TWI785853B - 組成物用於治療高血壓的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種組成物用於治療高血壓的用途，其中組成物是選自於下列所組成的群組：(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮、(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0001-2
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺，及其組合。本發明使用小分子化合物(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮、(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹

Description

組成物用於治療高血壓的用途
本發明是有關於一種組成物用於治療高血壓的用途。
高血壓是全世界重要的疾病之一，它的盛行率約占全人口25%，50歲以上約占30%，65歲以上約占50%。在台灣高人口死亡率疾病中，它在第九位，與第二位心臟病，第三位的腦中風息息相關。
高血壓藥物治療的開發，過去2、30年來從利尿劑、交感神經阻斷劑、鈣離子通道抑制劑、血管收縮素轉化酶抑制劑以至血管收縮素II型受器阻斷劑，已有許多藥物開發，但仍有約15~20%的頑固型高血壓，必須使用3種以上藥物治療，並且每種高血壓藥物都有它的副作用存在，特別是血管收縮素II型受器，阻斷了受器之後所有的訊息傳遞，包括正面(降血壓)與負面(副作用)的效果，不具有專一性。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎之用於治療高血壓的醫藥品以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種組成物用於製備一治療高血壓之醫藥品的用途，其中該組成物是選自於下列所組成的群組：(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮((E)-4-(3-(3-Methyl benzyloxy)benzylidene)-1-phenylpyrazolidine-3,5-dione)、(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0003-4
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺((2R)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)-N-[(E)-quinoxalin-6-ylmethylideneamino]propana mide)，及其組合。
在本發明的一實施例中，該自發性高血壓是自發性高血壓。
在本發明的一實施例中，該自發性高血壓是藉由抑制血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中白血病關聯性Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor,LARG)與RhoA蛋白質的交互作用而被治療。
在本發明的一實施例中，該高血壓是藉由降低血管平滑肌細胞中肌凝蛋白磷酸酶標靶次單元1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)的磷酸化而被治療。
在本發明的一實施例中，當該(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮單獨使用時，該(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮的有效劑量為至少5mg/kg。
在本發明的一實施例中，當該(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0004-5
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺單獨使用時，該(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0004-6
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺的有效劑量為至少10mg/kg。
在本發明的一實施例中，當該(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮及該(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0004-7
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺組合使用時，該(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮的有效劑量為至少3mg/kg，及該(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0004-8
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺的有效劑量為至少7mg/kg。
在本發明的一實施例中，該醫藥品進一步包含一醫藥學上可接受的載劑。
在本發明的一實施例中，該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
在本發明的一實施例中，該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
綜上所述，本發明組成物的功效在於：可藉由活體外細胞實驗來抑制血管平滑肌細胞中白血病關聯性Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子與RhoA蛋白質的交互作用，及藉由降低血管平滑肌細胞中肌凝蛋白磷酸酶標靶次單元1的磷 酸化，並在活體內動物實驗有效降低自發性高血壓大鼠的血壓，達到治療高血壓的效用。因此，本發明使用小分子化合物(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮、(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0005-9
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺或二種混合，可開發作為降血壓之治療藥物，不論是口服或注射皆有效。藉由注射使用可快速降壓，並且在不同劑量內，血壓一小時內可降20~40%，和傳統降壓藥(血管收縮素II受器)比較，它的優越性有過之無不及。
如果做成口服劑型，可依不同劑量及藥物動態變化，調至適當降壓效果。(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮與(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0005-10
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺是透過抑制血管收縮素II受器訊息傳遞鏈下游Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(Rho guanine nucleotide exchange factor,Rho GEF)/LARG小G蛋白，進而阻斷Rho A/Rho激酶以及肌凝蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)之活化，達到降低血壓效果，它的作用具有專一性。它們有別於血管收縮素II型受器，阻斷了受器之後所有的訊息傳遞，包括正面(降血壓)與負面(副作用)的效果，沒有專一性。此外，從動物實驗的觀察，高劑量的(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮或(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0005-11
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺並不會造成動物血液(血球)與器官(心、肺、肝、腎)組織的變化。因此，(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮、(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0005-12
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺或其組合有潛力成為具安全性的高血壓治療藥物。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1顯示(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮((E)-4-(3-(3-Methyl benzyloxy)benzylidene)-1-phenylpyrazolidine-3,5-dione)(下稱 Y16)抑制LARG與RhoA結合的細胞效應，其中來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC在無血清M199培養基中用指定濃度的Y16處理24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後進行共免疫沉澱，並檢視LARG-RhoA交互作用；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用GAPDH作為內部對照組；RhoA的GTP結合形式的相對量透過光密度測量進行量化並以甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)標準化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組(即圖中的符號C)；*表示與對照組比較，P<0.05。
圖2顯示Y16投藥給來自於自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC之後MYPT1磷酸化的水平，其中大鼠初代VSMC在無血清培養基中用指定濃度的Y16處理24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後檢視MYPT1磷酸化的水平；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用總MYPT1蛋白質及GAPDH作為內部對照組；磷酸-MYPT1(pMYPT1)的相對量透過光密度測量進行量化並以總MYPT1標準化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組(即圖中的符號C)；*表示與對照組比較，P<0.05。
圖3顯示Y16與(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0006-13
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺((2R)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)-N-[(E)-quinoxalin-6-ylmethylideneamino]propana mide)(下稱Rhosin)組合使用在來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC中抑制LARG與RhoA結合的細胞效應，其中來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC在無血清培養基中被處理以指定濃度的Y16及Rhosin歷時24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後進行共免疫沉澱，並檢視LARG-RhoA交互作用；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用GAPDH作為內部對照組；RhoA的GTP結合形式的相對量透過光密度測量進行量化並以GAPDH標準化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組(即圖中的符號C)；*表示與對照組比較，P<0.05。
圖4顯示Y16與Rhosin組合投藥給來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC之後MYPT1磷酸化的水平，來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC在無血清培養基中被處理以指定濃度的Y16及Rhosin歷時24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後檢視MYPT1磷酸化的水平；西方墨點分析 被用來測定蛋白質水平，使用總MYPT1蛋白質及GAPDH作為內部對照組；磷酸-MYPT1(pMYPT1)的相對量透過光密度測量進行量化並以總MYPT1標準化；結果顯示由Y16組合Rhosin劑量依賴性抑制MYPT1磷酸化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組(即圖中的符號C)；*表示與對照組比較，P<0.05。
圖5A及圖5B顯示Y16、或Y16與Rhosin組合對自發性高血壓大鼠初代VSMC細胞可活性的影響，其中檢測Y16、或Y16與Rhosin組合對自發性高血壓大鼠初代培養的VSMC的可活性，其中圖5A的細胞在無血清M199培養基中被處理以1、2.5、5、10、30或50μmol/L的Y16，圖5B的細胞在無血清M199培養基中被處理以1+1、2.5+2.5、5+5、15+15或25+25μmol/L的Y16與Rhosin組合歷時24小時；細胞隨後以10-7M血管收縮素II刺激10分鐘並進行細胞毒性分析；Y16及Rhosin處理對自發性高血壓大鼠VSMC的生長沒有任何顯著影響；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組(即圖中的符號C)；*表示與對照組比較，P<0.05。
圖6A至圖6D顯示Y16及Rhosin投藥前後的代表性樣品數據，包括ECG、HR(每分鐘心跳次數，BPM)及血壓(BP)，其中每隻大鼠被麻醉、連接到生理訊號紀錄裝置，並投藥不同濃度(劑量)的藥物(圖6A為對照組、圖6B為Y16、圖6C為Rhosin及圖6D為Y16+Rhosin)，然後紀錄牠們的ECG、HR及BP；此圖顯示代表性樣品的數據，BPM表示每分鐘心跳次數的縮寫。
圖7A及圖7B顯示Y16可以劑量依賴方式降低血壓及心率但對於心率沒有顯著效果，其中圖7A顯示Y16在0.2mg/kg及1mg/kg時對血壓沒有影響，在5mg/kg時，Y16可以將血壓降低21%，並且持續30分鐘(參見圖7A，5mg/kg組，79%±13%，與0分鐘相比；p=0.0081)；在10mg/kg時，Y16還可以將血壓降低21%並持續超過60分鐘(圖7A，10mg/kg組，79%±12%，與0分鐘相比；p=0.0007)；當劑量增加至20mg/kg時，20分鐘達到最大降血壓42%，持續60分鐘以上(圖7A，20mg/kg組，58%±8%，與0分鐘相比；p=0.0187)；圖7B顯示Y16略微降低心率，當劑量增加到20mg/kg時，Y16可使心率降低16%，持續30分鐘(圖7B，20mg/kg組，84%±8%，與0分鐘相比；p=0.1067)，但差異不具統計學顯著性；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標 準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比，BPM表示每分鐘心跳次數的縮寫。
圖8A及圖8B顯示Rhosin可以劑量依賴方式降低血壓但略微影響心率，其中圖8A顯示Rhosin對於血壓的影響，在Rhosin為5mg/kg下不具統計學顯著性，當劑量增加至10mg/kg時，60分鐘內血壓最大降低28%，並持續長達90分鐘(參見圖8A，10mg/kg組，72%±6%，與0分鐘相比；p<0.0001)；在20mg/kg時，在30分鐘時觀察到34%的血壓大幅降低，持續長達90分鐘(圖8A，20mg/kg組，66%±1%，與0分鐘相比；p=0.0002)，而最大的降低是60分鐘時為41%(圖8A，20mg/kg組，59%±2%，與0分鐘相比；p=0.0016)；圖8B顯示高劑量的Rhosin(20mg/kg)在60分鐘內將心率降低21%(圖8B，20mg/kg組，79%±4%，與0分鐘相比；p=0.0188)；同時，中等劑量(10mg/kg)也將心率在60分鐘時降低10%(圖8B，10mg/kg組，90%±7%，與0分鐘相比；p=0.0058)；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比。
圖9A顯示Y16與Rhosin協同降低自發性高血壓大鼠的血壓，其中在Y16(3mg/kg)+Rhosin(7mg/kg)組合組中，第30分鐘時血壓降低11%(89%±4%，與0分鐘相比；p<0.0001)；血壓最大降低20%(80%±15%，與0分鐘相比；p=0.0032)發生在第60分鐘，而在第90分鐘時觀察到血壓降低13%(87%±11%，與0分鐘相比；p=0.0071)。在Y16(5mg/kg)+Rhosin(10mg/kg)組合中，第30分鐘時血壓降低15%(85%±4%，與0分鐘相比；p<0.0001)；在第60分鐘時血壓最大降低34%(66%±12%，與0分鐘相比；p<0.0001)，而在第90分鐘時觀察到血壓降低26%(74%±12%，與0分鐘相比；p=0.0004)；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比。
圖9B顯示低劑量的Y16+Rhosin不會過度降低心率；Y16(3mg/kg)+Rhosin(7mg/kg)組合在第60分鐘時最大程度地降低大鼠的心率達7%(93%±6%，與0分鐘相比；p=0.0148)；而Y16(5mg/kg)+Rhosin(10mg/kg)組合在第60分鐘時最大降低心率達8%(92%±8%，與0分鐘相比；p=0.0396)；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比。
圖10顯示實驗中使用的Y16及Rhosin劑量沒有對大鼠造成任何明顯的異常，關於全血細胞計數及肝功能；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*表示與對照組相比，p<0.05；在0.2mg/kg、1mg/kg的Y16及5mg/kg的Rhosin時，血小板計數(platelets count,PLC)或白血球計數(white blood cell counts,WBC)略高並達到顯著差異；ALT表示丙胺酸胺基轉移酶(alanine transaminase)；GPT表示麩胺酸丙酮酸轉胺酶(glutamate pyruvate transaminase)；PLT表示血小板水平(platelet level)；WBC表示白血球計數(white blood cell counts)；AST表示天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase)；GOT表示麩胺草醋酸轉胺酶(glutamic oxaloacetic transaminase)；control表示對照組。
圖11顯示Y16及/或Rhosin對動物組織的組織學變化，其中心臟：C表示對照組，級別=1，心臟呈現輕微心肌病變(cardiomyopathy)(箭頭c)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=2，心臟呈現輕度心肌病變(箭頭c)；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=2，心臟呈現輕度心肌病變(箭頭c)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=2，心臟呈現輕度心肌病變(箭頭c)；肝臟：C表示對照組，級別=1，肝臟顯示最小的清楚細胞病灶(箭頭a)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=1，肝臟顯示最小的清楚細胞病灶(箭頭a)；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=1，肝臟顯示最小的脂肪變化(箭頭i)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=1，肝臟顯示最小的脂肪變化(箭頭i)；肺臟：C表示對照組，級別=1，肺臟顯示有少量單核細胞胸膜下浸潤(箭頭d)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=1，未觀察到明顯的肺組織病理學變化；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=1，肺臟顯示有少量單核細胞胸膜下浸潤(箭頭d)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=1，肺臟顯示有少量單核細胞胸膜下浸潤(箭頭d)；腎臟：C表示對照組，級別=2，腎臟表現出輕微的腎小管管型(箭頭e)，最小的腎小管再生(箭頭f)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=1，腎臟表現出最小的間質及腎絲球(glomerulus)纖維化(箭頭g)；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=1，腎臟表現出最小的腎小管再生(箭頭f)及最小的間質及腎絲球纖維化(箭頭g)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=1，腎臟表現出最小的單核細胞浸潤(箭頭d)。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
依據本發明，數據表示為平均值±標準偏差(standard deviation)，其中n代表獨立實驗的數量。採用變異數檢定(variance testing)及未配對的學生t檢定(unpaired Student’s t-test)來分析結果。小於0.05的P值被認為是顯著的。所有統計分析均使用SPSS19.0進行。
依據本發明，以下實施例所用到的統計學分析說明如下。對於生理訊號記錄，將每隻大鼠不同時間間隔的數據與Y16及Rhosin投藥前的數據進行比較。考慮到個體之間生理狀況的差異，血壓及心率不是按測量的絕對值計算的，而是每個時間點測量的血壓或心率相對於投藥前(0分鐘)測量的百分比。所有數據代表至少四次獨立實驗。
依據本發明，Rhosin是一種直接標靶Rho GEF結合域的細胞滲透性化合物，從而防止Rho與GEF交互作用，化學命名為(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
Figure 110138970-A0305-02-0010-14
啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺((2R)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)-N-[(E)-quinoxalin-6-ylmethylideneamino]propana mide)。Rhosin的分子量為358.4，CAS編號為1173671-63-0，並具有以下化學式：C20H18N6O。
依據本發明，Y16是一種第二型Rho抑制劑(Rho inhibitor II)，也是一種白血病關聯性Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor,LARG)Rho結合域阻斷劑，化學命名為(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮((E)-4-(3-(3-Methyl benzyloxy)benzylidene)-1-phenylpyrazolidine-3,5-dione)。Y16的分子量為384.43，CAS編號為429653-73-6，並具有以下化學式：C24H20N2O3，及結構式：
Figure 110138970-A0305-02-0011-1
本文所述之「有效劑量」係表示能直接治療患有高血壓之個體所需醫藥品的數量。有效劑量依所治療的生物種類或個體差異而可能不同，但可藉由例如濃度遞增試驗(concentration escalation)以實驗決定其有效劑量。
如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。
依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑 (suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。
實施例1. Y16在抑制自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHRs)的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中白血病關聯性Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor,LARG)與RhoA蛋白質的交互作用上的效用評估
在本實施例或以下實施例所用到的初代培養的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的培養方式如下。用Zoletil 50麻醉自發性高血壓大鼠，並立即切除胸主動脈。然後仔細清除樣品中的結締組織及黏附脂肪。每個分離的主動脈被縱向切開，然後藉由輕輕擦洗內膜表面去除內皮。將裸露的主動脈切成約2mm2的切片，然後將內膜朝下放置。然後輕輕加入補充有20%胎牛血清及抗生素(100U/ml青黴素及100mg/ml鏈黴素)的M199培養基以覆蓋組織，而不會干擾外植體(explant)的方向。培養7~10天，讓VSMC從外植體中長出，接而移除組織。實驗中使用經培養的VSMC，其對平滑肌α-肌動蛋白(α-actin)顯示>95%的陽性免疫染色。
在本實施例或以下實施例中所用到的小分子化合物的處理方式如下。將小分子化合物溶解在純水中以測試它們對VSMC的影響。投藥不同濃度的Y16歷時24小時，然後用10-7M血管收縮素II(angiotensin II)刺激10分鐘。所使用的Y16的濃度如下：1μM、2.5μM、5μM、10μM、30μM、50μM。
在本實施例或以下實施例中所用到的獲取細胞及蛋白質萃取的操作流程如下。將培養皿置於冰上並用冰冷的磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate-buffered saline,PBS)清洗兩次。所有後續流程均在冰上進行。將裂解緩衝液(冷的PBS溶液，pH 7.4，含有1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、25mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、10mmol/L MgCl2、10%甘油及1% IGEPAL® CA-630(一種非離子液體表面活性劑))加入培養盤中，然後在冰上反應2分鐘。然後刮下細胞並轉移到Eppendorf管中。將樣品超音波處理5秒，然後在4℃下以12,000g離心15分鐘。將上清液轉移到新試管中並保持在冰上。使用BSA蛋白質分析套組(BSA Protein Assay kit)測定蛋白質濃度。
在本實施例或以下實施例中所用到的共免疫沉澱(co-immunoprecipitation)的操作流程如下。用磷酸鹽緩衝溶液清洗蛋白質A/G瓊脂珠粒兩次，並用磷酸鹽緩衝鹽溶液配製50%蛋白質A/G瓊脂珠粒工作溶液。將100ml工作溶液加入1ml樣品中，並在4℃下振盪10分鐘(在置於水平振盪器上的冰上的EP管中)以去除非專一性結合蛋白質。然後將樣品在4℃下以12,000g離心15分鐘，然後將上清液轉移到新的離心管中以去除蛋白質A/G瓊脂珠粒。將抗-LARG抗體(1：100)加入500mg總蛋白質中，並將混合物在4℃下緩慢搖動過夜。接著加入100ml蛋白質A瓊脂珠粒，捕捉抗原-抗體複合物，然後4℃下緩慢搖動抗原-抗體混合物過夜。以12,000g離心5秒，收集沉澱物，然後用預冷的磷酸鹽緩衝溶液清洗3次。然後將瓊脂珠粒-抗原-抗體複合物用樣品緩衝液懸浮、輕輕混合及離心，上清液也可以暫時冷凍在-20℃下進行電泳。
在本實施例或以下實施例中所用到的西方墨點分析(Western blot analysis)的操作流程如下。藉由在12%或6%聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)上電泳分離等量的蛋白質(40mg)並轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)上。使用無蛋白質封阻緩衝液(Pierce Chemical,Rockford,Illinois,USA)在24℃下封阻非專一性結合位址歷時1小時。接著，使用抗-RhoA(1：1000)(Santa Cruz Biotechnology Inc,CA,USA)、抗-磷酸-MYPT1(anti-phospho-MYPT1)(Thr 696)(1：2000)(Millipore Corporation,Billerica,MA,USA)、抗-總MYPT1(anti-total-MYPT1)(1：2000)(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)或抗-甘油醛-3-磷酸去氫酶(anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,anti-GAPDH)(1：1000)(Chemicon,Temecula,CA,USA)於4℃下對膜反應隔夜。在暴露於辣根過氧化酶綴合的二級抗-小鼠或抗-兔子抗體(horseradish peroxidase-conjugated secondary anti-mouse or anti-rabbit antibody)後，將膜處理以ECL試劑(Millipore Corporation,Billerica,USA)。使用UVP成像系統(UVP)或X光膠片對訊號進行可視化，結果表示為目標蛋白/GAPDH或磷酸-MYPT1/總-MYPT1的光密度比(densitometric ratio)。
為了檢視Y16是否有效抑制VSMC中的LARG-RhoA交互作用及RhoA活性，在無血清培養基中生長的VSMC用不同濃度的Y16處理24小時，然後用10-7M血管收縮素II刺激10分鐘。結果顯示於圖1。
圖1顯示Y16抑制LARG與RhoA結合的細胞效應，其中來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC在無血清M199培養基中用指定濃度的Y16處理24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後進行共免疫沉澱，並檢視LARG-RhoA交互作用；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用GAPDH作為內部對照組；RhoA的GTP結合形式的相對量透過光密度測量進行量化並以GAPDH標準化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組；*表示與對照組比較，P<0.05。
如圖1所示，Y16劑量依賴性地抑制血管收縮素II誘導的LARG-RhoA複合物形成。在濃度為50μM的Y16下，抑制效果達到統計上顯著差異(相對於對照組的0.939±0.121，50μM的Y16組為0.469±0.074，以GAPDH標準化，P值<0.001)。
實施例2. Y16在抑制自發性高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中肌凝蛋白磷酸酶標靶次單元1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)的磷酸化上的效用評估
Y16可以減少由血管收縮素II刺激的肌凝蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)上磷酸化MYPT1的形成，這發生在RhoA的下游。本實施例的實驗操作流程是相同於實施例1所述者。結果顯示於圖2。
圖2顯示Y16投藥給來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC之後MYPT1磷酸化的水平，其中大鼠初代VSMC在無血清培養基中用指定濃度 的Y16處理24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後檢視MYPT1磷酸化的水平；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用總MYPT1蛋白質及GAPDH作為內部對照組；磷酸-MYPT1(pMYPT1)的相對量透過光密度測量進行量化並以總MYPT1標準化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組；*表示與對照組比較，P<0.05。
圖2的結果顯示藉由Y16劑量依賴性抑制MYPT1磷酸化。特別地，在濃度為5μM的Y16下，抑制效果(相較於對照組)達到統計上顯著差異(0.994±0.048相對於0.642±0.199，以總MYPT1標準化，P值=0.041)，如圖2所示。
實施例3. Rhosin在增強Y16對自發性高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中LARG與RhoA結合的抑制作用上之效用評估
在本實施例中，測試Y16及Rhosin一起使用時的抑制作用。本實施例的實驗操作流程是相同於實施例1所述者。結果顯示於圖3。
圖3顯示Y16與Rhosin組合使用在來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC中抑制LARG與RhoA結合的細胞效應，其中來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC在無血清培養基中被處理以指定濃度的Y16及Rhosin歷時24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後進行共免疫沉澱，並檢視LARG-RhoA交互作用；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用GAPDH作為內部對照組；RhoA的GTP結合形式的相對量透過光密度測量進行量化並以GAPDH標準化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組；*表示與對照組比較，P<0.05。
在與Rhosin組合使用之後，當Y16及Rhosin的濃度分別為25μM時，Y16對LARG-RhoA交互作用的抑制作用與對照組相比有統計上顯著差異(0.929±0.235相對於0.446±0.108，以GAPDH標準化，P值=0.003)，如圖3所示。
實施例4. Y16與Rhosin在協同抑制自發性高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中MYPT1的磷酸化上的效用評估
本實施例探討Y16與Rhosin在協同抑制自發性高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中MYPT1的磷酸化上的效用評估。本實施例的實驗操作流程是相同於實施例1所述者。結果顯示於圖4。
圖4顯示Y16與Rhosin組合投藥給來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC之後MYPT1磷酸化的水平，來自自發性高血壓大鼠的初代培養的VSMC在無血清培養基中被處理以指定濃度的Y16及Rhosin歷時24小時；隨後用10-7M血管收縮素II刺激細胞10分鐘，然後檢視MYPT1磷酸化的水平；西方墨點分析被用來測定蛋白質水平，使用總MYPT1蛋白質及GAPDH作為內部對照組；磷酸-MYPT1(pMYPT1)的相對量透過光密度測量進行量化並以總MYPT1標準化；結果顯示由Y16組合Rhosin劑量依賴性抑制MYPT1磷酸化；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組；*表示與對照組比較，P<0.05。
當Y16及Rhosin組合使用時，有效抑制MYPT1磷酸化所需的工作濃度顯著降低(相較於單獨Y16的濃度5μM，組合的濃度為2.5μM)(0.892±0.099相對於0.718±0.133，以總MYPT1標準化，P值=0.046)，如圖4所示。
實施例5. Y16對自發性高血壓大鼠初代VSMC細胞可活性的影響
在本實施例所用到的細胞可活性的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)分析的操作流程如下。Y16或Rhosin的細胞毒性結果是使用基於MTT的活體外分析進行測定。簡言之，丟棄來自細胞培養的培養基並小心吸出。接著，每孔加入50μL無血清培養基及50μL MTT溶液，然後將培養盤於37℃下培養3小時。在培養之後，對每孔加入150μL的MTT溶液(4mM HCl、0.1% NP40配於異丙醇(isopropanol)中)。然後將培養盤用箔包裹並在定軌振盪器(orbital shaker)上搖晃15分鐘，在OD=590nm處讀取吸光值。結果顯示於圖5A及圖5B。
圖5A及圖5B顯示Y16及Rhosin對自發性高血壓大鼠初代VSMC細胞可活性的影響，其中檢測Y16或Y16與Rhosin組合對自發性高血壓大鼠初代培養的VSMC的可活性，其中圖5A的VSMC在無血清M199培養基中被處理以1、 2.5、5、10、30或50μmol/L的Y16，圖5B的VSMC在無血清M199培養基中被處理以1+1、2.5+2.5、5+5、15+15或25+25μmol/L的Y16與Rhosin組合歷時24小時；細胞隨後以10-7M血管收縮素II刺激10分鐘並進行細胞毒性分析；Y16及Rhosin處理對自發性高血壓大鼠VSMC的生長沒有任何顯著影響；數據表示為五個獨立實驗的平均值±標準偏差；沒有用Y16處理的組別為對照組；*表示與對照組比較，P<0.05。
本實施例的結果顯示，降低LARG-RhoA交互作用或減少p-MYPT1的Y16對自發性高血壓大鼠VSMC的生長沒有任何顯著影響。這些細胞都存活著，因此西方墨點分析顯示RhoA或p-MYPT1的量減少是因為Y16的抑制作用而非Y16的毒性所造成的細胞死亡。
實施例6. Y16及Rhosin在降低自發性高血壓大鼠的血壓及心率上的效用評估
在本實施例或以下實施例中所用到的動物模型說明如下。台灣新北市輔仁大學實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of the Fu Jen Catholic University,New Taipei City,Taiwan)批准所有動物程序及實驗方案(批准號A10660)。16週齡雄性自發性高血壓大鼠(體重範圍：350~370g)購自台灣台北市國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center,Taipei,Taiwan)。將動物圈養在21℃的溫度下，在12小時的光照/黑暗循環下，並定期餵食顆粒飼料。動物被分成三個主要組別，包括Y16組、Rhosin組及Y16+Rhosin組。根據投藥的Y16及Rhosin劑量，每組進一步分為幾個亞組。投藥濃度列示如下。Y16組：0.2mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg；Rhosin組：5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg；Y16+Rhosin組：(Y16,3mg+Rhosin,7mg)/kg及(Y16,5mg+Rhosin,10mg)/kg。
在本實施例或以下實施例中所用到的生理訊號及血液檢測的操作流程如下。大鼠用Zoletil 50(30mg/kg，腹膜內注射)麻醉，然後連接到生理訊號紀錄裝置。Y16及Rhosin是藉由靜脈內注射投藥給實驗動物，接而測量及紀錄牠們的心電圖(electrocardiography,ECG)、心率(heart rate,HR)及血壓歷時90分鐘。在觀察及記錄生理訊號之後，在適當的試管中從大鼠中抽取血液並儲存用於隨後的全血細胞計數、肝功能及腎功能測試。接著，將大鼠犧牲，牠們的心 臟、肺、肝臟及腎臟被取出並儲存在多聚甲醛(paraformaldehyde)中以進行進一步的組織學檢測。結果顯示於圖6A至圖6D。
圖6A至圖6D顯示Y16及Rhosin投藥前後的代表性樣品數據，包括ECG、HR(每分鐘心跳次數，BPM)及血壓(BP)，其中每隻大鼠被麻醉、連接到生理訊號紀錄裝置，並投藥不同濃度(劑量)的藥物(圖6A為對照組、圖6B為Y16、圖6C為Rhosin及圖6D為Y16+Rhosin)，然後紀錄牠們的ECG、HR及BP；此圖顯示代表性樣品的數據，BPM表示每分鐘心跳次數的縮寫。
實施例7. Y16在以劑量依賴方式降低血壓及心率上的效用評估
本實施例的動物模型及實驗操作方式是相同於實施例6所述者。結果顯示於圖7A及圖7B。
圖7A及圖7B顯示Y16可以劑量依賴方式降低血壓及心率但對於心率沒有顯著效果，其中圖7A顯示Y16在0.2mg/kg及1mg/kg時對血壓沒有影響，在5mg/kg時，Y16可以將血壓降低21%，並且持續30分鐘(參見圖7A，5mg/kg組，79%±13%，與0分鐘相比；p=0.0081)；在10mg/kg時，Y16還可以將血壓降低21%並持續超過60分鐘(圖7A，10mg/kg組，79%±12%，與0分鐘相比；p=0.0007)；當劑量增加至20mg/kg時，20分鐘達到最大降血壓42%，持續60分鐘以上(圖7A，20mg/kg組，58%±8%，與0分鐘相比；p=0.0187)；圖7B顯示Y16略微降低心率，當劑量增加到20mg/kg時，Y16可使心率降低16%，持續30分鐘(圖7B，20mg/kg組，84%±8%，與0分鐘相比；p=0.1067)，但差異不具統計學顯著性；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比，BPM表示每分鐘心跳次數的縮寫。達到最大效果後，觀察90分鐘後血壓逐漸恢復到原來的水平。
實施例8. Rhosin在以類似的劑量依賴方式降低血壓及心率上的效用評估
本實施例的動物模型及實驗操作方式是相同於實施例6所述者。結果顯示於圖8A及圖8B。
圖8A及圖8B顯示Rhosin可以劑量依賴方式降低血壓但略微影響心率，其中圖8A顯示Rhosin對於血壓的影響，在Rhosin為5mg/kg下不具統計學顯著性，當劑量增加至10mg/kg時，60分鐘內血壓最大降低28%，並持續長達90分鐘(參見圖8A，10mg/kg組，72%±6%，與0分鐘相比；p<0.0001)；在20mg/kg時，在30分鐘時觀察到34%的血壓大幅降低，持續長達90分鐘(圖8A，20mg/kg組，66%±1%，與0分鐘相比；p=0.0002)，而最大的降低是60分鐘時為41%(圖8A，20mg/kg組，59%±2%，與0分鐘相比；p=0.0016)；圖8B顯示高劑量的Rhosin(20mg/kg)在60分鐘內將心率降低21%(圖8B，20mg/kg組，79%±4%，與0分鐘相比；p=0.0188)；同時，中等劑量(10mg/kg)也將心率在60分鐘時降低10%(圖8B，10mg/kg組，90%±7%，與0分鐘相比；p=0.0058)；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比。每個劑量在約60分鐘內達到最大效果，然後在觀察到的時間點(90分鐘)，血壓逐漸恢復到基線(baseline)(圖8A)。
實施例9. Y16與Rhosin在協同降低血壓上的效用評估
鑑於單劑量的Y16或高劑量Rhosin會降低血壓及心率，本實施例中測試Y16及Rhosin劑量的組合，以及對心率沒有明顯影響的低劑量。本實施例的動物模型及實驗操作方式是相同於實施例6所述者。結果顯示於圖9A及圖9B。
圖9A及圖9B顯示Y16與Rhosin協同降低自發性高血壓大鼠的血壓，其中圖9A在Y16(3mg/kg)+Rhosin(7mg/kg)組合組中，第30分鐘時血壓降低11%(89%±4%，與0分鐘相比；p<0.0001)；血壓最大降低20%(80%±15%，與0分鐘相比；p=0.0032)發生在第60分鐘，而在第90分鐘時觀察到血壓降低13%(87%±11%，與0分鐘相比；p=0.0071)。在Y16(5mg/kg)+Rhosin(10mg/kg)組合中，第30分鐘時血壓降低15%(85%±4%，與0分鐘相比；p<0.0001)；在第60分鐘時血壓最大降低34%(66%±12%，與0分鐘相比；p<0.0001)，而在第90分鐘時觀察到血壓降低26%(74%±12%，與0分鐘相比；p=0.0004)；圖9B顯示低劑量的Y16+Rhosin不會過度降低心率；Y16(3mg/kg)+Rhosin(7mg/kg)組合在第60分鐘時最大程度地降低大鼠的心率達7%(93%±6%，與0分鐘相比；p=0.0148)；而Y16(5mg/kg)+Rhosin(10mg/kg)組合在第60分鐘時最大降低心率達 8%(92%±8%，與0分鐘相比；p=0.0396)；在投藥前後比較每隻大鼠的數據；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*p<0.05、# p<0.01、$ p<0.005、&p<0.001，與投藥前(0分鐘)組別相比。
實施例10. 藉由血液檢測評估Y16及/或Rhosin對於實驗動物的不良反應
本實施例的動物模型及實驗操作方式是相同於實施例6所述者。為了觀察使用Y16或Rhosin是否會對動物產生不良反應甚至傷害，本實施例在收集所需的生理訊號後抽取大鼠血液進行血液檢測。結果顯示於圖10。
圖10顯示實驗中使用的Y16及Rhosin劑量沒有對大鼠造成任何明顯的異常，包括全血細胞計數及肝功能；結果以至少四個獨立實驗的平均值±標準偏差表示；*表示與對照組相比，p<0.05；在0.2mg/kg、1mg/kg的Y16及5mg/kg的Rhosin時，血小板計數(platelets count,PLC)或白血球計數(white blood cell counts,WBC)略高並達到顯著差異。血小板水平(platelet level,PLT)及白血球計數在低藥物濃度(諸如0.2mg/kg或1mg/kg)下略有升高，這與Y16或Rhosin的投藥無關，但可能與對動物操作(麻醉、插管、手術等)的生理反應有關。
實施例11 Y16及/或Rhosin對動物組織的組織學變化
在本實施例中所用到的組織學檢驗的操作流程如下。將組織在4%多聚甲醛中固定過夜，然後包埋在石蠟中進行組織學檢驗。橫切片(4μm)在75~85℃下作用10分鐘，然後用蘇木精/伊紅(hematoxylin/eosin,HE)染色，並在光學顯微鏡下檢查。根據Shackelford et al.(2002)描述的方法對病變的嚴重程度進行分級。HE染色的病變程度根據嚴重程度從1級到5級：1級=最低(<1%)；2級=輕度(1~25%)；3級=中度(26~50%)；4級=中度/重度(51~75%)；5級=重度/極重度(76~100%)。結果顯示於圖11。
圖11顯示Y16及/或Rhosin對動物組織的組織學變化，其中心臟：C表示對照組，級別=1，心臟呈現輕微心肌病變(cardiomyopathy)(箭頭c)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=2，心臟呈現輕度心肌病變(箭頭c)；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=2，心臟呈現輕度心肌病變(箭頭c)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=2，心臟呈現輕度心肌病變(箭頭c)；肝臟：C表示對照組，級別=1，肝臟顯示最小的清楚細胞病灶(箭頭a)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=1， 肝臟顯示最小的清楚細胞病灶(箭頭a)；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=1，肝臟顯示最小的脂肪變化(箭頭i)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=1，肝臟顯示最小的脂肪變化(箭頭i)；肺臟：C表示對照組，級別=1，肺臟顯示有少量單核細胞胸膜下浸潤(箭頭d)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=1，未觀察到明顯的肺組織病理學變化；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=1，肺臟顯示有少量單核細胞胸膜下浸潤(箭頭d)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=1，肺臟顯示有少量單核細胞胸膜下浸潤(箭頭d)；腎臟：C表示對照組，級別=2，腎臟表現出輕微的腎小管管型(箭頭e)，最小的腎小管再生(箭頭f)；Y表示Y16(20mg/kg)，級別=1，腎臟表現出最小的間質及腎絲球(glomerulus)纖維化(箭頭g)；R表示Rhosin(20mg/kg)，級別=1，腎臟表現出最小的腎小管再生(箭頭f)及最小的間質及腎絲球纖維化(箭頭g)；Y+R表示Y16(5mg/kg)及Rhosin(10mg/kg)，級別=1，腎臟表現出最小的單核細胞浸潤(箭頭d)。
根據大鼠的心臟、肝臟、肺臟及腎臟的組織學分析，實驗中所使用的Y16及Rhosin劑量不會對大鼠造成任何明顯的傷害。實驗組及對照組沒有顯著差異。這些表明這些組織的輕微損傷可能不是由藥物Y16或Rhosin引起的，而可能是由於實驗中使用的外科手術(圖11)。
綜上所述，本發明組成物(Y16及/或Rhosin)可藉由活體外細胞實驗來抑制血管平滑肌細胞中白血病關聯性Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子與RhoA蛋白質的交互作用，及藉由降低血管平滑肌細胞中肌凝蛋白磷酸酶標靶次單元1的磷酸化，並在活體內動物實驗有效降低自發性高血壓大鼠的血壓，達到治療高血壓的效用。因此，本發明使用小分子化合物Y16、Rhosin或二種混合，可開發作為降血壓之治療藥物，不論是口服或注射皆有效。藉由注射使用可快速降壓，並且在不同劑量內，血壓一小時內可降20~40%，和傳統降壓藥(血管收縮素II受器)比較，它的優越性有過之無不及。如果做成口服劑型，可依不同劑量及藥物動態變化，調至適當降壓效果。Y16與Rhosin是透過血管收縮素II受器訊息傳遞鏈下游Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(Rho guanine nucleotide exchange factor,Rho GEF)/LARG小G蛋白的抑制，進而阻斷Rho A/Rho激酶以及肌凝蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)之活化，達到降低血壓效果，它的作用具有專一性。它們有別於血管收縮素II型受器，阻斷了受器之後所有的訊息傳遞， 包括正面(降血壓)與負面(副作用)的效果，沒有專一性。此外，從動物實驗的觀察，高劑量的Y16或Rhosin並不會造成動物血液(肝、腎、血球)與器官(心、肺、肝、腎)組織的變化。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims (6)

  1. 一種組成物用於製備一治療高血壓之醫藥品的用途，其中該組成物是(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮((E)-4-(3-(3-Methyl benzyloxy)benzylidene)-1-phenylpyrazolidine-3,5-dione)及(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
    Figure 110138970-A0305-02-0023-15
    啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺((2R)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)-N-[(E)-quinoxalin-6-ylmethylideneamino]propanamide)的組合，其中該高血壓是自發性高血壓，其中該(E)-4-(3-(3-甲基苄氧基)亞苄基)-1-苯基吡唑烷-3,5-二酮的有效劑量為3~5mg/kg，及該(2R)-2-胺基-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[(E)-喹
    Figure 110138970-A0305-02-0023-16
    啉-6-基亞甲基胺基]丙醯胺的有效劑量為7~10mg/kg，其中該組成物降低血壓達至20~34%，且降低心率不超過8%。
  2. 如請求項1的用途，其中該自發性高血壓是藉由抑制血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中白血病關聯性Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor,LARG)與RhoA蛋白質的交互作用而被治療。
  3. 如請求項1的用途，其中該自發性高血壓是藉由降低血管平滑肌細胞中肌凝蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)上磷酸化肌凝蛋白磷酸酶標靶次單元1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)的形成而被治療。
  4. 如請求項1的用途，其中該醫藥品進一步包含一醫藥學上可接受的載劑。
  5. 如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
  6. 如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
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