本文所描述的特徵、功能或其他揭露內容，如針對各個流程圖、說明、圖示、附圖和/或本文其他揭露內容展示、描繪或描述的任何方法、過程、元件或限制。例如，應用、軟體組件或API中的至少一些可以是、包括機器學習部件和/或搜尋引擎優化部件、以其他方式為機器學習部件和/或搜尋引擎優化部件的一部分，其中，每個部件被配置成促進本文討論的其各種功能。應意識到的是，可以設想一個或多個其他應用，該等應用由基於MAM的儀器100或計算設備142的（多個）處理器執行。
基於MAM的儀器100或計算設備142的（多個）處理器可以經由負責向且從（多個）處理器和記憶體傳輸電子數據、數據包或其他電子信號的電腦匯流排連接至基於MAM的儀器100或計算設備142的記憶體，以實施或執行如各個流程圖、說明、圖示、附圖和/或本文其他揭露內容展示、描繪或描述的機器可讀指令、方法、過程、元件或限制。
基於MAM的儀器100或計算設備142的（多個）處理器可以經由電腦匯流排與記憶體介面連接以執行作業系統（OS）。該（多個）處理器還可以經由電腦匯流排與記憶體介面連接以創建、讀取、更新、刪除或以其他方式訪問或介面連接存儲在基於MAM的儀器100或計算設備142的記憶體中的數據和/或基於MAM的儀器100或計算設備142的資料庫（例如，關聯式資料庫，如Oracle、DB2、MySQL或基於NoSQL的資料庫，如MongoDB）。存儲在記憶體和/或資料庫中的數據可以包括本文所描述的數據或資訊中的所有或部分或任何數據或資訊，包括例如一個或多個搜索請求、一個或多個交易細節以及使用者的簡檔資訊。
基於MAM的儀器100或計算設備142可以進一步包括被配置成經由一個或多個外部/網路埠將數據傳送（例如，發送和接收）到一個或多個網路或本地終端的通信部件，如本文所描述的電腦網路和/或計算設備142。在一些實施方式中，通信部件可以包括用戶端-伺服器平台技術，如響應於接收和響應電子請求的ASP.NET、Java J2EE、Ruby on Rails、Node.js、web服務或線上API。基於MAM的儀器100或計算設備142的（多個）處理器可以實施基於MAM的儀器100或計算設備142的通信部件，該通信部件可以交互以實施或執行如各個流程圖、說明、圖示、附圖和/或本文其他揭露內容展示、描繪或描述的機器可讀指令、方法、過程、元件或限制。根據一些實施方式，基於MAM的儀器100或計算設備142的通信部件可以包括一個或多個收發器（例如，WWAN、WLAN和/或WPAN收發器）或與其交互，該一個或多個收發器根據IEEE標準、3GPP標準或其他標準運行並且可以用於經由基於MAM的儀器100或計算設備142的外部/網路埠接收和傳輸數據。
基於MAM的儀器100或計算設備142可以進一步包括或實施操作員介面，該操作員介面被配置成向管理員或操作員呈現資訊和/或從管理員或操作員接收輸入。基於MAM的儀器100或計算設備142的操作員介面可以提供顯示幕（例如，經由計算設備142 106）。基於MAM的儀器100或者計算設備142還可以提供I/O部件（例如，埠、電容式或電阻式觸敏輸入面板、鍵、按鈕、燈、LED），該等部件可以是可經由基於MAM的儀器100或計算設備142直接訪問的或附接至基於MAM的儀器或計算設備或者可以是可經由基於MAM的儀器100或計算設備142的終端間接訪問的或附接至基於MAM的儀器或計算設備的終端。根據一些實施方式，管理員或操作員可以經由基於MAM的儀器100或計算設備142的操作員介面和/或I/O部件訪問伺服器102以查看資訊、做出改變、輸入訓練數據和/或執行其他功能。
在一些實施方式中，基於MAM的儀器100或者計算設備142可以執行如本文所討論的功能作為「雲」網路的一部分，或者可以以其他方式與雲內的其他硬體或軟體組件進行通信以發送、檢索或以其他方式分析本文所描述的數據或資訊。
通常，根據一些實施方式的電腦程式或基於電腦的產品可以包括具有在其中具體化的電腦可讀程式碼或電腦指令的電腦可用存儲介質或有形的、非暫時性電腦可讀介質（例如，標準隨機存取記憶體（RAM）、光碟、通用序列匯流排（USB）驅動器等），其中，電腦可讀程式碼或電腦指令可以安裝在基於MAM的儀器100或計算設備142的（多個）處理器上或以其他方式被適配成由其執行（例如，與記憶體中的對應作業系統一起工作），以便促進、實施或執行如各個流程圖、說明、圖示、附圖和/或本文其他揭露內容展示、描繪或描述的機器可讀指令、方法、過程、元件或限制。在這方面，程式碼可以用任何期望的程式語言來實施，並且可以被實施為機器代碼、彙編代碼、位元組代碼、可解釋的原始程式碼等（例如，經由Golang、Python、C、C++、C＃、Objective-C、Java、Scala、Actionscript、Javascript、HTML、CSS、XML等）。
圖2展示了根據本文所揭露的各個實施方式的用於經由執行時間信號強度校準來減小第一基於MAM的儀器210與第二基於MAM的儀器260之間的差異性的示例流程圖。在一些實施方式中，第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260可以位於相同的實驗室中。在其他實施方式中，第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260可以位於不同的實驗室中。例如，第一基於MAM的儀器210可以位於第一地理位置處的第一實驗室處並且第二基於MAM的儀器260可以位於第二地理位置處的第二實驗室處。在一些實施方式中，第一MAM儀器210可以經由如針對圖1所描述的電腦網路通信地耦合至與第二MS儀器相關聯的一個或多個處理器。
可以以與如針對圖1的基於MAM的儀器100所描述的相同或類似的方式來配置第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260中的每個。因此，圖1的揭露內容以相同或類似的方式應用於第一基於MAM的儀器210和/或者第二基於MAM的儀器260。另外，第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260中的每個可以包括如針對圖1所描述的計算設備（例如，計算設備142）。在各個實施方式中，第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260可以是或包括如針對圖1所描述的質譜（MS）儀器。在其他實施方式中，第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260可以是或包括三重四極儀器。
在圖2的實施方式中，第一基於MAM的儀器210包括第一檢測器（例如，如本文針對圖1所描述的檢測器140）。另外，第一基於MAM的儀器210具有由(1)第一儀器模型或(2)第一組設置限定的第一儀器條件。對於如本文所描述的基於MAM的儀器，儀器模型可以限定基於MAM的儀器如何分析、讀取或以其他方式報告如本文所描述的分子、同種型、離子或其他相關資訊。例如，本文描述了用於圖1的基於MAM的儀器100的示例實施方式儀器模型或用於電離分子的配置。類似地，基於MAM的儀器可以包括可以影響基於MAM的儀器如何操作的基於MAM的儀器的一組設置。例如，設置可以改變基於MAM的儀器如何執行電離和/或改變如何讀取或檢測或以其他方式報告離子的靈敏度。儀器模型或者儀器設置的差異可以導致基於MAM的儀器以不同的方式進行操作，這可以導致基於MAM的儀器以不同的方式檢測和/或讀取分子、同種型、離子。因此，具有不同儀器模型或儀器設置的基於MAM的儀器可以具有不同的條件並且因此可以以與這種不同的儀器可能位於其中的儀器之間和/或與實驗室之間不同的方式進行操作。
在圖2的實施方式中，第一基於MAM的儀器210被配製成接收第一樣品204（例如，屬於蛋白水解肽的樣品）和參考標準品202（例如，屬於蛋白水解肽）。在圖2的實施方式中，第一樣品204具有未知的屬性（例如，品質屬性）濃度。然而，參考標準品202具有已知的屬性濃度並且因此可以用作校準物。例如，參考標準品可以是含有某種已知化學成分的化學樣品，例如具有某種批號或「批次」的樣品可以含有80%豐度的第一化學品或屬性、10%的第二化學品或屬性以及各種剩餘百分比的其他痕量化學品或屬性。參考標準品可以具有與相同化學品或成分的其他參考標準品樣品相同的化學品或屬性成分和/或相同的信號特徵標誌（例如，如可經由質譜儀檢測，如針對圖1所描述的）。因此，參考標準品可以用於品質控制目的，其中，將測試樣品（例如，第一樣品204和/或第二樣品254）與參考標準品（例如，參考標準品202和/或參考標準品252）進行比較以確定測試樣品與參考標準品樣品或批次之間的品質、數量、一致性、方差和/或偏差。例如，蛋白質阿法依泊汀（Epoetin alfa）（重組促紅血球生成素）（例如，Amgen公司的Epogen(r)）可以具有可以用於比較依泊汀的測試樣品批次以進行品質控制測量的參考標準品批次。
如圖2所示出的，對於第一基於MAM的儀器210，參考標準品202與樣品204並行分析。類似地，對於第二基於MAM的儀器260，參考標準品252與第二樣品254並行分析。對於參考標準品202和252，大多數品質屬性在每個參考標準品的整個生命週期內保持不變，並且因此充當通常用於校正儀器或樣品製備程序之間的（多種）差異的校準物，例如第一基於MAM的儀器210與第二基於MAM的儀器260和/或由操作第一基於MAM的儀器210和/或第二基於MAM的儀器260的（多個）實驗室分析者執行的樣品製備程序之間的條件的（多種）差異。
如本文所描述的，在每次運行時將參考標準品用作校準物的益處（例如，其中，參考標準品202和252可以是用作校準物的相同參考標準品的樣品）係可以消除對關於實驗室之間和儀器之間的可重現性的常規MAM的大多數要求。例如，可以將對實驗室之間和儀器之間的可重現性的假設簡化和修改為如下：(1)未經修飾的肽和經修飾的肽在相同的LC/MS序列中具有可重現的恢復（例如，相比於實驗室之間）；(2)未經修飾的肽和經修飾的肽在相同的LC/MS序列中具有可重現的MS響應因數（例如，相比於相同的響應因數）；(3)人工誘導的屬性變化可忽略不計。與常規方法要求相比，更容易滿足以上該等要求，因為關於實驗室之間的可重現性的大多數要求都降低至相同LC/MS序列內的可重現性（例如，相同的實驗室、相同的分析者以及相同的日期）。
如在圖2的實施方式中所示出的，第一基於MAM的儀器210被配置成經由第一檢測器檢測來自第一樣品的第一樣品同種型和來自參考標準品的第一參考標準品同種型。在蛋白水解肽的背景下，基於蛋白質的同種型可以是作為發揮相同的或類似的生物學作用的一組高度類似的蛋白質的成員的蛋白質變體。在一些實施方式中，第一樣品同種型可以是用於如本文所描述的品質控制目的的品質屬性。在其他實施方式中，品質屬性可以是蛋白質或所鑒定雜質或用於測量樣品或批次的品質的其他度量。例如，在各個實施方式中，可以藉由片段化、氧化、糖化、羥基化、序列變體、異構化、脫胺基、C-末端賴胺酸、O-連接的聚糖和/或N-連接的聚糖來限定品質屬性。
第一基於MAM的儀器210可以與一個或多個處理器相關聯。該一個或多個處理器可以與第一基於MAM的儀器210一起包括或者可以是通信地耦合至如例如針對圖1所描述的第一基於MAM的儀器210的計算設備（例如，計算設備142）的一部分。
在圖2的實施方式中，所述與第一基於MAM的儀器210相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第一MAM迭代確定與第一樣品同種型相對應的第一組校正因數。應理解的是，可以在第一MAM迭代之前、期間或之後確定該組校正因數，使得對該組校正因數的確定與第一MAM迭代相關聯。應進一步理解的是，如本文所描述的，該組校正因數可以包括單個校正因數或多個校正因數。在圖2的實施方式中，第一組校正因數基於參考標準品202。對於與特定胺基酸殘基相關聯的n+1種同種型，可以經由以下方程(1)來表達該關係，其中，ai 表示第一組校正因數，並且I0 和A0 表示參考標準品202的離子強度和屬性豐度值。
因此，參考標準品（例如，經由I0 和A0 表示）被用作校準物，其中，根據該等值確定第一組校正因數（例如，ai ）。如方程(1)所示出的，第一組校正因數（例如，ai ）基於（多種）第一參考標準品同種型的離子強度值（例如，I0 0 和Ii 0 ）和（多種）第一參考標準品同種型的第一參考標準品豐度值（例如，A0 0 和Ai 0 ）。以下表1描述了用於方程(1)和/或如本文其他地方所使用的各種符號： [表 1 ]
方程(1)可以用於基於參考標準品（Ai 0 ）中的已知屬性豐度來執行強度校準（例如，離子強度校準）。
另外，第一組校正因數（例如，ai ）可以用於校準與第一組樣品豐度值（例如，Ai ）相關聯的響應因數（k ）以確定（多種）第一樣品同種型的（多個）離子強度值（Ii ）。這在以下方程(2)中示出。通常，離子強度值可以表示如由MS檢測器140檢測的峰面積，如針對圖1所描述的。如下所示出的，校正因數ai 可以用於校準響應因數k ，當應用於豐度值（Ai ）時，該響應因數導致校準離子強度因數Ii 。這在從中導出方程(1)的以下方程(2)中示出：
在方程(2)中，藉由校正因數（ai ）來修飾每種同種型（i ）的響應因數（k ）。公式ai k 0 表示參考標準品（例如，202）的經校正響應因數，並且ai k 表示樣品（例如，第一樣品204）的經校正響應因數。由於樣品製備中的微小差異以及注射之間的儀器靈敏度的差異（例如，實驗室內的變化），參考標準品（k0 ）的響應因數可能不同於第一樣品204（k ）的響應因數。類似地，可以在第一樣品204與第二樣品254之間類似地引入或發生差異（例如，實驗室之間變化）。如在方程(2)中所示出的，在一些實施方式中，將校正因數a0 設置為1（a0 = 1）以求解方程(2)從而導出方程(1)。然而，應該解的是，將哪種同種型設置為恒定值（a0 = 1）並不重要；然而，通常設置最高豐度的同種型，其通常是未經修飾的同種型。
可以使用常規MAM方法或者具有更高精度的正交方法來建立參考標準品中每種屬性的豐度值（Ai 0 ）。如果使用絕對定量方法，則對相同屬性的所有後續的MAM分析在校準後成為絕對測量。
方程(1)和方程(2)可以用於計算樣品（例如，第一樣品204）中每種同種型i 的豐度值（Ai ）。例如，如方程(1)所示出的，根據包括校正因數（例如，ai ）和每種同種型（例如，同種型Ii ）的信號強度的值確定同種型i 的豐度值（Ai ）。
在圖2的實施方式中，所述與第一基於MAM的儀器210相關聯的一個或多個處理器可以進一步被配置成確定與（多種）第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值（例如，如方程(1)所示出的Ai ），其中，第一組樣品豐度值（例如，如方程(1)所示出的）基於第一組校正因數（例如，方程(1)的ai ）。如本文所描述的，可以以百分比形式來報告豐度值。如方程(1)所示出的，第一組樣品豐度值（例如，Ai ）進一步基於（多種）第一樣品同種型的（多個）離子強度值（例如，方程(1)的Ii ）。
圖2還展示了對第二基於MAM的儀器260的校準。使用與用於校準（220）第一基於MAM的儀器210相同的參考標準品（或相同參考標準品的不同樣品）來校準（270）第二基於MAM的儀器260。以此方式，第二基於MAM的儀器260和第一基於MAM的儀器210二者實現了與可以經由報告280示出的一致的結果。應理解的是，以與針對第一基於MAM的儀器210所描述的相同或類似的方式來配置和校準第二基於MAM的儀器260，包括使用相同的參考標準品（例如，其中，參考標準品202和參考標準品252係相同參考標準品的樣品），使得用於校準（例如，包括經由方程(1)和方程(2)）的本文揭露內容如適用於第一基於MAM的儀器210一樣同樣適用於第二基於MAM的儀器260。
第二基於MAM的儀器260包括第二檢測器（例如，如本文針對圖1所描述的檢測器140）。在圖2的實施方式中，第二基於MAM的儀器260具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置。如本文所描述的，第二基於MAM的儀器260的第二儀器條件可能不同於第一基於MAM的儀器210的第一儀器條件。在一些實施方式中，因為第二基於MAM的儀器260可以具有不同於第一基於MAM的儀器210的第一儀器模型的第二儀器模型，所以第二儀器條件可以不同於第一儀器條件。在其他實施方式中，因為第二基於MAM的儀器260可以具有不同於第一基於MAM的儀器210的第一組設置的第二組設置，所以第二儀器條件可以不同於第一儀器條件。
第二基於MAM的儀器260被配製成接收第二樣品254（例如，屬於蛋白水解肽的樣品）和參考標準品252（例如，屬於蛋白水解肽）。參考標準品252可以是與用於參考標準品202的參考標準品相同的參考標準品的不同樣品。第二基於MAM的儀器260被進一步配置成經由第二檢測器（例如，如本文針對圖1所描述的檢測器140）檢測來自第二樣品的第二樣品同種型（i ）和來自參考標準品的第二參考標準品同種型。應認識到的是，在一些實施方式中，第一樣品、第二樣品和參考中的每一個可以與共同蛋白水解肽相關聯，使得第一樣品具有給定蛋白水解肽、第二樣品具有蛋白水解肽並且參考標準品具有蛋白水解肽。
第二基於MAM的儀器260可以與一個或多個處理器相關聯。在一些實施方式中，該一個或多個處理器係相同計算設備（例如，計算設備142）的一部分，使得所述與第一基於MAM的儀器210相關聯的一個或多個處理器係與第二基於MAM的儀器260相關聯的相同的一個或多個處理器。在其他實施方式中，該一個或多個處理器係不同計算設備的一部分。
所述與第二基於MAM的儀器260相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第二MAM迭代確定與（多種）第二樣品同種型（i ）相對應的第二組校正因數（例如，ai ）。應理解的是，可以在第二MAM迭代之前、期間或之後確定該組校正因數（例如，ai ），使得對該組校正因數的確定與第二MAM迭代相關聯。在圖2的實施方式中，第二組校正因數（例如，ai ）基於參考標準品252，其係與參考標準品202的參考標準品相同的參考標準品。所述與第二基於MAM的儀器260相關聯的一個或多個處理器可以被進一步配置成確定與（多種）第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值（例如，Ai ），其中，第二組樣品豐度值（例如，Ai ）基於第二組校正因數（例如，ai ）。
基於針對第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260確定的校正因數，如由本文所描述的共同參考標準品202和252校準的，當藉由個兩個儀器分析同一樣品時，可以減小第一基於MAM的儀器210與第二基於MAM的儀器260之間的測量結果的差異性。可以經由報告280的一致的MAM結果來證明減小的差異性。例如，可以基於如本文所描述的應用第一基於MAM的儀器210的第一組校正因數（例如，ai ）和第二基於MAM的儀器260的第二組校正因數（例如，ai ）來減小根據第一組樣品豐度值（例如，Ai ）和第二組樣品豐度值（例如，Ai ）確定的（多個）方差值。如本文所描述的，在一些情況下，第一組樣品豐度值和第二組樣品豐度值的方差值可以減小至少25%。
因此，如針對圖2所展示的，可以並行分析樣品204和254以及共同參考標準品（例如，202和252）以分別校準（220和270）第一基於MAM的儀器210和第二基於MAM的儀器260。以此方式，可以使用參考標準品（例如，202和252）中的已知濃度來生成報告樣品中每個品質屬性的濃度的報告280，以便即使用不同的儀器也能取得一致的結果，例如具有如本文所描述的不同條件的儀器。例如，第一基於MAM的儀器210和第一基於MAM的儀器216中的每一個可以被配置成生成包括或以其他方式描述或報告同種型和/或（多種）品質屬性的報告（例如，報告280）。例如，報告280可以包括作為圖表報告的資訊或數據，並且可以包括如響應因數、峰面積或其他資訊等數據或資訊，例如如針對圖1所描述的。在各個實施方式中，可以使用如本文所描述的參考標準品202或252在校準（220或270）之後生成報告280。
圖3展示了根據本文所揭露的各個實施方式的用於經由執行時間信號強度校準在多個時間段內減小基於MAM的儀器（例如，基於MAM的儀器100）的差異性的方法300。應理解的是，以與針對圖2的第一基於MAM的儀器210所描述的相同或類似的方式來配置和校準圖3的基於MAM的儀器，包括使用參考標準品，使得用於校準（例如，包括藉由方程(1)和方程(2)）的本文揭露內容同樣適用於圖3的基於MAM的儀器。然而，關於圖3，跨不同時間段（例如，跨不同運行、不同MAM迭代和/或不同天、小時等）使用相同的基於MAM的儀器。可以如針對圖1的基於MAM的儀器100所描述的那樣來配置圖3的基於MAM的儀器。
方法300在框304處開始（302），其中，圖3的基於MAM的儀器在第一時間段內可以接收第一樣品（例如，樣品204，其可以屬於蛋白水解肽）和參考標準品（例如，參考標準品202，其可以屬於蛋白水解肽）。
在框306處，基於MAM的儀器可以經由檢測器（例如，檢測器140）在第一時間段內檢測來自第一樣品的第一樣品同種型（i ）和來自參考標準品的第一參考標準品同種型。
在框308處，一個或多個處理器（例如，如針對圖1所描述的一個或多個處理器）可以被配置成經由第一MAM迭代在第一時間段內確定與（多種）第一樣品同種型（i ）相對應的第一組校正因數（例如，ai ），其中，第一組校正因數（例如，ai ）基於參考標準品。
在框310處，一個或多個處理器還可以被配置成經由第一MAM迭代並且在第一時間段內確定與（多種）第一樣品同種型（i ）相對應的第一組校樣品豐度值（例如，Ai ）。第一組樣品豐度值可以基於第一組校正因數（例如，ai ）。該基於MAM的儀器在該第一時間段內可以具有由第一組設置限定的第一儀器條件。第一儀器條件可以與針對圖2所描述的相同或相似。
在框312處，基於MAM的儀器在第二時間段內可以接收第二樣品（例如，其可以屬於蛋白水解肽）和參考標準品（例如，其可以屬於蛋白水解肽）。
在框314處，基於MAM的儀器可以經由檢測器（例如，檢測器140）在第二時間段內檢測來自第二樣品的第二樣品同種型（i ）和來自參考標準品的第二參考標準品同種型。
在框316處，一個或多個處理器可以被配置成經由第二MAM迭代在第二時間段內確定與（多種）第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，第二組校正因數基於參考標準品。
在框318處，一個或多個處理器還可以被配置成經由第二MAM迭代並且在第二時間段內確定與（多種）第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值。該第二組樣品豐度值可以基於該第二組校正因數。該基於MAM的儀器在該第二時間段內可以具有由第二組設置限定的第二儀器條件。該基於MAM的儀器在該第一時間段內的該第二儀器條件可以不同於該基於MAM的儀器在該第二時間段內的該第二儀器條件。
基於針對每個時間段確定的校正因數，可以減小第一時間段與第二時間段之間的MAM迭代之間的測量結果差異性。例如，可以基於第一基於MAM的儀器的第一組校正因數和第二基於MAM的儀器的第二組校正因數來減小第一組樣品豐度值和第二組樣品豐度值的（多個）方差值。
如本文所描述的，圖4a和圖4b的實施方式展示了使用如本文所揭露的方差減小和校準對蛋白質P1的分析。P1在分子的一部分中含有兩個O-連接的糖基化位點，如本文在圖4b所示出的，每個具有6種不同糖型（同種型）。藉由由不同實驗室分析者使用不同的LC/MS儀器分析P1樣品及其參考標準品來分別生成圖4a和圖4b的圖示400和450，該LC/MS儀器包括Q ExactiveTM BioPharma平台儀器和兩個ExactiveTM Plus Orbitrap質譜儀器，每個儀器由賽默飛世爾科技（ThermoFisher Scientific）公司（加利福尼亞州聖約瑟（San Jose, CA））製造。所有數據均在賽默飛世爾科技公司提供的ChromeleonTM 軟體上處理，以確定每種感興趣的肽的（多個）峰面積。使用常規MAM迭代（402）以及新校準的MAM迭代（404）量化針對圖4a和圖4b的每個糖型所展示的豐度值（例如，Ai ）。新校準的MAM程序（404）基於用於經由如本文所描述的執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性的校準技術。為了獲得P1參考標準品中每種屬性的豐度值（例如，Ai 0 ），藉由常規MAM迭代（402）六次分析P1參考標準品，並且將六個測量結果的平均值用作參考標準品中的已知豐度。
圖4a展示了圖示400，該圖示描繪了減小跨六次示例MAM迭代的給定同種型的豐度值（例如，Ai ）的儀器之間/實驗室之間變化。例如，圖示400的y軸410y以百分比形式示出了豐度值（例如，Ai ）。圖示400的x軸410x示出了六次示例MAM迭代1到6，其將使用常規MAM迭代（402）確定的常規樣品豐度值與使用新校準的MAM迭代（404）確定的經校準豐度值進行比較，如針對本文所揭露的各個實施方式所描述的。例如，MAM迭代1到6可以是在不同的MAM儀器（例如，如針對圖2所描述的第一MAM儀器210和第二基於MAM的儀器260）上運行的MAM迭代或者MAM迭代1到6可以是跨不同時間段在同一MAM儀器上運行的MAM迭代（例如，如針對圖3所描述的）。
特別地，在圖4a的實施方式中，圖示400示出了糖型（同種型）的如使用常規MAM迭代（402）和新校準的MAM迭代（404）兩者所確定的測得的豐度值（例如，Ai ）。具體地，圖示400的糖型係第二內核唾液酸（SA）。在第一基於MAM的儀器（即第一ExactiveTM Plus Orbitrap質譜儀器）上測量在x軸410x上示出的迭代1到3。在不同的第二基於MAM的儀器（即不同的ExactiveTM Plus Orbitrap質譜儀器）上測量在x軸410x上示出的迭代4到6。如在圖示400中所示出的，與使用常規MAM程序（402）的跨每次迭代1到6的豐度值的差異性相比，使用新校準的MAM程序（404）的跨每次迭代1到6的豐度值（例如，Ai ）的儀器之間差異性顯著減小。所述另一方式，與使用常規MAM程序（402）的跨每次迭代1到6的豐度值的差異性相比，使用新校準的MAM程序（404）的跨每次迭代1到6的豐度值（例如，Ai ）的儀器之間一致性顯著提高。
圖4b展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的減小六種示例同種型（包括圖4a的同種型）的儀器之間/實驗室之間偏差。圖示450的y軸460y以百分比形式示出了中間精度相對標準差（RSD）。RSD與豐度值（例如，Ai ）相關。具體地，RSD的減小表明豐度值的差異性的減小。
圖示400的x軸460x示出了六種示例同種型（1HexNAc、1內核、1SA、2SA、第二內核SA和Aglyco）。如本文所描述，圖4a示出了對第二內核SA同種型的分析。如當比較常規MAM迭代（402）與新校準的MAM迭代（404）時所示出的，圖4b示出了六種同種型中的每一種中的相對標準差（RSD）（例如，糖型）的百分比減小。六種同種型中的每一種可以用作品質屬性以測試對給定樣品的批次的品質控制（例如，P1）。因此，相同樣品的測量結果中的一致性（即，減小的差異性/偏差）係很重要的。如圖4b的圖示450所示出的，新校準的MAM迭代（404）減小了相當大量（例如，兩至三倍）的RSD，從最大值25%減小至最大值5%，即使當跨不同的儀器測量P1糖型時也是如此。
如本文所描述的，圖5a和圖5b的實施方式展示了對第二蛋白質P2的屬性的分析。具體地，關於圖5a和圖5b的圖示500和圖示550，P2參考標準品在40ºC下孵育了4周。然後將20%的這種緊迫樣品（stressed sample）摻入到P2參考標準品中以產生測試樣品。使用胰蛋白酶用兩種不同方案對此測試樣品連同P2參考標準品以及緊迫樣品進行消化，並且在具有不同柱、流動相和梯度的兩種不同的LC/MS儀器上對每種消化物分析三次。將Thermo Q ExactiveTM BioPharma平台儀器用作第一基於MAM的儀器並且將Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM 質譜儀（賽默飛世爾科技公司）用作第二基於MAM的儀器。在第一基於MAM的儀器上對P2參考標準品分析六次並且將每種屬性的平均經測量豐度值用作標準豐度值。分析所有所得數據和資訊以獲得每種肽同種型的峰面積和相關豐度值。
另外，關於圖5a和圖5b，分析了P2的57種品質屬性。例如，57種品質屬性包括片段化、氧化、糖化、羥化、序列變體、異構化、脫胺基、C-末端賴胺酸、O-連接的聚糖和N-連接的聚糖。品質屬性覆蓋了從0.005%至5%的廣泛範圍的豐度值。
圖5a展示了圖示500，該圖示描繪減小跨十二次示例MAM迭代的豐度值（例如，Ai ）的儀器之間/實驗室之間變化。例如，圖示500的y軸510y以百分比形式示出了豐度值（例如，Ai ）。圖示500的x軸510x示出了十二次示例MAM迭代1到12，其將使用常規MAM迭代（402）確定的常規樣品豐度值與使用新校準的MAM迭代（404）確定的經校準豐度值進行比較，如針對本文所揭露的各個實施方式所描述的。例如，MAM迭代1到12可以是使用不同的MAM儀器（例如，如針對圖2所描述的第一MAM儀器210和第二基於MAM的儀器260）執行的MAM迭代或者MAM迭代1到12可以是使用不同時間段內在同一MAM儀器上執行的MAM迭代（例如，如針對圖3所描述的）。
特別地，在圖5a的實施方式中，圖示500示出了K117羥基化的如使用常規MAM迭代（402）和新校準的MAM迭代（404）兩者所確定的測得的豐度值（例如，Ai ）。具體地，圖示500展示了藉由兩種消化方案和兩種LC/MS儀器測量的K117羥基化的豐度，每種一式三份。MAM迭代1到3和7到9來自消化方案1並且運行4到6和10到12來自消化方案2。MAM迭代1到6在Q ExactiveTM BioPharma平台儀器上執行，並且MAM迭代7到12在Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM 質譜儀上執行。如在圖示500中所示出的，與使用常規MAM程序（402）的跨MAM迭代1到12的豐度值的差異性相比，使用新校準的MAM程序（404）的跨所有MAM迭代1到12的豐度值（例如，Ai ）的儀器之間差異性顯著減小。所述另一方式，與使用常規MAM程序（402）的跨每次MAM迭代1到12的豐度值的差異性相比，使用新校準的MAM程序（404）的跨每次MAM迭代1到12的豐度值（例如，Ai ）的儀器之間一致性顯著提高。因此，圖5a展示了兩種不同儀器模型的K117羥基化的測得的豐度值。利用常規MAM程序（402），跨兩個不同的基於MAM的儀器獲得不同的豐度變化。然而，新校準的MAM程序（404）跨兩個不同的基於MAM的儀器提供一致的豐度值。
圖5b展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的減小跨57種品質屬性的儀器之間/實驗室之間偏差。圖5a的K117羥基化占圖5b的57種品質屬性之一。圖示550的y軸560y以百分比形式示出了中間精度RSD。圖示550的x軸560x示出了57種品質屬性，其中，K117羥基化係一種這種品質屬性。使用常規MAM程序（402）和新校準的MAM程序（404）確定57種品質屬性中的每一種。圖5b的圖示550示出了當使用常規MAM程序（402）的品質屬性的RSD通常在3%到50%的範圍內時，對於大多數品質屬性，使用新校準的MAM程序（404）的品質屬性的RSD減小至小於20%，因此示出了根據本文所揭露的各個實施方式的經由執行時間信號強度校準的差異性的減小。
如本文所描述的，經由執行時間信號強度校準來減小（多個）基於MAM的儀器的差異性產生質譜分析的優點（例如，如針對圖2所描述的）。例如，如本文所描述的，校準響應因數（例如，ai ）消除了對必須具有相同響應因數（k ）的不同的肽同種型的需要。此技術可以應用於其他類型的儀器以用於MAM目的。例如，就常規方法而言，由於肽同種型中可能存在不同的片段化效率，因此三重四極儀器上的選擇反應監測（SRM）不適用於MAM目的。然而，本文所描述的新校準的MAM程序使得能夠在三重四極儀器上執行MAM，由於三重四極儀器具有更好的精度、線性度和動態範圍，因此其比使用軌道阱（orbitrap）儀器更有優勢。然而，在這種實施方式中，可能需要首先在高解析度的儀器上建立參考標準品中每種屬性的濃度。
儘管本文的揭露內容闡述了對許多不同實施方式的詳細說明，但應理解的是，本說明書的合法範圍由在本專利的結尾處所闡述的申請專利範圍的文字及其等效物限定。該詳細說明僅被解釋為係示例性的並且未描述每個可能的實施方式，因為描述每個可能的實施方式將是不切實際的。可以使用當前技術或在本專利提交日之後開發的技術來實施許多替代實施方式，其仍然落入本申請專利範圍的範圍內。
以下附加考慮適用於前述討論。貫穿整個說明書，多個實例可以實施被描述為單個實例的部件、操作或結構。儘管一種或多種方法的各個操作被示出和描述為單獨的操作，但是可以同時執行各個操作中的一個或多個，並且不需要以所展示的循序執行操作。在示例配置中作為單獨部件呈現的結構和功能可以實施為組合結構或部件。類似地，作為單個部件呈現的結構和功能可以實施為單獨的部件。該等和其他變化、修改、添加和改進都落入本文主題的範圍內。
另外，本文將某些實施方式描述為包括邏輯或許多常式、子常式、應用或指令。該等可以構成軟體（例如，在機器可讀介質上或在傳輸信號中具體化的代碼）或者硬體。在硬體中，常式等係能夠執行某些操作的有形單元並且可以以某種方式進行配置或安排。在示例實施方式中，可以藉由軟體（例如，應用或應用部分）將一個或多個電腦系統（例如，獨立的用戶端或伺服器電腦系統）或電腦系統的一個或多個硬體模組（例如，處理器或一組處理器）配置為操作以執行如本文所描述的某些操作的硬體模組。
本文所描述的示例方法的各種操作可以至少部分地由被臨時配置（例如，藉由軟體）或永久配置成執行相關操作的一個或多個處理器來執行。無論是臨時配置還是永久配置，這種處理器可以構成操作以執行一種或多種操作或功能的處理器實施的模組。在一些示例實施方式中，本文提及的模組可以包括處理器實施的模組。
類似地，本文所描述的方法或常式可以至少部分地由處理器實施。例如，方法的至少一些操作可以由一個或多個處理器或由處理器實施的硬體模組來執行。對操作中的某些操作的執行可以分佈在一個或多個處理器中，不僅駐留在單個機器內，還跨多個機器部署。在一些示例實施方式中，一個或多個處理器可以位於單個位置中，而在其他實施方式中，處理器可以跨多個位置分佈。
對操作中的某些操作的執行可以分佈在一個或多個處理器中，不僅駐留在單個機器內，還跨多個機器部署。在一些示例實施方式中，一個或多個處理器或處理器實施的模組可以位於單個地理位置中（例如，在家庭環境、辦公室環境或伺服器群內）。在其他實施方式中，一個或多個處理器或處理器實施的模組可以跨多個地理位置分佈。
此詳細描述僅被解釋為係示例性的並且未描述每個可能的實施方式，因為描述每個可能的實施方式如果不是不可能也將是不切實際的。熟悉該項技術者可以使用當前技術或者在本申請的提交日之後開發的技術來實施許多替代實施方式。
熟悉該項技術者將瞭解到，在不脫離本發明的範圍的情況下，關於上文描述的實施方式可以做出各種各樣的修改、改變和組合，並且可以將這種修改、改變和組合視為在本發明構思的範圍內。
除非明確列舉傳統的裝置加功能語言，如在（多項）申請專利範圍中明確列舉的「用於......的裝置」或「用於......的步驟」的語言，否則本專利申請結尾處的專利申請專利範圍不旨在根據35 U.S.C. § 112(f)來解釋。本文所描述的系統和方法涉及改進電腦功能，並改進常規電腦的運行。
方面
本揭露內容的以下方面僅是示例性的並且不旨在限制本揭露內容的範圍。
1. 一種校準系統，該校準系統被配置成經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性，該校準系統包括：第一基於MAM的儀器，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器，該第一基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置，該第一基於MAM的儀器被配置成接收第一樣品和參考標準品，並且該第一基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型；與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第一MAM迭代來確定與該（多種）第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品，並且所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該（多種）第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數；第二基於MAM的儀器，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器，該第二基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，該第二基於MAM的儀器被配置成接收第二樣品和該參考標準品，並且該第二基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型；以及與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品，並且所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
2. 根據方面1所述之校準系統，其中，所述與該第一MS儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第一MAM迭代來確定品質屬性。
3. 根據方面2所述之校準系統，其中，該品質屬性係以下各項中的任一項：該第一樣品同種型、蛋白質或所鑒定雜質。
4. 根據方面2或方面3所述之校準系統，其中，該品質屬性限定以下各項中的任一項或多項：片段化、氧化、糖化、羥基化、序列變體、異構化、脫醯胺化、C-末端賴胺酸、O-連接的聚糖和/或N-連接的聚糖。
5. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，所述與該第一MS儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成生成包括該品質屬性的報告。
6. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一儀器模型不同於該第二儀器模型。
7. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一組設置不同於該第二組設置。
8. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一組校正因數基於該第一參考標準品同種型的離子強度值和該第一參考標準品同種型的第一參考標準品豐度值。
9. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一組校正因數校準與該第一組樣品豐度值相關聯的響應因數以確定該第一樣品同種型的該離子強度值。
10. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一組樣品豐度值進一步基於該第一樣品同種型的離子強度值。
11. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一基於MAM的儀器為質譜（MS）儀器。
12. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一基於MAM的儀器為三重四極儀器。
13. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，與該第一MS儀器相關聯的一個或多個處理器經由電腦網路通信地耦合至所述與該第二MS儀器相關聯的一個或多個處理器。
14. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器係所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器。
15. 根據前述方面中任一項所述之校準系統，其中，該第一基於MAM的儀器位於第一地理位置處的第一實驗室處，並且該第二基於MAM的儀器位於第二地理位置處的第二實驗室處。
16. 一種用於經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性之校準方法，該校準方法包括：在包括第一檢測器的第一基於MAM的儀器處接收第一樣品和參考標準品；經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型；經由與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器在第一MAM迭代內確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品；經由所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數，並且其中，該第一基於MAM的儀器包括由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置；在包括第二檢測器的第二基於MAM的儀器處接收第二樣品和該參考標準品；經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型；經由與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器在第二MAM迭代內確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品；經由所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，該第二基於MAM的儀器包括由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
17. 一種用於經由執行時間信號強度校準在多個時間段內減小基於MAM的儀器的差異性的校準方法，該校準方法包括：在第一時間段內在基於MAM的儀器處接收第一樣品和參考標準品；經由該基於MAM的儀器的檢測器在該第一時間段內檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型；經由一個或多個處理器在該第一時間段內在第一MAM迭代內確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品；經由該一個或多個處理器在該第一時間段內經由該第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數，並且其中，在該第一時間段內該基於MAM的儀器包括由第一組設置限定的第一儀器條件；在第二時間段內在該基於MAM的儀器處接收第二樣品和該參考標準品；經由該基於MAM的儀器的檢測器在該第二時間段內檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型；經由該一個或多個處理器在該第二時間段內在第二MAM迭代內確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品；以及經由該一個或多個處理器在該第二時間段內經由該第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，在該第二時間段內該基於MAM的儀器包括由第二組設置限定的第二儀器條件，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
18. 根據方面17所述之校準系統，其中，該一個或多個處理器確定品質屬性。
19. 根據方面18所述之校準系統，其中，該品質屬性係以下各項中的任一項：該第一樣品同種型、該第二樣品同種型、蛋白質或所鑒定雜質。
20. 根據方面17至19中任一項所述之校準系統，其中，該一個或多個處理器被配置成生成包括該品質屬性的報告。
21. 根據方面1所述之校準系統，其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的該方差值減小至少25%。
22. 根據方面16所述之校準方法，其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的該方差值減小至少25%。
23. 根據方面17所述之校準方法，其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的該方差值減小至少25%。
24. 根據方面1所述之校準系統，其中，該第一樣品屬於蛋白水解肽，該第二樣品屬於該蛋白水解肽，並且該參考標準品屬於該蛋白水解肽。
25. 根據方面16所述之校準方法，其中，該第一樣品屬於蛋白水解肽，該第二樣品屬於該蛋白水解肽，並且該參考標準品屬於該蛋白水解肽。
26. 根據方面17所述之校準方法，其中，該第一樣品屬於蛋白水解肽，該第二樣品屬於該蛋白水解肽，並且該參考標準品屬於該蛋白水解肽。
附加揭露內容
如本文所描述的，提供了用於藉由將參考標準品中的每種屬性的已知豐度用作校準物來確定每種屬性的豐度的新校準系統和方法。參考標準品中的大多數品質屬性在標準品的整個壽命內保持不變並且因此可以充當用於校正儀器或樣品製備程序之間的差異的校準物。由於在典型的MAM方法中通常收集參考標準品數據以實現同一性和系統適用性目的，所以不需要分析者進行附加工作。利用這種方法，不再需要一致儀器模型。同時，實驗室之間的細微消化程序變化以及藉由自動化進行的改變將不會顯著影響測定結果。
屬性的分類
基於屬性的豐度在樣品製備期間是否可能發生變化，出於MAM的目的，將每種屬性分類為三種類型之一，該等類型包括1型屬性、2型屬性和3型屬性。
1型屬性在樣品製備期間不發生變化。實例包括序列變體、賴胺酸和脯胺酸羥基化等。當樣品在樣品製備期間未經歷極低pH時，可以將大多數糖基化分類到此組中。
2型屬性的豐度在樣品製備期間可能減小。實例包括由於修飾的不穩定性導致的磷酸化。因為2型屬性的反應（例如，磷酸化損失）底物通常是次要組分（例如，磷酸化的肽），所以2型屬性在樣品製備期間的絕對變化很小。特殊的2型屬性係剩餘的N-末端麩醯胺。當蛋白質的N-末端係麩醯胺殘基時，其通常會環化以形成作為主要組分的焦麩胺酸。作為次要組分的N-末端麩醯胺在此項工作中被認為係焦麩胺酸的經修飾形式。N-末端麩醯胺係2型屬性，因為在樣品製備期間可能發生環化以減小游離N-末端麩醯胺的豐度。
3型屬性的豐度在樣品製備期間可能增大。3型屬性包括氧化、脫醯胺化、天冬胺酸異構化、片段化等。因為3型屬性的反應底物係主要的未經修飾的肽，所以其在樣品製備期間的絕對變化可能相當高。
如稍後將討論的，通常可以以高精度和低定量限度來測量1型和2型屬性，因為結果的變化僅僅或主要來自LC-MS測量結果。另一方面，3型屬性具有較低的精度和較高的定量限度，因為樣品製備的變化有助於最終結果的變化。
符號
可以將本文所使用的符號總結如下：A 表示同種型的豐度，以分數值（或百分比）表示。I 表示同種型的測得的離子強度（選擇離子層析圖中峰值下面的面積）。K 表示響應因數，並且a 表示響應因數的校正因數。上標0 表示參考標準品（RS）。例如，A 0 表示RS中的同種型的已知豐度，並且I 0 表示RS中的同種型的測得的離子強度。下標0、1、2、...i、...n 表示與指定殘基（包括未經修飾的形式）相關聯的n +1種同種型。下標0表示最高豐度的同種型（通常是未經修飾的形式）。例如，Ai 表示同種型i 的豐度，Ii 表示同種型i 的離子強度，ki 表示同種型i 的響應因數，並且ai 表示同種型i 的響應因數校正因數。a 0 的值被限定為1。當除主要同種型之外僅存在一種同種型（n = 1）時，下標1在某些方程中可以省略。注意，當在本報告中提到同種型i = 0、1、......n 時，無論是否明確說明，該等同種型通常與單個殘基相關聯。例如，可以存在與肽中的Asn殘基相關聯的三種同種型，包括未經修飾的Asn、其脫醯胺化形式和其琥珀醯亞胺形式。然而，同一肽上的被氧化的Met殘基可以屬於不同的一組同種型（例如，假設這兩種修飾係隨機的並且因此彼此獨立）。
常規 MAM
在常規MAM方法中，在以下常規假設下基於經修飾肽和未經修飾肽的MS響應（例如，選擇離子層析圖中的峰值下面的面積）來計算每種屬性的豐度（例如，肽中的胺基酸殘基的不同修飾狀態）： 1. 在每個樣品內，與胺基酸殘基相關聯的所有同種型具有同一響應因數（所有響應因數的比率 = 1） 2. 人工誘導的屬性變化可忽略不計
假設胺基酸殘基具有n +1種修飾狀態（0、1、...、n ），則存在與感興趣的殘基相關的n +1種肽同種型。最高豐度的同種型（通常是未修飾的）被表示為i = 0。每種同種型的豐度係基於以下方程(3)來計算的：
在上文的方程(3)中，k 係肽的所有同種型的響應因數（例如，基於上文的常規假設1的恒定值），並且Ai 和Ii 分別係同種型i 的豐度和MS強度。響應因數k 表示肽回收和每種同種型的MS響應兩者的組合。
求解方程(3)得到方程(4)：
方程(4)表明，每種同種型的豐度藉由同種型的MS強度除以所有同種型的MS強度之和來計算。
由於上文所描述的假設，常規MAM方法必須滿足以下要求： 1. 消化效率必須係可再現的。 2. MS儀器條件必須相同。 3. 樣品製備必須引進最少量的人工修飾。
然而，在現實世界中，至少由於以下原因而很難滿足以上要求： 1. 由於樣品製備程序、分析者習慣、設備和試劑品質等的變化，肽回收可能發生變化。 2. 由於在MS儀器模型、儀器設置和維護儀器的方式的差異，不同肽同種型的響應因數可能不同。 3. 由於樣品製備程序、分析者習慣、設備和試劑品質以及儀器條件的變化，人工引入的修飾的量可能不同。
由於常規MAM要求的以上困難，需要新方法來克服該等挑戰以確保MAM的長期成功。
使用參考標準品校準響應因數
在MAM中，參考標準品通常與樣品並行分析以實現系統適用性和同一性目的。因為參考標準品中的大多數品質屬性在標準品的整個壽命內保持不變，所以參考標準品可以充當用於校正儀器或樣品製備程序之間的差異的校準物。可以使用常規MAM方法或者具有更高準確度的正交方法來建立參考標準品中的每種屬性的豐度。如果參考標準品中的屬性豐度係藉由具有絕對定量的分析性方法確定的，則同一屬性的所有後續MAM分析在響應因數校準之後也變為絕對測量結果。
在每次運行中將參考標準品用作校準物，可以消除關於實驗室之間和儀器之間可再現性的對常規MAM的大多數要求。在這種實施方式中，然後將如本文上文所描述的常規的兩個假設修改如下，即，修改後的假設： 1. 在同一LC-MS序列內，所有同種型中的響應因數的比率保持不變。 2. 人工誘導的屬性變化可忽略不計。
注意，在第一修改後的假設中，不是要求所有肽同種型在產品的壽命內具有同一響應因數（所有響應因數的比率 = 1），而是該假設僅要求響應因數比率在同一LC-MS序列（同一分析者、同一儀器以及同一天）內係恒定的。
根據新的修改後的假設，不再假設每種同種型具有同一響應因數。相反，假設在參考標準品和樣品兩者中，藉由同一校正因數ai 來修改同種型i 的響應因數。因此，參考標準品中的同種型i 的響應因數表示為ai k0 （其中，上標0代表參考標準品），並且樣品中的同種型i 的響應因數表示為ai k 。在考慮參考標準品和樣品兩者之後，方程(3)變為方程(5)，該方程(5)與本文所描述的方程(2)相同：
在一些實施方式中，由於樣品製備的微小差異、儀器靈敏度的差異等，參考標準品和樣品的響應因數可能不同。另外，對於可求解的方程，該等同種型之一的因數a 通常被設置為常量值。將哪種同種型設置為常量a 並不重要。一種好的方法係將其設置為最高豐度的同種型（其通常是未經修飾的形式（a0 = 1））。
求解方程(5)得到方程(6)，該方程(6)與本文所描述的方程(1)相同：
可以將方程(6)用於基於參考標準品中的已知屬性豐度（）來計算每種同種型的校正因數（ai ），並且計算樣品中的每種同種型的豐度（Ai ）。為了使參數ai 具有定義明確的值，分母不得接近於零。因此，為了實現成功的響應因數校準，參考標準品中的每種屬性必須具有足夠高的豐度（Ai 0 ）才能進行精確量化。
使用參考標準品校準人工修飾
由於一些屬性的不穩定性導致的修飾損失（2型）或者由於該等修飾的人工形成（3型），一些屬性（包括如磷酸化等2型屬性以及如氧化、脫醯胺化、Asp異構化和片段化等3型屬性）可能在樣品製備期間改變其豐度。屬性的該等人工變化引起分析者到分析者和逐日差異性，並且可以藉由將參考標準品用作校準物來進行校正，條件係該等人工變化的程度在同一LC-MS序列中係一致的。
在用因數bi 表示每種同種型的人工變化的程度的實施方式中，然後在考慮參考標準品和樣品兩者之後，方程(3)變為方程(7)：
在方程(7)中，Si 表示產生同種型i 的人工修飾的底物。例如，對於氧化和脫醯胺化（3型屬性），底物係未經修飾的肽。然而，對於磷酸化（2型屬性），由於可能的修飾不穩定性，底物係經修飾的（磷酸化的）肽。
取決於底物的性質，方程(7)可能會變複雜。例如，將方程(7)用於同一殘基上的多種修飾，如天冬醯胺殘基上的N-糖基化可以產生方程(7)的複雜變體。
如本文所描述的，對於具有單一修飾的殘基，可以將方程(7)簡化為方程(8)和/或方程(9)，這取決於底物係經修飾的肽（2型）還是未經修飾的肽（3型）。如在下文的實施方式中所示出的，對於方程(8)和(9)，右邊方程部分係左邊方程部分的解。
具體地，對於2型屬性並且關於方程(8)：
對於3型屬性並且關於方程(9)：
在方程(8)中，如果人工修飾的量遠小於未經修飾的形式（即，b ＜＜ 1）（這通常適用於大多數2型屬性），則可以將方程(8)估計為方程(10)：
當a 1 = 1 +b 時，方程(10)類似於方程(5)。也就係說，在這種實施方式中，消化期間的修飾損失可以藉由響應因數校準來建模，並且方程(8)和(5)將產生非常類似的結果。
為了使參數b 和屬性豐度A 具有定義明確的值，分母不得接近於零。因此，要使用方程(8)，參考標準品中的屬性的豐度（A 0 ）就必須遠大於0。要使用方程(9)，A 0 就必須遠小於1（100%），並且b 不得接近於1。另外，為了使方程(9)具有一般意義，b 的值必須遠小於未進行校準的屬性的豐度（b ＜＜I /(I 0 +I )）。否則，校準後的豐度A將接近於零並且有時為負值。
使用兩種不同的標準品校準響應因數和人工修飾兩者
可以將參考標準品用於校正響應因數（a ）（即，「a-校準」）和/或者人工修飾（b ）（即，「b-校準」）。校正a 和b 兩者需要附加標準品。為了獲得不同的標準品，可以緊迫參考標準品或另一樣品以產生含有較高水平的感興趣屬性的另一標準品，並且然後將兩種標準品與樣品一起進行分析。可以將這兩種標準品的已知屬性豐度及其確定的MS響應用於校正a 和b 兩者。
當考慮兩種標準品以及樣品時，可以使用上標零來表示參考標準品並且可以使用上標1來表示緊迫標準品。方程(11)和(12)展示了代表性方程，這取決於人工修飾的底物。注意，方程(11)和(12)適用於具有單一修飾的殘基。
對於2型屬性並且關於方程(11)：
對於3型屬性並且關於方程(12)：
如上文針對方程(11)和/或(12)所示出的，為了使參數a 和參數b 具有定義明確的值，分母不得接近於零。因此，方程(11)要求，並且方程(12)要求且。類似於方程(9)，為使方程(12)有意義，b 的值必須遠小於未進行b -校準的屬性的豐度（b ＜＜I /(aI 0 +I )），否則，校準後的豐度A 將接近於零並且有時為負值。
抗鏈黴親和素 IgG2 的多屬性分析的實例
如本文所描述的，已經經由本揭露內容的校準系統和方法的特定應用將各個示例實施方式付諸實踐。然而，應理解的是，本揭露內容的校準系統和方法不限於特定應用。例如，重組型抗鏈黴親和素IgG2由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系表達。抗鏈黴親和素IgG2材料被用作參考標準品。為了產生用於分析的測試樣品，將參考標準品在大約40ºC下孵育約30天以產生樣品1，並且然後藉由將樣品1與參比標準品以不同比率混合來產生樣品2和樣品3（參見表2）。
使用以下程序用胰蛋白酶來消化IgG2參考標準品和測試樣品（每種約120 μg）。首先，在含有6.5 M鹽酸胍（賓夕法尼亞州斯特勞茲堡萬安精細化學品公司（Macron Fine Chemicals））和0.2 M Tris（加利福尼亞州霍利斯特天惠華公司（TEKnova））的pH為7.5的變性溶液中，在大約25ºC下用8 mM二硫蘇糖醇將每種樣品處理約30分鐘以還原二硫鍵。然後，在黑暗環境中在大約25ºC下用14 mM碘乙酸將還原後的IgG2烷基化約20分鐘。用6 mM DTT淬滅烷基化反應。
為了在樣品製備程序中有意產生某種差異，使用兩種不同的方法用胰蛋白酶來消化每種經還原/烷基化的樣品。在第一種方法中，例如根據製造商的推薦程序，使用Bio-Rad（加利福尼亞州赫拉克勒斯公司（Hercules））Bio-Spin(r)6柱將經還原/烷基化的樣品（IgG2濃度為約1.2 mg/mL）交換到含有大約0.1 M Tris和大約50 mM甲硫胺酸的消化緩衝液（pH 7.5）中。在緩衝液交換之後，加入適量的胰蛋白以實現大約1:12的酶:底物比率，然後在大約37ºC下孵育約60分鐘。在8 M鹽酸胍中使用等體積的大約0.25 M乙酸鹽緩衝液（pH 4.8）來淬滅消化。消化物中的最終IgG2濃度為約0.5 mg/mL。
在第二種方法中，使用Microcon-30kDa過濾器（麻塞諸塞州伯靈頓密理博西格瑪公司（Millipore Sigma））將每種經還原/烷基化的樣品交換到同一消化緩衝液中。首先，將每種經還原/烷基化的樣品在大約14000 g下旋轉沈降，並且棄去流出物（flow-through）。在某些實施方式中，每次向過濾器加入250 µL消化緩衝液後將該過程重複三次。在同一過濾器上藉由以下進行胰蛋白酶消化：加入140 µL消化緩衝液和10 µg胰蛋白酶（以1 mg/mL），然後在大約37ºC下孵育約60分鐘。消化後，向過濾器加入等體積的淬滅溶液，並且在大約14000 g下旋轉沈降以在新的接收管中收集肽。根據上文的程序，消化物中的最終IgG2濃度為約0.4 mg/mL。
表2示出了在示例中使用的抗鏈黴親和素IgG2樣品。 [表 2 ]
在抗鏈黴親和素IgG2和/或類似的實施方式中，在由連接至質譜儀，例如賽默飛費科技（Thermo Scientific）Q Exactive Plus Biopharma質譜儀或者Orbitrap Fusion Lumos質譜儀的安捷倫（Agilent）（加利福尼亞州聖克拉拉）HPLC系統構成的三個LC-MS/MS系統中的每一個上分析每種消化物。還使用了附加的或替代性的系統，如本文中的揭露內容，不限於任何一種類型的系統、質譜儀等。在一些實施方式中，為了在液相層析條件中有目的地引入某種差異，使用了兩種不同的LC方法（參見表3）。
對於第一種LC方法（例如，表3中的系統A和系統B），使肽在沃特世（Waters）（麻塞諸塞州米爾福德）Acquity肽CSH柱（150 × 2.1 mm、1.7 μm顆粒、孔徑170 Å）上以大約0.3 mL/分鐘的流速進行洗脫，其中柱溫保持處於大約60ºC。流動相A為水中的0.1%甲酸，並且流動相B為乙腈中的0.1%甲酸。在大約0.5%的B下初始保持約5分鐘之後，流動相B總體上在約40分鐘內線性增加至大約35%。藉由在約4分鐘內將流動相B增加至大約99%，保持約1分鐘來實現柱洗滌。用大約0.5%的B使柱平衡約15分鐘。對於第二種LC方法（例如，表3中的系統C），使肽在沃特世Acquity BEH C18柱（2.1 × 150 mm、1.7 μm顆粒）上以大約0.3 mL/分鐘的流速進行洗脫，其中柱溫保持處於約60ºC。流動相A為水中的0.1%甲酸和約0.02%三氟乙酸（TFA），並且流動相B為乙腈中的0.1%甲酸和0.02% TFA。在大約0.5%的B下初始保持約5分鐘之後，相B總體上在約40分鐘內線性增加至大約40%。藉由在約4分鐘內將相B增加至大約99%，保持約1分鐘來實現柱洗滌。用大約0.5%的B使柱平衡約15分鐘。
將HPLC系統藉由電灑介面直接連接至質譜儀，例如，賽默科技Q Exactive Plus Biopharma質譜儀（例如，系統A）或賽默科技Orbitrap Fusion Lumos質譜儀（例如，系統B和系統C）。雖然本文的實施方式描述了賽默科技Q Exactive Plus Biopharma質譜儀和/或賽默科技Orbitrap Fusion Lumos質譜儀，但是應理解的是，根據本文所揭露的實施方式可以使用類似的（多種）質譜儀。將Q Exactive Plus Biopharma設置為以約70,000的解析度和AGC = 1×106 執行全掃描MS，然後係對最高豐度離子的五次數據依賴性MS/MS（高能碰撞解離（HCD）歸一化碰撞能量 = 27）。對於Fusion Lumos，以約60,000的解析度和AGC = 4×105 來收集全掃描MS數據，然後係離子阱中的最高速度數據依賴性MS/MS（CID歸一化碰撞能量 = 30）。藉由分析軟體，例如賽默科技Xcalibur軟體來完成儀器控制和數據收集。注入約3 µg至4 µg的每種胰蛋白酶消化物用於分析。當然，根據本文所揭露的實施方式可以使用與Xcalibur軟體類似的軟體。
在如可以BiopharmaFinderTM 購自賽默飛科技的分析軟體MassAnalyzer上處理LC-MS/MS數據。如MassAnalyzer等分析軟體能夠以全自動化的方式執行特徵提取、保留時間比對、肽鑒定和屬性量化。對於肽鑒定，分析軟體，例如MassAnalyzer可以依賴於實驗性MS/MS與精確預測的理論性MS/MS的比較。使用匹配窗函數來提取選擇離子層析圖以最大化層析圖中的信噪比。作為最終輸出，分析軟體，例如MassAnalyzer）可以產生所鑒定變體的列表。應理解的是，根據本文所揭露的實施方式可以使用與MassAnalyzer類似的分析軟體。
對融合蛋白的多屬性分析的實例
由CHO細胞表達的重組融合蛋白（例如，第一蛋白質或蛋白質片段與至少第二蛋白質或其片段重組融合，通常使連接子與蛋白質/片段連接）可以在如蘇胺酸殘基和絲胺酸殘基上包含多個糖基化位點。該等O-聚糖可能對分子的異質性貢獻最大。在此示例中，多屬性方法用於量化融合蛋白中的該等糖型。
對於蛋白水解消化，首先在大約1 mg/mL的蛋白質濃度下使融合蛋白在含有大約7.5 M鹽酸胍、大約250 mM tris（pH 7.5）和大約2 mM EDTA的溶液中進行變性。在蛋白水解消化之前，將大約2 µl的500 mM DTT溶液加入到大約100 µL的變性蛋白質溶液中，然後在大約25ºC下孵育約30分鐘以還原二硫鍵。然後，加入大約4 µL的500 mM碘乙酸鈉，然後在約25ºC下孵育約20分鐘以烷基化半胱胺酸側鏈。在藉由Bio-Rad Bio-Spin脫鹽柱使緩衝液交換到100 mM tris、50 mM甲硫胺酸、pH 7.5的溶液後，用大約5 µg的胰蛋白酶將每50 µg的脫鹽樣品在大約37ºC下消化約30分鐘。為了淬滅消化，將大約2%的甲酸加入到每個消化物中以使最終酸濃度為大約0.2%。
使用由直接與質譜儀（例如，Thermo Scientific Exactive plus質譜儀或Q Exactive plus高解析度質譜儀）連接的Agilent HPLC構成的LC-MS系統來分析每種胰蛋白酶消化物（約3 µg）（參見表3）。在Agilent Zorbax C18 RR HD柱（2.1 × 150 mm、1.8 µm顆粒、孔徑為300 Å）上以大約0.2 mL/分鐘的流速洗脫肽，柱溫保持在50ºC。流動相A為水中的大約0.1%的甲酸，並且流動相B為乙腈中的0.1%的甲酸。從大約1.0%開始，流動相B在約70分鐘後線性增加到大約40%並且在約76分鐘時增加到大約90%。在大約90%下洗滌約5分鐘後，用大約1%的B使柱平衡約11分鐘。以140,000的解析度收集全掃描MS數據，並且將自動增益控制（AGC）目標設定為1 x 10。例如藉由Thermo Scientific Xcalibur軟體來完成儀器控制和數據收集。
例如藉由Thermo Scientific Pinpoint軟體和Chromeleon軟體來分析數據以鑒定和相對定量翻譯後修飾。使用HCD和電子轉移解離（ETD）藉由MS/MS來表徵O-糖肽列表，其中，通常發現六種糖型。Pinpoint可以生成具有六種形式的O-糖肽的準確質量和同位素分佈的工作簿。將該工作簿導入到Chromeleon軟體中，其中，其藉由保留時間、準確質量以及同位素分佈來靶向MS1前體離子。在Chromeleon中構建選擇離子層析圖，並且將每個峰整合為峰面積。手動確認每個峰的整合以確保準確性。
表3展示了如所描述的示例LC-MS系統和測量結果。 [表 3 ]
響應校準的實例
使用被配置成實施本文所描述的一個或多個方程的分析軟體（如Microsoft(R)（華盛頓州雷德蒙德（Redmond,WA））Excel(R)）進行響應校準。藉由分析軟體（例如，MassAnalyzer）來處理抗鏈黴親和素相關數據。由於MassAnalyzer直接輸出每種屬性的未經校準的豐度，並且該等未經校準的豐度與相應MS強度（峰面積）成比例，因此將其在相應計算中視為MS強度。使用Thermo Scientific Chromeleon來處理Fc-融合蛋白數據，其中，每種屬性的峰面積被確定並且用作MS強度以進行相應計算。通常的做法係對參考標準品樣品進行至少兩次分析（以歸類樣品）。為了反映現實世界性能，在計算中使用兩個參考標準品運行的平均MS強度。
抗鏈黴親和素 IgG2 中大量屬性的測量的實例
在此示例中，證明了對如本文所揭露的校準系統和方法的性能的綜合評估。將抗鏈黴親和素IgG2參考標準品在大約40ºC下孵育約四周。然後分別將大約10%和大約20%的此緊迫樣品摻入到參考標準品中，以產生另外兩個測試樣品（參見例如表2）。將這種測試樣品連同參考標準品以及緊迫樣品一起用胰蛋白酶一式三份地用兩種不同方案進行消化，並且用不同的柱、流動相、梯度和質譜儀在三種不同LC-MS系統（參見例如表3中示出的A、B和C）上對每種消化物進行分析。另外，對參考標準品和緊迫樣品各自在系統A上分析六次，並且將每種屬性的平均測量豐度用作參考豐度。藉由分析軟體（例如，MassAnalyzer）來處理所有數據，以獲得每種肽同種型的未經校準的豐度。將該等豐度用作MS強度以進行進一步校準。
由於系統A和系統B使用相同的層析條件，因此來自該等運行（例如，總共60次LC-MS/MS運行）的數據被一起處理，因為其具有一致的保留時間。例如，總共標識177種品質屬性並且將其量化為高於檢測極限（例如，如所有60次運行中的非零峰面積所示的）。這種屬性覆蓋廣泛的豐度水平，包括從0.001%到39%。這種屬性包括序列變體、羥基化、N-連接的聚糖和O-連接的聚糖、N-末端變體和C-末端變體、片段化、糖化、氧化、脫醯胺、琥珀醯亞胺形成等。將片段化與胰蛋白酶的非特異性活性在其在緊迫樣品中的增加水平方面進行區別（例如，當與參考標準品運行相比時，t-測試p-值 ＜ 0.005並且倍數變化 ＞ 2.0）。
校準響應因數的實例（ a 校準）
藉由使用參考標準品來進行響應因數校準（參見方程(5)和(6)），計算這三個樣品中177種屬性中的每一種的豐度。圖6展示了關於兩種不同的儀器設置和兩種不同的樣品製備程序的在樣品2中的兩種屬性的測得的豐度的圖示602。在響應因數校準之後，如本文所描述的，由樣品製備和儀器設置的差異引起的變化大大減小，如圖6的12個測量結果（即，A/1、A/2、B/1和B/2）的相對標準差（RSD）所示。具體地，圖6的實施方式藉由兩個LC-MS系統（例如，A和B）和兩種消化方案（/1和/2）描繪了重鏈Cys127Tyr序列變體（頂部）（604）和未糖基化的Asn289（底部）（606）的樣品2中在經響應因數校準和未經響應因數校準的情況下的測得的豐度。在響應因數校準之後（參見方程(6)），儀器和樣品製備程序之間的差異大大減小，如RSD值605和607所示。
圖7展示了圖示702，該圖示描繪了三種屬性類型的在經響應因數校準（704）和未經響應因數校準（706）的情況下（參見方程(6)）的中間精度（例如，由RSD所示）的示例比較。如在圖7中所示出的，在校準大約86%的所監測屬性之後，中間精度得到了大大提高。圖7的值的形狀表示屬性的類型，並且開放形狀值表示在將被精確量化的參考標準品中具有足夠高豐度的屬性（序列內RSD ＜ 10%）。
具體地，圖7示出了在經響應因數校準（704）和未經響應因數校準（706）的情況下三種樣品中的所有177種屬性（120種1型屬性、12種2型屬性和45種3型屬性）的所確定RSD（根據如在圖6中所示出的在兩種消化方案和兩種儀器設置的情況下的12個測量結果）。圖7表示總共177 × 3 = 531個數據點，每個數據點具有12個測量結果。大多數數據點（457個或86%）的RSD在響應因數校準之後減小。在這531個數據點中，RSD ＜ 10%的點的數量從校準前的64（12%）增加至校準後的205（39%）。在該等之中，在圖7的實施方式中，1型屬性從55個增加至171個，2型屬性從2個增加至36個，3型屬性從7個增加至19個。在具有良好中間精度（RSD ＜ 10%）的這205個數據點中，83%（205個中的171個）係1型屬性。
如前所討論的，響應因數校準要求參考標準品中的屬性的豐度通常足夠高才能進行準確量化。在圖7中，豐度比標準差高10倍（序列內RSD ＜ 10%）的屬性用開放形狀值標記。例如，至少在圖7的實施方式中，校準後RSD低於10%的大多數屬性在參考標準品中具有高豐度（即，開放形狀值）。
校準人工修飾的實例（ b 校準）
對於關於2型和3型屬性的實施方式，可以將方程(8)用於2型屬性並且將方程(9)用於3型屬性來校準不同樣品製備條件之間的人工修飾變化。
例如，圖8展示了對2型屬性的人工修飾的校準的實施方式的圖示802，該圖示示出了與響應因數a校準類似的結果。具體地，圖8展示了校準後的2型屬性的中間精度（例如，三個樣品中的兩種屬性產生六個測量結果（806））的提高，將該中間精度與在響應因數校準之後的RSD（804）進行比較。根據本文所描述的實施方式，這兩種校準方法產生非常類似的RSD。
圖9展示了與響應因數a校準相比較的對3型屬性的人工修飾b校準的性能的圖示902。如圖9所展示的，對於3型屬性，對人工修飾（904）的校準提高了大多數測量結果的中間精度。對於校準參數b接近未經校準的屬性豐度I /(I 0 +I )的屬性，經校準的豐度A （參見方程(9)）將如此接近於零，以至於其可能顯著影響RSD值。為了在不同的校準方法之間進行公平比較，藉由將經校準的豐度的標準差除以平均經a校準的屬性豐度來計算RSD。與響應因數校準（a校準）相比，當未經校準的RSD（906）低於50%時，人工修飾校準（b校準）產生類似的性能。當未經校準的RSD高於50%時，與a校準相比，b校準性能可能變得不太有效，並且當未經校準的RSD接近100%時，校準人工修飾使得結果較不一致（例如，較高的RSD）。
校準響應因數（ a ）和人工修飾（ b ）兩者的實例
在一些實施方式中，當藉由緊迫參考標準品容易獲得第二標準品時，可以針對3型屬性校準響應因數和人工修飾兩者。圖10展示了與單標準品響應因數（a）校準相比較的針對3型屬性的雙標準品校準（a和b）的性能的實施方式的圖示1002。具體地，圖10示出了與無校準（1006）相比的藉由將參考標準品和緊迫樣品（樣品1）用作兩個標準品並且將樣品2和3用作樣品進行的校準（1004）的性能。藉由將經校準的豐度的標準差除以平均經a校準的屬性豐度來計算RSD。圖10表明，雙標準品校準的性能通常優於單標準品響應因數校準，但是改進程度可能很小，並且在這種但不是所有的情況下，可能無法證明在給定產物的壽命內維持第二參考標準品。
用由迥然不同的 LC-MS 系統產生的數據進行的實例響應因數校準
圖11展示了圖示1102，該圖示描繪了藉由響應因數校準而在兩個不同的LC-MS系統中收集的兩個數據集的一致性方面取得改進。具體地，圖11展示了在經響應因數校準（1114）和未經響應因數校準（1116）的情況下藉由系統A（1104）和系統C（1106）比較所確定的屬性豐度。圖11進一步展示了在經校準和未經校準的情況下比較兩個數據集的中間精度（RSD）。如在圖11中所描繪的，開放形狀值表示參考標準品中的豐度為標準差的至少10倍的屬性（例如，序列內RSD ＜ 10%）。
換言之，圖11展示了基於LC-MS數據分析的響應因數校準的性能，其中，使用兩種不同的LC方法和兩個不同的MS系統（系統A（1104）和系統C（1106））來收集LC-MS數據，其中，藉由兩個不同的程序進行樣品製備。在圖11的實施方式中，在經響應因數校準（1114）和未經響應因數校準（1116）的情況下將所確定屬性豐度彼此比較。
如在圖11中所示出的，使用不同的方法來分析樣品可以檢測和鑒定不同的一組屬性，其中有117種係共同屬性。在圖11中，在經a校準和未經a校準的情況下，對三個樣品中的117種屬性的測量產生351個數據點，並且藉由這兩種方法產生對應的所確定豐度。在圖11（上圖）（1103）中展示了這種值。如在圖11中所示出的，即使這兩個LC-MS系統完全不同，校準也大大地提高了測量結果的一致性。圖11（下圖）（1113）示出了對這117種屬性的響應因數校準之後的中間精度提高。可以用同一儀器和方法來精確測量該等屬性中的許多屬性（示為開放形狀值）。
然而，當在不同的系統上測量這種屬性時，結果不一致，如在橫軸（未經校準的）中從10%至100%的較大RSD值所示。該等測量結果中的大多數在校準後再次變得一致，如其在縱軸上小於10%的RSD值所示。
融合蛋白的實例聚糖圖譜
在此示例中，融合蛋白含有具有六種不同的糖型的兩個O-連接的糖基化位點。三位分析者在三個LC-MS系統上在四次運行中將具有未知糖型豐度的樣品與參考標準品一起分析（參見表3）。在Chromeleon上處理所有數據，以得到感興趣的每種肽的峰面積。使用常規方法（方程(4)）以及響應因數校準（方程(6)）來量化每種糖型的豐度。為了確定參考標準品中的每種屬性的豐度，藉由常規MAM對參考標準品進行六次分析，並且將六個測量結果的平均值用作參考標準品中的已知豐度。
圖12展示了圖示1202，該圖示示出了四個序列（1206）中的糖型（SAHexHexNAc）的測得的豐度（1204），每個序列一式為三。在響應因數校準（方程(6)）之後，儀器之間變化大大地減少。還如在圖12（下圖）中所示出的，針對六種糖型（1216）的響應因數校準將RSD（1214）從最大值21%減小至最大值5%（SA：唾液酸或N-乙醯神經胺酸；Hex：己糖；HexNAc：N-乙醯基己糖胺）。具體地，圖12（上圖）（1203）示出了在經響應因數校準和未經響應因數校準的情況下的該等糖型之一的12個測得的豐度（在4個序列1206中進行一式三份分析）。儘管測得的豐度在同一序列內具有高可再現性，但是這種測得的豐度會在序列之間顯著變化。響應因數校準消除了儀器之間的差異。圖12（下圖）（1213）在未經校準和經校準的情況下比較了所有六種糖型的中間RSD。在未經校準的情況下，該等糖型的RSD介於2.4%與21%之間。在校準之後，RSD減小到不超過5%。
校準
在一些但不是所有實施方式中，使用校準方法來計算屬性豐度可能需要對參考標準品中每種同種型的離子強度的附加測量。該等附加測量可能會在最終的屬性豐度計算中引入附加誤差。如果由該等附加測量引起的誤差小於實驗室與儀器之間的變化，則可以實現提高中間精度。
在一些但不是所有實施方式中，為了能夠在校準後提高測量精度，必須確定參考標準品中每種同種型的離子強度。這就要求感興趣的屬性必須在參考標準品中具有足夠高的豐度。作為一般規則，屬性豐度應該係測量的標準差的至少十倍（例如，如本文所描述的圖7、8、9和10中的開放形狀值所示出的）。
對於涉及3型b校準的實施方式（方程(9)），計算屬性豐度A 可以涉及取未經校準的屬性豐度I /(I 0 +I )與屬性豐度b 之間的差。如果b 的值接近I /(I 0 +I )，則計算A 涉及取兩個較大的數的差來導出非常小的數，這可能會產生較大的誤差。在極端情況下，b 的值可能會大於I /(I 0 +I )並且會獲得A 的負值。這可能會使3型屬性的b校準不太穩健。對於在方程(12)中所示的3型屬性的a校準和b校準也是如此。
在一些實施方式中，響應因數的差異（其包括消化效率和儀器響應兩者）可能是主要關注點，因為HPLC和MS儀器的演變以及樣品製備中的自動化係不可避免的。人工修飾通常是可以控制的（如本文所描述的）並且不是大的關注點。因此，當比較三種校準方法時，因為響應因數校準（a校準）的穩健性和對所有三種類型的屬性的適用性，所以其通常是最受青睞的。儘管能夠校正未藉由a校準來校正的樣品製備中的不一致性，但是當校正水平接近屬性豐度時，關於3型屬性的人工修飾校準（b校準）通常不太穩健。在一些實施方式中，由於數學上的相似性，對2型屬性進行b校準會產生與a校準類似的結果，並且因此可以用a校準來替代。另一方面，在一些但不是所有實施方式中，用兩種標準來校準響應因數和人工修飾（a校準和b校準）兩者可能由於需要針對產品的壽命的附加標準而不太實際。另外，進行a校準和b校準可能需要再進行兩次離子強度測量，這進一步增大了最終的屬性豐度結果的變化。因此，使用單標準來校準響應因數通常用於在cGMP環境中實施如本文所描述的新MAM系統和方法。
新MAM系統和方法比常規MAM更有優勢，因為新MAM系統和方法藉由執行時間響應校準而極大地減小了實驗室之間差異性。新MAM系統和方法有效地消除了需要MAM使用一致的裝設備，這係當前MAM工作流程中的主要問題。另外，因為在當前的工作流程中通常已經需要將參考標準品與樣品並行地分析，所以分析人員無需做附加工作。
如本文所描述的，使用方程(6)來校準響應因數消除了不同的肽同種型對具有相同的響應因數的需求。因此，新MAM系統和方法可以用於MAM的其他類型的儀器。例如，由於藉由常規MAM對不同的同種型的等效響應因數的需要，三重四極儀器上的選擇反應監測（SRM）由於在肽同種型中可能存在非常不同的片段化效率而不可接受。另一方面，新MAM系統和方法使得利用三重四極儀器成為可能，因為這種新MAM系統和方法不需要不同的肽同種型具有等效響應因數。然而，必須首先在高解析度儀器上建立參考標準品中每種屬性的豐度。
由於假設所有同種型具有相同的響應因數（該假設可能不適用於涉及電荷、疏水性或肽長度變化的修飾），因此常規MAM方法的一個缺點係測得的屬性豐度不是絕對的。只要響應因數在該方法的整個壽命內係一致的，此缺點通常就不是主要問題。然而，當參考標準品中的屬性豐度藉由具有絕對定量的技術確定時，根據新MAM方法確定的屬性豐度也就變為絕對值。
如針對本文中的各個實施方式所示的數據也可以用於產生關於MAM平台的定量限度（LOQ）的洞見。可以將LOQ定義為RSD低於10%的屬性的最小濃度。例如，圖13展示了圖示1302，該圖示示出了這三種屬性類型的屬性豐度（1306和/或1316）和序列內RSD（1304和/或1314）的關係。在圖13的實施方式中，對於1型屬性（上圖）（1303），當從其他主要肽中很好地分辨出次要同種型時，大多數屬性的RSD（1304）在低至0.003%（LOQ = 0.003%）的豐度（1306）處低於10%。如果未從主峰中很好地分辨出同種型，則由於此工作中所使用的質譜儀的有限掃描內動態範圍，LOQ將會較高。然而，對於2型和3型屬性（下圖）（1313），大多數低於0.1%的屬性具有 ＞ 10%的RSD（1314）並且大多數高於1%的屬性具有 ＜ 10%的RSD（1314），從而表明，LOQ通常介於約0.1%與約1%之間，這取決於樣品製備期間引入的變化量。
具體地，圖13示出了不同屬性類型的屬性豐度（1306和/或1316）和序列內RSD（n = 6）（1304和/或1314）的關係。對於圖13（上圖）（1303）的大多數1型屬性，序列內RSD低於10%，其中，豐度低至0.003%，從而表明，當屬性在樣品製備期間未發生變化時，LC-MS系統的定量限度低至0.003%。還如圖13（下圖）（1313）所示出，對於大多數2型和3型屬性，定量限度高得多（0.1%至1%）。
附加方面
本揭露內容的以下附加方面僅是示例性的並且不旨在限制本揭露內容的範圍。以下附加方面可以被視為本揭露內容的其他方面的一部分、視為其補充或視為與其分離，藉由非限制性示例的方式包括作為方面1至26中任一方面的補充。
27. 一種校準系統，該校準系統被配置成經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性，該校準系統包括：第一基於MAM的儀器，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器，該第一基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置，該第一基於MAM的儀器被配置成接收第一樣品和參考標準品，並且該第一基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型，其中，該第一樣品具有第一製劑類型；與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品，並且所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數；第二基於MAM的儀器，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器，該第二基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，該第二基於MAM的儀器被配置成接收第二樣品和該參考標準品，並且該第二基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型，其中，該第二樣品具有第二製劑類型，並且其中，該第一製劑類型不同於該第二製劑類型，從而引起該第一樣品與該第二樣品之間的差異，該差異由樣品製備期間對屬性豐度的人工改變引起；與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品，並且所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小，其中，(1)所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第一MAM迭代或者(2)所述與該第二基於MAM儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第二MAM迭代中的至少一項確定品質屬性以減小該第一樣品與該第二樣品之間的差異，該品質屬性與2型屬性或3型屬性相關聯。
28. 根據方面27所述之校準系統，其中，在製備該第一樣品或該第二樣品期間，該2型屬性引起豐度減小。
29. 根據方面27所述之校準系統，其中，在製備該第一樣品或該第二樣品期間，該3型屬性引起豐度增大。
30. 一種用於經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性之校準方法，該校準方法包括：在第一基於MAM的儀器處接收第一樣品和參考標準品，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器，並且該第一基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置；由該第一基於MAM的儀器的第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型，其中，該第一樣品具有第一製劑類型；由與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品；由所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數；由第二基於MAM的儀器接收第二樣品和該參考標準品，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器，該第二基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件；由該第二基於MAM的儀器的第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型，其中，該第二樣品具有第二製劑類型，並且其中，該第一製劑類型不同於該第二製劑類型，從而引起該第一樣品與該第二樣品之間的差異，該差異由樣品製備期間對屬性豐度的人工改變引起；由與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品；以及由所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小，並且其中，(1)所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第一MAM迭代或者(2)所述與該第二基於MAM儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第二MAM迭代中的至少一項確定品質屬性以減小該第一樣品與該第二樣品之間的差異，該品質屬性與2型屬性或3型屬性相關聯。
31. 根據方面30所述之校準方法，其中，在製備該第一樣品或該第二樣品期間，該2型屬性引起豐度減小。
32. 根據方面30所述之校準方法，其中，在製備該第一樣品或該第二樣品期間，該3型屬性引起豐度增大。
33. 一種校準系統，該校準系統被配置成經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性，該校準系統包括：第一基於MAM的儀器，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器，該第一基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置，該第一基於MAM的儀器被配置成接收第一樣品、參考標準品和緊迫標準品，並且該第一基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型、來自該參考標準品的第一參考標準品同種型以及來自該緊迫標準品的緊迫參考標準品同種型；與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品和該緊迫標準品，並且所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數；第二基於MAM的儀器，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器，該第二基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，該第二基於MAM的儀器被配置成接收第二樣品、該參考標準品和該緊迫標準品，並且該第二基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型、來自該參考標準品的第二參考標準品同種型以及來自該緊迫標準品的第二緊迫標準品同種型；以及與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品和該緊迫標準品，並且所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
34. 根據方面33所述之校準系統，其中，相比該參考標準品，該緊迫標準品含有更高水平的品質屬性。
35. 一種用於經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法（MAM）的實驗室之間或儀器之間差異性之校準方法，該校準方法包括：在第一基於MAM的儀器處接收第一樣品、參考標準品和緊迫標準品，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器，並且該第一基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置；由該第一基於MAM的儀器的該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型、來自該參考標準品的第一參考標準品同種型以及來自該緊迫標準品的緊迫參考標準品同種型；由與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品和該緊迫標準品；由所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數；在第二基於MAM的儀器處接收第二樣品、該參考標準品和該緊迫標準品，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器，該第二基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件；由該第二基於MAM的儀器的第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型、來自該參考標準品的第二參考標準品同種型以及來自該緊迫標準品的第二緊迫標準品同種型；由與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品和該緊迫標準品；以及由所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
36. 根據方面35所述之校準方法，其中，相比該參考標準品，該緊迫標準品含有更高水平的品質屬性。
100‧‧‧基於MAM的儀器 102‧‧‧質譜儀 110‧‧‧樣品 114‧‧‧離子源 116‧‧‧質量分析器 140‧‧‧檢測器 142‧‧‧計算設備 151‧‧‧電離 152‧‧‧離子 202‧‧‧參考標準品 204‧‧‧第一樣品 210‧‧‧第一基於MAM的儀器 220‧‧‧校準 252‧‧‧參考標準品 254‧‧‧第二樣品 260‧‧‧第二基於MAM的儀器 270‧‧‧校準 280‧‧‧報告 300‧‧‧減小基於MAM的儀器的差異性的方法 302‧‧‧方法300的開始 304‧‧‧步驟框 306‧‧‧步驟框 308‧‧‧步驟框 310‧‧‧步驟框 312‧‧‧步驟框 314‧‧‧步驟框 316‧‧‧步驟框 318‧‧‧步驟框 400‧‧‧圖4a的圖示 402‧‧‧常規MAM迭代；常規MAM程序；常規方法 404‧‧‧新校準的MAM迭代；新校準的MAM程序；新方法 410x‧‧‧圖示400的x軸 410y‧‧‧圖示400的y軸 450‧‧‧圖4b的圖示 460x‧‧‧圖示450的x軸 460y‧‧‧圖示450的y軸 500‧‧‧圖5a的圖示 510x‧‧‧圖示500的x軸 510y‧‧‧圖示500的y軸 550‧‧‧圖5b的圖示 560x‧‧‧圖示550的x軸 560y‧‧‧圖示550的y軸 602‧‧‧圖6的圖示 604‧‧‧重鏈Cys127Tyr序列變體所測得的豐度 605‧‧‧未經校準與經校準的RSD值 606‧‧‧未糖基化的Asn289所測得的豐度 607‧‧‧未經校準與經校準的RSD值 702‧‧‧圖7的圖示 704‧‧‧經校準的RSD值 706‧‧‧未經校準的RSD值 802‧‧‧圖8的圖示 804‧‧‧未經校準與經校準的RSD值 806‧‧‧六個測量結果 902‧‧‧圖9的圖示 904‧‧‧經校準的RSD值 906‧‧‧未經校準的RSD值 1002‧‧‧圖10的圖示 1004‧‧‧經校準的RSD值 1006‧‧‧未經校準的RSD值 1102‧‧‧圖11的圖示 1103‧‧‧圖11的上圖 1104‧‧‧來自系統A的豐度 1106‧‧‧來自系統C的豐度 1113‧‧‧圖11的下圖 1114‧‧‧經校準的RSD值 1116‧‧‧未經校準的RSD值 1202‧‧‧圖12的圖示 1203‧‧‧圖12的上圖 1204‧‧‧測得的豐度 1206‧‧‧四個序列 1213‧‧‧圖12的下圖 1214‧‧‧RSD值 1216‧‧‧六種糖型 1302‧‧‧圖13的圖示 1303‧‧‧圖13的上圖 1304‧‧‧序列內RSD值 1306‧‧‧屬性豐度 1313‧‧‧圖13的下圖 1314‧‧‧序列內RSD值 1316‧‧‧屬性豐度
下文描述的附圖描繪了其中揭露的系統和方法的各方面。應理解的是，每個附圖描繪了揭露的系統和方法的特定方面的實施方式，並且附圖中的每一個旨在與其可能的實施方式一致。進一步地，在任何可能的情況下，以下說明涉及包括在以下附圖中的附圖標記，其中，在多個附圖中描繪的特徵係用一致的附圖標記表示的。
在附圖中示出了當前討論的安排，然而，應理解的是，本發明的實施方式不限於所示出的精確安排和工具，其中：
[圖1]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的包括質譜儀的示例基於MAM之儀器。
[圖2]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的用於經由執行時間信號強度校準來減小第一基於MAM的儀器與第二基於MAM的儀器之間的差異性之示例流程圖。
[圖3]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的用於經由執行時間信號強度校準來減小多個時間段內的基於MAM的儀器的差異性之方法。
[圖4a]展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的減小跨六次示例MAM迭代的給定同種型的豐度值的儀器之間/實驗室之間變化。
[圖4b]展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的減小六種示例同種型（包括圖4a的同種型）的儀器之間/實驗室之間偏差。
[圖5a]展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的減小跨十二次示例MAM迭代的豐度值的儀器之間/實驗室之間的變化。
[圖5b]展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的減小跨57種品質屬性的儀器之間/實驗室之間偏差。
[圖6]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的關於兩種不同的儀器設置和兩種不同的樣品製備程序的樣品中的兩種屬性的測得的豐度之圖示。
[圖7]展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的具有和不具有響應因數校準的中間精度之示例比較。
[圖8]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的示出與響應因數a校準的類似結果的針對2型屬性的人工修飾的校準的實施方式之圖示。
[圖9]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的與響應因數a校準相比較的針對3型屬性的人工修飾b校準的性能之圖示。
[圖10]展示了根據本文所揭露的各個實施方式的示出與單標準響應因數（a）校準相比較的針對3型屬性的雙標準校準（a&b）的性能的實施方式之圖示。
[圖11]展示了圖示，該圖示描繪了根據本文所揭露的各個實施方式的在藉由響應因數校準在兩個不同的LC-MS系統上收集的兩個數據集的一致性中取得的改進。
[圖12]展示了圖示，該圖示示出了根據本文所揭露的各個實施方式的四種序列（每種序列一式三份）中的糖型的測得的豐度。
[圖13]展示了圖示，該圖示示出了根據本文所揭露的各個實施方式的三種屬性類型的屬性豐度和序列內RSD之關係。
附圖僅用於說明目的描繪了較佳的實施方式。在沒有偏離本文所描述的本發明的原則的情況下，可以採用本文所展示的系統和方法的替代實施方式。
300‧‧‧減小基於MAM的儀器的差異性的方法
302‧‧‧方法300的開始
304‧‧‧步驟框
306‧‧‧步驟框
308‧‧‧步驟框
310‧‧‧步驟框
312‧‧‧步驟框
314‧‧‧步驟框
316‧‧‧步驟框
318‧‧‧步驟框

Claims (13)

  1. 一種校準系統，該校準系統被配置成經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法(MAM)之實驗室之間或儀器之間差異性，該校準系統包括：第一基於MAM的儀器，該第一基於MAM的儀器包括第一檢測器，該第一基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置，該第一基於MAM的儀器被配置成接收第一樣品和參考標準品，並且該第一基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型；與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品，並且所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數；第二基於MAM的儀器，該第二基於MAM的儀器包括第二檢測器，該第二基於MAM的儀器具有由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，該第二基於MAM的儀器被配置成接收第二樣品和該參考標準品， 並且該第二基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型；以及與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器，所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成經由第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品，並且所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器被進一步配置成確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
  2. 如請求項1之校準系統，其中所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第一MAM迭代來確定品質屬性，視情況其中：(a)該品質屬性係以下各項中的任一項：該第一樣品同種型、蛋白質或所鑒定雜質；或(b)該品質屬性限定以下各項中的任何一項或多項：片段化、氧化、糖化、羥基化、序列變體、異構化、脫醯胺化、C-末端賴胺酸、O-連接的聚糖或N-連接的聚糖；或(c)所述該第一基於MAM儀器相關聯的一個或多個處理器被配置成生成包括該品質屬性的報告。
  3. 如請求項1至2中任一項之校準系統，其中該第一儀器模型不同於該第二儀器模型或該第一組設置不同於該第二組設置。
  4. 如請求項1至2中任一項之校準系統，其中該第一組校正因數基於該第一參考標準品同種型的離子強度值和該第一參考標準品同種型的第一參考標準品豐度值或該第一組校正因數校準與該第一組樣品豐度值相關聯的響應因數以確定該第一樣品同種型的離子強度值。
  5. 如請求項1至2中任一項之校準系統，其中該第一組樣品豐度值進一步基於該第一樣品同種型的離子強度值。
  6. 如請求項1至2中任一項之校準系統，其中該第一基於MAM的儀器(a)為質譜(MS)儀器或(b)為三重四極儀器或(c)位於第一地理位置處的第一實驗室處，並且該第二基於MAM的儀器位於第二地理位置處的第二實驗室處。
  7. 如請求項1至2中任一項之校準系統，其中與該第一基於MAM儀器相關聯的一個或多個處理器係(a)經由電腦網路通信地耦合至所述與該第二基於MAM儀器相關聯的一個或多個處理器，或(b)與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器。
  8. 如請求項1之校準系統，其中該第一樣品具有第一製劑類型；其中該第二樣品具有第二製劑類型，並且其中該第一製劑類型不同於該第二製劑類型，從而引起該第一樣品與該第二樣品之間的差異，該差異由樣品製備期間對屬性豐度的人工改變引起；以及其中該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小，其中以下至少一項確定品質屬性以減小該第一樣品與該第二樣品之間的差異：(1)所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第一MAM迭代，或(2)所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第二MAM迭代，該品質屬性與2型屬性或3型屬性相關聯。
  9. 如請求項1之校準系統，其中該第一基於MAM的儀器被進一步配置成接收緊迫標準品，且該第一基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第一檢測器檢測來自該緊迫標準品的緊迫參考標準品同種型；其中該第一組校正因數基於該參考標準品和該緊迫標準品；其中該第二基於MAM的儀器被配置成接收該緊迫標準品，且該第二基於MAM的儀器被進一步配置成經由該第二檢測器檢測來自該緊 迫標準品的第二緊迫參考標準品同種型；且其中該第二組校正因數基於該參考標準品和該緊迫標準品。
  10. 一種用於經由執行時間信號強度校準來減小多屬性方法(MAM)的實驗室之間或儀器之間差異性之校準方法，該校準方法包括：在包括第一檢測器的第一基於MAM的儀器處接收第一樣品和參考標準品；經由該第一檢測器檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型；經由與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器在第一MAM迭代內確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品；經由所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數，並且其中，該第一基於MAM的儀器包括由以下各項中的至少一項限定的第一儀器條件：(1)第一儀器模型或(2)第一組設置；在包括第二檢測器的第二基於MAM的儀器處接收第二樣品和該參考標準品；經由該第二檢測器檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型；經由與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器在第二MAM迭代內確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其 中，該第二組校正因數基於該參考標準品；經由所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，該第二基於MAM的儀器包括由以下各項中的至少一項限定的第二儀器條件：(1)第二儀器模型或(2)第二組設置，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
  11. 如請求項10之校準方法，其中該第一樣品具有第一製劑類型；其中該第二樣品具有第二製劑類型，並且其中該第一製劑類型不同於該第二製劑類型，從而引起該第一樣品與該第二樣品之間的差異，該差異由樣品製備期間對屬性豐度的人工改變引起；並且其中以下至少一項確定品質屬性以減小該第一樣品與該第二樣品之間的差異：(1)所述與該第一基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第一MAM迭代，或(2)所述與該第二基於MAM的儀器相關聯的一個或多個處理器經由該第二MAM迭代，該品質屬性與2型屬性或3型屬性相關聯。
  12. 如請求項10之校準方法，該校準方法進一步包含： 在該第一基於MAM的儀器處接收緊迫標準品；由該第一基於MAM的儀器的該第一檢測器檢測來自該緊迫標準品的緊迫參考標準品同種型；其中該第一組校正因數係基於該參考標準品和該緊迫標準品；在該第二基於MAM的儀器處接收該緊迫標準品；且由該第二基於MAM的儀器的該第二檢測器檢測來自該緊迫標準品的第二緊迫參考標準品同種型；其中該第二組校正因數係基於該參考標準品和該緊迫標準品。
  13. 一種用於經由執行時間信號強度校準在多個時間段內減小基於MAM的儀器的差異性的校準方法，該校準方法包括：在第一時間段內在基於MAM的儀器處接收第一樣品和參考標準品；經由該基於MAM的儀器的檢測器在該第一時間段內檢測來自該第一樣品的第一樣品同種型和來自該參考標準品的第一參考標準品同種型；經由一個或多個處理器在該第一時間段內在第一MAM迭代內確定與該第一樣品同種型相對應的第一組校正因數，其中，該第一組校正因數基於該參考標準品；經由該一個或多個處理器在該第一時間段內經由該第一MAM迭代來確定與該第一樣品同種型相對應的第一組樣品豐度值，其中，該第一組樣品豐度值基於該第一組校正因數，並且其中，在該第一時間段內該基於MAM的儀器包括由第一組設置限定的第一儀器條件； 在第二時間段內在該基於MAM的儀器處接收第二樣品和該參考標準品；經由該基於MAM的儀器的檢測器在該第二時間段內檢測來自該第二樣品的第二樣品同種型和來自該參考標準品的第二參考標準品同種型；經由該一個或多個處理器在該第二時間段內在第二MAM迭代內確定與該第二樣品同種型相對應的第二組校正因數，其中，該第二組校正因數基於該參考標準品；以及經由該一個或多個處理器在該第二時間段內經由該第二MAM迭代來確定與該第二樣品同種型相對應的第二組樣品豐度值，其中，該第二組樣品豐度值基於該第二組校正因數，並且其中，在該第二時間段內該基於MAM的儀器包括由第二組設置限定的第二儀器條件，其中，該第二儀器條件不同於該第一儀器條件，並且其中，該第一組樣品豐度值和該第二組樣品豐度值的方差值基於該第一組校正因數和該第二組校正因數而減小。
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