TWI780046B - 炎症促進因子表現抑制劑、其有效成分之篩選方法、對於該方法為有用之表現匣、診斷藥及診斷方法 - Google Patents

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Abstract

本發明發現會影響炎症促進因子之表現量的新穎因子，提供基於此之炎症促進因子表現抑制劑，及其開發工具，以及提供免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等之診斷藥及診斷方法。
亦即，本發明提供含有選自RBMS2表現抑制劑及RBMS2功能抑制劑所構成之組群中之至少1種的炎症促進因子表現抑制劑、以RBMS2之表現或功能作為指標的篩選方法及在該方法中有用的表現匣、含有RBMS2基因表現產物檢測劑的診斷藥、以及以RBMS2基因表現量作為指標的疾病檢測方法。

Description

炎症促進因子表現抑制劑、其有效成分之篩選方法、對於該方法為有用之表現匣、診斷藥及診斷方法
本發明係關於炎症促進因子表現抑制劑、其有效成分之篩選方法、及於該方法中有用之表現匣、以及免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等之診斷藥及診斷方法等。
因IL-6、COX-2等炎症促進因子而致症狀表現或惡化的疾病，例如免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等疾病的患者數目非常多。例如，若就為代表性免疫疾病之風濕性關節炎而言，在日本國內有約70萬名，在世界中有約7,000萬名患者。又，為炎症性疾病之一的關節症，只在日本就有約1,560萬名患者，亦可謂關節症之代表的變形性膝關節症，推定在日本有約1,000萬名患者。再者，為疼痛性疾病之代表的腰痛症，只在日本國內就有2,400 萬名患者。而且，此等疾病之患者數目，隨著高齡化進行，有年年增加的傾向。咸認為此等現象，不僅在高齡化率為世界最高的日本，而且隨著今後生活環境及飲食生活、營養狀態之改善、醫療技術之進步等，在朝向高齡化的所有國家中同樣都會發生。藉由在較早期發現此等疾病，開始適當的治療，可抑制疾病的重症化，從而可使患者保有較高的生活品質(QOL)。因此，有關此等疾病之治療藥或其開發工具的研究，進而開發此等疾病之診斷藥或診斷方法，成為社會上非常重要的期求。
此等之中，近年已明白炎症促進因子mRNA之轉錄後調節與上述疾病的關連。暗示炎症促進因子mRNA之分解調控成為決定炎症應答之持續時間的要因，據說涉及炎症促進因子於mRNA層級之分解、安定化的因子，參與免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病之發病或慢性化。例如，在非專利文獻1中，記載鋅指蛋白36(Tristetraprolin(TTP))、Regnase-1導致IL-6 mRNA的分解。又，在非專利文獻2中，揭示Arid5a調控IL-6 mRNA的安定性。已解明此等因子之異常在炎症之促進等所致之上述疾病的發病或惡化機制中扮演重要的角色。因此，影響炎症促進因子之表現量的因子成為上述疾病治療藥之標的，此等因子之新發現為眾所期望。又，藉著測定在患者之細胞、血液等中會影響炎症促進因子之表現量的物質之量，可診斷上述疾病之有無或進行度的診斷藥或診斷方法非常有用，此等因子之新發現為眾所期望。
RNA-結合性基元(RNA-binding motif)、單股-交互作用性蛋白質(single-stranded-interacting protein 2(RBMS2))雖然為所謂在N末端側具有2個RNA結合性結構域的蛋白質，但實際上尚無解析其功能的報告，其功能至目前為止尚不明白。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Inflammation and Regeneration, Vol.33, No.1, January 2013, pp54-65.
[非專利文獻2]PNAS, June 4, 2013, vol.110, no.23, pp9409-9414
本發明，以發現影響炎症促進因子之表現量的新穎因子，以及提供基於該因子的炎症促進因子表現抑制劑或其開發工具，及免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等之診斷藥及診斷方法作為課題。
本發明者等鑒於上述課題，致力於深入研究的結果，發現RBMS2負責各種炎症促進因子mRNA的轉錄後調節。再者，關於藉由炎症促進因子而致症狀表現或惡化的疾病，發現RBMS2之表現與炎症促進因子之表現有正相關性。根據此等認知發現藉由RBMS2之表現或功能的 抑制，可抑制炎症促進因子，終而可預防或治療上述疾病，而且藉由以RBMS2之表現量作為指標，可診斷此等疾病。基於以上進一步進行研究的結果，而完成本發明。亦即，本發明包含下述的態樣：
第1項 一種表現匣，其包含RBMS2基因表現調控區及被配置成可藉由該區調控表現的基因。
第2項 如第1項所述之表現匣，其中該基因為報導基因。
第3項 一種載體，其包含如第1或2項所述之表現匣。
第4項 一種細胞，其包含如第3項所述之載體。
第5項 一種炎症促進因子表現抑制劑之有效成分的篩選用試藥，其含有選自表現匣、包含該表現匣的載體、以及包含該載體的細胞所構成之組群中之至少1種，其中該表現匣包含RBMS2基因表現調控區及被配置成可藉由該區調控表現的基因。
第6項 一種抑制RBMS2之表現或功能之物質的篩選方法，其係以選自於受檢物質存在下之下述(i)至(iii)所構成之組群中之至少1種作為指標：(i)藉由RBMS2基因表現調控區來調控表現之基因表現量；(ii)RBMS2與包含富含AU單元之RNA的結合量；及(iii)在RBMS2過剩表現細胞中，於3’-UTR包含富含AU單元的mRNA量或來自該mRNA的蛋白質量。
第7項 如第6項所述之篩選方法，其包含在受檢物質存在下，前述指標之值比受檢物質不存在下之該指標之值低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2之表現或功能的物質。
第8項 如第6或7項所述之篩選方法，其中該富含AU單元係從選自IL-6 mRNA、COX-2 mRNA、IL-8 mRNA、IL-1 β mRNA、TNF-α mRNA、MMP1 mRNA、IL-24 mRNA、及c-Myc mRNA所構成之組群中之至少1種mRNA而來之富含AU單元。
第9項 如第6至8項之任一項所述之篩選方法，其中選擇該抑制RBMS2之表現或功能的物質作為炎症促進因子表現抑制劑之有效成分或其候選物質。
第10項 如第6至9項之任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a1)至(c1)：(a1)使含有表現匣的表現系與受檢物質接觸的步驟，其中該表現匣包含RBMS2基因表現調控區及被配置成可藉由該區調控表現的基因；(b1)測定已接觸受檢物質之表現系中之該基因的表現量，作為受檢表現量，並將該受檢表現量與對照表現量比較的步驟，其中該對照表現量係未接觸受檢物質之表現系中該基因的表現量；以及(c1)在受檢表現量比對照表現量低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2表現之物質的步驟。
第11項 如第10項所述之篩選方法，其中該表現系為 細胞。
第12項 如第10或11項所述之篩選方法，其中該基因為報導基因。
第13項 如第6至9項之任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a2)至(c2)：(a2)於受檢物質存在下，使包含富含AU單元之RNA與RBMS2接觸的步驟；(b2)測定在受檢物質存在下經接觸之情況之該RNA與該RBMS2之結合量，作為受檢結合量，並將該受檢結合量與對照結合量比較的步驟，其中該對照結合量係在受檢物質不存在下經接觸之情況之該RNA與該RBMS2之結合量；以及(c2)在受檢結合量比對照結合量低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2之功能的物質的步驟。
第14項 如第13項所述之篩選方法，其中該結合量之測定方法為免疫沉降法或凝膠移位法。
第15項 如第6至9項之任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a3)至(c3)：(a3)使含有下述mRNA，且RBMS2過剩表現的細胞與受檢物質接觸的步驟，其中該mRNA在3’-UTR包含富含AU單元；(b3)測定與受檢物質接觸後之細胞中之該mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量，作為受檢量，將未與受檢物質接觸之細胞中之該mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量作 為對照量，比較該受檢量與該對照量的步驟；以及(c3)在受檢量比對照量低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2之功能的物質的步驟。
第16項 如第15項所述之篩選方法，其中該mRNA包含報導蛋白質的ORF。
第17項 一種炎症促進因子表現抑制劑，其含有選自RBMS2表現抑制劑及RBMS2功能抑制劑所構成之組群中之至少1種。
第18項 如第17項所述之炎症促進因子表現抑制劑，其含有RBMS2表現抑制劑。
第19項 如第18項所述之炎症促進因子表現抑制劑，其中該RBMS2表現抑制劑含有選自RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、RBMS2特異性反義核酸、及此等之表現載體所構成之組群中之至少1種RBMS2表現抑制劑。
第20項 如第18項所述之炎症促進因子表現抑制劑，其中該RBMS2表現抑制劑為IL-10。
第21項 如第17至20項之任一項所述之炎症促進因子表現抑制劑，其中為表現抑制對象之該炎症促進因子係選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1 β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種。
第22項 如第17至21項之任一項所述之炎症促進因子表現抑制劑，其係作為選自免疫疾病、炎症性疾病及疼痛性疾病所構成之組群中之至少1種的預防或治療劑而使 用。
第23項 如第17至22項之任一項所述之炎症促進因子表現抑制劑，其係作為選自自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、及過敏性疾病所構成之組群中之至少1種的預防或治療劑而使用。
第24項 一種藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病的診斷藥，其含有RBMS2基因表現產物檢測劑。
第25項 如第24項所述之診斷藥，其中前述疾病係藉由炎症促進因子而發病或惡化者。
第26項 如第24或25項所述之診斷藥，其中該疾病為選自免疫疾病、炎症性疾病及疼痛性疾病所構成之組群中之至少1種。
第27項 如第25或26項所述之診斷藥，其中炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-1 β、IL-8、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種。
第28項 如第24至27項中任一項所述之診斷藥，其中該RBMS2基因表現產物檢測劑，係針對RBMS2 mRNA或來自其之核酸的探針或引子、或識別RBMS2蛋白質的抗體。
第29項 如第24至28項中任一項所述之診斷藥，其中為診斷對象疾病的該疾病係選自自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、 淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、及過敏性疾病所構成之組群的至少1種疾病。
第30項 如第29項所述之診斷藥，其中為診斷對象疾病的該疾病為風濕性關節炎。
第31項 如第24至30項中任一項所述之診斷藥，其診斷對象為前述疾病之有無。
第32項 如第24至30項中任一項所述之診斷藥，其診斷對象為前述疾病之進行度。
第33項 一種免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之檢測方法，其具有：(a1)測定在採取自受檢體之樣本中RBMS2基因表現產物之受檢表現量的步驟；及(b1)將在上述步驟(a1)中所測定之受檢表現量與對照表現量對比的步驟，其中該對照表現量係由未罹患免疫疾病、炎症性疾病及疼痛性疾病之任一者之對照受檢體所採取的樣本中之RBMS2基因表現產物的表現量；並且(c1)以受檢表現量比對照表現量高之情形作為受檢體罹患免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病的判斷指標。
第34項 一種免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之進行度的判定方法，其具有(a2)測定在採取自罹患免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之受檢體之樣本中RBMS2基因表現產物之受檢表現量的步驟；以及 (b2)將在上述步驟(a2)中所測定之受檢表現量與對照表現量對比的步驟，其中該對照表現量係由罹患免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之對照受檢體所採取之樣本中RBMS2基因表現產物之表現量；並且(c2)以受檢表現量比對照表現量高，作為受檢體在免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之進行度上比對照受檢體高的判斷指標。
第35項 如第33或34項所述之方法，其中該步驟(a1)及步驟(a2)中之該樣本為血液樣本。
第36項 如第33至35項中任一項所述之方法，其中該步驟(a1)及步驟(a2)中之該樣本為血液樣本中的血球成分。
第37項 如第33至第36項中任一項所述之方法，其中該免疫疾病、炎症性疾病及疼痛性疾病係因選自IL-6、COX-2、IL-1 β、IL-8、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種而發病或惡化者。
第38項 如第33至37項中任一項所述之方法，其中RBMS2基因表現產物之受檢表現量及對照表現量，係使用針對RBMS2 mRNA或來自其之核酸的探針或引子、或識別RBMS2蛋白質的抗體而測定。
若依照本發明，可提供新穎炎症促進因子表現抑制劑，其中利用賦予對炎症促進因子表現量之影響的新穎標的因子，並提供免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性 疾病等之新穎預防或治療劑，進一步提供此等之開發工具(例如有效成分之篩選方法、對該方法有用之表現匣等)。又，若依照本發明，關於新穎機制，可提供免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等之診斷藥及診斷方法。
第1A圖係展示實施例1A之篩選的概要。
第1B圖係展示實施例1B之結果。在圖形左側，上方之模式圖表示所用之對照報導載體(無IL-6之3’UTR)的部分構造，下方之模式圖表示所用之報導載體(有IL-6之3’UTR)的部分構造。白長條表示導入空白載體(pcDNA3.1)之情況，黑長條表示導入RBMS2表現載體(pcDNA3.1 FLAG-RBMS2)之情況。橫軸表示測定之螢光素酶活性的相對值。
第1C圖係展示實施例1C之結果。左側之圖的縱軸表示RBMS2 mRNA量相對於GAPDH mRNA量的相對值，右側之圖的縱軸，表示IL-6 mRNA量對於GAPDH mRNA量的相對值。橫軸中，N.C.表示導入對照siRNA之情況，RBMS2-1及RBMS2-2表示導入針對RBMS2之相異區域的siRNA的情況。白長條表示未添加IL-1 β之情況，黑長條表示添加IL-1 β之情況。
第1D圖係展示實施例1D之結果。縱軸表示上清液中之IL-6蛋白質濃度。橫軸中，N.C.表示導入對照siRNA之情況，RBMS2-1及RBMS2-2表示導入針對RBMS2之相異 區域的siRNA的情況。白長條表示未添加IL-1 β之情況，黑長條表示添加IL-1 β之情況。
第1E圖係展示實施例1E之結果。左側之圖的縱軸表示RBMS2 mRNA量對於GAPDH mRNA量的相對值，右側之圖的縱軸表示IL-6 mRNA量相對於GAPDH mRNA量的相對值。橫軸中，空白(Empty)表示感染對照逆轉錄病毒之情況，RBMS2表示感染表現RBMS2之逆轉錄病毒的情況。白長條表示未添加IL-1 β之情況，黑長條表示添加IL-1 β之情況。
第1F圖係展示實施例1F之結果。縱軸表示所測定之螢光素酶活性的相對值。橫軸中，空白(Empty)表示導入空白載體之情況，RBMS2表示導入RBMS2表現載體之情況。
第2A圖係展示實施例2A之結果。縱軸表示IL-6 mRNA量對於肌動蛋白β(Actb)mRNA量之相對值。橫軸中，-表示從導入表現載體48小時後回收之細胞樣本，LPS表示從添加LPS 5小時後回收之細胞樣本，ActD表示從添加放線菌素D 3小時後回收之細胞樣本。黑長條表示導入空白載體之情況，●表示導入RBMS2表現載體之情況。
第2B圖係展示實施例2B之結果。橫軸中，0表示從導入載體24小時後(未添加強力黴素(doxycycline)時)回收之細胞樣本，2表示從添加強力黴素2小時後回收之細胞樣本。縱軸表示螢光素酶mRNA量之相對比率(0之情況為100%)。黑長條表示導入空白載體之情況，●表示導入RBMS2表現載體之情況。
第2C圖係展示實施例2C之結果。圖形左側之模式圖展示所用之變異型3’UTR報導載體的部分構造。橫軸表示螢光素酶活性之相對值。白長條表示導入空白載體之情況，黑長條表示導入RBMS2表現載體之情況。*表示t-test之結果，p值為0.05以下。
第3A圖係展示實施例3A之結果。縱軸表示將免疫沉降前細胞溶解液中之螢光素酶mRNA量當作100%之情況，免疫沉降物中之螢光素酶mRNA量的相對值。橫軸中，ARE WT表示導入野生型3’UTR報導載體(實施例1A)的情況，其中該報導載體在螢光素酶ORF之下游連結有IL-6之野生型3’UTR；ARE Mut表示導入變異型3’UTR報導載體(實施例2C：ARE mutant)的情況。黑長條表示藉由抗FLAG抗體而免疫沉降的情況，白長條表示藉由非特異性IgG而免疫沉降的情況。
第3B圖係展示實施例3B之結果。縱軸表示將免疫沉降前之細胞溶解液中之螢光素酶mRNA量當作100%之情況，免疫沉降物中螢光素酶mRNA量之相對值。橫軸中，RBMS2 WT表示導入經FLAG標識之野生型RBMS2之表現載體的情況，RBMS2 △RRM1表示導入經FLAG標識之RRM1結構域缺損型RBMS2之表現載體的情況。黑長條表示藉由抗FLAG抗體而免疫沉降之情況，白長條表示藉由非特異性IgG而免疫沉降之情況。
第3C圖係展示實施例3C之結果。圖形左側之模式圖，表示藉由所用之表現載體而表現之RBMS2的構造。橫 軸表示螢光素酶活性之相對值。
第4A圖係展示實施例4A之結果。各圖之縱軸表示各圖上部所記載之基因之mRNA量對於GAPDH mRNA量的相對值。橫軸中，N.C.表示導入對照siRNA之情況，RBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。白長條表示未添加IL-1 β之情況，黑長條表示添加IL-1 β之情況。
第4B圖係展示實施例4B之結果。上段表示使用LPS之情況，中段表示使用Pam3CSK4之情況，下段表示使用IL-1 β之情況。各圖之縱軸，表示各圖上部所記載之基因之mRNA量對於GAPDH mRNA量的相對值。橫軸中、N.C.表示導入對照siRNA之情況，RBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。白長條表示LPS、Pam3CSK4及IL-1 β之任一項均未添加的情況，黑長條表示添加LPS、Pam3CSK4或IL-1 β的情況。
第4C圖係展示實施例4C之結果。縱軸表示使用報導載體之情況下螢光素酶活性的相對值，其中該報導載體在螢光素酶ORF之下游配置有各圖上部所記載之基因的野生型3’UTR(或其ARE變異型3’UTR)。橫軸中，WT表示採用野生型3’UTR的情況，Mut表示採用ARE變異型3’UTR的情況。白長條表示導入空白載體的情況，黑長條表示導入RBMS2表現載體的情況。
第5A圖係展示實施例5A中之RBMS2缺損型小鼠製作方案。
第5B圖係展示實施例5B之結果。各圖之縱軸表示將 各圖上部所記載之因子添加於培養基之情況之IL-6的表現量(對於GAPDH mRNA量之相對值)。橫軸中，0表示各圖上部所記載之因子添加前，1、3、5、及9表示各圖上部所記載之因子添加後經過的時間。白長條表示使用來自野生型小鼠之細胞的情況，灰長條表示使用來自RBMS2雜合缺損型小鼠之細胞的情況，黑長條表示使用來自RBMS2純合缺損型小鼠之細胞的情況。
第5C圖係展示實施例5C之結果。各圖之縱軸表示各圖上部所記載之基因的mRNA表現量(對於GAPDH mRNA量之相對值)。橫軸中，0表示Pam3CSK4添加前，1、3、5、及9表示Pam3CSK4添加後經過之時間。白長條表示使用來自野生型小鼠之細胞的情況，灰長條表示使用來自RBMS2雜合缺損型小鼠之細胞的情況，黑長條表示使用來自RBMS2純合缺損型小鼠由之細胞的情況。
第6A圖係展示實施例6之生存時間的計測結果。縱軸表示生存率，橫軸表示LPS投與後之時間。WT表示野生型小鼠的生存率，KO表示RBMS2純合缺損型小鼠的生存率。
第6B圖係展示實施例6之IL-6濃度的測定結果。縱軸表示血清中之IL-6濃度，橫軸中，WT表示野生型小鼠，KO表示RBMS2純合缺損型小鼠。圖中，各圖點表示各個體之血清中的IL-6濃度，線段表示平均值。
第7圖係展示實施例7之結果。縱軸表示RBMS2表現量之相對值。橫軸表示IL-6表現量之相對值。
第8圖係展示實施例8之結果。縱軸表示RBMS2 mRNA表現量對於HPRT mRNA表現量的相對值。橫軸表示IL-10蛋白質或TGF β蛋白質添加後經過之時間。白長條表示添加IL-10蛋白質的情況，黑長條表示添加TGF β蛋白質的情況。
第9圖係展示實施例9之結果。左側之圖的縱軸表示在螢光素酶ORF之下游連結有IL-6 3’UTR之情況的螢光素酶活性；右側之圖的縱軸表示在螢光素酶ORF之下游連結有PTGS2(COX2)3’UTR之情況的螢光素酶活性。橫軸中，空白(Empty)表示導入空白載體的情況，RBMS2表示導入RBMS2表現載體的情況，HuR表示導入HuR表現載體的情況。
第10A圖係展示實施例10A之結果。縱軸表示螢光素酶活性之相對值。橫軸中，空白(Empty)表示導入空白載體、FL表示導入野生型RBMS2表現載體、dR1表示導入RRM1結構域刪除體表現載體、F101A F104A表示導入F101A及F104A之雙重變異體之表現載體的情況。**表示p值<0.01。
第10B圖係展示實施例10B之結果。左側之圖表示IL-6 mRNA量的測定結果，右側之圖表示IL-8 mRNA量的測定結果。縱軸表示IL-6 mRNA量或IL-8 mRNA量對於GAPDH mRNA量的相對值。橫軸中，空白(empty)表示感染對照慢病毒(lentivirus)的情況，FL表示感染表現野生型RBMS2之慢病毒的情況，RRM1表示感染表現RRM1結構域刪除 體之慢病毒的情況，FF表示感染表現F101A及F104A之雙重變異體之慢病毒的情況。
第10C圖係展示實施例10C之結果。縱軸表示將免疫沉降前之細胞溶解液中之螢光素酶mRNA量當作100%之情況，免疫沉降物中螢光素酶mRNA量的相對值。橫軸中，WT FL表示導入經FLAG標識之野生型RBMS2之表現載體的情況，WT dR1表示導入經FLAG標識之RRM1結構域缺損型RBMS2之表現載體的情況，WT F101/F104A表示導入F101A及F104A之雙重變異體之表現載體的情況。黑長條表示藉由抗FLAG抗體而免疫沉降的情況，白長條表示藉由非特異性IgG而免疫沉降的情況。
第11圖係展示實施例11之結果。縱軸表示試驗後耳廓之厚度減去試驗前耳廓之厚度所得到的值(表示耳廓腫脹之指標)。橫軸中，Het表示RBMS2基因雜合缺損型小鼠，KO表示RBMS2基因純合缺損型小鼠。
第12圖係展示實施例12之結果。縱軸表示轉染針對RBMS2之siRNA之情況的mRNA表現量，橫軸表示轉染非特異性siRNA(負對照)之情況的mRNA表現量。各圖點表示藉由RBMS2剔除，表現量增加至2倍以上或降低至2分之1以下的基因。
1.定義
在本說明書中，關於「含有」及「包含」之表達，包括「含有」、「包含」、「實質上構成」及「唯一構成」之概 念。
胺基酸序列之「相同性」意指2個以上可對比之胺基酸序列，對彼此之胺基酸序列的一致程度。因此，某2個胺基酸序列之一致性越高，則彼等序列之相同性或類似性越高。胺基酸序列相同性之程度，例如，係使用為序列分析用工具之FASTA，並使用預設參數(default parameter)而決定。或，亦可使用根據Karlin及Altschul之演算法BLAST(KarlinS,Altschul SF.,“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”,Proc Natl Acad Sci USA.87：2264-2268(1990)、KarlinS,Altschul SF.,“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”,Proc Natl Acad Sci USA.90：5873-7(1993))而決定。基於此種BLAST演算法之稱為BLASTX的程式正開發中。此等解析方法之具體手法為周知，只要參考National Center of Biotechnology Information(NCBI)之網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)即可。又，鹼基序列之『相同性』亦以上述為基準而定義。
在本說明書中，「保存性置換」意指胺基酸殘基被置換成具有類似側鏈之胺基酸殘基。例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸等具有鹼性側鏈的胺基酸殘基間的互相置換為保存性置換。此外，天冬胺酸、麩胺酸等具有酸性側鏈的胺基酸殘基；甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸等具有非帶電性極性側鏈 的胺基酸殘基；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸等具有非極性側鏈的胺基酸殘基；蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸等具有β-分枝側鏈的胺基酸殘基；酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸等具有芳香族側鏈的胺基酸殘基彼此之置換亦同樣為保存性置換。
在本說明書中，單以「RBMS2」表示之情況，意指RBMS2蛋白質。
在本說明書中，「核苷酸」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」，與核酸同義，包含DNA及RNA兩者。又，此等可為雙股，亦可為單股，在具有某種序列之「核苷酸」(或「寡核苷酸」、「多核苷酸」)的情況，若未特別聲明，概括地意指具有與其互補之序列的「核苷酸」(或「寡核苷酸」及「多核苷酸」)。再者，在「核苷酸」(或「寡核苷酸」及「多核苷酸」)為RNA之情況，序列表所示之鹼基記號「T」可用「U」代替。
2.表現匣
本發明係關於包含RBMS2基因表現調控區及被配置成藉由該區調控表現之基因的表現匣(在本說明書中，稱為「本發明之表現匣」)。以下，關於此項加以說明。
在本案中，「表現匣」意指細胞(例如真核細胞，較佳為動物細胞，更佳為哺乳動物細胞)內，具有使該表現匣所含之基因表現之功能的多核苷酸。
在本案中，「RBMS2基因表現調控區」意指 在細胞內，調控內在性RBMS2基因表現的DNA區域、或具有與其同等之表現調控能力的DNA區域，但其範圍無特別限制。就該區域而言，可列舉例如RBMS2基因之轉錄起始點、包含其上游(5’側)之序列及視需要亦包含其下游(3’側)之序列的啟動子。就該啟動子之具體例而言，在將RBMS2基因之轉錄起始點的鹼基設為+1，其下游(3’側)為正值，其上游為0或負值之情況，可列舉例如-10000至+2000，較佳為-5000至+1000，更佳為-2000至+500，進一步更佳為-1000至+200，又進一步更佳為-500至+100，特佳為-200至+50之DNA區域。只要該啟動子與在細胞內調控內在性RBMS2基因之表現的啟動子具有同等程度之表現調控能力，亦可具有變異。在此情況，具有變異之啟動子的鹼基序列，與細胞內調控內在性RBMS2基因之表現之啟動子的鹼基序列，具有例如70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，進一步更佳為95%以上，又進一步更佳為97%以上，特佳為99%以上的相同性。變異之部位，以在例如周知之表現調控單元(例如通用轉錄因子結合區域、各種活化子結合區域等)以外的部位為較佳。再者，表現調控單元之共同序列已周知，在各種數據庫中可容易探索到。
在本案中，「RBMS2基因」無特別限制，可列舉來自動物，例如人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔、豬、馬、牛、綿羊、山羊、鹿等各種哺乳類者。
來自各種動物之RBMS2基因為周知。為其 表現產物之RBMS2 mRNA及RBMS2蛋白質可如以下例示。具體言之，例如就人類RBMS2 mRNA而言，可列舉序列編號3所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_002898.3)，就小鼠RBMS2 mRNA而言，可列舉序列編號4所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_019711.2)。就人類RBMS2蛋白質而言，可列舉序列編號2所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_002889.1)，就小鼠RBMS2蛋白質而言，可列舉序列編號5所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_062685.2)。又，RBMS2蛋白質中，亦包含N末端缺損之類型，就此種類型而言，例如若為小鼠之情況，可列舉序列編號6所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_001034169.1)(mRNA為序列編號7所示之鹼基序列所構成(NCBI Reference Sequence：NM_001039080.1))。
為RBMS2基因之表現產物的RBMS2蛋白質，只要具有可促進「含有來自炎症促進因子mRNA(例如，IL-6 mRNA、COX-2 mRNA、IL-8 mRNA、IL-1 β mRNA、TNF-α mRNA、MMP1 mRNA、IL-24 mRNA、c-Myc mRNA等)之3’UTR的mRNA或轉譯自該mRNA的蛋白質」之表現的活性(以下稱為「炎症促進因子表現促進活性」)，亦可具有置換、刪除、附加、插入等胺基酸變異。就變異而言，從所謂不易損及炎症促進因子表現促進活性的觀點言，較佳為置換，更佳為保存性置換。
又，為RBMS2基因之表現產物的RBMS2 mRNA，只要轉譯自該mRNA的蛋白質具有炎症促進因子表現促進活性，亦可具有置換、刪除、附加、插入等鹼基變異。就變異而言，以轉譯自該mRNA之蛋白質中，不發生胺基酸置換的變異或發生胺基酸之保存性置換的變異為較佳。
炎症促進因子表現促進活性之有無，可依照周知之方法或以其為基準來判定。例如，可依照實施例記載之方法或以其為基準來判定。就具體例而言，在實施例1B中，使用受檢蛋白質之表現載體作為表現載體的情況，若螢光素酶活性比使用空白載體之情況高，則可判定該受檢蛋白質具有炎症促進因子表現促進活性。
就為RBMS2基因之表現產物的RBMS2蛋白質之較佳具體例而言，可列舉選自下述(a)記載之蛋白質及下述(b)記載之蛋白質：(a)由序列編號2、5、或6所示之胺基酸序列所構成的蛋白質、及(b)由與序列編號2、5、或6所示之胺基酸序列具有85%以上之相同性的胺基酸序列所構成，且具有炎症促進因子表現促進活性之蛋白質。所構成之組群的至少1種。
在上述(b)中，相同性更佳為90%以上，進一步更佳為95%以上，又進一步更佳為98%以上。
就上述(b)記載之蛋白質的一例而言，可列 舉如(b’)對於序列編號2、5、或6所示之胺基酸序列經置換、刪除、附加、或插入1個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有炎症促進因子表現促進活性的蛋白質。
在上述(b’)中，複數個意指例如2至30個，較佳為2至10個，更佳為2至5個，進一步更佳為2或3個。
就為RBMS2基因之表現產物的RBMS2 mRNA之較佳具體例而言，可列舉選自下述(c)記載之mRNA及下述(d)記載之mRNA：(c)由序列編號3、4、或7所示之鹼基序列所構成的mRNA、及(d)由與序列編號3、4、或7所示之鹼基序列具有85%以上之相同性的鹼基序列所構成，且編碼具有炎症促進因子表現促進活性之蛋白質的mRNA所構成之組群中的至少1種。
在上述(d)中，相同性更佳為90%以上，進一步更佳為95%以上，又進一步更佳為98%以上。
就上述(d)記載之蛋白質的一例而言，可列舉如(d’)對於序列編號3、4、或7所示之鹼基序列，經置換、刪除、附加、或插入1個或複數個鹼基而成之鹼基序列所構成，且具有炎症促進因子表現促進活性的蛋白質。
在上述(d’)中，複數個意指例如2至500個，較佳為2至100個，更佳為2至50個，進一步更佳為2至10個。
在本案中，被配置成可藉由RBMS2基因表現調控區調控表現的「基因」，只要為可檢測出其表現產物的基因，其範圍無特別限制。再者，其中術語「基因」意指包含該基因表現產物即蛋白質的編碼序列，雖亦可包含該基因之其他序列(例如內含子序列等)，然而為不包含啟動子的概念。就該基因而言，可列舉例如報導基因、藥劑耐性基因、酵素基因、構造基因、輸送基因、貯藏基因、收縮基因、防禦基因、調節基因等、以及此等基因之改變基因等。就改變基因之例子而言，可列舉以使其表現產物即蛋白質的一部分發生置換、刪除、附加、插入等胺基酸變異之方式令鹼基發生變異的上述基因，或者表現複數種之上述基因之表現產物融合成之蛋白質的基因等。此等之中，較佳可列舉報導基因、藥劑耐性基因等，更佳可列舉報導基因。
在本案中，「報導基因」意指例如編碼可與特定基質反應而產生發光(顯色)之發光(顯色)蛋白質、或藉由激發光發出螢光之螢光蛋白質的基因，但其範圍無特別限定。就發光(顯色)蛋白質而言，可列舉如螢光素酶、β半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、β葡萄醣醛酸酶等，就螢光蛋白質而言，可列舉如GFP、Azami-Green、ZsGreen、GFP2、HyPer、Sirius、BFP、CFP、Turquoise、Cyan、TFP1、 YFP、Venus、ZsYellow、Banana、KusabiraOrange、RFP、DsRed、AsRed、Strawberry、Jred、KillerRed、Cherry、HcRed、mPlum等。
在本案中，「藥劑耐性基因」意指對表現該基因之細胞賦予對抗菌藥等藥劑之耐性的基因，但其範圍無特別限定。具體而言，可列舉如氯黴素耐性基因、四環素耐性基因、新黴素耐性基因、紅黴素耐性基因、大觀黴素(spectinomycin)耐性基因、卡那黴素耐性基因、潮黴素(hygromycin)耐性基因、嘌呤黴素(puromycin)耐性基因等。
關於上述「基因」，「被配置成可被調控表現」意指以可表現該基因所編碼之蛋白質的方式來配置該基因。具體而言，例如可列舉從5’側，依照該基因表現調控區、該基因之順序而配置的態樣。
本發明之表現匣，視需要可包含其他單元(例如，多選殖位點(multicloning site)(MCS))。例如，在從5’側依照RBMS2基因表現調控區、上述「基因」之順配置的情況，可列舉於RBMS2基因表現調控區之5’側(較佳為與其鄰接)、RBMS2基因表現調控區與上述「基因」之間(較佳為與任一者或兩者鄰接)、在上述「基因」之3’側(較佳為與其鄰接)，配置MCS之態樣。MCS只要包含複數(例如2至50，較佳為2至20，更佳為2至10)個限制酵素位點即可，無特別限制。
本發明之表現匣，可僅由其，或與其他序列一起構成載體。此種載體(以下稱為「本發明之載體」) 亦包含於本發明。就其他序列而言，無特別限制，可採用表現載體可以含有的各種周知序列。就此種序列之一例而言，可列舉如複製起點、藥劑耐性基因等。又，藥劑耐性基因之種類可例示上述者。載體之種類無特別限制，可列舉如動物細胞表現質體等質體載體；逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、仙台病毒等病毒載體等。
本發明之載體可被含於細胞內。此種細胞(以下稱為「本發明之細胞」)亦可包含於本發明。在本發明之細胞中，本發明之載體可存在於基因組外，亦能以組入基因組內之狀態存在。就細胞來源之生物種類而言，無特別限制，可列舉如人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔、豬、馬、牛、綿羊、山羊、鹿等各種哺乳類。又，就該細胞之種類而言，亦無特別限制，可列舉來自各種組織或各種性質之細胞，例如血液細胞、造血幹細胞．前驅細胞、配子(精子、卵子)、纖維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角蛋白生成細胞、肌肉細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。
選自本發明之表現匣、本發明之載體、及本發明之細胞所構成之組群中的至少1種，可適合使用於後述之本發明的篩選方法中。從此觀點而言，本發明亦關於抑制RBMS2之表現或功能之物質(以炎症促進因子表現抑制劑之有效成分為較佳)的篩選用試藥(在本說明書中，稱為「本發明之試藥」)，其含有選自本發明之表現匣、本 發明之載體、及本發明之細胞所構成之組群中的至少1種。
本發明之試藥，只要含有選自本發明之表現匣、本發明之載體、及本發明之細胞所構成之組群中的至少1種即可，無特別限定，此外，亦可包含例如從本發明之表現匣檢測表現產物所必要者。就此種物之具體例而言，可列舉雜交用之試藥、探針之標識、標識體之檢測劑、緩衝液、器具等。本發明之試藥亦可為包含此等之篩選用套組的態樣。
3.篩選方法
本發明係關於抑制RBMS2之表現或功能之物質的篩選方法，其包含於受檢物質存在下，以選自下述(i)至(iii)所構成之組群中之至少1種為指標：(i)藉由RBMS2基因表現調控區來調控表現之基因表現量；(ii)RBMS2與包含富含AU單元之RNA的結合量；以及(iii)在RBMS2過剩表現細胞中，於3’-UTR包含富含AU單元的mRNA量或來自該mRNA的蛋白質量。(在本說明書中，有時稱為「本發明之篩選方法」)。以下，對於此點加以說明。
就本案中之「受檢物質」而言，不管是天然存在之化合物或人工製作之化合物，均可廣泛使用。又，不限於精製之化合物，亦可使用將多種化合物混合成之組成物，或動植物之萃取液。在化合物中，不限於低分子化 合物，亦可包含蛋白質、核酸、多糖類等高分子化合物。
本發明之篩選方法，更具體而言，在受檢物質存在下之前述指標之值，比受檢物質不存在下之前述指標之值較低的情況，可選擇以該受檢物質作為抑制RBMS2之表現或功能的物質。
所篩選之「抑制RBMS2之表現或功能的物質」，可選擇作為炎症促進因子表現抑制劑之有效成分或其候選物質。
以下，分別對於利用指標(i)至(iii)之各個的態樣，說明具體的篩選方法。
3-1.利用指標(i)之篩選方法
利用指標(i)之篩選方法包含下述步驟(a1)至(c1)：(a1)使含有表現匣的表現系與受檢物質接觸的步驟，其中該表現匣包含RBMS2基因表現調控區及被配置成可藉由該區調控表現的基因；(b1)測定已接觸受檢物質之表現系中之該基因的表現量，作為受檢表現量，並將該受檢表現量與對照表現量比較的步驟，其中該對照表現量係未接觸受檢物質之表現系中該基因的表現量以及(c1)在受檢表現量比對照表現量較低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2之表現的物質的步驟。
在步驟(a1)中，關於「包含RBMS2基因表現調控區及被配置成可藉由該區調控表現之基因的表現匣」，係與上述「2．表現匣」相同。但是，步驟(a1)中之 該表現匣，從包含細胞之基因組內之內在性RBMS2基因表現調控區及其下游之RBMS2基因的表現匣之觀點而言，與上述「2．表現匣」中之表現匣並不相同。
在步驟(a1)中，「表現系」只要為包含使來自上述表現匣之基因表現之必要成分的體系，則無特別限制。就該表現系而言，可列舉如無細胞蛋白質表現系、細胞。無細胞蛋白質表現系，通常由包含轉錄及轉譯所必要之因子(RNA聚合酶、核糖體、各種核糖核苷酸等)的溶液(細胞萃取液等)構成，可使用各種市售者。細胞只要為來自上述表現匣而可使基因表現之細胞即可，無特別限制，可列舉來自各種組織或各種性質之細胞，例如血液細胞、造血幹細胞．前驅細胞、配子(精子、卵子)、纖維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角蛋白生成細胞、肌肉細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。表現系從「能更簡便地進行篩選」之觀點而言，以細胞為較佳。
在步驟(a1)中，包含上述表現匣之表現系，於例如表現系為無細胞蛋白質表現系之情況，只要為該系之溶液內包含上述表現匣的狀態即可。又，於表現系為細胞之情況，上述表現匣可列舉組入細胞之基因組內的態樣、存在於基因組外(例如質體之狀態)的態樣等。
在步驟(a1)中，使受檢物質接觸之態樣無特別限定。在表現系為無細胞蛋白質表現系之情況，例如，只要在該系之溶液中添加受檢物質即可。又，在表現系為 細胞之情況，例如，只要在細胞培養之培養基中添加受檢物質即可。
在步驟(a1)中，受檢物質之接觸時間無特別限制，可依據受檢物質之種類、表現系之種類等而適宜設定。該時間例如為5分鐘至72小時。
在步驟(b1)中，受檢表現量及對照表現量之測定，可依照周知之方法或以其為基準而進行。較適合者，可使用上述本發明之診斷藥來進行。若在測定對象為核酸(RBMS2 mRNA或來自其之核酸(cDNA等))之情況，例如，可藉由使用作為探針或引子之北方墨點法(northen blot)、RT-PCR法、DNA晶片解析法、原位雜交解析法等測定。若在測定對象為蛋白質之情況，例如，可使用特異性抗體，藉由西方墨點法、ELISA法等測定。在測定對象為報導蛋白質之情況，可藉由能檢測其報導信號(螢光、顯色、發光等)之方法(螢光顯微鏡觀察、螢光素酶檢定等)測定。在測定對象為藥劑耐性蛋白質之情況，可藉由測定藥劑存在下之存活細胞數而間接地測定。
在利用北方墨點法之情況，具體而言，可例示將探針以放射性同位元素(32P、33P等：RI)或螢光物質等標識，將其依照常法，與轉移至尼龍膜等之來自上述表現系的mRNA雜交後，藉由放射線檢測器BAS-1800II(富士薄膜公司製)或螢光檢測器等檢測來自探針之標識物(RI或螢光物質等之標識物質)的信號，而測定診斷藥與來自受檢者樣本之mRNA所形成之雙股的方法。又，亦可採取下 述方法：使用AlkPhos直接標識及檢測系統(AlkPhos Direct Labelling and Detection System，Amersham Pharmacia Biotech公司製)，依照其規程(protocol)將探針標識，該探針與來自上述表現系之mRNA雜交後，藉由多生物成像儀STORM860(Amersham Pharmacia Biotech公司製)檢測來自探針標識物之信號而測定的方法。
在利用RT-PCR法之情況，具體而言，可例示：依照常法從來自上述表現系之RNA調製cDNA，以該cDNA作為模板並以可使標的區域擴增之方式，使一對引子(與上述cDNA(單股)結合之正鏈、與+鏈結合之逆鏈)與該cDNA雜交，依照常法進行PCR法，檢測所得到之擴增雙股DNA的方法。再者，擴增之雙股DNA的檢測，可使用藉由使用預先以RI或螢光物質標識之引子進行上述PCR，檢測所產生之標識雙股DNA的方法，或將產生之雙股DNA，依照常法轉移至尼龍膜等，使用標識探針與其雜交而檢測的方法等。再者，所生成之標識雙股DNA產物，可藉由Agilent 2100 Bioanalyzer(橫河Analytical Systems公司製)等測定。又，亦可使用SYBR Green RT-PCR Reagents(Applied Biosystems公司製)，依照其規程調製RT-PCR反應液，使其於ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems公司製)反應，檢測其反應物。
在利用DNA晶片解析之情況，可列舉準備貼附DNA探針(單股或雙股)之DNA晶片，使其與從來自上述表現系之RNA依照常法調製的cRNA雜交，將所形成 之DNA與cRNA的雙股，與標識探針結合並檢測的方法。
西方墨點法可例示使用一次抗體後，使用以125I等放射性同位元素、螢光物質、辣根過氧化物酶(HRP)等酵素等標識的標識抗體(與一次抗體結合之抗體)，作為二次抗體，藉由放射線測定器BAS-1800II(富士Film公司製等)、螢光檢測器等檢測從所得到之標識化合物而來之放射性同位元素、螢光物質等標識物質的信號而進行測定的方法。又，亦可使用一次抗體後，使用ECL Plus西方墨點檢測系統(ECL Plus Western Blotting Detection System)(Amersham Pharmacia Biotech公司製)，依照其規程進行檢測，並藉由多生物成像儀STORM860(Amersham Pharmacia Biotech公司製)來測定。
在步驟(c1)中，例如，在受檢表現量比對照表現量較低之情況，例如，受檢表現量為對照表現量之1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、或1/100的情況，可選擇受檢物質作為抑制RBMS2之表現的物質。
3-2.利用指標(ii)之篩選方法
利用指標(ii)的篩選方法包含下述步驟(a2)至(c2)：(a2)於受檢物質存在下，使包含富含AU單元之RNA與RBMS2接觸的步驟；(b2)測定在受檢物質存在下接觸之情況，該RNA與該RBMS2之結合量，作為受檢結合量，並將該受檢結合量與對照結合量比較的步驟，其中該對照結合量係在受檢物質不存在下接觸之情況，該RNA與該RBMS2之結合量；以 及(c2)在受檢結合量比對照結合量較低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2之功能的物質的步驟。
在步驟(a2)中，富含AU單元意指以AUUUA等為代表之以通式：(U)nW1(U)mW2(U)。[式中：U表示尿嘧啶；W1及W2可相同或相異，表示腺嘌呤或尿嘧啶(但是，排除W1及W2兩者均為尿嘧啶之情況)；n表示0至3之整數；o表示0至3之整數；m表示3至5之整數(較佳為3)]所示之鹼基序列作為共同序列的單元。該富含AU單元，較佳為來自炎症促進因子之mRNA(例如，選自IL-6 mRNA、COX-2 mRNA、IL-8 mRNA、IL-1 β mRNA、TNF-α mRNA、MMP1 mRNA、IL-24 mRNA、及c-Myc mRNA所構成之組群中的至少1種mRNA)的富含AU單元。其中，「來自~之富含AU單元」，易言之，意指此等mRNA所含之富含AU單元。
在步驟(a2)中，含有富含AU單元之RNA，只要含有該富含AU單元之RNA即可，無特別限制。該RNA中之富含AU單元之數目為，例如1至20個，較佳為2至15個，更佳為3至12個，進一步更佳為4至10個，又進一步更佳為6至9個。在該RNA中之富含AU單元之數目為複數的情況，富含AU單元以存在於比較狹小範圍內(例如20至400bp，較佳為40至200bp，更佳為60至150bp，進一步更佳為80至120bp)為較佳。又，此範圍以富含U 為較佳。就富含U之程度而言，該範圍之U之數目相對於全鹼基數目的比率，例如為20%以上，較佳為30%以上，更佳為50%以上。該比率之上限無特別限制，可例示為90%、80%、70%等。
在步驟(a2)中，關於RBMS2，與上述「2．表現匣」中之RBMS2蛋白質相同。
在步驟(a2)中，使受檢物質接觸之態樣，為可使3成分，即含有富含AU單元之RNA、RBMS2、及受檢物質接觸的態樣，但並無特別限定。例如，可列舉將此等3成分於適當溶劑中混合之態樣，將此等3成分於細胞內共存之態樣等。
在步驟(a2)中，受檢物質之接觸時間無特別限制，可依照受檢物質之種類、接觸係於試驗管內進行或於細胞內進行等而適宜設定。該時間為例如5分鐘至72小時。
在步驟(b2)中，受檢結合量及對照結合量之測定，可依照周知之方法或以其為基準而進行。例如，可藉由免疫沉降法或凝膠移位法等測定。
免疫沉降法典型上可依照以下方式進行。調製包含RNA及RBMS2(與受檢物質接觸，或未接觸)之細胞的細胞溶解液，其中該RNA為含有富含AU單元之RNA，將該溶解液以針對RBMS2之抗體，或在該RBMS2附加有標籤之情況，以針對該標籤之抗體，進行免疫沉降，藉由PCR測定沉降物中所含之「含有富含AU單元之RNA」 的量。若該測定量越多，表示受檢結合量或對照結合量越多。
凝膠移位法，典型地可依照以下方式進行。將包含：含有富含AU單元之RNA及RBMS2(進一步包含，或不含受檢物質)的溶液，使用適當凝膠(丙烯醯胺凝膠等)等進行電泳，測定顯示含有富含AU單元之RNA與RBMS2結合成之複合物的吸收帶之信號。若該測定量越多，表示受檢結合量或對照結合量越多。
在步驟(c2)中，例如受檢結合量比對照結合量較低之情況，例如，受檢結合量為對照結合量之1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、或1/100的情況，可選擇受檢物質作為抑制RBMS2之表現的物質。
3-3.利用指標(iii)之篩選方法
利用指標(iii)的篩選方法包含下述步驟(a3)至(c3)：(a3)使含有下述mRNA且RBMS2過剩表現的細胞與受檢物質接觸的步驟，其中該mRNA在3’-UTR包含富含AU單元；(b3)測定與受檢物質接觸之細胞中之該mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量作為受檢量，將未與受檢物質接觸之細胞中之該mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量作為對照量，並比較該受檢量與該對照量的步驟；以及(c3)在受檢量比對照量較低的情況，選擇該受檢物質作為抑制RBMS2之功能的物質的步驟。
在步驟(a3)中，關於富含AU單元，係與「3-2. 利用指標(ii)之篩選方法」中的富含AU單元相同。
在步驟(a3)中，於3’-UTR中包含富含AU單元之mRNA，只要為3’-UTR中包含此富含AU單元之mRNA即可，無特別限制。該mRNA之3’-UTR中的富含AU單元之數目，例如為1至20個，較佳為2至15，更佳為3至12，進一步更佳為4至10，又進一步更佳為6至9。該mRNA中之富含AU單元之數目為複數的情況，以富含AU單元於比較狹小範圍內(例如，20至400，較佳為40至200，更佳為60至150，進一步更佳為80至120)存在為較佳。
在步驟(a3)中，於3’-UTR中包含富含AU單元之mRNA，較佳為炎症促進因子之mRNA，更佳可列舉IL-6 mRNA、COX-2 mRNA、IL-8 mRNA、IL-1 β mRNA、TNF-α mRNA、MMP1 mRNA、IL-24 mRNA、c-Myc mRNA等，或此等mRNA之變異型。就該變異型而言，較佳可列舉富含AU單元以外之序列、或一部分之富含AU單元中，1個或複數個(例如，為2至50個，較佳為2至20個，更佳為2至10個，進一步更佳為2至5個，又進一步更佳為2或3個)鹼基被置換、刪除、附加、或插入的mRNA。
在步驟(a3)中，關於RBMS2，與上述「2.表現匣」中之RBMS2蛋白質相同。
在步驟(a3)中，關於細胞，與上述「3-1.利用指標(i)之篩選方法」中之細胞相同。
在步驟(a3)中，使受檢物質接觸之態樣，無特別限定。可列舉例如在細胞培養之培養基中添加受檢物 質的態樣。
在步驟(a3)中，受檢物質之接觸時間，無特別限制，可依照受檢物質之種類等而適宜設定。該時間為例如5分鐘至72小時。
在步驟(b3)中，關於受檢量及對照量之測定，與上述「3-1.利用指標(i)之篩選方法」中之受檢表現量及對照表現量的測定相同。
在步驟(c3)中，於例如受檢量比對照量較低之情況，例如於受檢量為對照量之1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、或1/100的情況，可選擇受檢物質作為抑制RBMS2之表現的物質。
4.炎症促進因子表現抑制劑
本發明係關於含有選自RBMS2表現抑制劑及RBMS2功能抑制劑所構成之組群中之至少1種的炎症促進因子表現抑制劑(在本說明書中，稱為「本發明之劑」)。以下，針對此項加以說明。
關於為表現抑制對象及功能抑制對象之RBMS2，與上述「2.表現匣」中之RBMS2蛋白質相同。
就RBMS2表現抑制劑而言，只要能抑制RBMS2蛋白質之表現量者即可，無特別限制，可列舉如RBMS2特異性小型干擾RNA(siRNA)、RBMS2特異性微RNA(miRNA)、RBMS2特異性反義核酸、此等之表現載體等。又，除了此等之外，IL-10蛋白質有作為RBMS2表現抑制劑之功能，亦示於本實施例。
RBMS2特異性siRNA，只要為特異性地抑制編碼RBMS2之基因表現的雙股RNA分子即可，無特別限制。在一實施態樣中，siRNA以例如18鹼基以上、19鹼基以上、20鹼基以上、或21鹼基以上之長度為較佳。又，siRNA以例如25鹼基以下，24鹼基以下，23鹼基以下，或22鹼基以下之長度為較佳。假設此處記載之siRNA之長度的上限值及下限值，可任意地組合。例如，假設下限為18鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度；下限為19鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度；下限為20鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度；下限為21鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度的組合。
siRNA亦可為shRNA(小髮夾樣RNA)。shRNA可設計成為其一部分形成莖環(stem loop)構造的方式。例如，shRNA可設計成：若以某區域之序列作為序列a，以序列a之互補鏈作為序列b，以成為序列a、間隔子、序列b之順序，使此等序列存在於單股RNA鏈上，且全部成為45至60鹼基之長度。序列a係編碼為標的之RBMS2的鹼基序列之一部分區域的序列，標的區域無特別限定，可將任意之區域作為候選。於是，序列a之長度為19至25鹼基，較佳為19至21鹼基。
RBMS2特異性siRNA，亦可在5’或3’末端具有附加之鹼基。該附加之鹼基的長度，通常為約2至4 鹼基。該附加之鹼基可為DNA，亦可為RNA，然而若使用DNA，有可使核酸之安定性提高的情況。就此種附加之鹼基序列而言，可列舉如ug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等序列，然而不以此等為限。
siRNA可在3'末端具有突出部序列(突出(overhanging))，具體而言，可列舉附加dTdT(dT表示脫氧胸苷)者。又，亦可為末端無附加之平滑末端(鈍端)。siRNA之正義鏈及反義鏈可為不同鹼基數，例如，可列舉反義鏈在3'末端及5'末端具有突出部序列(突出)之「不對稱干擾RNA(aiRNA)」。典型之aiRNA，反義鏈為21鹼基所構成，正義鏈為15鹼基所構成，反義鏈之兩端各為3鹼基的突出構造。
RBMS2特異性siRNA之標的序列的位置，無特別限制；在一實施態樣中，以選自：從5’-UTR及起始密碼子至約50個鹼基為止、及3’-UTR以外之區域的標的序列為宜。對於所選擇之標的序列的候選群，較佳使用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等同源性檢索軟體調查在標的以外之mRNA中，連續16-17個鹼基所構成之序列是否具有同源性，來確認所選擇之標的序列的特異性。對於特異性已被確認之標的序列，可設計在AA(或NA)以下之19-21鹼基具有TT或UU之3’末端突出的正義鏈，及在該19-21鹼基具有互補之序列及TT或UU之3’末端突出的反義鏈所構成之雙股RNA，作為siRNA。又， 為siRNA之前驅體的shRNA，適宜選擇可形成環圈構造之任何連接子(linker)序列(例如，約5-25鹼基)，可藉由將上述正義鏈與反義鏈經由該連接子序列連結而設計。
siRNA及/或shRNA之序列，可使用各種網站上免費提供之檢索軟體進行檢索。就此種網站而言，可列舉如以下所示。
Ambion提供之siRNA Target Finder(http：//www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html)p Silencer(註冊商標)Expression Vector用插入設計工具(http：//www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html)RNAi Codex提供之GeneSeer(http：//codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi)。
siRNA可藉由將mRNA上之標的序列的正義鏈及反義鏈分別以DNA/RNA自動合成機合成，在適當之黏合(annealing)緩衝液中，於約90至約95℃進行約1分鐘改質後，於約30至約70℃進行約1至約8小時黏合而調製。又，亦可藉由合成為siRNA之前驅體的shRNA，將其使用RNA切斷蛋白質dicer酵素切斷而調製。
RBMS2特異性miRNA只要可阻礙編碼RBMS2之基因之轉譯，任何均可。例如，miRNA，並非如siRNA可將標的mRNA切斷，而是與標的之3’非轉譯區域(UTR)配對，阻礙其轉譯。miRNA可為pri-miRNA(primary miRNA)、pre-miRNA(precursor miRNA)、及成熟miRNA之任一種。miRNA之長度無特別限制，pri-miRNA之長度通 常為數百至數千個鹼基，pre-miRNA之長度通常為50至80個鹼基，成熟miRNA之長度通常為18至30個鹼基。在一實施態樣中，RBMS2特異性miRNA，較佳為pre-miRNA或成熟miRNA，更佳為成熟miRNA。此種RBMS2特異性miRNA，可藉由周知之手法合成，亦可從提供合成RNA之公司購入。
RBMS2特異性反義核酸，意指包含與編碼RBMS2之基因之mRNA之鹼基序列互補或實質上互補之鹼基序列或其一部分的核酸，其藉由與該mRNA形成特異性且安定之雙股而結合，具有抑制RBMS2蛋白質合成之功能的核酸。反義核酸亦可為DNA、RNA、DNA/RNA嵌合體之任一種。在反義核酸為DNA之情況，藉由標的RNA與反義DNA所形成之RNA：DNA雜交物被內在性核糖核酸酶H(RNase H)識別，而引起標的RNA之選擇性分解。因此，在導向由RNase H分解之反義DNA的情況，標的序列不僅為mRNA中之序列，亦可為RBMS2基因之初期轉譯產物之內含子區域的序列。內含子序列可藉由使用BLAST、FASTA等同源性檢索程式，將基因組序列，與RBMS2基因之cDNA鹼基序列比較而決定。
RBMS2特異性反義核酸之標的區域，只要藉由該反義核酸雜交，結果能阻礙轉譯成RBMS2蛋白質者即可，其長度無限制。RBMS2特異性反義核酸可為編碼RBMS2之mRNA的全序列，亦可為部分序列。若考慮合成之容易度或抗原性、細胞內移行性之問題等，以約10至約 40個鹼基，尤其約15至約30個鹼基所構成之寡核苷酸為較佳，但不以此等為限。更具體而言，可選擇RBMS2基因之5’端髮夾環、5’端非轉譯區域、轉譯起始密碼子、蛋白質編碼區域、ORF轉譯終止密碼子、3’端非轉譯區域、3’端廻文(palindrome)區域或3’端髮夾環等，作為反義核酸之較佳標的區域，然而不以彼等為限。
RBMS2特異性反義核酸不僅可與RBMS2基因之mRNA或初期轉錄產物雜交，阻礙轉譯成蛋白質，亦可與為雙股DNA之此等基因結合，形成三股(triplex)，而阻礙轉錄成RNA(抗基因(antigene))。
構成上述之RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、及RBMS2特異性反義核酸的核苷酸分子，為了使安定性(化學上及/或對酵素)或比活性(與RNA之親和性)提高，可包含各種化學修飾。例如，為了防止被核酸酶等水解酵素之分解，可將構成反義核酸之各核苷酸的磷酸殘基(phosphate)置換成例如硫代磷酸殘基(phosphorothioate；PS)、甲基膦酸殘基(methylphosphonate)、二硫代磷酸殘基(phosphorodithioate)等化學修飾磷酸殘基。又，可將各核苷酸之糖(核糖)之2’位的羥基，置換成-OR(R=CH3(2’-O-Me)、CH2CH2OCH3(2’-O-MOE)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、或CH2CH2CN等)。再者，可在鹼基部分(嘧啶、嘌呤)施行化學修飾，例如，可於嘧啶鹼基之5位施行甲基或陽離子性官能基的導入，或將2位之羰基置換成硫羰基等。又，可將構成siRNA或miRNA之核苷 酸分子的一部分置換成天然型之DNA。
RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、及RBMS2特異性反義核酸等，可藉由基於RBMS2基因之cDNA序列或基因組DNA序列決定mRNA或初期轉錄產物之標的序列，使用市售之DNA/RNA自動合成機，合成與其互補的序列而調製。又，包含上述各種修飾之反義核酸，亦可藉由任何周知之手法，以化學方式合成。
關於RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、或RBMS2特異性反義核酸之表現載體，只要RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、或RBMS2特異性反義核酸以能表現之狀態組入即可，無特別限定。典型而言，該表現載體包含：啟動子序列、以及含RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、或RBMS2特異性反義核酸之編碼序列(視需要，進一步的轉錄終結信號序列)的多核苷酸，視需要可包含其他序列。啟動子無特別限制，可列舉如CMV啟動子、EF1啟動子、SV40啟動子、MSCV啟動子、hTERT啟動子、β肌動蛋白啟動子、CAG啟動子等RNA聚合酶II(polII)系啟動子；小鼠及人類之U6-snRNA啟動子、人類H1-RNase P RNA啟動子、人類纈胺酸-tRNA啟動子等RNA聚合酶III(polIII)系啟動子等，此等之中，從可正確地進行短RNA之轉錄的觀點而言，以polIII系啟動子為較佳。就其他序列而言，無特別限制，可採用各種能包含表現載體的周知序列。就此種序列之一例而言，可列舉如複製起點、藥劑耐性基因等。又，藥劑耐性基因之 種類及載體之種類，可例示上述者。
就RBMS2表現抑制劑之其他例子而言，可列舉RBMS2特異性核糖酶等。「核糖酶(ribozyme)」狹義地意指具有切斷核酸之酵素活性的RNA，然而在本案中，亦包含具有序列特異性核酸切斷活性的DNA。就核糖酶核酸而言，泛用性最高者，為於類病毒或擬病毒等感染性RNA中所見之自我剪接RNA，已知有槌頭型或髮夾型等。槌頭型以約40鹼基發揮酵素活性，藉由使保持槌頭構造之部分所鄰接之兩端的各數個鹼基(合計約10個鹼基)成為與mRNA之期望切斷部位互補的序列，可只將標的mRNA特異性地切斷。此類型之核糖酶核酸，由於只以RNA為基質，有「不攻擊基因組DNA」的優點。在RBMS2基因之mRNA本身保持雙股構造的情況，藉由使用能與RNA解旋酶特異性結合之雜交核糖酶，可將標的序列變成單股，其中該雜交核糖酶連結有來自病毒核酸的RNA基序(motif)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(10)：5572-5577(2001)]。再者，在將核糖酶以包含其之編碼DNA之表現載體的態樣使用的情況，為了促進轉錄產物移行至細胞質，亦可設計成進一步連結有可改變tRNA之序列的雜交核糖酶[Nucleic Acids Res.,29(13)：2780-2788(2001)]。
RBMS2功能抑制劑，只要為能抑制RBMS2蛋白質之功能者即可，無特別限制。其中，抑制RBMS2蛋白質之功能，意指例如(x)使RBMS2與包含富含AU單元之RNA的結合量減少，及/或(y)使RBMS2過剩表現細胞中 於3’-UTR包含富含AU單元的mRNA量或來自前述mRNA的蛋白質量減少。是否抑制RBMS2蛋白質之功能，例如，可依照上述「3-2.利用指標(ii)之篩選方法」或「3-3.利用指標(iii)之篩選方法」所記載的方法判定。
為本發明之劑之表現抑制對象的炎症促進因子，只要為有助於活體內炎症反應之發生或其惡化的因子即可，無特別限制。就該因子而言，可列舉如IL-6、COX-2、IL-1 β、IL-8、TNF-α、MMP1、IL-24、c-Myc等。
本發明之劑，可使用作為藉由炎症促進因子(例如IL-6、COX-2、IL-1 β、IL-8、TNF-α、MMP1、IL-24、c-Myc等)而發病或惡化之疾病的預防或治療劑。就該疾病而言，具體言之，可列舉如免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等。就診斷對象疾病而言，更具體言之，可列舉如自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、過敏性疾病等，較佳可列舉自體免疫疾病、風濕性關節炎、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、術後疼痛、過敏性疾病等，更佳可列舉風濕性關節炎。
本案中之自體免疫疾病，可包含以下者，然而不以彼等為限：格林．巴利症候群、潰瘍性大腸炎、可隆氏病、巴塞多(Basedow)氏病、風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、多發性肌炎、硬皮症、薛格連氏症候群(Sjogren’s syndrome)。
本案中之風濕性疾病，可包含以下者，然而不以彼等為限：風濕性關節炎、少年性特發性關節炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮症、多發性肌炎、血管炎症候群、白塞特氏病、薛格連氏症候群、關節症性乾癬。
本案中之變性關節疾病，可包含以下者，然而不以彼等為限：變形性膝關節症、變形性股關節症、變形性肘關節症、變形性肩關節症、變形性手關節症、變形性足關節症。
本案中之淋巴增殖性疾病可包含下述者：淋巴浮腫、淋巴節炎、惡性淋巴瘤、巨大淋巴結增生(卡斯爾曼病(Castleman’s disease))，然而不以彼等為限。
本案中之中樞性脫髓疾病可包含下述者：多發性硬化症、急性瀰漫性腦脊髓炎、炎症性廣泛性硬化症，然而不以彼等為限。
本案中之脊椎關節症，可包含下述者：僵直性脊椎炎、反應性關節炎、乾癬性關節炎，然而不以彼等為限。
本案中之炎症性疼痛，可包含下述者：變形性關節症、腰痛症、肩關節周圍炎、頸肩腕症候群、腱．腱鞘炎、齒痛，然而不以彼等為限。
本案中之過敏性疾病，可包含下述者：接觸性皮膚炎、濕疹、蕁麻疹、昆克浮腫(Quinke’s edema)、結節性紅斑、異位性(atopic)皮膚炎等過敏性皮膚疾病、過敏性鼻炎、支氣管氣喘、藥物過敏、食物過敏，然而不以 彼等為限。
本發明之劑，只要含有選自RBMS2表現抑制劑及RBMS2功能抑制劑所構成之組群中的至少1種(在本說明書中，簡稱為「有效成分」)即可，無特別限制，視需要可含有其他成分。就其他成分而言，只要為藥學上容許之成分即可，無特別限定，可列舉如基劑、載劑、溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、安定劑、賦形劑、黏合劑、崩散劑、潤滑劑、增黏劑、保濕劑、著色料、香料、螯合劑等。
本發明之劑的使用態樣，無特別限制，可依據其種類，採取適當之使用態樣。本發明之劑，例如，能以試管中之方式使用(例如，添加於培養細胞之培養基)，亦能以活體中之方式使用(例如，投與至動物)。
本發明之劑之適用對象無特別限定，可列舉如人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔、豬、馬、牛、綿羊、山羊、鹿等各種哺乳類動物；動物細胞等。細胞之種類亦無特別限制，可列舉如血液細胞、造血幹細胞．前驅細胞、配子(精子、卵子)、纖維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角蛋白生成細胞、肌肉細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。
本發明之劑的劑型無特別限制，可依據其使用態樣而採取適當劑型。例如，若於投與至動物之情況，可列舉如錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、細粒劑、糖漿劑、 腸溶劑、緩釋性膠囊劑、咀嚼錠、滴劑、丸劑、內用液劑、糖果錠劑、緩釋劑、緩釋性顆粒劑等口服劑；點鼻劑、吸入劑、肛門栓劑、插入劑、浣腸劑、凝膠劑等外用劑等。又，本發明之劑可為固體製劑、半固體製劑、液劑之任一種。
本發明之劑中之有效成分的含量，係受使用態樣、適用對象、適用對象之狀態等影響，並無限定，然而可為例如0.0001至100重量%，較佳為0.001至50重量%。
將本發明之劑投與至動物之情況的投與量，只要為可表現藥效之有效量即可，無特別限定，通常就有效成分之重量而言，一般在經口投與之情況，每一日為0.1至1000mg/kg體重，較佳為每一日0.5至500mg/kg體重，在非經口投與之情況，每一日為0.01至100mg/kg體重，較佳為0.05至50mg/kg體重。上述投與量以1日1次或分為2至3次投與為較佳，亦可依據年齡、病態、症狀而適宜增減。
5.診斷藥
本發明係關於動物疾病之診斷藥(在本說明書中，亦以「本發明之診斷藥」表示)，其含有RBMS2基因表現產物檢測劑。以下，針對此點加以說明。
為RBMS2基因表現產物檢測劑之檢測對象的RBMS2基因表現產物，只要為診斷對象之生物活體內表現的RBMS2基因表現產物即可，無特別限定，可列舉如 RBMS2 mRNA或來自其之核酸(cDNA等)、RBMS2蛋白質等。
為診斷對象之動物，只要能使RBMS2基因於活體內表現之動物即可，無特別限制，可列舉如人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔等各種哺乳類。
來自各種動物之RBMS2 mRNA及RBMS2蛋白質的序列為周知。具體而言，例如就人類RBMS2 mRNA而言，可列舉序列編號3所示鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_002898.3)，就小鼠RBMS2 mRNA而言，可列舉序列編號4所示鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_019711.2)。就人類RBMS2蛋白質而言，可列舉序列編號2所示胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_002889.1)，就小鼠RBMS2蛋白質而言，可列舉序列編號5所示胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_062685.2)。又，RBMS2蛋白質中，亦包含N末端缺損之類型者，就此種類型者而言，若為例如小鼠之情況，可列舉序列編號6所示胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_001034169.1)(mRNA為序列編號7所示鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_001039080.1))。
為檢測對象之RBMS2蛋白質，只要具有「可促進包含來自炎症促進因子mRNA(例如，IL-6 mRNA、COX-2 mRNA、IL-8 mRNA、IL-1 β mRNA、TNF-α mRNA、MMP1 mRNA、IL-24 mRNA、c-Myc mRNA等)之3’UTR的mRNA或由該mRNA轉譯的蛋白質之表現」的活性(炎症促進因子表現促進活性)，亦可具有置換、刪除、附加、插入等胺基酸變異。就變異而言，從較不易損及炎症促進因子表現促進活性的觀點而言，較佳可列舉置換，更佳可列舉保存性置換。
又，為檢測對象之RBMS2 mRNA，只要從該mRNA轉譯之蛋白質具有炎症促進因子表現促進活性，亦可具有置換、刪除、附加、插入等鹼基變異。就變異而言，以在從該mRNA轉譯之蛋白質中不發生胺基酸置換的變異，或發生胺基酸之保存性置換的變異為較佳。
炎症促進因子表現促進活性之有無，可依照周知之方法或以其為基準而判定。例如，可依照實施例記載之方法或以其為基準而判定。就具體例而言，在實施例1B中，使用受檢蛋白質之表現載體作為表現載體的情況，若螢光素酶活性比使用空白載體之情況高，可判定該受檢蛋白質具有炎症促進因子表現促進活性。
就為檢測對象之RBMS2蛋白質的較佳具體例而言，可列舉選自下述(a)記載之蛋白質及下述(b)記載之蛋白質所構成之組群中的至少1種：(a)由序列編號2、5、或6所示之胺基酸序列所構成的蛋白質；及(b)由與序列編號2、5、或6所示之胺基酸序列具有85%以上之相同性的胺基酸序列所構成，且具有炎症促進 因子表現促進活性之蛋白質。
在上述(b)中，相同性較佳為90%以上，更佳為95%以上，進一步更佳為98%以上。
就上述(b)記載之蛋白質的一例而言，可列舉如(b’)由對於序列編號2、5、或6所示之胺基酸序列經置換、刪除、附加、或插入1個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列所構成，且具有炎症促進因子表現促進活性的蛋白質。
在上述(b’)中，複數個意指例如2至30個，較佳為2至10個，更佳為2至5個，進一步更佳為2或3個。
就為檢測對象之RBMS2 mRNA的較佳具體例而言，可列舉選自下述(c)記載之蛋白質及下述(d)記載之mRNA所構成之組群中的至少1種：(c)由序列編號3、4、或7所示之鹼基序列所構成的mRNA；及(d)由與序列編號3、4、或7所示之鹼基序列具有85%以上之相同性的鹼基序列所構成，且編碼具有炎症促進因子表現促進活性之蛋白質的mRNA。
在上述(d)中，相同性較佳為90%以上，更佳為95%以上，進一步更佳為98%以上。
就上述(d)記載之蛋白質的一例而言，可列舉如 (d’)由對於序列編號3、4、或7所示之鹼基序列經置換、刪除、附加、或插入1個或複數個鹼基而成之鹼基序列所構成，且編碼具有炎症促進因子表現促進活性之蛋白質的mRNA。
在上述(d’)中，複數個意指例如2至500個，較佳為2至100個，更佳為2至50個，進一步更佳為2至10個。
RBMS2基因表現產物檢測劑，只要能進行上述之RBMS2基因表現產物的檢測及定量者即可，無特別限定。就RBMS2基因表現產物檢測劑而言，在RBMS2基因表現產物為核酸(例如，RBMS2 mRNA、來自其之核酸(cDNA等)等)之情況，可列舉如引子、探針等，在RBMS2基因表現產物為蛋白質之情況，可列舉如抗體等。
引子或探針等，只要可選擇地(特異性地)識別RBMS2 mRNA或來自其之核酸等者即可，無特別限定。其中，「選擇性地(特異性地)識別」意指例如在北方墨點法中，RBMS2 mRNA可以特異性地檢出，又在RT-PCR法中，RBMS2 mRNA或來自其之核酸(cDNA等)可特異性地擴增，然而不以此為限，本技術領域人士只要能判斷上述檢測物或擴增物係來自RBMS2 mRNA者即可。
就引子或探針之具體例而言，可列舉選自下述(e)記載之多核苷酸及下述(f)記載之多核苷酸所構成之組群中的至少1種：(e)在RBMS2 mRNA之鹼基序列中具有連續至少15個 鹼基之多核苷酸及/或與該多核苷酸互補的多核苷酸，及(f)RBMS2 mRNA之鹼基序列或在嚴苛條件下能雜交於與其互補之鹼基序列上且具有至少15個鹼基的多核苷酸。
互補之多核苷酸或互補之鹼基序列(互補鏈、逆鏈)，意指對於由RBMS2 mRNA之鹼基序列所構成之多核苷酸的全長序列、或具有該鹼基序列中至少連續15個鹼基長之鹼基序列的部分序列(其中，為了方便，亦將此等稱為「正鏈」)，依據「A：T及G：C」之鹼基對關係，具有鹼基性互補之關係的多核苷酸或鹼基序列。但是，該互補鏈不限於形成與為對象之正鏈之鹼基序列完全互補序列的情況，亦可為在嚴苛條件下具有能與為對象之正鏈雜交之程度的互補關係。再者，其中之嚴苛條件，如Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA)所教導，可基於複合物或結合有探針之核酸的熔解溫度(Tm)來決定。例如就雜交後之洗淨條件而言，通常可列舉如「1×SSC，0.1%SDS，37℃」程度之條件。互補鏈，以即使藉由該條件洗淨，仍維持與為對象之正鏈雜交之狀態者為較佳。雖無特別限制，然而就更嚴苛之雜交條件而言，可列舉「0.5×SSC，0.1%SDS，42℃」之程度，就進一步更嚴苛之雜交條件而言，可列舉「0.1×SSC，0.1%SDS，65℃」之程度的洗淨條件。具體言之，就此種互補鏈而言，可例示：由與為對象之正鏈的鹼基序列具有完全互補之關係之 鹼基序列所構成的鏈，及由與該鏈具有至少90%，較佳為95%，更佳為98%以上，進一步更佳為99%以上之相同性之鹼基序列所構成的鏈。
引子或探針等，可依據例如序列編號3、4、或7所示之RBMS2 mRNA的鹼基序列，利用例如載體NTI(Infomax公司製)來設計。具體而言，可使用將前述RBMS2 mRNA之鹼基序列輸入載體NTI之軟體所得到的引子或探針之候選序列、或含有至少一部分該序列的序列，作為引子或探針。
引子或探針等之鹼基長，只要為如上述，具有連續至少15個鹼基之長度者，無特別限制，可依照用途而適宜設定。就鹼基長度而言，若在例如使用作為引子之情況，可例示如15個鹼基至100個鹼基，較佳為15個鹼基至50個鹼基，更佳為15個鹼基至35個鹼基，若在例如使用作為探針之情況，可例示例如15個鹼基至全序列之鹼基數，較佳為15個鹼基至1000個鹼基，更佳為100個鹼基至1000個鹼基。
引子或探針等，只要未顯著地損及其功能，可施行修飾。就修飾而言，例如，可列舉標識物，例如螢光色素、酵素、蛋白質、放射性同位體、化學發光物質、生物素等之附加。
就本發明中所用之螢光色素而言，較佳為使用一般標識核苷酸、核酸之檢測或定量所用者，例如，可列舉HEX(4,7,2’,4’,5’,7’-六氯-6-羧基螢光素，綠色螢光 色素)、螢光素(fluorescein)、NED(商品名，Applied Biosystems公司製，黃色螢光色素)、或6-FAM(商品名，Applied Biosystems公司製，黃綠色螢光色素)、羅丹明(rhodamin)或其衍生物[例如，四甲基羅丹明(TMR)]，然而不以此等為限。藉由螢光色素標識核苷酸之方法，可使用周知之標識法中的適當者[參照Nature Biotechnology,14,303-308(1996)]。又，亦可使用市售之螢光標識套組(例如，Amersham Pharmacia公司製，寡核苷酸ECL 3’-Oligo標識系統等)。
引子亦可於任何固相進行固定化而使用。因此，本發明之診斷藥，可以將探針(寡或多核苷酸)做成固定化探針(例如將探針固定化之DNA晶片、cDNA微陣列、寡DNA陣列、膜過濾器等；以下總稱為「DNA晶片等」)之態樣提供。
固定化所使用之固相，只要能使寡或多核苷酸固定化者即可，無特別限制，可列舉如玻璃板、尼龍膜、微珠粒、矽晶片、毛細管或其他基板等。寡或多核苷酸於固相之固定，可有將預先合成之寡或多核苷酸承載於固相上的方法，亦有將為目的之寡或多核苷酸於固相上合成的方法。固定方法，例如若為DNA微陣列，可利用市售之Spotter(Amersham公司製等)等，依照固定化探針之種類來選擇為該技術領域所周知者[例如，藉由光微影技術(Affymetrix公司)、噴墨技術(Rosetta Inpharmatics公司)的寡核苷酸之原位合成等]。
抗體等只要能選擇性地(特異性地)識別RBMS2蛋白質者即可，無特別限定。其中，「選擇性地(特異性地)識別」意指例如在西方墨點法或ELISA法中，RBMS2蛋白質可特異性地檢出，然而不以此為限，本技術領域人士只要能判斷上述檢測物係來自RBMS2蛋白質者即可。
抗體中，包含多株抗體、單株抗體、嵌合體抗體、單鏈抗體、或Fab片段或藉由Fab表現庫所生成之片段等具有抗原結合性之上述抗體的一部分。對於RBMS2蛋白質之胺基酸序列中通常由至少連續8個胺基酸，較佳15個胺基酸，更佳20個胺基酸所構成之多肽具有抗原結合性的抗體，亦包含於本發明之抗體中。
此等抗體之製造方法完全為周知，本發明之抗體亦可依照此等之常法製造(Current protocols in Molecular Biology,Chapter 11.12~11.13(2000))。具體而言，在本發明之抗體為多株抗體的情況，可使用依照常法在大腸菌等中表現而後精製之RBMS2蛋白質；或依照常法合成具有該RBMS2蛋白質之部分胺基酸序列的寡肽，以其對家兎等非人類動物施行免疫，依照常法從該免疫動物之血清中得到。另一方面，在為單株抗體之情況，可將依照常法在大腸菌等中表現而後精製之RBMS2蛋白質、或將具有RBMS2蛋白質之部分胺基酸序列的寡肽對小鼠等非人類動物施行免疫，使所得到之脾臟細胞及骨髓瘤細胞進行細胞融合，從所調製之融合瘤細胞中得到(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4~11.11)。
在抗體製作中使用作為免疫抗原之RBMS2蛋白質，可基於周知之基因序列資料，藉由DNA選殖、各質體之構築、對宿主之轉染、轉形體之培養及從培養物進行蛋白質回收之操作而得到。此等操作可依照本技術領域人士已知之方法、或文獻記載之方法(Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983),DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985))等為基準而進行。
具體而言，藉由製作能使編碼RBMS2的基因於期望之宿主細胞中表現的重組DNA(表現載體)，將其導入宿主細胞中並使宿主轉形，培養該轉形體，從所得到之培養物，回收目的蛋白質，可得到作為本發明抗體製造用之免疫抗原的蛋白質。又，RBMS2蛋白質之部分肽，亦可依據周知之基因序列資料，藉由一般化學合成法(肽合成)而製造。
又，本發明之抗體可為使用具有RBMS2蛋白質之部分胺基酸序列的寡肽而調製者。使用於該抗體之製造的寡(多)肽，雖不需要具有功能上之生物活性，然而以具有與RBMS2蛋白質相同之免疫原特性者為較佳。較佳可例示具有此免疫原特性，且由RBMS2蛋白質之胺基酸序列中至少連續8個胺基酸，較佳15個胺基酸，更佳20個胺基酸所構成之寡(多)肽。
針對該寡(多)肽之抗體的製造，亦可依據宿 主，藉由使用各種佐劑，提高免疫學上之反應而進行。雖無限定，然而此種佐劑，包含弗氏(Freund)佐劑、如氫氧化鋁之礦物凝膠、及溶血卵磷酯、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、聚陰離子、胜肽、油乳劑、如鑰孔血藍蛋白(keyhole impet hemocyanin)及二硝基酚之表面活性物質、BCG(Calmette-Guerin桿菌)或小棒桿菌(Corynebacterium parvum)等人類佐劑。
本發明之診斷藥，只要含有上述RBMS2基因表現產物檢測劑者即可，無特別限定，可為僅由該檢測劑構成者，亦可除了該檢測劑外，包含例如RBMS2基因表現產物之檢測所必需者。就此種物之具體例而言，可列舉雜交用之試藥、探針之標識、標識體之檢測劑、緩衝液、器具等。本發明之診斷藥，亦可為包含此等之診斷藥套組的態樣。
本發明之診斷藥的診斷對象疾病，只要為藉由炎症促進因子(例如IL-6、COX-2、IL-1 β、IL-8、TNF-α、MMP1、IL-24、c-Myc等)而發病或惡化之疾病，則無特別限制。就診斷對象疾病而言，具體言之，可列舉如免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等。就診斷對象疾病而言，更具體言之，可列舉如自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、過敏性疾病等，較佳可列舉自體免疫疾病、風濕性關節炎、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、術後 疼痛、過敏性疾病等，更佳可列舉風濕性關節炎。
本案中之自體免疫疾病，可包含以下者，然而不以彼等為限：格林．巴利症候群、潰瘍性大腸炎、可隆氏病、巴塞多氏病、風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、多發性肌炎、硬皮症、薛格連氏症候群。
本案中之風濕性疾病，可包含以下者，然而不以彼等為限：風濕性關節炎、少年性特發性關節炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮症、多發性肌炎、血管炎症候群、白塞特氏病、薛格連氏症候群、關節症性乾癬。
本案中之變性關節疾病可包含下述者，然而不以彼等為限：變形性膝關節症、變形性股關節症、變形性肘關節症、變形性肩關節症、變形性手關節症、變形性足關節症。
本案中之淋巴增殖性疾病可包含下述者，然而不以彼等為限：淋巴浮腫、淋巴節炎、惡性淋巴瘤、卡斯爾曼病。
本案中之中樞性脫髓疾病，可包含下述者，然而不以彼等為限：多發性硬化症、急性瀰漫性腦脊髓炎、炎症性廣泛性硬化症。
本案中之脊椎關節症可包含下述者，然而不以彼等為限：僵直性脊椎炎、反應性關節炎、乾癬性關節炎。
本案中之炎症性疼痛可包含下述者，然而不以彼等為限：變形性關節症、腰痛症、肩關節周圍炎、 頸肩腕症候群、腱．腱鞘炎、齒痛。
本案中之過敏性疾病可包含下述者，然而不以彼等為限：接觸性皮膚炎、濕疹、蕁麻疹、昆克浮腫、結節性紅斑、異位性皮膚炎等過敏性皮膚疾病、過敏性鼻炎、支氣管哮喘、藥物過敏、食物過敏。
本發明之診斷藥，如後述之「2.疾病之檢測方法」及「3.疾病之進行度的判定方法」中所記載，可使用於上述診斷對象疾病之有無(亦即，受檢體是否罹患疾病)的診斷、及上述診斷對象疾病之進行度的診斷。
2.疾病之檢測方法
本發明係關於以RBMS2表現量作為指標之免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病的檢測方法(在本說明書中，亦以「本發明之疾病檢測方法」表示)。以下，關於此點加以說明。
就本發明之疾病檢測方法的具體態樣而言，可列舉如以下之態樣：一種免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之檢測方法，其具有(a1)測定從受檢體採取之樣本中RBMS2基因表現產物之受檢表現量的步驟；及(b1)將在上述步驟(a1)中所測定之受檢表現量與對照表現量對比的步驟，其中該對照表現量係從未罹患免疫疾病、炎症性疾病及疼痛性疾病之任一者之對照受檢體所採取的樣本中之RBMS2基因表現產物的表現量；(c1)以受檢表現量比對照表現量高作為受檢體罹患 免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病的判斷指標。
受檢體為本發明之疾病檢測方法的對象，其之生物種類無特別限定。例如，可列舉人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔等各種哺乳類。
樣本只要為含RBMS2基因表現產物之樣本即可，無特別限制，可依照檢測對象疾病之種類等而適宜選擇。就樣本而言，可列舉如血液樣本、尿樣本、其他各種組織片等。就樣本而言，雖可使用從活體採取之原樣者，然而以將檢測對象之RBMS2基因表現產物依照常法精製、濃縮者為較佳。又，在檢測對象之RBMS2基因表現產物為核酸的情況，亦可調製從RBMS2 mRNA反映該mRNA之序列資料的核酸(例如cDNA等)，使用其作為樣本。
RBMS2基因表現產物之受檢表現量及對照表現量的測定，可依照周知之方法或以其為基準而進行。較佳而言，可使用上述本發明之診斷藥而進行。若在RBMS2基因表現產物為核酸(RBMS2 mRNA或來自其之核酸(cDNA等))之情況，例如，可使用本發明之診斷藥作為探針或引子，藉由北方墨點法、RT-PCR法、DNA晶片解析法、原位雜交解析法等而測定。若在RBMS2基因表現產物為蛋白質之情況，例如，可使用本發明之診斷藥作為抗體，藉由西方墨點法、ELISA法等而測定。
在利用北方墨點法之情況，藉由使用本發明之診斷藥作為探針，可測定樣本中之RBMS2 mRNA或來自其之核酸的有無或其量。具體而言，可例示將本發明之 診斷藥(互補鏈)藉由放射性同位元素(32P、33P等：RI)或螢光物質等標識，將其依照常法與轉移至尼龍膜等之來自受檢者之樣本的mRNA雜交後，將所形成之診斷藥與來自受檢者之樣本之mRNA的雙股，藉由放射線檢測器BAS-1800II(富士Film公司製)或螢光檢測器等檢測、測定來自診斷藥之標識物(RI或螢光物質等標識物質)之信號的方法。又，亦可使用AlkPhos直接標識及檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech公司製)，依照其規程將診斷藥標識，使其與來自受檢者之樣本的mRNA雜交後，藉由多生物成像儀STORM860(Amersham Pharmacia Biotech公司製)檢測、測定來自診斷藥之標識物之信號的方法。
在利用RT-PCR法之情況，藉由使用本發明之診斷藥作為引子，可測定樣本中之RBMS2 mRNA或來自其之核酸的有無或其量。具體而言，可例示從來自受檢者之活體組織的RNA，依照常法調製cDNA，以其作為模板，並以使標的區域可擴增之方式，與從本發明之診斷藥調製之一對引子(可與上述cDNA(-鏈)結合之正鏈，與+鏈結合之逆鏈)雜交，繼而依照常法進行PCR法，檢測所得到之擴增雙股DNA的方法。再者，經擴增之雙股DNA的檢測，可使用下述方法：使用預先以RI或螢光物質標識之引子進行上述PCR，並檢測由此所產生之標識雙股DNA的方法；將所產生之雙股DNA依照常法轉移至尼龍膜等，使用經標識之診斷藥作為探針與其雜交並檢測之方法等。再者，所生成之標識雙股DNA產物，可藉由Agilent 2100 Bioanalyzer (橫河Analytical Systems公司製)等測定。又，藉由SYBR Green RT-PCR Reagents(Applied Biosystems公司製)，依照該規程調製RT-PCR反應液，在ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems公司製)中使之反應，亦可檢測該反應物。
在利用DNA晶片解析之情況，可列舉：製備貼附有本發明之診斷藥以作為DNA探針(單股或雙股)的DNA晶片，使其與依照常法從來自受檢者之活體組織之RNA所調製的cRNA雜交，使所形成之DNA與cRNA的雙股與從本發明之診斷藥所調製之標識探針結合並檢測的方法。
西方墨點法，可例示使用本發明之診斷藥作為一次抗體後，使用以125I等放射性同位元素、螢光物質、辣根過氧化物酶(HRP)等酵素等標識的標識抗體(可與一次抗體結合之抗體)作為二次抗體，藉由放射線測定器BAS-1800II(富士Film公司製等)、螢光檢測器等檢測來自所得到之標識化合物之放射性同位元素、螢光物質等標識物質的信號而測定的方法。又，亦可使用本發明之診斷藥作為一次抗體後，使用ECL Plus Western Blotting Detection System(Amersham Pharmacia Biotech公司製)，依照該規程檢測，並藉由多生物成像儀STORM860(Amersham Pharmacia Biotech公司製)測定。
為受檢表現量之對比對象的對照表現量，可為1個受檢體之對照表現量，然而以複數個受檢體之對 照表現量的平均值或中央值等為較佳。
受檢體是否罹患免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之判斷，可用受檢表現量比對照表現量高作為基準而判斷。具體而言，可用例如受檢表現量比對照表現量上升50%以上，較佳為上升100%以上，更佳為上升200%以上，作為指標而進行。
3.疾病之進行度的判定方法
本發明係關於以RBMS2表現量作為指標之免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之進行度的判定方法(在本說明書中，亦以「本發明之進行度判定方法」表示)。以下，針對此點加以說明。
就本發明之進行度判定方法的具體態樣而言，可列舉例如以下之態樣：一種免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之進行度的判定方法，其具有(a2)測定從罹患免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病的受檢體所採取之樣本中RBMS2基因表現產物之受檢表現量的步驟，及(b2)將在上述步驟(a2)中所測定之受檢表現量與對照表現量對比的步驟，該對照表現量為從罹患免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之對照受檢體所採取的樣本中之RBMS2基因表現產物的表現量；(c3)以受檢表現量比對照表現量高，作為受檢體在免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之進行度比對照受檢體 高的判斷指標。
關於受檢體、樣本、受檢表現量及對照表現量之測定、為受檢表現量之對比對象的對照表現量等，如上述「2.疾病之檢測方法」中所記載。
疾病之進行度，可定義為例如與IL-6、COX-2、IL-1 β、IL-8、TNF-α、MMP1、IL-24、c-Myc等炎症促進因子之表現相關連之症狀的嚴重度。
受檢體與對照受檢體相比，是否免疫疾病、炎症性疾病或疼痛性疾病之進行度高的判斷，係以受檢表現量比對照表現量高作為基準來判斷。具體而言，例如可用受檢表現量比對照表現量上升50%以上，較佳為上升100%以上，更佳為上升200%以上，作為指標而進行。
[實施例]
以下，根據實施例，詳細說明本發明，然而本發明不受此等實施例之限定。
實施例1：作為IL-6轉錄後調節因子之RBMS2的鑑定
實施例1A
為了尋找IL-6轉錄後調節因子，進行篩選。將概要示於第1A圖。具體而言，如以下方式進行。首先，製作報導載體，其係在SV40啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、IL-6之3’UTR(序列編號1)而成。於384孔培養盤上，使用轉染試藥(Fugene HD，Promega公司製)，將該報導載體、及各種基因之表現載體導入HEK293T細胞。從 導入經過48小時後，測定各孔之螢光素酶活性。將所得到之測定值，與對照組(導入有作為表現載體之空白載體的樣本)之測定值比較，篩選出對於對照組有變化的表現載體(1次篩選)。從所選擇之表現載體，萃取與RNA相關之約100個基因的表現載體，以與上述同樣之方式進行篩選(2次篩選)。
2次篩選之結果，鑑定RBMS2(NP_002889.1，序列編號2)，作為IL-6轉錄後調節因子。
實施例1B
將實施例1A所製作之報導載體、或從該報導載體排除人類IL-6之3’UTR所形成的對照報導載體，與RBMS2表現載體或空白載體一起導入HEK293T細胞。從導入經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第1B圖。
如第1B圖所示，RBMS2以依存於IL-6之3’UTR方式使螢光素酶活性上升。
實施例1C
將針對RBMS2之siRNA(人類RBMS2-1(Thermo Fisher Scientific(Ambion),Silencer Select,siRNA ID No.s11867，序列編號8)、或人類RBMS2-2(Thermo Fisher Scientific(Ambion),Silencer Select,siRNA ID No.s11868，序列編號9))、或對照siRNA(陰性對照(Thermo Fisher Scientific(Ambion)，Silencer Select Negative Control No.1 siRNA，製品編號：4390843))導入MDA-MB-231細胞。從導入48小時後，將IL-1 β添加於培養基(終濃度：20ng/ml)中，從該添 加起3小時後，回收細胞。再者，MDA-MB-231細胞恆常地產生IL-6，藉由IL-1 β刺激，將表現更多之IL-6。從細胞調製cDNA，藉由定量PCR測定RBMS2 mRNA(PCR引子：正向序列編號12、反向序列編號13)及IL-6 mRNA(PCR引子：正向序列編號14、反向序列編號15)的表現量。將結果示於第1C圖。
如第1C圖所示，在MDA-MB-231細胞中，藉由抑制RBMS2表現，IL-6 mRNA之表現量顯著地降低。
實施例1D
除了從導入36小時後，添加IL-1 β，且從該添加起16小時後，回收培養上清液，並將該上清液中之IL-6蛋白質表現量藉由ELISA測定之外，以與實施例1C同樣之方式進行。將結果示於第1D圖。
如第1D圖所示，在MDA-MB-231細胞中，藉由抑制RBMS2表現，IL-6蛋白質之表現量顯著地降低。
實施例1E
使表現RBMS2之逆轉錄病毒或對照逆轉錄病毒感染MDA-MB-231細胞後，於嘌呤黴素存在下進行1週培養，得到RBMS2之強制表現細胞。將此細胞以IL-1 β刺激3小時後，回收細胞，從細胞調製cDNA。藉由定量PCR測定細胞中之IL-6 mRNA的表現量。將結果示於第1E圖。
如第1E圖所示，藉由RBMS2之強制表現，IL-6 mRNA之表現量上升。
實施例1F
製作在IL-6基因之啟動子(序列編號36)下游配置有螢光素酶基因之ORF的報導載體。將該報導載體與RBMS2表現載體或空白載體一起導入MDA-MB-231細胞。從導入起經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第1F圖。
如第1F圖所示，RBMS2之表現未影響由IL-6啟動子所誘導之螢光素酶活性。
實施例1之結果
由以上，強力暗示RBMS2並未影響IL-6 mRNA之轉錄調節，而是經由轉錄後調節正向調控IL-6之表現。
實施例2：經由RBMS2所致之ARE的IL-6 mRNA安定化
實施例2A
將RBMS2表現載體或空白載體導入THP-1細胞。從導入起48小時後，藉由將LPS添加於培養基(終濃度：1ug/ml)而誘導IL-6 mRNA之表現，從該添加起5小時後，藉由將放線菌素D添加於培養基(終濃度：5ug/ml)而停止mRNA合成。從表現載體導入48小時後，從LPS添加5小時後、及從放線菌素D添加3小時後，回收細胞，藉由定量PCR測定IL-6 mRNA量。將結果示於第2A圖。
如第2A圖所示，在導入空白載體之情況，藉由LPS誘導IL-6 mRNA之表現，然而若藉由放線菌素D處理阻礙轉錄，則IL-6 mRNA急速地分解，其量減少。與此相對地，在使RBMS2強制表現之情況，於放線菌素D處理後確認 更多IL-6 mRNA殘存。由此暗示藉由RBMS2，IL-6 mRNA的半衰期延長。
實施例2B
製作在四環素應答因子(TRE)及啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、IL-6之3’UTR而成的四環素應答表現載體。將此四環素應答表現載體，與RBMS2表現載體或空白載體一起導入預先組入Tet-off調節質體的HEK293T細胞。從導入起24小時後，將強力黴素添加於培養基中(終濃度：10ug/ml)。從載體導入起24小時後，及從強力黴素添加2小時後，回收細胞，藉由定量PCR測定螢光素酶mRNA(PCR引子：正向序列編號16、反向序列編號17)之量。將結果示於第2B圖。
如第2B圖所示，在導入空白載體之情況，藉由強力黴素添加(mRNA合成停止)，含IL-6 3’UTR之螢光素酶mRNA量降低。與此相對地，在使RBMS2強制表現之情況，確認強力黴素添加後含IL-6 3’UTR之螢光素酶mRNA殘存較多。由此，暗示藉由RBMS2，含IL-6 3’UTR之螢光素酶mRNA的半衰期延長。
實施例2C
製作在啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、IL-6之變異型3’UTR(97-267(鹼基序列：序列編號37)、122-193(鹼基序列：序列編號38)、△ARE1(鹼基序列：序列編號39)、△ARE2(鹼基序列：序列編號40)、或ARE mutant(鹼基序列：序列編號41))而成的變異型3’UTR報導載體。 將此變異型3’UTR報導載體與RBMS2表現載體或空白載體一起導入HEK293T細胞。從導入經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第2C圖。
在IL-6 mRNA之3’UTR中，存在有關mRNA之安定化的莖環構造，及富含AU的富含AU單元(ARE)。莖環構造係由為RNase之Regnase-1(ZC3H12A)識別及其後續分解的重要單元。又，據報導ARID5a藉由拮抗Regnase-1之功能，有助於IL-6 mRNA之安定化。不過，如第2C圖所示，RBMS2使3’UTR中缺損此莖環構造之報導基因(reporter)(97-267及122-193)的活性上升。
在IL-6 mRNA中，2個相鄰的ARE以2處接近之方式存在。已知TTP等ARE結合性蛋白質經由此區域參與mRNA的分解。如第2C圖所示，若缺損一個ARE區域，則未見RBMS2所致之報導基因活性的上升(△ARE1及△ARE2)。又，使ARE之序列變異(將U置換為G)，亦未見RBMS2所致之報導基因活性的上升(ARE mutant)。由此，暗示RBMS2係經由ARE區域參與mRNA之安定化。
實施例2之結果
由以上，強力暗示RBMS2係因經由ARE區域之mRNA安定化機構，於轉錄後層級調控IL-6之表現。
實施例3：經由ARE之RBMS2與IL-6 mRNA的結合
實施例3A
將實施例1A所製作之報導載體(在螢光素酶ORF之下 游有IL-6之野生型3’UTR)、或實施例2C所製作之ARE變異型3’UTR報導載體(ARE mutant)，與以FLAG標識之RBMS2的表現載體一起導入HEK293T細胞。從導入48小時後，回收細胞，調製細胞溶解液。將該細胞溶解液藉由抗FLAG抗體或非特異性IgG免疫沉降，藉由定量PCR測定免疫沉降物所含的螢光素酶mRNA量。將結果示於第3A圖中。
如第3A圖所示，藉由抗FLAG抗體之免疫沉降，可見到含IL-6之野生型3’UTR之螢光素酶mRNA的強力濃縮。與此相對地，含ARE變異型3’UTR之螢光素酶mRNA的未濃縮。從以上，暗示RBMS2經由ARE結合。
實施例3B
將實施例1A所製作之報告載體(在螢光素酶ORF之下游有IL-6之野生型3’UTR)，與FLAG標識之野生型RBMS2或RRM1結構域缺損型RBMS2(胺基酸序列：序列編號46)的表現載體一起導入HEK293T細胞。從導入48小時後，回收細胞，調製細胞溶解液。將該細胞溶解液藉由抗FLAG抗體或非特異性IgG免疫沉降，藉由定量PCR測定免疫沉降物所含之螢光素酶mRNA量。將結果示於第3B圖。
如第3B圖所示，暗示即使使RBMS2之RRM1結構域缺損變異體過剩表現，仍未見RNA之濃縮，因此RRM1結構域在與ARE之結合為重要。
實施例3C
將實施例1A所製作之報導載體(在螢光素酶ORF之下 游有IL-6之野生型3’UTR)，與FLAG標識之野生型RBMS2或RRM結構域缺損型RBMS2(RBMS2 △RRM1(胺基酸序列：序列編號46)、RBMS2 △RRM2(胺基酸序列：序列編號47)、或RBMS2 △RRM1/2(胺基酸序列：序列編號48))的表現載體、或空白載體，一起導入HEK293T細胞。從導入起經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第3C圖。
如第3C圖所示，在缺損RRM1結構域之RBMS2變異體中，未見到IL-6 3’UTR依存性之螢光素酶活性的上升。
實施例3之結果
由以上，暗示RBMS2藉由對存在於IL-6 mRNA之3’UTR的ARE，經由RRM1結構域而結合，使IL-6之表現亢進。
實施例4：藉由RBMS2之含ARE之基因的表現調控
實施例4A
將針對RBMS2之siRNA(Human RBMS2-1(Thermo Fisher Scientific(Ambion),Silencer Select,siRNA ID No.s11867，序列編號8))、或人類RBMS2-2(Thermo Fisher Scientific(Ambion)，Silencer Select,siRNA ID No.s11868，序列編號9)、或對照siRNA(Negative control(Thermo Fisher Scientific(Ambion)，Silencer Select Negative Control No.1 siRNA，製品編號：4390843))，導入MDA-MB-231細胞。從導入起48小時後，將IL-1 β添加於培養基(終濃度：20 ng/ml)，從該添加起3小時後，回收細胞。從細胞調製cDNA，藉由定量PCR測定RBMS2 mRNA(PCR引子：正向序列編號12、反向序列編號13)、IL-6 mRNA(PCR引子：正向序列編號14、反向序列編號15)、PTGS2(COX-2)mRNA(PCR引子：正向序列編號20、反向序列編號21)、IL-8 mRNA(PCR引子：正向序列編號22、反向序列編號23)、IL-1 β mRNA(PCR引子：正向序列編號18、反向序列編號19)、NFKBIA mRNA(PCR引子：正向序列編號24、反向序列編號25)、ZC3H12A mRNA(PCR引子：正向序列編號26、反向序列編號27)的表現量。將結果示於第4A圖。
如第4A圖所示，在MDA-MB-231細胞中，藉由RBMS2表現抑制，抑制於3’UTR具有ARE區域之IL-1 β、IL-8、及COX-2的表現。另一方面，在3’UTR不具有ARE區域之NFKBIA或ZC3H12A的表現未見到差異。
實施例4B
將針對RBMS2之siRNA(小鼠RBMS2-1(Thermo Fisher Scientific(Ambion),Silencer Select,siRNA ID No.s80716，序列編號10)、或小鼠RBMS2-2(Thermo Fisher Scientific(Ambion),Silencer Select,siRNA ID No.s80717，序列編號11))、或對照siRNA(陰性對照(Thermo Fisher Scientific(Ambion)，Silencer Select Negative Control No.1 siRNA，製品編號：4390843))導入MEF細胞。從導入起48小時後，將LPS、Pam3CSK4或IL-1 β添加於培養基中(LPS終濃度：1ug/ml；Pam3CSK4終濃度：1ug/ml；或IL-1 β終濃度：20 ng/ml)，從該添加起3小時後，回收細胞。從細胞調製cDNA，藉由定量PCR測定RBMS2 mRNA(PCR引子：正向序列編號28、反向序列編號29)、IL-6 mRNA(PCR引子：正向序列編號30、反向序列編號31)、IL-1 β mRNA(PCR引子：正向序列編號32、反向序列編號33)、TNF-α mRNA(PCR引子：正向序列編號34、反向序列編號35)的表現量。將結果示於第4B圖。
如第4B圖所示，在小鼠胎兒性纖維母細胞(MEF)中，LPS、Pam3CSK4、或IL-1 β之刺激所致之TNF-α、IL-1 β、及IL-6的表現上升，藉由抑制RBMS2表現而受到抑制。
實施例4C
製作在啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、3’UTR(IL-8之野生型3’UTR(鹼基序列：序列編號42)、IL-8之ARE變異型3’UTR(鹼基序列：序列編號43)、IL-1 β之野生型3’UTR(鹼基序列：序列編號44)、或IL-1 β之ARE變異型3’UTR(鹼基序列：序列編號45))而成的報導載體。將製作之報導載體、實施例1A所製作之報導載體(在螢光素酶ORF之下游具有IL-6之野生型3’UTR)、或實施例2C所製作之IL-6的ARE變異型3’UTR報導載體(ARE mutant)，與RBMS2表現載體或空白載體一起導入HEK293T細胞。從導入起經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第4C圖。
如第4C圖所示，若在IL-6、IL-8、IL-1 β等之3’UTR中所含的ARE中未施加變異，則不會見到RBMS2所致之 螢光素酶活性上升。
實施例4之結果
以上可以明白RBMS2不僅可調控IL-6 mRNA，亦可調控具有ARE之mRNA。又，藉由抑制RBMS2，顯然可使IL-6 mRNA等炎症促進因子的表現量降低。
實施例5：RBMS2缺損型小鼠中之炎症性細胞激素的表現降低
實施例5A
藉由使用TALEN之基因組編集，製作RBMS2缺損型小鼠。其結果，成功地得到缺損包含第2外顯子之110鹼基的變異小鼠。將製作方案示於第5A圖。
實施例5B
將從RBMS2純合缺損型小鼠、RBMS2雜合缺損型小鼠、或野生型小鼠之骨髓所得到的細胞，於M-CSF存在下培養7日，得到來自骨髓之巨噬細胞(BMDM)。在BMDM之培養基中，添加LPS(終濃度：100ng/ml)、Pam3CSK4(終濃度：300ng/ml)、或poly I：C(終濃度：10ug/ml)。在添加前、或從添加起經過1小時、3小時、5小時、或9小時後，回收細胞，藉由定量PCR測定IL-6的表現量。將結果示於第5B圖。
如第5B圖所示，藉由Pam3CSK4刺激所誘導之IL-6的表現，在RBMS2缺損型小鼠中顯著地減少。
實施例5C
除了在BMDM培養基中添加Pam3CSK4，且測定 IL-1 β、COX-2及TNF-α之表現量以外，以與實施例5B同樣之方式進行。
如第5C圖所示，關於IL-6以外之基因，亦可得到與實施例5B同樣之結果。
實施例6：RBMS2缺損型小鼠之敗血症抵抗性
在RBMS2純合缺損型小鼠(n=7)或野生型小鼠(n=5)之腹腔內，投與LPS(15mg/kg)。投與後，於5小時後採取血清，進一步計測各小鼠之生存時間。又，藉由定量PCR測定血清中之IL-6濃度。將生存時間之計測結果示於第6A圖，將IL-6濃度之測定結果示於第6B圖。
如第6A圖及第6B圖所示，野生型小鼠從腹腔內投與LPS後81小時以內，有60%小鼠死亡，然而RBMS2基因剔除小鼠，為炎症促進因子之IL-6的表現量受到抑制，80%以上存活。從以上之結果可以明白RBMS2在活體中參與炎症應答之惡化。
實施例7：風濕性關節炎患者之RBMS2表現量與IL-6表現量的相關性
藉由來自風濕性關節炎患者(n=12)之末梢血單核球將RNA逆轉錄後，藉由定量PCR測定RBMS2及IL-6的表現量。將結果示於第7圖。
如第7圖所示，在來自風濕性關節炎患者之末梢血單核球中，顯示RBMS2之表現與IL-6的表現量為正相關。
若考慮在非風濕性關節炎患者之情況IL-6的表現量， 比風濕性關節炎患者低之點，以及風濕性關節炎患者中，IL-6之表現量與疾病的進行度相關之點，上述結果暗示藉由以RBMS2之表現量作為指標，可進行風濕性關節炎(其之有無，及進行度)的診斷。
實施例8：調控RBMS2之表現之因子的探索
在為人類T細胞株之Jurkat細胞的培養基中，添加IL-10蛋白質或TGF β蛋白質(終濃度：IL-10蛋白質→20ng/mL、TGF β蛋白質→10ng/mL)。從添加前、添加經過8小時後及24小時後之細胞調製cDNA，藉由定量PCR，測定RBMS2 mRNA及HPRT(對照)mRNA之表現量。將結果示於第8圖。
如第8圖所示，藉由IL-10蛋白質之添加，RBMS2 mRNA之表現量降低。由此，可看出IL-10蛋白質具有抑制RBMS2表現的作用。
實施例9：含ARE之基因之表現調控活性的比較
從實施例4C之結果可以明白RBMS2之活性，不僅依存於IL-6 3’UTR中存在之莖環構造，亦依存於富含AU單元(ARE)。另一方面，據報導HuR能經由ARE正向調控炎症性細胞激素之表現，研判其與RBMS2之角色類似。因此，藉由螢光素酶檢定比較RBMS2與HuR的活性。
具體而言，首先，製作在啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、IL-6之3’UTR或PTGS2(COX-2)之3’UTR 而成的報導載體。將該報導載體，與RBMS2表現載體、HuR表現載體、或空白載體一起導入HEK293T細胞。從導入起經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第9圖。
其結果，在使用IL-6 3’UTR之情況，藉由RBMS2，螢光素酶活性亢進，相對於此，在HuR方面未見到此種亢進。又，若欲HuR作用，根據報導使用PTGS2(COX-2)之3’UTR的情況，可見到HuR所導致之螢光素酶活性亢進，不過RBMS2顯然比HuR更強力地使螢光素酶活性亢進。由此，強烈暗示RBMS2與HuR以不同的mRNA作為標的，對於共通的標的mRNA，RBMS2具有比HuR更強的活性。
實施例10：經由RRM1結構域的RBMS2與ARE之結合
實施例10A
迄今，據報導RRM結構域中之β摺疊(beta sheet)為RNA結合活性中所必需，因此芳香族胺基酸在β摺疊之形成中成為必要。因此，使用蛋白質二次構造之預測程式推測RRM1結構域中之β摺疊，並製作該β摺疊內之胺基酸之變異體的表現載體。將此等表現載體、或空白載體，與實施例1A所製作之報導載體(在螢光素酶ORF之下游有1L-6之野生型3’UTR)，一起導入MDA-MB-231細胞。從導入起經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第10A圖。
從其結果可以明白RRM1結構域中之2個苯丙胺酸殘 基(F101及F104)，為RBMS2所致之報導基因活性促進所必要。
實施例10B
將表現F101/F104A變異體之慢病毒導入MDA-MB-231細胞，5日後，從細胞調製cDNA，藉由定量PCR測定IL-6 mRNA及IL-8 mRNA的表現量。將結果示於第10B圖。
如第10B圖所示，即使F101/F104A變異體過剩表現，亦無法使內在性IL-6及IL-8的表現程度提高。
實施例10C
將實施例1A所製作之報導載體(在螢光素酶ORF之下游有IL-6之野生型3’UTR)，與以FLAG標識之F101/F104A變異體的表現載體，一起導入HEK293T細胞。從導入起48小時後，回收細胞，調製細胞溶解液。將該細胞溶解液藉由抗FLAG抗體或非特異性IgG進行免疫沉降，藉由定量PCR測定免疫沉降物所含的螢光素酶mRNA量。將結果示於第10C圖。
如第10C圖所示，藉由F101A及F104A之雙重變異，與IL-6之3’UTR的結合顯著地減弱。
實施例11
將2,4-二硝基氟苯溶液(溶劑為丙酮與橄欖油之混合溶液(丙酮4：橄欖油1))塗布於RBMS2純合缺損型小鼠(n=15)之腹部。1週後，將2,4-二硝基氟苯溶液(溶劑為丙酮與橄欖油之混合溶液(丙酮4：橄欖油1))或只將該混合溶劑塗布於小鼠之耳部。6小時後測定耳廓之厚度，以所 得到之測定值，減去試驗前耳廓之厚度值的值，作為表示耳廓之腫脹的指標。將結果示於第11圖。
如第11圖所示，RBMS2純合缺損者，耳廓腫脹的程度低。由此，暗示RBMS2與接觸性皮膚炎等過敏性疾病有關連。
實施例12
以陰性對照或針對RBMS2之siRNA轉染MDA-MB-231細胞(分別n=3)。48小時後製備RNA，依照規程(Illumina公司)調製RNA定序用之數據庫，藉由Next-seq進行RNA定序。將藉由RBMS2基因剔除而表現量增加2倍以上或降低2分之1以下的基因示於第12圖。
如第12圖所示，可知IL-6、IL-8、MMP1、c-myc、IL-24 mRNA等在3’UTR具有ARE之mRNA的表現量，藉由RBMS2基因剔除而降低。
又，如上述實施例1至12所示，RBMS2不僅調控IL-6，亦調控其他炎症促進因子(IL-1 β、IL-8、COX-2、TNF-α、MMP1、IL-24、c-Myc等在3’UTR具有ARE的基因)的表現，由此暗示對於此等炎症促進因子參與發病及進行的疾病(免疫疾病、炎症性疾病、疼痛性疾病等)，亦可藉由RBMS2之表現量作為指標，而從事疾病之有無及進行度的診斷。
<110> 國立大學法人東京醫科齒科大學(Tokyo Medical and Dental University) 日本臟器製藥股份有限公司(Nippon Zoki Pharmaceutical Co.,Ltd.)
<120> 炎症促進因子表現抑制劑、其有效成分之篩選方法、對於該方法為有用之 表現匣、診斷藥及診斷方法
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<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 446
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
Figure 106115449-A0305-02-0084-1
<210> 2
<211> 407
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 106115449-A0305-02-0084-2
Figure 106115449-A0202-12-0082-3
Figure 106115449-A0202-12-0083-4
<210> 3
<211> 8504
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
Figure 106115449-A0202-12-0083-5
Figure 106115449-A0202-12-0084-6
Figure 106115449-A0202-12-0085-7
Figure 106115449-A0202-12-0086-8
Figure 106115449-A0202-12-0087-9
Figure 106115449-A0202-12-0088-10
<210> 4
<211> 5207
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 4
Figure 106115449-A0202-12-0088-11
Figure 106115449-A0202-12-0089-12
Figure 106115449-A0202-12-0090-13
Figure 106115449-A0202-12-0091-14
<210> 5
<211> 383
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Figure 106115449-A0202-12-0091-15
Figure 106115449-A0202-12-0092-16
Figure 106115449-A0202-12-0093-17
<210> 6
<211> 355
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Figure 106115449-A0202-12-0093-18
Figure 106115449-A0202-12-0094-19
<210> 7
<211> 5390
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 7
Figure 106115449-A0202-12-0095-20
Figure 106115449-A0202-12-0096-21
Figure 106115449-A0202-12-0097-22
Figure 106115449-A0202-12-0098-23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RBMS2-1 siRNA
<400> 8
Figure 106115449-A0202-12-0098-24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RBMS2-2 siRNA
<400> 9
Figure 106115449-A0202-12-0098-25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠RBMS2-1 siRNA
<400> 10
Figure 106115449-A0202-12-0098-26
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠RBMS2-2 siRNA
<400> 11
Figure 106115449-A0202-12-0098-27
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RBMS2前置引子
<400> 12
Figure 106115449-A0202-12-0099-32
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人RBMS2反置引子
<400> 13
Figure 106115449-A0202-12-0099-31
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-6前置引子
<400> 14
Figure 106115449-A0202-12-0099-30
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-6反置引子
<400> 15
Figure 106115449-A0202-12-0099-29
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 螢光素前置引子
<400> 16
Figure 106115449-A0202-12-0099-28
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 螢光素反置引子
<400> 17
Figure 106115449-A0202-12-0100-33
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL1B前置引子
<400> 18
Figure 106115449-A0202-12-0100-34
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL1B反置引子
<400> 19
Figure 106115449-A0202-12-0100-35
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PTGS2前置引子
<400> 20
Figure 106115449-A0202-12-0100-36
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PTGS2反置引子
<400> 21
Figure 106115449-A0202-12-0100-37
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL8前置引子
<400> 22
Figure 106115449-A0202-12-0101-42
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL8反置引子
<400> 23
Figure 106115449-A0202-12-0101-41
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人NFKBIA前置引子
<400> 24
Figure 106115449-A0202-12-0101-40
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人NFKBIA反置引子
<400> 25
Figure 106115449-A0202-12-0101-39
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ZC3H12A前置引子
<400> 26
Figure 106115449-A0202-12-0101-38
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ZC3H12A反置引子
<400> 27
Figure 106115449-A0202-12-0102-43
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠RBMS2前置引子
<400> 28
Figure 106115449-A0202-12-0102-44
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠RBMS2反置引子
<400> 29
Figure 106115449-A0202-12-0102-45
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL6前置引子
<400> 30
Figure 106115449-A0202-12-0102-46
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL6反置引子
<400> 31
Figure 106115449-A0202-12-0102-48
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL1b前置引子
<400> 32
Figure 106115449-A0202-12-0103-49
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL1b反置引子
<400> 33
Figure 106115449-A0202-12-0103-50
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TNFa前置引子
<400> 34
Figure 106115449-A0202-12-0103-51
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TNFa反置引子
<400> 35
Figure 106115449-A0202-12-0103-52
<210> 36
<211> 1240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6啟動子
<400> 36
Figure 106115449-A0202-12-0103-53
Figure 106115449-A0202-12-0104-54
<210> 37
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 3’UTR 97-267
<400> 37
Figure 106115449-A0202-12-0104-55
<210> 38
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 3’UTR 122-193
<400> 38
Figure 106115449-A0202-12-0105-60
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 3’UTR delta ARE1
<400> 39
Figure 106115449-A0202-12-0105-59
<210> 40
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 3’UTR delta ARE2
<400> 40
Figure 106115449-A0202-12-0105-57
<210> 41
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 3’UTR ARE突變體
<400> 41
Figure 106115449-A0202-12-0105-56
<210> 42
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-8 3’UTR野生型
<400> 42
Figure 106115449-A0202-12-0106-61
<210> 43
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-8 3’UTR突變體
<400> 43
Figure 106115449-A0202-12-0106-64
<210> 44
<211> 584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL1B 3’UTR野生型
<400> 44
Figure 106115449-A0202-12-0106-63
Figure 106115449-A0202-12-0107-65
<210> 45
<211> 584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL1B 3’UTR突變體
<400> 45
Figure 106115449-A0202-12-0107-66
<210> 46
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3xFLAG-RBMS2 delta RRM1功能域
<400> 46
Figure 106115449-A0202-12-0107-67
Figure 106115449-A0202-12-0108-68
Figure 106115449-A0202-12-0109-69
<210> 47
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3xFLAG- RBMS2 delta RRM2功能域
<400> 47
Figure 106115449-A0202-12-0109-70
Figure 106115449-A0202-12-0110-71
<210> 48
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3xFLAG- RBMS2 delta RRM1/2功能域
<400> 48
Figure 106115449-A0202-12-0110-72
Figure 106115449-A0202-12-0111-73

Claims (12)

  1. 一種炎症促進因子表現抑制劑之有效成分的篩選用試藥，其含有選自表現匣、包含該表現匣的載體、以及包含該載體的細胞所構成之組群中之至少1種；其中，該表現匣包含RBMS2基因啟動子及被配置成可藉由該啟動子調控表現的報導基因；該報導基因係從5’側依照該啟動子及該報導基因之順序而被配置；該炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種。
  2. 一種炎症促進因子表現抑制劑之有效成分的篩選方法，其係以選自在受檢物質存在下之下述(i)至(iii)所構成之組群中之至少1種作為指標，(i)藉由RBMS2基因啟動子來調控表現之基因表現量；(ii)RBMS2與包含富含AU單元之RNA的結合量；以及(iii)在RBMS2過剩表現細胞中，於3’-UTR包含富含AU單元的mRNA量或來自該mRNA的蛋白質量；其中，該炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種；該富含AU單元為從選自IL-6 mRNA、COX-2 mRNA、IL-8 mRNA、IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、 MMP1 mRNA、IL-24 mRNA、及c-Myc mRNA所構成之組群中之至少1種mRNA而來的富含AU單元；前述表現的表現系為細胞。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之篩選方法，其包含：在受檢物質存在下之前述指標之值比受檢物質不存在下之前述指標之值低的情況，選擇該受檢物質作為炎症促進因子表現抑制劑的有效成分。
  4. 如申請專利範圍第2或3項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a1)至(c1)：(a1)使含有表現匣的表現系與受檢物質接觸的步驟，其中該表現匣包含RBMS2基因啟動子及被配置成可藉由該啟動子調控表現的基因；(b1)測定已接觸受檢物質之表現系中之該基因的表現量，作為受檢表現量，並將該受檢表現量與對照表現量比較的步驟，其中該對照表現量係未接觸受檢物質之表現系中之前述基因的表現量；以及(c1)在受檢表現量比對照表現量低的情況，選擇該受檢物質作為炎症促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟；其中，該被配置成可藉由該啟動子調控表現的基因係從5’側依照該啟動子及該基因之順序而被配置。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之篩選方法，其中前述基因為報導基因。
  6. 如申請專利範圍第2或3項所述之篩選方法，其包含 下述步驟(a2)至(c2)：(a2)於受檢物質存在下，使包含富含AU單元之RNA與RBMS2接觸的步驟；(b2)測定在受檢物質存在下經接觸之情況之前述RNA與前述RBMS2的結合量，作為受檢結合量，並將該受檢結合量與對照結合量比較的步驟，其中該對照結合量係在受檢物質不存在下經接觸之情況之前述RNA與前述RBMS2的結合量；以及(c2)在受檢結合量比對照結合量低的情況，選擇該受檢物質作為炎症促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
  7. 如申請專利範圍第2或3項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a3)至(c3)：(a3)使含有下述mRNA且RBMS2過剩表現的細胞與受檢物質接觸的步驟，其中該mRNA在3’-UTR包含富含AU單元；(b3)測定與受檢物質接觸後之細胞中之前述mRNA量或來自前述mRNA之蛋白質量作為受檢量，將未與受檢物質接觸之細胞中之前述mRNA量或來自前述mRNA之蛋白質量作為對照量，比較該受檢量與該對照量的步驟；以及(c3)在受檢量比對照量低的情況，選擇該受檢物質作為炎症促進因子表現抑制劑的有效成分的步驟。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之篩選方法，其中前述 mRNA包含報導蛋白質之ORF。
  9. 一種炎症促進因子表現抑制劑之用途，其係用於製造藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病的預防或治療劑；其中，該炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種；該炎症促進因子表現抑制劑含有RBMS2表現抑制劑，該RBMS2表現抑制劑含有選自RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、RBMS2特異性反義核酸、此等之表現載體、及IL-10所構成之組群中之至少1種；該藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病為選自自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、及過敏性疾病所構成之組群中之至少1種。
  10. 一種藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病的診斷藥，其含有RBMS2基因表現產物檢測劑；其中，該RBMS2基因表現產物檢測劑係針對RBMS2 mRNA或來自其之核酸的探針或引子、或識別RBMS2蛋白質的抗體；該炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中 之至少1種；該藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病為選自自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、及過敏性疾病所構成之組群中之至少1種。
  11. 一種藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病之檢測方法，其具有：(a1)測定在採取自受檢體之樣本中之RBMS2基因表現產物之受檢表現量的步驟；以及(b1)將在上述步驟(a1)中所測定之受檢表現量與對照表現量對比的步驟，其中該對照表現量係由未罹患藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病之對照受檢體所採取的樣本中之RBMS2基因表現產物的表現量；並且(c1)以受檢表現量比對照表現量高之情形作為受檢體罹患藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病的判斷指標；其中，該炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種；該藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病為選自自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性 脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、及過敏性疾病所構成之組群中之至少1種。
  12. 一種藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病之進行度的判定方法，其具有：(a2)測定在採取自罹患藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病之受檢體之樣本中之RBMS2基因表現產物之受檢表現量的步驟；以及(b2)將在上述步驟(a2)中所測定之受檢表現量與對照表現量對比的步驟，其中該對照表現量係由罹患藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病之對照受檢體所採取之樣本中之RBMS2基因表現產物的表現量；並且(c3)以受檢表現量比對照表現量高，作為受檢體在藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病之進行度上比對照受檢體高的判斷指標；該炎症促進因子為選自IL-6、COX-2、IL-8、IL-1β、TNF-α、MMP1、IL-24、及c-Myc所構成之組群中之至少1種；該藉由炎症促進因子而發病或惡化之疾病為選自自體免疫疾病、風濕性疾病、風濕性關節炎、變性關節疾病、關節炎、敗血症、淋巴增殖性疾病、中樞性脫髓疾病、脊椎關節症、炎症性疼痛、術後疼痛、及過敏性疾病所構成之組群中之至少1種。
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