CN112424907A - 减小多属性方法的实验室之间和/或仪器之间差异性的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)分析的实验室之间和/或仪器之间差异性的系统和方法。在各个方面，多个基于MAM的仪器各自具有检测器和由不同仪器模型或不同组设置限定的不同仪器条件。每个基于MAM的仪器接收对应样品和作为校准物的参考标准品。每个基于MAM的仪器经由其检测器检测其对应样品的样品同种型和该参考标准品的参考标准品同种型。该基于MAM的仪器与(多个)处理器相关联，该(多个)处理器经由对应MAM迭代来确定与这些样品同种型相对应的校正因子和样品丰度值。这些校正因子基于该参考标准品，并且这些样品丰度值基于这些校正因子。可以根据这些基于MAM的仪器中的每一个的校正因子来减小这些样品丰度值的方差值。

Description

减小多属性方法的实验室之间和/或仪器之间差异性的系统 和方法
相关申请的引用
本申请要求(2018年6月8日提交的)美国临时申请号62/763,110以及(2018 年10月16日提交的)美国临时申请号62/746,323的权益。前述临时申请中的每一个的全文通过引用并入本文。
技术领域
本披露内容总体上涉及经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM) 的实验室之间和仪器之间差异性。
背景技术
生物治疗开发通常包括监测(多个)治疗分子的某些属性，其中，这种属性被标识为用于测量产品安全性和功效目的的关键质量属性(CQA)。质谱分析法(MS)可以用于测量质量属性的测定中。通常，MS是指电离化学物种并且基于离子的质荷比来对离子进行分类的分析型技术。以这种方式，MS设备可以测量样品内分子的质量。在多肽属性的情况下，使用质谱分析法实现了使用更少的分析来评估更多的质量属性。
MS可以用于通过实施多分析物/属性或所谓的多属性方法(MAM)使用紫外 (UV)数据和质量数据两者来监测翻译后修饰(PTM)(包括糖基化谱)和/或赋形剂。MAM使用MS数据以及属性的自动识别和相对量化的组合(Rogers,RS等人,2015, Development of aquantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization,quality control testing and disposition of biologics[用于生物制剂的表征、质量控制测试和处置的量化质谱分析多属性方法的开发],mAbs 7:5,881-890)。由于效率和质量控制的益处，MAM被越来越多地与MS一起使用，例如为质量属性分析提供增加的选择性、灵敏度和灵活性。MAM是指可以在单个分析中量化多个产品属性和过程属性(例如，质量属性/CQA)的分析方法。例如，通常将基于MAM的测定靶向监测下游过程，但是这些测定也被越来越多地用于批(例如，样品)签发的质量控制测定。
例如，基于蛋白水解消化然后是蛋白水解肽(肽是通过蛋白水解产生的较大多肽的片段)的液相色谱法(LC)分析/MS分析的MAM程序可以用于量化治疗性蛋白的各种质量属性。该程序利用由质谱检测器提供的分辨力，并且可以使用蛋白水解肽的每种同种型(包括经修饰形式和未经修饰形式)的MS强度进行定量。
将质谱分析法与MAM结合可能会带来挑战，因为MS程序通常需要训练有素的分析者和重要的实验室基础设施。具体地，基于质谱分析法的MAM分析的主要挑战是在实验室中使用的制备样品和那些实验室中的不同仪器的观察到的高度差异性。例如，样品制备的差异性可能源自以不同方式制备样品的不同实验室分析者，这就导致了所制备样品之间的差异。例如，在接收到样品之后，实验室分析者通常执行复杂的程序(例如，蛋白水解消化)以制备用于注射的样品。由于程序的复杂性，即使原始样品是一致的，所制备样品也可能是相当可变的。由于样品制备程序的长持续时间，因此其可能引入改变各种属性的丰度的修饰。这些人工修饰导致MAM结果的不准确性和变化。实验室分析者在样品制备过程中的不同的消化效率也会促成实验室之间的差异性。差异性也可能源自使用不同设置或执行不同操作模型的实验室仪器。目前，为了确保可再现的属性测量，不仅所有分析实验室都必须使用类似的仪器模型，而且还必须将仪器调整至相同的条件。然而，将实验室限制为特定模型也可能会遏制实验室升级其设备以利用最新进展。
基于MS-MAM的分析的挑战还源自在常规MAM程序中使用的假设和方法。例如，在常规MS-MAM程序中，在以下假设下基于经修饰的肽和未经修饰的肽的MS 响应(例如，峰面积)来确定每种属性的丰度(例如，肽中氨基酸残基的不同修饰状态)：(1)未经修饰的肽和经修饰的肽在实验室之间具有可再现的回收；(2)未经修饰的肽和经修饰的肽具有相同的MS响应因子；以及(3)人工诱导的属性变化可以忽略不计。
由于这些假设，常规MAM程序取决于多个所需条件，包括(1)消化效率在实验室之间是可再现的；(2)MS仪器条件是完全相同的；以及(3)由不同实验室执行的样品制备引入最少量或恒定量的人工修饰。然而，实际上，由于样品制备程序、分析者习惯、仪器、试剂质量等的变化，很难满足这些所需条件。肽回收也可能波动，这导致附加的差异性。
满足所需条件的附加挑战包括MS仪器模型或仪器设置方面的差异。例如，一个实验室仪器的维护方式可能不同于第二实验室仪器的维护方式。另外，含有不同变体的肽在不同实验室的响应因子可能不同。满足所需条件的进一步挑战包括样品制备程序、分析者习惯、设备质量和试剂质量、以及仪器条件的变化。另外，人工引入的修饰量可能有所不同。
因此，常规基于MS的MAM方法在实验室之间和/或仪器之间差异性方面缺乏稳健性。
另外，基于质谱分析法的多属性方法(MAM)的主要挑战是分析者与仪器之间的其高度差异性。对于可再现的属性测量，不仅需要所有分析实验室具有类似的仪器模型，而且还必须将仪器调整至相同的条件。考虑到新的色谱技术和质谱分析技术的快速发展，这带来了巨大的长期挑战。另外，在样品制备期间在消化效率和人工修饰 (例如，氧化、脱酰胺化、Asp异构化和片段化)方面的差异也会促成实验室之间的差异性。必须解决这些挑战以确保MAM在例如cGMP环境中的长期成功。
发明内容
因此，需要经由运行时间信号强度校准来减小基于MS的多属性方法(MAM) 的实验室之间和/或仪器之间差异性的系统和方法。
如本文所描述的，披露了用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间和/或仪器之间差异性的系统和方法。如针对各个实施例所描述的，这些系统和方法可以用于通过将参考标准品中的测得的或已知属性丰度(例如，每种质量属性的参考标准品丰度值)用作校准物来确定样品中的属性丰度(例如，每种质量属性的样品丰度值)。这种新技术增加了实验室之间和/或仪器之间效率并且允许减小实验室和/或仪器之间的差异性。例如，因为通常会收集参考标准品数据进行MAM分析，所以这种新技术不需要分析者或实验室进行额外工作或需要最小量的额外工作。这是因为，对于典型的MAM程序，参考标准品与样品并行分析以实现其他目的，例如，系统稳定性和同一性目的。另外，将参考标准品用作校准物是进一步有益的，因为在参考标准品中，大多数质量属性在标准品的整个寿命内保持不变，并且因此可以以独特的方式将参考标准品用作校准物以校正仪器或样品制备程序之间的差异。
在本文所描述的各个实施例中，描述了用于经由运行时间信号强度校准来减小MAM分析的实验室之间和/或仪器之间差异性的系统和方法。例如，对于一些实施例，这种系统和方法可以包括第一基于MAM的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器。该第一基于MAM的仪器可以具有由(1)第一仪器模型或(2)第一组设置中的至少一项限定的第一仪器条件。该第一基于MAM的仪器可以被配置成接收第一样品和参考标准品。该第一基于MAM的仪器可以被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型。
这些系统和方法可以进一步包括与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器。与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器可以被配置成经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子。该第一组校正因子可以基于该参考标准品。与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器可以被进一步配置成确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子。
这些系统和方法可以进一步包括第二基于MAM的仪器，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器。该第二基于MAM的仪器可以具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置。
在各个实施例中，该第二仪器条件可以不同于该第一仪器条件。
该第二基于MAM的仪器可以被配置成接收第二样品和该参考标准品。该第二基于MAM的仪器可以被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型。
这些系统和方法可以进一步包括与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器。与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器可以被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子。该第二组校正因子可以基于该参考标准品。与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器可以被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子。
基于为每个仪器确定的这些校正因子，可以减小该第一基于MAM的仪器与该第二基于MAM的仪器之间的测量结果差异性。例如，可以基于该第一基于MAM的仪器的该第一组校正因子和该第二基于MAM的仪器的该第二组校正因子来减小该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值。
在另外的实施例中，披露了用于在多个时间段内经由运行时间信号强度校准来减小基于MAM的仪器的差异性的系统和方法。在这种实施例中，基于MAM的仪器在第一时间段内可以接收第一样品和参考标准品。
该基于MAM的仪器可以经由检测器在该第一时间段内检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型。
可以将一个或多个处理器配置成经由第一MAM迭代在该第一时间段内确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品。
该一个或多个处理器还可以被配置成经由该第一MAM迭代并且在该第一时间段内确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值。该第一组样品丰度值可以基于该第一组校正因子。该基于MAM的仪器在该第一时间段内可以具有由第一组设置限定的第一仪器条件。
该基于MAM的仪器在第二时间段内可以被配置成接收第二样品和参考标准品。
该基于MAM的仪器可以在该第二时间段内经由该检测器检测来自该第一样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型。
该一个或多个处理器可以被配置成在该第二时间段内经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品。
该一个或多个处理器还可以被配置成经由该第二MAM迭代并且在该第二时间段内确定与该第二样品同种型相对应的第二组校样品丰度值。该第二组样品丰度值可以基于该第二组校正因子。该基于MAM的仪器在该第二时间段内可以具有由第二组设置限定的第二仪器条件。
该基于MAM的仪器在该第一时间段内的该第二仪器条件可以不同于该基于 MAM的仪器在该第二时间段内的该第二仪器条件。
基于针对每个时间段确定的这些校正因子，可以减小该基于MAM的仪器在该第一时间段与该第二时间段之间的这些MAM迭代之间的测量结果差异性。例如，可以基于该第一基于MAM的仪器的该第一组校正因子和该第二基于MAM的仪器的该第二组校正因子来减小该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值。
如本文中进一步描述的，例如关于图4a、图4b、图5a和图5b，对各种同种型的分析表明，当与现有的基于MAM的程序相比时，应用本文所披露的系统和方法使实验室之间和/或仪器之间差异性(例如，中间精度RSD)减小两至三倍。利用所披露的系统和方法，不再需要实验室或仪器之间或在不同时间段执行的MAM迭代之间的一致仪器模型。同时，实验室之间的细微消化程序变化以及通过自动化进行的改变不会显著影响不同实验室、仪器或者在不同时间段执行的MAM迭代之间的测定结果。
这些新系统和方法还为其他仪器，如用于选择反应监测的三重四极杆仪器提供了另外的机会，因为利用这些所披露的系统和方法，不再需要不同肽同种型之间的一致响应因子。
另外，相比常规方法，所披露的系统和方法具有显著优势，因为这些新系统和新方法通过运行时间信号强度校准大大减小了实验室之间变化。如本文所描述的这些新系统和方法有效消除了MAM使用一致设备/仪器的要求，这在当前MAM工作流程中是个主要问题。此外，当需要准确量化质量属性时，这些新系统和方法适用于任何基于MAM的应用。另外，因为在生物制药工作流程中参考标准品通常与样品并行分析，所以分析者不需要进行附加工作。
根据上文并且利用本文种的披露内容，本披露内容至少因为权利要求叙述了以下内容而包括计算机功能的改进或其他技术的改进：例如，可以通过利用同一样品(例如，(多种)蛋白水解肽的同一样品)并且将参考标准品用作校准物来减小运行MAM 程序的基于MAM的仪器之间的差异性从而改进(多个)基于MAM的仪器。也就是说，本披露内容描述了计算机本身的运行或任何其他技术或技术领域的改进，因为这些系统和方法减小跨MAM的仪器的差异性。与现有技术相比，这种情况得到改善，至少是因为常规的MAM过程需要由于样品制备程序、分析者习惯、仪器和试剂质量的变化而很难满足的条件。
本披露内容涉及其他技术或技术领域的改进，至少是因为即使基于MAM的仪器具有不同的仪器模型或具有不同组设置，甚至是跨实验室，也可以校准基于MAM的仪器。
本披露内容包括利用或通过使用特定机器，例如基于MAM的仪器来应用独特的改进。
本披露内容包括除生物治疗剂开发或研究领域中的众所周知的、日常的、常规的活动之外的具体特征，和/或增加了使本披露内容集中于特定的有用应用——例如，经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间和仪器之间差异性——的非常规步骤。
另外，为了克服如本文所描述的挑战，描述了用于将参考标准品中的测得的属性用作校准物来校准样品中的属性丰度的新校准系统和方法。在参考标准品中，大多数质量属性在该标准品的整个寿命内保持不变并且因此可以充当用于校正仪器或样品制备程序之间的差异的校准物。由于在典型的MAM方法中通常收集参考标准品数据，所以不需要分析者进行附加工作。来自大量属性的测试数据表明，该方法大大地减小了仪器之间差异性。利用这种方法，不再需要一致的仪器模型和样品制备程序。因此，消化程序的变化、现代仪器的进步将不会显著影响测定结果。这些新系统和新方法还允许校准其他仪器，如用于选择反应监测的三重四极杆仪器，因为不再需要不同肽同种型之间的一致响应因子。
如本文所描述的，开发了基于对蛋白水解肽的LC-MS分析之后的蛋白水解消化的多属性方法以量化用于治疗蛋白质的各种质量属性。这些方法利用由质谱(MS) 检测器提供的分辨力并且使用蛋白水解肽的每种同种型(包括经修饰和未经修饰的形式)的MS强度进行定量。由于这些方法对每种临床相关的质量属性的高度特异型，所以这种方法已在生物制药行业中获得了大量关注。
对于本领域的普通技术人员来说，根据以下对已经通过说明的方式示出和描述的优选实施例的描述，优点将变得更加明显。如将认识到的，本发明实施例可以具有其他和不同的实施例，并且可以在各个方面对其细节进行修改。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。
附图说明
下文描述的附图描绘了其中披露的系统和方法的各方面。应理解的是，每个附图描绘了披露的系统和方法的特定方面的实施例，并且附图中的每一个旨在与其可能的实施例一致。进一步地，在任何可能的情况下，以下说明涉及包括在以下附图中的附图标记，其中，在多个附图中描绘的特征是用一致的附图标记表示的。
在附图中示出了当前讨论的安排，然而，应理解的是，本发明的实施例不限于所示出的精确安排和工具，其中：
图1展示了根据本文所披露的各个实施例的包括质谱仪的示例基于MAM的仪器。
图2展示了根据本文所披露的各个实施例的用于经由运行时间信号强度校准来减小第一基于MAM的仪器与第二基于MAM的仪器之间的差异性的示例流程图。
图3展示了根据本文所披露的各个实施例的用于经由运行时间信号强度校准来减小多个时间段内的基于MAM的仪器的差异性的方法。
图4a展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的减小给定同种型跨六次示例MAM迭代的丰度值的仪器之间/实验室之间变化。
图4b展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的减小六种示例同种型(包括图4a的同种型)的仪器之间/实验室之间偏差。
图5a展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的减小跨十二次示例MAM迭代的丰度值的仪器之间/实验室之间的变化。
图5b展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的减小跨57种质量属性的仪器之间/实验室之间偏差。
图6展示了根据本文所披露的各个实施例的关于两种不同的仪器设置和两种不同的样品制备程序的样品中的两种属性的测得的丰度的图示。
图7展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的具有和不具有响应因子校准的中间精度的示例比较。
图8展示了根据本文所披露的各个实施例的示出与响应因子a校准的类似结果的针对2型属性的人工修饰的校准的实施例的图示。
图9展示了根据本文所披露的各个实施例的与响应因子a校准相比较的针对3型属性的人工修饰b校准的性能的图示。
图10展示了根据本文所披露的各个实施例的示出与单标准响应因子(a)校准相比较的针对3型属性的双标准校准(a&b)的性能的实施例的图示。
图11展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的在通过响应因子校准在两个不同的LC-MS系统上收集的两个数据集的一致性中取得的改进。
图12展示了图示，该图示示出了根据本文所披露的各个实施例的四种序列(每种序列一式三份)中的糖型的测得的丰度。
图13展示了图示，该图示示出了根据本文所披露的各个实施例的三种属性类型的属性丰度和序列内RSD的关系。
附图仅用于说明目的描绘了优选实施例。在没有偏离本文所描述的本发明的原则的情况下，可以采用本文所展示的系统和方法的替代实施例。
具体实施方式
图1展示了根据本文所披露的各个实施例的包括质谱仪(MS)102的示例基于 MAM的仪器100。如本文所描述的，MAM可以用于同时分析分子(例如，蛋白质或同种型)的多种性质或属性(例如，质量属性)。为了测量单个分子的性质或属性，质谱仪102可以接收分子或肽的样品110，如本文所描述的同种型的样品或同种型的参考标准品。质谱仪102可以将接收到的分子样品转换成离子，从而使得可以过滤和标识样品分子的电离形式。
通常，质谱仪包括离子源、质量分析器和检测器。例如，对于离子源114，通常通过添加一个或多个质子将分子或肽的小型样品(例如，样品110)电离(151)为阳离子。质量分析器116根据离子的质量和电荷对这些离子(例如，离子152)进行分类和分离。检测器(例如，检测器140)测量经分离的离子，并且可以经由具有一个或多个处理器的计算设备(例如，计算设备142)来记录和显示结果，例如经由图表或其他报告。该一个或多个处理器可以是基于MAM的仪器100的一部分或单独的计算设备(例如，计算设备142)的一部分。
离子152可以由检测器140电子地检测，其中，离子152具有不同的强度并且因此产生由检测器140检测到的不同的或变化的离子强度(例如，信号)。可以在计算设备142中读取、存储和/或分析由检测器140检测到的离子152，例如其中，检测到的离子可以生成电子信息(例如，离子读数的峰面积等)。因此，如本文所描述的，基于MAM的仪器100可以生成关于离子强度的信息。可以经由二维(2D)图表、曲线图或记录来显示离子强度，例如其中，这种图表的质谱的y轴可以表示离子的信号强度。通常，质量-电荷(m/z)值是在图表、曲线图或记录的x轴上测量的，其中，“m”是指分子的或原子的质量数并且“z”是指离子的电荷数。
另外，可以根据从MS信息生成的对离子强度/信号的分析来确定响应因子。响应因子可以等于由分子或同种型(例如，如由离子152确定)产生的离子强度信号与产生信号的分子或同种型的量的比率。例如关于表1，本文进一步描述了响应因子(例如，k)和离子强度(例如，Ii)。
应理解的是，可以以各种方式完成经由质谱仪对分子(例如，同种型)的电离。虽然以这样的一种方式描绘和描述了图1的质谱仪的实施例，但是应理解的是，任何质谱仪或用于执行质谱分析的方法可以用于本文所描述的系统和方法。例如，质谱仪 102可以包括或基于Orbitrap、TOF(飞行时间)和/或基于单级子或三级子、四极子的质谱仪器中的任何一种。
计算设备142可以包括一个或多个处理器和/或用于读取、存储或分析分子、同种型、参考标准品、离子或本文所描述的其他信息的一个或多个计算机存储器。计算设备142的该一个或多个处理器和/或一个或多个计算机存储器还可以用于实施关于经由运行时间信号强度校准来减小MAM分析的实验室之间或仪器之间差异性的本文所描述的功能、方法、流程图或其他特征中的任何一种。另外或在替代方案中，如本文所描述的，基于MAM的仪器100可以包括计算设备142的一个或多个处理器和 /或一个或多个计算机存储器，该一个或多个处理器和/或一个或多个计算机存储器还可以用于实施关于经由运行时间信号强度校准来减小MAM分析的实验室之间或仪器之间差异性的本文所描述的功能、方法、流程图或其他特征中的任何一种。如图1 中所展示的，计算设备142可以直接(例如，硬连线电缆，如通用串行总线(USB) 电缆)或经由计算机网络(私人的或者公用的，如经由互联网)通信地耦合至基于 MAM的仪器100，并且可以通信地耦合至质谱仪102的部件中的任何一个，包括例如离子源114、质量分析器116和/或检测器140中的任何一个。
具体地，基于MAM的仪器100或者计算设备142可以是可以包括一个或多个处理器以及一个或多个计算机存储器的计算设备。存储器可以包括一种或多种形式的易失性和/或非易失性存储器、固定和/或可移动存储器，如只读存储器(ROM)、电子可编程只读存储器(EPROM)、随机存取存储器(RAM)、可擦除电子可编程只读存储器(EEPROM)和/或其他硬盘驱动器、闪存、MicroSD卡等。存储器可以存储能够促进如本文讨论的功能的操作系统(OS)(例如，Microsoft Windows、Linux、Unix 等)。存储器还可以存储机器可读指令，包括一个或多个应用、一个或多个软件组件和/或一个或多个应用编程接口(API)中的任何一个，其可以被实施为促进或执行本文所描述的特征、功能或其他披露内容，如针对各个流程图、说明、图示、附图和/ 或本文其他披露内容展示、描绘或描述的任何方法、过程、元件或限制。例如，应用、软件组件或API中的至少一些可以是、包括机器学习部件和/或搜索引擎优化部件、以其他方式为机器学习部件和/或搜索引擎优化部件的一部分，其中，每个部件被配置成促进本文讨论的其各种功能。应意识到的是，可以设想一个或多个其他应用，这些应用由基于MAM的仪器100或计算设备142的(多个)处理器执行。
基于MAM的仪器100或计算设备142的(多个)处理器可以经由负责向且从(多个)处理器和存储器传输电子数据、数据包或其他电子信号的计算机总线连接至基于 MAM的仪器100或计算设备142的存储器，以实施或执行如各个流程图、说明、图示、附图和/或本文其他披露内容展示、描绘或描述的机器可读指令、方法、过程、元件或限制。
基于MAM的仪器100或计算设备142的(多个)处理器可以经由计算机总线与存储器接口连接以执行操作系统(OS)。该(多个)处理器还可以经由计算机总线与存储器接口连接以创建、读取、更新、删除或以其他方式访问或接口连接存储在基于 MAM的仪器100或计算设备142的存储器中的数据和/或基于MAM的仪器100或计算设备142的数据库(例如，关系数据库，如Oracle、DB2、MySQL或基于NoSQL 的数据库，如MongoDB)。存储在存储器和/或数据库中的数据可以包括本文所描述的数据或信息中的所有或部分或任何数据或信息，包括例如一个或多个搜索请求、一个或多个交易细节以及用户的简档信息。
基于MAM的仪器100或计算设备142可以进一步包括被配置成经由一个或多个外部/网络端口将数据传送(例如，发送和接收)到一个或多个网络或本地终端的通信部件，如本文所描述的计算机网络和/或计算设备142。在一些实施例中，通信部件可以包括客户端-服务器平台技术，如响应于接收和响应电子请求的ASP.NET、Java J2EE、Ruby on Rails、Node.js、web服务或在线API。基于MAM的仪器100或计算设备142的(多个)处理器可以实施基于MAM的仪器100或计算设备142的通信部件，该通信部件可以交互以实施或执行如各个流程图、说明、图示、附图和/或本文其他披露内容展示、描绘或描述的机器可读指令、方法、过程、元件或限制。根据一些实施例，基于MAM的仪器100或计算设备142的通信部件可以包括一个或多个收发器(例如，WWAN、WLAN和/或WPAN收发器)或与其交互，该一个或多个收发器根据IEEE标准、3GPP标准或其他标准运行并且可以用于经由基于MAM的仪器 100或计算设备142的外部/网络端口接收和传输数据。
基于MAM的仪器100或计算设备142可以进一步包括或实施操作员界面，该操作员界面被配置成向管理员或操作员呈现信息和/或从管理员或操作员接收输入。基于MAM的仪器100或计算设备142的操作员界面可以提供显示屏(例如，经由计算设备142 106)。基于MAM的仪器100或者计算设备142还可以提供I/O部件(例如，端口、电容式或电阻式触敏输入面板、键、按钮、灯、LED)，这些部件可以是可经由基于MAM的仪器100或计算设备142直接访问的或附接至基于MAM的仪器或计算设备或者可以是可经由基于MAM的仪器100或计算设备142的终端间接访问的或附接至基于MAM的仪器或计算设备的终端。根据一些实施例，管理员或操作员可以经由基于MAM的仪器100或计算设备142的操作员界面和/或I/O部件访问服务器 102以查看信息、做出改变、输入训练数据和/或执行其他功能。
在一些实施例中，基于MAM的仪器100或者计算设备142可以执行如本文所讨论的功能作为“云”网络的一部分，或者可以以其他方式与云内的其他硬件或软件组件进行通信以发送、检索或以其他方式分析本文所描述的数据或信息。
通常，根据一些实施例的计算机程序或基于计算机的产品可以包括具有在其中具体化的计算机可读程序代码或计算机指令的计算机可用存储介质或有形的、非暂时性计算机可读介质(例如，标准随机存取存储器(RAM)、光盘、通用串行总线(USB) 驱动器等)，其中，计算机可读程序代码或计算机指令可以安装在基于MAM的仪器 100或计算设备142的(多个)处理器上或以其他方式被适配成由其执行(例如，与存储器中的对应操作系统一起工作)，以便促进、实施或执行如各个流程图、说明、图示、附图和/或本文其他披露内容展示、描绘或描述的机器可读指令、方法、过程、元件或限制。在这方面，程序代码可以用任何期望的程序语言来实施，并且可以被实施为机器代码、汇编代码、字节代码、可解释的源代码等(例如，经由Golang、Python、 C、C++、C#、Objective-C、Java、Scala、Actionscript、Javascript、HTML、CSS、 XML等)。
图2展示了根据本文所披露的各个实施例的用于经由运行时间信号强度校准来减小第一基于MAM的仪器210与第二基于MAM的仪器260之间的差异性的示例流程图。在一些实施例中，第一基于MAM的仪器210和第二基于MAM的仪器260可以位于相同的实验室中。在其他实施例中，第一基于MAM的仪器210和第二基于 MAM的仪器260可以位于不同的实验室中。例如，第一基于MAM的仪器210可以位于第一地理位置处的第一实验室处并且第二基于MAM的仪器260可以位于第二地理位置处的第二实验室处。在一些实施例中，第一MAM仪器210可以经由如针对图 1所描述的计算机网络通信地耦合至与第二MS仪器相关联的一个或多个处理器。
可以以与如针对图1的基于MAM的仪器100所描述的相同或类似的方式来配置第一基于MAM的仪器210和第二基于MAM的仪器260中的每个。因此，图1的披露内容以相同或类似的方式应用于第一基于MAM的仪器210和/或者第二基于MAM 的仪器260。另外，第一基于MAM的仪器210和第二基于MAM的仪器260中的每个可以包括如针对图1所描述的计算设备(例如，计算设备142)。在各个实施例中，第一基于MAM的仪器210和第二基于MAM的仪器260可以是或包括如针对图1所描述的质谱(MS)仪器。在其他实施例中，第一基于MAM的仪器210和第二基于 MAM的仪器260可以是或包括三重四极杆仪器。
在图2的实施例中，第一基于MAM的仪器210包括第一检测器(例如，如本文针对图1所描述的检测器140)。另外，第一基于MAM的仪器210具有由(1)第一仪器模型或(2)第一组设置限定的第一仪器条件。对于如本文所描述的基于MAM的仪器，仪器模型可以限定基于MAM的仪器如何分析、读取或以其他方式报告如本文所描述的分子、同种型、离子或其他相关信息。例如，本文描述了用于图1的基于 MAM的仪器100的示例实施例仪器模型或用于电离分子的配置。类似地，基于MAM 的仪器可以包括可以影响基于MAM的仪器如何操作的基于MAM的仪器的一组设置。例如，设置可以改变基于MAM的仪器如何执行电离和/或改变如何读取或检测或以其他方式报告离子的灵敏度。仪器模型或者仪器设置的差异可以导致基于MAM 的仪器以不同的方式进行操作，这可以导致基于MAM的仪器以不同的方式检测和/ 或读取分子、同种型、离子。因此，具有不同仪器模型或仪器设置的基于MAM的仪器可以具有不同的条件并且因此可以以与这种不同的仪器可能位于其中的仪器之间和/或与实验室之间不同的方式进行操作。
在图2的实施例中，第一基于MAM的仪器210被配制成接收第一样品204(例如，属于蛋白水解肽的样品)和参考标准品202(例如，属于蛋白水解肽)。在图2 的实施例中，第一样品204具有未知的属性(例如，质量属性)浓度。然而，参考标准品202具有已知的属性浓度并且因此可以用作校准物。例如，参考标准品可以是含有某种已知化学成分的化学样品，例如具有某种批号或“批次”的样品可以含有80％丰度的第一化学品或属性、10％的第二化学品或属性以及各种剩余百分比的其他痕量化学品或属性。参考标准品可以具有与相同化学品或成分的其他参考标准品样品相同的化学品或属性成分和/或相同的信号特征标志(例如，如可经由质谱仪检测，如针对图1所描述的)。因此，参考标准品可以用于质量控制目的，其中，将测试样品(例如，第一样品204和/或第二样品254)与参考标准品(例如，参考标准品202和/或参考标准品252)进行比较以确定测试样品与参考标准品样品或批次之间的质量、数量、一致性、方差和/或偏差。例如，蛋白质阿法依泊汀(Epoetin alfa)(重组促红细胞生成素)(例如，Amgen公司的
Figure BDA0002807026570000151
)可以具有可以用于比较依泊汀的测试样品批次以进行质量控制测量的参考标准品批次。
如图2所示出的，对于第一基于MAM的仪器210，参考标准品202与样品204 并行分析。类似地，对于第二基于MAM的仪器260，参考标准品252与第二样品254 并行分析。对于参考标准品202和252，大多数质量属性在每个参考标准品的整个生命周期内保持不变，并且因此充当通常用于校正仪器或样品制备程序之间的(多种) 差异的校准物，例如第一基于MAM的仪器210与第二基于MAM的仪器260和/或由操作第一基于MAM的仪器210和/或第二基于MAM的仪器260的(多个)实验室分析者执行的样品制备程序之间的条件的(多种)差异。
如本文所描述的，在每次运行时将参考标准品用作校准物的益处(例如，其中，参考标准品202和252可以是用作校准物的相同参考标准品的样品)是可以消除对关于实验室之间和仪器之间的可重现性的常规MAM的大多数要求。例如，可以将对实验室之间和仪器之间的可重现性的假设简化和修改为如下：(1)未经修饰的肽和经修饰的肽在相同的LC/MS序列中具有可重现的恢复(例如，相比于实验室之间)；(2)未经修饰的肽和经修饰的肽在相同的LC/MS序列中具有可重现的MS响应因子(例如，相比于相同的响应因子)；(3)人工诱导的属性变化可忽略不计。与常规方法要求相比，更容易满足以上这些要求，因为关于实验室之间的可重现性的大多数要求都降低至相同LC/MS序列内的可重现性(例如，相同的实验室、相同的分析者以及相同的日期)。
如在图2的实施例中所示出的，第一基于MAM的仪器210被配置成经由第一检测器检测来自第一样品的第一样品同种型和来自参考标准品的第一参考标准品同种型。在蛋白水解肽的背景下，基于蛋白质的同种型可以是作为发挥相同的或类似的生物学作用的一组高度类似的蛋白质的成员的蛋白质变体。在一些实施例中，第一样品同种型可以是用于如本文所描述的质量控制目的的质量属性。在其他实施例中，质量属性可以是蛋白质或所鉴定杂质或用于测量样品或批次的质量的其他度量。例如，在各个实施例中，可以通过片段化、氧化、糖化、羟基化、序列变体、异构化、脱氨基、 C-末端赖氨酸、O-连接的聚糖和/或N-连接的聚糖来限定质量属性。
第一基于MAM的仪器210可以与一个或多个处理器相关联。该一个或多个处理器可以与第一基于MAM的仪器210一起包括或者可以是通信地耦合至如例如针对图 1所描述的第一基于MAM的仪器210的计算设备(例如，计算设备142)的一部分。
在图2的实施例中，与第一基于MAM的仪器210相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代确定与第一样品同种型相对应的第一组校正因子。应理解的是，可以在第一MAM迭代之前、期间或之后确定该组校正因子，使得对该组校正因子的确定与第一MAM迭代相关联。应进一步理解的是，如本文所描述的，该组校正因子可以包括单个校正因子或多个校正因子。在图2的实施例中，第一组校正因子基于参考标准品202。对于与特定氨基酸残基相关联的n+1种同种型，可以经由以下方程(1)来表达该关系，其中，ai表示第一组校正因子，并且I0和A0表示参考标准品202的离子强度和属性丰度值。
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因此，参考标准品(例如，经由I0和A0表示)被用作校准物，其中，根据这些值确定第一组校正因子(例如，ai)。如方程(1)所示出的，第一组校正因子(例如， ai)基于(多种)第一参考标准品同种型的离子强度值(例如，I0 0和Ii 0)和(多种) 第一参考标准品同种型的第一参考标准品丰度值(例如，A0 0和Ai 0)。以下表1描述了用于方程(1)和/或如本文其他地方所使用的各种符号：
表1
Figure BDA0002807026570000162
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方程(1)可以用于基于参考标准品(Ai 0)中的已知属性丰度来执行强度校准(例如，离子强度校准)。
另外，第一组校正因子(例如，ai)可以用于校准与第一组样品丰度值(例如， Ai)相关联的响应因子(k)以确定(多种)第一样品同种型的(多个)离子强度值 (Ii)。这在以下方程(2)中示出。通常，离子强度值可以表示如由MS检测器140 检测的峰面积，如针对图1所描述的。如下所示出的，校正因子ai可以用于校准响应因子k，当应用于丰度值(Ai)时，该响应因子导致校准离子强度因子Ii。这在从中导出方程(1)的以下方程(2)中示出：
Figure BDA0002807026570000172
在方程(2)中，通过校正因子(ai)来修饰每种同种型(i)的响应因子(k)。公式aik0表示参考标准品(例如，202)的经校正响应因子，并且aik表示样品(例如，第一样品204)的经校正响应因子。由于样品制备中的微小差异以及注射之间的仪器灵敏度的差异(例如，实验室内的变化)，参考标准品(k0)的响应因子可能不同于第一样品204(k)的响应因子。类似地，可以在第一样品204与第二样品254之间类似地引入或发生差异(例如，实验室之间变化)。如在方程(2)中所示出的，在一些实施例中，将校正因子a0设置为1(a0＝1)以求解方程(2)从而导出方程(1)。然而，应该解的是，将哪种同种型设置为恒定值(a0＝1)并不重要；然而，通常设置最高丰度的同种型，其通常是未经修饰的同种型。
可以使用常规MAM方法或者具有更高精度的正交方法来建立参考标准品中每种属性的丰度值(Ai 0)。如果使用绝对定量方法，则对相同属性的所有后续的MAM 分析在校准后成为绝对测量。
方程(1)和方程(2)可以用于计算样品(例如，第一样品204)中每种同种型i 的丰度值(Ai)。例如，如方程(1)所示出的，根据包括校正因子(例如，ai)和每种同种型(例如，同种型Ii)的信号强度的值确定同种型i的丰度值(Ai)。
在图2的实施例中，与第一基于MAM的仪器210相关联的一个或多个处理器可以进一步被配置成确定与(多种)第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值(例如，如方程(1)所示出的Ai)，其中，第一组样品丰度值(例如，如方程(1)所示出的) 基于第一组校正因子(例如，方程(1)的ai)。如本文所描述的，可以以百分比形式来报告丰度值。如方程(1)所示出的，第一组样品丰度值(例如，Ai)进一步基于(多种)第一样品同种型的(多个)离子强度值(例如，方程(1)的Ii)。
图2还展示了对第二基于MAM的仪器260的校准。使用与用于校准(220)第一基于MAM的仪器210相同的参考标准品(或相同参考标准品的不同样品)来校准 (270)第二基于MAM的仪器260。以此方式，第二基于MAM的仪器260和第一基于MAM的仪器210二者实现了与可以经由报告280示出的一致的结果。应理解的是，以与针对第一基于MAM的仪器210所描述的相同或类似的方式来配置和校准第二基于MAM的仪器260，包括使用相同的参考标准品(例如，其中，参考标准品202 和参考标准品252是相同参考标准品的样品)，使得用于校准(例如，包括经由方程(1) 和方程(2))的本文披露内容如适用于第一基于MAM的仪器210一样同样适用于第二基于MAM的仪器260。
第二基于MAM的仪器260包括第二检测器(例如，如本文针对图1所描述的检测器140)。在图2的实施例中，第二基于MAM的仪器260具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置。如本文所描述的，第二基于MAM的仪器260的第二仪器条件可能不同于第一基于MAM的仪器210的第一仪器条件。在一些实施例中，因为第二基于MAM的仪器260可以具有不同于第一基于MAM的仪器210的第一仪器模型的第二仪器模型，所以第二仪器条件可以不同于第一仪器条件。在其他实施例中，因为第二基于MAM的仪器260可以具有不同于第一基于MAM的仪器210的第一组设置的第二组设置，所以第二仪器条件可以不同于第一仪器条件。
第二基于MAM的仪器260被配制成接收第二样品254(例如，属于蛋白水解肽的样品)和参考标准品252(例如，属于蛋白水解肽)。参考标准品252可以是与用于参考标准品202的参考标准品相同的参考标准品的不同样品。第二基于MAM的仪器260被进一步配置成经由第二检测器(例如，如本文针对图1所描述的检测器140) 检测来自第二样品的第二样品同种型(i)和来自参考标准品的第二参考标准品同种型。应认识到的是，在一些实施例中，第一样品、第二样品和参考中的每一个可以与共同蛋白水解肽相关联，使得第一样品具有给定蛋白水解肽、第二样品具有蛋白水解肽并且参考标准品具有蛋白水解肽。
第二基于MAM的仪器260可以与一个或多个处理器相关联。在一些实施例中，该一个或多个处理器是相同计算设备(例如，计算设备142)的一部分，使得与第一基于MAM的仪器210相关联的一个或多个处理器是与第二基于MAM的仪器260相关联的相同的一个或多个处理器。在其他实施例中，该一个或多个处理器是不同计算设备的一部分。
与第二基于MAM的仪器260相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二 MAM迭代确定与(多种)第二样品同种型(i)相对应的第二组校正因子(例如，ai)。应理解的是，可以在第二MAM迭代之前、期间或之后确定该组校正因子(例如，ai)，使得对该组校正因子的确定与第二MAM迭代相关联。在图2的实施例中，第二组校正因子(例如，ai)基于参考标准品252，其是与参考标准品202的参考标准品相同的参考标准品。与第二基于MAM的仪器260相关联的一个或多个处理器可以被进一步配置成确定与(多种)第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值(例如，Ai)，其中，第二组样品丰度值(例如，Ai)基于第二组校正因子(例如，ai)。
基于针对第一基于MAM的仪器210和第二基于MAM的仪器260确定的校正因子，如由本文所描述的共同参考标准品202和252校准的，当通过个两个仪器分析同一样品时，可以减小第一基于MAM的仪器210与第二基于MAM的仪器260之间的测量结果的差异性。可以经由报告280的一致的MAM结果来证明减小的差异性。例如，可以基于如本文所描述的应用第一基于MAM的仪器210的第一组校正因子(例如，ai)和第二基于MAM的仪器260的第二组校正因子(例如，ai)来减小根据第一组样品丰度值(例如，Ai)和第二组样品丰度值(例如，Ai)确定的(多个)方差值。如本文所描述的，在一些情况下，第一组样品丰度值和第二组样品丰度值的方差值可以减小至少25％。
因此，如针对图2所展示的，可以并行分析样品204和254以及共同参考标准品 (例如，202和252)以分别校准(220和270)第一基于MAM的仪器210和第二基于MAM的仪器260。以此方式，可以使用参考标准品(例如，202和252)中的已知浓度来生成报告样品中每个质量属性的浓度的报告280，以便即使用不同的仪器也能取得一致的结果，例如具有如本文所描述的不同条件的仪器。例如，第一基于MAM 的仪器210和第一基于MAM的仪器216中的每一个可以被配置成生成包括或以其他方式描述或报告同种型和/或(多种)质量属性的报告(例如，报告280)。例如，报告280可以包括作为图表报告的信息或数据，并且可以包括如响应因子、峰面积或其他信息等数据或信息，例如如针对图1所描述的。在各个实施例中，可以使用如本文所描述的参考标准品202或252在校准(220或270)之后生成报告280。
图3展示了根据本文所披露的各个实施例的用于经由运行时间信号强度校准在多个时间段内减小基于MAM的仪器(例如，基于MAM的仪器100)的差异性的方法300。应理解的是，以与针对图2的第一基于MAM的仪器210所描述的相同或类似的方式来配置和校准图3的基于MAM的仪器，包括使用参考标准品，使得用于校准(例如，包括通过方程(1)和方程(2))的本文披露内容同样适用于图3的基于 MAM的仪器。然而，关于图3，跨不同时间段(例如，跨不同运行、不同MAM迭代和/或不同天、小时等)使用相同的基于MAM的仪器。可以如针对图1的基于MAM 的仪器100所描述的那样来配置图3的基于MAM的仪器。
方法300在框304处开始(302)，其中，图3的基于MAM的仪器在第一时间段内可以接收第一样品(例如，样品204，其可以属于蛋白水解肽)和参考标准品(例如，参考标准品202，其可以属于蛋白水解肽)。
在框306处，基于MAM的仪器可以经由检测器(例如，检测器140)在第一时间段内检测来自第一样品的第一样品同种型(i)和来自参考标准品的第一参考标准品同种型。
在框308处，一个或多个处理器(例如，如针对图1所描述的一个或多个处理器) 可以被配置成经由第一MAM迭代在第一时间段内确定与(多种)第一样品同种型(i) 相对应的第一组校正因子(例如，ai)，其中，第一组校正因子(例如，ai)基于参考标准品。
在框310处，一个或多个处理器还可以被配置成经由第一MAM迭代并且在第一时间段内确定与(多种)第一样品同种型(i)相对应的第一组校样品丰度值(例如， Ai)。第一组样品丰度值可以基于第一组校正因子(例如，ai)。该基于MAM的仪器在该第一时间段内可以具有由第一组设置限定的第一仪器条件。第一仪器条件可以与针对图2所描述的相同或相似。
在框312处，基于MAM的仪器在第二时间段内可以接收第二样品(例如，其可以属于蛋白水解肽)和参考标准品(例如，其可以属于蛋白水解肽)。
在框314处，基于MAM的仪器可以经由检测器(例如，检测器140)在第二时间段内检测来自第二样品的第二样品同种型(i)和来自参考标准品的第二参考标准品同种型。
在框316处，一个或多个处理器可以被配置成经由第二MAM迭代在第二时间段内确定与(多种)第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，第二组校正因子基于参考标准品。
在框318处，一个或多个处理器还可以被配置成经由第二MAM迭代并且在第二时间段内确定与(多种)第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值。该第二组样品丰度值可以基于该第二组校正因子。该基于MAM的仪器在该第二时间段内可以具有由第二组设置限定的第二仪器条件。该基于MAM的仪器在该第一时间段内的该第二仪器条件可以不同于该基于MAM的仪器在该第二时间段内的该第二仪器条件。
基于针对每个时间段确定的校正因子，可以减小第一时间段与第二时间段之间的MAM迭代之间的测量结果差异性。例如，可以基于第一基于MAM的仪器的第一组校正因子和第二基于MAM的仪器的第二组校正因子来减小第一组样品丰度值和第二组样品丰度值的(多个)方差值。
如本文所描述的，图4a和图4b的实施例展示了使用如本文所披露的方差减小和校准对蛋白质P1的分析。P1在分子的一部分中含有两个O-连接的糖基化位点，如本文在图4b所示出的，每个具有6种不同糖型(同种型)。通过由不同实验室分析者使用不同的LC/MS仪器分析P1样品及其参考标准品来分别生成图4a和图4b的图示 400和450，该LC/MS仪器包括Q ExactiveTMBioPharma平台仪器和两个ExactiveTM Plus Orbitrap质谱仪器，每个仪器由赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)公司 (加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA))制造。所有数据均在赛默飞世尔科技公司提供的ChromeleonTM软件上处理，以确定每种感兴趣的肽的(多个)峰面积。使用常规 MAM迭代(402)以及新校准的MAM迭代(404)量化针对图4a和图4b的每个糖型所展示的丰度值(例如，Ai)。新校准的MAM程序(404)基于用于经由如本文所描述的运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准技术。为了获得P1参考标准品中每种属性的丰度值(例如，Ai 0)，通过常规MAM迭代(402)六次分析P1参考标准品，并且将六个测量结果的平均值用作参考标准品中的已知丰度。
图4a展示了图示400，该图示描绘了减小给定同种型跨六次示例MAM迭代的丰度值(例如，Ai)的仪器之间/实验室之间变化。例如，图示400的y轴410y以百分比形式示出了丰度值(例如，Ai)。图示400的x轴410x示出了六次示例MAM迭代 1到6，其将使用常规MAM迭代(402)确定的常规样品丰度值与使用新校准的MAM 迭代(404)确定的经校准丰度值进行比较，如针对本文所披露的各个实施例所描述的。例如，MAM迭代1到6可以是在不同的MAM仪器(例如，如针对图2所描述的第一MAM仪器210和第二基于MAM的仪器260)上运行的MAM迭代或者MAM 迭代1到6可以是跨不同时间段在同一MAM仪器上运行的MAM迭代(例如，如针对图3所描述的)。
特别地，在图4a的实施例中，图示400示出了糖型(同种型)的如使用常规MAM 迭代(402)和新校准的MAM迭代(404)两者所确定的测得的丰度值(例如，Ai)。具体地，图示400的糖型是第二内核唾液酸(SA)。在第一基于MAM的仪器(即第一ExactiveTMPlus Orbitrap质谱仪器)上测量在x轴410x上示出的迭代1到3。在不同的第二基于MAM的仪器(即不同的ExactiveTMPlus Orbitrap质谱仪器)上测量在 x轴410x上示出的迭代4到6。如在图示400中所示出的，与使用常规MAM程序(402) 的跨每次迭代1到6的丰度值的差异性相比，使用新校准的MAM程序(404)的跨每次迭代1到6的丰度值(例如，Ai)的仪器之间差异性显著减小。换言之，与使用常规MAM程序(402)的跨每次迭代1到6的丰度值的差异性相比，使用新校准的MAM程序(404)的跨每次迭代1到6的丰度值(例如，Ai)的仪器之间一致性显著提高。
图4b展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的减小六种示例同种型(包括图4a的同种型)的仪器之间/实验室之间偏差。图示450的y轴460y 以百分比形式示出了中间精度相对标准偏差(RSD)。RSD与丰度值(例如，Ai)相关。具体地，RSD的减小表明丰度值的差异性的减小。
图示400的x轴460x示出了六种示例同种型(1HexNAc、1内核、1SA、2SA、第二内核SA和Aglyco)。如本文所描述，图4a示出了对第二内核SA同种型的分析。如当比较常规MAM迭代(402)与新校准的MAM迭代(404)时所示出的，图4b 示出了六种同种型中的每一种中的相对标准偏差(RSD)(例如，糖型)的百分比减小。六种同种型中的每一种可以用作质量属性以测试对给定样品的批次的质量控制 (例如，P1)。因此，相同样品的测量结果中的一致性(即，减小的差异性/偏差)是很重要的。如图4b的图示450所示出的，新校准的MAM迭代(404)减小了相当大量(例如，两至三倍)的RSD，从最大值25％减小至最大值5％，即使当跨不同的仪器测量P1糖型时也是如此。
如本文所描述的，图5a和图5b的实施例展示了对第二蛋白质P2的属性的分析。具体地，关于图5a和图5b的图示500和图示550，P2参考标准品在40℃下孵育了 4周。然后将20％的这种胁迫样品掺入到P2参考标准品中以产生测试样品。使用胰蛋白酶用两种不同方案对此测试样品连同P2参考标准品以及胁迫样品进行消化，并且在具有不同柱、流动相和梯度的两种不同的LC/MS仪器上对每种消化物分析三次。将Thermo Q ExactiveTMBioPharma平台仪器用作第一基于MAM的仪器并且将 Orbitrap FusionTMLumosTMTribridTM质谱仪(赛默飞世尔科技公司)用作第二基于 MAM的仪器。在第一基于MAM的仪器上对P2参考标准品分析六次并且将每种属性的平均经测量丰度值用作标准丰度值。分析所有所得数据和信息以获得每种肽同种型的峰面积和相关丰度值。
另外，关于图5a和图5b，分析了P2的57种质量属性。例如，57种质量属性包括片段化、氧化、糖化、羟化、序列变体、异构化、脱氨基、C-末端赖氨酸、O-连接的聚糖和N-连接的聚糖。质量属性覆盖了从0.005％至5％的广泛范围的丰度值。
图5a展示了图示500，该图示描绘减小跨十二次示例MAM迭代的丰度值(例如， Ai)的仪器之间/实验室之间变化。例如，图示500的y轴510y以百分比形式示出了丰度值(例如，Ai)。图示500的x轴510x示出了十二次示例MAM迭代1到12，其将使用常规MAM迭代(402)确定的常规样品丰度值与使用新校准的MAM迭代(404) 确定的经校准丰度值进行比较，如针对本文所披露的各个实施例所描述的。例如， MAM迭代1到12可以是使用不同的MAM仪器(例如，如针对图2所描述的第一 MAM仪器210和第二基于MAM的仪器260)执行的MAM迭代或者MAM迭代1 到12可以是使用不同时间段内在同一MAM仪器上执行的MAM迭代(例如，如针对图3所描述的)。
特别地，在图5a的实施例中，图示500示出了K117羟基化的如使用常规MAM 迭代(402)和新校准的MAM迭代(404)两者所确定的测得的丰度值(例如，Ai)。具体地，图示500展示了通过两种消化方案和两种LC/MS仪器测量的K117羟基化的丰度，每种一式三份。MAM迭代1到3和7到9来自消化方案1并且运行4到6和 10到12来自消化方案2。MAM迭代1到6在QExactiveTMBioPharma平台仪器上执行，并且MAM迭代7到12在OrbitrapFusionTMLumosTMTribridTM质谱仪上执行。如在图示500中所示出的，与使用常规MAM程序(402)的跨MAM迭代1到12的丰度值的差异性相比，使用新校准的MAM程序(404)的跨所有MAM迭代1到12的丰度值(例如，Ai)的仪器之间差异性显著减小。换言之，与使用常规MAM程序(402) 的跨每次MAM迭代1到12的丰度值的差异性相比，使用新校准的MAM程序(404) 的跨每次MAM迭代1到12的丰度值(例如，Ai)的仪器之间一致性显著提高。因此，图5a展示了两种不同仪器模型的K117羟基化的测得的丰度值。利用常规MAM 程序(402)，跨两个不同的基于MAM的仪器获得不同的丰度变化。然而，新校准的 MAM程序(404)跨两个不同的基于MAM的仪器提供一致的丰度值。
图5b展示了图示，该图示描绘了根据本文所披露的各个实施例的减小跨57种质量属性的仪器之间/实验室之间偏差。图5a的K117羟基化占图5b的57种质量属性之一。图示550的y轴560y以百分比形式示出了中间精度RSD。图示550的x轴560x 示出了57种质量属性，其中，K117羟基化是一种这种质量属性。使用常规MAM程序(402)和新校准的MAM程序(404)确定57种质量属性中的每一种。图5b的图示550示出了当使用常规MAM程序(402)的质量属性的RSD通常在3％到50％的范围内时，对于大多数质量属性，使用新校准的MAM程序(404)的质量属性的RSD 减小至小于20％，因此示出了根据本文所披露的各个实施例的经由运行时间信号强度校准的差异性的减小。
如本文所描述的，经由运行时间信号强度校准来减小(多个)基于MAM的仪器的差异性产生质谱分析的优点(例如，如针对图2所描述的)。例如，如本文所描述的，校准响应因子(例如，ai)消除了对必须具有相同响应因子(k)的不同的肽同种型的需要。此技术可以应用于其他类型的仪器以用于MAM目的。例如，就常规方法而言，由于肽同种型中可能存在不同的片段化效率，因此三重四极杆仪器上的选择反应监测(SRM)不适用于MAM目的。然而，本文所描述的新校准的MAM程序使得能够在三重四极杆仪器上执行MAM，由于三重四极杆仪器具有更好的精度、线性度和动态范围，因此其可以比使用轨道阱(orbitrap)仪器更有优势。然而，在这种实施例中，可能需要首先在高分辨率的仪器上建立参考标准品中每种属性的浓度。
尽管本文的披露内容阐述了对许多不同实施例的详细说明，但应理解的是，本说明书的合法范围由在本专利的结尾处所阐述的权利要求的文字及其等效物限定。该详细说明仅被解释为是示例性的并且未描述每个可能的实施例，因为描述每个可能的实施例将是不切实际的。可以使用当前技术或在本专利提交日之后开发的技术来实施许多替代实施例，其仍然落入本权利要求的范围内。
以下附加考虑适用于前述讨论。贯穿整个说明书，多个实例可以实施被描述为单个实例的部件、操作或结构。尽管一种或多种方法的各个操作被示出和描述为单独的操作，但是可以同时执行各个操作中的一个或多个，并且不需要以所展示的顺序执行操作。在示例配置中作为单独部件呈现的结构和功能可以实施为组合结构或部件。类似地，作为单个部件呈现的结构和功能可以实施为单独的部件。这些和其他变化、修改、添加和改进都落入本文主题的范围内。
另外，本文将某些实施例描述为包括逻辑或许多例程、子例程、应用或指令。这些可以构成软件(例如，在机器可读介质上或在传输信号中具体化的代码)或者硬件。在硬件中，例程等是能够执行某些操作的有形单元并且可以以某种方式进行配置或安排。在示例实施例中，可以通过软件(例如，应用或应用部分)将一个或多个计算机系统(例如，独立的客户端或服务器计算机系统)或计算机系统的一个或多个硬件模块(例如，处理器或一组处理器)配置为操作以执行如本文所描述的某些操作的硬件模块。
本文所描述的示例方法的各种操作可以至少部分地由被临时配置(例如，通过软件)或永久配置成执行相关操作的一个或多个处理器来执行。无论是临时配置还是永久配置，这种处理器可以构成操作以执行一种或多种操作或功能的处理器实施的模块。在一些示例实施例中，本文提及的模块可以包括处理器实施的模块。
类似地，本文所描述的方法或例程可以至少部分地由处理器实施。例如，方法的至少一些操作可以由一个或多个处理器或由处理器实施的硬件模块来执行。对操作中的某些操作的执行可以分布在一个或多个处理器中，不仅驻留在单个机器内，还跨多个机器部署。在一些示例实施例中，一个或多个处理器可以位于单个位置中，而在其他实施例中，处理器可以跨多个位置分布。
对操作中的某些操作的执行可以分布在一个或多个处理器中，不仅驻留在单个机器内，还跨多个机器部署。在一些示例实施例中，一个或多个处理器或处理器实施的模块可以位于单个地理位置中(例如，在家庭环境、办公室环境或服务器群内)。在其他实施例中，一个或多个处理器或处理器实施的模块可以跨多个地理位置分布。
此详细描述仅被解释为是示例性的并且未描述每个可能的实施例，因为描述每个可能的实施例如果不是不可能也将是不切实际的。本领域普通技术人员可以使用当前技术或者在本申请的提交日之后开发的技术来实施许多替代实施例。
本领域普通技术人员将了解到，在不脱离本发明的范围的情况下，关于上文描述的实施例可以做出各种各样的修改、改变和组合，并且可以将这种修改、改变和组合视为在本发明构思的范围内。
除非明确列举传统的装置加功能语言，如在(多项)权利要求中明确列举的“用于……的装置”或“用于……的步骤”的语言，否则本专利申请结尾处的专利权利要求不旨在根据35U.S.C.§112(f)来解释。本文所描述的系统和方法涉及改进计算机功能，并改进常规计算机的运行。
方面
本披露内容的以下方面仅是示例性的并且不旨在限制本披露内容的范围。
1.一种校准系统，该校准系统被配置成经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性，该校准系统包括：第一基于MAM 的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置，该第一基于MAM的仪器被配置成接收第一样品和参考标准品，并且该第一基于 MAM的仪器被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型；与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代来确定与该(多种)第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品，并且与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该(多种)第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；第二基于MAM 的仪器，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，该第二基于MAM的仪器被配置成接收第二样品和该参考标准品，并且该第二基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型；以及与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品，并且与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
2.根据方面1所述的校准系统，其中，与该第一MS仪器相关联的一个或多个处理器经由该第一MAM迭代来确定质量属性。
3.根据方面2所述的校准系统，其中，该质量属性是以下各项中的任一项：该第一样品同种型、蛋白质或所鉴定杂质。
4.根据方面2或方面3所述的校准系统，其中，该质量属性限定以下各项中的任一项或多项：片段化、氧化、糖化、羟基化、序列变体、异构化、脱酰胺化、C- 末端赖氨酸、O-连接的聚糖和/或N-连接的聚糖。
5.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，与该第一MS仪器相关联的一个或多个处理器被配置成生成包括该质量属性的报告。
6.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一仪器模型不同于该第二仪器模型。
7.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一组设置不同于该第二组设置。
8.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一组校正因子基于该第一参考标准品同种型的离子强度值和该第一参考标准品同种型的第一参考标准品丰度值。
9.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一组校正因子校准与该第一组样品丰度值相关联的响应因子以确定该第一样品同种型的该离子强度值。
10.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一组样品丰度值进一步基于该第一样品同种型的离子强度值。
11.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一基于MAM的仪器为质谱(MS)仪器。
12.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一基于MAM的仪器为三重四极杆仪器。
13.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，与该第一MS仪器相关联的一个或多个处理器经由计算机网络通信地耦合至与该第二MS仪器相关联的一个或多个处理器。
14.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器是与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器。
15.根据前述方面中任一项所述的校准系统，其中，该第一基于MAM的仪器位于第一地理位置处的第一实验室处，并且该第二基于MAM的仪器位于第二地理位置处的第二实验室处。
16.一种用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准方法，该校准方法包括：在包括第一检测器的第一基于 MAM的仪器处接收第一样品和参考标准品；经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型；经由与该第一基于 MAM的仪器相关联的一个或多个处理器在第一MAM迭代内确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品；经由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器来确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子，并且其中，该第一基于MAM的仪器包括由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1) 第一仪器模型或(2)第一组设置；在包括第二检测器的第二基于MAM的仪器处接收第二样品和该参考标准品；经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型；经由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器在第二MAM迭代内确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品；经由与该第二基于MAM 的仪器相关联的一个或多个处理器来确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，该第二基于 MAM的仪器包括由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，并且其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
17.一种用于经由运行时间信号强度校准在多个时间段内减小基于MAM的仪器的差异性的校准方法，该校准方法包括：在第一时间段内在基于MAM的仪器处接收第一样品和参考标准品；经由该基于MAM的仪器的检测器在该第一时间段内检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型；经由一个或多个处理器在该第一时间段内在第一MAM迭代内确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品；经由该一个或多个处理器在该第一时间段内经由该第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子，并且其中，在该第一时间段内该基于MAM的仪器包括由第一组设置限定的第一仪器条件；在第二时间段内在该基于MAM的仪器处接收第二样品和该参考标准品；经由该基于MAM的仪器的检测器在该第二时间段内检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型；经由该一个或多个处理器在该第二时间段内在第二MAM迭代内确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品；以及经由该一个或多个处理器在该第二时间段内经由该第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，在该第二时间段内该基于MAM的仪器包括由第二组设置限定的第二仪器条件，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，并且其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
18.根据方面17所述的校准系统，其中，该一个或多个处理器确定质量属性。
19.根据方面18所述的校准系统，其中，该质量属性是以下各项中的任一项：该第一样品同种型、该第二样品同种型、蛋白质或所鉴定杂质。
20.根据方面17至19中任一项所述的校准系统，其中，该一个或多个处理器被配置成生成包括该质量属性的报告。
21.根据方面1所述的校准系统，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的该方差值减小至少25％。
22.根据方面16所述的校准方法，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的该方差值减小至少25％。
23.根据方面17所述的校准方法，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的该方差值减小至少25％。
24.根据方面1所述的校准系统，其中，该第一样品属于蛋白水解肽，该第二样品属于该蛋白水解肽，并且该参考标准品属于该蛋白水解肽。
25.根据方面16所述的校准方法，其中，该第一样品属于蛋白水解肽，该第二样品属于该蛋白水解肽，并且该参考标准品属于该蛋白水解肽。
26.根据方面17所述的校准方法，其中，该第一样品属于蛋白水解肽，该第二样品属于该蛋白水解肽，并且该参考标准品属于该蛋白水解肽。
附加披露内容
如本文所描述的，提供了用于通过将参考标准品中的每种属性的已知丰度用作校准物来确定每种属性的丰度的新校准系统和方法。参考标准品中的大多数质量属性在标准品的整个寿命内保持不变并且因此可以充当用于校正仪器或样品制备程序之间的差异的校准物。由于在典型的MAM方法中通常收集参考标准品数据以实现同一性和系统适用性目的，所以不需要分析者进行附加工作。利用这种方法，不再需要一致仪器模型。同时，实验室之间的细微消化程序变化以及通过自动化进行的改变将不会显著影响测定结果。
属性的分类
基于属性的丰度在样品制备期间是否可能发生变化，出于MAM的目的，将每种属性分类为三种类型之一，这些类型包括1型属性、2型属性和3型属性。
1型属性在样品制备期间不发生变化。实例包括序列变体、赖氨酸和脯氨酸羟基化等。当样品在样品制备期间未经历极低pH时，可以将大多数糖基化分类到此组中。
2型属性的丰度在样品制备期间可能减小。实例包括由于修饰的不稳定性导致的磷酸化。因为2型属性的反应(例如，磷酸化损失)底物通常是次要组分(例如，磷酸化的肽)，所以2型属性在样品制备期间的绝对变化很小。特殊的2型属性是剩余的N-末端谷氨酰胺。当蛋白质的N-末端是谷氨酰胺残基时，其通常会环化以形成作为主要组分的焦谷氨酸。作为次要组分的N-末端谷氨酰胺在此项工作中被认为是焦谷氨酸的经修饰形式。N-末端谷氨酰胺是2型属性，因为在样品制备期间可能发生环化以减小游离N-末端谷氨酰胺的丰度。
3型属性的丰度在样品制备期间可能增大。3型属性包括氧化、脱酰胺化、天冬氨酸异构化、片段化等。因为3型属性的反应底物是主要的未经修饰的肽，所以其在样品制备期间的绝对变化可能相当高。
如稍后将讨论的，通常可以以高精度和低定量限度来测量1型和2型属性，因为结果的变化仅仅或主要来自LC-MS测量结果。另一方面，3型属性具有较低的精度和较高的定量限度，因为样品制备的变化有助于最终结果的变化。
符号
可以将本文所使用的符号总结如下：A表示同种型的丰度，以分数值(或百分比)表示。I表示同种型的测得的离子强度(选择离子色谱图中峰值下面的面积)。K表示响应因子，并且a表示响应因子的校正因子。上标0表示参考标准品(RS)。例如， A0表示RS中的同种型的已知丰度，并且I0表示RS中的同种型的测得的离子强度。下标0、1、2、…i、…n表示与指定残基(包括未经修饰的形式)相关联的n+1种同种型。下标0表示最高丰度的同种型(通常是未经修饰的形式)。例如，Ai表示同种型i的丰度，Ii表示同种型i的离子强度，ki表示同种型i的响应因子，并且ai表示同种型i的响应因子校正因子。a0的值被限定为1。当除主要同种型之外仅存在一种同种型(n＝1)时，下标1在某些方程中可以省略。注意，当在本报告中提到同种型 i＝0、1、……n时，无论是否明确说明，这些同种型通常与单个残基相关联。例如，可以存在与肽中的Asn残基相关联的三种同种型，包括未经修饰的Asn、其脱酰胺化形式和其琥珀酰亚胺形式。然而，同一肽上的被氧化的Met残基可以属于不同的一组同种型(例如，假设这两种修饰是随机的并且因此彼此独立)。
常规MAM
在常规MAM方法中，在以下常规假设下基于经修饰肽和未经修饰肽的MS响应 (例如，选择离子色谱图中的峰值下面的面积)来计算每种属性的丰度(例如，肽中的氨基酸残基的不同修饰状态)：
1.在每个样品内，与氨基酸残基相关联的所有同种型具有同一响应因子 (所有响应因子的比率＝1)
2.人工诱导的属性变化可忽略不计
假设氨基酸残基具有n+1种修饰状态(0、1、…、n)，则存在与感兴趣的残基相关的n+1种肽同种型。最高丰度的同种型(通常是未修饰的)被表示为i＝0。每种同种型的丰度是基于以下方程(3)来计算的：
Figure BDA0002807026570000331
在上文的方程(3)中，k是肽的所有同种型的响应因子(例如，基于上文的常规假设1的恒定值)，并且Ai和Ii分别是同种型i的丰度和MS强度。响应因子k表示肽回收和每种同种型的MS响应两者的组合。
求解方程(3)得到方程(4)：
Figure BDA0002807026570000332
方程(4)表明，每种同种型的丰度通过同种型的MS强度除以所有同种型的MS 强度之和来计算。
由于上文所描述的假设，常规MAM方法必须满足以下要求：
1.消化效率必须是可再现的。
2.MS仪器条件必须相同。
3.样品制备必须引进最少量的人工修饰。
然而，在现实世界中，至少由于以下原因而很难满足以上要求：
1.由于样品制备程序、分析者习惯、设备和试剂质量等的变化，肽回收可能发生变化。
2.由于在MS仪器模型、仪器设置和维护仪器的方式的差异，不同肽同种型的响应因子可能不同。
3.由于样品制备程序、分析者习惯、设备和试剂质量以及仪器条件的变化，人工引入的修饰的量可能不同。
由于常规MAM要求的以上困难，需要新方法来克服这些挑战以确保MAM的长期成功。
使用参考标准品校准响应因子
在MAM中，参考标准品通常与样品并行分析以实现系统适用性和同一性目的。因为参考标准品中的大多数质量属性在标准品的整个寿命内保持不变，所以参考标准品可以充当用于校正仪器或样品制备程序之间的差异的校准物。可以使用常规MAM 方法或者具有更高准确度的正交方法来建立参考标准品中的每种属性的丰度。如果参考标准品中的属性丰度是通过具有绝对定量的分析性方法确定的，则同一属性的所有后续MAM分析在响应因子校准之后也变为绝对测量结果。
在每次运行中将参考标准品用作校准物，可以消除关于实验室之间和仪器之间可再现性的对常规MAM的大多数要求。在这种实施例中，然后将如本文上文所描述的常规的两个假设修改如下，即，修改后的假设：
1.在同一LC-MS序列内，所有同种型中的响应因子的比率保持不变。
2.人工诱导的属性变化可忽略不计。
注意，在第一修改后的假设中，不是要求所有肽同种型在产品的寿命内具有同一响应因子(所有响应因子的比率＝1)，而是该假设仅要求响应因子比率在同一LC-MS 序列(同一分析者、同一仪器以及同一天)内是恒定的。
根据新的修改后的假设，不再假设每种同种型具有同一响应因子。相反，假设在参考标准品和样品两者中，通过同一校正因子ai来修改同种型i的响应因子。因此，参考标准品中的同种型i的响应因子表示为aik0(其中，上标0代表参考标准品)，并且样品中的同种型i的响应因子表示为aik。在考虑参考标准品和样品两者之后，方程(3)变为方程(5)，该方程(5)与本文所描述的方程(2)相同：
Figure BDA0002807026570000341
在一些实施例中，由于样品制备的微小差异、仪器灵敏度的差异等，参考标准品和样品的响应因子可能不同。另外，对于可求解的方程，这些同种型之一的因子a通常被设置为常量值。将哪种同种型设置为常量a并不重要。一种好的方法是将其设置为最高丰度的同种型(其通常是未经修饰的形式(a0＝1))。
求解方程(5)得到方程(6)，该方程(6)与本文所描述的方程(1)相同：
Figure BDA0002807026570000351
可以将方程(6)用于基于参考标准品中的已知属性丰度(Ai 0)来计算每种同种型的校正因子(ai)，并且计算样品中的每种同种型的丰度(Ai)。为了使参数ai具有定义明确的值，分母不得接近于零。因此，为了实现成功的响应因子校准，参考标准品中的每种属性必须具有足够高的丰度(Ai 0)才能进行精确量化。
使用参考标准品校准人工修饰
由于一些属性的不稳定性导致的修饰损失(2型)或者由于这些修饰的人工形成(3型)，一些属性(包括如磷酸化等2型属性以及如氧化、脱酰胺化、Asp异构化和片段化等3型属性)可能在样品制备期间改变其丰度。属性的这些人工变化引起分析者到分析者和逐日差异性，并且可以通过将参考标准品用作校准物来进行校正，条件是这些人工变化的程度在同一LC-MS序列中是一致的。
在用因子bi表示每种同种型的人工变化的程度的实施例中，然后在考虑参考标准品和样品两者之后，方程(3)变为方程(7)：
Figure BDA0002807026570000352
在方程(7)中，Si表示产生同种型i的人工修饰的底物。例如，对于氧化和脱酰胺化(3型属性)，底物是未经修饰的肽。然而，对于磷酸化(2型属性)，由于可能的修饰不稳定性，底物是经修饰的(磷酸化的)肽。
取决于底物的性质，方程(7)可能会变复杂。例如，将方程(7)用于同一残基上的多种修饰，如天冬酰胺残基上的N-糖基化可以产生方程(7)的复杂变体。
如本文所描述的，对于具有单一修饰的残基，可以将方程(7)简化为方程(8)和 /或方程(9)，这取决于底物是经修饰的肽(2型)还是未经修饰的肽(3型)。如在下文的实施例中所示出的，对于方程(8)和(9)，右边方程部分是左边方程部分的解。
具体地，对于2型属性并且关于方程(8)：
Figure BDA0002807026570000361
对于3型属性并且关于方程(9)：
Figure BDA0002807026570000362
在方程(8)中，如果人工修饰的量远小于未经修饰的形式(即，b<<1)(这通常适用于大多数2型属性)，则可以将方程(8)估计为方程(10)：
Figure BDA0002807026570000363
当a1＝1+b时，方程(10)类似于方程(5)。也就是说，在这种实施例中，消化期间的修饰损失可以通过响应因子校准来建模，并且方程(8)和(5)将产生非常类似的结果。
为了使参数b和属性丰度A具有定义明确的值，分母不得接近于零。因此，要使用方程(8)，参考标准品中的属性的丰度(A0)就必须远大于0。要使用方程(9)，A0就必须远小于1(100％)，并且b不得接近于1。另外，为了使方程(9)具有一般意义，b的值必须远小于未进行校准的属性的丰度(b<<I/(I0+I))。否则，校准后的丰度A将接近于零并且有时为负值。
使用两种不同的标准品校准响应因子和人工修饰两者
可以将参考标准品用于校正响应因子(a)(即，“a-校准”)和/或者人工修饰(b)(即，“b-校准”)。校正a和b两者需要附加标准品。为了获得不同的标准品，可以胁迫参考标准品或另一样品以产生含有较高水平的感兴趣属性的另一标准品，并且然后将两种标准品与样品一起进行分析。可以将这两种标准品的已知属性丰度及其确定的MS响应用于校正a和b两者。
当考虑两种标准品以及样品时，可以使用上标零来表示参考标准品并且可以使用上标1来表示胁迫标准品。方程(11)和(12)展示了代表性方程，这取决于人工修饰的底物。注意，方程(11)和(12)适用于具有单一修饰的残基。
对于2型属性并且关于方程(11)：
Figure BDA0002807026570000371
对于3型属性并且关于方程(12)：
Figure BDA0002807026570000372
如上文针对方程(11)和/或(12)所示出的，为了使参数a和参数b具有定义明确的值，分母不得接近于零。因此，方程(11)要求
Figure BDA0002807026570000373
并且方程(12)要求A1＞＞A0且A0＜＜1。类似于方程(9)，为使方程(12)有意义，b的值必须远小于未进行b-校准的属性的丰度(b<<I/(aI0+I))，否则，校准后的丰度A将接近于零并且有时为负值。
抗链霉亲和素IgG2的多属性分析的实例
如本文所描述的，已经经由本披露内容的校准系统和方法的特定应用将各个示例实施例付诸实践。然而，应理解的是，本披露内容的校准系统和方法不限于特定应用。例如，重组型抗链霉亲和素IgG2由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系表达。抗链霉亲和素IgG2材料被用作参考标准品。为了产生用于分析的测试样品，将参考标准品在大约40℃下孵育约30天以产生样品1，并且然后通过将样品1与参比标准品以不同比率混合来产生样品2和样品3(参见表2)。
使用以下程序用胰蛋白酶来消化IgG2参考标准品和测试样品(每种约120μg)。首先，在含有6.5M盐酸胍(宾夕法尼亚州斯特劳兹堡万安精细化学品公司(Macron FineChemicals))和0.2M Tris(加利福尼亚州霍利斯特天惠华公司(TEKnova))的 pH为7.5的变性溶液中，在大约25℃下用8mM二硫苏糖醇将每种样品处理约30 分钟以还原二硫键。然后，在黑暗环境中在大约25℃下用14mM碘乙酸将还原后的 IgG2烷基化约20分钟。用6mM DTT淬灭烷基化反应。
为了在样品制备程序中有意产生某种差异，使用两种不同的方法用胰蛋白酶来消化每种经还原/烷基化的样品。在第一种方法中，例如根据制造商的推荐程序，使用 Bio-Rad(加利福尼亚州赫拉克勒斯公司(Hercules))Bio-
Figure BDA0002807026570000381
6柱将经还原/烷基化的样品(IgG2浓度为约1.2mg/mL)交换到含有大约0.1M Tris和大约50mM甲硫氨酸的消化缓冲液(pH 7.5)中。在缓冲液交换之后，加入适量的胰蛋白以实现大约1: 12的酶:底物比率，然后在大约37℃下孵育约60分钟。在8M盐酸胍中使用等体积的大约0.25M乙酸盐缓冲液(pH4.8)来淬灭消化。消化物中的最终IgG2浓度为约0.5mg/mL。
在第二种方法中，使用Microcon-30kDa过滤器(马萨诸塞州伯灵顿密理博西格玛公司(Millipore Sigma))将每种经还原/烷基化的样品交换到同一消化缓冲液中。首先，将每种经还原/烷基化的样品在大约14000g下旋转沉降，并且弃去流出物 (flow-through)。在某些实施例中，每次向过滤器加入250μL消化缓冲液后将该过程重复三次。在同一过滤器上通过以下进行胰蛋白酶消化：加入140μL消化缓冲液和 10μg胰蛋白酶(以1mg/mL)，然后在大约37℃下孵育约60分钟。消化后，向过滤器加入等体积的淬灭溶液，并且在大约14000g下旋转沉降以在新的接收管中收集肽。根据上文的程序，消化物中的最终IgG2浓度为约0.4mg/mL。
表2示出了在示例中使用的抗链霉亲和素IgG2样品。
表2
Figure BDA0002807026570000391
在抗链霉亲和素IgG2和/或类似的实施例中，在由连接至质谱仪，例如赛默飞费科技(Thermo Scientific)Q Exactive Plus Biopharma质谱仪或者Orbitrap Fusion Lumos质谱仪的安捷伦(Agilent)(加利福尼亚州圣克拉拉)HPLC系统构成的三个LC-MS/MS 系统中的每一个上分析每种消化物。还使用了附加的或替代性的系统，如本文中的披露内容，不限于任何一种类型的系统、质谱仪等。在一些实施例中，为了在液相色谱条件中有目的地引入某种差异，使用了两种不同的LC方法(参见表3)。
对于第一种LC方法(例如，表3中的系统A和系统B)，使肽在沃特世(Waters) (马萨诸塞州米尔福德)Acquity肽CSH柱(150×2.1mm、1.7μm颗粒、孔径
Figure BDA0002807026570000392
) 上以大约0.3mL/分钟的流速进行洗脱，其中柱温保持处于大约60℃。流动相A为水中的0.1％甲酸，并且流动相B为乙腈中的0.1％甲酸。在大约0.5％的B下初始保持约5分钟之后，流动相B总体上在约40分钟内线性增加至大约35％。通过在约4分钟内将流动相B增加至大约99％，保持约1分钟来实现柱洗涤。用大约0.5％的B使柱平衡约15分钟。对于第二种LC方法(例如，表3中的系统C)，使肽在沃特世Acquity BEH C18柱(2.1×150mm、1.7μm颗粒)上以大约0.3mL/分钟的流速进行洗脱，其中柱温保持处于约60℃。流动相A为水中的0.1％甲酸和约0.02％三氟乙酸(TFA)，并且流动相B为乙腈中的0.1％甲酸和0.02％TFA。在大约0.5％的B下初始保持约5分钟之后，相B总体上在约40分钟内线性增加至大约40％。通过在约4分钟内将相 B增加至大约99％，保持约1分钟来实现柱洗涤。用大约0.5％的B使柱平衡约15分钟。
将HPLC系统通过电喷雾接口直接连接至质谱仪，例如，赛默科技Q Exactive PlusBiopharma质谱仪(例如，系统A)或赛默科技Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(例如，系统B和系统C)。虽然本文的实施例描述了赛默科技Q Exactive Plus Biopharma质谱仪和/或赛默科技Orbitrap Fusion Lumos质谱仪，但是应理解的是，根据本文所披露的实施例可以使用类似的(多种)质谱仪。将Q Exactive Plus Biopharma设置为以约 70,000的分辨率和AGC＝1×106执行全扫描MS，然后是对最高丰度离子的五次数据依赖性MS/MS(高能碰撞解离(HCD)归一化碰撞能量＝27)。对于Fusion Lumos，以约60,000的分辨率和AGC＝4×105来收集全扫描MS数据，然后是离子阱中的最高速度数据依赖性MS/MS(CID归一化碰撞能量＝30)。通过分析软件，例如赛默科技Xcalibur软件来完成仪器控制和数据收集。注入约3μg至4μg的每种胰蛋白酶消化物用于分析。当然，根据本文所披露的实施例可以使用与Xcalibur软件类似的软件。
在如可以BiopharmaFinderTM购自赛默飞科技的分析软件MassAnalyzer上处理LC-MS/MS数据。如MassAnalyzer等分析软件能够以全自动化的方式执行特征提取、保留时间比对、肽鉴定和属性量化。对于肽鉴定，分析软件，例如MassAnalyzer可以依赖于实验性MS/MS与精确预测的理论性MS/MS的比较。使用匹配窗函数来提取选择离子色谱图以最大化色谱图中的信噪比。作为最终输出，分析软件，例如 MassAnalyzer)可以产生所鉴定变体的列表。应理解的是，根据本文所披露的实施例可以使用与MassAnalyzer类似的分析软件。
对融合蛋白的多属性分析的实例
由CHO细胞表达的重组融合蛋白(例如，第一蛋白质或蛋白质片段与至少第二蛋白质或其片段重组融合，通常使连接子与蛋白质/片段连接)可以在如苏氨酸残基和丝氨酸残基上包含多个糖基化位点。这些O-聚糖可能对分子的异质性贡献最大。在此示例中，多属性方法用于量化融合蛋白中的这些糖型。
对于蛋白水解消化，首先在大约1mg/mL的蛋白质浓度下使融合蛋白在含有大约7.5M盐酸胍、大约250mM tris(pH 7.5)和大约2mM EDTA的溶液中进行变性。在蛋白水解消化之前，将大约2μl的500mM DTT溶液加入到大约100μL的变性蛋白质溶液中，然后在大约25℃下孵育约30分钟以还原二硫键。然后，加入大约4μL 的500mM碘乙酸钠，然后在约25℃下孵育约20分钟以烷基化半胱氨酸侧链。在通过Bio-Rad Bio-Spin脱盐柱使缓冲液交换到100mM tris、50mM甲硫氨酸、pH 7.5的溶液后，用大约5μg的胰蛋白酶将每50μg的脱盐样品在大约37℃下消化约30分钟。为了淬灭消化，将大约2％的甲酸加入到每个消化物中以使最终酸浓度为大约0.2％。
使用由直接与质谱仪(例如，Thermo Scientific Exactive plus质谱仪或QExactive plus高分辨率质谱仪)连接的Agilent HPLC构成的LC-MS系统来分析每种胰蛋白酶消化物(约3μg)(参见表3)。在Agilent Zorbax C18 RR HD柱(2.1×150mm、1.8μm 颗粒、孔径为
Figure BDA0002807026570000412
)上以大约0.2mL/分钟的流速洗脱肽，柱温保持在50℃。流动相A为水中的大约0.1％的甲酸，并且流动相B为乙腈中的0.1％的甲酸。从大约1.0％开始，流动相B在约70分钟后线性增加到大约40％并且在约76分钟时增加到大约 90％。在大约90％下洗涤约5分钟后，用大约1％的B使柱平衡约11分钟。以140,000 的分辨率收集全扫描MS数据，并且将自动增益控制(AGC)目标设定为1x 10。例如通过Thermo Scientific Xcalibur软件来完成仪器控制和数据收集。
例如通过Thermo Scientific Pinpoint软件和Chromeleon软件来分析数据以鉴定和相对定量翻译后修饰。使用HCD和电子转移解离(ETD)通过MS/MS来表征O-糖肽列表，其中，通常发现六种糖型。Pinpoint可以生成具有六种形式的O-糖肽的准确质量和同位素分布的工作簿。将该工作簿导入到Chromeleon软件中，其中，其通过保留时间、准确质量以及同位素分布来靶向MS1前体离子。在Chromeleon中构建选择离子色谱图，并且将每个峰整合为峰面积。手动确认每个峰的整合以确保准确性。
表3展示了如所描述的示例LC-MS系统和测量结果。
表3
Figure BDA0002807026570000411
Figure BDA0002807026570000421
响应校准的实例
使用被配置成实施本文所描述的一个或多个方程的分析软件(如
Figure BDA0002807026570000423
(华盛顿州雷德蒙德(Redmond,WA))
Figure BDA0002807026570000422
)进行响应校准。通过分析软件(例如，MassAnalyzer)来处理抗链霉亲和素相关数据。由于MassAnalyzer直接输出每种属性的未经校准的丰度，并且这些未经校准的丰度与相应MS强度(峰面积)成比例，因此将其在相应计算中视为MS强度。使用Thermo Scientific Chromeleon来处理Fc-融合蛋白数据，其中，每种属性的峰面积被确定并且用作MS强度以进行相应计算。通常的做法是对参考标准品样品进行至少两次分析(以归类样品)。为了反映现实世界性能，在计算中使用两个参考标准品运行的平均MS强度。
抗链霉亲和素IgG2中大量属性的测量的实例
在此示例中，证明了对如本文所披露的校准系统和方法的性能的综合评估。将抗链霉亲和素IgG2参考标准品在大约40℃下孵育约四周。然后分别将大约10％和大约 20％的此胁迫样品掺入到参考标准品中，以产生另外两个测试样品(参见例如表2)。将这种测试样品连同参考标准品以及胁迫样品一起用胰蛋白酶一式三份地用两种不同方案进行消化，并且用不同的柱、流动相、梯度和质谱仪在三种不同LC-MS系统(参见例如表3中示出的A、B和C)上对每种消化物进行分析。另外，对参考标准品和胁迫样品各自在系统A上分析六次，并且将每种属性的平均测量丰度用作参考丰度。通过分析软件(例如，MassAnalyzer)来处理所有数据，以获得每种肽同种型的未经校准的丰度。将这些丰度用作MS强度以进行进一步校准。
由于系统A和系统B使用相同的色谱条件，因此来自这些运行(例如，总共60 次LC-MS/MS运行)的数据被一起处理，因为其具有一致的保留时间。例如，总共标识177种质量属性并且将其量化为高于检测极限(例如，如所有60次运行中的非零峰面积所示的)。这种属性覆盖广泛的丰度水平，包括从0.001％到39％。这种属性包括序列变体、羟基化、N-连接的聚糖和O-连接的聚糖、N-末端变体和C-末端变体、片段化、糖化、氧化、脱酰胺、琥珀酰亚胺形成等。将片段化与胰蛋白酶的非特异性活性在其在胁迫样品中的增加水平方面进行区别(例如，当与参考标准品运行相比时， t-测试p-值<0.005并且倍数变化>2.0)。
校准响应因子的实例(a校准)
通过使用参考标准品来进行响应因子校准(参见方程(5)和(6))，计算这三个样品中177种属性中的每一种的丰度。图6展示了关于两种不同的仪器设置和两种不同的样品制备程序的在样品2中的两种属性的测得的丰度的图示602。在响应因子校准之后，如本文所描述的，由样品制备和仪器设置的差异引起的变化大大减小，如图 6的12个测量结果(即，A/1、A/2、B/1和B/2)的相对标准偏差(RSD)所示。具体地，图6的实施例通过两个LC-MS系统(例如，A和B)和两种消化方案(/1和 /2)描绘了重链Cys127Tyr序列变体(顶部)(604)和未糖基化的Asn289(底部)(606) 的样品2中在经响应因子校准和未经响应因子校准的情况下的测得的丰度。在响应因子校准之后(参见方程(6))，仪器和样品制备程序之间的差异大大减小，如RSD值 605和607所示。
图7展示了图示702，该图示描绘了三种属性类型的在经响应因子校准(704) 和未经响应因子校准(706)的情况下(参见方程(6))的中间精度(例如，由RSD 所示)的示例比较。如在图7中所示出的，在校准大约86％的所监测属性之后，中间精度得到了大大提高。图7的值的形状表示属性的类型，并且开放形状值表示在将被精确量化的参考标准品中具有足够高丰度的属性(序列内RSD<10％)。
具体地，图7示出了在经响应因子校准(704)和未经响应因子校准(706)的情况下三种样品中的所有177种属性(120种1型属性、12种2型属性和45种3型属性)的所确定RSD(根据如在图6中所示出的在两种消化方案和两种仪器设置的情况下的12个测量结果)。图7表示总共177×3＝531个数据点，每个数据点具有12个测量结果。大多数数据点(457个或86％)的RSD在响应因子校准之后减小。在这 531个数据点中，RSD<10％的点的数量从校准前的64(12％)增加至校准后的205 (39％)。在这些之中，在图7的实施例中，1型属性从55个增加至171个，2型属性从2个增加至36个，3型属性从7个增加至19个。在具有良好中间精度(RSD<10％) 的这205个数据点中，83％(205个中的171个)是1型属性。
如前所讨论的，响应因子校准要求参考标准品中的属性的丰度通常足够高才能进行准确量化。在图7中，丰度比标准偏差高10倍(序列内RSD<10％)的属性用开放形状值标记。例如，至少在图7的实施例中，校准后RSD低于10％的大多数属性在参考标准品中具有高丰度(即，开放形状值)。
校准人工修饰的实例(b校准)
对于关于2型和3型属性的实施例，可以将方程(8)用于2型属性并且将方程(9) 用于3型属性来校准不同样品制备条件之间的人工修饰变化。
例如，图8展示了对2型属性的人工修饰的校准的实施例的图示802，该图示示出了与响应因子a校准类似的结果。具体地，图8展示了校准后的2型属性的中间精度(例如，三个样品中的两种属性产生六个测量结果(806))的提高，将该中间精度与在响应因子校准之后的RSD(804)进行比较。根据本文所描述的实施例，这两种校准方法产生非常类似的RSD。
图9展示了与响应因子a校准相比较的对3型属性的人工修饰b校准的性能的图示902。如图9所展示的，对于3型属性，对人工修饰(904)的校准提高了大多数测量结果的中间精度。对于校准参数b接近未经校准的属性丰度I/(I0+I)的属性，经校准的丰度A(参见方程(9))将如此接近于零，以至于其可能显著影响RSD值。为了在不同的校准方法之间进行公平比较，通过将经校准的丰度的标准偏差除以平均经 a校准的属性丰度来计算RSD。与响应因子校准(a校准)相比，当未经校准的RSD (906)低于50％时，人工修饰校准(b校准)产生类似的性能。当未经校准的RSD 高于50％时，与a校准相比，b校准性能可能变得不太有效，并且当未经校准的RSD 接近100％时，校准人工修饰使得结果较不一致(例如，较高的RSD)。
校准响应因子(a)和人工修饰(b)两者的实例
在一些实施例中，当通过胁迫参考标准品容易获得第二标准品时，可以针对3型属性校准响应因子和人工修饰两者。图10展示了与单标准品响应因子(a)校准相比较的针对3型属性的双标准品校准(a和b)的性能的实施例的图示1002。具体地，图10示出了与无校准(1006)相比的通过将参考标准品和胁迫样品(样品1)用作两个标准品并且将样品2和3用作样品进行的校准(1004)的性能。通过将经校准的丰度的标准偏差除以平均经a校准的属性丰度来计算RSD。图10表明，双标准品校准的性能通常优于单标准品响应因子校准，但是改进程度可能很小，并且在这种但不是所有的情况下，可能无法证明在给定产物的寿命内维持第二参考标准品。
用由迥然不同的LC-MS系统产生的数据进行的实例响应因子校准
图11展示了图示1102，该图示描绘了通过响应因子校准而在两个不同的LC-MS 系统中收集的两个数据集的一致性方面取得改进。具体地，图11展示了在经响应因子校准(1114)和未经响应因子校准(1116)的情况下通过系统A(1104)和系统C (1106)比较所确定的属性丰度。图11进一步展示了在经校准和未经校准的情况下比较两个数据集的中间精度(RSD)。如在图11中所描绘的，开放形状值表示参考标准品中的丰度为标准偏差的至少10倍的属性(例如，序列内RSD<10％)。
换言之，图11展示了基于LC-MS数据分析的响应因子校准的性能，其中，使用两种不同的LC方法和两个不同的MS系统(系统A(1104)和系统C(1106))来收集LC-MS数据，其中，通过两个不同的程序进行样品制备。在图11的实施例中，在经响应因子校准(1114)和未经响应因子校准(1116)的情况下将所确定属性丰度彼此比较。
如在图11中所示出的，使用不同的方法来分析样品可以检测和鉴定不同的一组属性，其中有117种是共同属性。在图11中，在经a校准和未经a校准的情况下，对三个样品中的117种属性的测量产生351个数据点，并且通过这两种方法产生对应的所确定丰度。在图11(上图)(1103)中展示了这种值。如在图11中所示出的，即使这两个LC-MS系统完全不同，校准也大大地提高了测量结果的一致性。图11(下图)(1113)示出了对这117种属性的响应因子校准之后的中间精度提高。可以用同一仪器和方法来精确测量这些属性中的许多属性(示为开放形状值)。
然而，当在不同的系统上测量这种属性时，结果不一致，如在横轴(未经校准的)中从10％至100％的较大RSD值所示。这些测量结果中的大多数在校准后再次变得一致，如其在纵轴上小于10％的RSD值所示。
融合蛋白的实例聚糖图谱
在此示例中，融合蛋白含有具有六种不同的糖型的两个O-连接的糖基化位点。三位分析者在三个LC-MS系统上在四次运行中将具有未知糖型丰度的样品与参考标准品一起分析(参见表3)。在Chromeleon上处理所有数据，以得到感兴趣的每种肽的峰面积。使用常规方法(方程(4)))以及响应因子校准(方程(6))来量化每种糖型的丰度。为了确定参考标准品中的每种属性的丰度，通过常规MAM对参考标准品进行六次分析，并且将六个测量结果的平均值用作参考标准品中的已知丰度。
图12展示了图示1202，该图示示出了四个序列(1206)中的糖型(SAHexHexNAc) 的测得的丰度(1204)，每个序列一式为三。在响应因子校准(方程(6))之后，仪器之间变化大大地减少。还如在图12(下图)中所示出的，针对六种糖型(1216)的响应因子校准将RSD(1214)从最大值21％减小至最大值5％(SA：唾液酸或N-乙酰神经氨酸；Hex：己糖；HexNAc：N-乙酰基己糖胺)。具体地，图12(上图)(1203) 示出了在经响应因子校准和未经响应因子校准的情况下的这些糖型之一的12个测得的丰度(在4个序列1206中进行一式三份分析)。尽管测得的丰度在同一序列内具有高可再现性，但是这种测得的丰度会在序列之间显著变化。响应因子校准消除了仪器之间的差异。图12(下图)(1213)在未经校准和经校准的情况下比较了所有六种糖型的中间RSD。在未经校准的情况下，这些糖型的RSD介于2.4％与21％之间。在校准之后，RSD减小到不超过5％。
校准
在一些但不是所有实施例中，使用校准方法来计算属性丰度可能需要对参考标准品中每种同种型的离子强度的附加测量。这些附加测量可能会在最终的属性丰度计算中引入附加误差。如果由这些附加测量引起的误差小于实验室与仪器之间的变化，则可以实现提高中间精度。
在一些但不是所有实施例中，为了能够在校准后提高测量精度，必须确定参考标准品中每种同种型的离子强度。这就要求感兴趣的属性必须在参考标准品中具有足够高的丰度。作为一般规则，属性丰度应该是测量的标准偏差的至少十倍(例如，如本文所描述的图7、8、9和10中的开放形状值所示出的)。
对于涉及3型b校准的实施例(方程(9))，计算属性丰度A可以涉及取未经校准的属性丰度I/(I0+I)与属性丰度b之间的差。如果b的值接近I/(I0+I)，则计算A 涉及取两个较大的数的差来导出非常小的数，这可能会产生较大的误差。在极端情况下，b的值可能会大于I/(I0+I)并且会获得A的负值。这可能会使3型属性的b校准不太稳健。对于在方程(12)中所示的3型属性的a校准和b校准也是如此。
在一些实施例中，响应因子的差异(其包括消化效率和仪器响应两者)可能是主要关注点，因为HPLC和MS仪器的演变以及样品制备中的自动化是不可避免的。人工修饰通常是可以控制的(如本文所描述的)并且不是大的关注点。因此，当比较三种校准方法时，因为响应因子校准(a校准)的稳健性和对所有三种类型的属性的适用性，所以其通常是最受青睐的。尽管能够校正未通过a校准来校正的样品制备中的不一致性，但是当校正水平接近属性丰度时，关于3型属性的人工修饰校准(b校准) 通常不太稳健。在一些实施例中，由于数学上的相似性，对2型属性进行b校准会产生与a校准类似的结果，并且因此可以用a校准来替代。另一方面，在一些但不是所有实施例中，用两种标准来校准响应因子和人工修饰(a校准和b校准)两者可能由于需要针对产品的寿命的附加标准而不太实际。另外，进行a校准和b校准可能需要再进行两次离子强度测量，这进一步增大了最终的属性丰度结果的变化。因此，使用单标准来校准响应因子通常用于在cGMP环境中实施如本文所描述的新MAM系统和方法。
新MAM系统和方法比常规MAM更有优势，因为新MAM系统和方法通过运行时间响应校准而极大地减小了实验室之间差异性。新MAM系统和方法有效地消除了需要MAM使用一致的装设备，这是当前MAM工作流程中的主要问题。另外，因为在当前的工作流程中通常已经需要将参考标准品与样品并行地分析，所以分析人员无需做附加工作。
如本文所描述的，使用方程(6)来校准响应因子消除了不同的肽同种型对具有相同的响应因子的需求。因此，新MAM系统和方法可以用于MAM的其他类型的仪器。例如，由于通过常规MAM对不同的同种型的等效响应因子的需要，三重四极杆仪器上的选择反应监测(SRM)由于在肽同种型中可能存在非常不同的片段化效率而不可接受。另一方面，新MAM系统和方法使得利用三重四极仪器成为可能，因为这种新 MAM系统和方法不需要不同的肽同种型具有等效响应因子。然而，必须首先在高分辨率仪器上建立参考标准品中每种属性的丰度。
由于假设所有同种型具有相同的响应因子(该假设可能不适用于涉及电荷、疏水性或肽长度变化的修饰)，因此常规MAM方法的一个缺点是测得的属性丰度不是绝对的。只要响应因子在该方法的整个寿命内是一致的，此缺点通常就不是主要问题。然而，当参考标准品中的属性丰度通过具有绝对定量的技术确定时，根据新MAM方法确定的属性丰度也就变为绝对值。
如针对本文中的各个实施例所示的数据也可以用于产生关于MAM平台的定量限度(LOQ)的洞见。可以将LOQ定义为RSD低于10％的属性的最小浓度。例如，图13展示了图示1302，该图示示出了这三种属性类型的属性丰度(1306和/或1316) 和序列内RSD(1304和/或1314)的关系。在图13的实施例中，对于1型属性(上图)(1303)，当从其他主要肽中很好地分辨出次要同种型时，大多数属性的RSD(1304) 在低至0.003％(LOQ＝0.003％)的丰度(1306)处低于10％。如果未从主峰中很好地分辨出同种型，则由于此工作中所使用的质谱仪的有限扫描内动态范围，LOQ将会较高。然而，对于2型和3型属性(下图)(1313)，大多数低于0.1％的属性具有> 10％的RSD(1314)并且大多数高于1％的属性具有<10％的RSD(1314)，从而表明，LOQ通常介于约0.1％与约1％之间，这取决于样品制备期间引入的变化量。
具体地，图13示出了不同属性类型的属性丰度(1306和/或1316)和序列内RSD (n＝6)(1304和/或1314)的关系。对于图13(上图)(1303)的大多数1型属性，序列内RSD低于10％，其中，丰度低至0.003％，从而表明，当属性在样品制备期间未发生变化时，LC-MS系统的定量限度低至0.003％。还如图13(下图)(1313)所示出，对于大多数2型和3型属性，定量限度高得多(0.1％至1％)。
附加方面
本披露内容的以下附加方面仅是示例性的并且不旨在限制本披露内容的范围。以下附加方面可以被视为本披露内容的其他方面的一部分、视为其补充或视为与其分离，通过非限制性示例的方式包括作为方面1至26中任一方面的补充。
27.一种校准系统，该校准系统被配置成经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性，该校准系统包括：第一基于MAM 的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置，该第一基于MAM的仪器被配置成接收第一样品和参考标准品，并且该第一基于 MAM的仪器被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型，其中，该第一样品具有第一制剂类型；与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品，并且与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；第二基于MAM的仪器，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，该第二基于MAM的仪器被配置成接收第二样品和该参考标准品，并且该第二基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型，其中，该第二样品具有第二制剂类型，并且其中，该第一制剂类型不同于该第二制剂类型，从而引起该第一样品与该第二样品之间的差异，该差异由样品制备期间对属性丰度的人工改变引起；与该第二基于MAM 的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品，并且与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小，其中，(1)与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第一MAM迭代或者(2)与该第二基于MAM仪器相关联的一个或多个处理器经由该第二MAM迭代中的至少一项确定质量属性以减小该第一样品与该第二样品之间的差异，该质量属性与2型属性或3型属性相关联。
28.根据方面27所述的校准系统，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该2型属性引起丰度减小。
29.根据方面27所述的校准系统，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该3型属性引起丰度增大。
30.一种用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准方法，该校准方法包括：在第一基于MAM的仪器处接收第一样品和参考标准品，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，并且该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置；由该第一基于MAM的仪器的第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型，其中，该第一样品具有第一制剂类型；由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品；由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；由第二基于MAM的仪器接收第二样品和该参考标准品，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件；由该第二基于MAM的仪器的第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型，其中，该第二样品具有第二制剂类型，并且其中，该第一制剂类型不同于该第二制剂类型，从而引起该第一样品与该第二样品之间的差异，该差异由样品制备期间对属性丰度的人工改变引起；由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品；以及由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小，并且其中，(1)与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第一MAM迭代或者(2)与该第二基于MAM仪器相关联的一个或多个处理器经由该第二MAM迭代中的至少一项确定质量属性以减小该第一样品与该第二样品之间的差异，该质量属性与2型属性或3型属性相关联。
31.根据方面30所述的校准方法，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该2型属性引起丰度减小。
32.根据方面30所述的校准方法，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该3型属性引起丰度增大。
33.一种校准系统，该校准系统被配置成经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性，该校准系统包括：第一基于MAM 的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置，该第一基于MAM的仪器被配置成接收第一样品、参考标准品和胁迫标准品，并且该第一基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型、来自该参考标准品的第一参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的胁迫参考标准品同种型；与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品，并且与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；第二基于MAM的仪器，该第二基于MAM 的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，该第二基于MAM的仪器被配置成接收第二样品、该参考标准品和该胁迫标准品，并且该第二基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型、来自该参考标准品的第二参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的第二胁迫标准品同种型；以及与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品，并且与该第二基于MAM 的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
34.根据方面33所述的校准系统，其中，相比该参考标准品，该胁迫标准品含有更高水平的质量属性。
35.一种用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准方法，该校准方法包括：在第一基于MAM的仪器处接收第一样品、参考标准品和胁迫标准品，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，并且该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1) 第一仪器模型或(2)第一组设置；由该第一基于MAM的仪器的该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型、来自该参考标准品的第一参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的胁迫参考标准品同种型；由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品；由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；在第二基于MAM 的仪器处接收第二样品、该参考标准品和该胁迫标准品，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件；由该第二基于MAM的仪器的第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型、来自该参考标准品的第二参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的第二胁迫标准品同种型；由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第二 MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品；以及由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
36.根据方面35所述的校准方法，其中，相比该参考标准品，该胁迫标准品含有更高水平的质量属性。

Claims (36)

1.一种校准系统，该校准系统被配置成经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性，该校准系统包括：
第一基于MAM的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置，该第一基于MAM的仪器被配置成接收第一样品和参考标准品，并且该第一基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型；
与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品，并且与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；
第二基于MAM的仪器，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，
其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，
该第二基于MAM的仪器被配置成接收第二样品和该参考标准品，并且该第二基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型；以及
与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品，并且与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
2.如权利要求1所述的校准系统，其中，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第一MAM迭代来确定质量属性。
3.如权利要求2所述的校准系统，其中，该质量属性是以下各项中的任一项：该第一样品同种型、蛋白质或所鉴定杂质。
4.如权利要求2所述的校准系统，其中，该质量属性限定以下各项中的任何一项或多项：片段化、氧化、糖化、羟基化、序列变体、异构化、脱酰胺化、C-末端赖氨酸、O-连接的聚糖和/或N-连接的聚糖。
5.如权利要求2所述的校准系统，其中，与该第一MS仪器相关联的一个或多个处理器被配置成生成包括该质量属性的报告。
6.如权利要求1所述的校准系统，其中，第一仪器模型不同于该第二仪器模型。
7.如权利要求1所述的校准系统，其中，第一组设置不同于该第二组设置。
8.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一组校正因子基于该第一参考标准品同种型的离子强度值和该第一参考标准品同种型的第一参考标准品丰度值。
9.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一组校正因子校准与该第一组样品丰度值相关联的响应因子以确定该第一样品同种型的离子强度值。
10.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一组样品丰度值进一步基于该第一样品同种型的离子强度值。
11.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一基于MAM的仪器为质谱(MS)仪器。
12.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一基于MAM的仪器为三重四极杆仪器。
13.如权利要求1所述的校准系统，其中，与该第一MS仪器相关联的一个或多个处理器经由计算机网络通信地耦合至与该第二MS仪器相关联的一个或多个处理器。
14.如权利要求1所述的校准系统，其中，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器是与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器。
15.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一基于MAM的仪器位于第一地理位置处的第一实验室处，并且该第二基于MAM的仪器位于第二地理位置处的第二实验室处。
16.一种用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准方法，该校准方法包括：
在包括第一检测器的第一基于MAM的仪器处接收第一样品和参考标准品；
经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型；
经由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器在第一MAM迭代内确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品；
经由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器来确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子，并且其中，该第一基于MAM的仪器包括由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置；
在包括第二检测器的第二基于MAM的仪器处接收第二样品和该参考标准品；
经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型；
经由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器在第二MAM迭代内确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品；
经由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器来确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，该第二基于MAM的仪器包括由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，
其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，并且
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
17.一种用于经由运行时间信号强度校准在多个时间段内减小基于MAM的仪器的差异性的校准方法，该校准方法包括：
在第一时间段内在基于MAM的仪器处接收第一样品和参考标准品；
经由该基于MAM的仪器的检测器在该第一时间段内检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型；
经由一个或多个处理器在该第一时间段内在第一MAM迭代内确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品；
经由该一个或多个处理器在该第一时间段内经由该第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子，并且其中，在该第一时间段内该基于MAM的仪器包括由第一组设置限定的第一仪器条件；
在第二时间段内在该基于MAM的仪器处接收第二样品和该参考标准品；
经由该基于MAM的仪器的检测器在该第二时间段内检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型；
经由该一个或多个处理器在该第二时间段内在第二MAM迭代内确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品；以及
经由该一个或多个处理器在该第二时间段内经由该第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且其中，在该第二时间段内该基于MAM的仪器包括由第二组设置限定的第二仪器条件，
其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，并且
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
18.如权利要求17所述的校准方法，其中，该一个或多个处理器确定质量属性。
19.如权利要求18所述的校准方法，其中，该质量属性是以下各项中的任一项：该第一样品同种型、该第二样品同种型、蛋白质或所鉴定杂质。
20.如权利要求18所述的校准方法，其中，该一个或多个处理器被配置成生成该质量属性的报告。
21.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值减小至少25％。
22.如权利要求16所述的校准方法，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值减小至少25％。
23.如权利要求17所述的校准方法，其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值减小至少25％。
24.如权利要求1所述的校准系统，其中，该第一样品属于蛋白水解肽，该第二样品属于该蛋白水解肽，并且该参考标准品属于该蛋白水解肽。
25.如权利要求16所述的校准方法，其中，该第一样品属于蛋白水解肽，该第二样品属于该蛋白水解肽，并且该参考标准品属于该蛋白水解肽。
26.如权利要求17所述的校准方法，其中，该第一样品属于蛋白水解肽，该第二样品属于该蛋白水解肽，并且该参考标准品属于该蛋白水解肽。
27.一种校准系统，该校准系统被配置成经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性，该校准系统包括：
第一基于MAM的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置，该第一基于MAM的仪器被配置成接收第一样品和参考标准品，并且该第一基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型，其中，该第一样品具有第一制剂类型；
与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品，并且与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；
第二基于MAM的仪器，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，
其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，
该第二基于MAM的仪器被配置成接收第二样品和该参考标准品，并且该第二基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型，其中，该第二样品具有第二制剂类型，并且
其中，该第一制剂类型不同于该第二制剂类型，从而引起该第一样品与该第二样品之间的差异，该差异由样品制备期间对属性丰度的人工改变引起；以及
与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品，并且与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小，
其中，(1)与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第一MAM迭代或者(2)与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第二MAM迭代中的至少一项确定质量属性以减小该第一样品与该第二样品之间的差异，该质量属性与2型属性或3型属性相关联。
28.如权利要求27所述的校准系统，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该2型属性引起丰度减小。
29.如权利要求27所述的校准系统，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该3型属性引起丰度增大。
30.一种用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准方法，该校准方法包括：
在第一基于MAM的仪器处接收第一样品和参考标准品，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，并且该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置；
由该第一基于MAM的仪器的第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型和来自该参考标准品的第一参考标准品同种型，其中，该第一样品具有第一制剂类型；
由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品；
由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；
由第二基于MAM的仪器接收第二样品和该参考标准品，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件；
由该第二基于MAM的仪器的第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型和来自该参考标准品的第二参考标准品同种型，其中，该第二样品具有第二制剂类型，并且其中，该第一制剂类型不同于该第二制剂类型，从而引起该第一样品与该第二样品之间的差异，该差异由样品制备期间对属性丰度的人工改变引起；
由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品；以及
由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小，并且
其中，(1)与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第一MAM迭代或者(2)与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由该第二MAM迭代中的至少一项确定质量属性以减小该第一样品与该第二样品之间的差异，该质量属性与2型属性或3型属性相关联。
31.如权利要求30所述的校准方法，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该2型属性引起丰度减小。
32.如权利要求30所述的校准方法，其中，在制备该第一样品或该第二样品期间，该3型属性引起丰度增大。
33.一种校准系统，该校准系统被配置成经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性，该校准系统包括：
第一基于MAM的仪器，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置，该第一基于MAM的仪器被配置成接收第一样品、参考标准品和胁迫标准品，并且该第一基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型、来自该参考标准品的第一参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的胁迫参考标准品同种型；
与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品，并且与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；
第二基于MAM的仪器，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，
其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件，
该第二基于MAM的仪器被配置成接收第二样品、该参考标准品和该胁迫标准品，并且该第二基于MAM的仪器被进一步配置成经由该第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型、来自该参考标准品的第二参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的第二胁迫标准品同种型；以及
与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器，与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被配置成经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品，并且与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器被进一步配置成确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，并且
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
34.如权利要求33所述的校准系统，其中，相比该参考标准品，该胁迫标准品含有更高水平的质量属性。
35.一种用于经由运行时间信号强度校准来减小多属性方法(MAM)的实验室之间或仪器之间差异性的校准方法，该校准方法包括：
在第一基于MAM的仪器处接收第一样品、参考标准品和胁迫标准品，该第一基于MAM的仪器包括第一检测器，并且该第一基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第一仪器条件：(1)第一仪器模型或(2)第一组设置；
由该第一基于MAM的仪器的该第一检测器检测来自该第一样品的第一样品同种型、来自该参考标准品的第一参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的胁迫参考标准品同种型；
由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第一MAM迭代来确定与该第一样品同种型相对应的第一组校正因子，其中，该第一组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品；
由与该第一基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第一样品同种型相对应的第一组样品丰度值，其中，该第一组样品丰度值基于该第一组校正因子；
在第二基于MAM的仪器处接收第二样品、该参考标准品和该胁迫标准品，该第二基于MAM的仪器包括第二检测器，该第二基于MAM的仪器具有由以下各项中的至少一项限定的第二仪器条件：(1)第二仪器模型或(2)第二组设置，其中，该第二仪器条件不同于该第一仪器条件；
由该第二基于MAM的仪器的第二检测器检测来自该第二样品的第二样品同种型、来自该参考标准品的第二参考标准品同种型以及来自该胁迫标准品的第二胁迫标准品同种型；
由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器经由第二MAM迭代来确定与该第二样品同种型相对应的第二组校正因子，其中，该第二组校正因子基于该参考标准品和该胁迫标准品；以及
由与该第二基于MAM的仪器相关联的一个或多个处理器确定与该第二样品同种型相对应的第二组样品丰度值，其中，该第二组样品丰度值基于该第二组校正因子，
其中，该第一组样品丰度值和该第二组样品丰度值的方差值基于该第一组校正因子和该第二组校正因子而减小。
36.如权利要求35所述的校准方法，其中，相比该参考标准品，该胁迫标准品含有更高水平的质量属性。
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