TWI822726B - Ｎｙｅｓｏ ｔ細胞受體 - Google Patents
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Abstract
本發明關於特異於NY-ESO-1/LAGE-1之經分離之T細胞受體(TCR)和包含該TCR之功能部分的多肽。本發明進一步涉及多價TCR複合物、編碼TCR之核酸、表現該TCR之細胞和包含該TCR之醫藥組成物。本發明亦關於該TCR於作為藥物之用途，特別是該TCR於治療癌症之用途。
Description
本發明關於特異於NY-ESO-1/LAGE-1之經分離的T細胞受體(TCR)和包含該TCR之功能部分的多肽。本發明進一步涉及多價TCR複合物、編碼TCR之核酸、表現該TCR之細胞和包含該TCR之醫藥組成物。本發明亦關於該TCR於作為藥物之用途，特別是該TCR於治療癌症之用途。
形成由細胞介導之免疫系統的一部分之T淋巴細胞(或T細胞)在根除病原體中起主要作用。T細胞在胸腺中發展並在其表面上表現T細胞受體分子，該T細胞受體分子允許識別表現在有核細胞上之主要組織相容性複合物(MHC)分子所呈遞之肽(稱為抗原呈遞)。源自病原體之抗原，即，由MHC分子呈遞之外來抗原將引發強大之T細胞反應，然而由於在該等T細胞發展期間胸腺中之自身抗原特異性T細胞的負選擇，自身抗原通常不會導致T細胞反應。該免疫系統可經由有效之細胞因子釋出和T細胞之細胞性細胞毒性機制而因此區分呈現外來抗原或自身抗原之有核細胞並特異地靶向和根除受感染之細胞。
免疫系統之力量已被公認為是未來癌症療法之大有可為的工具。在過去的十年中，研究已開始藉由使用過繼性細胞轉移療法(ACT)來利用該T細胞之獨特性質，該過繼性細胞轉移療法涉及投予源自患者之在體外擴增的淋巴細胞。ACT為用於治療癌症之有吸引力的概念，因為它不需要患者之免疫能力，且該轉移之淋巴細胞的特異性可靶向非突變而因此為免疫原性差之腫瘤抗原，該免疫原性差之腫瘤抗原通常不能有效地觸發自體T細胞反應。儘管ACT已被證明為治療各種類型癌症之大有可為的方法，其作為臨床治療之廣泛應用已因需要客製分離和表徵來自各患者之腫瘤特異性T細胞(此一過程不僅困難且費時，亦時常無法產生高親留力之T細胞)而受阻礙(Xue et al. Clin. Exp. Immunol. 2005 Feb; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 2009 Nov; 20(11): 1240-1248)。
將腫瘤抗原特異性T細胞受體(TCR)基因轉移入原代T細胞可以克服ACT目前的某些限制，因其可允許快速產生具有確定之抗原特異性的腫瘤反應性T淋巴細胞，即使是在免疫功能低下之患者中。然而，鑑定帶有特異地識別腫瘤抗原之TCR且在體內顯示出所需之抗腫瘤作用的合適T細胞選殖株仍為正在進行之研究的主題。考慮到2012年全球出現之新癌症病例約有1410萬，而目前癌症佔全球人類死亡原因之約14.6%，因此迫切需要新穎且有效之治療選項。本發明之目的是滿足上述需求。
NY-ESO-1和LAGE-1為屬於癌症/睪丸抗原一族的重要免疫治療靶抗原。癌症/睪丸抗原表現在睪丸之各種惡性腫瘤和生殖細胞中，但不表現在其他成體組織中。
因此，提供特異於NY-ESO-1/LAGE-1之TCR或其衍生物是特別理想的。
本發明之目的和綜述
為了滿足這些需要，本發明之目的係提供特異於NY-ESO-1/LAGE-1之經分離的T細胞受體(TCR)。特別地，該TCR特異地識別胺基酸序列SEQ ID NO：1或其片段。更特別地，該TCR特異地識別胺基酸序列SEQ ID NO：2或其片段。甚至更特別地，該TCR特異地識別胺基酸序列SEQ ID NO：3或其片段。
特別地，當抗原性靶的NY-ESO-1/LAGE-1呈遞在靶細胞之MHC分子(具體地說，MHC-I分子，特別是HLA-A分子，較佳為HLA-A*02，且具體地說，由等位基因HLA-A*02:01編碼之HLA-A2分子)上時，本發明之TCR可識別該抗原性靶的NY-ESO-1/LAGE-1(該T細胞或TCR據說是“侷限”於特定之MHC分子)。亦可設想的是，本發明之TCR識別呈現在其他HLA-A*02等位基因上之抗原性靶的。
於一特定之實施態樣中，該TCR識別SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HLA-A*02結合型。於特定之實施態樣中，該TCR特異地識別SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HLA-A*02:01結合型。該TCR對NY-ESO具有高度特異性且顯示出與其他肽類之交叉反應性低。
本發明特別關於具有TCRα鏈之TCR，該TCRα鏈包含互補決定區3(CDR3)，其中該CDR3包含SEQ ID NO：6之序列。該TCR可具有TCRβ鏈，該TCRβ鏈包含CDR3，其中該CDR3包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
更具體地說，根據本發明之TCR可包含
-TCRα鏈，該TCRα鏈包含CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列；和
-TCRβ鏈，該TCRβ鏈包含CDR1、CDR2和CDR3，該CDR1具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
再更具體地說，本發明關於包含可變TCRα區和可變TCRβ區之經分離之TCR，該可變TCRα區具有與SEQ ID NO：10至少80%同一性之胺基酸序列且該可變TCRβ區具有與SEQ ID NO：11至少80%同一性之胺基酸序列。特別地，該TCR可包含具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的可變TCRα區和具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的可變TCRβ區。
該經分離之TCR包含TCRα鏈和TCRβ鏈，該TCRα鏈具有與SEQ ID NO：12至少80%同一性之胺基酸序列且該TCRβ鏈具有與SEQ ID NO：13至少80%同一性之胺基酸序列。特別地，該經分離之TCR可包含具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的TCRα鏈及具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的TCRβ鏈。
因此，該TCR可包含TCRα鏈和TCRβ鏈，其中
-該可變TCRα區具有與SEQ ID NO：10至少80%同一性之胺基酸序列且包含具有SEQ ID NO：6中所示之胺基酸序列的CDR3區；
-該可變TCRβ區具有與SEQ ID NO：11至少80%同一性之胺基酸序列且包含具有SEQ ID NO：9中所示之胺基酸序列的CDR3區。
根據本發明之TCR為經分離和/或純化的且可為可溶性或與膜結合的。
於一些實施態樣中，該TCR之胺基酸序列可包含一或多個表型沉默之取代。此外，本發明之TCR可為經標記的。有用之標記為本技藝所已知且可使用常規方法，可選擇地經由各種長度之連接子與TCR或TCR變體偶聯。術語“標記”或“標記基團”係指任何可檢測之標記。此外，或者，該胺基酸序列可經修飾以包含治療劑或藥物動力學修飾部分。該治療劑可選自由下列所組成之群組：免疫效應分子、細胞毒性劑和放射核素(radionuclide)。該免疫效應分子可為，例如細胞因子。藥物動力學修飾部分可為至少一個聚乙二醇重複單位、至少一個二醇基團、至少一個唾液酸基團或彼等之組合。
該TCR，尤其是可溶形式之根據本發明的TCR，可藉由附接另外之功能部分被加以修飾，該另外之功能部分為，例如用於降低免疫原性、增加流體動力學尺寸(溶液中之尺寸)溶解度和/或穩定性(例如藉由增強之對蛋白水解降解之保護)和/或延長血清半衰期。其他有用之功能部分和修飾包括可用於切斷或開啟患者體內攜帶本發明之TCR的效應宿主細胞之“自殺”或“安全開關”。
本發明亦設想具有改變之糖基化模式的TCR。亦可想像將藥物或治療實體(諸如小分子化合物)添加至該TCR，特別是可溶形式之本發明TCR。
該TCR，特別是可溶形式之本發明TCR可經另外修飾以引入有助於鑑定、追蹤、純化和/或分離該對應分子之額外結構域(標籤)。
於一些實施態樣中，該TCR為單鏈型，其中該TCRα鏈和TCRβ鏈係藉由連接子序列連接。
本發明之另一態樣關於包含如本文所描述之TCR的功能部分之肽，其中該功能部分包含SEQ ID NO：6和9之胺基酸序列中一者。
於特定之實施態樣中，該功能部分包含TCRα可變鏈和/或TCRβ可變鏈。
特定之實施態樣係關於包含至少二個如本文所描述之TCR的多價TCR複合物。於更特定之實施態樣中，至少有一個該TCR係與治療劑結合。
某些實施態樣係關於表現在效應細胞，特別是免疫效應細胞上之為功能性多肽或功能性多價多肽形式的本發明TCR，其中當表現該TCR之上述效應細胞與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合時可誘導IFN-γ分泌。
由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合時所誘導之IFN-γ分泌可多於3 ng/ml，諸如多於4 ng/ml，多於5 ng/ml，更佳為多於6 ng/ml，最佳為多於7 ng/ml。若與不相關之肽(例如SEQ ID NO：15或16)的HLA-A*02結合型結合相比較，當與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合時，該IFN-γ分泌可高出至少4倍。
某些實施態樣係關於根據本發明之經分離的TCR、多肽或多價TCR複合物，其中藉由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所誘導之MIP-1α和MIP-1β分泌係低於預定閾值。
藉由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所誘導之MIP-1α分泌可能少於1 ng/ml，較佳為少於0.8 ng/ml，更佳為少於0.7 ng/ml。
藉由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所誘導之MIP-1β分泌可能少於3 ng/ml，較佳為少於2.8 ng/ml，更佳為少於2.5 ng/ml。
MIP-1α和MIP-1β分泌量少是有利的，因為趨化因子(諸如MIP-1α和MIP-1β(亦分別稱為CLL3和CLL4)，特別是MIP-1α)已知可促進腫瘤進展(Liao et al. Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015); Silva et al. Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017))。
細胞因子和趨化因子釋出(諸如IFN-γ分泌和MIP-1α和MIP-1β分泌)可利用固定在磁珠之T細胞抗體，藉由玻管內分析測量(Greiner et al. 2006, Blood. 2006 Dec 15;108(13):4109-17)，在該玻管內分析中，係將以ivtRNA轉染之T2細胞與表現該欲研究之TCR的富含CD8+
和/或非富含CD8+
之PBMC一起培育，該ivtRNA係編碼選自由SEQ ID NO：1至3(較佳為SEQ ID NO：3)所組成之群組的胺基酸序列中一者，或在玻管內分析中，使用裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
(SLL)肽(SEQ ID NO：3)，或源自NY-ESO-1之無關肽(例如SEQ ID NO：15或16)的T2細胞。
本發明之另一態樣係關於編碼如本文所描述之TCR或編碼如上述之多肽的核酸。
本發明之進一步態樣係關於包含如上述之本申請案之核酸的質體或載體。較佳地，該載體為適合用於轉導或轉染細胞(特別是真核細胞)之表現載體或載體。該載體可為，例如逆轉錄病毒載體，例如γ-逆轉錄病毒或慢病毒載體。
本發明之另一態樣關於表現如本文所描述之TCR的細胞。該細胞可為經分離的或非天然存在的。
本發明之另一態樣關於包含如上述之核酸或如上述之質體或載體的細胞。更具體地，該細胞可包含：
a)表現載體，其包含至少一種如上述之核酸，或
b)第一表現載體和第二表現載體，該第一表現載體包含編碼如本文所描述之TCR的α鏈之核酸且該第二表現載體包含編碼如本文所描述之TCR的β鏈之核酸。
該細胞可為外周血淋巴細胞(PBL)或外周血單核細胞(PBMC)。通常，該細胞為免疫效應細胞，特別是T細胞。其他合適之細胞類型包括γ-δ T細胞和NK樣T細胞。
另一態樣係關於特異地結合如本文所描述之TCR的一部分(其介導對NY-ESO-1/LAGE-1之特異性)的抗體或其抗原結合片段。於一特定之實施態樣中，該介導NY-ESO-1/LAGE-1特異性之TCR的一部分包含SEQ ID NO：6之α鏈的CDR3和/或SEQ ID NO：9之β鏈的CDR3。
本發明之另一態樣關於包含如本文所描述之TCR、如本文所描述之多肽、如本文所描述之多價TCR複合物、如本文所描述之核酸、如本文所描述之載體、如本文所描述之細胞、如本文所描述之抗體的醫藥組成物。
通常，該醫藥組成物包含至少一種醫藥上可接受之載體。
本發明之另一態樣關於如本文所描述之TCR、如本文所描述之多肽、如本文所描述之多價TCR複合物、如本文所描述之核酸、如本文所描述之載體、如本文所描述之細胞、如本文所描述之抗體於作為藥物(特別是用於治療癌症)之用途。該癌症可為血液學癌症或實體腫瘤。該癌症可選自由下列所組成之群組：肉瘤、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腎癌、胰臟癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、肝細胞癌瘤、頭頸癌、胃癌、子宮內膜癌、結腸直腸癌、膽管癌瘤、乳癌、膀胱癌、髓樣白血病和急性淋巴母細胞白血病。較佳地，該癌症為肉瘤或骨肉瘤。
發明詳細描述
在參考本發明之一些佳實施態樣詳細描述之前，提供下列一般定義。
如下文中說明性描述之本發明可在缺少本文未具體揭示之任何要素、限制的情況下適當地實施。
本發明將參照特定之實施態樣並參考某些附圖來描述，但本發明並不受限於該實施態樣和附圖，而是僅受申請專利範圍限制。
當本說明書和申請專利範圍中使用術語“包含”時，其並不排除其他元件。出於本發明之目的，術語“由......組成(consisting of)”被認為是術語“由......組成(comprising of)”之較佳實施態樣。若下文中群組被定義為包含至少某數量之實施態樣，其應亦被理解為揭示較佳為僅由這些實施態樣所組成之群組。
出於本發明之目的，術語“獲得”被認為是術語“可獲得的”之較佳實施態樣。若下文中，例如抗體被定義為可從特定來源獲得，其亦應被理解為揭示可從該來源獲得之抗體。
除非另外具體說明，當提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如“一(a、an)”或“該(the)”時，其包括該名詞之複數。在本發明之背景中，術語“約”或“近似”表示本技藝之技術熟習人士所理解之仍可確保所討論之特性的技術效果之準確度區間。該術語通常表示偏離所指明之數值±10%，較佳為±5%。
技術術語係憑藉本技藝之技術熟習人士之常識或代表的意義使用。若將特定含義傳達至某些術語，則術語之定義將在下文中該術語使用之背景下給予。
TCR背景
TCR係由二個不同且分開之蛋白質鏈(即，TCRα和TCRβ鏈)所組成。該TCRα鏈包含可變(V)、連接(J)和恆定(C)區。該TCRβ鏈包含可變(V)、多樣性(D)、連接(J)和恆定(C)區。TCRα和TCRβ鏈之經重排的V(D)J區均含有高變區(CDR，互補決定區)，其中該CDR3區決定該特異性抗原決定部位識別。在TCRα和TCRβ鏈二者之C-端區均含有疏水性跨膜結構域並以短的細胞質尾部結束。
通常，TCR為具有一條α鏈和一條β鏈之異二聚體。該異二聚體可與呈遞肽之MHC分子結合。
在本發明之背景下，術語“可變TCRα區”或“TCRα可變鏈”或“可變結構域”係指TCRα鏈之可變區。在本發明之背景下，術語“可變TCRβ區”或“TCRβ可變鏈”係指TCRβ鏈之可變區。
該TCR基因座和基因係使用國際免疫遺傳學(IMGT)TCR命名法(IMGT Database, www. IMGT. org; Giudicelli, V., et al., IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979; T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12-441352-8)命名。
靶的
本發明之第一態樣關於特異於NY-ESO-1/LAGE-1之經分離的T細胞受體(TCR)。
NY-ESO-1/LAGE-1屬於稱為癌症/睪丸抗原之群組。癌症/睪丸抗原係表現在各種惡性腫瘤和生殖細胞中，但不表現在其他成組織中。因此，NY-ESO-1/LAGE-1重要之免疫治療靶抗原。該編碼NY-ESO-1之人類基因被命名為CTAG1A(ENSGT00000268651)，其具有稱為CTAG1A-002和CTAG1A-201(ENST00000599837和ENST00000593606)的二種同種型，其複本命名為CTAG1B(ENSG0000184033)，該複本具有稱為CTAG1B-001和CTAG1B-002(ENST00000359887和ENST00000328435)的二種同種型。該編碼LAGE-1之人類基因被命名為CTAG2.1(ENSG0000126890)，其具有稱為CATG2.1之同種型和稱為CATG2.2之同種型(ENST0000247306和ENST0000369585)。
特別地，該TCR特異性識別胺基酸序列SEQ ID NO：1(LLMWI)或其片段。更特別地，該TCR特異性識別胺基酸序列SEQ ID NO：2(SLLMWI)或其片段。甚至更特別地，該TCR特異性識別胺基酸序列SEQ ID NO：3(SLLMWITQC)或其片段。SEQ ID NO：1至3為NY-ESO-1及LAGE-1之一部分。
通常，當抗原之肽片段係由主要組織相容性複合體(MHC)分子呈遞時其可被TCR識別。
人類白血球抗原(HLA)系統或複合物為編碼人類主要組織相容性複合物(MHC)蛋白之基因複合物。HLA-A*02為HLA-A基因座上之一種特定的第I類主要組織相容性複合物(MHC)等位基因群組。HLA-A*02:01為特異性HLA-A*02等位基因。
因此，於一特定之實施態樣中，該TCR特異性識別HLA-A*02結合型之SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
於甚至更具體之實施態樣中，TCR特異性識別HLA-A*02:01結合型之SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的胺基酸序列。
TCR對NY-ESO具有高度特異性並顯示出與其他肽(諸如SEQ ID NO：17至22所示之肽)之交叉反應性低，特別是當經過內部加工時。於一實施態樣中，該TCR基本上顯示出不與肽SEQ ID NO：17交叉反應，特別是當經過內部加工時。於一些實施態樣中，該TCR基本上顯示出與SEQ ID NO：17至22所示之肽類其中至少一者不會交叉反應性，特別是當經過內部加工時。交叉反應性可藉由如本所描述之INFγ分泌來測量。
TCR特異性序列
一些實施態樣係關於包含TCRα鏈和TCRβ鏈之經分離的TCR，其中
-該TCRα鏈包含具有SEQ ID NO：6之序列之互補決定區3(CDR3)，
-該TCRβ鏈包含具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之CDR3。
特定之實施態樣關於經分離之TCR，該TCR包含：
-包含CDR1、CDR2和CDR3之TCRα鏈，該CDR1具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO：6之序列，
-包含CDR1、CDR2和CDR3之TCRβ鏈，該CDR1具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO：9之序列。
於一些實施態樣中，該TCR包含可變TCRα區和可變TCRβ區，該可變TCRα區具有與SEQ ID NO：10至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性之胺基酸序列，且該可變TCRβ區具有與SEQ ID NO：11至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性之胺基酸序列。
較佳之實施態樣係關於包含可變TCRα區和可變TCRβ區之TCR，該TCR包含具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的可變TCRα區和具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的可變TCRβ區。
實施例中所使用之T細胞選殖株T11.8-10-17的TCR包含TCRα鏈和TCRβ鏈，該TCRα鏈包含具有SEQ ID NO：6之序列的互補性決定區3(CDR3)，且該TCRβ鏈包含具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的CDR3。特別地，本發明之TCR包含具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的可變TCRα區和具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的可變TCRβ區。
從實施例中可以看出，根據本發明之TCR特異於NYESO-1/LAGE-1並顯示出與其他抗原決定部位或抗原之交叉反應性非常低。
其他實施態樣關於包含TCRα鏈和TCRβ鏈之經分離之TCR，該TCRα鏈與SEQ ID NO：12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性之胺基酸序列，該TCRβ鏈與SEQ ID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性之胺基酸序列。
特定之實施態樣係關於包含TCRα鏈和TCRβ鏈之TCR，該TCRα鏈具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列且該TCRβ鏈具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列。因此，本文所描述之特異於HLA-A*02:01之複合物(其具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之NY-ESO-1/LAGE-1肽)的TCR包含由TRAV12-2基因編碼之Vα鏈和由TRBV12-4基因編碼之Vβ鏈。
其他實施態樣關於包含TCRα鏈和TCRβ鏈之經分離的TCR，其中
-該可變TCRα區具有與SEQ ID NO：10至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性之胺基酸序列且包含具有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列的CDR3區；
-該可變TCRβ區具有與SEQ ID NO：11至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性之胺基酸序列且包含具有SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列的CDR3區。
測定多個序列之間的同一性百分比較佳為使用Vector NTI AdvanceTM
10程式(Invitrogen Corporation，美國加州Carlsbad)之AlignX應用來達成。該程式使用經修飾之Clustal W算法(Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680; Invitrogen Corporation; Vector NTI AdvanceTM
10 DNA and protein sequence analysis software. User’s Manual, 2004, pp. 389-662)。同一性百分比係使用AlignX之標準參數測定。
根據本發明之TCR為經分離或純化的。在本發明之背景下，“經分離的”意指該TCR並非存在於其最初出現在自然界之背景下。在本發明之背景下，“經純化的”意指，例如該TCR不含或基本上不含其最初起源之細胞的其他蛋白質和非蛋白質部分。
於一些實施態樣中，該TCR之胺基酸序列可包含一或多個表型沉默取代。
“表型沉默取代”亦稱為“保守性胺基酸取代”。本技藝之技術熟習人士理解“保守性胺基酸取代”之概念且較佳地，意指編碼帶正電荷之殘基(H、K和R)的密碼子被編碼帶正電荷之殘基的密碼子取代，編碼帶負電荷之殘基(D和E)的密碼子被編碼帶負電荷之殘基的密碼子取代，編碼中性極性殘基(C、G、N、Q、S、T和Y)之密碼子被編碼中性極性殘基之密碼子取代，且編碼中性非極性殘基(A、F、I、L、M、P、V和W)之密碼子被編碼中性非極性殘基之密碼子取代。這些變化可自發性地發生、藉由隨機誘變引入或可藉由定向誘變引入。這些變化可在不破壞這些多肽之必要特徵的情況下進行。一般技術人士可輕易地且例行地藉由本技藝已知之方法篩選變體胺基酸和/或編碼彼之核酸，以確定這些變化是否實質上降低或破壞該配體結合能力。
本技藝之技術熟習人士理解編碼該TCR之核酸亦可經過修飾。整體核酸序列中之有用的修飾包括該序列之密碼子優化。可進行導致該表現之胺基酸序列內之保守性取代的改變。這些變化可在不影響功能之TCR鏈之胺基酸序列的互補決定區和非互補決定區中進行。通常，不應在CDR3區中執行添加和刪除。
根據本發明之一些實施態樣，該TCR之胺基酸序列係經修飾以包含可檢測之標記、治療劑或藥物動力學修飾部分。
可檢測之標記的非限制性實例有放射性標記、螢光標記、核酸探針、酶和造影劑。可與TCR結合之治療劑包括放射性化合物、免疫調節劑、酶或化學治療劑。該治療劑可使用與TCR連接之脂質體包封，從而使該化合物可在靶的位點被緩慢地釋出。此將避免在體內運輸期間之損害並確保該治療劑(例如毒素)在該TCR與相關抗原呈遞細胞結合後具有最大效果。治療劑之其他實例有：
肽細胞毒素，即，具有殺死哺乳動物細胞能力之蛋白質或肽，諸如蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細菌性外毒素A、DNase和RNase。小分子細胞毒性劑，即，具有殺死哺乳動物細胞之能力的分子量小於700道耳吞之化合物。該等化合物可含有具有細胞毒性效果之有毒金屬。此外，應理解的是，這些小分子細胞毒性劑亦包括前藥，即，在生理條件下腐爛或轉化以釋出細胞毒性劑之化合物。該等作用劑可，例如包括多西紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、美登素(maytansine)衍生物、雷切黴素(rachelmycin)、加利車黴素(calicheamicin)、依托泊苷(etoposide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊利替康(irinotecan)、卟吩姆鈉II(porfimer sodium photofrin II)、替莫唑胺(temozolomide)、拓撲替康(topotecan)、三甲曲沙葡萄糖醛酯(trimetrexate glucoronate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧瑞他汀E(auristatin E)、長春新鹼(vincristine)和阿黴素(doxorubicin)；放射性核素，諸如碘131、錸186、銦111、釔90、鉍210和213、錒225和砹213。放射性核素與TCR或其衍生物之聯結可，例如藉由下列群組進行：螯合劑；免疫刺激劑(immunostimulator)，亦稱為免疫刺激劑(immunostimulant)，即，刺激免疫反應之免疫效應分子。示例性免疫刺激劑有細胞因子，諸如IL-2和IFN-γ、抗體或其片段，包括抗T細胞或NK細胞決定簇抗體(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；具有抗體樣結合特徵之替代蛋白質支架；超抗原，即，引起T細胞非特異地活化，導致多株T細胞活化和大量細胞因子釋出之抗原及其突變體；趨化因子，諸如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白，等補體活化劑；異種蛋白結構域、同種異體蛋白結構域、病毒/細菌蛋白結構域、病毒/細菌肽。
在人T淋巴細胞上之抗原受體分子(T細胞受體分子)係與細胞表面上之CD3(T3)分子複合物非-共價聯結。使用抗CD3單株抗體擾動該複合物會誘導T細胞活化。因此，一些實施態樣係關於與抗CD3抗體或該抗CD3抗體之功能片段或變體聯結之如文所描述的TCR(其通常係藉由與該α或β鏈之N-或C-端融合來聯結)。適合用於本文所描述之組成物和方法中之抗體片段和變體/類似物包括微型抗體、Fab片段、F(ab＜'＞)2片段、dsFv和scFv片段、奈米抗體™(Ablynx公司(比利時)，包含源自駱駝科動物(例如駱駝或美洲駝)抗體之合成的單一免疫球蛋白可變重鏈結構域之分子和結構域抗體(包含親和力成熟之單一免疫球蛋白單可變重鏈結構域或免疫球蛋白可變輕鏈結構域(Domantis(比利時)之分子)或替換之蛋白質支架，該蛋白質支架顯示出抗體樣結合特徵，諸如親和體(Affibody)(包含經工程處理之蛋白A支架親和體(瑞典))或抗運載蛋白(Anticalin)(包含經工程處理之抗運載蛋白Pieris(德國))。
較佳地，該治療劑可選自由免疫效應分子、細胞毒性劑和放射性核素所組成之群組。較佳地，該免疫效應分子為細胞因子。
該藥物動力學修飾部分可為，例如至少一個聚乙二醇重複單位、至少一個二醇基團、至少一個唾液酸基團或彼等之組合。可使用本技藝之技術熟習人士已知的多種方式可導致至少一種聚乙二醇重複單位、至少一個二醇基團、至少一個唾液酸基團聯結。於較佳之實施態樣中，該單位係與該TCR共價連接。根據本發明之TCR可藉由一或數種藥物動力學修飾部分進行修飾。特別地，該TCR之可溶形式可藉由一或數種藥物動力學修飾部分進行修飾。該藥物動力學修飾部分可實現對該治療劑之藥物動力學變化形廓有利的改變，例如改善之血漿半衰期、降低或增強之免疫原性和改善之溶解度。
根據本發明之TCR可為可溶性或與膜結合的。術語“可溶性”係指為可溶形式(即，不具有跨膜或細胞質結構域)之TCR，例如作為用於將治療劑遞送至抗原呈遞細胞之靶向劑。為了穩定性，可溶性αβ異二聚體TCR較佳為在對應之恆定結構域的殘基之間具有引入的二硫鍵，例如WO 03/020763中所描述者。存在於本發明之αβ異二聚體中的一或二個恆定結構域可在C端截短，例如截短至多15個或至多10個或至多8個或更少之胺基酸。為了用於過繼療法，αβ異二聚體TCR可，例如以具有細胞質和跨膜結構域之全長鏈形式轉染。TCR可含有對應於自然界中發現之介於該相應之α和β恆定結構域之間的二硫鍵，此外或另外，可存在非天然之二硫鍵。
根據本發明之TCR，尤其是TCR之可溶性形式，可藉由連接額外之功能部分(例如用於降低免疫原性、增加流體動力學尺寸(在溶液中之尺寸)溶解度和/或穩定性(例如藉由增強之對蛋白質水解降解的保護作用)和/或延長血清半衰期)改質。
其他有用之功能部分和修飾包括可用於切斷患者體內攜帶本發明之TCR之效應宿主細胞的“自殺”或“安全開關”。一種實例為Gargett和Brown Front Pharmacol 2014;5:235所描述之可誘導的凋亡蛋白酶(Caspase)9 (iCasp9)“安全開關”。簡單地說，藉由眾所周知之方法修飾效應宿主細胞以表現凋亡蛋白酶9結構域，該凋亡蛋白酶9結構域之二聚體化係取決於小分子二聚體劑藥物(諸如AP1903/CIP)並導致快速引起該經修飾之效應細胞發生細胞凋亡。該系統描述於，例如EP2173869(A2)中。其他“自殺”、“安全開關”之實例為本技藝已知，例如單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、表現CD20及隨後使用抗CD20抗體耗盡或myc標籤(Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15; 105(2):623-8)。
本發明亦設想具有改變之糖基化模式的TCR。如本技藝所知，糖基化模式可取決於胺基酸序列(例如存有或不存有下文所討論之特定糖基化胺基酸殘基)和/或該產生蛋白質之宿主細胞或生物體。糖基化之多肽通常為N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分連接該天門冬醯胺殘基之側鏈。在該結合分子中添加N-連接之糖基化位點可藉由改變該胺基酸序列從而使其含有一或多個選自下列群組之三肽序列很方便地達成：天門冬醯胺-X-絲胺酸和天門冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除了脯胺酸外之任何胺基酸)。O-連接之糖基化位點的引入可藉由在起始序列中添加或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來達成。
另一種TCR糖基化方法係藉由化學或酶催化方式將糖苷與蛋白質偶聯。根據所使用之偶聯模式，該糖可連接至(a)精胺酸和組胺酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基，諸如半胱胺酸之巰基，(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之羥基，(e)芳香族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳香族殘基，或(f)麩胺醯胺之醯胺基。類似地，去糖基化(即，除去存在於結合分子上之碳水化合物部分)可藉由化學方法完成(例如將TCR暴露於三氟甲磺酸)或使用內和外糖苷酶藉由酶催化方法完成。
亦可設想將藥物(諸如小分子化合物)添加至該TCR，特別是本發明TCR之可溶形式。鍵聯可經由共價鍵或非共價交互作用(諸如透過靜電力)實現。可使用本技藝中已知之各種連接子以形成藥物軛合物。
該TCR，特別是本發明TCR之可溶形式可另加修飾以引入協助鑑定、追蹤、純化和/或分離該對應分子(標籤)的額外結構域。因此，於一些實施態樣中，該TCRα鏈或TCRβ鏈可經過修飾以包含抗原決定部位標籤。
抗原決定部位標籤為可被併入本發明TCR之標籤的有用實例。抗原決定部位標籤為短的胺基酸延伸段，其可允許與特定抗體結合，因此能夠識別和追蹤患者體內之可溶性TCR或宿主細胞或培養之(宿主)細胞的結合和運動。檢測該抗原決定部位標籤，且因此，檢測該經標記之TCR可使用許多不同之技術實現。
藉由在特異於該標籤之結合分子(抗體)的存在下培養該細胞可將標籤進一步用於刺激和擴增攜帶本發明TCR之宿主細胞。
一般而言，在某些情況下，該TCR可藉由各種修飾該TCR與靶抗原之親和力和解離速率的突變進行修飾。特別地，該突變可增加該親和力和/或降低解離速率。因此，該TCR可在至少一個CDR及其可變結構域框架區發生突變。
然而，於一較佳之實施態樣中，該TCR之CDR區為未經修飾或為體外親和力成熟的，諸如用於實施例中之TCR受體。此意味該CDR區具有天然存在之序列。這可能是有利的，因為體外親和力成熟可能導致對TCR分子之免疫原性。這可能導致抗藥物抗體減少產生或使該治療效果和治療去活化和/或誘導不良作用。
該突變可為一或多個取代、缺失或插入。這些突變可藉由本技藝中任何合適之方法引入，諸如聚合酶鏈反應、基於限制酶之選殖、接合無關之選殖程序(其描述於Sambrook, Molecular Cloning-4th
Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press之實施例中) 。
理論上，由於內源性和外源性TCR鏈之間的錯配，可能發生不可預測之具有交叉反應風險的TCR特異性。為了避免TCR序列錯配，該重組TCR序列可經修飾以含有最少之鼠源化Cα和Cβ區，該種技術已被證明可有效增強數種不同之經轉導的TCR鏈正確配對。TCR鼠源化(即，以小鼠之對應部分交換人α和β鏈中之恆定區)為經常應用以改善宿主細胞中TCR之細胞表面表現的技術。不欲受限於特定理論，咸認鼠源化之TCR與CD3共受體更有效地結合；和/或優先彼此配對且較不傾向在體外在經遺傳修飾之人T細胞上形成混合之TCR以表現具有所需之抗原特異性的TCR，但仍保留並表現其“原始”TCR。
已鑑定9種負責改善鼠源化TCR之表現的胺基酸(Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184 (11):6223-31)並設想以TCRα和/或β鏈恆定區中之一個或全部胺基酸殘基取代其鼠對應部分殘基。該技術亦稱為“最小鼠源化”並提供增強細胞表面表現之優點，同時減少胺基酸序列中“外來”胺基酸殘基之數量，從而降低免疫原性。
一些實施態樣係關於如本文描述之經分離的TCR，其中該TCR為單鏈型，其中該TCRα鏈和TCRβ鏈係藉由連接子序列連接。
合適之單鏈TCR形式包含由對應於可變TCRα區之胺基酸序列構成的第一節段、由可變TCRβ區的胺基酸序列(其與對應於TCRβ鏈恆定區胞外序列之胺基酸序列的N端融合)構成之第二節段和連接該第一節段之C端與第二節段之N端的連接子序列。或者，該第一節段可由對應於TCRβ鏈可變區之胺基酸序列構成，該第二節段可由對應於TCRα鏈可變區序列之胺基酸序列(其與對應於TCRα鏈恆定區胞外序列之胺基酸序列的N端融合)構成。上述單鏈TCR在第一和第二鏈之間可進一步包含二硫鍵，且其中該連接子序列之長度和該二硫鍵之位置為能使該第一和第二節段之可變結構域序列基本上如同在天然T細胞受體中般彼此定向。更具體地，該第一節段可由對應於TCRα鏈可變區序列之胺基酸序列(其融合至對應於TCRα鏈恆定區胞外序列之胺基酸序列的N端)構成，該第二節段可由對應於TCRβ鏈可變區之胺基酸序列(其融合至對應於TCRβ鏈恆定區胞外序列之胺基酸序列的N端)構成，且二硫鍵可提供在第一和第二鏈之間。該連接子序列可為不損害該TCR功能之任何序列。
在本發明之背景下，“功能性”TCRα和/或β鏈融合蛋白應意指TCR或TCR變體，其藉由，例如加入、刪除或取代胺基酸來進行修飾且至少保持基本生物活性。在TCR之α和/或β鏈的情況中，這應意味著該二條鏈保持形成能發揮其生物學功能之T細胞受體(或是與未經修飾之α和/或β鏈，或是與另一本發明之融合蛋白α和/或β鏈)的能力，特別是與該TCR之特異性肽-MHC複合物結合，和/或在特定肽：MHC相互作用時之功能性信號轉導的功能。
於特定之實施態樣中，該TCR可經修飾成為功能性T細胞受體(TCR)α和/或β鏈融合蛋白，其中該抗原決定部位標籤的長度為6至15個胺基酸，較佳為9至11個胺基酸。於另一實施態樣中，該TCR可經修飾成為功能性T細胞受體(TCR)α和/或β鏈融合蛋白，其中該T細胞受體(TCR)α和/或β鏈融合蛋白包含二或更多個抗原決定部位標籤(或是被隔開，或是直接串聯)。該融合蛋白之實施態樣可含有2、3、4、5或甚至更多個抗原決定部位標籤，只要該融合蛋白保持其生物活性(“功能性”)。
較佳為根據本發明之功能性T細胞受體(TCR)α和/或β鏈融合蛋白，其中該抗原決定部位標籤係選自，但不限於CD20或Her2/neu標籤，或其他習知標籤，諸如myc標籤、FLAG標籤、T7標籤、HA(凝血素)-標籤、His標籤、S標籤、GST標籤或GFP標籤。myc、T7、GST、GFP標籤為源自現有分子之抗原決定部位。相反地，FLAG為經設計用於高抗原性之合成的抗原決定部位標籤(參見，例如美國專利案編號4,703,004和4,851,341)。較佳地，可使用myc標籤，因為可使用高品質試劑來檢測它。當然，除了被抗體識別外，抗原決定部位標籤可具有一或多種額外功能。這些標籤之序列描述於文獻中且為本技藝之技術熟習人士所周知。
TCR變體
本發明之另一態樣關於包含如本文所描述之TCR的功能部分之多肽，其中該功能部分包含SEQ ID NO：6和9之胺基酸序列至少一者。
該功能部分可介導該TCR與抗原(特別是抗原-MHC複合物)結合。
於一實施態樣中，該功能部分包含如本文所描述之TCRα可變鏈和/或TCRβ可變鏈。
該TCR變體分子可具有該TCR受體之結合特性，但可與效應細胞(除T細胞外)之信號傳導結構域組合，特別是與NK細胞之信號傳導結構域組合。因此，一些實施態樣係關於包含如本文所描述之TCR的功能部分之蛋白質與效應細胞(諸如NK細胞)之信號傳導結構域的組合。
本發明之另一態樣關於包含至少二個如本文所描述之TCR的多價TCR複合物。於該態樣之一實施態樣中，至少二個TCR分子係經由連接子部分連接以形成多價複合物。較佳地，該複合物為水溶性，因此該連接子部分應該據此選擇。較佳地，該連接子部分能夠連接至該TCR分子上之限定位置，從而使所形成之複合物的結構歧異性最小化。本發明之一實施態樣係由本發明之TCR複合物提供，其中該聚合物鏈或肽連接子序列在非位於TCR之可變區序列中的各TCR之胺基酸殘基之間延伸。由於本發明之複合物可用於醫療中，因此該連接子部分應就其藥學適用性(例如其免疫原性)選擇。滿足上述所需標準之連接子部分的實例為例如連接抗體片段之技藝所已知。
連接子之實例為親水聚合物和肽連接子。親水性聚合物之實例為聚伸烷基二醇。該類別中最常用的為基於聚乙二醇或PEG者。然而，其他實例係基於其他合適的，可選擇地經取代之聚伸烷基二醇，包括聚丙二醇及乙二醇和丙二醇之共聚物。肽連接子係由胺基酸鏈組成，並用於產生單純連接子或可使TCR分子連接至其上之多聚體化結構域。
一種實施態樣係關於多價TCR複合物，其中至少一個該TCR與治療劑結合。
細胞因子和趨化因子釋出
一些實施態樣係關於如本文所描述之經分離的TCR、如本文所描述之多肽、如本文所描述之多價TCR複合物，其中該表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合可引起IFN-γ分泌。
由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所引起之IFN-γ分泌可多於3 ng/ml，例如多於4 ng/ml，多於5 ng/ml，更佳為多於6 ng/ml，最佳為多於7 ng/ml。若與不相關之肽(例如SEQ ID NO：15或16)的HLA-A*02結合型結合相比較，當與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合時，該IFN-γ分泌可高出至少4倍。
細胞因子和趨化因子釋出(例如IFN-γ分泌及MIP-1α和MIP-1β分泌)可藉由玻管內分析測量，該玻管內分析中係將經ivt
RNA(其編碼選自由SEQ ID NO：1至3(較佳為SEQ ID NO：3)所組成之群組的胺基酸序列中一者)轉染之T2細胞與表現待研究之TCR的富含CD8+之PBMC一起培育，或使用裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
(SLL)肽或源自NY-ESO-1之不相關肽的T2細胞。
一些實施態樣係關於如本文所描述之經分離的TCR、如本文所描述之多肽或如本文所描述之多價TCR複合物，其中由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列或其HLA-A*02結合型結合所引起之MIP-1α和MIP-1β分泌係低於預定之閾值。該閾值可使用至少1：1之特定之效應子對靶的之比例測定。
在各使用10,000個細胞，轉基因TCR+
效應細胞對靶細胞之比率至少為1：1之情況下，由表現在效應細胞上之本發明的TCR與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型在玻管內結合所引起之MIP-1α分泌可少於1 ng/ml，較佳為少於0.8 ng/ml，更佳為少於0.7 ng/ml。在各使用10,000個細胞，轉基因TCR+
效應細胞對靶的之比率至少為1：1之情況下，與選自SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所引起之MIP-1β分泌可少於3 ng/ml，較佳為少於2.8 ng/ml，更佳為少於2.5 ng/ml。
“效應細胞”可為外周血淋巴細胞(PBL)或外周血單核細胞(PBMC)。通常，該效應細胞為免疫效應細胞，尤其是T細胞。其他合適之細胞類型包括γ-δT細胞和NK樣T細胞。
若與不相關之肽(例如SEQ ID NO：15或16)的HLA-A*02結合型結合相比較，當與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合時，該MIP-1α分泌可高出至多15倍，較佳為高出至多10倍。若與不相關之肽(例如SEQ ID NO：15或16)的HLA-A*02結合型結合相比較，當與選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合時，該MIP-1β分泌可高出至多30倍，較佳為高出至多25倍。
本發明亦關於用於識別與選自SEQ ID NO：1至3之靶的胺基酸序列，或較佳地，與HLA-A*02或其HLA-A*02：01結合型結合之TCR或其片段的方法，其中該方法包含將候選TCR或其片段與選自SEQ ID NO：1至3之胺基酸序列，或較佳地，HLA-A*02或其HLA-A*02：01結合型接觸，並測定該候選TCR或其片段是否與該靶的結合和/或介導免疫反應。
該候選TCR或其片段是否介導免疫反應可，例如藉由測量細胞因子分泌測定，諸如IFN-γ分泌。如上述，細胞因子分泌可藉由玻管內分析測量，其中以編碼選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列中一者(較佳為SEQ ID NO：3)之ivt
RNA轉染之K562細胞(或其他APC)係與表現TCR之富含CD8+的PBMC或包含待研究之TCR之片段的分子一起培育。
核酸、載體
本發明之另一態樣係關於編碼如本文所描述之TCR的核酸或編碼該編碼如本文所描述之TCR的多核苷酸之核酸。
“核酸分子”通常意指DNA或RNA之聚合物，其可為單股或雙股，合成的或從天然來源獲得(例如經分離和/或純化的)，其可含有天然、非天然或經改變之核苷酸，且其可含有天然、非天然或經改變之核苷酸間鍵聯，諸如胺基磷酸酯鍵聯或硫代磷酸酯鍵聯，而非在未經修飾之寡核苷酸的核苷酸之間發現的磷酸二酯。較佳地，本文所描述之核酸為重組的。如本文中所使用之術語“重組”係指(i)藉由在活細胞外將天然或合成之核酸節段與可在活細胞中複製之核酸分子連結而構建之分子，或(ii) 從上述(i)中所描述者複製而產生之分子。出於本文之目的，複製可在玻管內複製或體內複製。該核酸可使用本技藝已知之程序基於化學合成和/或酶催化之連接反應來構建或可商購(例如從Genscript、Thermo Fisher和類似之公司購得)。參見，例如Sambrook等人，例如核酸可使用天然存在之核苷酸或經各種修飾之核苷酸化學合成，該經各種修飾之核苷酸係經過設計以提高該分子之生物穩定性或增加在雜交時形成之雙螺旋體之物理穩定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代之核苷酸)。該核酸可包含編碼該重組TCR、多肽或蛋白質或其功能部分或功能性變體之任一者的任何核苷酸序列。
本發明亦提供該經分離或純化之核酸的變體，其中該變體核酸包含與編碼本文所描述之TCR的核苷酸序列具有至少75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。該等變體核苷酸序列編碼特異性識別NY-ESO1/LAGE-1之功能性TCR。
本發明亦提供經分離或純化之核酸，該核酸包含與本文所描述之任一核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列或在嚴格條件下與本文所描述之任一核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
較佳地，在嚴格條件下雜交之核苷酸序列係在高嚴格性條件下雜交。“高嚴格性條件”意指該核苷酸序列與靶的序列(本文所描述之任一核酸的核苷酸序列)雜交之量係可檢測地較非特異性雜交強。高嚴格性條件包括可區分具有精確互補序列之多核苷酸或僅包含些許零散錯配之多核苷酸與碰巧具有些許小區域(例如3至10個鹼基)與該核苷酸序列匹配的隨機序列之條件。該等小互補區較具有14至17或更多個鹼基之全長互補序列更容易融化，且高嚴格性雜交使它們易於區分。相對較高之嚴格性條件將包括，例如低鹽和/或高溫條件，諸如在約50至70℃之溫度下由約0.02至0.1M NaCl或等效物提供。該等高嚴格性條件耐受少量(若有)介於該核苷酸序列與該模板或靶的股之間的錯配，且特別適合用於檢測本文所描述之任何TCR的表現。一般理解的是，藉由加入增加量之甲醯胺可使條件更嚴格。
如本文他處已描述者，編碼該TCR之核酸可被加以修飾。在整個核酸序列中之有用的修飾可為密碼子優化。可製造能導致在該表現之胺基酸序列內之保守性取代的改變。這些變化可在不會影響功能之TCR鏈的胺基酸序列之互補決定區和非互補決定區中進行。通常，不應在該CDR3區中進行添加和刪除。
另一實施態樣係關於包含該編碼如本文所描述之TCR的核酸之載體。
該載體較佳為質體、穿梭載體、噬菌體質體、黏粒、表現載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或用於基因療法之顆粒和/或載體。
“載體”為有能力攜帶核酸序列進入其中可合成該經編碼之多肽的合適宿主細胞中之任何分子或組成物。通常，且較佳地，載體為已使用本技藝已知之重組DNA技術進行工程處理以納入所需之核酸序列(例如本發明之核酸)的核酸。該載體可包含DNA或RNA和/或包含脂質體。該載體可為質體、穿梭載體、噬菌體質體、黏粒、表現載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或用於基因療法之顆粒和/或載體。載體可包括允許在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多種可選擇之標記基因和本技藝之一般技術人士所已知之其他遺傳元件。較佳地，該載體為包括根據本發明之核酸的表現載體，該根據本發明之核酸係可操作地連接允許該核酸表現的序列。
較佳地，該載體為表現載體。更佳地，該載體為逆轉錄病毒，更具體地說，為γ-逆轉錄病毒或慢病毒載體。
細胞、細胞株
本發明之另一態樣關於表現如本文所描述之TCR的細胞。
於一些實施態樣中，該細胞為經分離或非天然存在的。
於特定之實施態樣中，該細胞可包含編碼如本文所描述之TCR的核酸或包含該核酸之載體。
在該細胞中，可引入上述包含編碼上述TCR之核酸序列的載體或可引入編碼該TCR之ivt
RNA。該細胞可為外周血淋巴細胞，諸如T細胞。該選殖和外源表現該TCR之方法描述於，例如Engels et al. (Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013)中。以慢病毒載體轉導原代人T細胞係描述於，例如Cribbs “simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells” BMC Biotechnol. 2013; 13: 98中。
術語“轉染”和“轉導”可互換且係指將外源核酸序列引入宿主細胞(例如引入真核宿主細胞)中之過程。應注意的是引入或轉移核酸序列不限於所提及之方法，而是可藉由任何數目之方法實現，包括電穿孔、顯微注射、基因槍遞送、脂質轉染、超感染和該提及之藉由逆轉錄病毒或其他適合用於轉導或轉染之病毒進行的感染。
一些實施態樣係關於包含下列群組之細胞：
a)表現載體，其包含至少一個如本文所描述之核酸，或
b)第一表現載體(其包含編碼如本文所描述之TCR的α鏈之核酸)和第二表現載體(其包含編碼如本文所描述之TCR的β鏈之核酸)。
於一些實施態樣中，該細胞為外周血淋巴細胞(PBL)或外周血單核細胞(PBMC)。該細胞可為天然殺手細胞或T細胞。較佳地，該細胞為T細胞。該T細胞可為CD4+T細胞或CD8+T細胞。於一些實施態樣中，該細胞為幹細胞樣記憶T細胞。
幹細胞樣記憶T細胞(TSCM)為分化度較低之CD8+T細胞亞群，其特徵在於自我更新之能力及長期持續存在。一旦這些細胞在體內遇到它們的抗原，它們進一步分化為中樞記憶T細胞(TCM)、效應記憶T細胞(TEM)和終末分化之效應記憶T細胞(TEMRA)(其中一些TSCM保持靜止)(Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014))。這些剩餘之TSCM細胞顯示出在體內建立持久之免疫記憶的能力，因此被視為是用於過繼性T細胞療法的重要T細胞亞群(Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297)。可使用免疫磁性選擇以將T細胞池限制在幹細胞記憶T細胞亞型，參見(Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44)。
針對TCR之抗體
本發明之另一態樣關於特異性結合如本文所描述之TCR之一部分的抗體或其抗原結合片段，該TCR之一部分介導對NY-ESO-1/LAGE-1之特異性。於一實施態樣中，該介導對NY-ESO-1/LAGE-1特異性之TCR的一部分包含SEQ ID NO：6之α鏈的CDR3和/或SEQ ID NO：9之β鏈的CDR3。
該抗體抗原結合片段可調節該TCR之活性。其可阻斷或可能不會阻斷該TCR與NY-ESO結合。其可用於調節該TCR之治療活性或用於診斷目的。
醫藥組成物、醫學治療和套組
本發明之另一態樣係關於醫藥組成物，該醫藥組成物包含如本文所描述之TCR、包含該TCR之功能部分的多肽、如本文所描述之多價TCR複合物、編碼該TCR之核酸、包含該核酸之載體、包含該TCR之細胞或該特異性結合如本文所描述之TCR之一部分的抗體。
較佳地，本發明那些活性組分係在與可接受之載體或載體材料混合之劑量中用於該等可治療或至少減輕疾病之醫藥組成物中。該等組成物可(除了該活性組分和載體外)包括填充物質、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑和其他現有技術已知之材料。
術語“醫藥上可接受的”係定義不會干擾該活性組分之生物活性之有效性的非毒性材料。該載體之選擇係取決於該應用。
該醫藥組成物可含有可增強該活性組分之活性或補充該治療的額外組分。該等額外組分和/或因子可為該醫藥組成物之一部分，以實現協同效果或使不利或不欲有之效果最小化。
用於本發明之活性組分的配製劑或製劑及施用/醫療之技術刊載於“Remington's Pharmaceutical Sciences”，賓州Easton，Mack出版公司，最新版本中。適當之施用為腸胃道外施用，例如肌肉內、皮下、髓內注射及鞘內、直接心室內、靜脈內、結內、腹膜內或腫瘤內注射。靜脈內注射為患者之較佳治療方法。
根據較佳之實施態樣，該醫藥組成物為輸注液或注射液。
可注射之組成物為包含至少一種活性成分之醫藥上可接受的流體組成物，該活性成分，例如表現TCR之經擴增的T細胞群(例如對該待治療之患者而言為自體的或同種異體的)。該活性成分通常溶解或懸浮於生理學上可接受之載體中，且該組成物可另外包含少量之一或多種無毒輔助物質，諸如乳化劑、防腐劑和pH緩衝劑，等。該等可與本發明之融合蛋白一起使用之可注射的組成物為習知的；本技藝之一般技術人士熟知適當之配製劑。
通常，該醫藥組成物包含至少一種醫藥上可接受之載體。
因此，本發明之另一態樣係關於如本文所描述之TCR、包含該TCR之功能部分的多肽、如本文所描述之多價TCR複合物、編碼該TCR之核酸、包含該核酸之載體、包含該TCR之細胞或該特異性結合如本文所描述之TCR之一部分的抗體於作為藥物之用途。
一些實施態樣係關於如本文所描述之TCR、包含該TCR之功能部分的多肽、如本文所描述之多價TCR複合物、編碼該TCR之核酸、包含該核酸之載體、包含該TCR之細胞於治療癌症之用途。
於一實施態樣中，該癌症為血液學癌症或實體腫瘤。
血液學癌症亦稱為血癌，其不會形成實體腫瘤，因此分散在體內。血液學癌症之實例為白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。實體腫瘤有二種主要類型，肉瘤和癌瘤。肉瘤為，例如血管、骨、脂肪組織、韌帶、淋巴管、肌肉或肌腱之腫瘤。
於一實施態樣中，該癌症係選自由下列所組成之群組：肉瘤、前列腺癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腎癌、胰臟癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、肝細胞癌瘤、頭頸癌、胃癌、子宮內膜癌、結腸直腸癌、膽管癌瘤、乳癌、膀胱癌、髓樣白血病和急性淋巴母細胞白血病。較佳地，該癌症為肉瘤或骨肉瘤。
該TCR在識別骨肉瘤和黑色素瘤上特別優異，諸如骨肉瘤細胞株SAOS-2和黑色素瘤細胞株MM415和Mel624.38。
本發明亦考慮含有下列群組之一或多者的醫藥組成物和套組(i)如本文所描述之經分離的TCR；(ii)包含編碼重組TCR之核酸的病毒顆粒；(iii)經修飾以表現如本文所描述之重組TCR的免疫細胞，諸如T細胞或NK細胞；(iv)編碼如本文所描述之重組TCR的核酸。於一些實施態樣中，本發明提供包含慢病毒載體顆粒之組成物，該慢病毒載體顆粒包含編碼如本文所描述之重組TCR的核苷酸序列(或已使用本文所描述之載體顆粒修飾以表現重組TCR之T細胞)。該等組成物可依本文所進一步描述之本發明的方法投予個體。
包含如本文所描述之經修飾的T細胞之組成物可根據已知技術用於過繼免疫療法之方法和組成物中，或本技藝之技術熟習人士基於本揭示內容將可清楚明白之其變體。
於一些實施態樣中，該細胞之配製方法如下：首先從細胞之培養基中收穫細胞，然後清洗細胞並在適合用於以治療有效量投予該細胞之培養基(“醫藥上可接受之”載體)和容器系統中濃縮之。合適之輸注介質可為任何等張之培養基配製劑，通常為生理鹽水、Normosol R(亞培)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但亦可使用在水中之5%葡萄糖水溶液或乳酸林格氏液。該輸注介質可補充以人血清白蛋白。
組成物中用於有效治療之細胞數量通常多於10個細胞，且高達106
個細胞，至多為，且包括108
或109
個細胞，並可多於1010
個細胞。該細胞數量將取決於該組成物所欲之最終用途及其中包含之細胞類型。例如，若需要特異於特定抗原之細胞，則該群體將含有多於70%，通常多於80%、85%和90至95%之該等細胞。在本文所提供之用途方面，該細胞之體積通常為1升或更少，可為500ml或更少，甚至為250ml或100ml或更少。因此，所需細胞之密度通常大於106
個細胞/ml，且通常大於107
個細胞/ml，通常為108
個細胞/ml或更大。臨床相關數量之免疫細胞可被分配在多個輸注液中，該多個輸注液中之累積數量等於或超過109
、1010
或1011
個細胞。本發明提供之醫藥組成物可為各種形式，例如為固體、液體、粉末、水性溶液或凍乾形式。合適之藥物載體的實例為本技藝所已知。該等載體和/或添加劑可藉由習知方法配製並可以合適之劑量投予個體。穩定劑，諸如脂質、核酸酶抑制劑、聚合物和螯合劑可保護該組成物免於在體內降解。在意圖藉由注射投予之組成物中可包括一或多種表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑和等張劑。
如本文所描述之重組TCR或該包含編碼本發明提供之重組TCR的核苷酸序列之病毒載體顆粒可以套組形式包裝。套組可選擇地包括一或多種組分，諸如使用說明書、裝置和額外試劑，以及用於實施該方法之組分，諸如管子、容器和注射器。示例性套組可包括編碼本文提供之重組TCR的核酸、該重組TCR多肽或病毒，且可選擇地包括使用說明書、用於檢測個體中之病毒的裝置和用於對個體投予該組成物之裝置。
本發明亦考慮包含編碼所欲基因(例如重組TCR)之多核苷酸的套組。本發明亦考慮包含編碼所欲序列(例如重組TCR)之病毒載體和可選擇地，編碼免疫檢查點抑制劑的多核苷酸序列之套組。
本發明所考慮之套組亦包括用於實行用於檢測編碼本發明之任何一或多種TCR之多核苷酸是否存在之方法的套組。特別地，該等診斷套組可包括多組適當之擴增和檢測引物及用於進行深度測序之其他相關試劑以檢測編碼本發明之TCR的多核苷酸。於進一步之實施態樣中，本發明之套組可包含用於檢測本發明之TCR的試劑，諸如抗體或其他結合分子。診斷套組亦可含用於測定編碼本發明之TCR的多核苷酸是否存在或用於測定本發明之TCR是否存在的說明書。套組亦可包含說明書。說明書通常包括描述該套組中包含之組分及投予方法，包括測定該個體之適當狀態、適當之劑量和適當之投予方法的有形表現。說明書亦可包括在治療期間內監測該個體之指導。
本發明所提供之套組亦可包括用於對個體投予本文所描述之組成物的裝置。本技藝已知之各種用於投予藥物或疫苗之裝置的任一者均可包括在本文提供之套組中。示例性裝置包括，但不限於皮下注射針、靜脈內注射針、導管、無針注射裝置、吸入器和液體分配器，諸如點眼藥器。通常，用於投予套組之病毒的裝置將與該套組之病毒相容；例如無針注射裝置，諸如高壓注射裝置可包含在具有未被高壓注射損壞之病毒的套組中，但通常不包含在具有被高壓注射損壞之病毒的套組中。
本發明提供之套組亦可包括用於對個體投予化合物(諸如T細胞活化劑或刺激劑)或TLR激動劑(諸如TLR4激動劑)之裝置。本技藝已知之各種用於對個體投予藥物之裝置的任一者可包含在本文提供之套組中。示例性裝置包括皮下注射針、靜脈內注射針、導管、無針注射，但不限於皮下注射針、靜脈內注射針、導管、無針注射裝置、吸入器和液體分配器，諸如點眼藥器。通常，用於投予該套組之化合物的裝置將與投予該化合物之所需方法相容。
實施例
實施例1：分離NY-ESO-1/LAGE-1特異性T細胞選殖株之方法
使用玻管內預激(priming)方法來分離具有任何所需之MHC限制性和抗原特異性的T細胞選殖株。該預激系統使用HLA-A*02:01陰性供體之成熟樹突細胞(mDC)作為抗原呈遞細胞和自體之富含CD8+
的T細胞作為反應細胞。使用玻管內轉錄之RNA(ivt
RNA)作為特異性抗原之來源，該ivt
RNA係編碼如SEQ ID NO：14所示之全長人CTAG1A/B胺基酸序列。同時，使用編碼人HLA-A*02:01之 ivt
RNA作為轉染入mDC中之限制性元件的來源，以就該專用之HLA等位基因設立同種異體預激作用(如WO2007/017201中所描述者)。在電穿孔進入mDC後，將編碼CTAG1之ivt
RNA轉譯成全長蛋白質，該全長蛋白質再接著經過加工並由轉基因HLA-A*02:01分子以肽之形式呈遞，該轉基因HLA-A*02:01分子係由經轉染之mDC表現。T細胞與來自相同供體之經ivt
RNA轉染之mDC在玻管內共同培養導致重新誘導抗原特異性T細胞，此抗原特異性T細胞為對應之TCR的來源。抗原特異性T細胞可藉由各種方法富含並藉由有限稀釋或基於FACS之單細胞分選來選殖。
實施例1.1：使用以編碼HLA-A*02:01之ivt
RNA轉染之成熟樹突細胞進行同種異體預激方法。
根據以下方案，使用由同種異體HLA-A*02：01分子呈遞之肽完成樹突細胞預激具有高親和力TCR之T細胞：
HLA-A*02：01/CTAG1預激作用
根據Jonuleit等人(Jonuleit et al. 1997, Eur. J. Immunol. 1997, 27:3135-3142)，使用合適之成熟混合物產生成熟之樹突細胞(8天mDC)。
抗原呈遞細胞(第8天，成熟之mDC)係源自健康供體並以20μg之編碼所需抗原和HLA分子(HLA-A*02：01)之ivt
RNA進行電穿孔。隨後，以1:10之比例將製備好之mDC與富含CD8+
之健康供體的PBMC在補充有IL-2(50單位/ml，每隔一天)之合適細胞培養基中，在37℃(6%CO2
)下共同培養約14天。隨後，使用HLA-A*02：01 NY-ESO-1/LAGE-1157-165
多聚體(ProImmune)鑑定NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性細胞並隨後使用FACS技術藉由單細胞分選分離。
實施例2：功能/特異性分析
在鑑別可與HLA-A2上之理想的NY-ESO-1/LAGE-1抗原決定部位(NY-ESO-1/LAGE-1157-165
)結合的候選TCR(T11.8-10-17)後，進行與功能和特異性有關之完整表徵。分析證實該T細胞選殖株T11.8-10-17對NY-ESO-1 (更準確地說是NY-ESO-1/LAGE-1157-165
)之特異性(第1圖)、經T11.8-10-17-轉導之富含CD8+的T細胞特異地溶解裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
肽之HLA-A2陽性腫瘤細胞株的能力(第2圖)和與各種人腫瘤細胞株共同培養之經T11.8-10-17-轉導之富含CD8+的T細胞於識別腫瘤細胞的能力(第3圖)。
實施例2.1：分析原始T細胞選殖株T11.8-10-17
實施例2.1.1：抗原特異性
實驗佈局：以裝載ivt
RNA之K562或裝載肽之T2細胞進行刺激
根據以下方案確認NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性：進行標準夾心ELISA分析，檢測IFN-γ(BD人IFN-γELISA組)。
在作為靶細胞方面，在T2細胞(HLA-A*02POS
)上加載飽和量(10-5
M)之NY-ESO-1/LAGE-1157-165
肽(“SLL肽”；SEQ ID NO：3)或不相關之NY-ESO-1衍生之肽(“FTV肽”；SEQ ID NO：15)，即FTVSGNILTI肽(“FTV肽”)或RLLEFYLAM肽(“RLL肽”，SEQ ID NO：16)。此外，以20μg之編碼NY-ESO-1/LAGE-1157-165
的ivt
RNA轉染K562細胞(經HLA-A*02：01轉導；“K562-A2”)或使用水進行電穿孔作為對照組。使用20,000個靶細胞和10,000個T細胞，將各靶細胞株與T細胞選殖株T11.8-10-17以約2：1之比例共同培養。藉由標準夾心ELISA檢測IFN-γ(BD人IFN-γELISA組)。
結果
該候選選殖株僅在使用表現NY-ESO-1之K562-A2細胞或裝載SLL肽之T2細胞刺激時才分泌IFN-γ，但不會在與使用水進行電穿孔之K562-A2組合時或與裝載無關肽(FVT或RLL)之T2細胞組合時分泌(第1圖)。
實施例2.2：腫瘤細胞之識別
實驗佈局：殺死腫瘤細胞
藉由與HLA-A*02陽性NY-ESO-1/LAGE-1陽性腫瘤細胞株Mel624.38共同培養來評估經T11.8-10-17-TCR或基準-TCR-轉導之CD8+
T細胞(CD8-T11.8-10-17-TCR或CD8_benchmark-TCR)之滅殺能力(第2a圖)。此外，亦以HLA-A*02陽性NY-ESO-1/LAGE-1陽性腫瘤細胞株MM415測試CD8-T11.8-10-17之滅殺(第2b圖)。在作為陰性對照組方面，使用未經轉導之富含CD8+
之PBMC作為效應細胞(CD8_UT)或使用HLA-A*02陽性，但NY-ESO-1/LAGE-1陰性腫瘤細胞株SK-Mel23作為靶細胞。以約4：1之效應細胞對靶細胞比例設立共同培養物，即，在共同培養的前一天接種10,000個黏附NT腫瘤細胞，隨後加入40,000個轉基因TCR+
T細胞。在全部67小時之期間內，每四小時使用活細胞監控(IncuCyte®ZOOM)來測量增加之紅螢光靶細胞(總積分強度，以GCUxμm2
/圖像計)，該紅螢光靶細增加表示誘導靶細胞凋亡(膜聯蛋白V，紅色)。
結果
經T11.8-10-17-TCR或基準-TCR轉導之CD8+
T細胞顯示出僅滅殺NY-ESO-1/LAGE-1陽性和HLA-A2陽性腫瘤細胞株Mel624.38(第2a圖)或MM415(第2b圖)，此係由10小時後已開始之紅色螢光(IncuCyte®膜聯蛋白V)增加代表。相反地，在未與效應細胞共同培養之腫瘤細胞的情況中，或與經T11.8-10-17轉導之CD8+
T細胞共同培養之NY-ESO-1/LAGE-1陰性，而HLA-A2陽性的腫瘤細胞株SK-Mel23的情況中並未觀察到紅色螢光增加，這表示靶細胞未被殺死。未經轉導之CD8+
T細胞顯示出無任何腫瘤細胞株發生細胞溶解。
實施例2.3：識別腫瘤細胞
實驗佈局：使用腫瘤細胞株刺激
使用IFN-γELISA來評估當以一組HLA-A*02：01陽性，NY-ESO-1/LAGE-1陽性人腫瘤細胞株(Mel624.38、FM6、FM3.29、MM415、SAOS2、U266)刺激經T11.8-10-17轉導之T細胞(CD8_T11.8-10-17) 時細胞因子分泌的情形。藉由NanoString nCounter®分析來檢測靶細胞中之NY-ESO-1/LAGE-1表現。在作為用於經T11.8-10-17轉導之T細胞的陽性對照組方面，以SLL-肽(10-5
M)裝載T2細胞。在作為用於效應子功能之陰性對照組方面，將經T11.8-10-17轉導之T細胞與裝載無關(FTV)肽(10-5
M)之T2細胞、SK-Mel23(HLA-A2陽性，NY-ESO-1/LAGE-1陰性)或SKM1 (HLA-A2陽性，NY-ESO-1/LAGE-1陰性)共同培養，或將未經轉導之T細胞與腫瘤細胞或裝載肽之T2細胞共同培養。無效應細胞之靶細胞的培養係作為額外之陰性對照組。使用40,000個經T11.8-10-17轉導之T細胞和20,000個靶細胞，以2：1之比例將靶細胞與T細胞共同培養(第3圖)。
結果
T11.8-10-17轉基因CD8+
T細胞顯示出與NY-ESO-1/LAGE-1陽性，HLA-A*02陽性腫瘤細胞株Mel624.38、FM6、FM3.29、MM415、SAOS2和U266或裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
之T2細胞共同培養時大量分泌IFN-γ。相反地，未檢測到T11.8-10-17轉基因CD8+
T細胞識別HLA-A*02陽性，NY-ESO-1/LAGE-1陰性腫瘤細胞株SK-Mel23和SKM1或裝載不相關肽之T2細胞。與任一靶細胞共同培養之未經轉導的T細胞或無效應T細胞之靶細胞顯示出未分泌IFN-γ(第3圖)。
實施例2.4：識別錯配之抗原決定部位
實驗佈局2.4.1：識別裝載肽之抗原決定部位
以裝載肽(10-5
M)之T2細胞進行經NY-ESO-1/LAGE-1157-165
-特異性基準TCR-轉導(CD8-基準-TCR)或T11.8-10-17-TCR-轉導之CD8+
(CD8_T11-10-17)T細胞分泌IFN-γ(IFN-γ分泌)之識別肽的測試。藉由in silico
Expitope®分析(Expitope® 2.0; Jaravine et al. BMC Cancer 2017)所有執行之數據庫並除去該組合積分閾值(設為0)，測試75個與SLL肽序列(9聚體)至少56%同源(最多4個錯配)且具有較20,000nM低之MHC(IC50)結合積分之肽。作為陰性對照組，使用未經轉導之富含CD8+的PBMC(CD8_UT)作為效應細胞或以裝載無關(irr.；FTVSGNILTI)肽之T2細胞(10-5
M)刺激TCR轉基因T細胞。亦測試靶細胞之背景IFN-γ分泌(僅靶的)。以裝載SLL肽(#10*)之T2細胞活化作為陽性對照組之T細胞(10-5
M)。使用20,000個靶細胞和20,000個經T11.8-10-17-TCR或基準-TCR轉導或未經轉導之T細胞，將靶細胞與T細胞以1:1之比例共同培養。藉由標準ELISA測量IFN-γ分泌，以[pg/mL]計。所顯示的為六種經識別之肽(第4圖)。
結果
所顯示的為被T11.8-10-17-TCR和基準-TCR 轉基因CD8+
T細胞交叉識別之肽(肽序列總結在表1中)。轉基因T細胞識別陽性對照肽(SLL，SLLMWITQC)，但不會識別該無關肽(irr.；FTVSGNILTI)，因此可證明該轉基因T細胞之功能性。此外，二種轉基因T細胞交叉識別之肽#3且T11.8-10-17-轉基因T細胞亦被裝載肽#6、#11、#32、#34和#51之T2細胞輕微活化。未經轉導之T細胞並未被觀察到識別任何T2細胞。分別培養之T細胞或T2靶細胞未分泌IFN-γ(第4圖)。
實驗佈局2.4.2：識別ivt
RNA錯配之抗原決定部位
測試該表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)或基準-TCR (CD8_BENCHMARK-TCR)之富含CD8+
的PBMC在與裝載肽之HLA-A*02-01轉基因K562細胞(K562-A2+irr.，K562-A2+SLL)或與經靶的 ivt
RNA轉染之HLA-A2轉基因K562 (K5i62-A2+NY-ESO-1，K562-A2+eGFP)共同培養後16小時，釋出特異性IFN-γ之情形。在此實驗方面，以20μg之NY-ESO-1或eGFP-ivt
RNA為在300μl之RPMI1640培養基中的3×106
個K562細胞進行電穿孔(300伏特和300μF；指數型脈衝)。在陽性對照組方面，以裝載SLL肽(10-5
M)(K562-A2+SLL)或裝載20μg之編碼NY-ESO-1的ivt
RNA(K562-A2+NY-ESO-1)之HLA-A*02：01-轉基因K562細胞刺激T細胞。使用裝載不相關肽(10-5
M；K562-A2+FTV)或20 μg之編碼eGFP之ivt
RNA(K562-A2+eGFP)的HLA-A*02：01-轉基因K562細胞作為陰性對照組。另外，以20μg之編碼eGFP的ivt
RNA加上長肽來轉染HLA-A*02：01陽性K562細胞，該長肽包含可被表現本發明之T11.8-10-17TCR (CD8_T11.8-10-17)或基準-TCR(CD8_benchmark-TCR)之轉基因T細胞交叉識別的抗原決定部位和側翼序列(K562-A2+#3、K562-A2+#6、K562-A2+#11、K562-A2+#32、K562-A2+#34、K562-A2+#51)。使用40,000個靶細胞和20,000個經T11.8-10-17-或基準-TCR-轉導之T細胞，將靶細胞與T細胞以2:1之比例共同培養。藉由標準ELISA測量IFN-γ[pg/mL]分泌(第5圖)。
結果
T11.8-10-17-TCR和基準-TCR-轉基因CD8+
T細胞識別該陽性對照組，即，裝載SLL肽之K562-HLA-A*02：01陽性細胞(K562-A2+SLL)或經NY-ESO-1-ivt
RNA轉染之K562-HLA-A*02：01陽性細胞(K562-A2+NYESO)，但不會識別裝載不相關肽之K562-HLA-A*02：01陽性細胞(K562-A2+irr.和K562-A2+eGFP)，證明該轉基因T細胞之特異性和功能性。基準-TCR轉基因T細胞仍然能夠識別肽#3(即使是經細胞內加工且呈遞在K562-HLA-A*02：01陽性細胞上時)，但T11.8-10-17顯示出不再交叉識別任何經細胞內加工之肽(#3、#6、#11、#32、#34和#51)。由此獲致結論：與基準TCR相比較，若該測試之肽經細胞內加工，則T11.8-10-17-轉基因T細胞不會交叉識別任何該測試之肽。
實施例3：細胞因子變化形廓
實驗佈局3.1：IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B之分泌
評估二位經遺傳修飾以表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)或基準-TCR(CD8_benchmark-TCR)之不同健康供體在以裝載10-5
M之NY-ESO-1/LAGE-1157-165
(T2(SLL))肽或10-5
M之源自NY-ESO-1之不相關肽(T2(FTV))的HLA-A*02：01陽性T2細胞刺激時，富含CD8+
之轉基因TCR PBMC特異性釋出細胞因子(IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B，按[ng/ml]測量)(第6a圖：供體1；第6b圖：供體2)。
在作為陰性對照組方面，以裝載HLA-A*02:01陽性FTV之T2細胞(T2(FTV))刺激T11.8-10-17-或基準-轉基因CD8+
T細胞，或將未經轉導之富含CD8+之PBMC(CD8_ut)與裝載肽之T2細胞共同培養。此外，將T2細胞或T細胞分開培養。
使用10,000個靶細胞和10,000個經T11.8-10-17-TCR或基準-TCR-轉導之T細胞，將靶細胞與T細胞以1:1之比例共同培養。在設立共同培養18小時後，使用Milliplex MAP套組藉由多重分析來測定由T11.8-10-17-或基準-TCR-轉基因CD8+
T細胞分泌之IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B並藉由MagPix分析器進行分析。
結果
所有陰性對照均未測得明顯之細胞因子釋出。二種轉基因TCR均導致該對應之T細胞分泌相當量之IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B且就效應子功能而言顯示出較佳之細胞因子變化形廓。
實驗佈局3.2：MIP-1α和MIP-1β之分泌
當以裝載10-5
M之NY-ESO-1/LAGE-1157-165
(SLL)肽(T2(SLL))或10-5
M之源自NY-ESO-1之不相關肽(FTV)(T2(FTV))的HLA-A*02：01陽性T2細胞刺激時，表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17)或基準-TCR(CD8_benchmark-TCR)之富含CD8+
的PBMC釋出特異性趨化因子(MIP-1α和MIP-1β)(第7a圖：供體1或第7b圖：供體2)。與TCR T11.8-10-17轉基因T細胞相比較，當使用裝載SLL肽之T2細胞刺激時，該基準-TCR轉基因T細胞分泌較多量之MIP-1α和MIP-1β。
在作為陰性對照組方面，以裝載HLA-A*02:01陽性FTV之T2細胞(T2(FTV))刺激T11.8-10-17-或基準-轉基因CD8+
T細胞，或將未經轉導之富含CD8+
之PBMC (CD8_ut)與裝載肽之T2細胞共同培養。此外，將T2細胞或T細胞分開培養。
使用10,000個靶細胞和10,000個經T11.8-10-17-或基準-TCR-轉導之T細胞，將靶細胞和T細胞以1:1之比例共同培養。在設立共同培養18小時後，使用Milliplex MAP套組藉由多重分析測定由T11.8-10-17-或基準-TCR-轉基因T細胞分泌之MIP-1α和MIP-1β並藉由MagPix分析器分析。
結果
所有陰性對照組所測得之細胞因子釋出均為可忽略的。此外，分開培養之T2細胞或T細胞未顯示出釋出任何趨化因子。與基準-TCR轉基因T細胞相比較，經T11.8-10-17轉導之T細胞所釋出之MIP-1α和MIP-1β的量明顯較少。由於已知趨化因子，諸如MIP-1α和MIP-1β(亦分別稱為CCL3和CLC4)，特別是MIP-1α，可促進腫瘤進展(Liao et al. Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015)；Silva et al. Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017)、Yu Wu et al. J Immunol., Nov 1;181(9):6384-93 (2008))，MIP-1α和MIP-1β分泌量較少是有利的。
第1圖顯示當以經CTAG1B-ivt
RNA(其中CTAG1B表示人NY-ESO-1基因複本(CTAG1B-001，基因ID ENST0000359887))轉染之腫瘤細胞株K562-A2(穩定的經HLA-A*02：01轉導之K562細胞株，K562_A2+NY-ESO)，或裝載10-5
M NY-ESO-1157-165
肽之T2細胞(T2+SLL)刺激時，該NY-ESO-1157-165
特異性T細胞選殖株T11.8-10-17分泌之IFN-γ，使用以水進行電穿孔之K562-A2(K562_A2+H2O)或裝載10-5
M之源自NY-ESO-1之肽的T2細胞(RLLEFYLAM：T2+RLL和FTVSGNILTI：T2+FTV)作為陰性對照組。使用標準ELISA來檢測IFN-γ-釋出[pg/ml]。
第2a和2b圖顯示出與經基準-TCR轉導之T細胞(CD8_benchmark-TCR)相比較(第2a圖)，由富含CD8+
之表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165-
特異性TCR T11.8-10-17 (CD8-T11.8-10-17)的PBMC滅殺之HLA-A*02陽性NY-ESO-1/LAGE-1陽性腫瘤細胞株Mel624.38(第2a圖)和MM415(第2b圖)。在作為陰性對照組方面，使用未經轉導之富含CD8+
的PBMC作為效應細胞(CD8_UT)或使用HLA-A*02陽性，NY-ESO-1/LAGE-1陰性腫瘤細胞株SK-Mel23作為靶細胞株。在67小時之全部期間內，藉由活細胞成像(IncuCyte®ZOOM)每4小時測試紅色螢光靶細胞增加情形(以GCUxμm2
/圖像表示之總累積強度)，此紅色螢光靶細胞指示經誘導之靶細胞凋亡(Annexin V，紅色)。
第3圖顯示在與表現NY-ESO-1/LAGE-1之HLA-A*02：01陽性腫瘤細胞(Mel624.38、FM6、FM3.29、MM415、SAOS2、U266)或與裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
-肽之T2細胞(T2+SLL)的共同培養中，表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) 之NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性，富含CD8+
的PBMC特異地釋出IFN-γ。未經轉導之CD8+
T細胞(CD8_ut)顯示出當與任何腫瘤細胞株或T2細胞共同培養時均未釋出IFN-γ。作為陰性對照組的為與NY-ESO-1/LAGE-1mRNA(SK-Mel23，SKM1)陰性之HLA-A*02：01陽性腫瘤細胞或與裝載FTVSGNILTI(無關肽)之T2細胞(T2+FTV)(其顯示出未釋出IFN-γ)共同培養之T11.8-10-17轉基因CD8+
T細胞(CD8_T11.8-10-17)或未經轉導之CD8+
T細胞(CD8_ut)。在作為進一步之對照組方面，測試未與效應T細胞共同培養之抗原呈遞細胞(APC)分泌之IFN-γ。藉由使用測量IFN-γ釋出[以pg/ml計]的標準ELISA來測量T11.8-10-17轉基因CD8+
T細胞之活化。
第4圖顯示當以裝載肽(10-5
M)之T2細胞刺激時，NY-ESO-1/LAGE-1157-165
-特異性基準或T11.8-10-17-TCR-轉導之CD8+
T細胞分泌之IFN-γ。藉由in silico
Expitope®研究分析來鑑定測試之肽中與SLL肽序列至少56%同源(最多4個錯配)之肽(參考表1)。在陰性對照組方面，使用未經轉導之富含CD8+
的PBMC作為效應細胞或以裝載無關肽(irr.；FTVSGNILTI)之T2細胞刺激TCR轉基因T細胞。以裝載SLL肽之T2細胞活化陽性對照組T細胞。藉由標準ELISA測量IFN-γ分泌。
第5圖顯示表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)或NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性基準TCR(CD8_benchmark-TCR)之富含CD8+
之PBMC在與裝載肽之HLA-A*02-01轉基因K562細胞(K562-A2+irr，K562-A2+SLL)或經靶的ivt
RNA轉染之HLA-A*02-01轉基因K562-A2(K562-A2+NYESO，K562-A2+eGFP)的共同培養中所釋出之IFN-γ。使用以裝載SLL肽之HLA-A*02：01-轉基因K562細胞(K562-A2+SLL)或以編碼NY-ESO-1之ivt
RNA(K562-A2+NY-ESO-1)刺激之T細胞作為陽性對照組。使用裝載不相關肽(K562-A2+irr.，FTV)或編碼eGFP之ivt
RNA(K562-A2+eGFP)的HLA-A*02：01-轉基因K562細胞作為陰性對照組。另外，以編碼eGFP之ivt
RNA加上源自對應抗原(其包含可被表現本發明之T11.8-10-17TCR(CD8_T11.8-10-17)或基準-TCR(CD8_benchmark-TCR)之轉基因T細胞交叉識別的抗原決定部位(K562-A2+#3、K562-A2+#6、K562-A2+#11、K562-A2+#32、K562-A2+#34、K562-A2+#51))之長肽(因由該細胞在內部加工)來轉染HLA-A*02：01轉基因K562細胞。
第6a和6b圖顯示二位表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17(CD8_T11.8-10-17)或NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性基準-TCR(CD8_benchmark-TCR) 之不同健康供體(第6a圖：供體1；第6b圖：供體2)在以裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
(T2(SLL))肽或源自NY-ESO-1之不相關肽(T2(FTV))的HLA-A*02：01陽性T2細胞刺激時，其富含CD8+
之PBMC釋出之特異性細胞因子(IFN-γ、TNF-α)和顆粒酶B(以[ng/ml]測量)。二種轉基因TCR均導致該對應之T細胞分泌相當量之IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B且就效應子功能而言，顯示出較佳之細胞因子變化形廓。以裝載HLA-A*02：01陽性FTV之T2細胞(T2(FTV))刺激之T11.8-10-17-或基準-轉基因CD8+
T細胞，或與裝載肽之T2細胞共同培養之未經轉導的富含CD8+
之PBMC(CD8_ut)作為陰性對照組。所有陰性對照組皆未測到顯著之細胞因子釋出。此外，單獨培養之T2細胞或T細胞並未顯示任何背景細胞因子釋出。使用Milliplex MAP套組藉由多重分析測定由T11.8-10-17-或基準-TCR-轉基因T細胞分泌之IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B並藉由MagPix分析器進行分析。
第7a和7b圖顯示當以裝載NY-ESO-1/LAGE-1157-165
(SLL)肽(T2(SLL))或源自NY-ESO-1之不相關肽(FTV)(T2(FTV))的HLA-A*02：01陽性T2細胞刺激時，表現NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性TCR T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17)或NY-ESO-1/LAGE-1157-165
特異性基準-TCR(CD8_benchmark-TCR)之富含CD8+
的PBMC釋出特異性趨化因子(MIP-1α和MIP-1β)(第7a圖：供體1或第7b圖：供體2)。與TCR T11.8-10-17轉基因T細胞相比較，當以裝載SLL肽之T2細胞刺激時，該基準-TCR轉基因T細胞分泌較多量之MIP-1α和明顯較多量之MIP-1β。
在作為陰性對照組方面，以裝載HLA-A*02：01陽性FTV之T2細胞(T2(FTV))刺激T11.8-10-17-或基準-轉基因CD8+
T細胞，或將未經轉導之富含CD8+
之PBMC(CD8_ut)與裝載肽之T2細胞共同培養。所有陰性對照組所測得之趨化因子釋出均為可忽略。此外，單獨培養之T2細胞或T細胞未顯示釋出任何趨化因子。由T11.8-10-17-或基準轉基因CD8+
T細胞分泌之MIP-1α和MIP-1β係使用Milliplex MAP套組藉由多重分析測定並藉由MagPix分析器進行分析。
Claims (42)
- 一種經分離之T細胞受體(TCR)，其特異於NY-ESO-1/LAGE-1，其中該TCR包含：- TCRα鏈，其包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR3；及- TCRβ鏈，其包含具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的CDR3。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR特異地識別該胺基酸序列SEQ ID NO：1。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR特異地識別該胺基酸序列SEQ ID NO：2。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR特異地識別該胺基酸序列SEQ ID NO：3。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR特異地識別該SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HLA-A*02結合型。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR特異地識別該SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HLA-A*02：01結合型。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR包含可變TCRα區和可變TCRβ區，該可變TCRα區具有與SEQ ID NO：10至少80%同一性之胺基酸序列，且該可變TCRβ區具有與SEQ ID NO：11至少80%同一性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR包含可變TCRα區和可變TCRβ區，該可變TCRα區具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列，且該可變TCRβ區具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR包含TCRα鏈和TCRβ鏈，該TCRα鏈具有與SEQ ID NO：12至少80%同一性之胺基酸序列，且該TCRβ鏈具有與SEQ ID NO：13至少80%同一性之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR包含TCRα鏈和TCRβ鏈，該TCRα鏈具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列，且該TCRβ鏈具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR為經分離或純化的。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該經分離之TCR之胺基酸序列包含一或多個表型沉默取代。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該經分離之TCR之胺基酸序列係經修飾以包含可檢測之標記、治療劑或藥物動力學修飾部分。
- 如申請專利範圍第13項之經分離之TCR，其中該治療劑係選自由下列所組成之群組：免疫效應分子、細胞毒性劑和放射性核素。
- 如申請專利範圍第14項之經分離之TCR，其中該免疫效應分子為細胞因子。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR為可溶性或與膜結合的。
- 如申請專利範圍第13項之經分離之TCR，其中該藥物動力學修飾部分為至少一個聚乙二醇重複單元、至少一個二醇基團、至少一個唾液酸基團或彼等之組合。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCR為單鏈型，其中該TCRα鏈和該TCRβ鏈係藉由連接子序列連接。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中該TCRα鏈或該TCRβ鏈係經修飾以包含抗原決定部位標籤。
- 一種經分離之多肽，其包含：- TCRα鏈，其包含具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的CDR3；及- TCRβ鏈，其包含具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO：9之胺基酸序列的CDR3。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其中IFN-γ分泌係藉由與該選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合引起。
- 如申請專利範圍第21項之經分離之TCR，其中該藉由與該選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合引起之IFN-γ分泌係多於3ng/ml。
- 如申請專利範圍第21項之經分離之TCR，其中IFN-γ分泌係藉由玻管內分析測量，該玻管內分析中以編碼選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列中一者的ivtRNA轉染之T2細胞係與表現待研究之TCR的富含CD8+之PBMC一起培育。
- 如申請專利範圍第21項之經分離之TCR，其中該藉由與該選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所引起之MIP-1α分泌係少於1ng/ml。
- 如申請專利範圍第24項之經分離之TCR，其中該藉由與該選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列之HLA-A*02結合型結合所引起之MIP-1β分泌係少於3ng/ml。
- 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1項之經分離之TCR或編碼如申請專利範圍第20項之經分離之多肽。
- 一種載體，其包含如申請專利範圍第26項之核酸。
- 如申請專利範圍第27項之載體，其中該載體為表現載體。
- 如申請專利範圍第27項之載體，其中該載體為逆轉錄病毒載體。
- 如申請專利範圍第27項之載體，其中該載體為慢病毒載體。
- 一種細胞，其表現如申請專利範圍第1項之經分離之TCR。
- 如申請專利範圍第31項之細胞，其中該細胞為經分離的或非天然存在的。
- 一種細胞，其包含如申請專利範圍第26項之核酸或如申請專利範圍第27項之載體。
- 如申請專利範圍第31項之細胞，其中該細胞包含：a)表現載體，其包含如申請專利範圍第26項之核酸；或b)第一表現載體和第二表現載體，該第一表現載體包含編碼如申請專利範圍第1項之經分離之TCR之α鏈的核酸，且該第二表現載體包含編碼如申請專利範圍第1項之經分離之TCR之β鏈的核酸。
- 如申請專利範圍第31項之細胞，其中該細胞為外周血 淋巴細胞(PBL)或外周血單核細胞(PBMC)。
- 如申請專利範圍第35項之細胞，其中該細胞為T細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項之經分離之TCR、如申請專利範圍第20項之經分離之多肽、如申請專利範圍第26項之核酸、如申請專利範圍第27項之載體或如申請專利範圍第31項之細胞。
- 如申請專利範圍第37項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含至少一種醫藥上可接受之載體。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其係作為藥物。
- 如申請專利範圍第1項之經分離之TCR，其係用於治療癌症。
- 如申請專利範圍第40項之經分離之TCR，其中該癌症為血液學癌症或實體腫瘤。
- 如申請專利範圍第40項之經分離之TCR，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：肉瘤、前列腺癌、子宮癌、 甲狀腺癌、睪丸癌、腎癌、胰臟癌、卵巢癌、食道癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、肝細胞癌瘤、頭頸癌、胃癌、子宮內膜癌、結腸直腸癌、膽管癌瘤、乳癌、膀胱癌、髓樣白血病和急性淋巴母細胞白血病。
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