TWI797600B

TWI797600B - 用以提升腦組織能力之組合物及其用途

Info

Publication number: TWI797600B
Application number: TW110114810A
Authority: TW
Inventors: 何協勳; 郭易緯; 夏可強; 林文揚; 林家弘; 林杞輝; 劉承叡; 陳淑慧
Original assignee: 豐華生物科技股份有限公司
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-04-01
Also published as: TW202241476A; US20230000930A1; CN115226897A

Abstract

一種包含唾液乳酸桿菌 ( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種 ( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其具有提升腦組織能力之生理活性效果，因此，上述之組合物可作為提升腦組織能力之用途，且以食品或醫藥組合物的形式存在。

Description

用以提升腦組織能力之組合物及其用途

本發明是有關一種組合物以及其用途，特別是一種用以提升腦組織能力之含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物及其用途。

美國的統計顯示帕金森氏症(Parkinson's disease，PD)約占60歲以上老年人口的1%。台灣的資料顯示好發病的年齡平均約62歲左右，盛行率約莫1%。男性發病的機率為女性的1.5倍。巴金森氏症的主要病理變化發生在中腦黑質緻密部的多巴胺性神經元退化，影響運動進行性發展，導致運動遲緩、震顫、僵硬和姿勢不穩定。

中腦黑質腹側的緻密部含有大量多巴胺神經元，並傳訊給大腦基底核。巴金森氏症造成多巴胺神經元退化的原因目前仍未有定論。其中較主要的一群患者(約佔60~70%)是因為遺傳、腦外傷、化學毒物等因子造成位於中腦的黑質細胞(substantia nigra)退化，進一步造成神經傳導物質多巴胺(dopamine)的分泌不足或是乙醯膽鹼(acetylcholine，Ach)與多巴胺之比例不平衡所致。進而使得基底核(basal ganglia)中仰賴黑質細胞提供多巴胺做為神經傳導物質的紋狀體(striatum)受到影響，無法調節大腦皮質、視丘(thalamus)與錐體外系統(extrapyramidal system)的訊息，因而引起各肌肉之間協調運作功能上的障礙。

很多的研究證據顯示巴金森氏症都會有腸道菌叢及代謝物改變的現象，尤其巴金森氏症患者具有很高的胃幽門桿菌罹患率。此外，最近的研究亦發現巴金森氏症會伴隨著糞便菌相中Blautia、Coprococcus以及Roseburia屬減少現象及Ralstonia屬增多等菌相失衡的情形。

一些研究已顯示某些乳酸菌株不僅可以治療疾病並且能減少認知功能及情緒性的行為損耗。舉例而言，Dinan等人提出精神益生菌(Psychobiotics)是益生菌概念的延伸，意指適量攝取具有活性的微生物能有助於精神病患者的健康，常見的功能如增加腸道抵抗力、改善腸道菌相、免疫調節、幫助消化等(Dinan et al.,(2013)."Psychobiotics：a novel class of psychotropic".Biological Psychiatry,74(10)：720-6.doi：https：//doi.org/10.1016/j.biopsych.2013.05.001)。近年來亦發現餵食乳酸菌可以影響宿主行為及腦部功能，例如Desbonnet等人的研究中發現，餵養Bifidobacterium infantis 35624除了可以改善小鼠類憂鬱的行為表現外，還能增加小鼠腦中的神經傳導物質(Desbonnet et al.,(2008)."The probiotic Bifidobacteria infantis：An assessment of potential antidepressant properties in the rat".Journal of Psychiatric Research,43(2)：164-174.doi：https：//doi.org/10.1016/j.jpsychires.2008.03.009)。

有鑑於此，發展出一種安全且可長期使用的營養補充品來提升腦組織能力有其迫切性。而乳酸菌一般來說是安全的，因此，找出具有提升腦組織能力功效的乳酸菌菌株便是目前極需努力的目標。

本發明提供一種包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其具有提升腦組織能力之生理活性效果，因此，本發明之含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物可作為提升腦組織能力之用途，且以食品或醫藥組合物的形式存在。

本發明一實施例之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中食品組合物包含經分離之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一以及生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。經分離之乳酸菌菌株包含寄存編號為BCRC 910437之唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株、寄存編號為BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02菌株、或以上菌株之組合，上述菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所。

本發明另一實施例之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中醫藥組合物包含經分離之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一以及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。經分離之乳酸菌菌株包含寄存編號為BCRC 910437之唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株、寄存編號為BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02菌株、或以上菌株之組合，上述菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所。

本發明又一實施例之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物包含經分離之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一以及生理上或醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。經分離之乳酸菌菌株具有提升腦組織能力之生理活性效果，且包含寄存編號為BCRC 910437之唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株、寄存編號為BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02菌株、或以上菌株之組合，上述菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所。

以下藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容易瞭解本發明之目的、技術內容、特點及其所達成之功效。

圖1顯示大鼠於飼養期間之平均體重變化。

圖2顯示以每分鐘身體旋轉次數評估大鼠之運動性之試驗結果。

圖3顯示以平衡桿上之停留時間評估大鼠之協調性以及平衡性之試驗結果。

圖4顯示大鼠紋狀體中酪氨酸羥化酶陽性水平(Tyrosine hydroxylase positive level，TH+level)之試驗結果，其以未病變側腦組織標準化病變側腦組織之酪氨酸羥化酶陽性水平%表示。

圖5顯示大鼠黑質緻密部中酪氨酸羥化酶陽性水平(TH+level)之試驗結果，其以未病變側腦組織標準化病變側腦組織之酪氨酸羥化酶陽性水平%表示。

圖6顯示大鼠腦組織之基礎粒線體之基礎耗氧率(Oxygen Consumption Rate，OCR)試驗結果，並以正常飲食控制組標準化其餘各組之基礎耗氧率%表示。

圖7顯示大鼠肌肉組織之基礎粒線體之基礎耗氧率(OCR)試驗結果，並以正常飲食控制組標準化其餘各組之基礎耗氧率%表示。

以下將詳述本發明之各實施例，並配合圖式作為例示。除了這些詳細說明之外，本發明亦可廣泛地施行於其它的實施例中，任何所述實施例的輕易替代、修改、等效變化都包含在本發明之範圍內，並以申請專利範圍為準。在說明書的描述中，為了使讀者對本發明有較完整的瞭解，提供了許多特定細節；然而，本發明可能在省略部分或全部特定細節的前提下，仍可實施。此外，眾所周知的步驟或元件並未描述於細節中，以避免對本發明形成不必要之限制。圖式中相同或類似之元件將以相同或類似符號來表示。特別注意的是，圖式僅為示意之用，並非代表元件實際之尺寸或數量，有些細節可能未完全繪出，以求圖式之簡潔。

本發明所述的乳酸菌菌株以冷凍乾燥培養物形式寄存於財團法人食品工業發展研究所，地址為台灣新竹市食品路331號。寄存詳細資料如表1所示：

如表1所列寄存於財團法人食品工業發展研究所之寄存編號BCRC 910437之唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株以及寄存編號BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02菌株具有提升腦組織修復能力之生理活性效果。因此，表1所列之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物可用於提升腦組織修復能力之用途。

於一實施例中，本發明之用以提升腦組織修復能力之組合物包含經分離之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物，以及賦形劑、稀釋劑或載體，其中唾液乳酸桿菌AP-32菌株之寄存編號為BCRC 910437，長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株之寄存編號為BCRC 910812，寄存於財團法人食品工業研究所。

於一實施例中，賦形劑、稀釋劑或載體可為生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體，使本發明之組合物作為一食品組合物使用。於一實施例中，賦形劑、稀釋劑或載體可為醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體，使本發明之組合物作為一醫藥組合物使用。

於食品組合物之實施例中，生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體可為一食品，舉例而言，食品可包含但不限於乳製飲品、茶、咖啡、糖果(例如口含片、咀嚼錠、軟糖等)、機能性飲品或以上之組合，其中乳製飲品可包含發酵乳、優格、乳酪或乳粉等。

於醫藥組合物之實施例中，醫藥組合物可為一口服劑型。舉例而言，口服劑型可為錠劑、膠囊、溶液劑或粉劑等。

於一實施例中，所述之唾液乳酸桿菌為活性菌株，於食品組合物或醫藥組合物之實施例中，菌株數量為10⁶CFU以上，較佳者，菌株數量為10¹⁰CFU以上。於一實施例中，所述之唾液乳酸桿菌可為去活性菌株。於含乳酸菌發酵物之組合物之實施例中，發酵物可包含去活性菌株的發酵液、去除菌體的發酵液或上述之乾燥粉末。舉例而言，發酵液可為發酵上清液或乳清發酵液等。於一實施例中，依組合物總重量計，乳酸菌發酵物之乾燥粉末含量為0.5wt%以上；或者，乳酸菌發酵物之發酵液含量為2.5wt%以上。

實施例1：乳酸菌菌株之形態學及一般性質

根據16S rDNA序列分析以及API細菌鑑定系統分析結果來確認乳酸菌菌株於分類學上的特徵。乳酸菌菌株於形態學及一般性質上的特徵詳如表2所示：

實施例2：乳酸菌菌株之收集、培養與保存

本發明之乳酸菌菌株是以20%甘油保存於-80℃。使用前，於37℃下以含有0.05% cysteine的MRS broth(DIFCO)活化24小時二次後使用。所使用之唾液乳酸桿菌AP-32菌株來源為人類腸道，長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株來源為健康人類母乳。於一實施例中，培養所使用的液態培養基包含碳源以及氮源至少其中之一。舉例而言，碳源包含葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、澱粉、糖蜜、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、麥芽萃取物、麥芽糊精或以上任意組合；氮源包含(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₃PO₄、NH₄NO₃、NH₄Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、尿素(urea)、蛋白腖(peptone)、聚蛋白腖(polypeptone)、胰化腖(tryptone)、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、大豆粉(soybean flour)、乳清、或以上之組合。於一實施例中，依培養所使用之液態培養基的重量計，液態培養基包含2-5wt%之葡萄糖以及麥芽糊精之混合物，較佳者，液態培養基包含3wt%之葡萄糖以及麥芽糊精之混合物。於一實施例中，培養所使用的液態培養基包含5-30wt%牛奶以及1-10wt%大豆粉至少其中之一。

乳酸菌菌株之發酵物是以本發明之乳酸菌菌株於液態培養基發酵所產生的，再經離心、過濾、加熱殺菌等步驟，最後純化取得。依實際需求，發酵物可進一步乾燥成乳酸菌發酵物粉末，而粉末劑型或所形成的水溶液劑型可保存於常溫。

實施例3：巴金森氏症大鼠之動物造症模式

本試驗採用6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine，6-OHDA)的方式來誘發大鼠產生仿巴金森氏症的症狀。採用單側注射6-OHDA破壞單側多巴胺系統造成單側性巴金森氏症(hemi parkinsonism)動物模式，克服雙側注射6-OHDA術後大鼠照護的困難是目前研究常用的方法。利用立體定位儀並透過微注射器將6-OHDA注入黑質緻密部與紋狀體之間，破壞黑質緻密部之多巴胺神經元造成釋放至紋狀體的多巴胺減少，使大鼠誘發類似巴金森氏的病症。

單側6-OHDA損傷程序：用Tiletamine以及Zolazepam(TZ)以1：1比例混和而成的肌肉注射麻醉藥劑(2.5mg/kg)和若朋(0.3mg/kg)麻醉所有經受6-OHDA損傷的大鼠。所有大鼠均用Desipramine(Norpramin)(25mg/kg)腹腔注射，在6-OHDA損傷前保護其去甲腎上腺素能神經元。使用微鑽在右額骨上鑽一個鑽孔。用Hamilton微量注射器將溶解在4L無菌0.9% NaCl以及0.02%抗壞血酸中的12g 6-OHDA(購自Sigma)以0.5L/min流速注入內側前腦束(medial forebrain bundle，MFB)。根據Paxinos和Watson的立體定位圖譜，注射部位的立體定位坐標為前額縫合線：後部4.0mm，側面1.3mm，硬腦膜腹側7.8mm，以0.5μl/min的流速進行6-OHDA注射，注射後在10分鐘內緩慢取出針頭，讓大鼠從麻醉中恢復。

單側注射6-OHDA進行行為評估的方法是利用阿朴嗎啡(Apomorphine)做腹部注射，阿朴嗎啡會促使紋狀體多巴胺突觸後接受器(Dopaminergic post-synaptic receptors)增加。在多巴胺減少的情況下，該側多巴胺的傳遞顯得較為薄弱而出現不平衡旋轉的現象，當觀察大鼠於每小時旋轉達一百轉以上即可確認為患有巴金森氏症。

本試驗使用自樂斯科生物科技股份有限公司購得300g之6-8週齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，安置在溫度控制22±2℃以及濕度55±5%的飼養箱中，動物房維持12小時的光暗週期。以購自樂斯科生物科技股份有限公司之MFG固形飼料餵養大鼠適應期一週。試驗中控制組及適應週給予試驗動物之一般固形飼料為MFG飼料，其熱量為3.57kcal/g，動物飼料(Chow 5001)與水提供予大鼠自由攝食。本試驗使用6-8週齡的Sprague Dawley大鼠30隻，每組5隻隨機分成以下組別： (1)正常飲食控制組(ND)：實驗大鼠未注射6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine，6-OHDA)造症，且未餵食本發明之乳酸菌菌株或其發酵物；(2)巴金森氏症造症組(PD)：注射6-OHDA至實驗大鼠，待3週及6週後給予阿朴嗎啡(Apomorphine)評估來確認仿帕金森氏症動物模式造症成功；(3)左多巴治療組(LD)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式以6mg/kg之劑量連續給予左多巴(L-dopa)14週；(4)實驗組一(AP-32)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式連續給予1倍劑量(1.03×10⁹CFU/kg/day)之本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株14週；(5)實驗組二(BLI-02)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式連續給予1倍劑量(1.03×10⁹CFU/kg/day)之本發明之長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株14週；(6)實驗組三(gL-57)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式連續給予1倍劑量(1.03×10⁹CFU/kg/day)之短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)gL-57菌株14週；(7)實驗組四(gL-39)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式連續給予1倍劑量(1.03×10⁹CFU/kg/day)之動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)gL-39菌株14週；(8)實驗組五(AP-32MR)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式連續給予62mg/kg/day劑量之本發明唾液乳酸桿菌AP-32菌株之發酵物14週； (9)實驗組六(BLI-02MR)：注射6-OHDA至實驗大鼠並確認造症成功，再由管餵模式連續給予62mg/kg/day劑量之本發明長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株之發酵物14週。

本試驗是依照文獻補充乳酸菌的劑量作為參考，並依人體實際建議攝取量作設計，即「建議每人每日建議補充約1×10¹⁰CFU」的劑量作為1倍劑量來進行試驗。以成人60kg體重計算，人體每日乳酸菌之建議攝取量為1×10¹⁰CFU；人體每日乳酸菌發酵物之建議攝取量為600mg。由於人體與不同實驗動物之代謝速率有所差異，因此依據2005年美國食品藥物管理局所公告之估算方法(Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)(US FDA，2005)，將人體劑量換算成試驗動物之投予劑量。人體與大鼠之換算系數為6.2倍，故大鼠之1倍劑量乳酸菌為10¹⁰CFU/60kg×6.2=1.03×10⁹CFU/kg；大鼠之1倍劑量乳酸菌發酵物為600mg/60kg×6.2=62mg/kg。依據試驗動物之個別體重變異換算出試驗樣品劑量，溶於1mL去離子水中直接管灌，並同時給予MFG固形飼料。未管餵本發明之乳酸菌或其發酵物之組別則管餵等體積之去離子水。

實施例4：大鼠糞便之短鏈與中鏈脂肪酸分析

本試驗利用氣相色譜法質譜法聯用法(GC-MS)分析大鼠糞便中的短鏈脂肪酸(Short chain fatty acid，SCFA)與中鏈脂肪酸(middle chain fatty acid，MCFA)之含量。試驗步驟如下：

(1)收集大鼠之腸道內容物和糞便樣本凍乾並將其研磨成粉。

(2)稱取150mg凍乾粉，先加入150μL 1M的鹽酸飽和氯化鈉溶液，再加入含內標物質2-乙基丁酸的1.5mL乙酸乙酯(內標濃度為5μg/mL)。

(3)將樣本放於均質器上研磨混勻，經l0000rpm離心10min。

(4)取220μL上清液以100mg硫酸鎂乾燥後，經18000rpm離心10min。

(5)取150μL上清液用50mg硫酸鎂乾燥後，經18000rpm離心10min後，取72μL上清液置於密封氣相小瓶中。

(6)加入18μL衍生化試劑MTBSTFA，旋緊瓶蓋，混勻後置於80℃水浴中水浴20分鐘。

(7)將樣本放於室溫衍生化8h，再以GC-MS代謝組進行分析。將經過衍生化反應之樣品，取1μL直接透過自動進樣裝置注入儀器分析。

氣相層析質譜儀套件是由Thermo Finnigan Trace GC 2000與Polaris Q mass detector以及質譜儀器軟體(Xcalibur)所組成。層析管柱為30m×0.25mm×0.25μm之Rtx-5MS毛細管柱(restek)。注入器與離子源之溫度分別為230℃與200℃。所有GC-MS所測得的波峰，可依不同滯留時間與質譜特性，透過市售標準品之比對以及NIST與Wiley資料庫之搜索，逐一進行能量代謝相關中間代謝產物成分鑑定與定量分析工作，以了解能量代謝偏好性。

大鼠糞便之短鏈脂肪酸以及中鏈脂肪酸之含量分析結果如表3所示，其中符號a表示與正常飲食控制組(ND)相比具有顯著差異，p<0.05；符號b表示與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異，p<0.05。表3之分析結果顯示，在四株試驗乳酸菌菌株中，以本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株有較佳的短鏈脂肪酸產出，其中乙酸的產量為最佳。AP-32組之大鼠腸道中的丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、己酸、庚酸與巴金森氏症造症組(PD)相比有顯著的增加；而AP-32MR組之大鼠腸道中的丙酸、丁酸、異戊酸與巴金森氏症造症組(PD)相比亦有顯著的增加。BLI-02組之大鼠腸道中的丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、己酸、庚酸與巴金森氏症造症組(PD)相比有顯著的增加；而BLI-02MR組之大鼠腸道中的丙酸、丁酸、異戊酸與巴金森氏症造症組(PD)相比亦有顯著的增加。

實施例5：大鼠之平均體重與身體組成之分析

大鼠身體組成是使用身體組成測定儀(DEXA,GE Lumar,Madison,Wisc.,USA)進行測量。老鼠經8小時的空腹，麻醉後以四肢張開的姿勢固定四肢於固定板上，並分別輸入老鼠資料，包括出生日期、身長與體重後即開始進行測量。身體組成測定儀以兩個不同等級的X光掃描大鼠身體，藉由骨頭與軟組織吸收不同程度的X光，軟組織中肌肉與脂肪也會吸收不同程度的X光，再經由儀器內建之公式計算後，獲得肌肉量和體脂肪率。統計分析利用One-way ANOVA以Tukey HSD檢驗，表示方法為mean±SEM。

大鼠之身體組成成分之分析結果如表4所示，其中符號a表示與正常飲食控制組(ND)相比具有顯著差異，p<0.05；符號b表示與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異，p<0.05。表4之分析結果顯示，餵食本發明唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)之組別，其總體脂肪、總肌肉含量與骨密度有提升的效果，與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異。相較於左多巴治療組(LD)，AP-32組與BLI-02組亦有較佳的提升。

請參照圖1，其為各組大鼠於飼養期間之平均體重變化。圖1之結果顯示，因6-OHDA注射造症引起的肌肉不協調，進而影響大鼠的進食，造成體重逐週下降。餵食左多巴之治療組(LD)對於大鼠體重的提升並沒有幫助，但餵食本發明唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)之組別，大鼠的體重能夠逐步的上升，在第14週已接近正常飲食控制組(ND)的體重。

實施例6：大鼠之運動功能評估

本試驗是利用Rotarod滾筒跑步機，檢測大鼠協調性與平衡感。RT Series滾筒式跑步機主要是應用於研究藥物對動作協調性和抗疲勞特性的實驗，以及抗疲勞藥物篩選和鑑定檢測的理想儀器。此儀器主要適用於大、小鼠進行疲勞實驗、骨骼肌鬆弛實驗、中樞神經抑制實驗、以及其他需以運動方式檢測藥物作用的實驗，例如毒性對運動能力的影響、體內某種物質缺乏對運動能力的影響以及心腦血管藥物對運動能力的影響等。統計分析利用One-way ANOVA以Tukey HSD檢驗，表示方法為mean±SEM。

以6-OHDA造症會使大鼠失去身體平衡，因而增加平均每分鐘身體旋轉次數，因此，透過每分鐘身體旋轉次數可評估6-OHDA造症對大鼠的影響。對於大鼠之每分鐘身體旋轉次數之試驗結果如圖2所示，其中符號a表示與正常飲食控制組(ND)相比具有顯著差異，p<0.05；符號b表示與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異，p<0.05。由可圖2之結果可知，相較於巴金森氏症造症組(PD)，餵食左多巴(LD)、唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)、唾液乳酸桿菌AP-32菌株之發酵物(AP-32MR)、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株之發酵物(BLI-02MR)之組別皆能顯著降低身體旋轉次數。需注意的是，相較於餵食左多巴(LD)，餵食本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)、唾液乳酸桿菌AP-32菌株之發酵物(AP-32MR)、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株之發酵物(BLI-02MR)具有更佳的改善效果。

以6-OHDA造症會使大鼠失去身體的協調以及平衡，因此，透過大鼠於平衡桿上停留的時間長度可評估6-OHDA造症對大鼠的影響。對於大鼠之協調性以及平衡性之試驗結果如圖3所示，其中符號a表示與正常飲食控制組(ND)相比具有顯著差異，p<0.05；符號b表示與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異，p<0.05。由圖3之結果可知，相較於巴金森氏症造症組(PD)，餵食左多巴(LD)、唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)、唾液乳酸桿菌AP-32菌株之發酵物(AP-32MR)、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株之發酵物(BLI-02MR)之組別皆能顯著提升大鼠平衡感，延長於平衡桿上的停留時間。

實施例7：大鼠大腦中酪氨酸羥化酶陽性水平(Tyrosine hydroxylase positive level，TH+level)分析

在人體中，多巴胺是重要的兒茶胺類的神經傳導物質，同時也是內分泌系統的激素，用來調節血管的收縮、以及肝醣分解等生理功能。多巴胺是由酪胺酸(tyrosine)經一連串反應衍生而來的生物胺類。多巴胺的代謝路徑是由苯丙胺酸(phenylalanine)先經由苯丙胺酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase)催化形成酪胺酸，再經由酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)催化產生左多巴(L-dopa)，再藉著芳香族胺基酸脫羧酶(aromatic amino acid decarboxylase，AADC)或多巴脫羧酶(DOPA decarboylase)脫去一分子的二氧化碳成為多巴胺。因此，酪氨酸羥化酶在大腦多巴胺的合成中扮演重要角色。

臨床上，缺乏酪胺酸羥化酶(TH)將造成神經傳導物質的傳遞被阻斷，進而造成多巴胺、正腎上腺素、腎上腺素(總稱兒茶酚胺(catecholamine)) 以及血清張力素(serotonin)在中樞及周邊神經系統的缺乏。臨床醫學稱之為酪胺酸羥化酶缺乏症。此症的表現差異很大，從症狀最輕微的酪胺酸羥化酶缺乏Dopa-反應型肌張力不全症(TH-deficient dopa-responsive dystonia，DRD)、較為嚴重的TH缺乏型嬰幼兒巴金森氏症(TH-deficientinfantile parkinsonism)，以及更為嚴重的進行性嬰幼兒腦部病變(TH-deficient progressive infantile encephalopathy)都可能發生。症狀較輕微者約在童年時期發病，一開始可能表現單邊或不對稱的四肢肌張力不全、姿勢性顫抖或步伐不協調等症狀。但隨著病程的進展，可能發生典型dopa-反應型肌張力不全性步伐異常(classic dopa-responsive dystonic gait disorder)。輕微症狀患者通常對藥物治療是有效的。症狀中度嚴重者，患者可能無法走路或是步行非常困難。這些患者治療上較不易，會需要數種藥物配合，但常常會受到藥物副作用的影響而出現過度運動和易怒等現象，且需長期配合治療。

本試驗是將試驗動物犧牲後，馬上利用骨剪將腦殼剪開，露出完整的腦組織後，用刮勺沿著腦組織周圍小心地將腦組織取出，移至1.5mL的微量離心管中，並保存於-80℃冰箱待日後實驗使用。低溫腦組織切片用一級抗體處理，一級抗體如下：antiphospho-α-synucleinSer129 polyclonal antibody、monoclonal anti-α-synuclein antibody、anti-NeuN monoclonal antibody或monoclonal anti-tyrosine hydroxylase antibody。之後將一級抗體洗掉，再用二級抗體以及streptavidin peroxidase conjugates處理。最後腦組織切片藉由二氨基聯苯胺(3’,3’-diaminobenzendine，DAB)染色，並用Stereo Investigator software(MBF Biosciences)計算NeuN+神經元(NeuN+-neurons)或TH+多巴胺神經元(TH+-dopaminergic neurons)的數量。再用ImageJ software(National Institutes of Health)去定量基底核中酪氨酸羥化酶陽性(TH+)染色的結果，並以未病變側腦組織標準化病變側腦組織的酪氨酸羥化酶陽性水平%表示。統計分析利用One-way ANOVA以Tukey HSD檢驗，表示方法為mean±SEM。

利用腦中TH+水平評估6-OHDA誘導大鼠成帕金森氏症後的多巴胺能神經元。於內側前腦束(medial forebrain bundle，MFB)單邊注射6-OHDA會損傷紋狀體和黑質緻密部中的多巴胺能神經元。紋狀體之酪氨酸羥化酶陽性水平之試驗結果如圖4所示；黑質緻密部之酪氨酸羥化酶陽性水平之試驗結果如圖5所示，其中符號a表示與正常飲食控制組(ND)相比具有顯著差異，p<0.05；符號b表示與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異，p<0.05。在紋狀體(如圖4所示)和黑質緻密部(如圖5所示)中，未經治療的巴金森氏症造症組(PD)與正常飲食控制組(ND)相比，其TH+水平顯示腦中多巴胺能神經元顯著減少。相較於巴金森氏症造症組(PD)，餵食本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)以及長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株之發酵物(BLI-02MR)之組別在紋狀體以及黑質緻密部之TH+含量顯著增加，如圖4以及圖5所示，且與巴金森氏症造症組(PD)比較下具有統計上的差異。

由上述試驗結果可知，巴金森氏症大鼠經補充本發明之乳酸菌或其發酵物可有效保護大腦中多巴胺能神經元。此外，大鼠腦部酪氨酸羥化酶陽性(TH+)含量提升，將有助於緩解酪胺酸羥化酶缺乏症造成的相關肌肉張力不全等病症。

實施例8：腦組織與肌肉組織中粒線體活性分析

有研究指出，大腦多巴胺神經元退化與大腦中的粒線體功能障礙有關。粒線體在大腦細胞中特別活躍，參與大腦中許多重要的生物學過程，包括自由基和神經遞質(Neurotransmitter)的調節。實際上，負責單胺神經遞質代謝的單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)就位於粒線體外膜內。粒線體功能障礙會降低ATP(三磷酸腺核苷，adenosine triphosphate)能量的產生並增加氧化壓力，而氧化壓力通常會在患有腦和精神疾病的人的大腦中發現。實驗研究也發現失智症身上的粒線體活性降低，無法提供足夠的能量給大腦。

本試驗是將試驗動物犧牲後，分別採取腦組織以及肌肉組織放置於含有DMEM(Dulbecco's modified minimal essential)培養基(含有2%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS))的盤子中。取出組織後加入含有琥珀酸一銨(monoammonium succinate，MAS)溶液的玻璃磨組織器，將組織磨製完全破碎後，離心去除上清液。加入不含牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的MAS溶液，再次離心去除上清液。加入1mL不含BSA的MAS溶液與下方沉澱物混合，便能取出含有粒線體之溶液，隨後進行蛋白質之定量。

將此組織培養盤放入XF24 extracellular flux analyzer進行分析。此測定方式為透過光學式探針以不需添加任何化學試劑、不接觸、不破壞細胞的狀況下進行偵測。偵測時，探針系統貼近細胞，於培養盤的底部形成一個暫時性的封閉空間，並且透過觀察此微小空間中氧氣消耗率與產酸率，即時觀測細胞中粒線體運作的狀況。此分析儀同時整合了自動化的藥物注射系統，所加入的藥物依序為，寡黴素(oligomycin)粒線體ATP合成酶抑制劑、羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，FCCP)、抗黴素A(antimycin A)粒線體complexIII抑制劑將粒線體膜上穿孔，目的為觀察粒線體基礎耗氧能力(basal respiration)、ATP生產效能(ATP production)、最大耗氧能力(Maximal Respiration)以及粒線體膜的完整性(Proton Leak)。

針對大鼠腦組織中粒線體活性之分析結果如圖6所示，針對大鼠肌肉組織中粒線體活性之分析結果如圖7所示，其中符號a表示與正常飲食控制組(ND)相比具有顯著差異，p<0.05；符號b表示與巴金森氏症造症組(PD)相比具有顯著差異，p<0.05。統計分析利用One-way ANOVA以Tukey HSD檢驗，表示方法為mean±SEM。請參照圖6，餵食14週本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)或其發酵物(AP-32MR、BLI-02MR)之大鼠腦組織中粒線體呼吸作用比例為最好，且與巴金森氏症造症組(PD)比較下具有統計上的差異。請參照圖7，餵食14週本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株(AP-32)、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株(BLI-02)或其發酵物(AP-32MR、BLI-02MR)之大鼠肌肉組織中粒線體呼吸作用比例為最好，且與巴金森氏症造症組(PD)比較下具有統計上的差異，其中餵食本發明乳菌之發酵物(AP-32MR、BLI-02MR)之組別有更佳的表現。餵食本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物能有效提升腦組織的粒腺體比例，這表示本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物有助於緩解大腦中因缺少粒線體功能造成的失智現象或精神壓力。有文獻指出巴金森氏症患者也可能伴隨體重減輕和肌肉質量減輕的問題。而餵食本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物有助於大鼠肌肉組織中的粒線體比例上升。肌肉粒線體活性的增強可能會增加肌肉的能量利用率，從而導致體重和肌肉質量恢復，將有助於肌肉運動上的表現。

綜合上述，本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物具有提升腦組織能力之生理活性效果，因此，本發明之唾液乳酸桿菌AP-32菌株、長雙岐桿菌嬰兒亞種BLI-02菌株或其發酵物可作為上述生理活性之用途，並以食品組合物或醫藥組合物的形式存在。

以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。

【生物材料寄存】

財團法人食品工業發展研究所、2009年7月30日、BCRC 910437

財團法人食品工業發展研究所、2018年1月18日、BCRC 910812

Claims

一種乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該食品組合物包含：經分離之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一，其中該乳酸菌菌株包含寄存編號為BCRC 910437之唾液乳酸桿菌 ( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 菌株、寄存編號為BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種 ( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02菌株、或以上菌株之組合，上述菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及生理上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該乳酸菌菌株為活性菌株。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該發酵物為包含去活性菌株或去除菌體的發酵上清液、乳清發酵液、或以上之乾燥粉末。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該賦形劑、稀釋劑或載體為一食品。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該賦形劑、稀釋劑或載體為發酵乳、優格、乳酪、乳粉、茶、咖啡、糖果、機能性飲品或以上之組合。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該乳酸菌菌株培養於一培養基，且該培養基包含碳源以及氮源至少其中之一，其中該碳源包含葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、澱粉、糖蜜、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、麥芽萃取物、麥芽糊精或以上之組合，以及該氮源包含(NH ₄) ₂SO ₄、(NH ₄) ₃PO ₄、NH ₄NO ₃、NH ₄Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白腖、聚蛋白腖、胰化腖、肉類萃取物、酵母萃取物、酵母粉、牛奶、大豆粉、乳清、或以上之組合。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該乳酸菌菌株培養於一培養基，且該培養基包含2-5%之葡萄糖以及麥芽糊精之混合物。
如請求項1所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之食品組合物之用途，其中該乳酸菌菌株培養於一液態培養基，且該液態培養基包含5-30wt%牛奶以及1-10wt%大豆粉至少其中之一。
一種乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含：經分離之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一，其中該乳酸菌菌株包含寄存編號為BCRC 910437之唾液乳酸桿菌 ( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 菌株、寄存編號為BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種 ( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02菌株、或以上菌株之組合，上述菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該乳酸菌菌株為活性菌株。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該發酵物為包含去活性菌株或去除菌體的發酵上清液、乳清發酵液、或以上之乾燥粉末。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物為一口服劑型。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物為錠劑、膠囊、溶液劑或粉劑。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該乳酸菌菌株培養於一培養基，且該培養基包含碳源以及氮源至少其中之一，其中該碳源包含葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、澱粉、糖蜜、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、麥芽萃取物、麥芽糊精或以上之組合，以及該氮源包含(NH ₄) ₂SO ₄、(NH ₄) ₃PO ₄、NH ₄NO ₃、NH ₄Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白腖、聚蛋白腖、胰化腖、肉類萃取物、酵母萃取物、酵母粉、牛奶、大豆粉、乳清、或以上之組合。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該乳酸菌菌株培養於一培養基，且該培養基包含2-5%之葡萄糖以及麥芽糊精之混合物。
如請求項9所述之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一在製備提升腦組織能力之醫藥組合物之用途，其中該乳酸菌菌株培養於一液態培養基，且該液態培養基包含5-30wt%牛奶以及1-10wt%大豆粉至少其中之一。
一種包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，包含：經分離之乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一，其中該乳酸菌菌株具有提升腦組織能力之生理活性效果，且包含寄存編號為BCRC 910437之唾液乳酸桿菌 ( Lactobacillus salivariussubsp. salicinius) AP-32 菌株、寄存編號為BCRC 910812之長雙岐桿菌嬰兒亞種 ( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02菌株、或以上菌株之組合，上述菌株寄存於財團法人食品工業發展研究所；以及生理上或醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該乳酸菌菌株為活性菌株。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該發酵物為包含去活性菌株或去除菌體的發酵上清液、乳清發酵液、或以上之乾燥粉末。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該賦形劑、稀釋劑或載體為一食品。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該賦形劑、稀釋劑或載體為發酵乳、優格、乳酪、乳粉、茶、咖啡、糖果、機能性飲品或以上之組合。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其為一醫藥組合物，且為一口服劑型。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其為一醫藥組合物，且為口服之錠劑、膠囊、溶液劑或粉劑。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該乳酸菌菌株培養於一培養基，且該培養基包含碳源以及氮源至少其中之一，其中該碳源包含葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、澱粉、糖蜜、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、麥芽萃取物、麥芽糊精或以上之組合，以及該氮源包含(NH ₄) ₂SO ₄、(NH ₄) ₃PO ₄、NH ₄NO ₃、NH ₄Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白腖、聚蛋白腖、胰化腖、肉類萃取物、酵母萃取物、酵母粉、牛奶、大豆粉、乳清、或以上之組合。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該乳酸菌菌株培養於一培養基，且該培養基包含2-5%之葡萄糖以及麥芽糊精之混合物。
如請求項17所述之包含乳酸菌菌株以及其發酵物至少其中之一之組合物，其中該乳酸菌菌株培養於一液態培養基，且該液態培養基包含5-30wt%牛奶以及1-10wt%大豆粉至少其中之一。