TWI818323B - 飼料添加劑之製法與其用於製備促進生長、預防及/或治療呼吸道疾病、抑制病原菌生長、抑制病原菌感染或抑制發炎之組成物的用途 - Google Patents
飼料添加劑之製法與其用於製備促進生長、預防及/或治療呼吸道疾病、抑制病原菌生長、抑制病原菌感染或抑制發炎之組成物的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供一種飼料添加劑之製法，其包含步驟(a)：提供一發酵基質，該發酵基質包含咖啡渣以及輔料，以該發酵基質的總重為基準，咖啡渣的含量係45wt%至80wt%，該發酵基質的碳氮比係35至65，該輔料包含玉米碎、粗糠、脫殼豆粉、碎米或其組合；及步驟(b)：以米麴菌對該發酵基質進行發酵，以獲得該飼料添加劑。以本發明之製法所製得之飼料添加劑具有較高比活性之消化酶、選擇性抑菌以及有效抗呼吸道病原菌的功效，進而可添加於動物飼料中並具有促進動物生長與避免感染呼吸道疾病的效果。
Description
本發明係關於一種飼料添加劑之製法與其用途，尤指一種飼料添加劑之製法與其用於促進生長、預防及/或治療呼吸道疾病之用途。
咖啡豆中含有多種不同的化學物質，包含咖啡因、多酚類物質等，其中，咖啡因具有促進新陳代謝與血液循環以及興奮中樞神經系統的作用，使其具有提振精神之功效；多酚類物質則具有抗氧化、抗發炎等有益功能而有助於身體健康，此外，咖啡豆經過烘焙並製作成咖啡飲品後更具有獨特風味與香氣，因此，近年來咖啡已成為廣受大眾喜愛的主流飲品之一。
然而，咖啡豆通常需要經過烹煮、萃取等過程以製成咖啡飲品，故製作成咖啡飲品後剩餘的咖啡渣所含有的機能性營養成份不高，難以再進一步有效地利用，而目前國內每年會產生將近9萬噸的咖啡渣，如果無法妥善處理與安置，將衍生嚴重的環保及廢棄物處理問題。
另一方面，目前在動物飼養產業中多以魚粉、豆粉作為動物飼料中營養的主要來源，其中，魚粉具有較高含量的蛋白質且普遍認為具有促進動物生長的作用，不過，魚粉價格昂貴使得成本增加，難以普遍用於動物飼料
中；而豆粉雖然價格便宜，但其所含有的營養無法與魚粉比擬，作為飼料也無法有效促進動物生長。
由此可知，目前仍有待發展出將咖啡渣應用於動物飼料中的手段，使咖啡渣所衍生出的環保及廢棄物處理問題得以解決，並能達到降低動物飼料成本的同時亦可促進動物生長之目的。
有鑑於現有技術所面臨的問題，本發明之目的在於提供一種飼料添加劑之製法，以其所製得之飼料添加劑具有較高比活性(specific activity)的消化酶，進而應用於動物飼料中可具有效促進動物生長之效果。
本發明之另一目的在於提供一種飼料添加劑之製法，以其所製得之飼料添加劑具有選擇性地抗菌以及抗呼吸道病原菌的功效。
本發明之另一目的在於提供一種飼料添加劑之製法，其能夠解決咖啡渣的處理與安置問題並降低動物飼料的製作成本。
為達成前述目的，本發明提供一種飼料添加劑之製法，其包含以下步驟：步驟(a)：提供一發酵基質，該發酵基質包含咖啡渣以及一輔料，且以該發酵基質的總重為基準，咖啡渣的含量係大於或等於45重量百分比(weight percentage，wt%)且小於或等於80wt%，其中，該發酵基質的碳氮比係大於或等於35且小於或等於65，該輔料包含玉米碎、粗糠、脫殼豆粉、碎米或其組合；以及步驟(b)：以米麴菌對該發酵基質進行發酵，以獲得該飼料添加劑。
藉由使發酵基質含有特定含量範圍之咖啡渣以及特定含量之碳氮比，並選用米麴菌對該發酵基質進行發酵之手段，能夠使所製得之飼料添加劑具有較高比活性的消化酶、選擇性地抗菌以及抗呼吸道病原菌的功效，進而可應用於動物飼料中以促進動物生長並降低成本，且降低動物感染呼吸道疾病
的風險；同時也使咖啡渣得以回收再利用，避免衍生環保以及廢棄物處理的問題。
依據本發明，所述米麴菌亦稱為米麯黴菌、米麴霉、麴黴菌或麯黴菌，具體而言，所述米麴菌係學名為Aspergillus oryzae之真菌。
依據本發明，所述碳氮比(C/N ratio)係指有機物中碳總含量與氮總含量的比值。舉例而言，碳氮比為20則代表有機物中的碳元素含量為氮元素含量的20倍。
依據本發明，該發酵基質進行發酵前可先進行滅菌處理。所述滅菌處理並無特別限制。於其中一實施態樣，所述滅菌處理可於溫度大於或等於120℃且小於或等於130℃、壓力大於或等於1巴(bar)且小於或等於1.5bar之條件下處30分鐘至90分鐘。
較佳的，該發酵基質的碳氮比係大於或等於35且小於或等於60。更佳的，該發酵基質的碳氮比係大於或等於37且小於或等於60。
較佳的，以該發酵基質的總重為基準，該輔料的含量係大於或等於20wt%且小於或等於55wt%。
較佳的，該發酵基質的碳氮比係大於或等於46且小於或等於53，該輔料包含粗糠，且以該發酵基質的總重為基準，粗糠的含量係大於或等於7wt%且小於或等於10wt%。藉由使發酵基質中含有特定含量範圍之粗糠，能進一步同時提升飼料添加劑中蛋白酶和澱粉酶的比活性。
於本發明的一些實施例中，該輔料為玉米碎，且以該發酵基質的總重為基準，玉米碎的含量係大於或等於25wt%且小於或等於40wt%；於本發明的另一些實施例中，該輔料為玉米碎以及粗糠，且以該發酵基質的總重為基準，玉米碎的含量係大於或等於25wt%且小於或等於38wt%，粗糠的含量係大於或等於7wt%且小於或等於15wt%；於本發明的另一些實施例中，該輔料
為玉米碎、粗糠以及脫殼豆粉，且以該發酵基質的總重為基準，玉米碎的含量係大於或等於14wt%且小於或等於20wt%，粗糠的含量係大於或等於8wt%且小於或等於12wt%，脫殼豆粉的含量係大於或等於1wt%且小於或等於5wt%。
較佳的，以該發酵基質的總重為基準，米麴菌的用量係大於或等於0.02wt%且小於或等於0.2wt%。具體而言，所述米麴菌之菌量濃度係大於或等於6.5×107孢子/公克(spore/g)。
較佳的，該發酵基質的含水率係大於或等於50wt%且小於或等於75wt%。更佳的，該發酵基質的含水率係大於或等於60wt%且小於或等於75wt%。再更佳的，該發酵基質的含水率係65wt%。
於本發明的一些實施例中，在步驟(a)中，該發酵基質可預先經過一破壁處理，該破壁處理包含將該發酵基質置於壓力係大於或等於4bar且小於或等於5bar、溫度係大於或等於130℃且小於或等於150℃以及轉速係大於或等於230轉/分鐘(revolutions per minute，rpm)且小於或等於250rpm之條件下2分鐘至5分鐘的步驟。藉由使該發酵基質預先經過破壁處理，可讓細胞內物質釋出而有利於後續米麴菌進行發酵的步驟，並且提升發酵物中的蛋白酶含量。
較佳的，在步驟(b)中，米麴菌對該發酵基質進行發酵的溫度係大於或等於25℃且小於或等於40℃，進行發酵的時間係大於或等於2天且小於或等於12天。更佳的，米麴菌對該發酵基質進行發酵的溫度係大於或等於25℃且小於或等於30℃，進行發酵的時間係大於或等於4天且小於或等於6天。
較佳的，在步驟(b)中，於米麴菌對該發酵基質進行發酵後還包含一乾燥步驟，以獲得該飼料添加劑，其中，該乾燥步驟係於大於或等於45℃且小於或等於60℃之條件下乾燥8小時以上。更佳的，該乾燥步驟係於50℃之條件下乾燥12小時至14小時。
此外，本發明另提供一種飼料添加劑，其係由前述之製法所製得。該飼料添加劑具有較高比活性之消化酶、選擇性地抗菌以及抗呼吸道病原菌的功效，因而可應用於動物飼料中並具有促進動物生長以及降低動物感染呼吸道疾病之風險的作用。
依據本發明，所述消化酶係指具有分解特定物質能力之蛋白質。較佳的，所述消化酶包含蛋白酶(protease)、澱粉酶(amylase)、纖維素酶(cellulase)以及木聚糖酶(xylanase)。
較佳的，所述飼料添加劑所具有蛋白酶的比活性係大於或等於355.80活性單位/公克(Unit/g)。更佳的，所述飼料添加劑所具有蛋白酶的比活性係大於或等於463.86Unit/g。再更佳的，所述飼料添加劑所具有蛋白酶的比活性係大於或等於854.74Unit/g。
此外，本發明另提供一種飼料添加劑用於製備促進動物生長之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由前述之飼料添加劑之製法所製得。應理解的是，所述促進生長之功效可適用於生長正常的動物個體，也可適用於生長遲緩的動物個體。
較佳的，所述動物係包含家禽或家畜。
較佳的，所述促進生長之功效係適用於生長正常的動物個體。
此外，本發明另提供一種飼料添加劑用於製備預防及/或治療呼吸道疾病之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由前述之飼料添加劑之製法所製得。
較佳的，該呼吸道疾病係指經豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)或肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)感染造成之疾病。
此外，本發明另提供一種飼料添加劑用於製備抑制病原菌生長之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由前述之飼料添加劑之製法所製得，
該病原菌包含豬鏈球菌(Streptococcus suis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer)、鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、豬肺炎黴漿菌或肺炎黴漿菌。較佳的，所述沙門氏菌為豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)，所述葡萄球菌為豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)。
此外，本發明另提供一種飼料添加劑用於製備抑制病原菌感染之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由前述之飼料添加劑之製法所製得，該病原菌包含豬肺炎黴漿菌或肺炎黴漿菌。
此外，本發明另提供一種飼料添加劑用於製備抑制發炎之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由前述之飼料添加劑之製法所製得。
較佳的，所述發炎係指肺炎。
較佳的，所述肺炎係由豬肺炎黴漿菌或肺炎黴漿菌所引起。
在說明說書中，由「小數值至大數值」表示的範圍，如果沒有特別指明，則表示其範圍為大於或等於該小數值且小於或等於該大數值。例如：30分鐘至90分鐘，即表示其範圍為「大於或等於30分鐘且小於或等於90分鐘」。
S1:步驟
S2:步驟
圖1係本發明之飼料添加劑的製法流程；圖2A係實施例10至14於發酵過程中之不同發酵時間的蛋白酶比活性測定結果；圖2B實施例10至14於發酵過程中之不同發酵時間的澱粉酶比活性測定結果；
圖3A至圖3C係分別為實施例1與比較例1對於大腸桿菌、豬鏈球菌以及豬霍亂沙門氏菌之抑菌能力測試結果；圖4係實施例1與比較例1對於乾酪乳桿菌之抑菌能力測試結果；圖5A以及圖5B分別為不同濃度之ME對於豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌的抑制生長測試結果；圖6A係濃度為800μg/ml之ME對於抑制豬肺炎黴漿菌感染的測試結果；圖6B為豬腎上皮細胞株經不同濃度之ME處理後的細胞存活率結果；圖6C係濃度1600μg/ml之ME對於抑制肺炎黴漿菌感染的測試結果；圖6D為人類肺上皮細胞株經不同濃度之ME處理後的細胞存活率結果；圖7A以及圖7B分別為小鼠肺泡巨噬細胞經不同濃度之ME處理後所釋出TNFα以及IL-6的含量測定結果；圖7C為小鼠肺泡巨噬細胞經不同濃度之ME處理後的細胞存活率結果；圖8A至圖8C分別為經流式細胞儀分析後所得之總細胞數量、嗜中性球數量以及單核球數量之測定結果。
以下列舉數種具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝者可經由本說明書之內容輕易地了解本發明所能達成之優點與功效，並且於不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更，以施行或應用本發明之內容。
實施例1：飼料添加劑
秤取600公克(g)的咖啡渣、300g的玉米碎以及100g的粗糠混合，再加入水調整其含水率，得到含水率約65wt%的混合物。
再取3公斤前述混合物置於溫度係121℃、壓力係1.2bar之條件下進行滅菌處理90分鐘，待冷卻至室溫後得到一發酵基質。
隨後秤取1.5g至3g、菌量為大於或等於6.5×107spore/g的米麴菌菌粉添加至該發酵基質中，再靜置於30℃的環境中進行發酵4天，以得到一初產物。
將該初產物置於50℃的環境中乾燥12小時至14小時，使其含水率低於7.5wt%後，再進行研磨至顆粒可通過孔徑大小約為830微米(μm)之篩網，即得到實施例1之飼料添加劑。實施例1所選用發酵基質的各成份比例(以發酵基質總重為基準)以及發酵基質的碳氮比皆列於下表1中，其中，發酵基質的碳氮比係依照各成份本身之碳氮比乘上各成份所對應之佔比的總和，於此，咖啡渣本身的碳氮比為20、玉米碎本身的碳氮比為97.3、脫殼豆粉本身的碳氮比為4.7以及粗糠本身的碳氮比為90。舉例而言，實施例1之發酵基質含有60wt%之咖啡渣(碳氮比為20)、30wt%之玉米碎(碳氮比為97.3)以及10wt%之粗糠(碳氮比為90)，故可得實施例1之發酵基質的碳氮比約為50.2。
實施例2至9：飼料添加劑
實施例2至9的製備流程大致上與實施例1相同，其不同之處在於所選用之發酵基質的成份比例以及發酵基質的碳氮比。實施例2至9所選用發酵基質的各成份比例(以發酵基質總重為基準)以及發酵基質的碳氮比亦列於下表1中。
實施例10至14：飼料添加劑
實施例10至14的製備流程大致上與實施例1相同，其不同之處在於所選用之發酵基質的成份比例以及發酵基質的碳氮比，且實施例10至14之發酵基質係進行了7天發酵。實施例10至14所選用發酵基質的各成份比例(以發酵基質總重為基準)以及發酵基質的碳氮比同樣列於下表1中。
表1：實施例1至14所選用發酵基質的各成份比例以及碳氮比。
比較例1：未經發酵咖啡渣
比較例1係選用與實施例1完全相同之咖啡渣，即代表未經發酵的咖啡渣。
試驗例1：消化酶比活性測定
本試驗例選用實施例1至9以及比較例1進行測試，並以蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶以及木聚糖酶的比活性來評估不同組別所具有的消化酶比活性。
(1)蛋白酶比活性測定
蛋白酶的活性測定於此係指在pH值為4.7且溫度為40℃的條件下，將蛋白質水解酶跟血紅蛋白(hemoglobin)混合進行水解作用30分鐘後，所測得被水解的血紅蛋白量，其可藉由測定血紅蛋白被分解後釋放出來的酪氨酸(tyrosine)的量來呈現。於此，蛋白酶的活性單位係以酪氨酸為基礎的血紅蛋白單位表示(Hemoglobin Unit of Tyrosine)，而1 HUT則代表在當量濃度(N)為0.006
之鹽酸溶液中，每一分鐘有濃度為1.10微克/毫升(μg/ml)之酪氨酸從血紅蛋白中釋放出來。
具體而言，先製備濃度為25、50、75以及100μg/ml之酪氨酸標準溶液，並以連續性波長酵素免疫分析儀(購自BioTek Instruments,Inc.，型號為MQX200)於波長為275奈米(nm)測得吸光值後，經計算得到濃度為1.10μg/ml之酪氨酸於波長為275nm的吸光值。隨後，取4g血紅蛋白加入100ml去離子水中並以0.3N之鹽酸溶液調整pH值至1.7，10分鐘後再以體積莫耳濃度(M)為0.5之醋酸鈉溶液調整pH值至4.7，接著再添加去離子水至總體積為200ml，即得到血紅蛋白溶液；另外，分別取5g實施例1至9之飼料添加劑(實施例1至9)以及未經發酵咖啡渣(比較例1)加入45ml的去離子水中，再於25℃、130rpm之條件震盪2小時後，以12000rpm離心5分鐘，取上清液即得到實施例1至9以及比較例1之待測樣品。
接著取實施例1至9以及比較例1之待測樣品先以去離子水稀釋5倍後，再取100微升(μl)稀釋後的實施例1至9以及比較例1之待測樣品，各自添加至500μl之血紅蛋白溶液(已於40℃水浴靜置5分鐘)中，並於40℃水浴反應30分鐘，接著加入500μl之三氯乙酸中止反應且在室溫靜置30分鐘後，在12000rpm的轉速下離心5分鐘，隨後取上清液並以連續性波長酵素免疫分析儀測量各組別於波長為275nm的吸光值。於此，由於待測樣品顏色深淺不一，各實驗組皆有對應之空白組為於中止反應才加入待測樣品，可以代表測量吸光值時的背景值。
蛋白酶活性的計算係先將所測得實施例1至9以及比較例1之吸光值扣除對應之空白組的吸光值後，再分別除以濃度為1.10μg/ml之酪氨酸的吸光值、總體積量以及反應的時間，即可得到在單位體積下，實施例1至9以及比較例1所具有的蛋白酶活性，其單位係HUT/ml，於此再進一步將其乘以各組別之
稀釋倍率，並除以各組別之待測樣品的濃度，即可得到實施例1至9以及比較例1之蛋白酶的比活性，其單位係HUT/g，即代表在實施例1至9以及比較例1之待測樣品中，每單位重量蛋白質中蛋白酶具有的活性。實施例1至9以及比較例1之蛋白酶的比活性結果列於下表2中，其中，HUT/g係以Unit/g表示。
(2)澱粉酶比活性測定
澱粉酶的活性測定係將實施例1至9以及比較例1之待測樣品與澱粉一起作用後，再添加碘液進行呈色並於波長為660nm測定吸光值，而待測樣品組別之吸光值相較於對照組之吸光值減少的程度，即可代表樣品中澱粉酶所佔的比例，並以此可得到各組別之澱粉酶比活性。
具體而言，秤取0.04g之澱粉溶於磷酸緩衝溶液中並使其總體積為100ml以得到澱粉溶液；另秤取0.277g之碘化鉀並與4.6ml且濃度為0.1N之碘酸鉀溶液、0.93ml之鹽酸溶液以及100ml之超純水混合，以得到呈色溶液；另外，取5g實施例1至9之飼料添加劑以及比較例1之未經發酵咖啡渣加入45ml的去離子水中，再於25℃、130rpm之條件震盪2小時後，以12000rpm離心5分鐘，取上清液即得到實施例1至9以及比較例1之待測樣品。
接著取實施例1至9以及比較例1之待測樣品先以去離子水稀釋5倍後，再取10μl之稀釋後的實施例1至9以及比較例1之待測樣品，各自添加至500μl之澱粉溶液(已於37℃水浴預熱2分鐘)中，並於37℃水浴反應8分鐘，接著加入500μl之呈色溶液，隨後再加入4000μl之超純水並進行反應5分鐘後，在8000rpm的轉速下離心5分鐘，取上清液再重複於8000rpm的轉速下離心5分鐘後，置於連續性波長酵素免疫分析儀並測量各組於波長為660nm的吸光值。於此，空白組為未加入含有澱粉酶之待測樣品的組別。
澱粉酶活性的計算係先將所測得之空白組的吸光值扣除實施例1至9以及比較例1之吸光值後，再除以空白組的吸光值並乘上800，即可得到在
單位體積下，實施例1至9以及比較例1所具有的澱粉酶活性，其單位係Unit/dl，於此再進一步將其乘上所稀釋的倍率並除以100，即可得到實施例1至9以及比較例1之澱粉酶的比活性，其單位係Unit/g。實施例1至9以及比較例1之澱粉酶的比活性結果列於下表2中。
(3)纖維素酶比活性測定
纖維素酶的活性於此係指在pH值為5.0且溫度為37℃的條件下，能夠從纖維素中解離出1微莫耳(μmole)的葡萄糖，即定義為1活性單位(1Unit)。本試驗係依照Sigma-Aldrich公司所載之Enzymatic Assay of Cellulase的試驗流程進行並經計算後得到實施例1至9以及比較例1之纖維素酶的比活性結果，其列於下表2中。
(4)木聚糖酶比活性測定
木聚糖酶的活性於此係指在pH值為4.5且溫度為30℃的條件下，能夠從木聚糖(xylan)中解離出1μmole的木糖(xylose)，即定義為1活性單位(1Unit)。本試驗係依照Sigma-Aldrich公司所載之Enzymatic Assay of XYLANASE(EC 3.2.1.8)的試驗流程進行並經計算後得到實施例1至9以及比較例1之木聚糖酶的比活性結果，其列於下表2中。
由上表2的結果可見，比較例1在蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶以及木聚糖酶之比活性測定實驗中皆無法測得各消化酶的比活性，換言之，在比較例1之未經發酵的咖啡渣中，各消化酶的比活性顯然未達到可被測得的程度；而觀實施例1至9的結果，該等組別皆可測得蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶以及木聚糖酶之比活性，其中，各組別中又以蛋白酶具有較高的比活性(355.80Unit/g至973.77Unit/g)。由此可知，相較於比較例1之未經發酵的咖啡渣，實施例1至9之飼料添加劑確實具有較高比活性之消化酶。
此外，進一步配合上表1所列發酵基質各成份比例以及碳氮比可見，實施例1與實施例5具有相近的發酵基質碳氮比，分別為50.2以及50.9，而實施例1另於發酵基質中添加10wt%的粗糠，使得實施例1相較於實施例5能夠再進一步提高蛋白酶和澱粉酶的比活性。由此可知，於發酵基質中另添加特定含量範圍之粗糠確實能夠進一步提高蛋白酶和澱粉酶的比活性。
試驗例2：發酵時間對消化酶比活性的影響
本試驗例係選用實施例10至14進行試驗。具體而言，在實施例10至14的製備流程製中，在滅菌後所得之3公斤的發酵基質中加入1.5g至3g且菌量大於或等於6.5×107spore/g的米麴菌後，靜置於30℃的環境中進行發酵至7天的過程中，分別於發酵3天、4天、5天、6天與7天之不同時間點取出樣品，置於50℃的環境中乾燥12小時至14小時使含水率低於7.5wt%後，依照與試驗例
1相同的方法測定實施例10至14之飼料添加劑於發酵過程中之不同時間點所含蛋白酶和澱粉酶的比活性，其結果分別列於下表3與表4中。
由上表3的結果可見，實施例10至14在經過3天以上的發酵所得之飼料添加劑皆含有高於340Unit/g之蛋白酶比活性，其中，實施例13及14在發酵3天的時間點即具有較高的蛋白酶比活性，分別為697.6Unit/g以及825.88Unit/g；此外，實施例10至14之蛋白酶比活性皆呈現隨著發酵時間增加而提升的趨勢。
為了清楚呈現蛋白酶比活性與發酵時間的關係，表3的結果亦於圖2A中以圖表呈現，由圖2A的結果可見，實施例10至14之蛋白酶比活性確實隨著發酵時間增加而有所提升，其中，於發酵時間為4天至6天的條件下呈現明顯增加。
表4：實施例10至14於發酵過程中之不同時間點所測得之飼料添加劑中澱粉酶的比活性。
由上表4的結果可見，實施例10至14在經過3天以上的發酵所得之飼料添加劑皆含有高於89Unit/g之澱粉酶比活性，其中，實施例10及11在發酵3天的時間點即具有較高的澱粉酶比活性，分別為167.89Unit/g以及165.02Unit/g；此外，實施例10至14之澱粉酶比活性同樣皆呈現隨著發酵時間增加而提升的趨勢。
為了清楚呈現澱粉酶比活性與發酵時間的關係，表4的結果亦於圖2B中以圖表呈現，由圖2B的結果可見，實施例10至14之澱粉酶比活性確實隨著發酵時間增加而有所提升，其中，於發酵時間為4天至6天的條件下呈現明顯增加。
試驗例3：促進動物生長評估
本試驗例係選用實施例1之飼料添加劑進行實驗。具體而言，將120頭斷奶仔豬(雄性60頭、雌性60頭，平均體重約為7.15公斤)隨機分為三組，使每組包含40頭斷奶仔豬(雄性20頭、雌性20頭)並分別設定為低劑量組、高劑量組以及對照組，其中，低劑量組為每噸基礎飼料中含有0.5公斤的實施例1之飼料添加劑、高劑量組為每噸基礎飼料中含有1公斤的實施例1之飼料添加劑以及對照組係不含有綜合酵素以及黏菌素(colistin)的基礎飼料。
實驗方式係於斷奶仔豬離乳後開始每日餵食前述不同組別的飼料持續六週，並每日紀錄體重以及飼料攝入量以得到一段時間內所增加的體重、平均日增重(average daily gain，ADG)以及飼料轉化率(feed conversion ratio，FCR)進而能評估仔豬的生長情況，其中，平均日增重數值愈高以及飼料轉化率愈低則代表飼料具有較佳的促進生長的效果，前述三組組別於餵食飼料持續四周後的結果列於下表5中，於餵食飼料持續六周後的結果則列於下表6中。
由表5的結果可觀察到，低劑量組、高劑量組以及對照組在開始餵食至第二週的增加體重雖然沒有明顯差異，不過繼續餵食至第四週時，低劑量組以及高劑量組在第二週至第四週所增加的體重明顯高於對照組，分別增加了約33%與37.5%；再觀第四週之體重、第二週至第四週之平均日增重以及飼料轉化率的結果，相較於對照組，低劑量組與高劑量組皆具有較佳的結果，即更高的第四週之體重與第二週至第四週之平均日增重以及更低的第二週至第四週之飼料轉化率；再觀表6的結果，於持續餵食至第六周後，低劑量組以及高劑量組的體重同樣皆高於對照組，而不論是開始餵食至第六周所增加的體重、開始餵食至第六周之平均日增重或者開始餵食至第六周之飼料轉化率，低劑量組與高劑量組相較於對照組皆具有較佳的結果，即在開始餵食至第六周後，具有更高的增加體重與平均日增重以及更低的飼料轉化率。由此可知，以本發明之製法所製得之飼料添加劑添加於動物基礎飼料中，確實具有促進動物生長的功效。
試驗例4：抑菌能力評估
本試驗例係選用實施例1之飼料添加劑以及比較例1之未經發酵咖啡渣分別針對不同種類之病原菌的抑菌效果進行測試，以評估該等組別所具有的抑菌能力。
(1)豬鏈球菌、大腸桿菌以及豬霍亂沙門氏菌抑菌測試
先秤取5g實施例1之飼料添加劑以及比較例1之未經發酵咖啡渣並加入25ml之去離水中震盪混合30分鐘後，再以10000rpm條件進行離心10分鐘並取出上清液，將上清液以孔徑大小為0.45μm之PES膜過濾後進行冷凍乾
燥，最後取200毫克(mg)之樣品溶於1ml的去離子水中以配製成實施例1以及比較例1之待測溶液。
接著，以無菌棉花棒分別沾取豬鏈球菌、大腸桿菌以及豬霍亂沙門氏菌之菌落並均勻塗布於不同菌株所適合之對應固態培養基中。於此，大腸桿菌與豬霍亂沙門氏菌皆採用國際標準檢測方法之MH固態培養基(Mueller Hinton agar，MH agar)於37℃培養16小時至18小時，豬鏈球菌則採用含5%綿羊血之固態血液瓊脂培養基於37℃培養16小時至18小時。
隨後，在固態培養基上不同位置挖空培養基以獲得直徑為8毫米(mm)之孔洞，再分別取100μl之前述實施例1的待測溶液及前述比較例1之待測溶液置於固態培養基的不同孔洞中，此外，濃度為1000百萬分濃度(ppm)之黏菌素或濃度為100ppm之慶大黴素(gentamicin)作為正控制組亦置於固態培養基之不同孔洞中，最後再依不同菌種特性於適當條件下培養24小時後，測量抑菌圈之直徑大小並列於下表7中，其單位以毫米(mm)表示。
由上表7的結果可見，比較例1於大腸桿菌、豬鏈球菌以及豬霍亂沙門氏菌的培養基上皆未產生可被量測直徑大小之抑菌圈，表示比較例1對於前述不同菌種皆不具有抑菌效果；再觀實施例1之結果，其於大腸桿菌以及
豬鏈球菌之培養基上分別量測到直徑大小為12mm以及14mm之抑菌圈，並且與慶大黴素之抗生素有相同的結果，此外，實施例1於豬霍亂沙門氏菌的培養基上亦可量測到直徑大小為12mm之抑菌圈，並且與黏菌素之抗生素具有相似的結果。
此外，為清楚呈現固態培養基上是否產生抑菌圈，前述各組別對於大腸桿菌、豬鏈球菌以及豬霍亂沙門氏菌的抑菌測試結果則分別如圖3A至圖3C所示。
於圖3A之大腸桿菌抑菌測試結果中，由左至右分別為比較例1、實施例1以及慶大黴素的結果，並分別標記為A1、A2與A3。由圖3A的結果可見，A3組的孔洞周圍出現明顯的抑菌圈，表示本次試驗結果並無受到實驗操作流程的影響；再觀A1組與A2組的結果，A2組的孔洞周圍亦出現明顯的抑菌圈而與A3組的結果相似，而A1組的孔洞周圍則未觀察到明顯抑菌圈。
再觀圖3B之豬鏈球菌抑菌測試結果，由左至右分別為比較例1、實施例1以及慶大黴素的結果，並分別標記為B1、B2與B3。由圖3B的結果可見，B3組的孔洞周圍出現明顯的抑菌圈，表示本次試驗結果並無受到實驗操作流程的影響；再觀B1組與B2組的結果，B2組的孔洞周圍亦出現抑菌圈而與B3組的結果相似，而B1組的孔洞周圍則沒有觀察到明顯抑菌圈。
再觀圖3C之豬霍亂沙門氏菌抑菌測試結果，由左至右分別為比較例1、實施例1以及黏菌素的結果，並分別標記為C1、C2與C3。由圖3C的結果可見，C3組的孔洞周圍有明顯的抑菌圈，即試驗結果未受到實驗操作流程影響；再觀C1組與C2組的結果，C2組的孔洞周圍同樣出現明顯的抑菌圈而與C3組的結果相似，而C1組的孔洞周圍則沒有觀察到明顯抑菌圈。
由此上表7以及圖3A至圖3C的結果可知，比較例1之未經發酵咖啡渣於經過本發明提供之製法製得實施例1之飼料添加劑後，確實對於大腸桿菌、豬鏈球菌以及豬霍亂沙門氏菌皆具有和抗生素相當之抑菌效果。
(2)乾酪乳桿菌(
Lactobacillus casei
)抑菌測試
本測試係如同前述抑菌測試(1)所載之方法製得實施例1以及比較例1之待測溶液，並對可安全食用的益生菌-乾酪乳桿菌進行抑菌測試。具體而言，乾酪乳桿菌係選用MRS固態培養基(de Man,Rogosa and Sharpe agar，MRS agar)，置於厭氧缸中並在37℃之溫度條件下厭氧培養24小時，隨後挖空不同位置的固態培養基以獲得直徑為8mm之孔洞，再分別取100μl且濃度為200mg/ml之前述實施例1和比較例1之待測溶液以及濃度為100U/ml之盤尼西林(penicillin)和濃度為100ppm之鏈黴素(streptomycin)置於固態培養基的不同孔洞中，接著於厭氧缸中、37℃之溫度條件下厭氣培養72小時後，測量抑菌圈之直徑大小，其單位以毫米(mm)表示。
乾酪乳桿菌抑菌測試的結果如圖4所示，其中，由左至右分別為比較例1、實施例1以及添加盤尼西林和鏈黴素之抗生素的組別，並且分別標記為A1、A2與A3。由圖4的結果可觀察到，A3組的孔洞周圍有明顯的抑菌圈，經量測後的抑菌圈直徑大小為28mm，顯示試驗結果未受到實驗操作流程影響；再觀A1組與A2組，該等組別皆沒有觀察到明顯抑菌圈，換言之，不論比較例1或實施例1之組別對於乾酪乳桿菌的生長皆沒有抑制效果，也就是說，比較例1之未經發酵咖啡渣於經過本發明提供之製法製得實施例1之飼料添加劑後，仍不會影響如乾酪乳桿菌等益生菌的生長。
(3)最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)與最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測試
本測試係如同前述抑菌測試(1)所載之方法製得實施例1之待測溶液，並且依據臨床與實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)所訂定的培養液微量稀釋法(broth microdilution test)，評估其最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。本測試係選用常見的家禽類病原菌和家畜類病原菌進行測試，其中，家禽類病原菌包含雷氏桿菌、鴨源雞桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌與葡萄球菌；家畜類病原菌包含豬葡萄球菌、豬鏈球菌、大腸桿菌以及豬霍亂沙門氏菌。
具體而言，先將前述不同種類的病原菌培養於胰蛋白酶大豆液態培養基(tryptone soy broth，TSB)中，隨後再依據光學比濁計量測試管的濁度值(扣除未加菌的TSB數值)將菌液濃度調整至0.5 McFarland，即1.5×108菌落形成單位/毫升(cfu/ml)，接著將前述實施例1之待測溶液以TSB做2倍序列稀釋後，取200μl經稀釋之待測溶液置於無菌96孔盤中，再取10μl之前述菌液置於96孔盤中並均勻混合，使得每孔最終病原菌濃度約為5×105至106cfu/ml，隨後於適當條件下培養18小時至24小時後進行觀察。若測試樣品具有抑菌能力，則會抑制病原菌生長而使培養液呈現清澈透明，而測試樣品可使培養液保持清澈的最低濃度則為MIC；此外，進一步將上述培養後的清澈培養液於固態培養基上再多培養24小時後，觀察固態培養基上無菌落形成的最低濃度則為MBC。實施例1對於前述不同病原菌的MIC與MBC列於下表8中，其中，不同病原菌皆選擇5株以上之菌株數進行測試。
由上表8的結果可見，針對不同種類的家禽類病原菌，實施例1之飼料添加劑所測得之MIC和MBC皆小於等於50mg/ml，其中，針對雷氏桿菌與鴨源雞桿菌具有較佳的抑菌能力，其MIC分別為1.56-6.25mg/ml以及6.12-12.5mg/ml；MBC分別為3.13-12.25mg/ml以及12.5mg/ml。而針對不同種類的家畜類病原菌，實施例1之飼料添加劑所測得之MIC和MBC則同樣皆小於等於50mg/ml。
由試驗例4的結果可知，以本發明提供之製法所製得之飼料添加劑確實具有能同時抑制多種病原菌生長卻不影響乾酪乳桿菌生長的功效，即具有選擇性地抑制壞菌但不影響益菌的效果。
試驗例5：抗呼吸道病原菌效果評估
本試驗例係選用實施例1之飼料添加劑，並以豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌作為呼吸道病原菌進行以下測試，其中，豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌的菌種編號分別為ATCC 25934以及ATCC 29342。在以下測試中，先秤取2g實施例1之飼料添加劑，並加入4ml、濃度為70%之酒精，再藉由超音波震盪
於常溫下震盪萃取1小時，隨後以12000rpm之轉速離心10分鐘並取出上清液，再經減壓濃縮去除溶劑後，即可得到實施例1之飼料添加劑的萃取物，作為以下測試所採用之樣品，並簡稱為ME。
(1)抑制病原菌生長測試
先以濃度為50%之酒精作為溶劑並透過超音波震盪將ME溶解，以獲得濃度為40mg/ml之ME原液，再以孔徑為0.22μm的濾膜過濾後，分別加入已含有菌量約為104cfu/ml之豬肺炎黴漿菌培養液以及含有菌量約為106cfu/ml之肺炎黴漿菌培養液中，使得兩種病原菌皆具有ME濃度為200微克/毫升(μg/ml)、400μg/ml以及800μg/ml的組別，其中，豬肺炎黴漿菌所選用之培養液係ATCC 1699培養液，肺炎黴漿菌所選用之培養液係ATCC 2611培養液。接著，在後續培養的第0小時、第12小時、第24小時、第36小時以及第48小時皆取出1ml的培養液，再藉由離心獲得病原菌沉澱後，進行DNA抽取並以定量即時聚合酶鏈鎖反應(qPCR)測定病原菌在不同時間點之菌量，豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌的qPCR測定結果分別如圖5A以及5B所示，其中，控制組為培養液中沒有加入ME的組別。
由圖5A的結果可見，針對豬肺炎黴漿菌，ME濃度為800μg/ml的組別在不同培養時間點所測得之菌量皆低於控制組，尤其在培養第48小時，相較於控制組，ME濃度為800μg/ml的組別明顯具有較低的菌量，且於統計上具有顯著差異(p值小於0.01)；再觀圖5B，針對肺炎黴漿菌，在培養第24小時已可觀察到ME濃度為800μg/ml的組別之菌量低於控制組，在培養第36小時則可觀察到ME濃度為400μg/ml以及800μg/ml的組別所具有的菌量皆低於控制組，而在培養第48小時，ME濃度為200μg/ml、400μg/ml以及800μg/ml的組別所具有的菌量皆低於控制組，且相較於控制組，ME濃度為200μg/ml以及400μg/ml
的組別於統計上具有顯著差異(p值小於0.05)，ME濃度為800μg/ml的組別於統計上亦具有顯著差異(p值小於0.01)。
由此可知，實施例1之飼料添加劑對於豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌確實皆具有抑制生長的效果，其中，又以ME濃度為800μg/ml的組別具有最佳的抑制生長效果。
(2)抑制病原菌感染測試
本測試選用豬腎上皮細胞株(PK-15 cell line)以及人類肺上皮細胞株(A549 cell line)分別作為被豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌感染的細胞，並採用慶大黴素保護測定法(gentamicin protection assay)測試ME對於抑制病原菌感染的效果。
本測試先進行細胞存活率之測定，以評估不同濃度之ME對於豬腎上皮細胞株與人類肺上皮細胞株生長的影響。具體而言，培養液選用含有10%之胎牛血清的DMEM，將細胞株接種於96孔細胞培養盤中並進行培養隔夜後，將培養液置換為含有不同ME濃度之培養液處理20小時，接著加入MTT試劑(0.5mg/ml)進行反應4小時後，再加入DMSO處理2小時，最後測定波長為570nm的吸光值以評估細胞存活情況。豬腎上皮細胞株與人類肺上皮細胞株的細胞存活率結果分別如圖6B以及圖6D所示，其中，控制組為培養液中沒有加入ME的組別。
在確認不影響細胞存活之ME濃度後，進行抑制病原菌感染測試。具體而言，豬腎上皮細胞株與人類肺上皮細胞株皆於含有10%之胎牛血清的DMEM培養液培養隔夜後，將培養液置換為含有ME之培養液處理2小時，其中，豬腎上皮細胞株係選用濃度為800μg/ml之ME進行處理，人類肺上皮細胞株係選用濃度為1600μg/ml之ME進行處理。接著，於豬腎上皮細胞株之培養液中加入豬肺炎黴漿菌、於人類肺上皮細胞株之培養液中加入肺炎黴漿菌進行感
染，並且使得兩組別之感染複數(multiplicity of infection，MOI)皆為100。於感染24小時後，以PBS清洗細胞株以除去培養液中未吸附細胞進行感染之病原菌，隨後加入含有濃度為400μg/ml之慶大黴素的培養液進行處理4小時，以確實去除附著於細胞上但未成功穿透細胞進行感染的病原菌，接著收集細胞後抽取DNA，並以qPCR測定感染並進入細胞之病原菌菌量。於此，已知不同菌量之病原菌亦抽取DNA後進行qPCR測定並作為標準曲線。ME對於豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌的抑制感染測定結果分別如圖6A以及圖6C所示，其中，控制組為培養液中沒有加入ME的組別。
由圖6A以及圖6B可見，在圖6B中，若以細胞存活率高於80%作為細胞生長未受明顯影響的依據，則可確定於培養液中含有濃度為800μg/ml之ME不會對於豬腎上皮細胞株的生長有所影響；再觀圖6A，相較於控制組，以ME濃度為800μg/ml進行處理的組別顯然具有明顯較低的菌量，並且於統計上具有顯著差異(p值小於0.05)，也就是說，豬腎上皮細胞株經過濃度為800μg/ml之ME處理後，確實顯著降低病原菌感染而進入細胞內的數量。
由圖6C以及圖6D可見，在圖6D中，若以細胞存活率高於80%作為細胞生長未受明顯影響的依據，則可確定於培養液中含有濃度為1600μg/ml之ME不會對於人類肺上皮細胞株的生長有所影響；再觀圖6C，相較於控制組，以ME濃度為1600μg/ml進行處理的組別顯然具有明顯較低的菌量，並且於統計上具有顯著差異(p值小於0.001)，也就是說，人類肺上皮細胞株經過濃度為1600μg/ml之ME處理後，確實顯著降低病原菌感染而進入細胞內的數量。
由此可知，實施例1之飼料添加劑能夠在不影響豬腎上皮細胞株以及人類肺上皮細胞株生長的情況下，明顯降低豬肺炎黴漿菌以及肺炎黴漿菌感染而進入細胞內的數量，即確實具有有效抑制病原菌感染的效果。
(3)抑制病原菌引起之發炎反應測試(細胞實驗)
本測試係選用小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S cell)以及肺炎黴漿菌進行測試，並藉由測定腫瘤壞死因子TNF-α以及細胞激素IL-6二者的含量以評估發炎反應的程度。
本試驗先進行細胞存活率之測定，以評估不同濃度之ME對於小鼠肺泡巨噬細胞生長的影響，其測定方式與前述(2)抑制病原菌感染測試中所記載相同。小鼠肺泡巨噬細胞的細胞存活率測定結果如圖7C所示，其中，控制組為培養液中沒有加入ME的組別。
在確認不影響細胞存活之ME濃度後，進行抑制病原菌引起之發炎反應測試。具體而言，將細胞株接種於24孔細胞培養盤中並進行隔夜培養，其中，培養液為含有10%之胎牛血清的RPMI培養液，隨後將培養液置換為含有ME濃度為200μg/ml、400μg/ml以及800μg/ml之培養液處理20小時，接著於培養液中加入肺炎黴漿菌進行感染，並且使得MOI為100。於感染2小時後，取培養液進行酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以測定培養液中TNF-α以及IL-6二者的含量，其結果分別如圖7A以及圖7B所示，其中，控制組為僅有培養液的組別；ME 800μg/ml(w/o Mp)為培養液中僅有添加800μg/ml之ME的組別；Mp為僅有小鼠肺泡巨噬細胞的組別；Mp+ME 200μg/ml、Mp+ME 400μg/ml以及Mp+ME 800μg/ml則為小鼠肺泡巨噬細胞經過不同濃度之ME處理的組別。
先由圖7C的結果可見，若以細胞存活率高於80%作為細胞生長未受明顯影響的依據，則可確定於培養液中含有濃度為800μg/ml之ME不會對於小鼠肺泡巨噬細胞的生長有所影響。再觀圖7A，針對TNF-α含量測定結果，相較於未加入ME處理之Mp組，以不同濃度之ME進行處理後的組別可觀察到隨著ME濃度增加而TNF-α含量下降的趨勢，且ME濃度為200μg/ml、400μg/ml以及800μg/ml三者組別所具有降低TNF-α含量的效果於統計上皆具有顯著差異(p
值分別為小於0.05、0.01以及0.001)，也就是說，小鼠肺泡巨噬細胞經過不同濃度之ME處理後，確實能有效減少培養液中的TNF-α含量。再觀圖7B，針對IL-6含量測定結果，其與TNF-α含量測定結果相似，相較於未加入ME處理之Mp組，以不同濃度之ME進行處理後的組別同樣可觀察到隨著ME濃度增加而IL-6含量下降的趨勢，且ME濃度為200μg/ml、400μg/ml以及800μg/ml三者組別所具有降低IL-6含量的效果亦於統計上皆具有顯著差異(p值分別為小於0.05、0.01以及0.001)，也就是說，小鼠肺泡巨噬細胞經過不同濃度之ME處理後，也確實能有效減少培養液中的IL-6含量。
由此可知，小鼠肺泡巨噬細胞經過實施例1之飼料添加劑處理後，確實明顯降低釋放出細胞外之TNF-α以及IL-6的含量，即確實具有有效抑制因呼吸道病原菌引起之發炎反應的效果。
(4)抑制病原菌引起之發炎反應測試(動物實驗)
本試驗係以肺炎黴漿菌感染BALB/c小鼠以引發發炎反應，並測定浸潤至肺泡中的嗜中性球(neutrophil)與單核球(monocyte)二者白血球的數量，以評估發炎反應的程度。具體而言，以ME給予量為1000毫克/公斤(mg/kg)之條件每日餵食小鼠一次並持續進行7日後，以肺炎黴漿菌感染小鼠並持續給予ME，於感染三日後對小鼠進行支氣管肺泡灌洗檢查(bronchoalveolar lavage)，隨後將所得之樣品以流式細胞儀(flow cytometry)進行分析，以測定樣品中的總細胞數量、嗜中性球數量以及單核球數量，其結果分別如圖8A、圖8B以及圖8C所示，其中，控制組為對應實驗組給予小鼠ME時，僅給予小鼠PBS的組別。
由圖8A可見，控制組與ME處理組之樣品中的總細胞數量相近，且於統計上不具有顯著差異，表示兩組別具有相同的比較基礎；再觀圖8B，相較於控制組，在ME處理組之樣品中的嗜中性球數量明顯下降，且於統
計上具有顯著差異(p值小於0.01)；而觀圖8C，相較於控制組，在ME處理組之樣品中的單核球數量則是略有降低。
由此可知，藉由施予小鼠實施例1之飼料添加劑，確實能夠降低因呼吸道病原菌感染而使嗜中性球浸潤至肺泡中的數量，進而可減緩隨後所引發之發炎反應的程度。
由試驗例5的結果可知，以本發明提供之製法所製得之飼料添加劑確實能夠有效抑制呼吸道病原菌的生長以及感染能力，同時亦可減緩及/或抑制因呼吸道病原菌所引起之發炎反應。
綜上所述，本發明藉由特定含量範圍之咖啡渣作為發酵基質且同時控制發酵基質的碳氮比在特定範圍中，再選用米麴菌進行發酵後，所製得之飼料添加劑可兼具較高比活性之消化酶、選擇性地抑菌以及抗呼吸道病原菌之功效，進而能應用於動物飼料中而有促進動物生長以及預防及/或治療呼吸道疾病的效果，不僅妥善解決了咖啡渣廢棄物的問題，亦提供了成本較低且可促進動物生長之動物飼料的替代方案，且同時可降低動物感染呼吸道疾病的風險，進而提升本發明於商業上之價值。
S1:步驟
S2:步驟
Claims (12)
- 一種飼料添加劑之製法，其包含以下步驟：步驟(a)：提供一發酵基質，該發酵基質包含咖啡渣以及一輔料，且以該發酵基質的總重為基準，咖啡渣的含量係大於或等於45重量百分比且小於或等於80重量百分比，其中，該發酵基質的碳氮比係大於或等於46且小於或等於53，該輔料包含粗糠，且以該發酵基質的總重為基準，粗糠的含量係大於或等於7重量百分比且小於或等於10重量百分比；以及步驟(b)：以米麴菌(Aspergillus oryzae)對該發酵基質進行發酵，以獲得該飼料添加劑，其中，以該發酵基質的總重為基準，該米麴菌的用量係大於或等於0.02重量百分比且小於或等於0.2重量百分比，且該米麴菌對該發酵基質進行發酵的溫度係大於或等於25℃且小於或等於40℃，進行發酵的時間係大於或等於2天且小於或等於12天。
- 如請求項1所述之飼料添加劑之製法，其中，以該發酵基質的總重為基準，該輔料的含量係大於或等於20重量百分比且小於或等於55重量百分比。
- 如請求項1所述之飼料添加劑之製法，其中，該輔料進一步包含玉米碎、脫殼豆粉、碎米或其組合。
- 如請求項1所述之飼料添加劑之製法，其中，該發酵基質的含水率係大於或等於50重量百分比且小於或等於75重量百分比。
- 一種飼料添加劑用於製備促進動物生長之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由如請求項1至4中任一項所述之飼料添加劑之製法所製得。
- 如請求項5所述之用途，其中，該飼料添加劑亦用於製備預防及/或治療呼吸道疾病之組成物的用途，且該呼吸道疾病是由豬鏈球菌 (Streptococcus suis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer)、鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)或肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)感染造成之疾病。
- 一種飼料添加劑用於製備預防及/或治療呼吸道疾病之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由如請求項1至4中任一項所述之飼料添加劑之製法所製得，且該呼吸道疾病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer)、鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)或肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)感染造成之疾病。
- 一種飼料添加劑用於製備抑制病原菌生長之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由如請求項1至4中任一項所述之飼料添加劑之製法所製得，該病原菌包含豬鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、雷氏桿菌、鴨源雞桿菌、葡萄球菌、豬肺炎黴漿菌或肺炎黴漿菌。
- 一種飼料添加劑用於製備抑制病原菌感染之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由如請求項1至4中任一項所述之飼料添加劑之製法所製得，該病原菌包含豬肺炎黴漿菌或肺炎黴漿菌。
- 一種飼料添加劑用於製備抑制發炎之組成物的用途，其中，該飼料添加劑係由如請求項1至4中任一項所述之飼料添加劑之製法所製得。
- 如請求項10所述之用途，其中，所述發炎係指肺炎。
- 如請求項11所述之用途，其中，所述肺炎係由豬肺炎黴漿菌或肺炎黴漿菌所引起。
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