TWI829706B - 抗ctla4抗體及其製備及使用方法 - Google Patents

抗ctla4抗體及其製備及使用方法 Download PDF

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Abstract

本文中提供結合至人類CTLA4之交叉反應性抗體(或其抗原結合片段)、結合至人類CTLA4之可活化抗體、編碼該等抗體之核酸分子、其醫藥組合物及其治療用途(例如用於治療癌症)之方法。

Description

抗CTLA4抗體及其製備及使用方法
本發明係關於結合至人類細胞毒性T-淋巴細胞蛋白4 (CTLA4)之交叉反應性抗體、結合至人類CTLA4之精度/背景依賴性可活化抗體、編碼該等抗體之核酸、其醫藥組合物及其治療用途。
CTLA4為用於下調T-細胞活化且維持免疫原體內穩態之蛋白質之免疫球蛋白(Ig)超家族之成員。已顯示活體內抗體介導之CTLA4之阻斷增強同源鼠科前列腺癌模型中之抗癌免疫反應(Kwon等人(1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94(15):8099-103)。此外，顯示CTLA4功能之阻斷在荷瘤小鼠之腫瘤生長之各階段增強抗腫瘤T細胞反應(Yang等人(1997) Cancer Res 57(18):4036-41；Hurwitz等人(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 (17):10067-7)。然而，適於人類使用之基於抗體之療法之開發仍困難，因為自臨床前動物模型至人類安全性之轉變經常係差的。因此，存在對在不同物種(諸如人類及實驗動物(例如，小鼠、猴、大鼠等))間具交叉反應性以使能同時進行動物模型研究且提供適宜人類治療候選之抗CTLA4抗體之需要。此外，存在對開發更安全抗CTLA4抗體之需要，該等抗體僅於某些情況下(諸如於蛋白酶濃化腫瘤微環境中)具活性。
本文中所引用之所有參考文獻(包括專利申請案、專利公開案、非專利文獻及UniProtKB/Swiss-Prot/GenBank寄存編號)之全文以引用的方式併入本文中，如同各個別參考文獻明確且個別地指示為以引用的方式併入般。
為滿足以上及其他需要，本文中揭示結合至人類CTLA4之抗體(例如，交叉反應性抗體)及其抗原結合片段。本發明之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段具有下列功能性質中之至少一者(例如，一者、一些或所有)：(a) 以500 nM或更低之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4，(b)具有對人類CTLA4之拮抗活性；(c)在多達100 nM之濃度下不結合至人類PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、CD95、CD120a、OX40、CD40、BTLA、VISTA、ICOS、及/或B7-H4；(d)與猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4交叉反應；(e)誘導ADCC效應(例如，對Treg)；(f)活化人類PBMC (例如，刺激IL-2及/或IFNγ之分泌)；(g)能抑制腫瘤細胞生長及建立對腫瘤細胞之免疫記憶；(h)具有對癌症之治療效應；及(i)阻斷人類CTLA4結合至人類CD80及/或人類CD86 (參見以下實例1至5)。
本文中揭示精度/背景依賴性可活化抗體，當以活性形式時，該等抗體結合至人類CTLA4，但是以減能形式時不結合，即，僅於裂解可裂解部分(CM)以移除掩蔽部分(MM)後，該等可活化抗體結合至CTLA4 (具活性)。於一些實施例中，本文中所述之發現之掩蔽部分(MM)能有效掩蔽抗體活性及/或減少或完全抑制抗原結合，而於一些實施例中，缺乏化學上不穩定殘基甲硫胺酸及/或色胺酸。此外，本文中所識別及所述之可活化抗體在治療多種癌症類型上與其親本抗體一樣有效，同時於易感動物(NOD小鼠)中具有顯著降低之細胞毒性。
因此，於一態樣中，本文中提供抗CTLA4抗體(例如，人類抗體)，該抗體結合人類CTLA4且與來自選自由食蟹獼猴、小鼠、大鼠及狗組成之群之至少一種非人類動物之CTLA4多肽交叉反應。於一些實施例中，該抗體結合至食蟹獼猴CTLA4及小鼠CTLA4。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該抗體以約350 nM或更低(例如，約300 nM或更低，約200 nM或更低，約100 nM或更低，約50 nM或更低，約10 nM或更低)之解離常數(KD ) 結合至人類CTLA4、食蟹獼猴CTLA4、小鼠CTLA4、大鼠CTLA4及/或狗CTLA4。於一些實施例中，藉由表面電漿子共振(SPR)量測KD 。於一些實施例中，抗體與CTLA4之結合誘導對表現CTLA4之細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。於一些實施例中，抗體與CTLA4之結合誘導對Treg細胞之ADCC。於一些實施例中，本文中所述之抗CTLA4抗體之結合誘導對表現CTLA4之人類細胞或人類Treg細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，其中該抗CTLA4抗體之ADCC活性高於活體外伊匹單抗(ipilimumab)之ADCC活性，且其中兩種抗體包含野生型人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，本文中所述之抗CTLA4抗體之結合誘導對表現CTLA4之人類細胞或人類Treg細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，其中該抗CTL4抗體之ADCC活性為活體外伊匹單抗之ADCC活性的兩倍或更高，且其中兩種抗體包含野生型人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體ADCC活性之EC50為活體外伊匹單抗ADCC活性之EC50之50%或更低。量測ADCC活性之檢定述於實例3及15中。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體於腫瘤微環境中選擇性地耗盡Treg細胞(例如，降低腫瘤浸潤淋巴細胞中之Treg細胞之百分比)，相較於小鼠癌症模型中之PBMC或脾。參見例如，實例18。
於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該抗體特異性結合至包含人類CTLA4之配位體結合位點(諸如人類CTLA4之CD80及/或CD86結合位點)處之胺基酸殘基之抗原決定基。於一些實施例中，該抗體特異性結合至類似於人類CTLA4之配位體結合位點(諸如人類CTLA4之CD80及/或CD86結合位點)之抗原決定基。於一些實施例中，該抗體特異性結合至包含人類CTLA4之胺基酸殘基Y105及L106之抗原決定基，其中該等胺基酸殘基之編號係根據SEQ ID NO: 207。於一些實施例中，該抗體不結合至人類CTLA4之殘基I108，其中該等胺基酸殘基之編號係根據SEQ ID NO: 207。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體阻斷CD80及/或CD86結合至人類CTLA4。於一些實施例中，針對阻斷CD80及/或CD86結合至人類CTLA4而言，該抗CTLA4抗體具有高於伊匹單抗之IC50之IC50。於一些實施例中，在CD86或CD80經板結合且CTLA4係於溶液中或CTLA4展示在細胞表面之檢定中，針對阻斷CD80及/或CD86結合至人類CTLA4，該抗CTLA4抗體具有為伊匹單抗之IC50的3.5倍或更高(包括3.9倍或更高)之IC50。參見實例13、表23、圖57A至57D及58。用於測試抗體之阻斷活性(配位體競爭)及IC50之檢定述於實例3及13中。
於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，a)其中該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中該HVR-H1包含如選自由以下組成之群之式之胺基酸序列：式(I)：X1TFSX2YX3IHWV (SEQ ID NO: 1)，其中X1為F或Y，X2為D或G，且X3為A、G或W；式(II)：YSIX1SGX2X3WX4WI (SEQ ID NO: 2)，其中X1為S或T，X2為H或Y，X3為H或Y，且X4為A、D或S；及式(III)：FSLSTGGVAVX1WI (SEQ ID NO: 3)，其中X1為G或S；其中該HVR-H2包含如選自由以下組成之群之式之胺基酸序列：式(IV)：IGX1IX2HSGSTYYSX3SLKSRV (SEQ ID NO: 4)，其中X1為D或E，X2為S或Y，且X3為P或Q；式(V)：IGX1ISPSX2GX3TX4YAQKFQGRV (SEQ ID NO: 5)，其中X1為I或W，X2為G或S，X3為G或S，且X4為K或N；及式(VI)：VSX1ISGX2GX3X4TYYADSVKGRF (SEQ ID NO: 6)，其中X1為A、G或S，X2為S或Y，X3為G或S，且X4為S或T；且其中該HVR-H3包含如選自由以下組成之群之式之胺基酸序列：式(VII)：ARX1X2X3X4FDX5 (SEQ ID NO: 7)，其中X1為G、R或S，X2為A、I或Y，X3為D、V或Y，X4為A、E或Y，且X5為I或Y；式(VIII)：ARX1GX2GYFDX3 (SEQ ID NO: 8)，其中X1為D或L，X2為F或Y，且X3為V或Y；式(IX)：ARX1X2X3X4AX5X6FDY (SEQ ID NO: 9)，其中X1為L或R，X2為I或P，X3為A或Y，X4為S或T，X5為T或Y，且X6為A或Y；式(X)：ARDX1X2X3GSSGYYX4GFDX5 (SEQ ID NO: 10)，其中X1為I或V，X2為A或H，X3為P或S，X4為D或Y，且X5為F或V，及b)其中該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中該HVR-L1包含如選自由以下組成之群之式之胺基酸序列：式(XI)：RASQX1X2X3SX4LX5 (SEQ ID NO: 11)，其中X1為G或S，X2為I或V，X3為G或S，X4為S或Y，且X5為A或N；式(XII)：RASQX1VX2X3RX4LA (SEQ ID NO: 12)，其中X1為S或T，X2為F、R或S，X3為G或S，且X4為F或Y；及(XIII)：RASX1SVDFX2GX3SFLX4 (SEQ ID NO: 13)，其中X1為E或Q，X2為D、F、H或Y，X3為F、I或K，且X4為A、D或H；其中該HVR-L2包含如式(XIV)：X1ASX2X3X4X5GX6 (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列，其中X1為A或D，X2為N、S或T，X3為L或R，X4為A、E或Q，X5為S或T，且X6為I或V；且其中該HVR-L3包含如選自由以下組成之群之式之胺基酸序列：式(XV)：YCX1X2X3X4X5X6PX7T (SEQ ID NO: 15)，其中X1為E、Q或V，X2為H或Q，X3為A、G、H、R或S，X4為D、L、S或Y，X5為E、G、P、Q或S，X6為L、T、V或W，且X7為F、L、P、W或Y；式(XVI)：YCQQX1X2X3WPPWT (SEQ ID NO: 16)，其中X1為S或Y，X2為D或Y，且X3為Q或Y；及式(XVII)：YCQX1YX2SSPPX3YT (SEQ ID NO: 17)，其中X1為H或Q，X2為T或V，且X3為E或V。於一些實施例中，該HVR-H1包含選自由SEQ ID NO: 18至29組成之群之胺基酸序列，該HVR-H2包含選自由SEQ ID NO: 30至39組成之群之胺基酸序列，該HVR-H3包含選自由SEQ ID NO: 40至52組成之群之胺基酸序列，該HVR-L1包含選自由SEQ ID NO: 53至65組成之群之胺基酸序列，該HVR-L2包含選自由SEQ ID NO: 66至69組成之群之胺基酸序列，且該HVR-L3包含選自由SEQ ID NO: 70至81組成之群之胺基酸序列。於一些實施例中，該抗體包含：a)包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之HVR-L3；b)包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之HVR-L3；c)包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之HVR-L3；d)包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之HVR-L3；e)包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之HVR-L3；f)包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L3；g)包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L3；h)包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之HVR-L3；i)包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3；j)包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之HVR-L3；k)包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之HVR-L3；l)包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之HVR-L3；或m)包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之HVR-L3。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 82至94組成之群之胺基酸序列，及/或該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 95至107組成之群之胺基酸序列。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該抗體包含：a)包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 82之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 95之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；b)包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 83之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 96之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 84之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 97之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；d)包含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 85之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；e)包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 86之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；f)包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 87之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；g)包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；h)包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 89之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；i)包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 90之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；j)包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 91之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；k)包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 92之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 105之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；l)包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 93之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 106之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區；或m)包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 94之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 107之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體之輕鏈可變區。
於一些實施例中，本文中所述之抗CTLA4抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該抗體之1、2、3、4、5或6個HVR包含表A中所示之HVR序列。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體包含包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區，其中該HVR-H1包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，或該HVR-H2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，或該HVR-H3包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體包含包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該HVR-L1包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列，或該HVR-L2包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列，或該HVR-L3包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。於一些實施例中，該抗體之HVR-H2包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體包含(a)包含包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之HVR-H2，及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之HVR-H3之重鏈可變區，及/或包含包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L3之輕鏈可變區。於一些實施例中，該抗體之HVR中之1、2、3、4、5或6者可包含1、2或3個保守胺基酸取代於該等HVR中。於一些實施例中，該抗CTLA4抗體包含(b)包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 87之胺基酸序列至少90% (例如，91%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列之重鏈可變區，及/或包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少90% (例如，91%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該抗體為抗體片段。於一些實施例中，該片段為Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 、Fv或scFv片段。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該抗體包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區(諸如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。於一些實施例中，包含人類IgG1或變異體之抗體具有增強之ADCC活性。於一些實施例中，該抗體包含人類IgG1，具有減少之岩藻糖基化(或未經岩藻糖基化)。於一些實施例中，該抗體為人類抗體。
本發明之其他態樣係關於與本文中所述抗體中之任一者競爭或交叉競爭結合至人類CTLA4之抗體。本文中亦提供結合至與本文中所述抗體中之任一者相同之抗原決定基及/或基本上相同之抗原決定基之抗體。
本發明之其他態樣係關於一種可活化抗體，其包含：a)第一多肽，自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)，其中該MM包含如式(XVIII)：Xm CXn CZo (SEQ ID NO: 134)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸；其中當該CM未裂解時，該MM抑制可活化抗體結合至人類CTLA4；其中該CM包含至少第一裂解位點；且其中該TBM包含抗體重鏈可變區(VH)；及b)包含抗體輕鏈可變區(VL)之第二多肽；且其中當該CM被裂解時，該可活化抗體經由VH及VL結合至人類CTLA4。於一些實施例中，m為3至10。
本發明之其他態樣係關於一種可活化抗體，其包含：a)第一多肽，自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)，其中該MM包含如式(XVIII)：Xm CXn CZo (SEQ ID NO: 134)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸；其中當該CM未裂解時，該MM抑制可活化抗體結合至人類CTLA4；其中該CM包含至少第一裂解位點；且其中該TBM包含抗體輕鏈可變區(VL)；及b)包含抗體重鏈可變區(VH)之第二多肽；且其中當該CM被裂解時，該可活化抗體經由VH及VL結合至人類CTLA4。於一些實施例中，m為3至10。
本發明之其他態樣係關於一種可活化抗體，其包含：自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)之多肽，其中該MM包含如式(XVIII)：Xm CXn CZo (SEQ ID NO: 134)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸；其中當該CM未裂解時，該MM抑制可活化抗體結合至人類CTLA4；其中該CM包含至少第一裂解位點；其中該TBM自N端至C端包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；且其中當該CM被裂解時，該可活化抗體經由VH及VL結合至人類CTLA4。於一些實施例中，m為3至10。
本發明之其他態樣係關於一種可活化抗體，其包含：自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)之多肽，其中該MM包含如式(XVIII)：Xm CXn CZo (SEQ ID NO: 134)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸；其中當該CM未裂解時，該MM抑制可活化抗體結合至人類CTLA4；其中該CM包含至少第一裂解位點；其中該TBM自N端至C端包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)；且其中當該CM被裂解時，該可活化抗體經由VH及VL結合至人類CTLA4。
於如上述可活化抗體中之任一者之一些實施例中，m為2、3、4、5或6。於一些實施例中，m為6。於一些實施例中，n為6至8。於一些實施例中，n為6。於一些實施例中，o為1至2。於一些實施例中，o為2。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，各X非M、W或C。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，式(XVIII)之Xm 中之各X獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，式(XVIII)之Xn 中之各X獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。於一些實施例中，該MM包含選自由Xm CPDHPYPCXX (SEQ ID NO:181)、Xm CDAFYPYCXX (SEQ ID NO:182)、Xm CDSHYPYCXX (SEQ ID NO:183)及Xm CVPYYYACXX (SEQ ID NO:184)組成之群之胺基酸序列，其中m為2至10，且其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸。於一些實施例中，各X非M、W或C。於一些實施例中，各X獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含選自SEQ ID NO: 141至147之胺基酸序列。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該MM在其N端處另包含另外胺基酸序列。於一些實施例中，該另外胺基酸序列包括SEQ ID NO: 148之胺基酸序列。
於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該第一裂解位點為選自由以下組成之群之蛋白酶之蛋白酶裂解位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素(plasmin)、凝血酶(Thrombin)、X因子、PSA、PSMA、組織蛋白酶(Cathepsin) D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶(Caspase)-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14、及TACE。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該CM另包含至第一裂解位點C端之第一連接子(L1 )。於一些實施例中，該L1 包含選自由SEQ ID NO: 156至163組成之群之胺基酸序列。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該CM另包含第二裂解位點。於一些實施例中，該第二裂解位點為L1 之C端。於一些實施例中，該第二裂解位點為選自由以下組成之群之蛋白酶之蛋白酶裂解位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、X因子、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14、及TACE。於一些實施例中，該第一及第二裂解位點係不同。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該CM另包含至第二裂解位點C端之第二連接子(L2 )。於一些實施例中，該L2 包含選自由SEQ ID NO: 156至163組成之群之胺基酸序列。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該CM另包含至第一裂解位點N端之第三連接子(L3 )。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該CM包含至少第一蛋白酶裂解位點且經選自由以下組成之群之一或多種蛋白酶裂解：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、X因子、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14、及TACE。
於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該可活化抗體包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，包含如式(XXIX)：EVGSYX1X2X3X4X5X6CX7X8X9X10X11X12CX13X14SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 164)之胺基酸序列，其中X1為A、D、I、N、P、或Y，X2為A、F、N、S、或V，X3為A、H、L、P、S、V、或Y，X4為A、H、S、或Y，X5為A、D、P、S、V、或Y，X6為A、D、L、S、或Y，X7為D、P、或V，X8為A、D、H、P、S、或T，X9為A、D、F、H、P、或Y，X10為L、P、或Y，X11為F、P、或Y，X12為A、P、S、或Y，X13為A、D、N、S、T、或Y，且X14為A、S、或Y。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該可活化抗體包含選自由SEQ ID NO: 165至179組成之群之胺基酸序列。
於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該VL包含包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L3。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該VL包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該VH包含包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之HVR-H2，及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之HVR-H3。於可與上述實施例中之任一者組合之一些實施例中，該VH包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 87之胺基酸序列至少約90% (例如，至少約92%、95%、98%、99%或更多)序列同一性之其變異體。
本發明之其他態樣係關於醫藥組合物，該醫藥組合物包含本文中所述抗體及/或可活化抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。
本發明之其他態樣係關於編碼本文中所述抗體及/或可活化抗體中之任一者之多核苷酸。於一些實施例中，該多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 108至133之序列。
本發明之其他態樣係關於包含本文中所述多核苷酸中之任一者之載體。於一些實施例中，該載體為表現載體及/或顯示載體。
本發明之其他態樣係關於包含本文中所述多核苷酸及/或載體中之任一者之宿主細胞。於一些實施例中，該宿主細胞為真核細胞。於一些實施例中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發明之其他態樣係關於一種製備抗體或可活化抗體之方法，其包括在適於產生抗體或可活化抗體之條件下培養本文中所述宿主細胞中之任一者。於一些實施例中，該方法進一步包括回收由該細胞產生之抗體或可活化抗體。
本發明之其他態樣係關於一種治療有需要受試者之癌症或延遲其癌症進展之方法，其包括對該受試者投與有效量之本文中所述抗體、可活化抗體及/或醫藥組合物中之任一者。於一些實施例中，該癌症為肝癌、消化系統癌(例如，結腸癌、結腸直腸癌)、肺癌、骨癌、心臟癌、腦癌、腎癌、膀胱癌、血液癌(例如，白血病)、皮膚癌、乳癌、甲狀腺癌、胰癌、頭頸癌、眼相關癌、男性生殖系統癌(例如，前列腺癌、睾丸癌)、或女性生殖系統癌(例如，子宮癌、子宮頸癌)。本發明之其他態樣係關於一種減少有需要受試者中之實體腫瘤大小之方法，其中該實體腫瘤具有約400至1000 mm3 之大小，該方法包括對該受試者投與有效量之本文中所述抗體、可活化抗體及/或醫藥組合物中之任一者。於一些實施例中，該實體腫瘤具有約400至800 mm3 之大小。於一些實施例中，該方法進一步包括對該受試者投與有效量之至少一種另外治療劑。於一些實施例中，該至少一種另外治療劑係選自由病毒基因療法、免疫檢查點抑制劑、靶療法、放射療法、疫苗接種療法及化療組成之群。於一些實施例中，該至少一種另外治療劑係選自由以下組成之群：鉑美特(pomalyst)、瑞復美(revlimid)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、DNA烷基化含鉑衍生物、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺(cyclophosphamide)、抗CD137抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗DR5抗體、抗CD1d抗體、抗TIM3抗體、抗SLAMF7抗體、抗KIR受體抗體、抗OX40抗體、抗HER2抗體、抗ErbB-2抗體、抗EGFR抗體、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、放射療法、單劑量輻射、分次輻射、焦點輻射、全器官輻射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受體、授受性轉移之T細胞、抗癌疫苗、及溶瘤病毒。於一些實施例中，該方法包括在用於移除受試者中之腫瘤之手術之前或於該手術後對該受試者投與有效量之本文中所述之抗CTLA4抗體、可活化抗體或醫藥組合物。於一些實施例中，該抗CD137抗體包括包含胺基酸序列FSLSTGGVGVGWI (SEQ ID NO: 223)之HVR-H1，包含胺基酸序列LALIDWADDKYYSPSLKSRL (SEQ ID NO:224)之HVR-H2，及包含胺基酸序列ARGGSDTVIGDWFAY (SEQ ID NO: 225)之HVR-H3之抗體重鏈可變區，及包括包含胺基酸序列RASQSIGSYLA (SEQ ID NO: 226)之HVR-L1，包含胺基酸序列DASNLETGV (SEQ ID NO: 227)之HVR-L2，及包含胺基酸序列YCQQGYYLWT (SEQ ID NO: 228)之HVR-L3之抗體輕鏈可變區。於一些實施例中，該抗CD137抗體包括包含SEQ ID NO: 229之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 229之序列至少90% (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之抗體重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 230之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 230之序列至少90% (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之抗體輕鏈可變區。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVGVGWIRQAPGKGLEWLALIDWADDKYYSPSLKSRLTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGGSDTVIGDWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 229) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYYLWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 230)
應瞭解，可組合以上及本文中所述之各種實施例之性質中之一者、一些或所有以形成本發明之其他實施例。本發明之此等及其他態樣將對熟習此項技術者變得顯而易見。本發明之此等及其他實施例進一步由隨後實施方式進行描述。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2019年2月2日申請之國際申請案第PCT/CN2019/074580號之優先權，其全文以引用的方式併入本文中。 以ASCII文本檔案之序列表之提交
以ASCII文本檔案之下列提交內容之全文以引用的方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式(CRF) (檔案名稱：695402000542SEQLIST.TXT，記錄日期：2019年6月5日，大小：102 KB)。I. 一般技術
本文中所述或提及之技術及程序一般係熟知且通常由熟習此項技術者使用習知方法學採用，諸如例如，廣泛利用述於以下之方法學：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編輯，(2003))；Methods in Enzymology 系列(Academic Press, Inc.)：PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson、B.D. Hames及G.R. Taylor編輯(1995))；Harlow及Lane編輯(1988)Antibodies, A Laboratory Manual 、及Animal Cell Culture (R.I. Freshney編輯(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology , Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編輯，1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R.I. Freshney)編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts，1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle、J.B. Griffiths及D.G. Newell編輯，1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編輯，1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction , (Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers，1997)；Antibodies (P. Finch，1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編輯，IRL Press，1988至1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編輯，Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編輯，Harwood Academic Publishers, 1995)；及Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita等人編輯，J.B. Lippincott Company, 1993)。II. 定義
在詳細描述本發明之前，應瞭解，本發明揭示內容不限於特定組合物或生物系統，當然其可變化。亦應瞭解，本文中所用之術語係僅出於描述特定實施例之目的，且不旨在限制。
如本文中所用，除非內容另有明確指定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數指示物。因此，例如，提及「一分子」視情況包括兩種或更多種此等分子之組合，及類似者。
如本文中所用，術語「約」係指為此技術領域之熟習者容易知曉之各自值的通常誤差範圍。本文中提及「約」值或參數包括(且描述)指向該值或參數本身之實施例。
應瞭解，本文中所述之本發明之態樣及實施例包括「包含」、「由…組成」及「基本上由…組成」態樣及實施例。
如本文中所用，術語「及/或」，諸如「A及/或B」之短語意欲包括A及B二者；A或B；A (單獨)；及B (單獨)。同樣，如本文中所用，術語「及/或」，諸如「A、B及/或C」之短語意欲涵蓋下列實施例各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
術語「胺基酸」係指天然產生及合成胺基酸，以及胺基酸類似物及功能類似於天然產生胺基酸之胺基酸擬似物。天然產生胺基酸為藉由遺傳密碼編碼之彼等，以及後期經修飾之彼等胺基酸，例如，羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。術語「胺基酸類似物」係指具有與天然產生胺基酸相同之基本化學結構但是C端羧基、N端胺基或側鏈官能基已經化學修飾成另一官能基。術語「胺基酸擬似物」係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構但是功能類似於天然產生胺基酸之化學化合物。如本文中所用，二十種習知胺基酸及其縮略語遵循習知用法。參見例如，Immunology—A Synthesis (第2版，E. S. Golub及D. R. Gren編輯，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。
本文中術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」可交換使用且可係指兩種或更多種胺基酸之聚合物。
本文中可交換使用之「多核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修改之核苷酸或鹼及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物之任何受質。多核苷酸可包括經修飾之核苷酸(諸如甲基化核苷酸)及其類似物。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後賦予核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可經非核苷酸組分中斷。多核苷酸可包含於合成後作出之修飾，諸如與標籤結合。其他類型之修改包括例如「帽」、天然產生核苷酸中之一或多者經類似物置換、內核苷酸修飾，諸如例如，具有不帶電鍵聯(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵聯(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之彼等，含有側鏈部分(諸如例如，蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-離胺酸等))之彼等，具有嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素(psoralen)等)之彼等，含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之彼等，含有烷基化劑之彼等，具有經修飾之鍵結(例如，α異頭物核酸等)之彼等，以及該(等)多核苷酸之未經修飾形式。此外，通常存在於糖中之羥基中之任一者可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護，或經活化以製備另外核苷酸之另外鍵聯，或可與固體或半固體擔體結合。5’及3’端OH可經磷酸化或經胺或來自1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。亦可將其他羥基衍生成標準保護基。多核苷酸亦可含有一般此項技術中已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基-、2’-氟-或2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-異頭物糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、無環類似物及鹼性核苷類似物(諸如甲基核苷)。一或多個磷酸二酯鍵聯可經替代連接基團置換。此等替代連接基團包括(但不限於)其中磷酸酯經P(O)S (「硫代酯」)、P(S)S (「二硫代酯」)、(O)NR2 (「醯胺」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2 (「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R或R’獨立地為H或經取代或未經取代之烷基(1至20個C)，該烷基視情況含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非多核苷酸中之所有鍵聯必須相同。上述適用於本文中提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
術語「經單離核酸」係指基因組、cDNA或合成來源之核酸分子或其組合，其自存在於核酸之天然來源中之其他核酸分子分離。例如，關於基因組DNA，術語「經單離」包括自天然締合基因組DNA之染色體分離之核酸分子。較佳地，「經單離」核酸係無天然側接核酸之序列(即位於所關注核酸之5′及3′端之序列)。
術語「抗體」在本文中以廣義使用且具體而言涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體、三特異性抗體)及抗體片段(例如，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 、Fv及/或單鏈可變片段或scFv)，只要其展示所需生物活性。
於一些實施例中，術語「抗體」係指具有由兩條相同重(H)鏈及兩條相同輕(L)鏈組成之基本四多肽鏈結構之抗原結合蛋白(即，免疫球蛋白)。各L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈藉由一或多個二硫鍵彼此連接，取決於H鏈同型。各重鏈在N端處具有可變區(本文中縮寫為VH )，接著恆定區。該重鏈恆定區包含三個域CH1 、CH2 及CH3 。各輕鏈在N端具有可變區(本文中縮寫為VL )，接著恆定區在其另一端。該輕鏈恆定區包含一個域CL 。將VL 與VH 對準及將CL 與重鏈之第一恆定域(CH1)對準。VH 及VL 配對一起形成單抗原結合位點。IgM抗體由5個基本異四聚體單元連同稱作J鏈之另一多肽組成，因此含有10個抗原結合位點，而分泌之IgA抗體可聚合形成包含2至5個基本4鏈單元連同J鏈之多價組裝。
可基於結構及序列分析將VH 及VL 區進一步細分成高可變性之區，稱作高可變區(HVR)。HVR散佈有更保守稱作框架區(FW)之區(參見例如，Chen等人(1999) J. Mol. Biol. (1999) 293, 865-881)。各VH 及VL 包含以下列順序自胺基端至羧基端排列之三個HVR及四個FW：FW-1_HVR-1_FW-2_HVR-2_FW-3_HVR-3_FW4。整篇本發明，將重鏈之三個HVR稱作HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。類似地，將輕鏈之三個HVR稱作HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
重鏈及輕鏈可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。於輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區藉由約12或更多個胺基酸之「J」區接合，其中該重鏈亦包含約10或更多個胺基酸之「D」區(參見例如，Fundamental Immunology第7章(Paul, W.編輯，第2版，Raven Press, N.Y). (1989))。
可將來自任何脊椎動物物種之L鏈分配為兩種明確區別類型(稱作κ及λ)中之一者，基於其恆定域之胺基酸序列。取決於其重鏈之恆定域(CH)之胺基酸序列，可將抗體分配成不同類別或同型。存在五類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及gM，其各自具有指定為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。可將抗體之IgG類別各自藉由γ重鏈(Y1至Y4)進一步分成四個子類別IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
術語「抗體衍生物」或抗體之「衍生物」係指能結合至與抗體結合相同抗原(例如，CTLA4)且包含連接至另外分子實體之抗體之胺基酸序列的分子。含於抗體衍生物中之抗體之胺基酸序列可為全長重鏈、全長輕鏈、全長重鏈之任何部分、抗體之全長輕鏈之任何部分、抗體之任何其他片段、或完整抗體。另外分子實體可為化學或生物分子。另外分子實體之實例包括化學基團、胺基酸、肽、蛋白質(諸如酵素、抗體)及化學化合物。另外分子實體可具有任何效用，諸如用作檢測劑、標籤、標記、藥劑或治療劑。抗體之胺基酸序列可藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式附接或連接至另外分子實體。術語「抗體衍生物」亦涵蓋嵌合抗體、人源化抗體及衍生自CTLA4抗體之胺基酸序列之修飾 (諸如保守胺基酸置換、新增及插入)之分子。
術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」係指保留結合至抗原之能力之抗體之一或多個部分，該抗體結合至該抗原(例如，CTLA4)。抗體之「抗原結合片段」之實例包括(i) Fab片段，由VL 、VH 、CL 及CH1 域組成之單價片段；(ii) F(ab′)2 片段，包含由鉸鏈區之二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH 及CH1 域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL 及VH 域組成之Fv片段，(v) dAb片段(Ward等人，Nature 341:544-546 (1989))，其由VH 域組成；及(vi)經單離之互補決定區(CDR)。
術語「結合分子」涵蓋(1)抗體，(2)抗體之抗原結合片段，及(3)抗體之衍生物，各者如本文中所定義。
術語「CTLA4」在本申請案中使用且包含人類CTLA4 (例如，UniProt寄存編號P16410)，以及其變異體、同工異型物及物種同源物(例如，小鼠CTLA4 (UniProt寄存編號P09793)、大鼠CTLA4 (UniProt寄存編號Q9Z1A7)、狗CTLA4 (UniProt寄存編號Q9XSI1)、食蟹獼猴CTLA4 (UniProt寄存編號G7PL88)等)。因此，如本文中所定義及揭示之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)亦可結合來自除了人類外之物種之CTLA4。於其他情況下，結合分子可對人類CTLA4完全特異性且可不展示物種或其他類型之交叉反應性。
術語「CTLA4抗體」係指如本文中所定義之能結合至人類CTLA4之抗體。
術語「嵌合抗體」係指包含源自不同動物物種之胺基酸序列之抗體，諸如具有源自人類抗體之可變區及鼠科免疫球蛋白恆定區之彼等。
術語「競爭結合」係指兩個抗體於其結合至結合靶中之相互作用。若在第二抗體之存在下第一抗體與其同源抗原決定基之結合相較於在第二抗體不存在下第一抗體之結合可檢測地減少，則第一抗體與第二抗體競爭結合。或者，在第一抗體之存在下第二抗體與其抗原決定基之結合亦可檢測地減少之情況可(但不必)為該案例。即，在第二抗體不抑制第一抗體結合至其各自抗原決定基下，第一抗體可抑制第二抗體結合至其抗原決定基。然而，在各抗體可檢測地抑制其他抗體與其同源抗原決定基之結合之情況下，無論是否至相同、更高或更低程度，將該等抗體稱作彼此「交叉競爭」以結合其各自抗原決定基。
術語「抗原決定基」係指抗體(或其抗原結合片段)結合之抗原之部分。抗原決定基可自鄰接胺基酸或藉由蛋白質之三級折疊並置之非鄰接胺基酸二者形成。自鄰接胺基酸形成之抗原決定基通常保留暴露於變性劑，然而藉由三級折疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理中喪失。抗原決定基可包含各種數目之胺基酸於獨特空間構形中。測定抗原決定基之空間構形之方法包括例如x-射線結晶學、2維核磁共振、氘及氫交換與質譜法組合、或定點誘變、或與抗原及其複合結構與其結合抗體及其變異體之電腦建模組合使用之所有方法(參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G. E. Morris編輯.(1996))。一旦確定抗原之所需抗原決定基，可例如使用本文中所述技術產生該抗原決定基之抗體。抗體之產生及表徵亦可闡明關於所需抗原決定基之資訊。自此資訊，然後可競爭篩選結合至相同抗原決定基之抗體。達成此之一種方法為進行交叉競爭研究以找到彼此競爭結合之抗體，即，競爭結合至抗原之抗體。基於其交叉競爭「分類」抗體之高通量方法述於PCT公開案第WO 03/48731號中。
術語「生殖系」係指抗體基因及基因片段之核苷酸序列，因為其經由生殖細胞自親本傳給後代。生殖系序列不同於成熟B細胞中編碼抗體之核苷酸序列，該等核苷酸序列已在B細胞成熟過程期間藉由重組及高突變事件改變。
術語「糖基化位點」係指藉由真核細胞識別為糖殘基之連接位置之胺基酸殘基。在碳水化合物(諸如寡糖)之情況下連接之胺基酸通常為天冬醯胺(N-鍵聯)、絲胺酸(O-鍵聯)及蘇胺酸(O-鍵聯)殘基。特定連接位點通常藉由胺基酸序列(本文中稱作「糖基化位點序列」)信號傳導。用於N-連接之糖基化之糖基化位點序列為：-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-，其中X可為習知胺基酸中之任一者，除了脯胺酸。術語「N-連接」及「O-連接」係指用作糖分子與胺基酸殘基之間之連接位點之化學基團。N-連接之糖通過胺基連接；O-連接之糖通過羥基連接。術語「多醣佔用」係指連接至糖基化位點之碳水化合物部分之存在(即，佔用多醣位點)。在多肽上存在至少兩個潛在糖基化位點之情況下，無(0-多醣位點佔用)、一個(1-多醣位點佔用)或兩個(2-多醣位點佔用)位點可由碳水化合物部分佔用。
術語「宿主細胞」係指可工程改造以產生所關注蛋白質、蛋白質片段或肽之細胞系統。宿主細胞包括(不限於)經培養細胞，例如，源自囓齒動物(大鼠、小鼠、豚鼠或倉鼠)之哺乳動物培養細胞，諸如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；人類細胞(例如，HEK293F細胞、HEK293T細胞)；或人類組織或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞(例如，S2細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌(E. coli )細胞)及包含於轉殖基因動物或經培養組織內之細胞。術語不僅涵蓋特定受試者細胞，而且涵蓋此細胞之後代。因為某些修飾可發生於後代中，由於突變或環境影響，此後代可不與親本細胞相同，但是仍包含於術語「宿主細胞」之範圍內。
「人類抗體」為具有胺基酸序列者，該胺基酸序列對應於藉由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。
術語「人源化抗體」係指含有源自人類抗體序列之胺基酸殘基之嵌合抗體。人源化抗體可含有來自非人類動物或合成抗體之CDR或HVR中之一些或所有，而抗體之框架區及恆定區含有源自人類抗體序列之胺基酸殘基。
術語「說明性抗體」係指本發明中所述及如表 A 及 B 中所列之彼等所指定之抗體中之任一者，及包含表 A 及 B 中所列之抗體之6個HVR及/或VH及VL之任何抗體。此等抗體可為任何類別(例如，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。因此，以上所識別之各抗體涵蓋具有VL 及VH 區之相同胺基酸序列之所有五類抗體。此外，IgG類別之抗體可為任何子類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。因此，以上於IgG子類別中所識別之各抗體涵蓋具有VL 及VH 區之相同胺基酸序列之所有四種子類別之抗體。五類以及四種IgG子類別之人類抗體之重鏈恆定區的胺基酸序列係此項技術中已知。
「經單離」抗體或結合分子(例如，可活化抗體)為已自其自然環境之組分分離者。於一些實施例中，抗體經純化為大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)所測定。評論用於評估抗體純度之方法，參見例如，Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
術語「Ka 」係指特定結合分子-抗原相互作用之締合速率常數，其中術語「kd 」係指特定結合分子-抗原相互作用之解離速率常數。
術語「KD 」係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。其自kd 與ka 之比率(即，kd /ka )獲得且表示為莫耳濃度(M)。KD 係用作抗體結合至其結合搭檔之親和力之量度。KD 越小，抗體結合越緊密，或抗體與抗原之間之親和力越高。例如，具有奈莫耳(nM)解離常數之抗體較具有微莫耳(μM)解離常數之抗體與特定抗原結合更緊密。可使用此項技術中良好建立之方法測定抗體之KD 值。一種測定抗體之KD 之方法為藉由使用表面電漿子共振，通常使用生物感測器系統，諸如Biacore®系統。例如，使用BIACORE™系統(BIAcore檢定)之檢定程序述於本發明之至少實例3中。
術語「哺乳動物」係指哺乳綱類別之任何動物物種。哺乳動物之實例包括：人類；實驗動物，諸如大鼠、小鼠、倉鼠、兔、非人類靈長類動物及豚鼠；家養動物，諸如貓、狗、牛、綿羊、山羊、馬及豬；及被俘野生動物，諸如獅子、老虎、大象及類似者。
關於哺乳動物之某種疾病病狀之術語「預防(prevent/preventing)」係指預防或延遲該疾病之發作，或預防其臨床或亞臨床症狀之表現。
如本文中所用，兩個多肽序列之間之「序列同一性」指示該等序列之間相同之胺基酸之百分比。多肽之胺基酸序列同一性習知上可使用已知電腦程式，諸如Bestfit、FASTA或BLAST測定(參見例如，Pearson,Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)；Pearson,Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)；Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)；Altschul等人，Nucelic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。當使用Bestfit或任何其他序列比對程序測定特定序列是否與參考胺基酸序列為例如95%同一性時，設置參數使得在參考胺基酸序列之全長上計算同一性百分比且允許參考序列之胺基酸殘基之總數目之多達5%的同源性空隙。測定多肽之間之同一性百分比之此上述方法適用於本文中所揭示之所有蛋白質、片段或其變異體。
如本文中所用，術語「結合」、「結合至」、「特異性結合」、「特異性結合至」或「對…特異性」係指可量測且可再生相互作用，諸如靶與抗體之間之結合，其確定在分子(包括生物分子)異質群之存在下靶之存在。例如，結合至或特異性結合至靶(其可為抗原決定基)之抗體為結合此靶之抗體，結合此靶較其結合至其他靶具有更高親和力、抗體親抗原性(avidity)、更便利、及/或更多持續時間。於一實施例中，抗體與不相關靶之結合程度係小於抗體與該靶之結合之約10%，如例如藉由放射性免疫檢定(RIA)所量測。於某些實施例中，特異性結合至靶之抗體具有≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM或≤ 0.1 nM之解離常數(Kd)。於某些實施例中，抗體特異性結合至蛋白質上之抗原決定基，該蛋白質在來自不同物種之蛋白質中係保守的。於另一實施例中，特異性結合可包括但不需要專一結合。
關於哺乳動物之某種疾病病狀之術語「治療(treat/treating/treatment)」係指造成患有該疾病病狀之哺乳動物之所需或有益效果。所需或有益效果可包括疾病之一或多種症狀之降低之頻率或嚴重度(即，腫瘤生長及/或轉移，或藉由免疫細胞之數目及/或活性介導之其他效果及類似者)，或阻止或抑制疾病、病狀或病症之進一步發展。於治療哺乳動物之癌症之上下文中，所需或有益效果可包括抑制癌細胞之進一步生長或擴散、癌細胞之死亡、抑制癌症再發生、減少與癌症相關之疼痛、或提高哺乳動物之存活。該效果可係主觀或客觀。例如，若哺乳動物為人類，則人類可注意提高之精力或活力或減少之疼痛，因為主觀改善之症狀或對療法反應。或者，臨床醫師可通知腫瘤大小或腫瘤負擔之減少，基於身體檢查、實驗室參數、腫瘤標記物或射線照相發現。臨床醫師可觀察對治療反應之一些實驗室標誌包括測試之標準化，諸如白血球計數、紅血球計數、血小板計數、紅血球沉降率、及各種酵素水平。此外，臨床醫師可觀察可檢測腫瘤標記物之減少。或者，可使用其他測試評價客觀改善，諸如語圖、核磁共振測試及正電子放射測試。
術語「載體」係指能轉運外來核酸分子之核酸分子。外來核酸分子藉由重組技術(諸如連接或重組)連接至載體核酸分子。此允許外來核酸分子被操作、選擇、於宿主細胞或生物體中進一步操作或表現。載體可為質粒、噬菌體、轉位子、黏粒、染色體、病毒或病毒子。可在引入宿主細胞後將一種載體融合至宿主細胞之基因組，及從而連同宿主基因組(例如，非表小體哺乳動物載體)複製。另一種載體能於引入其之宿主細胞中自發複製(例如，具有複製之細菌來源之細菌載體及表小體哺乳動物載體)。能指導以可操作方式連接其之可表現外來核酸之表現之另一特定類型之載體通常被稱作「表現載體」。表現載體一般具有驅動可表現外來核酸之表現之控制序列。稱作「轉錄載體」之更簡單載體僅能被轉錄但是不能被轉譯：其可於靶細胞中複製但是不可表現。術語「載體」涵蓋所有類型之載體，不管其功能。能指導以可操作方式連接其之可表現核酸之表現之載體通常被稱作「表現載體」。「載體」之其他實例可包括顯示載體(例如，指導編碼多肽在病毒或細胞(諸如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及/或哺乳動物細胞)表面上表現及顯示之載體)。
如本文中所用，「受試者」、「患者」或「個體」可係指人類或非人類動物。「非人類動物」可係指不歸類為人類之任何動物，諸如家養動物、農場動物或動物園動物、競技動物、寵物(諸如狗、馬、貓、牛等)，以及用於研究之動物。研究動物可係指(不限於)線蟲類動物、節肢動物、脊椎動物、哺乳動物、青蛙、囓齒動物(例如，小鼠或大鼠)、魚(例如，斑馬魚或尖鼻魨)、禽(例如，雞)、狗、貓及非人類靈長類動物(例如，恆河猴、食蟹獼猴、黑猩猩等)。於一些實施例中，受試者、患者或個體為人類。
「有效量」係指至少劑量有效量且持續必要時間段以達成一或多種所需或指定效果，包括治療性或預防性結果。可於一或多種投與中提供有效量。出於本發明之目的，抗體、藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以直接或間接達成預防性或治療性治療之量。如臨床背景中所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可或可不結合另一種藥物、化合物或醫藥組合物達成(例如，如作為單藥療法或組合療法投與之有效量)。因此，可於投與一或多種治療劑之背景下考慮「有效量」，且若結合一或多種其他劑，則可考慮以有效量提供單藥劑，可為或達成所需結果。III. 結合至人類 CTLA4 之結合分子
本發明部分係關於結合至人類CTLA4之經單離結合分子，其包括CTLA4抗體、CTLA4抗體之抗原結合片段及CTLA4抗體之衍生物。於一些實施例中，該等結合分子為本文中所述抗體中之任一者，包括關於HVR、可變區(VL、VH)及輕鏈及重鏈(例如，IgG1、IgG2、IgG4)之特定胺基酸序列所述之抗體。於一些實施例中，該等抗體為人類抗體。於一些實施例中，該等抗體為人源化抗體及/或嵌合抗體。於一些實施例中，本發明係關於結合至人類CTLA4且具有下列功能性質中之至少一者(例如，至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、至少八者或所有九者)之結合分子：(a) 以500 nM或更低之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4；(b)具有對人類CTLA4之拮抗活性；(c) 在多達100 nM之濃度下不結合至人類PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、CD95、CD120a、OX40、CD40、BTLA、VISTA、ICOS及/或B7-H4；(d)與猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4交叉反應；(e)誘導ADCC效應(例如，對Treg)；(f)活化人類PBMC (例如，刺激IL-2及/或IFNγ之分泌)；(g)能抑制腫瘤細胞生長；(h)具有對癌症之治療效應；及(i)阻斷人類CTLA4結合至人類CD80及/或人類CD86。於一些實施例中，本文中所述之抗CTLA4抗體相較於檢定中之伊匹單抗於阻斷CD80及/或CD86結合至人類CTLA4中具有更低活性，其中將人類CD80及/或CD86固定(或板結合)且人類CTLA4蛋白係於溶液中或在細胞表面上展示。參見圖：57C及57D及58。於一些實施例中，相較於PBMC或脾中之Treg耗盡，本文中所述之抗CTLA4抗體選擇性耗盡腫瘤微環境中之Treg細胞。於一些實施例中，本文中所述之抗CTLA4抗體相較於伊匹單抗於腫瘤微環境中具有更高Treg耗盡活性。參見圖：61A至B、62A至B及63。本文中亦提供與本文中所述抗體或抗原結合片段中之一或多者交叉競爭結合至人類CTLA4之一或多種抗CTLA4抗體或抗原結合片段。
於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低，約450 nM或更低，約400 nM或更低，約350 nM或更低，約300 nM或更低，約250 nM或更低，約200 nM或更低，約150 nM或更低，約100 nM或更低，約90 nM或更低，約80 nM或更低，約70 nM或更低，約60 nM或更低，約50 nM或更低，約40 nM或更低，約30 nM或更低，約25 nM或更低，約20 nM或更低，約10 nM或更低，約1 nM或更低，約0.1 nM或更低等)之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4。於一些實施例中，抗體或抗原以約 350 nM或更低之KD 結合片段結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約100 nM或更低之KD 結合至人類CTLA4。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約50 nM或更低之KD 結合至人類CTLA4。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之KD 結合至人類CTLA4。可使用此項技術中已知之任何方法(包括例如藉由表面電漿子共振、ELISA、等溫滴定量熱法、過濾結合檢定、EMSA等)進行量測抗體或抗原結合片段之KD 之方法。於一些實施例中，藉由表面電漿子共振或ELISA量測KD (參見例如以下實例 3)。
於一些實施例中，本文中所述之抗體或抗原結合片段具有對人類CTLA4之拮抗活性。於一些實施例中，當表現人類CTLA4之細胞(例如，人類細胞)經抗體或抗原結合片段接觸時，該等抗體或抗原結合片段抑制人類CTLA4之一或多種活性(例如，CTLA4阻斷，如使用CLA4阻斷報告基因檢定藉由報告基因信號增加所量測)。
於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與猴(例如，食蟹獼猴)、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4交叉反應。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與猴CTLA4交叉反應。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與小鼠CTLA4交叉反應。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與大鼠CTLA4交叉反應。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與狗CTLA4交叉反應。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與猴及小鼠CTLA4；猴及大鼠CTLA4；猴及狗CTLA4；小鼠及大鼠CTLA4；小鼠及狗CTLA4；大鼠及狗CTLA4；猴、小鼠及大鼠CTLA4；猴、小鼠及狗CTLA4；猴、大鼠及狗CTLA4；小鼠、大鼠及狗CTLA4；或猴、小鼠、大鼠及狗CTLA4交叉反應。於一些實施例中，若抗體或抗原結合片段以低於約500 nM (例如，低於約1 nM、低於約10 nM、低於約25 nM、低於約50 nM、低於約75 nM、低於約100 nM、低於約150 nM、低於約200 nM、低於約250 nM、低於約300 nM、低於約350 nM等)之KD 結合至非人類CTLA4分子，則抗體或抗原結合片段係交叉反應性。量測抗體交叉反應性之方法係此項技術中已知，包括(不限於)表面電漿子共振、ELISA、等溫滴定量熱法、過濾結合檢定、EMSA等。於一些實施例中，藉由ELISA量測交叉反應性(參見例如以下實例3)。
於一些實施例中，於抗體結合至表現CTLA4之細胞後，抗體誘導對表現CTLA4之細胞(例如，對表現CTLA4之人類細胞，諸如Treg)之ADCC效應。量測ADCC效應之方法(例如，活體外方法)係此項技術中已知，包括(不限於)經由以下實例3中所述之方法。於一些實施例中，抗體相對於對照(例如，同型對照或伊匹單抗)誘導ADCC效應超過約10% (例如，誘導ADCC超過約10%、超過約15%、超過約20%、超過約25%、超過約30%、超過約35%、超過約40%等)。
於一些實施例中，抗體或抗原結合片段能抑制腫瘤細胞生長及/或增殖。於一些實施例中，當與抗體或抗原結合片段接觸時，相對於不與抗體或抗原結合片段接觸之對應腫瘤細胞(或相對於與同型對照抗體接觸之對應腫瘤細胞)抑制腫瘤細胞生長及/或增殖至少約5% (例如，至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約99%)。於一些實施例中，當對受試者投與抗體或抗原結合片段時，抗體或抗原結合片段能減少受試者之腫瘤體積。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段能減少受試者之腫瘤體積相對於受試者之初始腫瘤體積(例如，在投與抗體或抗原結合片段之前；如相較於投與同型對照抗體之受試者之對應腫瘤)至少約5% (例如，至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約99%)。監測腫瘤細胞生長/增殖、腫瘤體積及/或腫瘤抑制之方法係此項技術中已知，包括例如經由以下實例4中所述之方法。
於一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有對癌症之治療效應。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段減少癌症之一或多種徵兆或症狀。於一些實施例中，當投與抗體或抗原結合片段時，患有癌症之受試者變為部分或完全緩解。
於另一態樣中，本發明提供經單離抗體，其與本發明之說明性抗體(諸如TY21585、TY21586、TY21587、TY21588、TY21589、TY21580、TY21591、TY21686、TY21687、TY21689、TY21680、TY21691、及/或TY21692)中之任一者競爭或交叉競爭結合至人類CTLA4。於特定實施例中，本發明提供經單離抗體，其與本發明之說明性抗體中之任一者競爭或交叉競爭結合至人類 CTLA4上之相同抗原決定基。抗體與另一種抗體競爭或交叉競爭結合之能力可使用此項技術中已知之標準結合檢定(諸如BIAcore分析、ELISA檢定或流動式細胞測量術)測定。例如，吾人可允許本發明之說明性抗體在飽和條件下結合至人類CTLA4及然後量測測試抗體結合至CTLA4之能力。若測試抗體能與說明性抗體同時結合至CTLA4，則測試抗體結合至與說明性抗體不同之抗原決定基。然而，若測試抗體不能同時結合至CTLA4，則測試抗體結合至相同抗原決定基、重疊抗原決定基或緊鄰藉由說明性抗體結合之抗原決定基之抗原決定基。可使用各種方法(諸如ELISA、RIA、FACS或表面電漿子共振)進行此實驗。
於一些實施例中，抗體或抗原結合片段阻斷CTLA4與其結合搭檔中之一或多者之間(例如，人類CTLA4與人類CD80、人類CTLA4與人類CD86)之結合。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段阻斷活體外CTLA4與其配位體之間之結合。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約100 nM或更低、約50 nM或更低、約25 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低等)之半最大抑制濃度(IC50 )以阻斷CTLA4結合至CD80及/或CD86。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有約100 nM或更低之半最大抑制濃度(IC50 )以阻斷CTLA4結合至CD80及/或CD86。於一些實施例中，當在約100 nM或更高(例如，約100 nM或更高、約500 nM或更高、約1 µM或更高、約10 µM或更高等)之濃度下提供時，抗體或抗原結合片段完全阻斷人類CTLA4結合至CD80及/或CD86。如本文中所用，術語「完全阻斷(complete blocking/completely blocks)」係指抗體或抗原結合片段減少第一蛋白與第二蛋白之間之結合至少約80% (例如，至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%等)的能力。量測抗體或抗原結合片段阻斷第一蛋白(例如，人類CTLA4)與第二蛋白(例如，人類CD80或人類CD86)之結合之能力的方法係此項技術中已知，包括(不限於)經由BIAcore分析、ELISA檢定及流動式細胞測量術(參見例如以下實例3)。於一些實施例中，本文中所述之抗CTLA4抗體具有較伊匹單抗更低阻斷配位體結合之活性。CTLA4 抗體
於一些態樣中，本發明提供結合至人類CTLA4之經單離抗體。於一些實施例中，抗體以1000 nM或更低(例如，50 nM或更低，10 nM或更低)之KD 結合人類CTLA4，如藉由表面電漿子共振所量測。於一些實施例中，抗體與選自食蟹獼猴、小鼠、大鼠及狗之至少一種非人類物種交叉反應。
於一些態樣中，本發明提供特異性結合至類似於人類CTLA4之配位體結合位點之抗原決定基之經單離抗體。於一些實施例中，抗體特異性結合至類似於人類CTLA4之CD80結合位點之抗原決定基。於一些實施例中，抗體特異性結合至類似於人類CTLA4之CD86結合位點之抗原決定基。於一些實施例中，抗體特異性結合至包含人類CTLA4之配位體結合位點(例如，CD80及/或CD86結合位點)中之一或多個胺基酸殘基之抗原決定基。於一些實施例中，抗體特異性結合至不同於伊匹單抗之抗原決定基之人類CTLA4之抗原決定基。於一些實施例中，抗原決定基不包含人類CTLA4之CC’環路基序中之胺基酸殘基。於一些實施例中，抗原決定基不包含人類CTLA4之胺基酸殘基L106或I108。於一些實施例中，抗體特異性結合至包含人類CTLA4之胺基酸殘基Y105及L106，但是非I108之抗原決定基，其中該等胺基酸殘基之編號係根據SEQ ID NO: 207。 KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPE (SEQ ID NO: 207)
於一態樣中，本發明提供包含重鏈可變區及輕鏈可變區之經單離抗體，a)其中該重鏈可變區包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中該HVR-H1包含如選自以下之式之胺基酸序列：式(I)：X1TFSX2YX3IHWV (SEQ ID NO: 1)，其中X1為F或Y，X2為D或G，且X3為A、G或W；式(II)：YSIX1SGX2X3WX4WI (SEQ ID NO: 2)，其中X1為S或T，X2為H或Y，X3為H或Y，且X4為A、D或S；及式(III)：FSLSTGGVAVX1WI (SEQ ID NO: 3)，其中X1為G或S；該HVR-H2包含如選自以下之式之胺基酸序列：式(IV)：IGX1IX2HSGSTYYSX3SLKSRV (SEQ ID NO: 4)，其中X1為D或E，X2為S或Y，且X3為P或Q；式(V)：IGX1ISPSX2GX3TX4YAQKFQGRV (SEQ ID NO: 5)，其中X1為I或W，X2為G或S，X3為G或S，且X4為K或N；及式(VI)： VSX1ISGX2GX3X4TYYADSVKGRF (SEQ ID NO: 6)，其中X1為A、G或S，X2 為S或Y，X3為G或S，且X4為S或T；且該HVR-H3包含如選自以下之式之胺基酸序列：式(VII)：ARX1X2X3X4FDX5 (SEQ ID NO: 7)，其中X1為G、R或S，X2為A、I或Y，X3為D、V或Y，X4為A、E或Y，且X5為I或Y；式(VIII)：ARX1GX2GYFDX3 (SEQ ID NO: 8)，其中X1為D或L，X2為F或Y，且X3為V或Y；式(IX)：ARX1X2X3X4AX5X6FDY (SEQ ID NO: 9)，其中X1為L或R，X2為 I或P，X3為A或Y，X4為S或T，X5為T或Y，且X6為A或Y；及式(X)：ARDX1X2X3GSSGYYX4GFDX5 (SEQ ID NO: 10)，其中X1為I或V，X2為A或H，X3為P或S，X4為D或Y，且X5為F或V；及/或b)其中該輕鏈可變區包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，其中該HVR-L1包含如選自以下之式之胺基酸序列：式(XI)：RASQX1X2X3SX4LX5 (SEQ ID NO: 11)，其中X1為G或S，X2為I或V，X3為G或S，X4為S或Y，且X5為A或N；式(XII)：RASQX1VX2X3RX4LA (SEQ ID NO: 12)，其中X1為S或T，X2為F、R或S，X3為G或S，且X4為F或Y；及式(XIII)：RASX1SVDFX2GX3SFLX4 (SEQ ID NO: 13)，其中X1為E或Q，X2為D、F、H或Y，X3為F、I或K，且X4為A、D或H；該HVR-L2包含如式(XIV)：X1ASX2X3X4X5GX6 (SEQ ID NO: 14)之胺基酸序列，其中X1為A或D，X2為N、S或T，X3為L或R，X4為A、E或Q，X5為S或T，且X6為I或V；且該HVR-L3包含如選自以下之式之胺基酸序列：式(XV)：YCX1X2X3X4X5X6PX7T (SEQ ID NO: 15)，其中X1為E、Q或V，X2為H或Q，X3為A、G、H、R或S，X4為D、L、S或Y，X5為E、G、P、Q或S，X6為L、T、V或W，且X7為F、L、P、W或Y；式(XVI)：YCQQX1X2X3WPPWT (SEQ ID NO: 16)，其中X1為S或Y，X2為D或Y，且X3為Q或Y；及式(XVII)：YCQX1YX2SSPPX3YT (SEQ ID NO: 17)，其中X1為H或Q，X2為T或V，且X3為E或V。
於一些實施例中，抗體包含：a)包含選自SEQ ID NO: 18至29之胺基酸序列之HVR-H1；包含選自SEQ ID NO: 30至39之胺基酸序列之HVR-H2；及包含選自SEQ ID NO: 40至52之胺基酸序列之HVR-H3；及/或b)包含選自SEQ ID NO: 53至65之胺基酸序列之HVR-L1；包含選自SEQ ID NO: 66至69之胺基酸序列之HVR-L2；及包含選自SEQ ID NOS: 70至81之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含針對下表 A 中所述之示例性抗體中之任一者所示之HVR中之一者、兩者、三者、四者、五者或所有六者。表 A ：抗 CTLA4 HVR 序列
於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包括包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之HVR-L3。
於一些實施例中，抗體包含：a)包含選自SEQ ID NO: 82至94之胺基酸序列之重鏈可變區；及/或b)包含選自SEQ ID NO: 95至107之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含具有與選自SEQ ID NO: 82至94之序列至少90% (例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列之重鏈可變區，及/或包含具有與選自SEQ ID NO: 95至107之序列至少90% (例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之胺基酸序列之輕鏈可變區。 於一些實施例中，抗體包含下表 B 中所述之示例性抗體中之任一者之重鏈可變區及輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含針對下表 B 中所述之示例性抗體中之任一者所示之重鏈可變區之1、2或所有3個HVR，及/或輕鏈可變區之1、2或所有3個HVR。表 B ：抗 CTLA4 可變區胺基酸序列
抗體名稱： VH ： VL ：
TY21585 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAIHWVRQAPGKGLEWIGIISPSSGSTNYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDIHSGSSGYYYGFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 82) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFFGISFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYTSSPPVYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 95)
TY21586 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYYWAWIRQAPGKGLEWVSSISGSGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDGFGYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 83) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYVYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQGLQTPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 96)
TY21587 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDVAPGSSGYYDGFDFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 84) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGSSLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDQWPPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 97)
TY21588 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWDWIRQAPGKGLEWVSGISGYGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARHSYYGSGNFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 85) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFFGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSWPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 98)
TY21589 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWIHWVRQAPGKGLEWIGWISPSGGGTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGAYEFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 86) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSRFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYPTPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 99)
TY21580 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWSWIRQAPGKGLEWLARIDWDDDKYYSTSLKSRLTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARSYVYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 87) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRGRFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSSWPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 100)
TY21591 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVAVSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRIATATYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 88) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVFSRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYYWPPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 101)
TY21686 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTGGVAVGWIRQAPGKGLEWVSAISGYGSTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARLPYSAYAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 89) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 102)
TY21687 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAIHWVRQAPGKGLEWIGIISPSGGGTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARHPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 90) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLDWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYVSSPPEYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 103)
TY21689 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGEIYHSGSTYYSPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRIDAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 91) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFDGFSFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDSWPYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 104)
TY21680 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSGYAIHWVRQAPGKGLEWIGIISPSGGGTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARLYDVAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 92) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGKSFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEQSLEVPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 105)
TY21691 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAIHWVRQAPGKGLEWIGIISPSGGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARLGYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQALQLPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 106)
TY21692 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGHYWSWIRQAPGKGLEWIGDISHSGSTYYSQSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGSRTGYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 94) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPLTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 107)
於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些實施例中，本發明之抗體與包含以下之抗體交叉競爭結合至人類CTLA4：a)包含選自SEQ ID NO: 18至29之胺基酸序列之HVR-H1；包含選自SEQ ID NO: 30至39之胺基酸序列之HVR-H2；及包含選自SEQ ID NO: 40至52之胺基酸序列之HVR-H3；及/或b)包含選自SEQ ID NO: 53至65之胺基酸序列之HVR-L1；包含選自SEQ ID NO: 66至69之胺基酸序列之HVR-L2；及包含選自SEQ ID NO: 70至81之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，本發明之抗體與包含針對表 A 中所述之示例性抗體中之任一者所示之HVR中之一者、兩者、三者、四者、五者或所有六者的抗體交叉競爭結合至人類CTLA4。於一些實施例中，本發明之抗體與包含以下之抗體交叉競爭結合至人類CTLA4：a)包含選自SEQ ID NO: 82至94之胺基酸序列之重鏈可變區；及/或b)包含選自SEQ ID NO: 95至107之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，本發明之抗體與包含針對表 B 中所述之示例性抗體中之任一者所示之VH及/或VL的抗體交叉競爭結合至人類CTLA4。
本文中所述之CTLA4抗體可為任何類別，諸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。於一些實施例中，該等CTLA4抗體為IgG類別，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類別。可使用此項技術中已知之方法將CTLA4抗體自一種類別或子類別轉變成另一種類別或子類別。用於產生所需類別或子類別之抗體之示例性方法包括以下步驟：單離編碼CTLA4抗體之重鏈之核酸及編碼CTLA4抗體之輕鏈之核酸，單離編碼VH 區之序列，將該VH 序列連接至編碼所需類別或子類別之重鏈恆定區之序列，表現細胞中之輕鏈基因及重鏈構築體，及收集CTLA4抗體。本發明之抗體可為單株抗體或多株抗體。本發明之抗體可為單特異性抗體或多特異性(例如，雙特異性抗體、三特異性抗體等)抗體。於一些實施例中，本文中所述之CTLA4抗體可包含一或多個Fc突變(例如，調節(增加或減少) ADCC或CDC活性之突變)。本發明之CTLA4抗體中可使用此項技術中已知之任何適宜Fc突變。
於一些實施例中，本發明之抗體為結合至第一及第二靶之雙特異性抗體，其中該第一靶為人類CTLA4。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合至第一及第二靶，其中該第一靶為人類CTLA4，且其中該雙特異性抗體包含a)包含選自SEQ ID NO: 18至29之胺基酸序列之HVR-H1；包含選自SEQ ID NO: 30至39之胺基酸序列之HVR-H2；及包含選自SEQ ID NO: 40至52之胺基酸序列之HVR-H3；及/或b)包含選自SEQ ID NO: 53至65之胺基酸序列之HVR-L1；包含選自SEQ ID NO: 66至69之胺基酸序列之HVR-L2；及包含選自SEQ ID NO: 70至81之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合至第一及第二靶，其中該第一靶為人類CTLA4，且其中該雙特異性抗體包含針對表 A 中所述之示例性抗體中之任一者所示之HVR中之一者、兩者、三者、四者、五者或所有六者。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合至第一及第二靶，其中該第一靶為人類CTLA4，且其中該雙特異性抗體包含：a)包含選自SEQ ID NO: 82至94之胺基酸序列之重鏈可變區；及/或b)包含選自SEQ ID NO: 95至107之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合至第一及第二靶，其中該第一靶為人類CTLA4，且其中該雙特異性抗體包含針對表 B 中所述之示例性抗體中之任一者所示之VH及/或VL。於一些實施例中，該第二靶為PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、CD95、CD120a、OX40、CD40、BTLA、VISTA、ICOS、Her1、Her2、Her3或B7-H4。
本發明之抗體可藉由此項技術中已知之任何技術產生，包括習知單株抗體方法學，例如，標準體細胞雜交技術(參見例如，Kohler及Milstein,Nature 256:495 (1975))、B淋巴細胞之病毒或致癌轉形、或如本文中詳細所述之重組抗體技術(參見例如，實例1及2)。於一些實施例中，本發明之抗體使用PCT申請案號PCT/CN2017/098333 (其全文以引用的方式併入本文中)及/或PCT申請案號PCT/CN2017/098299 (其全文以引用的方式併入本文中)中所述之庫及/或方法中之任一者產生。
雜交瘤產生為極完善建立之程序。用於製備雜交瘤之常見動物系統為鼠科系統。用於單離經免疫脾細胞用於融合之免疫方案及技術係此項技術中已知。融合搭檔(例如，鼠科骨髓瘤細胞)及融合程序亦已知。可用於製備本發明提供之人類CTLA4抗體之一種熟知方法涉及使用XenoMouse™動物系統。XenoMouse™小鼠經小鼠株工程改造，該等小鼠株包含人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之大片段且於小鼠抗體產生中有缺陷(參見例如，Green等人，(1994) Nature Genetics 7:13-21；WO2003/040170)。將動物用CTLA4抗原免疫。該CTLA4抗原為經單離及/或經純化之CTLA4。其可為CTLA4之片段，諸如CTLA4之細胞外域。動物之免疫可藉由此項技術中已知之任何方法進行(參見例如，Harlow及Lane，Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990)。用於將非人類動物(諸如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬)免疫之方法係此項技術中熟知(參見例如，Harlow及Lane，見上；及美國專利案第5,994,619號)。可投與CTLA4抗原與佐劑以刺激免疫反應。示例性佐劑包括完全或不完全弗氏(Freund's)佐劑、RIBI (胞壁醯基二肽)或ISCOM (免疫刺激複合物)。於將動物用CTLA4抗原免疫後，自經免疫動物單離之細胞製備產生抗體之永生化細胞系。於免疫後，將小動物處死及將淋巴結及/或脾B細胞永生。將細胞永生化之方法包括(但不限於)用致癌基因轉移細胞、用致癌病毒感染細胞、將其在永生化細胞選擇之條件下培養、使其遭受致癌或突變化合物、使其與永生化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合及使腫瘤抑制基因失活(參見例如Harlow及Lane，見上)。若使用與骨髓瘤細胞融合，則該等骨髓瘤細胞較佳地不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌細胞系)。使用CTLA4、其部分或表現CTLA4之細胞篩選永生化細胞。針對所需性質(包括穩健生長、高抗體產生及所需抗體性質)選擇、選殖及進一步篩選產生CTLA4抗體之細胞(例如，雜交瘤)，如下述所討論。雜交瘤可於活體內於同源動物中、於缺少免疫系統之動物(例如，裸鼠)中、或於細胞培養物中於活體外擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤之方法為一般技術者熟知。
本發明之抗體亦可使用噬菌體展示或酵母展示方法製備。用於單離人類抗體之此等展示方法建立於此項技術中(參見例如，Knappik等人(2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86；Feldhaus等人(2003) Nat Biotechnol 21:163-170；亦參見以下實例1及2之方法)。抗原結合片段
於一些其他態樣中，本發明提供本文中所述之CTLA4抗體中之任一者之抗原結合片段。
抗原結合片段可包含本文中所述抗體中之任一者之任何序列。於一些實施例中，該抗原結合片段包含以下之胺基酸序列：(1) CTLA4抗體之輕鏈；(2) CTLA4抗體之重鏈；(3)來自CTLA4抗體之輕鏈可變區；(4)來自CTLA4抗體之重鏈可變區；(5) CTLA4抗體之一或多個HVR (例如，1、2、3、4、5或6個HVR)；或(6)來自CTLA4抗體之輕鏈之三個HVR及來自CTLA4抗體之重鏈之三個HVR。
於一些實施例中，本發明提供選自表 A 及 B 中所列之彼等之抗體之抗原結合片段。
於一些實施例中，CTLA4抗體之抗原結合片段包括：(i) Fab片段，其為由VL 、VH 、CL 及CH 1域組成之單價片段；(ii) F(ab′)2 片段，其為包含由鉸鏈區處之二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH 及CH 1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL 及VH 域組成之Fv片段；(v) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546)，其由VH 域組成；(vi)經單離CDR，及(vii)單鏈抗體(scFv)，其為包含連接至抗體之VH 區之抗體之VL 區的多肽(參見例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。抗體衍生物
於一些其他態樣中，本發明提供本文中所述CTLA4抗體中之任一者之衍生物。
於一些實施例中，抗體衍生物係源自本發明之說明性抗體(例如，「親本抗體」)之胺基酸序列之修飾，同時保存親本抗體胺基酸序列之整體分子結構。可修飾親本抗體鏈之任何區域之胺基酸序列，諸如框架區、HVR區或恆定區。修飾之類型包括親本抗體之一或多個胺基酸之置換、插入、缺失或其組合。
於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 82至107中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之VL 或VH 區。於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 18至29中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HVR-H1胺基酸序列區。於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 30至39中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HVR-H2胺基酸序列區。於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 40至52中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HVR-H3胺基酸序列區。於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 53至65中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HVR-L1胺基酸序列區。於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 66至69中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HVR-L2胺基酸序列區。於一些實施例中，該抗體衍生物包含與如SEQ ID NO: 70至81中之任一者中所述之胺基酸序列至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性之HVR-L3胺基酸序列區。
於一些特定實施例中，該衍生物包含如SEQ ID NO: 18至107中之任一者中所述之胺基酸序列之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個保守或非保守置換，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個新增及/或缺失。
胺基酸置換涵蓋保守置換及非保守置換二者。術語「保守胺基酸置換」意指一種胺基酸經另一種胺基酸置換，其中該等兩種胺基酸具有某些物理化學性質之相似性，諸如涉及之殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、及/或兩親性。例如，通常可於各下列基團內作出置換：(a)非極性(疏水性)胺基酸，諸如丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸，諸如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩胺醯胺；(c)帶正電荷(鹼性)胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸及組胺酸；及(d)帶負電荷(酸性)胺基酸，諸如天冬胺酸及麩胺酸。
可於抗體之胺基酸序列之任何位置中作出修改，包括HVR、框架區或恆定區。於一實施例中，本發明提供一種抗體衍生物，其含有本發明之說明性抗體之VH 及VL HVR序列，又含有不同於該說明性抗體之彼等之框架序列。此等框架序列可獲自包含生殖系抗體基因序列之公共DNA資料庫或發表之參考文獻。例如，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於Genbank資料庫或「VBase」人類生殖系序列資料庫(Kaba等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)；Tomlinson等人，J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992)；及Cox等人，Eur. J. Immunol. 24:827-836 (1994))。可用於構築抗體衍生物之框架序列包括結構上類似於本發明之說明性抗體所用之框架序列者。例如，可將說明性抗體之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列，及HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3序列接枝至框架區，該等框架區具有與衍生框架序列之生殖系免疫球蛋白基因中發現之序列相同的序列，或可將HVR序列接枝至相較於該生殖系序列含有一或多個突變之框架區。
於一些實施例中，該抗體衍生物為包含本發明之說明性抗體之胺基酸序列之嵌合抗體。於一實例中，將來自一或多種說明性抗體之一或多個HVR與來自非人類動物(諸如小鼠或大鼠)之抗體之HVR組合。於另一實例中，嵌合抗體之所有HVR源自一或多種說明性抗體。於一些特定實施例中，嵌合抗體包含來自說明性抗體之重鏈可變區之1、2或3個HVR及/或來自說明性抗體之輕鏈可變區之1、2或3個HVR。可使用此項技術中已知之習知方法產生嵌合抗體。
另一種類型修改為使VH 及/或VL 鏈之HVR區內之胺基酸殘基突變。可進行定點誘變或PCR介導之誘變以引入該(該等)突變及對抗體結合有影響，或可於此項技術中已知之活體外或活體內檢定中評價所關注之其他功能性質。通常，引入保守置換。突變可為胺基酸新增及/或缺失。此外，通常改變VHR區內之至多1、2、3、4或5個殘基。於一些實施例中，該抗體衍生物包含重鏈HVR及/或輕鏈HVR中之1、2、3或4個胺基酸置換。於另一實施例中，該胺基酸置換為將抗體中之一或多個半胱胺酸變成另一種殘基，諸如(不限於)丙胺酸或絲胺酸。該半胱胺酸可為標準或非標準半胱胺酸。於一實施例中，該抗體衍生物相對於說明性抗體之胺基酸序列具有重鏈HVR區中之1、2、3或4個保守胺基酸置換。
亦可對VH 及/或VL 區內之框架殘基作出修改。通常，製備此等框架變異體以減少抗體之免疫原性。一種方法為使一或多個框架殘基「反突變」至對應生殖系序列。已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於衍生抗體之生殖系序列之框架殘基。此等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生抗體之生殖系序列來識別。為使框架區序列返回其生殖系組態，可藉由例如定點誘變或PCR介導之誘變將體細胞突變「反突變」至生殖系序列。
此外，亦可於說明性抗體之Fc區內做出修改，通常以改變抗體之一或多種功能性質，諸如血清半衰期、補體固著、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。於一實例中，修改CH1之鉸鏈區使得該鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目改變，例如，增加或減少。此方法進一步述於美國專利案第5,677,425號中。改變CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基之數目以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或減少抗體之穩定性。於另一種情況下，使抗體之Fc鉸鏈區突變以減少抗體之生物半衰期。
此外，可根據此項技術中已知之常規實驗修飾本發明之抗體以改變其潛在糖基化位點或模式。於另一態樣中，本發明提供含有輕鏈或重鏈可變區中之至少一個突變之CTLA4抗體之衍生物，該至少一個突變改變可變區中之糖基化模式。此抗體衍生物可具有對結合抗原之增加之親和力及/或經修改之特異性。該等突變可將新穎糖基化位點添加於V區中，改變一或多個V區糖基化位點之位置或移除先已存在之V區糖基化位點。於一實施例中，本發明提供具有重鏈可變區中之天冬醯胺處之潛在N-連接之糖基化位點之CTLA4抗體的衍生物，其中一重鏈可變區中之潛在N-連接之糖基化位點經移除。於另一實施例中，本發明提供具有重鏈可變區中之天冬醯胺處之潛在N-連接之糖基化位點之CTLA4抗體的衍生物，其中兩個重鏈可變區中之潛在N-連接之糖基化位點經移除。改變抗體之糖基化模式之方法係此項技術中已知，諸如述於美國專利案第6,933,368號中之彼等，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體衍生物，其包括連接至另外分子實體之如本文中所述之CTLA4抗體或其抗原結合片段。另外分子實體之實例包括醫藥劑、肽或蛋白質、檢測劑或標籤、及抗體。
於一些實施例中，該抗體衍生物包括連接至醫藥劑之本發明之抗體。醫藥劑之實例包括細胞毒性劑或其他癌症治療劑，及放射性同位素。細胞毒性劑之特定實例包括紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素(cytochalasin) B、短桿菌肽(gramicidin) D、溴化乙錠(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙素(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基蒽醌二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素(actinomycin) D、1-去氫睾酮、糖皮質激素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包括例如抗代謝劑(例如，胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)及洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(例如，柔紅黴素(先前稱作道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如，更生黴素(dactinomycin) (先前稱作放線菌素)、博來黴素(bleomycin)、光神黴素及安麯黴素(anthramycin) (AMC))、及抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼及長春鹼)。可與抗體共軛用於診斷或治療使用之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘131 、銦111 、釔90 及鑥177 。用於將抗體連接至醫藥劑之方法係此項技術中已知，諸如使用各種連接子技術。連接子類型之實例包括腙、硫醚、酯、二硫醚及含肽連接子。用於將治療劑連接至抗體之連接子及方法之進一步討論參見例如Saito等人，Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215 (2003)；Trail等人，Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337 (2003)；Payne,Cancer Cell 3:207-212 (2003)；Allen,Nat. Rev. Cancer 2:750-763 (2002)；Pastan及Kreitman，Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 (2002)；Senter及Springer (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。
於一些實施例中，該抗體衍生物為CTLA4抗體多聚體，其為CTLA4抗體之多聚形式，諸如抗體二聚體、三聚體或單聚抗體之更高階寡聚體。抗體多聚體內之個別單體可係相同或不同。此外，多聚體內之個別抗體可具有相同或不同結合特異性。抗體之多聚化可通過抗體之天然聚集達成。例如，一些百分比之經純化抗體製劑(例如，經純化IgG4分子)自發形成含有抗體均二聚體及其他更高階抗體多聚體之蛋白質聚集體。或者，抗體均二聚體可通過此項技術中已知之化學鍵聯技術(諸如通過使用交聯劑)形成。適宜交聯劑包括具有由適宜間隔子分開之兩個不同反應性基團之異雙官能性(諸如間-馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯、4-(馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯酯、及S-乙醯基硫代-乙酸N-琥珀醯酯)或同雙官能性(諸如辛二酸二琥珀醯酯)之彼等。此等連接子係自例如Pierce Chemical Company, Rockford, IL市面上可購得。亦可通過此項技術中已知之重組DNA技術將抗體多聚化。
由本發明提供之其他抗體衍生物之實例包括單鏈抗體、雙抗體、域抗體、奈米抗體及單抗體。「單鏈抗體」 (scFv)由包含連接至VH 域之VL 域之單多肽鏈組成，其中VL 域及VH 域配對以形成單價分子。單鏈抗體可根據此項技術中已知之方法製備(參見例如，Bird等人，(1988) Science 242:423-426及Huston等人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。「雙抗體」由兩條鏈組成，各鏈包含連接至藉由短肽連接子連接之相同多肽鏈上之輕鏈可變區之重鏈可變區，其中相同鏈上之兩個區彼此不配對，但是與另一條鏈上之互補域形成雙特異性分子。製備雙抗體之方法係此項技術中已知(參見例如，Holliger P.等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448，及Poljak R. J.等人，(1994) Structure 2:1121-1123)。域抗體(dAb)為抗體之小功能結合單元，其對應於抗體之重鏈或輕鏈任一者之可變區。域抗體於細菌、酵母及哺乳動物細胞系統中良好表現。域抗體之進一步細節及其產生方法係此項技術中已知(參見例如，美國專利案第6,291,158號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,172,197號、第6,696,245號；歐洲專利案0368684及0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及WO03/002609)。奈米抗體源自抗體之重鏈。奈米抗體通常包含單個可變域及兩個恆定域(CH2及CH3)且保留原始抗體之抗原結合能力。奈米抗體可藉由此項技術中已知之方法製備(參見例如，美國專利案第6,765,087號、美國專利案第6,838,254號、WO 06/079372)。單抗體由IgG4抗體之一條輕鏈及一條重鏈組成。單抗體可藉由移除IgG4抗體之鉸鏈區來製備。單抗體之進一步細節及製備其之方法可見於WO2007/059782中。IV. 靶向 CTLA4 之可活化結合多肽
本發明亦部分關於結合至人類CTLA4之精度/背景依賴性可活化結合多肽(即，可活化抗體)，其包括包含本文中所述抗CTLA4抗體(例如，抗CTLA4抗體、抗CTLA4抗體結合片段及/或抗CTLA4抗體衍生物)中之任一者之可活化抗體、可活化抗CTLA4抗體之抗原結合片段、及/或可活化抗CTLA4抗體之衍生物。於一些實施例中，本文中所述之可活化抗CTLA4抗體可具有改善之安全特性。例如，本文中所述之抗CTLA4抗體可具有更好安全邊限，如由脾重量變化所評估。將脾大小隨著所投與藥物劑量之增加之變化用作基準以評估所用藥物候選之安全邊限。如圖48A至B中所示，本文中所述之可活化抗CTLA4抗體相對於親本抗體(無掩蔽部分之抗體)具有更好安全邊限。
於一些實施例中，本發明之可活化抗體包含：(a)掩蔽部分(MM)；(b)可裂解部分(CM)；及(c)靶結合部分(TBM)。於一些實施例中，該MM為本文中所述之掩蔽部分中之任一者。於一些實施例中，該CM為本文中所述之可裂解部分中之任一者。於一些實施例中，該TBM為本文中所述之靶結合部分中之任一者(例如，包含抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區(諸如本文中所述之抗CTLA4抗體中之任一者之VH及/或VL)之靶結合部分(TBM))。於一些實施例中，當該CM未經裂解時，該MM干預及/或抑制可活化抗體結合至其靶(例如，人類CTLA4或人類CD137)。於一些實施例中，當該CM經裂解時，該可活化抗體能結合至其靶(例如，人類CTLA4或人類CD137)。
於一些實施例中，該可活化抗體包含：(a)自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)之多肽，其中該MM為本文中所述之掩蔽部分中之任一者，該CM為本文中所述之可裂解部分中之任一者，且其中該TBM包含抗體輕鏈可變區(VL)；及(b)抗體重鏈可變區(VH)。
於一些實施例中，該可活化抗體包含：(a)自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)之多肽，其中該MM為本文中所述之掩蔽部分中之任一者，該CM為本文中所述之可裂解部分中之任一者，且其中該TBM包含抗體重鏈可變區(VH)；及(b)抗體輕鏈可變區(VL)。
於一些實施例中，該可活化抗體包含：自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及靶結合部分(TBM)之多肽，其中該MM為本文中所述之掩蔽部分中之任一者，該CM為本文中所述之可裂解部分中之任一者，且其中該TBM包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)。
術語「可活化結合多肽」、「ABP」或「可活化抗體」包含包含靶結合部分(TBM)、可裂解部分(CM)及掩蔽部分(MM)之多肽。於一些實施例中，該TBM包含結合至靶之胺基酸序列。於一些實施例中，該TBM包含抗體之抗原結合域(ABD)或其抗體片段(例如，本文中所述之抗體或抗原結合片段中之任一者)。於一些實施例中，該抗原結合域包含包含本文中所述之重鏈可變區HVR中之一者、兩者或三者之重鏈可變區，及包含本文中所述之輕鏈可變區HVR中之一者、兩者或三者之輕鏈可變區(例如，如表 A 中所示之重鏈可變區HVR序列中之一者、兩者或三者，及/或輕鏈可變區HVR序列中之一者、兩者或三者，包括如表 A 中所示之示例性抗體中之任一者之所有六個HVR)。於一些實施例中，該抗原結合域包含包含本文中所述之重鏈可變區序列中之任一者之重鏈可變區，及包含本文中所述之輕鏈可變區序列中之任一者之輕鏈可變區(例如，如表 B 中所示之重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列)。於一些實施例中，該TBM (例如，包含ABD)包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)，其中該VH及VL在MM不存在下形成結合至靶之結合域。於一些實施例中，該VH及VL例如於scFv中共價連接。於一些實施例中，該VH及VL不共價連接。於一些實施例中，該VH及VL形成Fab片段。於一些實施例中，該VH連接至抗體重鏈恆定區，及該VL連接至抗體輕鏈恆定區。
於一些實施例中，該可活化抗體包含自N端至C端包含掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VL之結構之多肽，且該可活化抗體另包含包含VH (例如，Fab片段)之第二多肽。於一些實施例中，該可活化抗體包含自N端至C端包含掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VL-VH (例如，scFv)之結構之多肽。於一些實施例中，該可活化抗體包含自N端至C端包含掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VH之結構之多肽，且該可活化抗體另包含包含VL (例如，Fab片段)之第二多肽。於一些實施例中，該可活化抗體包含自N端至C端包含掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VH-VL (例如，scFv)之結構之多肽。
該CM一般包含可裂解之胺基酸序列，例如，用作能形成可還原二硫鍵之酵素及/或半胱胺酸-半胱胺酸對之受質。因而，當術語「裂解」、「可裂解」、「經裂解」及類似者結合CM使用時，該等術語涵蓋例如藉由蛋白酶之酶促裂解，以及半胱胺酸-半胱胺酸對之間之二硫鍵經由可由暴露於還原劑產生之二硫鍵之還原之中斷。
該MM係指胺基酸序列，當可活化抗體之CM係完整時(例如，未藉由對應酵素裂解，及/或含有未經還原之半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵)，該MM干預或抑制TBM結合至其靶。於一些實施例中，該MM干預或抑制TBM結合至其靶如此有效使得TBM與其靶之結合極其低及/或在檢測限以下(例如，於ELISA或流動式細胞測量術檢定中不可檢測結合)。該CM之胺基酸序列可與該MM重疊或包含於該MM內。應注意，為了方便，本文中使用「ABP」或「可活化抗體」係指呈其未經裂解(或「初始」)狀態以及其經裂解狀態二者之ABP或可活化抗體。對一般技術者將顯而易見於一些實施例中，經裂解之ABP可缺少MM，由於CM例如藉由蛋白酶之裂解導致至少MM之釋放(例如，在MM不藉由共價鍵(例如，半胱胺酸殘基之間之二硫鍵)接合至ABP之情況下)。以下更詳細描述示例性ABP。
於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)干預、阻止、降低(能力)、防止、抑制靶結合部分結合至其靶，或與靶結合部分競爭結合至其靶(例如「非活性」可活化抗體)。於一些實施例中，僅當多肽尚未被活化(例如，藉由pH變化(增加或減少)活化，藉由溫度變化(增加或減少)活化，與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸後活化等)時，該掩蔽部分(MM)干預、阻止、降低、防止、抑制靶結合部分結合至其靶或與靶結合部分競爭結合至其靶。於一些實施例中，活化誘導裂解部分內之多肽之裂解。於一些實施例中，活化誘導多肽之構形變化(例如，掩蔽部分(MM)之置換)，其導致掩蔽部分不再防止可活化抗體結合至其靶。於一些實施例中，僅當可裂解部分(CM)尚未藉由於該可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶裂解時，該掩蔽部分(MM)干預、阻止、降低靶結合部分結合至其靶之能力、防止、抑制靶結合部分結合至其靶或與靶結合部分競爭結合至其靶。於一些實施例中，在活化之前該掩蔽部分(MM)具有至少約2.0 (例如，至少約2.0、至少約3.0、至少約4.0、至少約5.0、至少約6.0、至少約7.0、至少約8.0、至少約9.0、至少約10、至少約25、至少約50、至少約75、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、至少約500等)之掩蔽效率。於一些實施例中，量測掩蔽效率作為包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體結合其靶(在活化之前)之親和力相對於缺少掩蔽部分之多肽結合其靶之親和力的差異(例如，對包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)之靶抗原(諸如CTLA4)之親和力相對於缺少掩蔽部分(MM)之親本抗體之親和力的差異，或對包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)之靶抗原(諸如CTLA4)之親和力相對於對活化後可活化抗體之靶抗原之親和力的差異)。於一些實施例中，掩蔽效率藉由包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)之結合之EC50 除以親本抗體之EC50 量測(例如，藉由ELISA藉由量測EC50 ；參見例如實例8之方法)。於一些實施例中，量測掩蔽效率作為包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體在活化之前結合其靶之親和力相對於包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體於活化後結合其靶之親和力的差異(例如，在活化之前對可活化抗體之靶抗原(諸如CTLA4)之親和力相對於活化後可活化抗體之親和力的差異)。於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)結合至靶結合部分(TBM)，且防止可活化抗體結合至其靶(例如，「減能」可活化抗體)。於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)具有結合至靶結合部分(TBM)之解離常數，其高於靶結合部分(TBM)對其靶之解離常數。
於一些實施例中，於可活化抗體已經活化(例如，藉由於可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理活化，藉由pH變化(增加或減少)活化，藉由溫度變化(增加或減少)活化，與第二分子(諸如酵素或蛋白質配位體)接觸後活化等)後，該掩蔽部分(MM)不干預、阻止靶結合部分(TBM)結合至其靶、降低其結合之能力，不防止、抑制靶結合部分結合至其靶，或不與靶結合部分競爭結合至其靶。於一些實施例中，於可裂解部分(CM)已藉由於可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶裂解後，該掩蔽部分(MM)不干預、阻止靶結合部分(TBM)結合其靶、降低其結合之能力，不防止、抑制靶結合部分結合其靶，或不與靶結合部分競爭結合其靶。於一些實施例中，於活化後該掩蔽部分(MM)具有至多約1.75 (例如，至多約1.75、至多約1.5、至多約1.4、至多約1.3、至多約1.2、至多約1.1、至多約1.0、至多約0.9、至多約0.8、至多約0.7、至多約0.6、或至多約0.5等)之掩蔽效率(例如，可活化抗體於活化後相較於親本抗體之親和力之相對親和力)。
於一些實施例中，本發明之可活化抗體：含有包含固定位置處之一對半胱胺酸以確保可活化抗體具有受限構形之掩蔽部分(MM)，及/或含有少量或無化學上不穩定殘基(諸如甲硫胺酸或色胺酸)。有利地，固定位置處之一對半胱胺酸殘基之納入確保可活化抗體具有受限構形，該等構形傾向於展示增加之結合親和力及/或特異性。此外，本發明之可活化抗體包含具有很少至無製造過程之不利殘基(諸如甲硫胺酸或色胺酸)之掩蔽部分。
於一些實施例中，本發明之可活化抗體係背景依賴性(例如，於某些背景下(諸如於蛋白酶濃化腫瘤微環境中)經活化(僅能結合其靶))。於一些實施例中，本發明之可活化抗體提供超過更多傳統非可活化抗體之提高之安全性(例如，顯示降低之毒性，不誘導許多器官之重量之顯著改變，不改變肝臟組織病理學、血液學及/或血液生物化學等)。於一些實施例中，本發明之可活化抗體相較於更多傳統非可活化抗體具有改善之藥物動力學性質(例如，具有更長活體內半衰期)。抗 CTLA4 可活化抗體活性
於一些實施例中，本發明係關於當呈活化形式時(例如，可活化抗體於可裂解部分中裂解(例如，用一或多種蛋白酶)後具活性，但是在於可裂解部分中裂解(例如，用一或多種蛋白酶)之前減能)結合至人類CTLA4之可活化抗體。於一些實施例中，當以活性形式時可活化抗體具有下列功能性質中之至少一者(例如，至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者、至少七者、至少八者、或所有九者)：(a)以500 nM或更低(例如，約10 nM或更低)之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4；(b)具有對人類CTLA4之拮抗活性；(c)在多達100 nM之濃度下不結合至人類PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、B7-H3、CD95、CD120a、OX40、CD40、BTLA、VISTA、ICOS、及/或B7-H4；(d)與猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4交叉反應；(e)誘導ADCC效應(例如，對Treg)；(f)活化人類PBMC (例如，刺激IL-2及/或IFNγ之分泌)；(g)能抑制腫瘤細胞生長；(h)具有對癌症之治療效應；及(i)抑制人類CTLA4結合至人類CD80及/或人類CD86。本文中亦提供一或多種可活化抗體，其與靶向CTLA4之可活化抗體及/或本文中所述之抗CTLA4抗體中之一或多者交叉競爭結合至人類CTLA4。
於一些實施例中，當呈減能形式時，可活化抗體以約500 nM或更多之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約450 nM或更低、約400 nM或更低、約350 nM或更低、約300 nM或更低、約250 nM或更低、約200 nM或更低、約150 nM或更低、約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約0.1 nM或更低等)之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體以約350 nM或更低之KD 結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體以約100 nM或更低之KD 結合至人類CTLA4。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體以約50 nM或更低之KD 結合至人類CTLA4。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體以約10 nM或更低之KD 結合至人類CTLA4。量測可活化抗體之KD 之方法可使用此項技術中已知之任何方法進行，包括例如，藉由表面電漿子共振、ELISA、等溫滴定量熱法、過濾結合檢定、EMSA等。於一些實施例中，藉由ELISA量測KD (參見例如，以下實例)。
於一些實施例中，當呈減能形式時，可活化抗體不具有對人類CTLA4之拮抗活性。於一些實施例中，當以活性形式(例如，誘導ADCC效應(諸如對Treg)、活化PBMC (諸如藉由活化、誘導及/或刺激IL-2及/或IFNγ分泌)、阻斷人類CTLA4結合至人類CD80及/或人類CD86等)時，可活化抗體具有對人類CTLA4之拮抗活性。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體抑制人類CTLA4之一或多種活性(例如，當表現人類CTLA4之細胞(諸如人類細胞)藉由可活化抗體接觸時，抑制人類CTLA4之一或多種活性)。
於一些實施例中，當呈減能形式時，可活化抗體不與猴(例如，食蟹獼猴)、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4交叉反應。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體與猴(例如，食蟹獼猴)、小鼠、大鼠及/或狗CTLA4交叉反應。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體與猴CTLA4交叉反應。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體與小鼠CTLA4交叉反應。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體與大鼠CTLA4交叉反應。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體與狗CTLA4交叉反應。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體與以下交叉反應：猴及小鼠CTLA4；猴及大鼠CTLA4；猴及狗CTLA4；小鼠及大鼠CTLA4；小鼠及狗CTLA4；大鼠及狗CTLA4；猴、小鼠及大鼠CTLA4；猴、小鼠及狗CTLA4；猴、大鼠及狗CTLA4；小鼠、大鼠及狗CTLA4；或猴、小鼠、大鼠及狗CTLA4。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化結合多肽在約350 nM下(例如，在約1nM下、在約10nM下、在約25nM下、在約50nM下、在約75nM下、在約100nM下、在約150 nM下、在約200 nM下、在約250 nM下、在約300 nM下、在約350 nM下)係交叉反應性。量測交叉反應性之方法係此項技術中已知，包括(不限於)表面電漿子共振、ELISA、等位滴定量熱法、過濾結合檢定、EMSA等。
於一些實施例中，當呈減能形式時，可活化抗體不誘導ADCC效應(例如，對表現CTLA4之人類細胞，諸如Treg)。於一些實施例中，當呈減能形式時，可活化抗體相較於對照結合多肽(例如，親本抗體)具有降低之ADCC效應(例如，對表現CTLA4之人類細胞，諸如Treg)。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體誘導ADCC效應(例如對表現CTLA4之人類細胞諸如Treg)。量測ADCC效應之方法(例如，活體外方法)係此項技術中已知，包括(不限於)經由以下實例中所述之方法。於一些實施例中，當呈減能形式時，可活化抗體誘導ADCC效應相對於對照(例如，親本抗體)少於約10% (例如，誘導ADCC少於約10%、少於約5%、少於約1%等)。於一些實施例中，當以活性形式時，可活化抗體誘導ADCC效應相對於對照(例如，同型對照)超過約10% (例如，誘導ADCC超過約10%、超過約15%、超過約20%、超過約25%、超過約30%、超過約35%、超過約40%等)。
於一些實施例中，可活化抗體能抑制腫瘤細胞生長及/或增殖。於一些實施例中，當與可活化抗體接觸時，相對於不與可活化抗體接觸之對應腫瘤細胞(或相對於與同型對照抗體接觸之對應腫瘤細胞)抑制腫瘤細胞生長及/或增殖至少約5% (例如，至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約99%)。於一些實施例中，當對受試者投與可活化抗體時，該等可活化抗體能減少受試者之腫瘤體積。於一些實施例中，相對於受試者之初始腫瘤體積(例如，在投與可活化抗體之前；相較於投與同型對照抗體之受試者之對應腫瘤)，可活化抗體能減少受試者之腫瘤體積至少約5% (例如，至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約99%)。監測腫瘤細胞生長/增殖、腫瘤體積及/或腫瘤抑制之方法係此項技術中已知，包括例如經由以下實例中所述之方法。
於一些實施例中，可活化抗體具有對癌症之治療效應。於一些實施例中，可活化抗體減少癌症之一或多種徵兆或症狀。於一些實施例中，當投與可活化抗體時，患有癌症之受試者進入部分或完全緩解。
於一些實施例中，本發明提供經單離可活化抗體，當以活性形式時，其與包含以下之抗體競爭或交叉競爭結合至人類CTLA4：a)包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之HVR-H2；及包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之HVR-H3；及/或b)包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之HVR-L2；及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之HVR-L3。於一些實施例中，本發明提供經單離可活化抗體，當以活性形式時，其與包含以下之抗體競爭或交叉競爭結合至人類CTLA4：a)包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之輕鏈可變區。可活化抗體與抗體競爭或交叉競爭結合之能力可使用此項技術中已知之標準結合檢定測定，諸如BIAcore分析、ELISA檢定或流動式細胞測量術。例如，吾人可允許抗體(例如，如上所述)在飽和條件下結合至人類CTLA4及然後量測測試可活化抗體(當以活性形式時)結合至CTLA4之能力。若測試可活化抗體能與抗體同時結合至CTLA4，則測試可活化抗體結合至與抗體不同的抗原決定基。然而，若測試可活化抗體不能同時結合至CTLA4，則測試可活化抗體結合至相同抗原決定基、重疊抗原決定基、或緊鄰藉由抗體結合之抗原決定基之抗原決定基。此實驗可使用各種方法(諸如ELISA、RIA、FACS或表面電漿子共振)進行。
於一些實施例中，可活化抗體(當呈減能形式時)不抑制CTLA4與其結合搭檔中之一或多者之間(例如，人類CTLA4與人類CD80、人類CTLA4與人類CD86)之結合。於一些實施例中，可活化抗體(當以活性形式時)抑制CTLA4與其結合搭檔中之一或多者之間(例如，人類CTLA4與人類CD80、人類CTLA4與人類CD86)之結合。於一些實施例中，可活化抗體抑制活體外CTLA4與其配位體之間之結合。於一些實施例中，可活化抗體具有約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約100 nM或更低、約50 nM或更低、約25 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低等)之半最大抑制濃度(IC50 )以抑制CTLA4結合至CD80及/或CD86。於一些實施例中，可活化抗體具有約100 nM或更低之半最大抑制濃度(IC50 )以抑制CTLA4結合至CD80及/或CD86。於一些實施例中，當在約100 nM或更高(例如，約100 nM或更高、約500 nM或更高、約1 µM或更高、約10 µM或更高等)之濃度下提供時，可活化抗體完全抑制人類CTLA4結合至CD80及/或CD86。如本文中所用，術語「完全抑制(complete inhibiting/completely inhibits)」係指可活化抗體減少第一蛋白與第二蛋白之間之結合至少約80% (例如，至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%等)的能力。量測多肽抑制第一蛋白(例如，人類CTLA4)與第二蛋白(例如，人類CD80或人類CD86)之結合之能力的方法係此項技術中已知，包括(不限於)經由BIAcore分析、ELISA檢定及流動式細胞測量術。掩蔽部分 (MM)
於一些實施例中，本發明係關於包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體。於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含如式(XVIII)：Xm CXn CZo (SEQ ID NO: 134)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。於一些實施例中，X非W、M、及/或C。於一些實施例中，式(XVIII)之Xm 中之各X獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸及/或式(XVIII)之Xn 中之各X獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。於一些實施例中，該MM包含藉由如式(XX)：(NNK)m TGY(NNK)n TGY(NHC)o (SEQ ID NO: 136)之多核苷酸序列編碼之多肽，其中各N獨立地為A、G、T、或C，其中各K獨立地為T或G，其中各Y獨立地為T或C，且其中各H獨立地為A、T、或C。
於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含如式(XIX): Zm CZn CZo (SEQ ID NO: 135)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，且各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。
於一些實施例中，m為2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、或9至10。於一些實施例中，m為6至8。於一些實施例中，m為3、4、5、6、7、8、9、或10。於一些實施例中，m為6。
於一些實施例中，n為3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、或9至10。於一些實施例中，n為6至8。於一些實施例中，n為3、4、5、6、7、8、9、或10。於一些實施例中，n為6。於一些實施例中，n為8。
於一些實施例中，o為1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、或9至10。於一些實施例中，o為1至2。於一些實施例中，o為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。於一些實施例中，o為2。
於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含如式(XXI)：Z6 CX6 CZ2 (SEQ ID NO: 137)之胺基酸序列，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。
於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含如式(XXII)：Z6 CX8 CZ2 (SEQ ID NO: 138)之胺基酸序列，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。
於一些實施例中，第一肽(FP)包含如式(XXIII)：(Z6 )C(Z6 )C(Z2 ) (SEQ ID NO: 139)之胺基酸序列，其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。
於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含如式(XXIV)：(Z6 )C(Z8 )C(Z2 ) (SEQ ID NO: 140)之胺基酸序列，其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。於一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)，該掩蔽部分包含選自由Xm CPDHPYPCXX (SEQ ID NO:181)、Xm CDAFYPYCXX (SEQ ID NO:182)、Xm CDSHYPYCXX (SEQ ID NO:183)、及Xm CVPYYYACXX (SEQ ID NO:184)組成之群之序列，其中m為2至10，且其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸。於一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)，該掩蔽部分包含序列EVGSYNFVADSCPDHPYPCSA (SEQ ID NO:189)、EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDS (SEQ ID NO:190)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCNS (SEQ ID NO:191)、EVGSYPNPSSDCVPYYYACAY (SEQ ID NO:192)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCQS (SEQ ID NO:193)、EVGSYPQPSSDCVPYYYACAY (SEQ ID NO:195)、或EVGSYPNPASDCVPYYYACAY (SEQ ID NO:196)。於一些實施例中，該MM包含EDCVPYYYACAY (SEQ ID NO:213)、EVGSSDCVPYYYACAY (SEQ ID NO:214)、EDCDAFYPYCDS (SEQ ID NO:215)、或EVGHSDCDAFYPYCDS (SEQ ID NO:216)之序列。
於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)包含選自NFVADSCPDHPYPCSA (SEQ ID NO: 141)、IVHHSDCDAFYPYCDS (SEQ ID NO: 142)、YSAYPACDSHYPYCNS (SEQ ID NO: 143)、PNPSSDCVPYYYACAY (SEQ ID NO: 144)、YSAYPACDSHYPYCQS (SEQ ID NO: 145)、PQPSSDCVPYYYACAY (SEQ ID NO: 146)、及PNPASDCVPYYYACAY (SEQ ID NO: 147)之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文中所述之掩蔽部分(MM)中之任一者可另包含一或多個另外胺基酸序列(例如，一或多個多肽標籤)。適宜另外胺基酸序列之實例可包括(不限於)純化標籤(諸如his-標籤、flag-標籤、麥芽糖結合蛋白及谷胱甘肽-S-轉移酶標籤)、檢測標籤(諸如可光度學檢測之標籤(例如，紅色或綠色螢光蛋白等))、具有可檢測之酵素活性之標籤(例如，鹼性磷酸酶等)、含有分泌序列、前導序列及/或穩定序列之標籤、蛋白酶裂解位點(例如，弗林蛋白酶(furin)裂解位點、TEV裂解位點、凝血酶裂解位點)及類似者。於一些實施例中，一或多個另外胺基酸序列係在掩蔽部分(MM)之N端。於一些實施例中，另外胺基酸序列包含序列EVGSY (SEQ ID NO: 148)或由該序列組成。
於一些實施例中，在活化之前(例如，在用於可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理之前，在經歷pH (局部)變化(增加或減少)之前，在溫度變化(增加或減少)之前，在與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸之前等)，該掩蔽部分結合至靶結合部分(TBM)且抑制可活化抗體結合至其靶，但是於活化後(例如，於用於可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理後，於經歷pH (局部)變化(增加或減少)後，於溫度變化(增加或減少)後，於與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸後等)不結合至TBM及/或抑制可活化抗體結合至其靶。於一些實施例中，當CM未經裂解時，該掩蔽部分(MM)抑制可活化抗體結合至其靶，但是當CM經裂解時，不抑制可活化抗體結合至其靶。於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)具有結合至TBM之解離常數，其大於可活化抗體對其靶之解離常數(當以活性形式時) (例如，至少大約1.5倍、至少大約2倍、至少大約2.5倍、至少大約3倍、至少大約3.5倍、至少大約4倍、至少大約4.5倍、至少大約5倍、至少大約10倍、至少大約100倍、至少大約500倍等)。可裂解部分 (CM)
於一些實施例中，本發明係關於包含可裂解部分(CM)之可活化抗體。於一些實施例中，該可裂解部分(CM)藉由以下裂解及/或破壞：用可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理，藉由pH變化(增加或減少)、藉由溫度變化(增加或減少)、及/或藉由與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸等。
於一些實施例中，該可裂解部分(CM)包含至少第一裂解位點(CS1 ) (例如，第一蛋白酶裂解位點)。於一些實施例中，該第一裂解位點為第一蛋白酶裂解位點。可使用藉由此項技術中已知之任何蛋白酶(例如，已知與包含CM之可活化抗體之靶共定位之蛋白酶)識別及/或裂解之任何適宜蛋白酶裂解位點，包括例如，藉由以下識別及/或裂解之蛋白酶裂解位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)、基質金屬蛋白酶(例如，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、及/或MMP-27)、菸草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、PSA、PSMA、ADAMS/ADAMTS (例如，ADAM 8、ADAM 9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、及/或ADAMTS5)、卡斯蛋白酶(例如，卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、及/或卡斯蛋白酶-14)、天冬胺酸蛋白酶(例如，RACE及/或腎素(Renin))；天冬胺酸組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶D及/或組織蛋白酶E)、半胱胺酸組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、及/或組織蛋白酶X/Z/P)、半胱胺酸蛋白酶(例如，Cruzipain、Legumain及/或Otubain-2)、KLK (例如，KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、及/或KLK14)、金屬蛋白酶(例如，Meprin、奈溶酶(Neprilysin)、PSMA、及/或BMP-1)、絲胺酸蛋白酶(例如，經活化之蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、胃促胰酶(Chymase)、及/或凝血因子蛋白酶(諸如FVIIa、FIXa、Fxa、FXIa、FXIIa))、彈性蛋白酶、粒酶B、胍基苯甲酸酶(guanidino-benzoatase)、HtrA1、人類嗜中性白血球彈性蛋白酶、乳鐵蛋白(lactoferrin)、marapsin、NS3/4A、PACE4、tPA、類胰蛋白酶(tryptase)、II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP) (例如，DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶(Matriptase)-2、MT-SP1/間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3及/或TMPRSS4)等。於一些實施例中，第一蛋白酶裂解位點為選自以下之蛋白酶之裂解位點：uPA、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、TEV蛋白酶、胞漿素、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14、及TACE。於一些實施例中，第一蛋白酶裂解位點為選自uPA、MMP-2、MMP-9、及/或TEV蛋白酶之蛋白酶之裂解位點。於一些實施例中，蛋白酶裂解包含選自SGRSA (SEQ ID NO: 149)、PLGLAG (SEQ ID NO: 150)及ENLYFQG (SEQ ID NO: 151)之胺基酸序列。
於一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，該可裂解部分包含如式(XXV)：EVGSY(Z6 )C(Z6 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 152)之胺基酸序列，其中各Z獨立地為選自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P之胺基酸。
於一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，該可裂解部分包含如式(XXVI)：EVGSY(Z6 )C(X6 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 153)之胺基酸序列，其中各X獨立地為選自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。
於一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，該可裂解部分包含如式(XXVII)：EVGSY(Z6 )C(Z8 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 154)之胺基酸序列，其中各Z獨立地為選自D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P之胺基酸。
於一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，該可裂解部分包含如式(XXVIII)：EVGSY(Z6 )C(X8 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 155)之胺基酸序列，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。
於一些實施例中，該可裂解部分(CM)另包含第一連接子(L1 )。於一些實施例中，該第一連接子(L1 )為第一裂解位點(CS1 ) (例如，第一蛋白酶裂解位點)之C端。於一些實施例中，該可裂解部分(CM)自N端至C端包含(CS1 )-L1 之結構。
可使用此項技術中已知之任何適宜連接子(例如，可撓性連接子)，包括例如：甘胺酸聚合物(G)n，其中n為至少1 (例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)之整數；甘胺酸-絲胺酸聚合物(GS)n，其中n為至少1 (例如，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)之整數，諸如GGGGS (SEQ ID NO: 156)、SGGS (SEQ ID NO: 157)、GGSG (SEQ ID NO: 158)、GGSGG (SEQ ID NO: 159)、GSGSG (SEQ ID NO: 160)、GSGGG (SEQ ID NO: 161)、GGGSG (SEQ ID NO: 162)、及/或GSSSG (SEQ ID NO: 163))；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及類似者。連接子序列可為任何長度，諸如約1個胺基酸(例如，甘胺酸或絲胺酸)至約20個胺基酸(例如，20個胺基酸甘胺酸聚合物或甘胺酸-絲胺酸聚合物)、約1個胺基酸至約15個胺基酸、約3個胺基酸至約12個胺基酸、約4個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、約6個胺基酸至約8個胺基酸等。於一些實施例中，連接子為長度約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸中之任一者。於一些實施例中，連接子包含選自SEQ ID NO: 159至163之胺基酸序列。於一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 156或157之胺基酸序列。
於一些實施例中，該可裂解部分(CM)另包含至少第二裂解位點(例如，至少第二、至少第三、至少第四、至少第五等)。於一些實施例中，該可裂解部分(CM)另包含第二裂解位點(CS2 )。於一些實施例中，該第二裂解位點為第二蛋白酶裂解位點。該第二蛋白酶裂解位點可為藉由上述蛋白酶中之任一者識別及/或裂解之任何適宜蛋白酶裂解位點。於一些實施例中，該第一(CS1 )及第二(CS2 )裂解位點為藉由相同蛋白酶識別及/或裂解之蛋白酶裂解位點。於一些實施例中，該第一(CS1 )及第二(CS2 )裂解位點為藉由不同蛋白酶識別及/或裂解之蛋白酶裂解位點(例如，該第一蛋白酶裂解位點藉由uPA識別及/或裂解，及該第二蛋白酶裂解位點藉由MMP-2識別及/或裂解；該第一蛋白酶裂解位點藉由uPA識別及/或裂解，及該第二蛋白酶裂解位點藉由MMP-9識別及/或裂解；該第一蛋白酶裂解位點藉由uPA識別及/或裂解，及該第二蛋白酶裂解位點藉由TEV蛋白酶識別及/或裂解等)。於一些實施例中，該至少第二裂解位點(CS2 )為第一連接子(L1 )之C端。於一些實施例中，該可裂解部分(CM)自N端至C端包含(CS1 )-L1 -(CS2 )之結構。
於一些實施例中，該可裂解部分(CM)另包含至少第二連接子(例如，至少第二、至少第三、至少第四、至少第五等)。於一些實施例中，該可裂解部分(CM)另包含第二連接子(L2 )。該第二連接子(L2 )可為上述任何適宜連接子。於一些實施例中，該第二連接子包含選自SEQ ID NO: 156至163之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一(L1 )及第二(L2 )連接子係相同(例如，兩種連接子包含SEQ ID NO: 156或157之序列)。於一些實施例中，該第一(L1 )及第二(L2 )連接子係不同(例如，該第一連接子(L1 )包含SEQ ID NO: 156之胺基酸序列，及該第二連接子(L2 )包含SEQ ID NO: 157之胺基酸序列等)。於一些實施例中，該至少第二連接子(L2 )為第二裂解位點(CS2 )之C端。於一些實施例中，該可裂解部分(CM)自N端至C端包含(CS1 )-L1 -(CS2 )-L2 之結構。示例性 MM-CM 序列
於一些實施例中，本發明之可活化抗體自N端至C端包含(FP)-(PCS1 )-L1 -(PCS2 )-L2 之結構。於一些實施例中，可活化抗體包含如式(XXIX)，EVGSYX1 X2 X3 X4 X5 X6 CX7 X8 X9 X10 X11 X12 CX13 X14 SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 164)之胺基酸序列，其中X1為A、D、I、N、P、或Y，X2為A、F、N、S、或V，X3為A、H、L、P、S、V、或Y，X4為A、H、S、或Y，X5為A、D、P、S、V、或Y，X6為A、D、L、S、或Y，X7為D、P、或V，X8為A、D、H、P、S、或T，X9為A、D、F、H、P、或Y，X10為L、P、或Y，X11為F、P、或Y，X12為A、P、S、或Y，X13為A、D、N、S、T、或Y，且X14為A、S、或Y。於一些實施例中，本發明之可活化抗體包含以下之胺基酸序列：EVGSYDALHYACPPDYYACYYSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 165)、EVGSYNSYHAYCPHPLYPCTASGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 166)、EVGSYASSAVLCVTAYFSCNSSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 167)、EVGSYNFVADSCPDHPYPCSASGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 168)、EVGSYNFVADSCPDHPYPCSASGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 169)、EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 170)、EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 171)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 172)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 173)、EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 174)、EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO: 175)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCQSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 176)、EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSAGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 177)、EVGSYPQPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 178)、及/或EVGSYPNPASDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 179)。於一些實施例中，本發明之多肽自N端至C端包含(FP)-(PCS1 )-L1 -(PCS2 )-L2 -(TBM)之結構。
於一些實施例中，可活化抗體包含胺基酸序列SGRSAGGGGTENLYFQGSGGS (SEQ ID NO:220)、SGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO:221)、或SGRSAPLGLA (SEQ ID NO:222)。於一些實施例中，可活化抗體包含EV(Zn)C(X8 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO:217)、EDC(Z6 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO:218)、或EDC(Z6 )C(Z2 )PLGLA (SEQ ID NO:219)之序列，其中各X獨立地為選自由A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y組成之群之胺基酸，其中n為1至11且其中各Z獨立地為選自由D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P組成之群之胺基酸。靶結合部分 (TBM)
於一些實施例中，本發明係關於包含靶結合部分(TBM)之可活化抗體。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含抗體輕鏈可變區。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含抗體重鏈可變區。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區。
於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含全長抗體輕鏈及/或全長抗體重鏈。抗體輕鏈可為κ或λ輕鏈。抗體重鏈可為任何類別，諸如IgG、IgM、IgE、IgA、或IgD。於一些實施例中，抗體重鏈為IgG類別，諸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4子類別。可使用此項技術中已知方法將本文中所述之抗體重鏈自一種類別或子類別轉變成另一種類別或子類別。
本文中所述之靶結合部分(TBM)中之任一者或多者可併入：本文中所述之HVR序列中之任一者(例如，如上表 A 中所示之重鏈可變區HVR序列中之一者、兩者或三者，及/或輕鏈可變區HVR序列中之一者、兩者或三者)；本文中所述之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列中之任一者(例如，如上表 B 中所示之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列)；及/或本文中所述之抗體中之任一者。
於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含本文中所述之抗CTLA4抗體中之一或多者之序列，該等抗體包括關於HVR、可變區(VL、VH)及/或輕鏈及重鏈(例如，IgG1、IgG2、IgG4)之特異性胺基酸序列所述之抗體。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含包含以下之抗體輕鏈可變區：包含胺基酸序列RASQSVRGRFLA (SEQ ID NO: 58)之HVR-L1，包含胺基酸序列DASNRATGI (SEQ ID NO: 66)之HVR-L2，及/或包含胺基酸序列YCQQSSSWPPT (SEQ ID NO: 75)之HVR-L3。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO:100之序列至少90% (例如，95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之序列之抗體輕鏈可變區。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含包含以下之抗體重鏈可變區：包含胺基酸序列YSISSGYHWSWI (SEQ ID NO: 23)之HVR-H1，包含胺基酸序列LARIDWDDDKYYSTSLKSRL (SEQ ID NO: 35)之HVR-H2，及/或包含胺基酸序列ARSYVYFDY (SEQ ID NO: 45)之HVR-H3。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO:87之序列至少90% (例如，95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之序列之抗體重鏈可變區。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含：a)抗體輕鏈可變區，其包含包含胺基酸序列RASQSVRGRFLA (SEQ ID NO: 58)之HVR-L1，包含胺基酸序列DASNRATGI (SEQ ID NO: 66)之HVR-L2，及/或包含胺基酸序列YCQQSSSWPPT (SEQ ID NO: 75)之HVR-L3；及b)抗體重鏈可變區，其包含包含胺基酸序列YSISSGYHWSWI (SEQ ID NO: 23)之HVR-H1，包含胺基酸序列LARIDWDDDKYYSTSLKSRL (SEQ ID NO: 35)之HVR-H2，及/或包含胺基酸序列ARSYVYFDY (SEQ ID NO: 45)之HVR-H3。於一些實施例中，該靶結合部分(TBM)包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之抗體輕鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之抗體重鏈可變區。可活化結合多肽性質
於一些實施例中，本發明之可活化結合多肽(即，可活化抗體)包含：(a)掩蔽部分(MM)，(b)可裂解部分，及(c)靶結合部分。於一些實施例中，該掩蔽部分(MM)結合至可活化抗體之靶結合部分(TBM)及相較於缺少掩蔽部分之對應結合多肽結合至CTLA4 (例如，人類CTLA4)及/或相較於親本抗體結合至CTLA4 (例如，人類CTLA4)減少或抑制可活化結合部分結合至CTLA4 (例如，人類CTLA4)。
於一些實施例中，「可活化」結合多肽係指結合多肽，當於抑制、掩蔽及/或未裂解狀態時，其展示結合至CTLA4之第一水平，及於未抑制、未掩蔽及/或裂解狀態時其展示結合至CTLA4之第二水平，其中CTLA4結合之第二水平高於CTLA4結合之第一水平。於一些實施例中，於可裂解部分內(例如，藉由一或多種蛋白酶)裂解後藉由可活化結合多肽獲取CTLA4係更高。
於一些實施例中，當多肽與CTLA4 (例如人類CTLA4)之結合親和力於可活化抗體活化後相較於在可活化抗體活化之前(例如，於藉由於可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理活化後，於藉由pH變化(增加或減少)活化後，於藉由溫度變化(增加或減少)活化後，於藉由與第二分子(諸如小分子)接觸活化後等)增加至少約2倍(例如，至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍、或至少約1000倍、或更多)時，一般認為本發明之可活化抗體為「可活化」結合多肽。於一些實施例中，若於「活化」後可活化抗體之EC50 減少至少約2倍(例如，至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍、或至少約1000倍、或更多) (例如，如藉由ELISA或FACS檢定所量測；參見以下實例)，則一般認為本發明之可活化抗體係「可活化」。於一些實施例中，若於用於可裂解部分(CM)內裂解之蛋白酶處理後多肽之EC50 減少至少約2倍(例如，如藉由ELISA或FACS檢定所量測；參見以下實例)，則一般認為本發明之可活化抗體係「可活化」。
於一些實施例中，當掩蔽部分(MM)結合至可活化抗體之靶結合部分(TBM)時，該可活化抗體對CTLA4之KD 係高於當掩蔽部分(MM)不結合至靶結合部分(TBM)時(例如於可活化抗體「活化」後(諸如於蛋白酶處理以於可裂解部分(CM)內裂解後))及/或高於親本抗體對CTLA4之KD 約2 (例如，約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750、或約1000或更多)倍。量測親和力之方法係此項技術中已知，包括例如藉由以下實例中所述之方法。
於一些實施例中，當掩蔽部分結合至可活化抗體之靶結合部分時，該可活化抗體對CTLA4之KD 相對於當掩蔽部分不結合至靶結合部分時(例如，於可活化抗體「活化」後(諸如於蛋白酶處理以於可裂解部分(CM)內裂解後))及/或相對於親本抗體對CTLA4之KD 減少至少約25% (例如，至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%)。量測親和力之方法係此項技術中已知，包括例如，藉由以下實例中所述之方法。
於一些實施例中，該掩蔽部分空間阻礙可活化抗體結合至CTLA4及/或變構阻礙可活化抗體結合至CTLA4。於一些實施例中，該掩蔽部分不包含可活化抗體及/或親本抗體之天然結合搭檔之胺基酸序列。
於一些實施例中，掩蔽部分對靶結合部分之解離常數高於可活化抗體對CTLA4之解離常數(當活化時)。於一些實施例中，掩蔽部分對靶結合部分之解離常數係高於可活化抗體對CTLA4之解離常數(當活化時)約2 (例如，約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750、或約1000或更多)倍。於一些實施例中，掩蔽部分對靶結合部分之解離常數約等於可活化抗體對CTLA4之解離常數(當活化時)。
本文中所述之可活化抗體可經進一步修飾。於一些實施例中，該等可活化抗體連接至另外分子實體。另外分子實體之實例包括醫藥劑、肽或蛋白質、檢測劑或標籤、及抗體。
於一些實施例中，本發明之可活化抗體連接至醫藥劑。醫藥劑之實例包括細胞毒性劑或其他癌症治療劑及放射性同位素。細胞毒性劑之特定實例包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、及嘌呤黴素及其類似物或同系物。治療劑亦包括例如抗代謝劑(例如，胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷基化劑(例如，二氯甲基二乙胺、噻替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、蒽環黴素(例如，柔紅黴素(先前稱作道諾黴素)及多柔比星)、抗生素(例如，更生黴素(先前稱作放線菌素)、博來黴素、光神黴素及安麯黴素(AMC))、及抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼及長春鹼)。可與抗體共軛用於診斷或治療使用之放射性同位素之實例包括(但不限於) 碘131 、銦111 、釔90 及鑥177 。用於將多肽連接至醫藥劑之方法係此項技術中已知，諸如使用各種連接子技術。連接子類型之實例包括腙、硫醚、酯、二硫醚及含肽連接子。將治療劑連接至抗體之連接子及方法之進一步討論參見例如，Saito等人，Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215 (2003)；Trail等人，Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337 (2003)；Payne,Cancer Cell 3:207-212 (2003)；Allen,Nat. Rev. Cancer 2:750-763 (2002)；Pastan及Kreitman,Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 (2002)；Senter及Springer (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。V. 產生 CTLA4 抗體及 / 或精度 / 背景依賴性可活化抗體之核酸、載體、宿主細胞及重組方法
本發明之另一態樣提供經單離核酸分子，其包含編碼本文中所提供之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之胺基酸序列之核苷酸序列。藉由核苷酸序列編碼之胺基酸序列可為抗體之任何部分(諸如HVR、包含1、2或3個HVR之序列、重鏈可變區、輕鏈可變區)，或可為全長重鏈或全長輕鏈。本發明之核酸可為例如DNA或RNA，且可含或可不含內含子序列。通常，核酸為cDNA分子。
於一些實施例中，本發明提供經單離核酸分子，其包含編碼選自由以下組成之群之胺基酸序列之核苷酸序列或由該核苷酸序列組成：(1)本文中所述之說明性抗體之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及/或HVR-L3之胺基酸序列；(2)本文中所述之說明性抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區；或(3)說明性抗體之全長重鏈或全長輕鏈。
於一些實施例中，核酸分子包含編碼如SEQ ID NO: 18至107中之任一者中所述之胺基酸序列之核苷酸序列或由該核苷酸序列組成。
於一些實施例中，核酸分子包含下表 C 中所述之核苷酸序列或由該核苷酸序列組成。表 C ：抗 CTLA4 可變區多核苷酸序列
抗體名稱： VH ： VL ：
TY21585 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTCTCCGACTACGCTATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGACTCGAGTGGATCGGTATCATCTCCCCATCTAGCGGTTCTACTAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGAGACATTCACTCTGGTTCTTCTGGTTACTACTACGGTTTCGACGTCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 108) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTGAGTCTGTGGACTTCTTCGGTATCTCTTTCCTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCGTGCCACCGGTATCCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCACTACACCTCTTCGCCACCAGTGTACACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 121)
TY21586 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATACTCTATCACCTCTGGTTACTACTGGGCCTGGATTCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGGTGTCTTCCATCTCTGGTTCCGGTTCTACTACCTACTACGCCGACTCTGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGAGATGGTTTCGGCTACTTCGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 109) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCTCTGCCTCTTCTAGCGTGAGCTACGTGTACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTTCTCTGGAATCTGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCGTGCAGGGTCTTCAGACCCCTTGGACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 122)
TY21587 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTCTCCGACTACGGTATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTGAAATCTACCACTCTGGTTCTACCTACTACTCTCCATCTCTGAAGTCTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGAGACGTTGCCCCTGGTTCTTCTGGTTACTACGACGGTTTCGACTTCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 110) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGGGTATTGGCTCTTCCCTGGCTTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCGTGCCACCGGTATCCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGTACGACCAATGGCCACCTTGGACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 123)
TY21588 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATACTCTATCTCCTCTGGTTACCACTGGGACTGGATTCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGGTGTCTGGTATCTCTGGTTACGGTGGTTCTACCTACTACGCCGACTCTGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGACACAGTTATTACGGTTCCGGTAATTTCGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 111) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTGAGTCTGTGGACTTCTTCGGTAAGTCTTTCCTGCACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCTGGAAACCGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACTCCTGGCCTCCGACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 124)
TY21589 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTCTCCGACTACTGGATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTTGGATCTCCCCATCTGGCGGTGGTACTAAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGAGGGGCTTACGAATTTGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 112) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTGTGAGCAGCCGTTTCCTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCGTGCCACCGGTATCCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACCCCACCCCTCTTACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 125)
TY21580 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATACTCTATCTCCTCTGGTTACCACTGGAGCTGGATTCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGCTGGCCCGGATCGACTGGGACGATGACAAGTACTACTCTACCTCTCTGAAGTCTCGTCTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGATCGTACGTGTACTTCGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 113) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTGTGCGCGGCCGTTTCCTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCGTGCCACCGGTATCCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGTCCTCCTCCTGGCCTCCGACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 126)
TY21591 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCTCTCTGTCTACCGGCGGTGTGGCTGTGAGCTGGATTCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTGAAATCTACCACTCTGGTTCTACCTACTACTCTCCATCTCTGAAGTCTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCCGTCGTATCGCCACCGCTACTTACTTCGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 114) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGACCGTGTTCTCTCGTTACCTGGCTTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCGTGCCACCGGTATCCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGTCCTACTACTGGCCACCTTGGACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 127)
TY21686 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCTCTCTGTCTACCGGCGGTGTGGCTGTGGGCTGGATTCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGGTGTCTGCTATCTCTGGTTACGGTTCTACTACCTACTACGCCGACTCTGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGATTGCCATACTCCGCCTACGCTTTCGACTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 115) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGGGTGTGTCTTCTTACCTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGCCGCCTCTACCTTGCAGTCTGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTACTACTGCCAGCACCACTACGGCACCCCACTGACCTTCGGTCAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 128)
TY21687 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTCTCCGGCTACGCTATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTATCATCTCCCCATCTGGCGGTGGTACTAAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGACACCCATTCGCCTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 116) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTGTGGACTTCTACGGTATCTCTTTCCTGGACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCGTGCCACCGGTATCCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGTACGTCTCTTCGCCACCAGAGTACACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 129)
TY21689 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATACACCTTCTCCGGCTACGGTATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTGAAATCTACCACTCTGGTTCTACCTACTACTCTCCATCTCTGAAGTCTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGAAGAATTGACGCCTTCGACATCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG( SEQ ID NO: 117) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTGTGGACTTCGACGGTTTCTCTTTCCTGCACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTTCTCTGGAATCTGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCCAGCAGCGTGACTCCTGGCCTTACACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 130)
TY21680 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATACACCTTCTCCGGCTACGCTATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTATCATCTCCCCATCTGGCGGTGGTACTAAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGACTCTATGACGTTGCCTACTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 118) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTGTGGACTTCCACGGTAAGTCTTTCCTGCACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTTCTCTGGAATCTGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCGAGCAATCCCTGGAAGTCCCATTCACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 131)
TY21691 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTCTCCGACTACGCTATTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTATCATCTCCCCATCTGGCGGTTCTACTAAGTACGCCCAGAAGTTCCAGGGTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCCAGACTCGGTTACGGGTACTTCGACGTCTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 119) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTGTGGACTTCTACGGTATCTCTTTCCTGCACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTTCTCTGGAATCTGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGCGTGCAGGCTCTTCAGTTGCCTCTTACCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 132)
TY21692 GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCCGGATACTCTATCACCTCTGGTCACTACTGGAGCTGGATTCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGATCGGTGACATCTCCCACTCTGGTTCTACCTACTACTCTCAATCTCTGAAGTCTCGTGTGACTATAAGTCGCGACAATTCGAAAAACACACTGTACCTACAACTGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGCGCGCGTGGTAGTAGGACCGGCTACTTCGACTATTGGGGTCAAGGAACACTAGTCACCGTCTCCTCG (SEQ ID NO: 120) GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCGAGTTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCTCTCAGTCTATCTCTTCTTACCTGAACTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATCTACGACGCCTCTAACCTGGAAACCGGTGTGCCATCTCGCTTCTCTGGATCCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTACTACTGCCAGCACCACTACGGCACCCCACTGACCTTCGGTCAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA (SEQ ID NO: 133)
可使用任何適宜分子生物技術獲得本發明之核酸。針對藉由雜交瘤表現之抗體，編碼藉由雜交瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈之cDNA可藉由PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。針對獲自免疫球蛋白基因庫之抗體(例如，使用噬菌體展示技術)，編碼該抗體之核酸可自該庫恢復。
可藉由將編碼VH 之DNA以可操作方式連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子將編碼VH 區之經單離DNA轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知(參見例如，Kabat等人(1991) NIH公開案第91-3242號)及包含此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。針對Fab片段重鏈基因，可將編碼VH 之DNA以可操作方式連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL 之DNA以可操作方式連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子將編碼VL 區之經單離DNA轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知(參見例如，Kabat等人(1991) NIH公開案第91-3242號)及包含此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為創建scFv基因，將編碼VH -及VL -之DNA片段以可操作方式連接至編碼可撓性連接子(例如，編碼胺基酸序列(Gly4 -Ser)3 )之另一片段，使得該等VH 及VL 序列可表現為鄰接單鏈蛋白，其中該等VL 及VH 區藉由可撓性連接子接合(參見例如，Bird等人，Science 242:423-426 (1988)；Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；及McCafferty等人，Nature 348:552-554 (1990))。
本發明另提供包含本文中所述之核酸分子之載體。於一些實施例中，該載體為表現載體或顯示載體(例如，病毒顯示載體、細菌顯示載體、酵母顯示載體、昆蟲顯示載體、哺乳動物顯示載體等)。核酸分子可編碼輕鏈或重鏈之部分(諸如CDR或HVR；輕鏈或重鏈可變區)、全長輕鏈或重鏈、包含重鏈或輕鏈之部分或全長之多肽、或抗體衍生物或抗原結合片段之胺基酸序列。於一些實施例中，該載體為可用於表現結合分子(諸如抗體或其抗原結合片段)之表現載體。於一些實施例中，本文中提供載體，其中第一載體包含編碼如本文中所述之重鏈可變區之多核苷酸序列，及第二載體包含編碼如本文中所述之輕鏈可變區之多核苷酸序列。於一些實施例中，單個載體包含編碼如本文中所述之重鏈可變區及如本文中所述之輕鏈可變區之多核苷酸。
為表現本發明之結合分子，將編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中使得DNA分子以可操作方式連接至轉錄及轉譯控制序列。於此上下文中，術語「以可操作方式連接」意指將抗體基因連接至載體使得該載體內之轉錄及轉譯控制序列提供其調節DNA分子之轉錄及轉譯所需功能。選擇與使用之表現宿主細胞相容之表現載體及表現控制序列。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入分開載體中，或可將兩種基因插入相同表現載體中。藉由任何適宜方法(例如，連接抗體基因片段及載體上之互補限制位點，或基於同源重組之DNA連接)將抗體基因插入表現載體中。可使用本文中所述之抗體之輕鏈及重鏈可變區以藉由將其插入已編碼所需同型及子類別之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中使得VH 片段以可操作方式連接至該載體內之CH 片段及VL 片段以可操作方式連接至該載體內之CL 片段來創造任何抗體同型及子類別之全長抗體基因。此外或或者，重組表現載體可編碼促進來自宿主細胞之抗體鏈之分泌的信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體使得信號肽於框架內連接至抗體鏈基因之胺基端。該信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。
除了抗體序列外，本發明之表現載體通常攜帶控制宿主細胞中之抗體序列之表現的調節序列。術語「調節序列」意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。此等調節序列述於例如Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可取決於如待轉形之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現水平等之此等因素。用於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列之實例包括指導哺乳動物細胞中高水平蛋白質表現之病毒元件，諸如源自巨細胞病毒(CMV)、猿腎病毒(Simian Virus) 40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要後期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒(polyoma)之啟動子及/或增強子。或者，可使用非病毒調節序列，諸如泛素(ubiquitin)啟動子或β-球蛋白啟動子。更進一步，調節元件由來自不同來源(諸如SR啟動子系統)之序列組成，該啟動子系統含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞白血病病毒1型之長末端重複(Takebe, Y.等人(1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
除了抗體鏈基因及調節序列外，表現載體可攜帶另外序列，諸如調節載體於宿主細胞中之複製(例如，複製起源)之序列及可選擇標記基因。可選擇標記基因促進已引入載體之宿主細胞之選擇(參見例如，美國專利案第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，所有由Axel等人)。例如，已引入載體之宿主細胞上之可選擇標記基因通常賦予對藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤)之耐性。可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於含有胺甲喋呤之dhfr-宿主細胞選擇/擴增)及neo基因(用於G418選擇)。
用於表現輕鏈及重鏈，藉由任何適宜技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中通常所用之廣泛各種技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染及類似者。雖然可於原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗體，真核細胞及通常哺乳動物宿主細胞中之抗體之表現係最典型。
本發明進一步提供含有本發明提供之核酸分子之宿主細胞。宿主細胞實質上可為任何細胞，針對該細胞表現載體係可得。其可為例如高等真核宿主細胞(諸如哺乳動物細胞)、低等真核宿主細胞(諸如酵母細胞)，且可為原核細胞(諸如細菌細胞)。將重組核酸引入宿主細胞中之方法係此項技術中已知，包括例如，藉由磷酸鈣轉染、DEAE、葡聚糖介導之轉染、電穿孔或噬菌體感染。
用於轉形之適宜原核宿主包括大腸桿菌、 枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis )、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium )及假單胞菌(Pseudomonas )、 鏈黴素(Streptomyces )及葡萄球菌(Staphylococcus )屬內之各種物種。
用於轉形之適宜真核宿主包括酵母、昆蟲(例如，S2細胞)及哺乳動物細胞。用於表現本發明之結合分子之哺乳動物宿主細胞包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，述於Urlaub及Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)；Sharp,J. Mol. Biol. 159:601-621 (1982)中)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、HEK293F細胞、HEK293T細胞及Sp2細胞。特定言之，併與NS0骨髓瘤或CHO細胞使用，另一表現系統為於WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所揭示之GS (麩胺醯胺合成酶)基因表現系統。於一些實施例中，於CHO細胞中產生本發明之抗體。於一些實施例中，本發明之抗體經修飾，且不包含C端離胺酸殘基(例如，本文中所述之抗體重鏈之C端離胺酸殘基經移除(諸如在抗體產生之前或在抗體產生期間))。當將編碼抗體基因之表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體藉由培養宿主細胞持續足以允許抗體於宿主細胞中表現或將抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中之時間段產生。可使用此項技術中已知之任何適宜蛋白質純化方法(例如，蛋白A層析法及/或離子交換層析法)將抗體自培養基回收。VI. 組合物
於其他態樣中，本發明提供含有本發明提供之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之組合物。於一態樣中，該組合物為包含結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。該等組合物可藉由此項技術中已知之習知方法製備。
於一些實施例中，本發明提供包含本發明提供之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及醫藥上可接受之載劑之組合物，其中該結合分子包含包含本文中所揭示之HVR胺基酸序列之可變域，且其中與存在於該組合物中之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之總量相比，該組合物包含不超過約11%、10%、8%、5%、3%、或2%之在該胺基酸序列之天冬醯胺處糖基化的該結合分子(例如，抗體或可活化抗體)。於另一實施例中，與存在於該組合物中之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之總量相比，該組合物包含至少約2%之該在該胺基酸序列之天冬醯胺處糖基化的結合分子(例如，抗體或可活化抗體)。
術語「醫藥上可接受之載劑」係指適用於調配物中用於遞送結合分子之任何非活性物質。載劑可為抗黏劑、黏合劑、塗層、崩解劑、填料或稀釋劑、防腐劑(諸如抗氧化劑、抗細菌劑或抗真菌劑)、甜味劑、延遲吸收劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑及類似者。適宜醫藥上可接受之載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及類似者)、右旋糖、植物油(諸如橄欖油)、鹽水、緩衝劑、緩衝鹽水、及等滲劑(諸如糖、聚醇、山梨醇及氯化鈉)。
組合物可呈任何適宜形式，諸如液體、半固體及固體劑型。液體劑型之實例包括溶液(例如，可注射及可輸注溶液)、微乳液、脂質體、分散液或懸浮液。固體劑型之實例包括錠劑、丸劑、膠囊、微膠囊及粉末。適用於遞送結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之組合物之特定形式為用於注射或輸注之無菌液體(諸如溶液、懸浮液或分散液)。無菌溶液可藉由將所需量之抗體併入適宜載劑中，接著滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液藉由將結合分子(例如，抗體或可活化抗體)併入含有基本分散介質及其他載劑之無菌媒劑中來製備。於用於製備無菌液體之無菌粉末之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)以產生活性成分加上來自其先前經無菌過濾之溶液之任何另外所需成分之粉末。組合物之各種劑型可藉由此項技術中已知之習知技術製備。
包含於組合物中之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之相對量將取決於許多因素(諸如使用之特異性結合分子及載劑、劑型、及所需釋放及藥效學特性)變化。單一劑型中之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之量一般將為產生治療效應之量，但是亦可為更少量。一般而言，此量將為相對於劑型之總重量約0.01%至約99%、約0.1%至約70%、或約1%至約30%之範圍。
除了結合分子(例如，抗體或可活化抗體)外，一或多種另外治療劑可包含於組合物中。另外治療劑之實例述於下文中。待包含於組合物中之另外治療劑之適宜量可由熟習此項技術者容易選擇，且將取決於許多因素(諸如使用之特定劑及載劑、劑型、及所需釋放及藥效動力學特性)變化。包含於單一劑型中之另外治療劑之量一般將為產生治療效應之劑之量，但是亦可為更少量。
本文中所述之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及/或組合物(例如，醫藥組合物)中之任一者可用於製備藥劑(例如，用於治療有需要受試者之癌症或延遲該癌症進展之藥劑)。VII. 結合分子及醫藥組合物之用途
本發明提供之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及醫藥組合物可用於治療、診斷或其他目的，諸如調節免疫反應、治療癌症、增強其他癌症療法之功效、增強疫苗功效、或治療自體免疫性疾病。因此，於其他態樣中，本發明提供使用結合分子(例如，抗體或可活化抗體)或醫藥組合物之方法。於一態樣中，本發明提供一種治療哺乳動物之病症之方法，其包括對需要治療之哺乳動物投與有效量之本發明提供之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)或組合物。結合分子(例如，抗體或可活化抗體)可為CTLA4抗體(例如，人類抗人類CTLA4抗體)或CTLA4可活化抗體。於一些實施例中，該哺乳動物為人類。
於一些實施例中，該病症為癌症。可利用本發明提供之方法、用途、組合物或藥劑治療或預防各種癌症。此等癌症之實例包括肺癌，諸如支氣管癌(例如，鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌及腺癌)、肺泡細胞癌、支氣管腺瘤、軟骨錯構瘤(非癌)、及肉瘤(癌)；心臟癌症，諸如黏液瘤、纖維瘤及橫紋肌瘤；骨癌，諸如骨軟骨瘤、軟骨瘤(chondromas)、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤、巨細胞腫瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor) (尤因氏肉瘤)、及網狀細胞肉瘤；腦癌，諸如神經膠質瘤(例如，多形性膠質母細胞瘤)、間變性星形細胞瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、脊索瘤、神經鞘膜瘤(Schwannomas)、室管膜瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、松果體瘤、骨瘤、血管母細胞瘤、顱咽管瘤、軟骨瘤、生殖細胞瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫及血管瘤；消化系統癌症，諸如平滑肌瘤、表皮樣癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、腸脂肪瘤、腸神經纖維瘤、腸纖維瘤、大腸息肉及結腸直腸癌；肝癌，諸如肝細胞腺瘤、血管瘤、肝細胞癌、纖維板層癌、膽管癌、肝母細胞瘤及血管肉瘤；腎臟癌症，諸如腎腺癌、腎細胞癌、腎上腺樣瘤及腎盂移行細胞癌；膀胱癌；血液癌，諸如急性淋巴細胞性(淋巴母細胞性)白血病、急性骨髓性(髓細胞性、骨髓性、髓母細胞性、髓單細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病(例如，塞紮裡氏(Sezary)症候群及毛細胞白血病)、慢性髓細胞性(類骨髓性、骨髓性、粒細胞性)白血病、霍奇金氏(Hodgkin's)淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫及骨髓增生性病症(包括諸如真性紅細胞增多症、骨髓纖維化、血小板增多症及慢性髓細胞性白血病之骨髓增生性病症)；皮膚癌，諸如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、卡波西氏(Kaposi's)肉瘤及佩吉特氏病(Paget's disease)；頭頸癌；眼相關癌症，諸如眼癌及眼內黑色素癌；男性生殖系統癌症，諸如良性前列腺增生、前列腺癌及睾丸癌(例如，精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌及絨膜癌)；乳癌；女性生殖系統癌症，諸如子宮癌(子宮內膜癌)、子宮頸癌、卵巢癌、外陰癌、陰道癌、輸卵管癌及葡萄胎；甲狀腺癌(包括乳頭狀、濾泡性、間變性或髓樣癌)；嗜鉻細胞瘤(腎上腺)；副甲狀腺之非癌生長；胰癌；及血液癌，諸如白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤。
於另一態樣中，本發明提供一種增強哺乳動物之免疫反應之方法，其包括對該哺乳動物投與有效量之本發明所提供之結合分子(例如抗體或可活化抗體)或組合物。於一些實施例中，該結合分子為CTLA4抗體或其抗原結合片段且該哺乳動物為人類。於一些實施例中，該結合分子為CTLA4可活化抗體且該哺乳動物為人類。術語「增強免疫反應」或其文法變型意指刺激、引起、增加、提高或增強哺乳動物之免疫系統之任何反應。該免疫反應可為細胞反應(即細胞介導，諸如細胞毒性T淋巴細胞介導)或體液反應(即抗體介導)，且可為一級或二級免疫反應。增強免疫反應之實例包括活化PBMCs及/或T細胞(包括增加一或多種細胞激素(諸如IL-2及/或IFNγ)之分泌)。免疫反應之增強可使用熟習此項技術者已知之許多活體外或活體內量測評估，該等量測包括(但不限於)細胞毒性T淋巴細胞檢定、細胞激素釋放、腫瘤消退、具有腫瘤動物之存活、抗體產生、免疫細胞增殖、細胞表面標記物之表現，及細胞毒性。通常，當相較於未經處理之哺乳動物或未使用所述方法處理之哺乳動物之免疫反應時，本發明之方法增強哺乳動物之免疫反應。
於實踐治療方法中，結合分子(例如抗體或可活化抗體)可單獨投與作為單藥療法或與一或多種另外治療劑或療法組合投與。因此，於另一態樣中，本發明提供一種組合療法，其包含結合分子(例如抗體或可活化抗體)與一或多種另外療法或治療劑組合用於分開、依序或同時投與。術語「另外治療劑」可係指除了本發明提供之結合分子(例如抗體或可活化抗體)外之任何治療劑。於一特定態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物之癌症之組合療法，其包括對該哺乳動物投與有效量之本文中所提供之結合分子(例如抗體或可活化抗體)與一或多種另外治療劑組合。於另一實施例中，該哺乳動物為人類。
廣泛多種癌症治療劑可與本發明提供之結合分子(例如抗體或可活化抗體)組合使用。一般技術者將認知可與本發明之方法及結合分子(例如抗體或可活化抗體)組合使用之其他癌症療法之存在及開發且該等療法將不限於本文中所述療法之形式。可用於治療癌症之組合療法中之另外治療劑類別之實例包括(1)化療劑，(2)免疫治療劑，及(3)激素治療劑。於一些實施例中，該另外治療為病毒基因療法、免疫檢查點抑制劑、靶療法、放射療法、疫苗接種療法及/或化療。
術語「化療劑」係指可造成癌細胞死亡或干涉癌細胞之生長、分裂、修復及/或功能之化學或生物物質。化療劑之實例包括揭示於WO 2006/129163及US 20060153808中之彼等，其揭示內容以引用的方式併入本文中。特定化療劑之實例包括：(1)烷基化劑，諸如苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、環磷醯胺(CYTOXAN)、異環磷醯胺(IFEX)、鹽酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride) (MUSTARGEN)、噻替呱(THIOPLEX)、鏈脲黴素(ZANOSAR)、卡莫司汀(BICNU, GLIADEL WAFER)、洛莫司汀(CEENU)及達卡巴嗪(DTIC-DOME)；(2)生物鹼或植物長春化生物鹼，包括細胞毒性抗生素，諸如多柔比星(ADRIAMYCIN)、表柔比星(epirubicin) (ELLENCE, PHARMORUBICIN)、柔紅黴素(CERUBIDINE, DAUNOXOME)、奈莫柔比星(nemorubicin)、伊達比星(idarubicin) (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS)、米托蒽醌(DHAD, NOVANTRONE)、更生黴素(放線菌素D，COSMEGEN)、光神黴素(MITHRACIN)、絲裂黴素(MUTAMYCIN)及博來黴素(BLENOXANE)、酒石酸長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE)、長春鹼(VELBAN)、長春新鹼(ONCOVIN)及長春地辛(vindesine) (ELDISINE)；(3)抗代謝劑，諸如卡培他濱(capecitabine) (XELODA)、阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、氟達拉濱(fludarabine) (FLUDARA)、吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR)、羥基脲(HYDRA)、胺甲喋呤(FOLEX, MEXATE, TREXALL)、奈拉濱(nelarabine) (ARRANON)、曲麥克特(trimetrexate) (NEUTREXIN)及培美曲塞(pemetrexed) (ALIMTA)；(4)嘧啶拮抗劑，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)；卡培他濱(XELODA)、雷替曲塞(raltitrexed) (TOMUDEX)、替加氟(tegafur)-尿嘧啶(UFTORAL)及吉西他濱(GEMZAR)；(5)紫杉烷，諸如多西他奇(docetaxel) (TAXOTERE)、紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL)；(6)鉑藥物，諸如順鉑(PLATINOL)及卡鉑(carboplatin) (PARAPLATIN)及奧沙利鉑(oxaliplatin) (ELOXATIN)；(7)拓撲異構酶抑制劑，諸如依立替康(irinotecan) (CAMPTOSAR)、托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN)、依託泊苷(ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR)及替尼泊苷(VUMON)；(8)表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin) (鬼臼毒素衍生物)，諸如依託泊苷(ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR)；(9)葉酸衍生物，諸如甲醯四氫葉酸(leucovorin) (WELLCOVORIN)；(10)亞硝基脲，諸如卡莫司汀(BiCNU)、洛莫司汀(CeeNU)；(11)受體酪胺酸激酶抑制劑，包括表皮生長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素受體、類胰島素生長因子受體(IGFR)、肝細胞生長因子受體(HGFR)及血小板源性生長因子受體(PDGFR)，諸如吉非替尼(gefitinib) (IRESSA)、埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA)、硼替佐米(bortezomib) (VELCADE)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate) (GLEEVEC)、基非替尼(genefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、沙利度胺、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT)、阿西替尼(axitinib)、利妥昔單抗(RITUXAN, MABTHERA)、曲妥單抗(HERCEPTIN)、西妥昔單抗(ERBITUX)、貝伐單抗(bevacizumab) (AVASTIN)及蘭尼單抗(ranibizumab) (LUCENTIS)、lym-1 (ONCOLYM)、揭示於WO2002/053596中之類胰島素生長因子-1受體(IGF-1R)之抗體；(12)血管生長抑制劑，諸如貝伐單抗(AVASTIN)、蘇拉明(suramin) (GERMANIN)、血管抑素(angiostatin)、SU5416、沙利度胺及基質金屬蛋白酶抑制劑(諸如巴馬司他(batimastat)及馬馬司他(marimastat))，及揭示於WO2002055106中之彼等；及(13)蛋白酶抑制劑，諸如硼替佐米(VELCADE)。
術語「免疫治療劑」係指可增強哺乳動物之免疫反應之化學或生物物質。免疫治療劑之實例包括：卡介苗(bacillus Calmette-Guerin) (BCG)；細胞激素，諸如干擾素；疫苗，諸如MyVax個人化免疫療法、Onyvax-P、Oncophage、GRNVAC1、Favld、Provenge、GVAX、Lovaxin C、BiovaxID、GMXX及NeuVax；及抗體，諸如阿侖單抗(alemtuzumab) (CAMPATH)、貝伐單抗(AVASTIN)、西妥昔單抗(ERBITUX)、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin) (MYLOTARG)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (ZEVALIN)、帕尼單抗(panitumumab) (VECTIBIX)、利妥昔單抗(RITUXAN, MABTHERA)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN)、托西莫單抗(tositumomab) (BEXXAR)、伊匹單抗(YERVOY)、曲美目單抗(tremelimumab)、CAT-3888、OX40受體之促效劑抗體(諸如揭示於WO2009/079335中者)、CD40受體之促效劑抗體(諸如揭示於WO2003/040170中者)、及TLR-9促效劑(諸如揭示於WO2003/015711、WO2004/016805及WO2009/022215中者)。
術語「激素治療劑」係指抑制或消除激素產生或抑制或抵消激素對癌細胞生長及/或存活之影響之化學或生物物質。適用於本文中方法之此等劑之實例包括揭示於US20070117809中之彼等。特定激素治療劑之實例包括他莫西芬(tamoxifen) (NOLVADEX)、托瑞米芬(toremifene) (Fareston)、氟維司群(fulvestrant) (FASLODEX)、阿納托唑(anastrozole) (ARIMIDEX)、依西美坦(exemestane) (AROMASIN)、來曲唑(letrozole) (FEMARA)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGACE)、戈舍瑞林(goserelin) (ZOLADEX)及亮脯利特(leuprolide) (LUPRON)。本發明之結合分子亦可與諸如以下之非藥物激素療法組合使用：(1)移除所有或部分器官或腺之手術方法，該等器官或腺參與激素產生，諸如卵巢、睾丸、腎上腺及垂體，及(2)輻射治療，其中患者之器官或腺經歷足以抑制或消除靶向激素之產生之量之輻射。
於一些實施例中，該另外治療劑為下列中之一或多者：鉑美特、瑞復美、來那度胺、泊馬度胺、沙利度胺、DNA烷基化含鉑衍生物、順鉑、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺、抗CD137抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗DR5抗體、抗CD1d抗體、抗TIM3抗體、抗SLAMF7抗體、抗KIR受體抗體、抗OX40抗體、抗HER2抗體、抗ErbB-2抗體、抗EGFR抗體、西妥昔單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、派姆單抗、放射療法、單劑量輻射、分次輻射、焦點輻射、全器官輻射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受體、授受性轉移之T細胞、抗癌疫苗、及溶瘤病毒。
用於治療癌症之組合療法亦包括結合分子(例如，抗體或可活化抗體)與移除腫瘤之手術之組合。可在手術之前、期間或之後對哺乳動物投與結合分子(例如，抗體或可活化抗體)。
用於治療癌症之組合療法亦包括結合分子(例如，抗體或可活化抗體)與輻射療法(諸如電離(電磁)放射療法(例如，X-射線或γ射線)及粒子束輻射療法(例如，高線性能量輻射))之組合。輻射源可係哺乳動物之外部或內部。可在輻射療法之前、期間或之後對哺乳動物投與結合分子(例如，抗體或可活化抗體)。
本發明提供之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及組合物可經由任何適宜投與之經腸途徑或非經腸途徑投與。術語投與之「經腸途徑」係指經由胃腸道之任何部分投與。經腸途徑之實例包括經口、經黏膜、經頰、及經直腸途徑、或經胃內途徑。投與之「非經腸途徑」係指除了經腸途徑外之投與途徑。投與之非經腸途徑之實例包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、腫瘤內、膀胱內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、經氣管、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內、皮下或局部投與。本發明之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及組合物可使用任何適宜方法投與，諸如藉由口服、鼻飼管、胃造口管、注射、輸注、可移植輸注泵及滲透泵。投與之適宜途徑及方法可取決於諸如以下之許多因素變化：正在使用之特異性結合分子(例如，抗體或可活化抗體)、所需吸收速率、使用之特定調配物或劑型、正在治療之病症之類型或嚴重度、特異性作用位點及患者病狀，且可藉由熟習此項技術者容易選擇。
術語結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之「有效量」可係指有效用於預期治療目的之量。例如，於增強免疫反應之背景下，「有效量」可為有效刺激、引起、增加、提高或增強哺乳動物之免疫系統之任何反應的任何量。於治療疾病之背景下，「有效量」可為足以造成正在治療之哺乳動物中之任何所需或有益效果的任何量。具體而言，於治療癌症中，所需或有益效果之實例包括抑制癌細胞之進一步生長或擴散、癌細胞之死亡、抑制癌症再發生、減少與癌症相關之疼痛、或提高哺乳動物之存活。結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之治療上有效量範圍通常為約0.001至約500 mg/kg，及更通常約0.01至約100 mg/kg哺乳動物之體重。例如，該量可為約0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg、或100 mg/kg哺乳動物之體重。於一些實施例中，結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之治療上有效量係於約0.01至30 mg/kg哺乳動物之體重之範圍內。於一些其他實施例中，結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之治療上有效量係於約0.05至15 mg/kg哺乳動物之體重之範圍內。待投與之精確劑量水平可由熟習此項技術者容易確定且將取決於許多因素，諸如待治療之病症之類型及嚴重度、採用之特定結合分子(例如，抗體或可活化抗體)、投與途徑、投與時間、治療持續時間、採用之特定另外療法、正在治療之患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康及先前醫療史、及醫療技術中熟知之類似因素。
通常在多種場合投與結合分子(例如，抗體或可活化抗體)或組合物。單一劑量之間之間隔可為例如每日、每週、每月、每三個月或每年。示例性治療方案需要以下投與：每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每三個月一次或每三至六個月一次。結合分子(例如，抗體或可活化抗體)之典型劑量方案包括1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，經由靜脈內投與，使用下列給藥時程表中之一者：(i)每四週六個劑量，然後每三個月；(ii)每三週；(iii) 3 mg/kg體重一次，接著每三週1 mg/kg體重。VIII. 套組
於另一態樣中，本文中提供一種套組，其包含本發明之結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及/或組合物。於一些實施例中，該套組另包含一種包裝插入物，其包含結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及/或組合物之使用說明。於一些實施例中，該套組另包含一或多種緩衝劑，例如，用於儲存、轉移、投與或以其他方式使用結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及/或組合物。於一些實施例中，該套組另包含用於儲存結合分子(例如，抗體或可活化抗體)及/或組合物之一或多種容器。
認為上述書面描述足以使熟習此項技術者能實踐本發明。僅出於說明目的提供下列實例，且不意欲以任何方式限制本發明之範圍。的確，除了本文中所示及所述之彼等外之本發明之各種修改將自上述描述對熟習此項技術者變得顯而易見且落於隨附申請專利範圍之範圍內。 實例實例 1 ：特異性結合至人類 CTLA4 之一級 Fab 之產生
採用專有噬菌粒庫(參見PCT公開案號PCT/CN2017/098333，其全文以引用的方式併入本文中；亦參見PCT公開案號PCT/CN2017/098299，其全文以引用的方式併入本文中)篩選人類CTLA4抗原。進行總共3至5輪篩選。於最後輪篩選後，進行單群落上清液ELISA以識別特異性識別人類CTLA4 (參見例如，UniProt寄存編號P16410)之主要命中。將該等主要命中定義為其ELISA信號為背景至少兩倍之彼等。然後將該等命中定序，及將獨特純系於大腸桿菌中表現及純化。其對人類CTLA4之親和力藉由ForteBio Octet RED96 Systems量測。簡言之，使用AHC感測器(抗人類IgG Fc捕獲浸及讀取生物感測器)捕獲重組人類CTLA4-Fc (Sino Biological, 11159-H03H)，及浸入含有經純化Fab之孔中，該等Fab於動態緩衝液(含0.02% Tween20、0.1% BSA之PBS緩衝液)中稀釋至10 µg/mL。將獲取之ForteBio數據用Data Acquisition軟體7.1處理，及將動力學數據擬合至1:1朗繆爾(Langmuir)結合模型。將候選之清單用ELISA陽性命中及獨特序列二者精簡至234個Fab命中。遵照KD 反應信號R＞ 0.1，R2 ＞ 0.9之標準，將清單進一步精簡至所關注之43個命中。此等命中之親和力及動力學參數(減去背景)示於下表 1 中。表 1 ：選定 Fab 對人類 CTLA4 之親和力
命中ID ： KD (M) ： kon(1/Ms) ： koff(1/s) ：
B18153 5.96E-09 8.93E+04 5.32E-04
B15719 6.93E-09 3.21E+05 2.22E-03
B15746 7.15E-09 3.07E+05 2.20E-03
B15734 7.63E-09 3.05E+05 2.33E-03
B15710 8.01E-09 3.51E+05 2.81E-03
B13874 1.06E-08 1.19E+05 1.26E-03
B13898 1.07E-08 1.09E+05 1.16E-03
B15728 1.18E-08 4.24E+05 4.99E-03
B15705 1.20E-08 1.94E+05 2.33E-03
B15716 1.21E-08 3.91E+04 4.71E-04
B15672 1.23E-08 6.83E+04 8.39E-04
B15738 1.24E-08 3.76E+05 4.67E-03
B15694 1.28E-08 1.52E+05 1.94E-03
B15754 1.35E-08 2.76E+05 3.71E-03
B15749 1.38E-08 2.69E+05 3.72E-03
B15740 1.45E-08 1.78E+05 2.58E-03
B15489 1.46E-08 6.08E+04 8.87E-04
B13880 1.59E-08 1.04E+05 1.66E-03
B15699 1.66E-08 4.42E+05 7.35E-03
B15745 1.73E-08 2.58E+05 4.47E-03
B18174 1.82E-08 5.16E+04 9.38E-04
B15739 1.86E-08 4.24E+05 7.86E-03
B15721 2.21E-08 5.31E+05 1.17E-02
B15673 2.44E-08 6.95E+04 1.70E-03
B15737 2.75E-08 4.77E+05 1.31E-02
B15696 2.79E-08 1.44E+05 4.03E-03
B15491 2.98E-08 6.24E+04 1.86E-03
B15724 3.01E-08 5.52E+05 1.66E-02
B15741 3.08E-08 2.09E+05 6.44E-03
B15757 3.72E-08 1.05E+05 3.91E-03
B15759 5.36E-08 2.46E+05 1.32E-02
B15756 5.55E-08 1.20E+05 6.63E-03
B15722 6.12E-08 7.09E+04 4.34E-03
B15750 6.23E-08 9.37E+04 5.84E-03
B15702 6.92E-08 3.61E+05 2.50E-02
B14242 7.58E-08 3.36E+05 2.55E-02
B13878 8.59E-08 3.08E+04 2.64E-03
B15717 1.05E-07 1.77E+05 1.85E-02
B15187 1.37E-07 2.73E+04 3.75E-03
B15695 1.52E-07 1.81E+05 2.76E-02
B15189 1.70E-07 2.04E+04 3.47E-03
B15762 1.85E-07 4.60E+04 8.49E-03
B15730 2.59E-07 3.45E+04 8.93E-03
接下來，藉由ELISA測定各種Fab命中之物種交叉反應性。簡言之，在4℃下，將100 μL 1.25 μg/mL抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma, I5260)塗覆在Maxisorp微定量盤(Thermo Scientific 446469)上過夜。於阻斷後，添加100 μL Fab命中(2 μg/mL)及培育1小時。於洗滌孔3至4次後，添加與人類FC片段融合之人類、食蟹獼猴或小鼠CTLA4抗原之連續稀釋及培育1小時。於洗滌後，將經HRP標記之山羊抗人類FC用PBS 1:2000稀釋，及添加至各孔用於一小時培育。將板洗滌三次及在室溫下用TMB受質培育3至5分鐘。於停止反應後，量測450 nm處之吸光度。下表 2 中概述所測試Fab各者之物種交叉反應性。有趣的是，此分析識別具有變化交叉反應性之Fab：結果指示命中B13873、B15700、B15704、B15706、B15709、B15711、B15712、B15715、B15720、B15725、B15723、B15731、B15732、B15735、B15736、B15744、B15760、B16083、及B15188結合至人類、猴及小鼠CTLA4；命中B15188、B15190、B15701、B15729、B15733、B15742、B15747、B15743、B15751、B15752、B15753及B18157結合至人類及猴CTLA4，且弱結合至小鼠CTLA4；命中B13878、B14242、B15189、B15491、B15673、B15694、B15696、B15699、B15702、B15705、B15710、B15716、B15717、B15719、B15721、B15722、B15724、B15728、B15734、B15737、B15738、B15739、B15740、B15745、B15746、B15749、B15750、B15754、B15756、B15757、B15759及B15762結合至人類CTLA4，但是不結合至小鼠CTLA4；命中B15688結合至人類及小鼠CTLA4，但是不結合至猴CTLA4；命中B13874、B13880、B13898、B15187、B15489、B15672、B15695、B15730、B15741、B18153及B18174結合至人類CTLA4，但是不結合至猴或小鼠CTLA4。表 2 ：與人類、猴及小鼠 CTLA4 之 Fab 交叉反應性
命中ID ： 結合人類CTLA? 結合猴CTLA4? 結合小鼠CTLA4?
B13873 是 是 是
B15688 是 否 是
B15700 是 是 是
B15704 是 是 是
B15706 是 是 是
B15709 是 是 是
B15711 是 是 是
B15712 是 是 是
B15715 是 是 是
B15720 是 是 是
B15723 是 是 是
B15725 是 是 是
B15731 是 是 是
B15732 是 是 是
B15735 是 是 是
B15736 是 是 是
B15744 是 是 是
B15760 是 是 是
B16083 是 是 是
B15188 是 是 弱
B15190 是 是 弱
B15701 是 是 弱
B15729 是 是 弱
B15733 是 是 弱
B15742 是 是 弱
B15743 是 是 弱
B15747 是 是 弱
B15751 是 是 弱
B15752 是 是 弱
B15753 是 是 弱
B18157 是 是 弱
B13874 是 否 否
B13878 是 是 否
B13880 是 否 否
B13898 是 否 否
B14242 是 是 否
B15187 是 否 否
B15189 是 是 否
B15489 是 否 否
B15491 是 是 否
B15672 是 否 否
B15673 是 是 否
B15694 是 是 否
B15695 是 否 否
B15696 是 是 否
B15699 是 是 否
B15702 是 是 否
B15705 是 是 否
B15710 是 是 否
B15716 是 是 否
B15717 是 是 否
B15719 是 是 否
B15721 是 是 否
B15722 是 是 否
B15724 是 是 否
B15728 是 是 否
B15730 是 否 否
B15734 是 是 否
B15737 是 是 否
B15738 是 是 否
B15739 是 是 否
B15740 是 是 否
B15741 是 否 否
B15745 是 是 否
B15746 是 是 否
B15749 是 是 否
B15750 是 是 否
B15754 是 是 否
B15756 是 是 否
B15757 是 是 否
B15759 是 是 否
B15762 是 是 否
B18153 是 否 否
B18174 是 否 否
實例 2 ： IgG 轉變及表現
然後將來自以上實例1之經精簡命中中之13者轉變成人類IgG1抗體用於詳細生物物理及功能表征(表 3 )。將Fab命中B15709、B15716、B15722、B15732、B15740、B15744、B15756、B15700、B15711、B15717、B15735、B15736及B16083之重鏈及輕鏈分開選殖至哺乳動物表現載體pTT5-SPB。亦將參考抗體之重鏈及輕鏈選殖至pTT5-SPB。表 3 ：選殖為 IgG1 抗體之 Fab 命中
抗體(AB) 名稱： Fab 命中ID ： 同型：
TY21585 B15709 hIgG1
TY21586 B15716 hIgG1
TY21587 B15722 hIgG1
TY21588 B15732 hIgG1
TY21589 B15740 hIgG1
TY21580 B15744 hIgG1
TY21591 B15756 hIgG1
TY21687 B15700 hIgG1
TY21688 B15711 hIgG1
TY21689 B15717 hIgG1
TY21680 B15735 hIgG1
TY21691 B15736 hIgG1
TY21692 B16083 hIgG1
TAC2114 參考 hIgG1
按照製造商之方案，將編碼抗體重鏈及輕鏈之質粒對短暫轉染至293F細胞。收集利用編碼抗體TY21585、TY21586、TY21587、TY21588、TY21589、TY21580、或TY21591之質粒轉染之細胞之上清液，藉由離心及過濾澄清，及將所得IgG用標準蛋白A親和層析法(MabSelect SuRe，GE Healthcare)純化。將蛋白質溶離及中和，及緩衝交換至20 mM PB緩衝液(20 mM NaH2 PO4 ，150 mM NaCl，pH 7.0)中。藉由UV-分光光度法測定蛋白質濃度，及在變性、還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE或SEC-HPLC分析IgG純度。
收集利用編碼抗體TY21687、TY21689、TY21680、TY21691、或TY21692之質粒轉染之細胞之上清液，藉由離心及過濾澄清，及將所得IgG用標準蛋白A親和層析法(MabSelect SuRe，GE Healthcare)純化。將蛋白質溶離及中和，及緩衝交換至20 mM組胺酸緩衝液(20 mM組胺酸，3.5 mL 6M NaCl，pH 5.5)中。藉由UV-分光光度法測定蛋白質濃度，及在變性、還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE或SEC-HPLC分析IgG純度。實例 3 ：經 IgG 轉變之抗體之活體外功能表征
根據製造商之指導方針，使用Biacore™ T200儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)藉由表面電漿子共振(SPR)分析檢查抗體對人類、猴及小鼠CTLA4之結合親和力及動力學(表 4 )。根據胺偶合套組(GE Biacore #BR-1000-50)之說明，藉由將其胺基偶合在感測器晶片之羧化表面上將來自人類抗體捕獲套組(GE BR-1008-39)之抗人類IgG (Fc)抗體固定在CM5晶片上。使用經固定之抗人類IgG (Fc)抗體捕獲抗體TY21585、TY21586、TY21580、TY21591、TY21687、TY21689、TY21680、TY21691、TY21692及TAC2114。TAC2114具有與商業抗體伊匹單抗相同之胺基酸序列。在六種不同濃度(3.13、6.25、12.5、25、50及100 nM於運行緩衝液中稀釋)下量測結合，及使用30 μL/min之流率。使用之運行緩衝液為HBS-EP (100 mM HEPES、1.5M氯化鈉、0.05%表面活性劑P20，pH 7.6)。根據製造商之指導方針，使用Biacore T200評價軟體(Biacore AB)將締合及解離曲線擬合至1: 1朗繆爾結合模型。如下表 4 中所示，所有測試抗體能結合人類及猴CTLA4，及所有抗體(除了TY21591、TY21689及TAC2114)亦能結合至小鼠CTLA4。表 4 ： IgG1 抗體與人類、猴及小鼠 CTLA4 之結合親和力
   KD (nM)
抗體名稱： 人類CTLA4 ： 猴CTLA4 ： 小鼠CTLA4 ：
TY21585 8.15 8.26 1.71
TY21586 7.80 15.00 303
TY21580 2.58 0.44 0.51
TY21591 9.68 3.27 NC
TY21687 1.82 1.52 2.76
TY21689 0.95 0.91 NC
TY21680 1.48 1.29 0.67
TY21691 2.08 2.44 1.46
TY21692 3.95 2.76 1.12
TAC2114 6.68 1.98 NC
NC=非交叉反應性。
接下來測試某些IgG抗體結合至可溶性人類(圖 1A ，表 5A )或犬(圖 1B ，表 5B ) CTLA4之能力。製備1 μg/mL與人類FC片段融合之人類CTLA4，或與His標籤融合之犬CTLA4及用於在2至8℃下塗覆ELISA板過夜。於阻斷後，添加100 μL經連續稀釋之IgG抗體及在37℃下培育1小時。將板洗滌四次及然後在37℃下用HRP-抗人類IgG (Fab特異性) (1:6000稀釋)培育1小時。將板再次洗滌四次，及在室溫下用TMB受質培育15分鐘。於停止反應後量測450 nm處之吸光度。藉由Graphpad Prism 6利用非線性擬合分析數據。如圖 1A 至 B 及表 5A 至 B 中所示，所有測試抗體結合至人類CTLA4及除了抗體TY21586及TAC2114外亦結合至犬CTLA4。有趣的是，TY21580以最高親和力結合人類及狗CTLA4二者，各自為0.27及0.49之KD 。表 5A ：針對人類 CTLA4 之 ELISA
抗體名稱： LogEC50 ： EC50 ： KD
M nM nM
TY21585 -9.256 5.552E-10 0.5552 0.56
TY21586 -8.896 1.27E-09 1.2710 1.27
TY21580 -9.571 2.685E-10 0.2685 0.27
TY21591 -9.080 8.309E-10 0.8309 0.83
TY21687 -9.495 3.201E-10 0.3201 0.32
TAC2114 -9.482 3.296E-10 0.3296 0.33
表 5B ：針對犬 CTLA4 之 ELISA
抗體名稱： LogEC50 ： EC50 ： KD
M nM nM
TY21585 -8.219 6.045E-09 6.0450 6.05
TY21586 ND ND ND ND
TY21580 -9.313 4.86E-10 0.4860 0.49
TY21591 -9.151 7.066E-10 0.7066 0.71
TY21687 -9.128 7.451E-10 0.7451 0.75
TAC2114 ND ND ND ND
ND=未測定。
亦評估抗體對在HEK293F細胞表面上短暫表現之人類及小鼠CTLA4之親和力(圖 2 )。簡言之，將HEK293F細胞自亦編碼EGFP之雙順反子IRES載體用表現全長人類、猴或小鼠CTLA4之質粒轉染，及使用EGFP表現識別經轉染細胞。於48小時後，將哺乳動物細胞懸浮液(2 x 105 /孔)轉染至微量離心(Eppendorf)管，離心，遺棄上清液，將細胞用1 mL PBSA再懸浮(至密度為4×106 個細胞/mL)，及添加至96孔板。將測試抗體之3倍連續稀釋(15 μg/mL、5 μg/mL、1.67 μg/mL、0.55 μg/mL、0.185 μg/mL、0.062 μg/mL、及0.0309 μg/mL，加上0 μg/mL空白對照)吸量管移入96孔板，在冰上培育1小時(避光)，將細胞用預冷卻之1 x PBSA緩衝液洗滌，及隨後在冰上用Alexa Fluor® 647結合之小鼠抗人類FC抗體培育30分鐘。然後將細胞洗滌一次，之後藉由流動式細胞測量術(Beckman® CytoFlex)分析。如圖 2 中所示，所有測試抗體能結合HEK293F細胞表面上表現之人類CTLA4，及除了TY21589外，所有抗體結合至小鼠細胞表面暴露之小鼠CTLA4。TY21580以低nM親和力結合至細胞表面上表現之人類及小鼠CTLA4，然而抗體TY21585及TY21586以高nM親和力結合至細胞表面上表現之人類CTLA4。
亦使用ForteBio red 96儀器(Pall, USA)測試抗體TY21580、TY21687、TY21680及TY21691對大鼠CTLA4蛋白之結合親和力及動力學。使用SA感測器(Pall, 185019)以固定與人類FC融合之經生物素化大鼠CTLA4蛋白，及然後使感測器與在15 μg/mL (用補充有0.02% Tween 20及0.1% BSA之KB緩衝液、PBS緩衝液稀釋)之濃度下之IgG-轉變之命中接觸300秒，然後於KB緩衝液中解離300秒。根據製造商之指導方針，使用ForteBio資料分析7.1 (Pall, USA)將締合及解離曲線擬合至1:1朗繆爾結合模型。如表 6 中所示，所有測試抗體能結合至大鼠CTLA4。表 6 ：測試抗體對大鼠 CTLA4 之結合親和力
抗體名稱： KD (nM) ：
TY21580 0.38
TY21687 0.78
TY21680 0.21
TY21691 0.58
IgG 與經活化 T 細胞之結合
接下來，測試IgG結合至經活化人類、猴及小鼠T細胞之能力。將人類PBMC使用Histopaque-1077 (Sigma)藉由密度梯度離心自健康供體(#106)之血液新鮮單離。將人類T細胞使用人類T細胞濃化套組(StemCell Technologies)自PBMC單離，接著用抗CD3及抗CD28抗體刺激。簡言之，在4℃下將抗CD3抗體(純系：OKT3，BioLegend)以0.2 μg含於200 μL中/孔塗覆於96孔板過夜。於洗滌後，將懸浮於含10% FBS及1% Penn/Strep之RPMI-1640中之T細胞添加至該板中。將5x10E5個T細胞含於200 μL中添加至96孔板之各孔。然後添加1 μL抗人類CD28抗體(純系：28.2，BD)至5 μg/mL之最終濃度。將T細胞培育96小時，及然後藉由流動式細胞測量術分析測定TY21580與T細胞之結合(圖 3 )。在37℃下將T細胞用經APC標記之TY21580或人類IgG1 (同型對照)染色2小時。於洗滌後，在CytoFLEX流動式細胞測量儀(Beckman Coulter)上分析細胞及用FlowJo軟體分析數據。如圖 3 中所示，TY21580結合至經活化CD4+及CD8+人類T細胞，而對照IgG顯示不結合。此外，APC-TY21580顯示不結合至休止T細胞(不顯示數據)。
將猴PBMC使用Histopaque-1077 (Sigma)藉由密度梯度離心自初始食蟹獼猴之血液新鮮單離。將猴T細胞使用泛T細胞單離套組非人類靈長類動物(Miltenyi Biotec)自PBMC單離，接著用抗CD3及抗CD28抗體刺激。簡言之，在4℃下將抗CD3抗體(純系：SP34，BD)以0.2 μg含於200 μL中/孔塗覆於96孔板過夜。於洗滌後，將懸浮於含10% FBS及1% Penn/Strep之RPMI-1640中之T細胞添加至該板中。將2x10E5個T細胞含於200 μL中添加至96孔板之各孔。然後添加1 μL抗人類CD28抗體(純系：28.2，BD)至5 μg/mL之最終濃度。將T細胞培育72小時，及藉由流動式細胞測量術分析測定TY21580與T細胞之結合(圖 3 )。在37℃下將T細胞用經APC標記之TY21580或人類IgG1 (同型對照)染色2小時。於洗滌後，在CytoFLEX流動式細胞測量儀(Beckman Coulter)上分析細胞及用FlowJo軟體分析數據。如圖 3 中所示，TY21580結合至經活化CD4+及CD8+猴T細胞，而對照IgG顯示不結合。此外，APC-TY21580顯示不結合至休止T細胞(不顯示數據)
使用自成年BALB/c小鼠脾單離之小鼠T細胞誘導CTLA-4表現。使用來自新鮮小鼠脾之脾細胞以利用EasySep™小鼠T細胞單離套組(StemCell Technologies)單離T細胞，接著用抗小鼠CD3及抗CD28抗體刺激。簡言之，在4℃下將抗小鼠CD3ε抗體(Biolegend)以0.2 μg含於200 μL中/孔塗覆於96孔板過夜。於洗滌後，將懸浮於含10% FBS及1% Penn/Strep之RPMI-1640中之小鼠T細胞以5x10E5個T細胞含於200 μL中添加至該板之各孔中。然後添加1 μL抗小鼠CD28抗體(eBioscience)至5 μg/mL之最終濃度。將小鼠T細胞培育72小時及然後藉由流動式細胞測量術分析測定TY21580與T細胞之結合(圖 3 )。在37℃下將T細胞用經APC標記之TY21580或人類IgG1 (同型對照)染色2小時。於洗滌後，在CytoFLEX流動式細胞測量儀(Beckman Coulter)上分析細胞及用FlowJo軟體分析數據。如圖 3 中所示，TY21580結合至經活化CD4+及CD8+ T細胞，而對照IgG顯示不結合。抗體對人類 CTLA4 之結合選擇性
接下來檢查抗體選擇性。將人類CTLA4、PD1、LAG3、Tim3、B7H3、CD95、TNFR1、OX40、CD40、PD-L1、BLTA、VISTA、PDL2、ICOS及B7H4在HEK293F細胞表面上短暫過度表現。將經轉染細胞於預冷卻之1 x PBSA緩衝液(1.76 mM KH2PO4、10.14 mM Na2 HPO4• 12H2 O、2.68 mM KCl、136.89 mM NaCl及1% BSA)中洗滌，然後在冰上用100 nM測試抗體培育1小時。將細胞用染色緩衝液洗滌一次，及添加Alexa Fluor® 647結合之小鼠抗人類FC抗體及在冰上培育30分鐘，避光。將樣品用染色緩衝液洗滌一次，之後藉由流動式細胞測量術分析。於人類CTLA4、PD1、LAG3、Tim3及B7-H3中測試TY21585、TY21586、TY21580、TY21687、TY21689、TY21680及TY21691 (圖 4A )；於人類CD95、TNFR1、OX40及CD40中進一步測試TY21585、TY21586、TY21580 (圖 4B )；此外，於人類PD-L1、BLTA、VISTA、PDL2、ICOS及B7-H4中測試TY21586、TY21580 (圖 4C )。如圖 4A 至 C 中所示，所有測試抗體特異性結合至人類CTLA4，且不結合至任何其他測試抗原(或利用空載體轉染之親本細胞)。藉由 ELISA 之配位體競爭結合
然後藉由ELISA測試抗體阻斷CTLA4結合至其同源配位體CD80及CD86之能力。將重組人類CTLA4 (與人類Fc及His標籤融合)於碳酸鹽緩衝液pH 9.4中稀釋至1 μg/mL，及在4℃下塗覆在Maxisorp板上過夜。在37℃下將板用補充有2% (w/v)脫脂乳之PBS阻斷1小時。於洗滌後，將50 μL經生物素化CD80 (4 μg/mL)及50 μL各種濃度之測試抗體(範圍自200 μg/mL至1.56 μg/mL之2倍連續稀釋液)依次添加至各孔及在37℃下培育1小時。將板洗滌四次，及將100 μL HRP-中性親和素(neutravidin) (1:1000)添加至各孔及在37℃下培育1小時。將板如先前所述洗滌，及添加50 μL TMB受質溶液及在室溫下培育5分鐘，之後藉由50 μL硫酸(2M)停止反應。如圖 5A 至 B 中所示，除了TY21589，所有測試抗體阻斷CTLA4結合至CD80。
將與人類Fc融合之重組人類CD86於碳酸鹽緩衝液pH 9.4中稀釋至1 μg/mL，及在4℃下塗覆在Maxisorp板上過夜。在37℃下將板用補充有2% (w/v)脫脂乳之PBS阻斷1小時。於洗滌後，將50 μL與人類FC及His標籤融合之經生物素化人類CTLA4 (2.8 μg/mL)及50 μL各種濃度之測試抗體(範圍自100 μg/mL至0.78 μg/mL之2倍連續稀釋液)依次添加至各孔及在37℃下培育1小時。將板洗滌四次，及將100 μL HRP-中性親和素(1:1000)添加至各孔及在37℃下培育1小時。將板如先前所述洗滌，及添加50 μL TMB受質溶液及在室溫下培育5分鐘，之後藉由50 μL硫酸(2M)停止反應。如圖 5C 至 D 中所示，所有測試抗體阻斷CTLA4結合至CD86。藉由流動式細胞測量術之配位體競爭結合
亦藉由流動式細胞測量術測試抗體阻斷CTLA4結合至其同源配位體CD80及CD86之能力。將編碼全長人類CTLA4之質粒於HEK293F細胞中短暫表現。將細胞用染色緩衝液(包含1.76 mM KH2 PO4 、10.14 mM Na2 HPO4 ·12H2 O、2.68 mM KCl、136.89 mM NaCl及1% BSA之PBSA緩衝液)洗滌，及再懸浮於含100 nM測試抗體之染色緩衝液中。於冰上培育60分鐘後，將100 nM經生物素化人類CD80-Fc-Bio或CD86-Fc-Bio添加至各孔及在冰上再培育1小時。將細胞用染色緩衝液洗滌一次，及添加100 μL含Alexa fluor 633結合之鏈黴抗生物素(streptavidin)之染色緩衝液及在冰上培育30分鐘，避光。將細胞洗滌一次，及藉由CytoFlex流動式細胞測量術分析。如圖 6A 中所示，所有測試抗體以濃度依賴性方式阻斷CTLA4結合至CD80。TY21588顯示最強阻斷能力，其次TY21580及TAC2114具有顯著阻斷；及TY21585、TY21587、TY21589、TY21591具有較不有效阻斷。TY21589顯示少至無阻斷。如圖 6B 中所示，所有測試抗體以濃度依賴性方式阻斷CTLA4結合至CD86。TY21588、TY21589、TY21580、TY21591及TAC2114顯示最強阻斷能力；TY21585及TY21587具有較不有效阻斷。結合至 FcγR
接下來測試TY21586、TY21580及TAC2114對CD16a (176Phe) (Sino Biological Inc，10389-H08H)、CD16a (176Val，10389-H08H1)、CD32a (Sino Biological Inc，10374-H08H)、CD32b (Sino Biological Inc，10259-H08H)及CD64 (Sino Biological Inc，10256-H08H)之結合親和力。根據製造商之指導方針，使用Biacore™ T200儀器(Biacore AB，Uppsala, Sweden)藉由表面電漿子共振(SPR)分析檢查蛋白質結合。根據胺偶合套組(GE Biacore #BR-1000-50)之說明，藉由將蛋白質L之胺基偶合在感測器晶片之羧化表面上將蛋白質L (Sino Biological Inc. 11044-H07E)固定在CM5晶片上。使用經固定之抗人類IgG (Fc)抗體捕獲TY21586、TY21580及TAC2114。將於FcγR蛋白之運行緩衝液中稀釋之連續濃度(12.5、25、50、25、100及200 nM)在30 μL/min之速率下注射。所用之運行緩衝液為HBS-EP (100 mM HEPES、1.5M氯化鈉、0.05%表面活性劑P20，pH 7.6)。根據製造商之指導方針，使用Biacore T200評價軟體(Biacore AB, Uppsala, Sweden)將締合及解離曲線擬合至1: 1朗繆爾結合模型。如下表 7 中所示，TY21586及TY21580顯示相較於參考抗體(TAC2114) 相似之結合至FcγR之親和力。表 7 ：結合至 FcγR 之抗體
KD (nM)
抗體名稱 CD16a (176Phe) CD16a (176Val) CD32a CD32b CD64
TY21586 143.000 453.000 884.000 1340.000 0.214
TY21580 145.000 624.000 884.000 1110.000 0.202
TAC2114 237.000 577.000 706.000 735.000 0.255
結合至 FcRn
根據製造商之指導方針，使用Biacore™ T200儀器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)藉由表面電漿子共振(SPR)分析檢查測試抗體對重組人類FcRn之結合親和力。根據胺偶合套組(GE Biacore #BR-1000-50)之說明，藉由將人類FcRn蛋白之胺基偶合在感測器晶片之羧化表面上將人類FcRn蛋白(Sino Biological Inc. 11044-H07E)固定在CM5晶片上。將100 nM各抗體於運行緩衝液(50 mM NaPO4、150 mM NaCl及0.05% (v/v)表面活性劑20，pH 6.0)中稀釋，及將樣品在30 μL/min之速率下注射120秒。如圖 7 中所示，抗體TY21585、TY21580、TY21591、TY21687及TY21691展示較TAC2114更高之結合至FcRn之結合%，其指示相較於參考抗體(TAC2114)，Biacore晶片上之IgG-FcRn複合物可經歷使該複合物穩定之構形變化。抗體TY21586、TY21587、TY21589、TY21689及TY21680顯示低的結合%。人類 PBMC 活化
初步研究顯示TY21580不刺激人類T細胞活化或增殖。因為T細胞上之CTLA4活性與第一信號(TCR/CD3)及涉及B7-CD28/CTLA-4之第二信號相關，選擇人類PBMC，及測定TY21580在低濃度抗CD3之存在下之活性。在4℃下將抗CD3抗體(OKT-3)塗覆在96孔板上過夜。於洗滌後，將1 x 105 個經新鮮單離之人類PBMC添加至各孔，接著在不同濃度下添加測試製品。於使用人類IL-2 ELISA Ready-SET-Go (Invitrogen)套組刺激48小時後量測IL-2之誘導。使用人類IFNγ ELISA Ready-SET-Go (Invitrogen)套組量測上清液中之IFNγ。如圖 8A 及圖 9 中所示，在抗CD3之存在下抗體TY21580顯著增加人類PBMC活化，而TY21580單獨不具有活性。樹突狀細胞 MLR 檢定
於三個供體對：D42/D109、D32/D104及D104/D42中使用單核細胞衍生之DC及CD4+ T淋巴細胞進行DC-MLR檢定(圖 10 )。為得到DC細胞，將PBMC藉由密度梯度離心自健康供體單離，及使用陽性選擇商業套組(StemCell)將CD14+單核細胞自PBMC純化。藉由於補充有10%熱滅活FBS、1%盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)、20 ng/mL rhGM-CSF及20 ng/mL rhIL-4之RPMI-1640中活體外培養6天使CD14+單核細胞偏向於DC。在第3天用新鮮培養基更換培養基。在第6天於補充有10%熱滅活FBS、1%盤尼西林/鏈黴素及50 ng/mL rhTNF-α之RPMI-1640培養基中誘導DC成熟24小時。將CD4+ T細胞藉由來自另一健康供體之陰性單離物純化。將測試製品滴定為對應濃度(如圖 10 中所示)。將所收集之DC (1 x 104 )與含有或不含有經滴定測試製品之異基因CD4+ T細胞(1 x 105 )共培養。將抗PD1抗體用作DC-MLR檢定之陽性對照。於共培養後之第5天，使用人類IFNγ Ready-SET-Go ELISA套組藉由ELISA於上清液中量測IFNγ。如圖 10 中所示，抗體TY21580於使用人類CD4+ T細胞及DC之DC-MLR檢定中顯示弱活性。抗體 TY21580 之 ADCC 活性
將過度表現人類CTLA-4之HEK293F細胞用作靶細胞以評價TY21580介導之ADCC活性。使用人類NK單離套組(StemCell)將人類NK細胞自人類PBMC新鮮單離。將1 x 105 個NK細胞及1 x 104 個HEK293F/hCTLA-4細胞(E:T比率10:1)與不同濃度之抗體混合。於培育4小時後，量測LDH以測定ADCC活性。然後使用下列公式計算溶胞%：溶胞% = [(實驗釋放) – Ave (靶+ NK)]/[Ave (靶最大值) – Ave (僅靶)] ×100%。如圖 11A 至 B 中所示，TY21580顯示較參考抗體(TAC2114)更強ADCC活性。同型對照顯示無任何ADCC活性。
亦使用人類Treg細胞(A，供體#96；B，供體#12)及NK細胞(A，供體#99；B，供體#05)評價ADCC活性。為得到人類Treg細胞，將人類PBMC自健康供體新鮮單離，及使用EASYSEP™人類調節T細胞濃化套組(StemCell Technologies)陰性選擇Treg細胞。在IL-2之存在下將經濃化人類Treg細胞進一步藉由CD3/CD28刺激擴增，及藉由CD25及FOXP3染色及FACS分析證實。為得到人類NK細胞，將人類PBMC自另一健康供體新鮮單離，及使用人類NK單離套組(StemCell Technologies)單離NK細胞。在37℃下將人類Treg細胞用10 µM鈣黃綠素-AM (Invitrogen)標記30分鐘。於洗滌三次後，將經標記之Treg細胞與不同濃度之測試製品混合，接著添加NK細胞。將1 x 105 個NK細胞及1 x 104 個經標記之人類Treg細胞添加至96孔板之孔中，及混合以使E:T比率10:1。於培育4小時後，量測上清液中之鈣黃綠素-AM濃度以使用下列公式測定ADCC活性：溶胞% = [(實驗釋放) – Ave (靶+ NK)]/[Ave (靶最大值) – Ave (僅靶)] ×100%。如圖 12A 至 B 中所示，抗體TY21580顯示較參考抗體(TAC2114)更強ADCC活性。同型對照顯示無ADCC活性。TY21580 之 CDC 活性
在37℃下將過度表現人類CTLA-4之HEK293F細胞用10 µM鈣黃綠素-AM (Invitrogen)標記30分鐘。向96孔板之孔中，將不同濃度之抗體與1x104 個經標記之細胞及5%正常人類血清補體(NHSC, Quidel)混合。於培育5小時後，量測上清液中之鈣黃綠素-AM以測定CDC活性(圖 13 )。
將人類PBMC自健康供體(供體#57)新鮮單離。使用EasySep人類CD4+ T細胞濃化套組(StemCell)單離CD4+ T細胞，及用PMA (50 ng/mL)+離子黴素(Ionmycin)（1 µM）刺激20小時以誘導細胞表面上之CTLA-4表現。然後在37℃下將經活化之人類CD4+ T細胞用10 µM鈣黃綠素-AM (Invitrogen)標記30分鐘。向96孔板之孔中，將不同濃度之抗體與1 x 104 個經標記之人類CD4+ T細胞及5%正常人類血清補體(NHSC, Quidel)混合。於培育5小時後，量測上清液中之鈣黃綠素-AM以測定CDC活性(圖 14 )。TY21580顯示對HEK293F/hCTLA-4細胞或經活化之人類T細胞無CDC活性。
一併考慮，此等結果指示本文中所述之抗體能以高親和力及特異性結合至人類CTLA4，且此等抗體有效阻斷CTLA4與其同源配位體CD86及CD80之相互作用。亦顯示該等抗體具有與來自不同物種之CTLA4之交叉反應性。此外，結合至CTLA4可調節T細胞活化且誘導對表現CTLA4之細胞(諸如Treg)之ADCC活性。實例 4 ： IgG 轉變之抗體之活體內表徵
如以上實例中所述，抗體之物種交叉反應性(人類及小鼠)允許測定抗體於多個同源腫瘤模型中之抗腫瘤效能，該等模型包括MC38及CT26結腸直腸腫瘤模型、H22肝腫瘤模型、PAN02胰腫瘤模型及3LL肺腫瘤模型。於 MC38 結腸直腸腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將C57BL/6小鼠(n=8隻/組，雌性，6至8週齡)皮下接種MC38 (NTCC-MC38)鼠科結腸癌細胞。當建立腫瘤(80 mm3 )時，用同型對照抗體及三種不同劑量之抗體TY21580藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次持續三週。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m. (圖 15A 至 C )。如圖 15A 中所示，相較於同型對照抗體，TY21580展示強效活體內抗腫瘤活性，其中腫瘤在所有三種劑量下完全消退。如圖 15B 中所示，於處理後多達六十天，10 mg/kg之TY21580組中之8/8小鼠，2.5 mg/kg之TY21580組中之7/8，0.5 mg/kg之TY21580組中之6/8保持無腫瘤。當將10 mg/kg之TY21580組中之小鼠再激發時，證明對MC38腫瘤細胞之持久免疫記憶，如圖 15C 中所示。於 CT26 結腸直腸腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將BALB/c小鼠(n=8隻/組，雌性，7至8週齡)皮下接種CT26 (上海生物科學研究院(Shanghai Institutes for Biological Sciences))鼠科結腸癌細胞。當建立腫瘤(70 mm3 )時，用同型對照抗體及兩種不同劑量之抗體TY21580藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 16 中所示，相較於同型對照抗體，TY21580展示強效活體內抗腫瘤活性，在低至0.1至1 mg/kg之劑量下具有幾乎100%抑制。於 H22 肝腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將BALB/c小鼠(n=5隻/組，雌性，7至8週齡)皮下接種H22 (中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection))鼠科肝癌細胞。當建立腫瘤(60 mm3 )時，用同型對照抗體、在三種不同劑量(0.1 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg)下之TY21586、或在兩種不同劑量(0.1 mg/kg、1 mg/kg)下之抗體TY21580藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 17 中所示，相較於同型對照抗體，TY21580及TY21586均以劑量依賴性方式展示強效活體內抗腫瘤活性。當在相同劑量下比較時，TY21580於此腫瘤模型中較TY21586更強效。此外，在1 mg/kg下之TY21580投與導致腫瘤消退。於路易士肺腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將C57BL/6小鼠(n=6隻/組，雌性，8週齡)皮下接種路易士 (JenNio Bio, Guandong, China)鼠科肺癌細胞。當建立腫瘤(70 mm3 )時，用同型對照抗體、或均在5 mg/kg之劑量下之抗體TY21580、TY21687、TY21680或TY21691藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 18 中所示，相較於同型對照抗體，抗體TY21580、TY21687及TY21680顯示腫瘤生長之顯著抑制，而抗體TY21691不顯示強效抗腫瘤活性。於 PAN02 胰腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將C57BL/6小鼠(n=8隻/組，雌性，6週齡)皮下接種PAN-02 (CAMS細胞培養中心)鼠科胰癌細胞。當建立腫瘤(85 mm3 )時，用同型對照抗體、或在三種不同劑量(0.5 mg/kg、2 mg/kg、0.5 mg/kg)下之抗體TY21580藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 19 中所示，相較於同型對照抗體，TY21580以劑量依賴性方式顯示強效抗腫瘤活性。抗體 TY21580 單藥療法或與抗 CD137 抗體組合於 3LL 肺腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將C57BL/6小鼠(n=10隻/組，雌性，6至8週齡)皮下接種3LL (JCRB)鼠科肺癌細胞。當建立腫瘤(75 mm3 )時，用同型對照抗體、TY21580 (10 mg/kg)、抗CD137 (10 mg/kg)、或TY21580與抗CD137之組合藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。抗CD137為所開發之專有單株抗體，其具有結合人類及鼠科CD137二者之能力(參見PCT申請案號PCT/CN2017/098332，其全文以引用的方式併入本文中)。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 20A 至 B 中所示，相較於同型對照抗體，TY21580及抗CD137均顯示強效抗腫瘤活性，且該組合抑制腫瘤生長超過單獨任一單藥療法。具有對 TY21580 之完全反應之小鼠之再激發
將BALB/c小鼠(n=8隻/組，雌性，7至8週齡)皮下接種H22 (中國典型培養物保藏中心)鼠科肝癌細胞。當建立腫瘤(60 mm3 )時，用同型對照抗體、或在兩種不同劑量(1 mg/kg、10 mg/kg)下之抗體TY21580藉由腹膜內注射開始處，一週兩次持續3週理。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。相較於同型對照抗體，在兩種劑量下之TY21580於最後劑量幾天後導致完全腫瘤消退，及於處理60天後小鼠保持無腫瘤。然後在第60天將10 mg/kg之TY21580處理組中之小鼠用H22腫瘤細胞於相反腹脇部中皮下再激發，及監測腫瘤生長。如圖 21 中所示，於用相同腫瘤細胞再激發後此等小鼠保持無腫瘤，表明於此等小鼠中發展特定抗腫瘤記憶。同時用相同數目之H22腫瘤細胞接種之初始小鼠建立再激發對照組，及其腫瘤快速生長。抗體藥物動力學
於BALB/c雌性小鼠(約8週齡)中進行抗體TY21585、TY21586、TY21580及TY21591之藥物動力學研究。對三隻小鼠/組藉由尾靜脈注射靜脈內注射10 mg/kg之測試抗體。於給藥後1小時、8小時、48小時、168小時、336小時及500小時時收集血液樣品(約20 μL/樣品)。自無抗體投與之三隻初始雌性小鼠收集空白對照血液。藉由ELISA測定各測試抗體之血清濃度，其中使用CTLA4-His-Fc捕獲，及使用經HRP標記之抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma)檢測。如圖 22 中所示，TY21586展示於小鼠中與TAC2114可比較的藥物動力學，而TY21585、TY21580及TY21591更快被清除。
亦於初始食蟹獼猴中進行TY21586及TY21580之藥物動力學研究。藉由靜脈內一次全劑量注射在10 mg/kg下對一隻雌性及一隻雄性猴投與各抗體。在預劑量(0小時)及給藥後0.25小時、1小時、8小時、24小時、72小時、120小時、168小時、240小時、336小時、504小時及672小時時收集血清樣品。藉由ELISA測定TY21586及TY21580之血清濃度，其中使用CTLA4-His-Fc捕獲，及使用經HRP標記之抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma)檢測。如圖 23 及圖 24 中所示，相較於TY21586，TY21580於猴中更快清除，可能由於此等動物中觀察到之抗藥物抗體之快速增加。重複給藥毒性研究
於正常BALB/c小鼠中進行TY21580之重複給藥毒性。在第1天、第4天、第7天及第11天腹膜內(10 mL/kg)投與媒劑對照或抗體TY21580 (在25 mg/kg或50 mg/kg下)。各組包含五隻雌性小鼠及五隻雄性小鼠(五週齡)。每日監測小鼠異常行為及症狀，及每日量測食物攝取及體重。在第14天，將動物安樂死用於驗屍後檢查及其他分析。自各動物收集血液，其中每組收集之多達六種血液樣品(三種雄性、三種雌性)用於血液學(RBC、血小板、WBC、WBC差分)及/或血液生物化學(ALT、AST、GLB、ALP及LDH等)分析。收集來自各小鼠之下列器官並稱重：心臟、肺、胸腺、肝、脾、腎、睾丸及卵巢。將每組來自6種動物(三隻雄性、三隻雌性)之肝樣品固定於FFPE中。製備用於肝組織之FFPE塊，切片及H&E染色用於組織病理學分析。
在整個研究之生命週期期間，未觀察到異常行為，或非預定之動物死亡。相較於媒劑對照，TY21580不影響動物之食物攝取及體重。驗屍後檢查亦不顯示處理組小鼠在兩種劑量水平下之任何明顯病變，除了脾重量於TY21580處理組中增加(圖 25A 至 B )。血液學分析不顯示任何顯著變化，如由用TY21580處理之小鼠中測試之血液生物化學參數所指示。於來自小鼠之肝之組織病理學切片中未發現明顯異常(圖 26 )。總之，TY21580於此研究中良好耐受，其中於小鼠中未觀察到顯著毒性。
一併考慮，此等結果指示本文中所述之CTLA4抗體對小鼠極安全，具有強效抗腫瘤活性，且可誘導對腫瘤細胞之持久免疫記憶。實例 5 ：抗體可展性特性
用於可展性評估，將經純化TY21586及TY21580交換至儲備緩衝液(20 mM組胺酸，pH 5.5)中。於儲備緩衝液中進行所有實驗，包括溶解度、在加速應力條件下之穩定性及示差掃描螢光(DSF)測試。針對所有SEC-HPLC分析，使用TSKgel管柱(Tosoh Bioscience G3000SWxl)。抗體溶解度
將含有抗體TY21586或TY21580之樣品於儲備緩衝液中在大於100 mg/mL之濃度下調配，及測試高分子量(HMW)蛋白質聚集體之量(表 8 )。然後於儲備緩衝液中將抗體調整至約12 mg/mL。然後將樣品(各12 μg)通過SEC-HPLC檢定以檢測高分子量蛋白質聚集體。如圖 27 中所示，在高濃度(100 mg/mL以上)下調配之抗體30分鐘未觀察到HMW聚集體之顯著增加。表 8 ：抗體溶解度
抗體名稱 濃度(mg/mL) 聚集(HMW %)
TY21586 197.8 0
TY21580 126.0 +0.10
在加速應力條件下之抗體穩定性
亦在加速應力條件下檢查抗體穩定性。此等實驗之結果概述於表 9 及圖 28 中。TY21586及TY21580於6個凍(-80℃)熔(室溫)循環後保持穩定。於50℃下7天後，HMW聚集體或低分子量(LMW)片段存在小變化。於長期时程實驗(40℃持續多達28天)中，TY21586及TY21580保持穩定，且HMW聚集體或LMW片段無顯著增加。表 9 ：在加速應力條件下之 HMX% 變化
抗體名稱 凍熔 6 個循環 50 ℃ 7 d 50 ℃ 7 d LMW% 40 ℃ 28 d 40 ℃ 28 d LMW%
TY21586 5.34 0 2.14 -0.22 1.37
TY21580 0.49 0 2.02 0.02 0.43
此外，熱穩定性(如由示差掃描螢光(DSF)所量測)顯示TY21586及TY21580二者在高達至少約55℃下係穩定。轉變中點(Tm) (幾乎所有蛋白質域之展開轉變發生所在之特徵溫度)示於下表 10 中。表 10 ：藉由 DSF 之熱穩定性
抗體名稱 Tm 開始( ℃) Tm1 ( ℃) Tm2 ( ℃)
TY21586-16Z01 55 67.26 76.40
TY21580-16Z01 55 67.64 76.50
最後，發現於離心後抗體TY21586及TY21580之最高可達成濃度各自係超過 197.8 mg/mL及126.0 mg/mL。
一併考慮，此等結果指示甚至在無調配物最佳化下，CTLA4抗體TY21586及TY21580具有優異可展性特性。實例 6 ：識別 TY21580 衍生之 CTLA4 可活化抗體之自阻斷肽的方法
本文中描述一種新穎系統，其已經設計及執行以有效發現具有良好可展性之掩蔽部分。於此系統中，靶抗體片段Fab (圖 29 )或scFv (圖 30 )首先在酵母表面展示，及經證實功能結合至其抗原。然後將改良之肽庫直接融合至CTLA4抗體(TY21580)之輕鏈之N端，及構築在酵母表面上展示融合蛋白之酵母庫。然後該酵母庫經歷若干輪基於FACS之篩選：首先將具有與抗原低結合之酵母純系濃化，然後將經濃化酵母純系用蛋白酶處理以移除N端肽，及選擇具有與抗原高結合之純系(圖 29 及 30 )。於4至5輪分選後，自此等純系提取質粒及通過DNA定序證實掩蔽肽序列。實例 7 ：設計 CTLA4 可活化抗體之受限肽庫 (CPL)
設計四種示例性受限肽庫(CPL) (表 11 )。表 11 ：經設計之 CPL
CPL 名稱： 胺基酸序列：
CPL010 EVGSY(Z6 )C(Z6 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 152)
CPL011 EVGSY(Z6 )C(X6 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 153)
CPL012 EVGSY(Z6 )C(Z8 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 154)
CPL013 EVGSY(Z6 )C(X8 )C(Z2 )SGRSA (SEQ ID NO: 155)
各X獨立地為選自由以下組成之群之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、及Y；各Z獨立地為選自由以下組成之群之胺基酸：D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H、及P
其核心處為序列Z6 CX6 CZ2 (SEQ ID NO: 137)或Z6CX8CZ2 (SEQ ID NO: 138)，及兩個固定半胱胺酸殘基形成二硫鍵以限制肽構形。於經合成之寡核苷酸中，於所有地方除了環內部採用簡併密碼子NHC，其中於CPL011及CPL013中亦採用NNK密碼子。與NNK或NNS密碼子相比，NHC密碼子編碼12個殘基(表 12 )，其包含顯著多樣性，但是缺少化學不穩定殘基甲硫胺酸、色胺酸及半胱胺酸。此外，與NNK或NNS密碼子相比減少之理論多樣性使能構築具由更好覆蓋率之庫。表 12 ： NHC 密碼子
NHC ： AAC ACC ATC TAC TCC TTC GAC GCC GTC CAC CCC CTC
胺基酸： N T I Y S F D A V H P L
於此等掩蔽肽序列後為不變裂解肽序列 (SGRSAGGGGSPLGLAGSGGS, SEQ ID NO: 180)，該序列含有兩個蛋白酶識別位點：針對蛋白酶尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因子(uPA)之SGRSA (SEQ ID NO: 149)，及針對蛋白酶基質金屬蛋白酶-2 (MMP-2)及基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)之PLGLAG (SEQ ID NO: 150)。此等識別位點已於靶向劑之活體內腫瘤細胞特異性活化中由許多組使用 (參見例如，Ke等人(1997) J Biol Chem 272(33):20456-62；Gerspach等人(2006) Cancer Immunol Immunother 55(12):1590-600；及Jiang等人(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101(51):17867-72)。在基於酵母之篩選期間，將MMP-9識別序列用菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶識別序列(ENLYFQG, SEQ ID NO: 151)置換，這由於TEV蛋白酶之可得性及特異性。
將CPL及不變裂解肽以scFv或Fab形式融合至靶抗體(TY21580)之輕鏈之N端，該靶抗體被連接至酵母表面展示之Aga2蛋白。替代TEV蛋白酶識別位點之納入於識別正確類型之掩蔽肽序列中係重要的，即，在蛋白酶裂解之前阻斷抗原結合，及於蛋白酶裂解後使能抗原結合。下述實例證明，初始於酵母中顯示之可活化抗體之裂解-活化機理於哺乳動物細胞中表現之全IgG分子中複製。實例 8 ：構築及驗證靶向 CTLA4 之 TY21580 衍生之可活化抗體 功能靶抗體在酵母表面上之展示
使用低副本數目基於CEN/ARS之載體以在釀酒酵母(S. cerevisiae )中之可誘導GAL1-10啟動子之控制下表現靶抗體(靶向人類 CTLA4之抗體TY21580)。scFv之表面展示通過在GAL1啟動子之控制下在其C端融合之Aga2蛋白達成，類似於先前公開之排列(Boder及Wittrup (1997) Nat Biotechnol 15(6):553-7)。針對Fab，其表面展示通過在GAL1啟動子之控制下融合至重鏈(融合VH及CH1)之N端之Aga2蛋白達成，而輕鏈(融合VL及CL)係在GAL10啟動子之控制下。該等Fab通過其與膜錨定之重鏈之締合在酵母表面上展示。
Fab或scFv之表面展示藉由用識別融合親和力標籤之抗體染色來驗證，及使用經生物素化人類CTLA4檢查在酵母上展示之Fab或scFv之功能性。簡言之，於半乳糖介質中誘導48小時後，收集酵母細胞(1x10^6)，用PBSA緩衝液洗滌一次，及然後在室溫下用10 nM經生物素化抗原培育1小時。然後將酵母細胞用PBSA緩衝液洗滌兩次，及用PE結合之鏈黴抗生物素(1:500稀釋) (eBioscience #2-4317-87)在4℃下培育30分鐘。然後藉由流動式細胞測量術分析酵母細胞。如圖 31A 至 B 中所示，靶向CTLA4之Fab (圖 31A )及scFv (圖 31B )均在酵母表面上成功展示，且均能強結合至其抗原。構築含 CPL 之酵母庫
通過5個PCR循環將編碼CPL之經合成寡核苷酸與編碼裂解肽之寡核苷酸融合。PCR反應之組成為：1X PrimeSTAR緩衝液、2.5 mM dNTP、各100 μM F-引物及R-引物，及100 μM模板1 (CPL寡核苷酸)及模板2 (編碼裂解肽之寡核苷酸)各者、及2.5 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶。使用之PCR程序為：1) 96℃持續5分鐘之1個循環；2) 96℃ (15秒)，60℃ (15秒)，72℃ (6秒)之5個循環；及3) 72℃持續3分鐘之1個循環。使用核酸外切酶I消化單股DNA，之後通過凝膠電泳純化PCR產物。然後將經純化之PCR產物用BamHI及KpnI消化，及選殖至用相同兩種限制酵素消化之細菌過濾載體中。於過濾載體中，將CPL及裂解肽放在細菌分泌信號肽之下游，及缺少信號序列之β-內醯胺酶(lactamase)之上游。在胺比西林(ampicillin)板上選擇之功能性β-內醯胺酶指示CPL及裂解肽之框架內融合，從而消除引入經合成間併寡核苷酸中之任何框架外誤差(N-1或N-2)。此外，亦自池減少一些差摺疊序列。將連接產物轉形至電活性細菌細胞，及CPL庫之多樣性一般係在5x10^9與1x10^10之間。個別純系之定序指示通過此方法達成極高框架內速率(於許多情況下，幾乎100%)。
為製備含CPL之酵母庫，自細菌庫提取質粒，及用作編碼CPL及裂解肽之DNA片段之PCR擴增的模板。將經擴增之PCR片段通過凝膠電泳純化，及與表現融合至Aga2之靶抗體之線性化質粒一起轉形至電活化酵母細胞。PCR片段及質粒之兩端之同源序列確保酵母細胞內部之有效同源重組。經構築之酵母庫之多樣性一般為1x10^9至2x10^9。對 CTLA4 抗體之掩蔽肽之基於 FACS 之篩選
使用來自CPL酵母庫之總計1x10^8個酵母細胞篩選對靶抗體之掩蔽肽。針對通過MoFlo XDP之各輪分選，收集於半乳糖介質中誘導之酵母細胞，用PBSA緩衝液洗滌一次，及然後用10 nM (於後來輪中減少至1 nM)經生物素化之抗原在室溫下培育1小時。然後將酵母細胞用PBSA緩衝液洗滌兩次，及用PE共軛之鏈黴抗生物素(1:500稀釋) (eBioscience #2-4317-87)在4℃下培育30分鐘。於用PBSA緩衝液再洗滌兩次後，將酵母細胞調整至2-3 OD/mL，及經歷分選。如圖 32 中所示，於第1輪中，使用10 nM經生物素化之CTLA4-Fc，及將弱結合物濃化。於葡萄糖介質中生長後，將來自第1輪之酵母細胞於半乳糖介質中誘導及用AcTEV蛋白酶(6U/OD細胞) (Thermo Fisher Scientific #12575015)在30℃下處理2小時，及將強結合物純化。自第3輪分選開始，將經生物素化之CTLA4-Fc之濃度降低至1 nM，及收集弱結合物。在第4輪，亦將酵母細胞之溶離份用AcTEV平行處理，以驗證蛋白酶裂解介導之靶抗體之活化。如圖 32 中所示，顯而易見AcTEV裂解導致強結合至抗原之細胞群體之急劇增加，表明該篩選策略係有效。將來自第5輪分選之單純系平板接種在選擇性培養基上，及個別生長以進一步證實裂解介導之經活化抗原結合。
如圖 33A 至 B 中所示，在掩蔽肽之存在下，呈scFv (圖 33A )或Fab (圖 33B )形式之選定CTLA4可活化抗體純系展示與抗原之少結合。然而，當將酵母細胞用TEV蛋白酶處理以移除掩蔽肽時，與抗原之結合急劇增加。將TEV識別位點併入裂解肽中，與應用TEV蛋白酶組合驗證選定純系顯著增加掩蔽肽選擇之成功率。
為識別掩蔽肽序列，自選定酵母純系(Generay #GK2002-200)提取穿梭質粒，及轉形至活性大腸桿菌細胞。製備質粒，及將編碼掩蔽肽之區域定序及比對。如所預期，可將此等序列分成若干組，指示通過分選輪之清楚濃化。四組掩蔽肽序列與不變裂解肽序列一起列於表 13 中。表 13 ：掩蔽肽序列
樣品ID ： 肽名稱： 掩蔽+ 裂解肽序列：
TY22401 B13189 EVGSYNFVADSCPDHPYPCSASGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 168)
TY22402 B13180 EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 170)
TY22403 B13192 EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 172)
TY22404 B13197 EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 174)
IgG 轉變及表現
將列於表 13 中之四組掩蔽肽，以及源自其中之二者(B13192及B13197)以消除潛在糖基化位點之另外四個掩蔽肽序列(表 14 )轉變成IgG1。表 14 ：另外掩蔽肽序列
樣品 ID ： 掩蔽 + 裂解肽序列：
TY22563 EVGSYYSAYPACDSHYPYCQSSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 177)
TY22564 EVGSYYSAYPACDSHYPYCNSAGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 178)
TY22565 EVGSYPQPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 179)
TY22566 EVGSYPNPASDCVPYYYACAYSGRSAGGGGSPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 180)
將重鏈及輕鏈分開選殖至哺乳動物表現載體pCDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific，目錄號K830001)，及將掩蔽肽及不變裂解肽以與在酵母表面上展示相同之方式融合至輕鏈之N端。親本CTLA4抗體(TY21580)之VH及VL序列列於以下： 抗CTLA4重鏈可變區(SEQ ID NO: 87)： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWSWIRQAPGKGLEWLARIDWDDDKYYSTSLKSRLTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARSYVYFDYWGQGTLVTVSS 抗CTLA4輕鏈可變區(SEQ ID NO: 100)： DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRGRFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSSWPPTFGQGTKVEIKR.
將質粒對短暫轉染至HEK293F細胞中。於6天後，收集上清液，藉由離心及過濾澄清，及將IgG用標準蛋白A親和層析法(MabSelect SuRe，GE Healthcare)純化。將IgG溶離及中和，及緩衝交換至PB緩衝液(20 mM磷酸鈉、150 mM NaCl，pH 7.0)中。藉由UV-分光光度法測定蛋白質濃度，及在變性、還原及非還原條件下藉由SDS-PAGE或SEC-HPLC分析IgG純度。重要的是，可活化抗體於HEK293細胞中之表現水平類似於其親本抗體，且其於蛋白A樹脂後之純化產率亦相似，表明掩蔽肽及裂解肽之存在對哺乳動物細胞中之抗體表現不具有負面影響。掩蔽效率之量測
使用ForteBio Octet RED96系統(Pall, USA)快速評估掩蔽肽之功效。簡言之，將可活化抗體(及其親本抗體，TY21580)於KB緩衝液(補充有0.02% Tween 20及0.1% BSA之PBS緩衝液)中稀釋至30 μg/mL，及藉由抗人類IgG捕獲(AHC)生物感測器(Pall, USA)平行捕獲。然後允許將感測器與His標記之CTLA4蛋白質(25 nM)締合300秒，及然後於KB緩衝液中再締合300秒。根據製造商之指導方針使用ForteBio數據分析7.1 (Pall, USA)將締合及解離曲線擬合至1:1朗繆爾結合模型。如圖 34A 至 B 中所示，利用可活化抗體達成之反應顯著低於針對親本抗體達成之反應，表明掩蔽肽有效阻斷抗體與其抗原之結合。然而，在四種可活化抗體中，TY22401係較不有效，與來自以下討論之ELISA檢定之結果一致。
將重組人類CTLA4-Fc於PBS中稀釋至1 μg/mL及在4℃下塗覆在Maxisorp板上過夜。在37℃下將板用補充有3%脫脂乳之PBS阻斷1小時。於洗滌後，將100 μL抗體之3倍連續稀釋添加至各孔。於37℃下培育1小時後，將板洗滌四次，及將100 μL HRP結合之抗人類IgG (Fab特異性) (1:6000稀釋)添加至各孔。將板在37℃下培育1小時，洗滌四次，及然後將50 μL TMB受質溶液添加至各孔，及將板在室溫下培育。於用50 μL H2 SO4 /孔停止反應後，量測450 nm處之吸光度。藉由使用GraphPad Prism 6軟體之非對稱S形(五參數邏輯方程)模型擬合ELISA數據來評價EC50 。進行可活化抗體TY22401、TY22402及TY22404之實驗兩次，導致針對此等可活化抗體各者獲得兩個經計算之掩蔽效率。各可活化抗體之掩蔽效率藉由可活化抗體之結合之EC50 除以親本抗體(TY21580)之EC50 來計算。如圖 35A 至 B 及表 15 中所示，相較於親本抗體，所有可活化抗體顯示與其抗原之急劇減少之結合，及經計算之掩蔽效率範圍自48至2213。掩蔽效率之差異可由EC50 值之量測及數據擬合中之變化造成，且各可活化抗體之掩蔽效率可落入經計算之範圍內(例如，可活化抗體TY22402之掩蔽效率係在377與2213之間)。此等結果指示當於哺乳動物細胞中表現時，自CPL識別之多個掩蔽肽維持其掩蔽效率且作為全IgG分子之部分。表 15 ：在蛋白酶裂解之前之可活化抗體 ELISA
樣品ID ： LogEC50 ： EC50
M ： nM ： R2 ： 掩蔽效率：
數據批次1
TY21580 -9.665 2.161E-10 0.216 0.999 1.0
TY22401 -7.623 2.382E-08 23.82 0.997 110
TY22402 -6.321 4.779E-07 477.9 0.997 2213
TY22404 -6.749 178.4E-07 178.4 0.998 826
  
數據批次2
TY21580 -9.478 3.324E-10 0.3324 0.998 1.0
TY22401 -7.800 1.586E-08 15.86 0.994 48
TY22402 -6.902 1.254E-07 125.4 0.998 377
TY22404 -6.892 1.281E-07 128.1 0.998 385
        
TY21580 -9.48 3.3E-10 0.33    1.0
TY22563 -7.32 4.771E-08 47.71    143.5
TY22564 -7.41 3.898E-08 38.98    117.3
TY22565 -6.68 2.099E-07 209.9    631.5
TY22566 -6.79 1.6264E-07 162.6    489.2
掩蔽肽之移除恢復抗體活性
將經純化之可活化抗體用識別裂解序列之蛋白酶處理，及然後測試以確定掩蔽肽之移除是否恢復其活性。作為實例，將20 μg TY22404 (0.5 mg/mL)於反應緩衝液(50 mM Tris-HCl，0.01% Tween 20，pH 8.5)中用1 μg重組人類uPA (Acrobiosystems, # PLU-H5229)處理；或將TY22404於反應緩衝液(50 mM Tris，150 mM NaCl，5 mM CaCl2 ，20 μM ZnCl2 ，pH 7.5)中用5或10單位之重組人類MMP-9 (BioVision, # 7867-500)處理。在37℃下進行反應21小時。藉由SDS-PAGE分析證實掩蔽肽自輕鏈移除(圖 36A )。然後如上所述藉由ELISA量測掩蔽效率。如圖 36B 及表 16 中所示，於移除掩蔽肽後，可活化抗體於其結合至抗原方面變得與親本抗體不可區分。表 16 ：於蛋白酶裂解後之可活化抗體 ELISA
樣品ID ： LogEC50 ： EC50
nM ： 掩蔽效率：
TY21580 -9.35 0.447 1.0
TY22404 -7.01 96.8 216
TY22404-uPA -9.40 0.402 0.9
TY22404-MMP-9 -9.39 0.412 0.9
可活化抗體可展性特性
出於製造目的，關鍵的是所發現之可活化抗體具有良好可展性特性。利用於哺乳動物細胞中表現之經純化之可活化抗體進行若干不同測試。將可活化抗體於於20 mM組胺酸，pH 5.5中調整至1 mg/mL，及使用具有Waters 2996 UV檢測器及TSKgel g3000 SWXL管柱(300 mm × 7.8 mm)之Waters 2695 (Tosoh Bioscience)使用分析型尺寸排阻層析法進行抗體質量分析。針對各檢定，注射10 μg抗體，及於緩衝液(200 mM磷酸鈉，在pH 7.0下)中在0.5 mL/min之流率下進行分級分離。
進行三個加速應力測試：在50℃下培育可活化抗體7天，在40℃下培育可活化抗體28天，及六個凍熔循環。藉由將100 μL樣品(1 mg/mL含於20 mM組胺酸，pH 5.5中)在-80℃下冷凍30分鐘，接著在室溫下解凍60分鐘進行凍熔測試。如圖 37A 至 C 中所示，所有可活化抗體保持穩定，且於50℃下儲存7天或40℃下儲存28天後展示小的聚集。於六個凍熔循環之後，其顯示輕微惡化；然而，主要單體峰保持約95%，指示此等可活化抗體在此等加速應力測試下極其穩定。不希望受理論束縛，值得注意的是，可活化抗體尚未通過廣泛緩衝液最佳化處理，及因此，可活化抗體之穩定性可利用最佳化緩衝液及賦形劑進一步改善。
接下來，將可活化抗體於20 mM組胺酸，pH 5.5中濃縮至大於150 mg/mL (表 17 )。未觀察到可活化抗體沉澱，且樣品之黏度相當容易控制。然後將濃縮之可活化抗體稀釋至20 mg/mL或1 mg/mL用於分析高分子量(HMW)物質。如圖 38 及表 17 中所示，未觀察到HMW物質之明顯增加，表明此等可活化抗體於所測試之緩衝液中極其可溶且穩定，多達高濃度。表 17 ：可活化抗體之濃度 ＞150 mg/mL
樣品ID ： 起始濃度(mg/mL) ： 高濃度(mg/mL) ：
TY22401 10.9 187.2
TY22402 8.4 160.0
為研究可活化抗體在低pH下之穩定性，將經純化之可活化抗體(在10 mg/mL下含於20 mM組胺酸，pH 5.5中)用檸檬酸滴定至1 mg/mL，及將pH調整至3.7並保持在室溫下持續30及60分鐘。之後，將樣品用1M Tris-鹼中和至pH 7.0。如上所述，利用ForteBio量測可活化抗體之掩蔽效率。如圖 39 中所示，掩蔽效率於低pH培育30或60分鐘後仍未改變，表明掩蔽肽於低pH培育後保持其阻斷功效。
一併考慮，資料指示所發現之可活化抗體在各種應力條件下保持穩定，及因此，其具有良好可展性特性。實例 9 ：靶向 CTLA4 之可活化抗體之活體外及活體內表徵
應瞭解，T細胞上之CTLA-4活性係與第一信號(TCR/CD3)及涉及B7-CD28/CTLA-4之第二信號相關。活體外功能表征
此處在低濃度之抗CD3抗體之存在下評價靶向CTLA4之可活化抗體對人類PBMC活化之活性。使用Histopaque-1077 (Sigma)藉由密度梯度離心將人類PBMC自健康供體(#44)之血液新鮮單離。在4℃下將抗CD3 (OKT-3)抗體塗覆在96孔板上過夜。於洗滌後，將1x10^5個經新鮮單離之人類PBMC添加至各孔，接著添加不同濃度之測試製品。於使用人類IL-2 ELISA Ready-SET-Go (Invitrogen)套組刺激48小時後量測IL-2之誘導。使用人類IFN-γ ELISA Ready-SET-Go (Invitrogen)套組量測上清液中之IFN-γ。如圖 40A 至 B 中所證明，在高濃度下，TY22404誘導IL-2產生，及TY22401誘導IFN-γ產生。然而，可活化抗體之活性顯著低於親本TY21580抗體之活性。
接下來，測試可活化抗體之抗體依賴性細胞毒性活性及與親本抗體TY21580比較。使用ADCC報告基因檢定評價可活化抗體之ADCC活性。將過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞(HEK293F/hCTLA-4細胞)用作靶細胞；將過度表現CD16a及NFAT-Luc之Jurkat細胞系(Jurkat/CD16a細胞)用作效應細胞。將1x10^5個Jurkat/CD16a細胞及1x10^4個HEK293F/hCTLA-4細胞(E:T比率10:1)與不同濃度之抗體混合。於培育6小時後，將100 µL One-Glo試劑添加至細胞，及將細胞裂解10分鐘。移除上清液用於使用SpectraMax i3x板讀取器之發光量測。如圖 41 中所示，可活化抗體顯示較親本抗體TY21580若干對數更低ADCC活性。TY22401之ADCC活性較TY22402及TY22404之ADCC活性更高。一併考慮，活體外資料指示經更好掩蔽之可活化抗體具有較少ADCC活性。
接下來於多個同源小鼠腫瘤模型(包括MC38結腸直腸腫瘤模型、CT26結腸直腸腫瘤模型、H22肝腫瘤模型及3LL肺腫瘤模型)中評價可活化抗體之抗腫瘤活性及與親本抗體TY21580之抗腫瘤活性比較。於 MC38 結腸直腸腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將C57BL/6小鼠(n=8隻/組，雌性，6至8週齡)皮下接種MC38 (NTCC-MC38)鼠科結腸癌細胞。當建立腫瘤(70 mm3 )時，用同型對照抗體、親本抗體TY21580、或三種可活化抗體中之一者藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長，評估隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m. (圖 42A )及個別腫瘤生長曲線(圖 42B )。如圖 42A 至 B 中所示，所有三種可活化抗體於MC38同源小鼠腫瘤模型中顯示與親本抗體TY21580可比較之強效抗腫瘤活性。於 CT26 結腸直腸腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將BALB/c小鼠(n=8隻/組，雌性，7至8週齡)皮下接種CT26 (上海生物科學研究院)鼠科結腸癌細胞。當建立腫瘤(100 mm3 )時，用同型對照抗體、親本抗體TY21580、或三種可活化抗體中之一者在5 mg/kg下藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 43 中所示，所有三種可活化抗體於CT26同源小鼠腫瘤模型中顯示與親本抗體TY21580可比較之強效抗腫瘤活性。於 H22 肝腫瘤模型中之抗腫瘤功效
將BALB/c小鼠(n=8隻/組，雌性，7至8週齡)皮下接種H22 (中國典型培養物保藏中心)鼠科肝癌細胞。當建立腫瘤(100 mm3 )時，用同型對照抗體、親本抗體TY21580、或三種可活化抗體中之一者在5 mg/kg下藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長並報告為隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m.。如圖 44 中所示，所有三種可活化抗體於H22同源小鼠腫瘤模型中顯示與親本抗體TY21580可比較之強效抗腫瘤活性。於 3LL 肺癌模型中之抗腫瘤功效
將C57BL/6小鼠(n=10隻/組，雌性，6至8週齡)皮下接種3LL (JCRB)鼠科肺癌細胞。當建立腫瘤(75 mm3 )時，用同型對照抗體、親本抗體TY21580、或三種可活化抗體中之一者藉由腹膜內注射開始處理，一週兩次。一週兩次監測腫瘤生長，評估隨時間之平均腫瘤體積± s.e.m. (圖 45A )及個別腫瘤生長曲線(圖 45B )。如圖 45A 至 B 中所示，所有三種可活化抗體於3LL同源小鼠腫瘤模型中顯示與親本抗體TY21580可比較之強效抗腫瘤活性。藥物動力學分析
於BALB/c雌性小鼠(約8週齡)中進行藥物動力學研究。對三隻小鼠/組腹膜內注射10 mg/kg之測試製品。於給藥後3小時、6小時、24小時、48小時、96小時及168小時時收集血液樣品(約50 µL/樣品)。自無抗體投與之三隻初始雌性小鼠收集空白對照血液。藉由ELISA測定各測試抗體之血清濃度，其中使用抗人類IgG Fc捕獲，及使用經HRP標記之抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma)檢測(圖 46A 至 C )。相較於針對親本抗體TY21580收集之先前資料，可活化抗體TY22401 (圖 46A )、TY22402 (圖 46B )及TY22404 (圖 46C )具有慢得多的清除時間及更長半衰期。TY22401具有196小時之半衰期，且在168小時之藥物濃度係約55 µg/mL。TY22402具有134小時之半衰期，且在168小時之藥物濃度係約40 µg/mL。TY22404具有254小時之半衰期，且在168小時之藥物濃度係約45 µg/mL。相比之下，親本抗體TY21580具有107小時之半衰期，且在168小時之藥物濃度係約17 µg/mL。重複給藥毒性研究
當評價TY21580對NOD小鼠之糖尿病發病年齡之影響時，發現TY21580之高劑量可導致NOD但是非正常BALB/c小鼠之動物死亡。此處使用NOD小鼠模型評價可活化抗體相較於TY21580之安全性。在第0、3、7及12天將NOD小鼠(n=5隻/組，雌性，6週齡)用同型對照抗體、親本抗體TY21580、或三種可活化抗體中之一者在50 mg/kg下藉由腹膜內注射處理。於TY21580處理組中，於第三次給藥後1隻動物死亡，及於第四次給藥後3隻動物死亡。如圖 47 中所示，在研究終止時用同型對照或三種可活化抗體中之任一者處理之所有動物係活著且健康良好。此等資料指示可活化抗體於小鼠中具有可接受之安全性/毒性特性，且於NOD小鼠中，可活化抗體較親本抗體TY21580安全得多。實例 10 ：靶向 CTLA4 之可活化抗體之另外活體內表徵
於親本抗體TY21580之先前研究中，發現TY21580之重複給藥導致雌性及雄性正常BALB/c小鼠二者中之增加之脾大小。除此之外，TY21580不顯示對其他評價參數之任何顯著副作用，該等參數包括許多器官之重量、肝組織病理學、血液學及血液生物化學。因此，評價若干可活化抗體對脾大小之影響且與親本抗體TY21580比較。
於正常BALB/c小鼠中如下進行可活化抗體之重複給藥毒性：在第1、4、7及11天腹膜內投與50 mg/kg之同型對照抗體、TY21580親本抗體、或可活化抗體TY22402、TY22566或TY22401 (10 mL/kg)。各組包含五隻雌性小鼠(五週齡)。每日監測小鼠異常行為及症狀，及每日量測食物攝取及體重。在第14天，將動物安樂死用於驗屍後檢查及其他分析。有趣的是，雖然可活化抗體TY22402 (圖 48A )或TY22566 (圖 48B )之投與相較於同型對照稍微增加小鼠之脾大小，此等可活化抗體相較於親本抗體TY21580之投與顯示對脾大小顯著更少影響。可活化抗體TY22401之投與相較於同型對照顯著增加脾大小，但是較使用親本抗體TY21580觀察到者仍在較低程度(圖 48C )。
因為CTLA4在Treg細胞上構成表現，評價可活化抗體TY22402、TY22566或TY22401對全血及脾二者中之Treg細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之影響及與親本抗體TY21580比較。將來自全血之單核細胞或脾細胞染色及使用下列抗體閘控：抗CD45-BV421、抗CD3-AF488、抗CD4-BV510、抗CD8a-PerCP-cy5.5、抗CD25-APC及抗FoxP3-PE。將Treg細胞定義為CD45+ CD3+ CD4+ CD25+ Foxp3+ 。如圖 18 中所示，相較於同型對照，親本抗體TY21580增加脾中之Treg細胞之百分比；然而，可活化抗體TY22402及TY22566不影響脾Treg之百分比。於全血中，當與同型對照相比時，TY21580、TY22402及TY22566稍微增加Treg細胞之百分比。可活化抗體TY22401增加脾及全血中之Treg細胞之百分比。TY21580、TY22402、TY22566或TY22401不顯著改變CD4+ 及CD8+ T細胞之百分比(不顯示數據)。表 18 ： 顯示可活化抗體對脾 Treg 及血液 Treg 細胞之影響之 FACS 分析
組： 樣品： 脾： CD4+ T 細胞中之 Treg % 血液： CD4+ T 細胞中之 Treg %
同型對照 (50 mg/kg ， BIW) 6-1 10.50 1.71
6-2 8.25 0.70
6-3 8.04 0.67
6-4 6.81 0.90
平均值 8.40 1.00
SD 1.54 0.49
TY21580 (50 mg/kg ， BIW) 5-1 11.55 2.14
5-2 8.52 1.56
5-3 10.64 1.84
5-4 11.69 1.40
平均值 10.60 1.74
SD 1.47 0.32
TY22402 (50 mg/kg ， BIW) 3-1 7.10 1.42
3-2 7.08 1.00
3-3 10.77 1.70
3-4 10.25 1.98
平均值 8.80 1.53
SD 1.99 0.42
TY22566 (50 mg/kg ， BIW) 4-1 11.31 3.07
4-2 6.42 1.04
4-3 11.31 2.70
4-4 5.26 1.48
平均值 8.58 2.07
SD 3.19 0.97
TY22401 (50 mg/kg ， BIW) 2-1 10.39 2.23
2-2 11.12 4.09
2-3 10.63 1.71
2-4 11.96 2.76
平均值 11.03 2.70
SD 0.69 1.02
實例 11 ：另外可活化抗體可展性檢定
利用於哺乳動物細胞中表現之經純化之可活化抗體進行若干不同測試以測定其可展性特性。進行三種加速應力測試。首先，將可活化抗體TY22401、TY22402或TY22566在50℃下培育7天，及藉由SEC測定其穩定性並與同型對照比較(圖 49 )。於50℃下培育7天後針對可活化抗體觀察到高分子量(HMW)聚集體或低分子量(LMW)片段之僅稍微增加(若有的話) (表 19 )。表 19 ：在 50 ℃ 下 7 天之可活化抗體穩定性
樣品： HMW % ( 對照 ) LMW % ( 對照 ) HMW % (50 ℃ ， 7 天 ) LMW % (50 ℃ ，7 天 )
TY22566 1.35 0.33 1.24 2.78
TY22401 2.15 0.20 2.13 1.97
TY22402 2.46 0 0.45 2.57
接下來，將可活化抗體TY22401、TY22402或TY22566在40℃下培育7、14、21或28天，及藉由SEC測定其穩定性並與同型對照比較(圖 50 )。於40℃下培育各種時間點後針對可活化抗體觀察到高分子量(HMW)聚集體或低分子量(LMW)片段之僅稍微增加(若有的話) (表 20 )。表 20 ：在 40 ℃ 下 28 天之可活化抗體穩定性
樣品： HMW % ( 對照 ) LMW % ( 對照 ) HMW % (40 ℃ ， 28 天 ) LMW % (40 ℃ ， 28 天 )
TY22566 1.02 0.00 1.86 1.64
TY22401 1.57 0.00 2.03 1.19
TY22402 1.02 0.00 1.86 1.64
此外，使可活化抗體TY22401、TY22402或TY22566經歷六個凍熔循環。藉由在-80℃下將100 μL樣品(1 mg/mL含於20 mM組胺酸，pH 5.5中)冷凍30分鐘，接著在室溫下解凍60分鐘進行凍熔測試，及藉由SEC量測穩定性並與同型對照比較(圖 51 )。於此等凍熔循環後針對可活化抗體觀察到高分子量(HMW)聚集體之僅稍微增加(若有的話) (表 21 )。表 21 ：於 6 個凍熔循環後之可活化抗體穩定性
樣品： HMW % ( 對照 ) HMW % (6 個循環 )
TY22566 1.35 4.36
TY22401 2.15 4.96
TY22402 2.46 3.48
接下來，將可活化抗體於20 mM組胺酸，pH 5.5中濃縮至大於115 mg/mL。然後將經濃縮之可活化抗體稀釋至20 mg/mL用於分析高分子量(HMW)物質。如圖 52 及表 22 中所示，未觀察到HMW物質之明顯增加，表明此等可活化抗體於所測試之緩衝液中極其可溶且穩定，多達高濃度。表 22 ：可活化抗體之濃度 ＞150 mg/mL
樣品： 經濃縮 (mg/mL) HMW % ( 對照 ) HMW % ( 經濃縮 )
TY22566 125.73 2.35 3.69
TY22401 115.98 1.47 1.80
TY22402 128.87 1.82 4.04
一併考慮，資料指示所發現之可活化抗體在各種應力條件下保持穩定，及因此，甚至在無調配物最佳化下，其具有良好可展性特性(圖 53 )。 實例12：TY21580及伊匹單抗對CTLA4之抗原決定基結合及交叉反應性
人類CTLA4之F片、FG環路及G片含有對CTLA4與其配位體CD80及CD86相互作用重要之大多數接觸殘基(圖 54 ；圖 55A 及 55B )。例如，人類CTLA-4/CD86介面藉由CTLA4之前β-片上之殘基E33、R35、T53、E97、M99、Y100、P101、P102、P103、Y104、Y105、L106形成(Schwartz等人(2001) Nature 410(6828): 604-608)及CTLA4之FG環路中之殘基之丙胺酸置換(99MYPPPYY105)減少或廢除與CD80之結合(Stamper等人(2001) Nature 410(6828): 608-611)。
伊匹單抗(抗CTLA4抗體)亦在CTLA4之前β-片上在F及G股(殘基I93、K95、E97、L106及I108)、FG環路(殘基99MYPPPY104)及CC’環路(殘基L39、V46及I93；位於FG環路之對側)處與CTLA4相互作用。先前研究顯示人類CTLA4之殘基S20、R35、R40、Q76、D88、K95、E97、Y104、L106及I108之突變導致伊匹單抗結合之顯著損失，其中殘基R35、K95、E97、Y104及I108之突變顯示CTLA4結合之嚴重損失。此外，顯示伊匹單抗於伊匹單抗-CTLA4晶體結構中直接接觸CTLA4之殘基R35、K95、E97、Y104、L106及I108 (Ramagopal等人(2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(21): 4223-4232)。此外，晶體結構已揭示伊匹單抗抗原決定基部分佔據CTLA4之CD80/CD86結合位點，具有較受體-配位體介面(針對CTLA-4/CD80 1,255 Å2及針對CTLA-4/CD86 1,212 Å2)更大介面面積(針對CTLA4/伊匹單抗1,880 Å2) (Ramagopal等人(2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(21): 4223-4232；Lee等人(2016) Nat Commun 7(13354)；He等人(2017) Oncotarget 8:67129-67139)。
研究抗CTLA4抗體TY21580及伊匹單抗之抗原決定基結合特徵。為縮小重要CTLA4抗原決定基基序及結合至CTLA4之TY21580及伊匹單抗之殘基，採用系統方法。首先，使用低副本數目基於CEN/ARS之載體以在用於釀酒酵母中之細胞表面展示之可誘導GAL1-10啟動子之控制下表現小鼠CTLA4、人類CTLA4或各種人類CTLA4突變蛋白質(Boder及Wittrup (1997) Nat Biotechnol 15(6):553-7)。於突變CTLA4載體中，將人類CTLA4之特定基序或殘基突變成丙胺酸或小鼠 CTLA4之對應殘基。將TY21580或伊匹單抗添加至展示CTLA4之細胞中及通過流動式細胞測量術評估抗體結合。
用於比較，來自CTLA4-CD80 (PDBID:1I8L)、CTLA4-CD86 (PDBID:1I85)及CTLA4-伊匹單抗(PDBID: 5XJ3, 5TRU)晶體結構(於來自分子間介面之C-α原子之4 Å內)之CTLA4上之接觸殘基示於圖 54 中。將藉由其相互作用C-α原子定義之接觸殘基於源自其對應X-射線結構之其人類序列中標記為灰色殘基。
如圖 56A 及 56B 中所示，TY21580及伊匹單抗之交叉反應性之差異係驚人的，其中TY21580結合至人類及小鼠CTLA4二者，及伊匹單抗結合至人類CTLA4但是不結合至小鼠CTLA4。用於比較，使人類CD80 (圖 56C )、人類CD86 (圖 56D )及小鼠CD86 (圖 56E )與人類及小鼠CTLA4二者相互作用。
為進一步研究伊匹單抗及TY21580對CTLA4之抗原決定基結合特性，將人類CTLA4之各種基序突變及評估結合。TY21580、伊匹單抗、人類CD80、人類CD86及小鼠CD86維持對ADS42AAA CTLA4突變體相較於野生型CTLA4相似結合能力(圖 56A 至 56E )。然而，當將人類CTLA4 CC’環路基序(42ADSQVT47)突變為小鼠CTLA4 CC’環路基序(42TNDQMT47)時，TY21580相較於結合至突變體之伊匹單抗、人類CD80、人類CD86及小鼠CD86兩倍更強結合至突變體(圖 56A 至 56E )。一致觀察到CD80及CD86不直接結合至此CC’環路基序(參見例如，圖 54 )。雖然伊匹單抗與人類CTLA4中之此基序直接接觸(圖 54 ；Ramagopal等人(2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(21): 4223-4232)，人類CTLA4結合對CC’環路之突變變化之影響係極小(參見圖 56B 中之人類WT相對於ADSQVT42TNDQMT)。一併考慮，此等結果表明CC’環路基序不顯著促進伊匹單抗或TY21580對人類CTLA4之結合親和力。
來自抗原決定基定位資料之最有趣觀察中之一者為當自人類CTLA4之殘基105至108引入突變時，結合至CTLA4之伊匹單抗與TY21580之間之驚人差異。例如，當將YL105AA及LGI106AAA引入人類CTLA4時，伊匹單抗失去其結合CTLA4之能力(圖 56B )，與圖 54 中所示之對伊匹單抗結合至人類CTLA4重要之已知接觸胺基酸一致。此外，如圖 56A 及 56C 至 56E 中所示，TY21580、人類CD80、人類CD86及小鼠CD86對CTLA4 YL105AA突變體之結合親和力減弱。雖然人類CD80、人類CD86及小鼠CD86與LGI106AAA之結合親和力亦減弱，TY21580與LGI106AAA之結合親和力顯著增強。此與伊匹單抗與LGI106AAA之結合親和力之總損失形成對比。
用於CTLA4藉由TY21580及伊匹單抗之結合位點之抗原決定基定位，將突變引入人類CTLA4之特異性位點。針對誘變選擇之位點為CTLA4藉由伊匹單抗、CD80及CD86之已知接觸位點(基於其晶體結構，參見圖 54 )，該等位點在人類與小鼠CTLA4序列之間具有大的序列變化。例如，圖 55A 及 55B 顯示CD80及CD86與人類CTLA4之複合結構之正視圖，其中突出I108且顯示為球。I108為與伊匹單抗接觸之最關鍵位點中之一者，然而其遠離CD80及CD86接觸區。G股含有接觸伊匹單抗、CD80及CD86之大多數殘基，該等殘基在人類與小鼠CTLA4之間顯著不同，如圖 54 中所示。CC’環路基序亦含有與伊匹單抗之接觸殘基，該等殘基在人類與小鼠CTLA4之間不同，然而，圖 56A 至 56E 中之結果指示引入CC’環路基序之突變體不顯著促進伊匹單抗、TY21580、CD80或CD86對CTLA4之整體結合。因此，為進一步評估G股基序對伊匹單抗、TY21580、CD80及CD86之結合貢獻，將人類CTLA4之G股(105YLGIG109)突變為小鼠CTLA4 (105FVGMG109)。
如圖 56B 中所示，伊匹單抗遭受對YLGIG105FVGMG突變體之結合親和力之嚴重損失。相反，當引入此突變時，TY21580、人類CD80、人類CD86及小鼠CD86保持結合能力(圖 56A 、 56C 至 56E )。此指示TY21580具有與伊匹單抗不同之結合抗原決定基，由於人類與小鼠CTLA4之間之G股結合中之此差異。
此外，人類CTLA4之G股中之其他胺基酸經對應小鼠序列或其他胺基酸置換以探測其與伊匹單抗、TY21580、CD80及CD86之相互作用。已知I108為用於伊匹單抗結合之極其重要胺基酸。與此期望一致，伊匹單抗失去其與I108A、I108S、I108E、I108K及I108R CTLA4突變體之結合親和力(圖 56B )。相反，I108突變體(I108A、I108S、I108E、I108K及I108R)對TY21580、CD80或CD86之結合親和力不具有影響，突出TY21580、CD80及CD86之結合抗原決定基相較於伊匹單抗(如由I108，伊匹單抗之最關鍵結合位點中之一者所示)之重要差異(Ramagopal等人(2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(21): 4223-4232)。圖 55A 及 55B 中之複合結構顯示I108的確物理上遠離CTLA4與其配位體CD80及CD86之間之結合位點，及因此可對CD80/CD86與CTLA4之間之結合不具有顯著影響。吾人之觀察證實TY21580之結合抗原決定基更類似於CD80/CD86，不同於伊匹單抗之抗原決定基。因此，認為TY21580特異性結合至包含胺基酸殘基Y105及L106，但是非人類CTLA4之I108之抗原決定基。 實例13：TY21580及伊匹單抗對CTLA4配位體結合阻斷之影響
通過基於ELISA之實驗測試TY21580及伊匹單抗阻斷CTLA4結合至其同源配位體CD80及CD86之能力，如實例3中所述(藉由 ELISA 之配位體競爭結合 )。簡言之，於一實驗中，將ELISA微定量盤塗覆重組人類CTLA4蛋白(1 μg/mL)及將經生物素化之CTLA4配位體(在1 μg/mL下之CD80或在2 μg/mL下之CD86)以及TY21580、伊匹單抗或同型對照抗體之連續稀釋添加至各孔(圖 57A 及 57B )。於另一實驗中，將ELISA微定量盤塗覆重組CD80或CD86蛋白(1 μg/mL)及將經生物素化之人類CTLA4 (0.2 μg/mL或1 μg/mL)以及TY21580、伊匹單抗或同型對照抗體之連續稀釋添加至各孔(圖 57C 及 57D )。於兩個實驗中，使用經HRP標記之中性親和素檢測人類CTLA4與CD80或CD86之間之結合水平，如實例3中所述(藉由 ELISA 之配位體競爭結合 )。
如圖 57A 及 57B 中所示，當將CTLA4固定在微定量盤上時，TY21580及伊匹單抗以劑量依賴性方式阻斷CD80及CD86結合至CTLA4，然而同型對照抗體不顯示阻斷活性，指示檢定特異性。如圖 57C 及 57D 中所示，當將CD80或CD86固定在微定量盤上時，TY21580及伊匹單抗再次以劑量依賴性方式阻斷CD80及CD86結合至CTLA4，而同型對照抗體不顯示阻斷活性。如表 23 中所示，雖然TY21580及伊匹單抗均阻斷配位體結合至CTLA4，當將人類CTLA4固定在微定量盤上時相較於當將CD80或CD86固定在微定量盤上時，TY21580及伊匹單抗之劑量依賴性阻斷活性係驚人不同。此等結果指示TY21580及伊匹單抗展示可比較之配位體阻斷活性，在CTLA4固定條件下具有相似IC50。然而，在CD80或CD86配位體固定條件下，伊匹單抗展示對CD80及CD86二者較TY21580強得多的配位體阻斷活性，如圖57C 及 57D 及表 23 中所示。然而，另外實驗表明在飽和濃度下添加抗CTLA4抗體後CTLA4與其配位體之相互作用之完全阻斷對腫瘤排斥不必要，意指TY21580在不完全阻斷CD80或CD86下仍可活化T細胞且具有強效抗腫瘤功效。事實上，TY21586顯示CD80及CD86之完全阻斷，類似於伊匹單抗，如圖 58 中所示。然而，TY21586及伊匹單抗具有較測試之其他抗體低得多的ADCC報告基因活性(圖 59 )，及因此於經由ADCC效應耗盡Treg細胞中較不有效(亦參見Tang等人(2018) Cell Biosci. 8(30):1-3)。不希望受理論束縛，據信CD28依賴性T細胞活化(例如，藉由阻斷CTLA4活性)對有效腫瘤排斥係重要的，然而T細胞之過度刺激可係有害。因此，針對TY21580觀察到之較弱配位體阻斷可為超過伊匹單抗之較強配位體阻斷活性之優點。表 23 ： TY21580 及伊匹單抗對 CTLA4 配位體結合阻斷之 IC50
測試抗體 IC50 (nM) 板結合CTLA4 溶液中之CTLA4
溶液中之CD80 溶液中之CD86 板結合CD80 板結合CD86
TY21580 3.809 0.4806 59.08 5.583
伊匹單抗 4.116 0.5873 1.789 1.429
雖然此等差異之潛在機理目前不清楚，結果指示TY21580與伊匹單抗之性質之間存在固有差異。一併考慮，此等結果表明TY21580可充當配位體阻斷劑，破壞CD80及CD86結合至其抑制性受體CTLA4。不希望受理論束縛，認為通過弱配位體阻斷將CD80及CD86自CTLA4固存解除允許此等配位體在T細胞活化期間通過共刺激受體CD28信號傳導，其可導致在T細胞免疫活化期間增加之有效性及安全性。實例 14 ： TY21580 及伊匹單抗對 CD28 路徑激活之 CTLA4 阻斷之影響
使用由Promega開發之基於細胞之CTLA4阻斷生物檢定(目錄號JA3001及JA3005)，評估TY21580及伊匹單抗之CTLA4阻斷功能。此檢定涉及在TY21580或伊匹單抗之存在或不存在下將兩種經遺傳工程改造之細胞系共培養，然後使用Bio-Glo™螢光素酶檢定系統量測由螢光素酶報告基因產生之生物發光信號。經共培養之兩種細胞系為(1) CTLA4效應細胞–表現人類CTLA4及藉由對TCR/CD28活化回應之初始啟動子驅動之螢光素酶報告基因之Jurkat T細胞；及(2) APC/Raji細胞 –內源表現CTLA4配位體CD80及CD86且另外表現經設計以抗原獨立性方式活化TCR之細胞表面蛋白之Raji細胞。當將此等兩種細胞類型共培養時，CTLA4與CD28對CD80及CD86結合競爭，其抑制CD28路徑之活化及導致低啟動子介導之發光。添加抗CTLA4抗體至此系統中可阻斷CTLA4與其配位體CD80及CD86之相互作用，導致更高TCR/CD28活化及隨後啟動子介導之發光。
如圖 58 中所示，所有測試抗體以劑量依賴性方式激活TCR/CD28路徑，如藉由隨著抗體濃度增加增加報告基因信號(即，發光)所證明。相比之下，同型對照抗體不顯示活性。此等結果證明藉由此等不同抗CTLA4抗體之CTLA4功能阻斷活性之範圍。雖然該等抗體之EC50有點相似(表 24 )，藉由此等抗體刺激之功能信號傳導活化之量級指示伊匹單抗及TY21586為所測試之最強效CTLA4阻斷劑，接著為TY21680、TY21580及TY21687 (圖 58 )。作為出自所測試抗體之CTLA4阻斷劑，TY21691具有最弱活性。此等結果證明所有測試抗體可以劑量依賴性方式阻斷CTLA4與CD80及CD86之相互作用，導致下游TCR/CD28路徑活性。不希望受理論束縛，結果表明所有測試抗體可增加T細胞活化，其可有利於治療癌症。如上所討論，較弱配位體阻斷劑(諸如TY21580)可於治療癌症中特別有效，因為其相較於強結合劑減低之過度刺激T細胞之風險。表 24 ：抗 CTLA4 抗體對 TCR/CD28 路徑激活之 EC50
伊匹單抗 TY21580 TY21586 TY21687 TY21680 TY21691
EC50 (μg/mL) 1.62 5.06 4.66 5.01 8.21 2.64
實例15：抗CTLA4抗體之ADCC活性
測試及比較伊匹單抗、TY21580、TY21586、TY21687、TY21680及TY21691之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。使用ADCC報告基因檢定評價可活化抗體之ADCC活性。將過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞(HEK293F/hCTLA4細胞)用作靶細胞；將過度表現CD16及NFAT-Luc之Jurkat細胞系(Jurkat/CD16a細胞)用作效應細胞。在經連續稀釋之抗CTLA4抗體之存在或不存在下，將1.2 x 105 個Jurkat/CD16a細胞及2x104 個HEK293F/hCTLA4細胞(E:T比率6:1)於96孔組織培養微定量盤中混合。於培育6小時後，將One-Glo試劑添加至細胞，及將細胞裂解。為量測報告基因活性，移除上清液用於使用SpectraMax i3x板讀取器之發光量測。將人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照。
如圖 59 中所示，所有測試抗體以劑量依賴性方式顯示各種程度之ADCC信號傳導活化，然而同型對照不顯示任何ADCC活性。此等結果證明藉由此等不同抗CTLA4抗體之ADCC信號傳導/刺激活性之範圍。如由信號傳導活化之量級(圖 59 )及EC50 (表 25 )二者所證明，TY21580誘導所有所測試抗體之最強效ADCC信號傳導活性。TY21691為誘導ADCC信號傳導中之最少活性抗體。雖然早期資料證明此等抗體具有對人類CTLA4之相似結合親和力，具有單數位nM之KD，此等ADCC報告基因結果表明所測試抗體之結合抗原決定基可較其結合親和力更顯著影響ADCC活性。應注意，雖然TY21586、TY21680、TY21580、TY21687及TY21691係交叉反應性，以上結果顯示其於配位體阻斷及ADCC活性中之有效性顯著不同，表明抗體抗原決定基結合位點之細微差異可導致抗腫瘤活性之顯著差異。表 25 ：抗 CTLA4 抗體對 ADCC 報告基因信號傳導之 EC50
　 伊匹單抗 TY21580 TY21586 TY21687 TY21680 TY21691
EC50 (μg/ml) 1.08 0.174 4.69 9.5 6.76 ＞10
實例16：TY21580及伊匹單抗於鼠科MC38結腸直腸腫瘤模型中之抗腫瘤功效
為測定TY21580及伊匹單抗之抗腫瘤功效，將敲入人類CTLA4之C57BL/6小鼠(n=6隻/組，雌性，5至9週齡)皮下接種MC38鼠科結腸癌細胞。當建立腫瘤(99 mm3 )時，將小鼠用同型對照抗體(1 mg/kg)、TY21580 (1 mg/kg或0.2 mg/kg)或伊匹單抗(1 mg/kg或0.2 mg/kg)藉由一週兩次腹膜內注射持續兩週處理。一週兩次監測組平均腫瘤生長(圖 60A) 及不同組中之各小鼠之個別腫瘤生長(圖 60B) 並報告為隨時間之平均腫瘤體積± SEM。如圖 60A 及 60B 中所示，TY21580顯示在1 mg/kg (組-2)及0.2 mg/kg (組-3)之劑量下之完全抗腫瘤效應，及此等小鼠中之所有腫瘤完全被廢除，除了對一小鼠第一次給藥後第32天極小腫瘤留下。伊匹單抗亦顯示在1 mg/kg (組-4)之劑量下之完全抗腫瘤效應；然而，在第一次給藥後之第32天用伊匹單抗之較低劑量(0.2 mg/kg，組-5)處理之腫瘤之一半(3/6)自腫瘤抑制逃脫。此顯示TY21580在抗腫瘤活性方面較伊匹單抗更有效。TY21580及伊匹單抗均良好耐受，在研究期間無動物死亡，且在所測試之劑量水平下於小鼠中未觀察到顯著體重損失。總之，此等結果表明TY21580為具有較伊匹單抗更強效抗癌活性之安全且有效抗癌劑。 實例17：TY21580及伊匹單抗對鼠科MC38結腸癌模型中之腫瘤內調節T (Treg)細胞水平之影響
於皮下MC38鼠科結腸癌同源模型中評價於用TY21580或伊匹單抗處理後CD4+ T細胞亞群中之T調節(Treg)細胞(CD4+ CD25+ )之百分比(圖 61A )。將荷瘤動物用TY21580或伊匹單抗在1 mg/kg (Q3d × 3個劑量)下處理。自腫瘤單離CD4+ T細胞，然後自此等CD4+ T細胞單離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)及外周細胞(即，PBMC及脾細胞)作為亞群。
於TIL中，於TY21580處理後Treg細胞之百分比顯著降低(針對TY21580處理組15.2%相對於針對同型對照組41.6%，P ＜0.001)。於伊匹單抗處理後Treg細胞無顯著降低(針對伊匹單抗28.4%相對於針對同型對照41.6%，P =ns)。此與伊匹單抗不顯著改變或耗盡微腫瘤環境內之FOXP3+ Treg細胞之觀察一致(Sharma等人(2018) Clin. Cancer Res. online publication only, PMID 30054281；Ferrara等人(2018) Clin. Cancer Res.)。於PBMC中，於TY21580處理後Treg細胞之百分比稍微增加(針對TY21580組6.2%相對於針對同型對照組3.9%，P =0.01)，但是於伊匹單抗處理後未看到此影響(針對伊匹單抗組4.8%相對於針對同型對照組3.9%)。亦參見Ha等人PNAS (2019) 116(2):609-618。於脾細胞中，TY21580及伊匹單抗處理均不具有對Treg細胞之百分比之影響(針對同型對照組8.6%；針對TY21580組7.8%；針對伊匹單抗組9.4%)。
亦評價細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)與Treg細胞之比率(即，CD8+ /Treg比率) (圖 61B )。於TIL中，於用TY21580處理後CD8+ /Treg比率增加(針對TY21580 18.7相對於針對同型對照3.7；P =0.0517，接近0.05)。伊匹單抗處理相較於同型對照對CD8+ /Treg比率之影響不顯著，及至多較TY21580之影響弱。於PBMC及脾細胞中，於TY21580或伊匹單抗處理後CD8+ /Treg比率不顯著改變。此等結果證明TY21580具體而言於腫瘤浸潤細胞(即，TIL)中，但是非外周細胞(即，PBMC及脾細胞)中展示誘導Treg細胞耗盡及增加CD8+ /Treg比率之活性。
TY21580抗CTLA4抗體對T細胞之調節活性提供對TY21580之活體內抗腫瘤功效之機械理解。不希望受理論束縛，結果表明TY21580於腫瘤微環境中降低免疫抑制Treg活性且增強細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)活性以介導抗腫瘤反應。TY21580與伊匹單抗之間於腫瘤Treg耗盡及CD8+ /Treg比率中之數量差異亦顯示TY21580展示較伊匹單抗於活體內更好抗腫瘤活性。 實例18：TY21580對鼠科CT26結腸癌模型中之腫瘤內調節T (Treg)細胞水平之影響
於皮下CT26鼠科結腸癌同源模型中評價於用TY21580處理後CD4+ T細胞亞群中之T調節(Treg)細胞之百分比(圖 62A )。將荷瘤動物用TY21580 (在第0天及第3天5 mg/kg)處理。自腫瘤單離CD4+ T細胞，然後自此等CD4+ T細胞單離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)及外周細胞(即，PBMC及淋巴結(LN)細胞)作為亞群。
如圖 62A 中所示，TY21580相較於同型對照顯著降低TIL中之Treg細胞之百分比(針對TY21580 12.6%相對於針對同型對照38.5%，P ＜0.001)。然而，TY21580相較於同型對照不影響外周淋巴細胞(即，PBMC及淋巴結(LN)細胞)中之Treg細胞之百分比。於TY21580處理後PBMC中之Treg細胞之百分比為5.8%相對於於同型對照處理後4.9% (P ＞0.05)。於TY21580處理後淋巴結細胞中之Treg細胞之百分比為8.1%相對於於同型對照處理後7.7% (P ＞0.05)。
亦評價細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)與Treg細胞之比率(即，CD8+ /Treg比率)。如圖 62B 中所示，TY21580亦相較於同型對照顯著增加TIL中之CD8+ T/Treg比率(針對TY21580 8.0%相對於針對同型對照0.6%，P ＜0.01)。然而，TY21580不具有對外周淋巴細胞中之CD8+ T/Treg比率之顯著影響。於PBMC中，於TY21580處理後CD8+ T/Treg比率為5.3相對於於同型對照處理後6.3 (P ＞0.05)。於淋巴結細胞中，於TY21580處理後CD8+ T/Treg比率為4.9相對於於同型對照處理後4.7 (P ＞0.05)。
此外，來自TY21580處理組之Foxp3+ CD4+ Treg細胞中之CTLA4表現水平顯著低於TIL中之同型對照組之彼等(針對TY21580 8985.2 MFI相對於針對同型對照20948.0 MFI ；圖 63 )。然而，CTLA4表現水平於PBMC (針對TY21580 2046.7 MFI相對於針對同型對照2740.9 MFI)或淋巴結(針對TY21580 3062.0 MFI相對於針對同型對照3247.9 MFI)中不改變。TIL中之Treg細胞亦展示較外周細胞(即，PBMC及LN)中之Treg細胞高得多的CTLA4表現水平，及CTLA4表現於TY21580處理後於TIL Treg細胞中顯著較低。
一併考慮，此等結果證明TY21580展示具體而言於腫瘤細胞(即，TIL)，但是非外周細胞(即，PBMC或淋巴結細胞)中誘導Treg耗盡及增加CD8+ /Treg比率之活性。TY21580對T細胞之此等調節活性提供對TY21580之強效活體內抗腫瘤功效之機械理解。不希望受理論束縛，此等結果表明TY21580於腫瘤微環境中降低免疫抑制Treg活性且增強細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)活性以介導抗腫瘤反應。實例 19 ： TY21580 於大型建立之 H22 肝腫瘤模型中之抗腫瘤功效
為測定TY21580於大型建立之腫瘤中之抗腫瘤功效，將雌性BALB/c小鼠皮下接種小鼠H22肝癌細胞。當在約500 mm3 或約800mm3 下建立相對大腫瘤時，將小鼠用TY21580在5mg/kg下藉由一週兩次(BIW)腹膜內注射持續4個劑量處理。將同型抗體用作對照。每週兩次監測組平均腫瘤生長(圖 64A) 及不同組中之各小鼠之個別腫瘤生長(圖 64B 至 64D) 並報告為隨時間之平均腫瘤體積± SEM。
如針對組平均腫瘤生長之圖 64A 及針對個別腫瘤生長之圖 64B 至 64D 中所示，相較於同型對照抗體處理組(圖 64A 及 64B )，於兩個TY21580處理組(即，當腫瘤達到約500 mm3 之大小時開始處理之組，如圖64A 及 64C 中所述，或約800mm3 時開始處理之組，如圖64A 及 64D 中所述)中觀察到建立之大H22腫瘤之顯著消退。此等結果證明TY21580於抑制大型建立之腫瘤中之顯著功效。實例 20 ：掩蔽肽長度對掩蔽效率之影響
選擇兩種可活化抗體TY22402及TY22404測試掩蔽效率對掩蔽肽長度之依賴性以適合其特定應用。藉由自N端移除殘基，剩下第一半胱胺酸殘基之前之僅5或2個殘基於掩蔽肽中將TY22402及TY22404之掩蔽肽自21個殘基縮短至16或12個殘基(表 26 )。使此等可活化抗體表現及自哺乳動物細胞純化及如實例8中所述量測其掩蔽效率並與親本抗體TY21580比較。來自兩個實驗之結果指示可使用在第一半胱胺酸殘基之前之具有範圍自2至11個殘基之長度之不同掩蔽肽製備此等可活化抗體以調節抗體掩蔽效率(圖 65A 及 65B ；表 27 及 28 )。此似乎表明核心掩蔽基序含有半胱胺酸環路及其緊鄰殘基，且足夠維持掩蔽效率。表 26 ：具有變化肽長度之掩蔽肽
樣品ID： 掩蔽+裂解肽序列(未加底線)：
TY22402 EVGSYIVHHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 197)
TY22775 EVGHSDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 198)
TY22864 EDCDAFYPYCDSSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 199)
TY22404 EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 200)
TY22776 EVGSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 201)
TY22871 EDCVPYYYACAYSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 202)
表 27 顯示圖 65A 中之抗體之掩蔽效率。表28顯示圖 65B 中之抗體之掩蔽效率。表 27 ：具有變化掩蔽肽長度之抗體之掩蔽效率
樣品ID EC50(nM) 掩蔽效率
TY21580 0.2223
TY22402 53.99 243
TY22775 37.31 168
TY22404 68.40 308
TY22776 65.90 296
表 28 ：具有變化掩蔽肽長度之抗體之掩蔽效率
樣品ID EC50(nM) 掩蔽效率
TY21580 0.2125
TY22402 115.6 554
TY22864 117 550
TY22404 121.5 572
TY22871 88.09 414
實例 21 ：裂解肽長度對掩蔽效率之影響
選擇TY22404測試掩蔽效率對裂解肽長度之依賴性以適合其特定應用。將TY22404之裂解肽縮短至各種長度(表 29 )。使可活化抗體表現及自哺乳動物細胞純化，及如實例8中所述量測其掩蔽效率並與親本抗體TY21580比較。如圖 66 及表 30 中所示，結果指示可使用具有範圍自5至20個殘基之其長度之不同裂解肽製備此等可活化抗體以調節抗體掩蔽效率。掩蔽與裂解基序之間之強相關性係驚人的；當肽長度自41截短至17個胺基酸時，TY23291之掩蔽效率相較於TY22404增加至少30倍。此等結果指示可設計及工程改造若干新穎掩蔽肽。此外，可進一步探索掩蔽與裂解基序之間之偶聯。表 29 ：具有變化裂解肽長度之掩蔽肽
樣品ID 肽名稱 掩蔽+ 裂解肽序列( 未加底線) ：
TY22404 EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAGGGGTPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 200)
TY23286 EVGSYPNPSSDCVPYYYACAYSGRSAPLGLA (SEQ ID NO: 209)
TY23289 EDCVPYYYACAYSGRSAPLGLA (SEQ ID NO: 210)
TY23280 EDCVPYYYACAYSGRSA (SEQ ID NO: 211)
TY23291 EDCVPYYYACAYPLGLA (SEQ ID NO: 212)
表 30 顯示圖 66 中之抗體之掩蔽效率。表 30 ：具有變化裂解肽長度之抗體之掩蔽效率
樣品ID EC50 (nM) 掩蔽效率
TY21580 0.2505
TY22404 117.4 469
TY23286 1496 5972
TY23289 133.2 532
TY23280 2952 11784
TY23291 3656 14595
圖 1A 至 B 顯示結合至CTLA4之抗體，如由ELISA所測定。圖 1A 顯示指定抗體結合至人類CTLA4。圖 1B 顯示指定抗體結合至犬CTLA4。
圖 2 顯示指定抗體、同型對照或媒劑(PBSA)與短暫過度表現空載體(pIRES)之HEK293F細胞或小鼠或人類CTLA4之物種交叉反應性，如由流動式細胞測量術所測定。
圖 3 顯示抗體TY21580或同型對照結合至經活化人類、猴及小鼠T細胞，如由流動式細胞測量術所測定。
圖 4A 至 C 顯示對CTLA4特異性之抗體，如由流動式細胞測量術所測定。圖 4A 顯示指定抗體或同型對照至短暫過度表現人類PD-1、CTLA4、LAG3、TIM3、B7-H3或空載體(293F)之HEK293F細胞之結合。圖 4B 顯示指定抗體、同型對照或媒劑(PBSA)至短暫過度表現人類CD95、CD120a、OX40、CD40、CTLA4或空載體(pIRES)之HEK293F細胞之結合。圖 4C 顯示指定抗體、同型對照或媒劑(PBSA)至短暫過度表現人類TIM3、CTLA4、PD-L1、LAG3、BTLA、VISTA、PD-L2、ICOS、B7-H4、PD-1、B7-H3或空載體(pIRES)之HEK293F細胞之結合。
圖 5A 至 D 顯示抗體之阻斷能力，如由ELISA所測定。圖 5A 顯示抗體TY21687、TY21689、TY21680及TY21691阻斷人類CD80結合至人類CTLA4之能力。圖 5B 顯示抗體TAC2114、TY21585、TY21587、TY21588、TY21589、TY21580及TY21591阻斷人類CD80結合至人類CTLA4之能力。圖 5C 顯示抗體TY21687、TY21689、TY21680及TY21691阻斷人類CD86結合至人類CTLA4之能力。圖 5D 顯示抗體TAC2114、TY21585、TY21587、TY21588、TY21589、TY21580及TY21591阻斷人類CD86結合至人類CTLA4之能力。
圖 6A 至 B 顯示抗體之阻斷能力，如由FACS所測定。圖 6A 顯示指定抗體、同型對照或媒劑(PBSA)阻斷人類CD80結合至短暫過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞之能力。圖 6B 顯示指定抗體、同型對照或媒劑(PBSA)阻斷人類CD86結合至短暫過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞之能力。
圖 7 顯示指定抗體結合FcRn之能力，如由表面電漿子共振(SPR)所測定。
圖 8A 至 B 顯示人類外周血單核細胞(PBMC)經抗體TY21580或同型對照活化，如由ELISA所量測。圖 8A 顯示對來自用抗體TY21580或同型對照處理之經CD3刺激之人類PBMC之IL-2分泌的影響。圖 8B 顯示對來自用抗體TY21580或同型對照處理之經CD3刺激之人類PBMC之IFNγ分泌的影響。
圖 9 顯示在抗CD3抗體之存在或不存在下，對來自用抗體TY21580處理之人類PBMC之IL-2分泌的影響，如由ELISA所量測。
圖 10 顯示對來自用抗體TY21580、同型對照或抗PD-1抗體處理之與異源CD4+ T細胞共培養之人類樹突狀細胞(DC)之IFNγ分泌的影響，如由ELISA所量測。
圖 11A 至 B 顯示示例性抗體對短暫過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性，如由乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢定所測定。圖 11A 顯示抗體TY21580或同型對照對短暫過度表現人類CTLA4且與人類自然殺手(NK)細胞培育之HEK293F細胞之ADCC活性。圖 11B 顯示抗體TY21580、TAC2114或同型對照對短暫過度表現人類CTLA4且與人類NK細胞培育之HEK293F細胞之ADCC活性。
圖 12A 至 B 顯示示例性抗體對自兩個供體單離之人類Treg之ADCC活性，如由鈣黃綠素(calcein)-AM釋放檢定所測定。圖 12A 顯示抗體TY21580、TAC2114或同型對照對與人類NK細胞培育之人類Treg細胞(來自供體#96)之ADCC活性。圖 12B 顯示抗體TY21580、TAC2114或同型對照對與人類NK細胞培育之人類Treg細胞(來自供體#12)之ADCC活性。
圖 13 顯示抗體TY21580或同型對照對短暫過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性，如由鈣黃綠素-AM釋放檢定所測定。
圖 14 顯示抗體TY21580或同型對照對經活化人類CD4+ T細胞之CDC活性，如由鈣黃綠素-AM釋放檢定所測定。
圖 15A 至 C 顯示抗體TY21580或同型對照於MC38同源小鼠結腸直腸腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。圖 15A 顯示荷MC38建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。圖 15B 顯示所測試之各組之個別腫瘤生長。圖 15C 顯示再激發研究，該等研究指示對MC3腫瘤細胞之免疫之持久記憶。
圖 16 顯示抗體TY21580或同型對照於CT26同源小鼠結腸直腸腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。顯示荷CT26建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。
圖 17 顯示抗體TY21586、TY21580或同型對照於H22同源小鼠肝腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。顯示荷H22建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。
圖 18 顯示抗體TY21580、TY21687、TY21687、TY21691及TY21580或同型對照於路易士同源小鼠肺腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。顯示荷路易士建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。
圖 19 顯示抗體TY21580或同型對照於PAN02同源小鼠胰腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。顯示荷PAN02建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。
圖 20A 至 B 顯示抗體TY21580、抗CD137抗體或同型對照，以及TY21580 +抗CD137組合療法於3LL同源小鼠肺腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。圖 20A 顯示荷3LL建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。圖 20B 顯示所測試之各組之個別腫瘤生長曲線。
圖 21 顯示再激發研究，該研究指示對H22小鼠肝腫瘤細胞之免疫之持久記憶。將於TY21580處理組中具有完全反應之小鼠在第59天在相反腹脇部用H22腫瘤細胞皮下再激發。亦同時將初始小鼠用H22腫瘤細胞接種。
圖 22 顯示在10 mg/kg之濃度下對雌性BALB/c小鼠靜脈內投與之指定抗體之血液濃度的時間過程，如由ELISA所測定。
圖 23 顯示於食蟹獼猴中在10 mg/kg之濃度下靜脈內投與之指定抗體之血液濃度的時間過程，如由ELISA所測定。
圖 24 顯示於食蟹獼猴中在10 mg/kg之濃度下靜脈內投與之指定抗體之血液濃度相較於此等猴中之抗藥物抗體(ADA)之出現的時間過程，如由ELISA所測定。
圖 25A 至 B 顯示於重複腹膜內投與抗體TY21580或媒劑對照後雄性及雌性BALB/c小鼠之平均脾重量。圖 25A 顯示於第1、4、7及11天重複腹膜內投與抗體TY21580或媒劑對照後雄性BALB/c小鼠之平均脾重量。圖 25B 顯示於第1、4、7及11天重複腹膜內投與抗體TY21580或媒劑對照後雌性BALB/c小鼠之平均脾重量。
圖 26 顯示於第1、4、7及11天重複腹膜內投與抗體TY21580或媒劑對照後BALB/c小鼠之組織病理學。
圖 27A 至 B 顯示示例性抗體於高濃度下儲存後之穩定性。圖 27A 顯示抗體TY21586於＞100 mg/mL下儲存後之尺寸排阻層析法(SEC)譜。圖 27B 顯示抗體TY21580於＞100 mg/mL下儲存後之SEC譜。
圖 28 顯示示例性抗體在加速應力條件下之SEC譜。
圖 29 顯示自阻斷肽使用在酵母表面上展示之抗CTLA4抗體之Fab片段之選擇過程的示意圖。
圖 30 顯示自阻斷肽使用在酵母表面上展示之抗CTLA4抗體之scFv片段之選擇過程的示意圖。
圖 31A 至 B 顯示靶向酵母上之CTLA4之Fab及scFv之功能展示，如由流動式細胞測量術所測定。圖 31A 顯示靶向酵母表面上之CTLA4之Fab之功能展示。圖 31B 顯示靶向酵母表面上之CTLA4之scFv之功能展示。
圖 32 顯示靶向人類CTLA4之可活化抗體之示例性選擇過程。使展示融合蛋白之酵母庫經歷若干輪基於FACS之篩選。
圖 33A 至 B 顯示示例性CTLA4可活化抗體純系之CTLA4結合親和力，如由流動式細胞測量術所測定。圖 33A 顯示以scFv形式之CTLA4可活化抗體純系(包括具有完整掩蔽肽或具有經TEV蛋白酶裂解之掩蔽肽之CTLA4可活化抗體純系B13287)相較於不具有掩蔽肽之靶抗體之scFv片段之結合親和力。圖 33B 顯示以Fab形式之CTLA4可活化抗體純系(包括具有完整掩蔽肽或具有經TEV蛋白酶裂解之掩蔽肽之CTLA4可活化抗體純系B13189)相較於不具有掩蔽肽之靶抗體之Fab片段之CTLA4結合親和力。
圖 34A 至 B 顯示示例性CTLA4可活化抗體TY22401、TY22403、TY22402及TY22404相較於親本抗體TY21580之掩蔽效率。圖 34A 顯示指定可活化抗體相較於親本抗體TY21580之締合及解離曲線，如由ForteBio System所測定。圖 34B 顯示可活化抗體相較於親本抗體TY21580之相對結合率之圖。
圖 35A 至 B 顯示示例性CTLA4可活化抗體對重組人類CTLA4-Fc之掩蔽效率，如由ELISA所測定。圖 35A 顯示第一批ELISA資料，該資料指示CTLA4可活化抗體TY22401、TY22402、TY22403、TY22404相較於親本抗體TY21580結合至重組人類CTLA4-Fc。圖 35B 顯示CTLA4可活化抗體TY22563、TY22564、TY22565、TY22566相較於親本抗體TY21580結合至重組人類CTLA4-Fc。
圖 36A 至 B 顯示在移除掩蔽肽後CTLA4可活化抗體TY22404之活性。圖 36A 顯示未處理、用蛋白酶uPA處理或用蛋白酶MMP-9之5或10個單位處理之可活化抗體TY22404之SDS-PAGE結果。圖 36B 顯示未處理、用蛋白酶uPA處理或用蛋白酶MMP-9處理之可活化抗體TY22404相較於親本抗體TY21580之結合，由ELISA所測定。
圖 37A 至 C 顯示示例性可活化抗體在加速應力條件下之尺寸排阻層析法(SEC)譜。圖 37A 顯示可活化抗體TY22402於六個凍熔循環後相較於對照條件之SEC譜。圖 37B 顯示可活化抗體TY22402於50℃下7天後相較於對照條件之SEC譜。圖 37C 顯示示例性可活化抗體於50℃下7天後、於40℃下儲存多達28天後、或於六個凍熔循環後相較於對照條件之SEC主峰面積百分比。
圖 38 顯示可活化抗體TY22401及TY22402於約8 mg/mL或＞150 mg/mL下儲存後之SEC主峰面積百分比。
圖 39 顯示未經處理之可活化抗體TY21580、TY22401、TY22402及TY22566在pH 3.7下培育30分鐘，或在pH 3.7下培育1小時之掩蔽效率，如由ForteBio System所測定。
圖 40A 至 B 顯示人類外周血單核細胞(PBMC)藉由同型對照抗體、親本抗體TY21580或示例性CTLA4可活化抗體TY22401、TY22402或TY22404之活化，如由ELISA所量測。圖 40A 顯示對來自用同型對照抗體、親本抗體TY21580及示例性CTLA4可活化抗體TY22401、TY22402或TY22404刺激之CD3引發之人類PBMC之IL-2分泌的影響。圖 40B 顯示對來自用同型對照抗體、親本抗體TY21580及示例性CTLA4可活化抗體TY22401、TY22402或TY22404刺激之CD3引發之人類PBMC之IFNγ分泌的影響。
圖 41 顯示同型對照抗體、親本抗體TY21580或示例性可活化抗體TY22401、TY21580或TY22404對短暫過度表現人類CTLA4之HEK293F細胞之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性，如由ADCC報告基因檢定所測定。
圖 42A 至 B 顯示親本抗體TY21580、同型對照抗體或示例性CTLA4可活化抗體TY22401、TY22402或TY22566於MC38同源小鼠結腸直腸腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。圖 42A 顯示荷MC38建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。圖 42B 顯示用TY21580、TY22401、TY22402及TY22566處理之組之個別腫瘤生長曲線。
圖 43 顯示同型對照抗體、親本抗體TY21580或三種可活化抗體中之一者於CT26同源小鼠結腸直腸腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。顯示荷CT26建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。
圖 44 顯示同型對照抗體、親本抗體TY21580或三種可活化抗體中之一者於H22同源小鼠肝腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。顯示荷H22建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。
圖 45A 至 B 顯示親本抗體TY21580、同型對照抗體及示例性可活化抗體TY22401、TY22402或TY22566於3LL同源小鼠肺腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。圖 45A 顯示荷3LL建立之腫瘤之雌性C57BL/6小鼠之不同處理組之腫瘤生長曲線。數據點表示組平均值；誤差線表示SEM。圖 45B 顯示用TY21580、TY22401、TY22402及TY22566處理之組之個別腫瘤生長曲線。
圖 46A 至 C 顯示在10 mg/kg之濃度下對雌性BALB/c小鼠靜脈內投與之試驗品(TA)之血液濃度的時間過程，如由ELISA所測定。圖 46A 顯示在10 mg/kg之濃度下對雌性BALB/c小鼠靜脈內投與之可活化抗體TY22401之血液濃度相較於親本抗體TY21580的時間過程。圖 46B 顯示在10 mg/kg之濃度下對雌性BALB/c小鼠靜脈內投與之可活化抗體TY22402之血液濃度相較於親本抗體TY21580的時間過程。圖 46C 顯示在10 mg/kg之濃度下對雌性BALB/c小鼠靜脈內投與之可活化抗體TY22404之血液濃度相較於親本抗體TY21580的時間過程。
圖 47 顯示同型對照抗體、親本抗體TY21580及示例性可活化抗體TY22566、TY22401及TY22402使用NOD小鼠模型之重複給藥毒性。針對各處理組顯示20天內之存活率百分比。
圖 48A 至 C 顯示於重複腹膜內投與指定可活化抗體後BALB/c小鼠之平均脾重量。圖 48A 顯示於第1、4、7及11天重複腹膜內投與可活化抗體TY22402、親本抗體TY21580或同型對照後BALB/c小鼠之平均脾重量。圖 48B 顯示於第1、4、7及11天重複腹膜內投與可活化抗體TY22566、親本抗體TY21580或同型對照後BALB/c小鼠之平均脾重量。圖 48C 顯示於第1、4、7及11天重複腹膜內投與可活化抗體TY22401、親本抗體TY21580或同型對照後BALB/c小鼠之平均脾重量。
圖 49 顯示指定可活化抗體於50℃下7天後相較於對照條件之尺寸排阻層析法(SEC)譜。
圖 50 顯示指定可活化抗體於40℃下儲存7、14、21或28天後相較於對照條件之尺寸排阻層析法(SEC)譜。
圖 51 顯示指定可活化抗體於六個凍熔循環後相較於對照條件之尺寸排阻層析法(SEC)譜。
圖 52 顯示指定可活化抗體於＞115 mg/mL下儲存後之SEC主峰比率百分比。
圖 53 顯示穩定性資料之概述。
圖 54 描述人類及小鼠CTLA4之一部分與接觸殘基之多序列比對，該接觸殘基定位在人類CTLA4與CD80、CD86或伊匹單抗中之一者之間(基於兩個晶體結構)。接觸胺基酸係呈灰色陰影，關鍵接觸胺基酸係於框中，二聚體介面胺基酸係用點指示，及小鼠與人類CTLA4之間不同之胺基酸加底線並加粗。所示序列自頂部至底部由SEQ ID NO: 203至208表示。
圖 55A 描述人類CTLA4與其配位體CD80之間之相互作用。圖 55B 描述人類CTLA4與其配位體CD86之間之相互作用。圖 55C 描述人類與小鼠CTLA4之間之結構比對。人類CTLA4為黑色，小鼠CTLA4為白色。
圖 56A 至 56E 描述抗原決定基定位實驗之結果，其顯示TY21580 (圖 56A )、伊匹單抗(圖 56B )、人類CD80 (圖 56C )、人類CD86 (圖 56D )及小鼠CD86 (圖 56E )對人類CTLA4、小鼠CTLA4及CTLA4突變體之結合能力(藉由流動式細胞測量術)。
圖 57A 至 57D 描述TY21580及伊匹單抗對人類CTLA4與CD80或CD86之間之受體-配位體結合阻斷之影響。圖 57A 及 57B 顯示在TY21580、伊匹單抗或同型對照抗體之連續稀釋之存在下，人類CD80 (圖 57A )或CD86 (圖 57B )對板結合之人類重組CTLA4蛋白之結合曲線，如由ELISA所量測。圖 57C 至 57D 顯示在TY21580、伊匹單抗或同型對照抗體之連續稀釋之存在下，人類重組CTLA4蛋白對板結合之人類CD80 (圖 57C )或CD86 (圖 57D )之結合曲線，如由ELISA所量測。
圖 58 描述CD28路徑藉由抗CTLA4抗體之CTLA4阻斷介導之報告基因訊號活化。在經連續稀釋之抗CTLA4抗體之存在下，將Jurkat/CTLA4及aAPC/Raji細胞與作為同型對照之人類IgG1抗HEL抗體共培養。於過夜培育後用Bio-Glo螢光素酶受質量測發光信號及將相對螢光素酶單位(RLU)對空白對照標準化。將結果表示為平均RLU倍數± SEM。一式三份進行實驗。註釋：自分析排除TY21580之最高濃度(500 μg/mL)之數據點，同時擬合曲線，因為在此點處觀察到明顯鉤效應。
圖 59 描述藉由抗CTLA4抗體之ADCC報告基因訊號活化。在經連續稀釋之抗CTLA4抗體之存在下，將Jurkat/NFAT-Luc/CD16細胞及HEK293F/hCTLA4細胞與作為同型對照之人類IgG1抗HEL抗體共培養。於6小時培育後用ONE-Glo螢光素酶受質量測發光信號。將相對螢光素酶單位(RLU)對空白對照標準化，及將結果表示為平均RLU ± SEM。一式三份進行實驗。
圖 60A 及 60B 描述用抗CTLA4抗體處理之荷MC38腫瘤小鼠之腫瘤生長曲線。圖 60A 描述用同型對照抗體(1 mg/kg BIW)、TY21580 (1 mg/kg或0.2 mg/kg BIW)或伊匹單抗(1 mg/kg或0.2 mg/kg BIW)處理之荷MC38腫瘤小鼠中隨時間之組平均腫瘤生長。數據點表示平均值；誤差線表示平均標準誤差(SEM)。圖 60B 描述用同型對照抗體(組-1)、TY21580 (組-2及組-3)或伊匹單抗(組-4及組-5)處理之個別荷MC38腫瘤小鼠中隨時間之腫瘤生長。
圖 61A 及 61B 描述TY21580及伊匹單抗對來自用TY21580或伊匹單抗處理之小鼠之皮下MC38腫瘤中之腫瘤內調節T (Treg)細胞水平的影響。圖 61A 顯示自腫瘤單離之CD4+ T細胞中之T調節(Treg)細胞(CD4+ CD25+)之百分比。圖 61B 描述自腫瘤單離之CD4+ T細胞亞群中之細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)與Treg細胞之比率(即，CD8+/Treg比率)。各數據點表示來自一種小鼠之資料。利用Prism 7 (GraphPad軟體)完成統計分析。使用多重T試驗計算P -值。註釋：P ＞0.05；**：0.001＜P ＜0.01，***：P ＜0.001。
圖 62A 及 62B 描述TY21580及伊匹單抗對來自用TY21580或伊匹單抗處理之小鼠之皮下CT26腫瘤中之腫瘤內調節T (Treg)細胞水平的影響。圖 62A 顯示自腫瘤單離之CD4+ T細胞中之T調節(Treg)細胞(CD4+ CD25+ )之百分比。圖 62B 描述自腫瘤單離之CD4+ T細胞亞群中之細胞毒性T淋巴細胞(CD8+ T細胞)與Treg細胞之比率(即，CD8+ /Treg比率)。各數據點表示來自一種小鼠之數據。利用Prism 7 (GraphPad軟體)完成統計分析。使用多重T試驗計算P -值。註釋：P ＞0.05；**：0.001＜P ＜0.01，***：P ＜0.001。
圖 63 描述在用同型對照抗體或TY21580處理之荷CT26腫瘤小鼠中之FOXP3+ CD4+ Treg細胞上藉由平均螢光強度(MFI)量測之CTLA4表現水平。各數據點表示來自一種小鼠之數據。利用Prism 7 (GraphPad軟體)完成統計分析。使用多重T試驗計算P -值。註釋：P ＞0.05；**：0.001＜P ＜0.01，***：P ＜0.001。
圖 64A 至 64D 描述用TY21580或同型對照抗體處理之荷小鼠H22肝癌小鼠之腫瘤生長曲線。圖 64A 描述當腫瘤達到500 mm3 或800 mm3 時開始用TY21580處理，或當腫瘤達到500 mm3 時開始用同型對照抗體處理之組平均腫瘤生長。數據點表示來自8隻小鼠/組之腫瘤之平均值，誤差線表示平均標準誤差(SEM)。圖 64B 至 64D 描述各小鼠之個別腫瘤生長。圖 64B 描述用同型對照抗體處理之小鼠之腫瘤生長，其中當腫瘤達到500 mm3 時開始處理；圖 64C 描述用TY21580處理之小鼠之腫瘤生長，其中當腫瘤達到500 mm3 時開始處理；圖 64D 描述用TY21580處理之小鼠之腫瘤生長，當腫瘤達到800 mm3 時開始處理。
圖 65A 及 65B 描述含有可變長度之掩蔽肽之示例性可活化抗體相較於親本抗體TY21580之掩蔽效率。使用基於ELISA之方法測定掩蔽效率。圖 65A 及 65B 表示為測試各種可活化抗CTLA4抗體使用相同實驗方法建立之兩個實驗。
圖 66 描述含有變化長度之裂解肽之示例性可活化抗體相較於親本抗體TY21580之掩蔽效率。使用基於ELISA之方法測定掩蔽效率。
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<220>
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<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> 變異體
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<220>
<221> 變異體
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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Claims (27)

  1. 一種抗CTLA4抗體，其中該抗體包含：a)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之HVR-L3；b)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列之HVR-L3；c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之HVR-L3；d)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列之HVR-L3；或 e)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H1，包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之HVR-H2，包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之HVR-H3，包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1，包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之HVR-L2，及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列之HVR-L3。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體以約350nM或更低之解離常數(KD)結合至人類CTLA4、食蟹獼猴CTLA4、小鼠CTLA4、大鼠CTLA4及狗CTLA4。
  3. 如請求項2之抗體，其中該KD藉由表面電漿子共振(SPR)量測。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗CTLA4抗體之結合誘導對表現CTLA4之人類細胞或人類Treg細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，其中該抗CTLA4抗體之ADCC活性高於伊匹單抗(ipilimumab)之ADCC活性。
  5. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中(a)該抗體特異性結合至包含人類CTLA4之胺基酸殘基Y105及L106但是不包含殘基I108之抗原決定基，其中該等胺基酸殘基之編號係根據SEQ ID NO：207；及/或(b)於CD80及/或CD86係板結合且CTLA4係於溶液中或呈現在細胞表面上之檢定中，該抗CTLA4抗體阻斷CD80及/或CD86結合至人類CTLA4具有IC50高於伊匹單抗之IC50。
  6. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列之輕鏈可變區；b)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列之輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列之輕鏈可變區；d)包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列之輕鏈可變區；或e)包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  7. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體為人類抗體。
  8. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體為選自由Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段組成之群之抗體片段。
  9. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。
  10. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，該HVR-H1包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該HVR-H2包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列，該HVR-H3包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列，該HVR-L1包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列，該HVR-L2包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列，且該HVR-L3包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，該HVR-H1包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，該HVR-H2包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，該HVR-H3包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列，該HVR-L1包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列，該HVR-L2包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列，且該HVR-L3包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列。
  12. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，該HVR-H1包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，該HVR-H2包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，該HVR-H3包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，該HVR-L1包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列，該HVR-L2包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列，且該HVR-L3包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列。
  13. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，該HVR-H1包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該HVR-H2包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列，該HVR-H3包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列，該HVR-L1包含SEQ ID NO： 61之胺基酸序列，該HVR-L2包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列，且該HVR-L3包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列。
  14. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，該HVR-H1包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，該HVR-H2包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列，該HVR-H3包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列，該HVR-L1包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列，該HVR-L2包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列，且該HVR-L3包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列。
  15. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列。
  16. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列。
  17. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列。
  18. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈 可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列。
  20. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包含人類IgG1 Fc區，該人類IgG1 Fc區包含增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之一或多個突變。
  21. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至20中任一項之抗體。
  22. 一種多核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO：108至133組成之群之序列。
  23. 一種載體，其包含如請求項21或請求項22之多核苷酸。
  24. 一種宿主細胞，其包含如請求項21或22之多核苷酸或如請求項23之載體。
  25. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  26. 一種如請求項1至20中任一項之抗體或如請求項25之醫藥組合物之用途，其係用於製備於有需要之個體治療癌症或延遲癌症進展之藥劑。
  27. 一種如請求項1至20中任一項之抗體或如請求項25之醫藥組合物之用途，其係用於製備減少有需要個體中實體腫瘤大小之藥劑。
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