TWI756896B - 蠶絲蛋白組合物及其製造方法 - Google Patents

Abstract

一種蠶絲蛋白組合物，其包含絲質蛋白，其中該組合物的透明度於波長約500至800 nm的吸光度為約0.001至0.599。

Description

蠶絲蛋白組合物及其製造方法

本揭露關於一種蠶絲蛋白組合物及其製造方法，特別是關於一種透明度高、厚度薄且能應用於傷口癒合的膜狀蠶絲蛋白組合物及其製造方法。

作為人體最大器官的皮膚可能會因外在因素，如擦傷、割傷、燒燙傷、雷射手術或外科手術而受到傷害。皮膚的傷口會依序經過炎症期、增生期、成熟期/重塑期的三個階段而漸漸癒合。皮膚受傷後會止血而進入炎症期。炎症期中人體的免疫系統為抵抗外來微生物入侵，傷口出現輕微紅、腫、熱、痛的發炎反應。在受傷後4至5天即進入增生期。增生期中傷口會長出新的微血管，並有膠原組織來填補傷口，而使得肉芽組織增生、傷口收口。傷口收口癒合後進入成熟期/重塑期。成熟期/重塑期中多餘的微血管退化與萎縮、膠原組織拉長並且排列整齊、疤痕變得平且淡。

研究人員發現，在傷口癒合的過程中，若傷口保持濕潤，則能加快癒合的速度，並降低疤痕產生機會。後來也有研究證實，當傷口保持濕潤，則表面細胞增生的速度較快。為此，領域中研發出密閉性與半密閉性的敷料，以提供傷口濕潤環境來促進傷口癒合。市面上常見的敷料有俗稱「人工皮」的親水膠體(hydrocolloids)敷料、藻酸鈣(alginates)敷料、薄膜(film)、膠原蛋白敷 料(collagen dressing)。上述敷料主要目的是維持傷口的濕潤以及吸收傷口所產生的分泌物。各種敷料所適用的傷口類型與更換頻率不盡相同、在臨床操作上也有優缺點。

目前市售的人工皮的組成包含主體膠與吸水性物質。主體膠提供敷料的黏性與拉伸強度，以方便黏貼於傷口上。該主體膠的成分包含橡膠、明膠等。吸水性物質則多採人工合成高分子聚合物，如羧甲基纖維素、聚氨酯等。但現有人工皮呈現暗黃色、透明度不佳，而無法直接透過人工皮觀察傷口癒合。再者，現有人工皮的厚度約0.3mm並不夠薄，而容易使敷料的邊角翹起或整片脫落。本領域針對傷口癒合，仍有開發更薄、更透明、吸水透氣敷料的需求。

一般的傷口若沒有感染會於1至2週癒合。但糖尿病患者的傷口有可能超過一個約都無法痊癒，而稱為慢性傷口。糖尿病患者傷口延遲癒合的原因來自於高血糖。糖尿病會導致傷口周邊的血管病變，而使血管硬化或是堵塞，造成傷口部位的血液循環不好。

有鑒於上述先前技術，本揭露的一目的為提供一種蠶絲蛋白組合物。該蠶絲蛋白組合物具有高透明度、吸水、透氣等特性，且做成薄膜狀能達到極薄的厚度。此外，該蠶絲蛋白組合物的薄膜能作為敷料的主體層，並與細胞修復因子結合。添加有細胞修復因子的敷料能針對傷口不易癒合的患者族群，如糖尿病患者，促進細胞修復使傷口加速癒合。

根據本揭露之一目的，本揭露之一實施例提供一種蠶絲蛋白組合物，其包含絲質蛋白(fibroin)，其中該組合物的透明度(transparency)於波長約500至800nm的吸光度(absorbance)為約0.001至0.599。

較佳地，其中該組合物為膜狀，且厚度為約5至300μm。

根據本揭露之另一目的，本揭露之一實施例提供一種組合物，其包含主體層及添加物，其中該主體層包含如前述的蠶絲蛋白組合物，該添加物包含桑科親水性化合物、唇形科親水性化合物、銀耳科親水性化合物、薑科親水性化合物、蘭科親水性化合物、細胞修復因子、保濕劑或其組合。

較佳地，其中該細胞修復因子包含胰島素、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、血管內皮增生因子(Vascular endothelial growth factor)、成細胞纖維生長因子(Fibroblast Growth Factor)、表皮生長因子(Epidermal growth factor)、血小板生長因子(Platelet-derived growth factor)、胜肽、沒食子酸鉍、龍腦、或上述任一添加物的亞型(isoform)、衍生物或其組合。

較佳地，其中該保濕劑包含多元醇、胺基酸、乳酸鈉、尿素、高分子多醣、膠原蛋白、纖維素、磷酸鹽類、或上述任一添加物的衍生物或其組合。

根據本揭露之又一目的，本揭露之一實施例提供一種製造蠶絲蛋白組合物的方法，其包含以下步驟：提供一蠶絲；將該蠶絲浸泡在溶液中進行脫膠並獲得絲質蛋白(fibroin)； 將絲質蛋白加入溶液中加熱進行溶解以獲得溶解液，並將該溶解液進行雜質分離以獲得上清液；將該上清液進行灌注並獲得灌注物；將該灌注物進行退火(annealing)獲得該蠶絲蛋白組合物。

較佳地，其中雜質分離步驟中以0.2μm~至5mm孔徑過濾、以2,000 xg至30,000 xg分離、進行透析分離雜質或上述任一方法之組合。

較佳地，其中退火步驟中係於真空或局部真空下進行，真空壓力介於100至1300mmHg。

較佳地，如上述製造蠶絲蛋白組合物的方法，其另包含以下步驟：提供一包含如前述的蠶絲蛋白組合物的主體層；於該主體層上共軛添加物；採用溫度液壓差共軛使主體層中的蠶絲蛋白組合物與添加物共軛。

較佳地，其中共軛步驟中的溫度為約0至70℃、液壓差滲透壓為約50至1200mOsm/kg H₂O。

本揭露的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例與隨文檢附的圖式後變得更加明顯。

圖1為說明本發明實施方式之組合物逐步過程的示意圖。

圖2為關於本發明，其顯示用一般大眾習知製程或本發明製程所得到的膜，其纖維失重率比較。

圖3為關於本發明組合物，顯示用一般大眾習知製程或本發明製程所得到的膜的透明度比較。

圖4為關於本發明，其顯示在用一般大眾習知製程或本發明製程所得到的膜上生長的成纖維母細胞的存活率。

圖5為關於本發明膜或親水凝膠(hydrocolloid)敷料的釋放模式，其為在37℃下負載類胰島素生長因子累積釋放曲線。

圖6關於以未添加對照組、類胰島素生長因子、親水凝膠敷料添加類胰島素生長因子、及本發明蠶絲蛋白組合物處理的糖尿病傷口癒合的時程分析，其為傷後第3天到第13天的傷口區域圖像(比例尺=5mm)。

圖7關於以未添加對照組及本發明蠶絲蛋白組合物處理的傷口時程分析，其為受傷後第3及第5天的傷口區域影像。

圖8上承圖6的處理組，經組織切片分析傷口邊緣缺口、傷口表皮間隙、傷口肉芽組織面積、傷口表皮再生率。

以下係參照相關圖式以詳細描述實施例。然而，該些實施例可用不同型態來實現，但這並非實施或運用本案所請發明之具體實施例的唯一形式，故不應理解成對上述實施例之限制。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。相反的，提供該些實施例係讓本說明書可徹底且完整揭露，以充分地向本揭露所屬技術領域中具有通常知識者完 全表達本揭露之精神。圖式中相似的元件符號係指相似的元件。在以下的敘述中，將不會詳細描述習知的功能或結構，以不贅述實施例中不必要的細節。

除非另有定義，本文所用之所有技術用詞與術語均與本創作所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的意義相同。在發生衝突的情況下，以包括定義在內之本說明書為準。

在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。

雖然用以界定本揭露較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本揭露所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實施例之外，或除非另有明確的說明，當可理解本文中所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

本揭露之一實施例為一種蠶絲蛋白組合物，其包含絲質蛋白(fibroin)。在一較佳的實施例中，蠶絲蛋白組合物主要由絲質蛋白(fibroin)所構成。在蠶絲蛋白組合物中絲質蛋白佔組合物整體的含量為10%以上，較佳為30%以上、更佳為50%以上。在一可行的實施例中，蠶絲蛋白組合物包含微量的不可避免之雜質。該雜質包含蠶絲的絲膠蛋白(sericin)、P25蛋白(fibrohexamerin；Fhx)及絹絲腺體細胞等。在蠶絲蛋白組合物中雜質佔組合物整體的含量為30%以下，較佳為20%以下、更佳為10%以下。在一可行的實施例中，蠶絲蛋白組合物除包含絲質蛋白(fibroin)以外，另包含膠原蛋白(collagen)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose；CMC)、幾丁質(chitin)、殼聚醣(chitosan)、海藻酸(Alginate)、明膠(gelatin)、水凝膠(hydrogel)、親水凝膠(hydrocolloid)、甘油(glycerol)、聚乳酸-烴基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)；PLGA)、聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)及上述相關衍生物，或其組合物。

本揭露的實施例中該蠶絲蛋白組合物由於包含的雜質少，因此可透光。在一較佳的實施例中，蠶絲蛋白組合物為透明、無色。在一可行的實施例中，蠶絲蛋白組合物的透明度(transparency)於波長約500至800nm、較佳為600至700nm下測量吸光度(absorbance)，且蠶絲蛋白組合物的吸光度為約0.001至0.999、較佳為約0.001至0.599、更佳為0.001至0.200。

本揭露的實施例中該蠶絲蛋白組合物的成形形狀可依據需求調整，在不損及材質特性的情況下並不特別限定。在一可行的實施例中，蠶絲蛋白組合物為膜狀、片狀、絲狀、塊狀，較佳為膜狀。在一較佳的實施例中，膜狀的蠶絲蛋白組合物的厚度為約5-300μm、更佳為20-90μm。

本揭露之一實施例為一種組合物，其包含主體層及添加物。在一可行的實施例中，主體層包含蠶絲蛋白組合物。在一可行的實施例中，主體層除包含蠶絲蛋白組合物以外，另包含膠原蛋白、羧甲基纖維素、幾丁質、殼聚醣、海藻酸、明膠、水凝膠、親水凝膠、甘油、聚乳酸-烴基乙酸共聚物、聚乙二醇及上述相關衍生物，或其組合物。在一較佳的實施例中，主體層所包含的蠶絲蛋白組合物具有如前述的形狀、性質、透明度等。在一可行的實施例中，主體層包含至少一層的蠶絲蛋白組合物，意即一層、兩層、三層並以此類推。

在一可行的實施例中，植物萃取物取自桑科(Moraceae)、漆樹科(Anacardiaceae)、金絲桃科(Guttiferae)、唇形花科(Labiatae)、天南星科(Araceae)、銀耳科(Tremellaceae)、薑科(Zingiberaceae)、蘭科(Orchidaceae)植物或其組合物。在一可行的實施例中，添加物包含細胞修復因子、保濕劑、顏料、抗菌劑、導電物質或其組合。在一可行的實施例中，細胞修復因子包含胰島素、類胰島素生長因子、血管內皮增生因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子、胜肽、沒食子酸鉍、龍腦或其組合。在一可行的實施例中，胞修復因子的添加量為約0.001至30%(w/w)、較佳為約0.025至20%(w/w)、更佳為約0.05至10%(w/w)。在一可行的實施例中，保濕劑包含多元醇、胺基酸、乳酸鈉、尿素、高分子多醣、膠原蛋白、纖維素、磷酸鹽類或其組合。

本揭露之一實施例為一種製造蠶絲蛋白組合物的方法，其包含以下步驟：準備蠶絲、脫膠、溶解、雜質分離、灌注、退火及共軛添加物。以下針對各步驟進行說明。

準備蠶絲：蠶絲取自蠶蛾科(Bombycidae)及天蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲所製造之蠶絲，在一可行的實施例中，包括家蠶(Bombyx mori)、野蠶 (Bombyx mandarina formosana)、荷氏家蠶(Bombyx horsfieldi)。將蠶絲經清水沖洗，以初步去除蠶絲表面所附著的雜質。

脫膠：將該蠶絲浸泡在溶液中進行脫膠並獲得絲質蛋白。在一可行的實施例中，脫膠步驟中的該溶液為水溶液、鹼金屬及鹼土金屬溶液及其組合物。蠶絲浸泡在溶液中以高溫進行脫膠。在一可行的實施例中，脫膠步驟中的高溫為約85至200℃、較佳為約100至150℃。在一可行的實施例中，蠶絲浸泡在溶液中高溫處理時間約10至240分鐘、較佳為5至180分鐘。以ddH₂O清洗蠶絲，絲膠蛋白會浮於水面上，故藉此脫除絲膠蛋白(sericin)。清洗後所得的絲質蛋白以熱風烘乾。在一可行的實施例中，熱風的溫度為40至70℃、較佳為50至70℃。在一可行的實施例中，烘乾時間約2至8小時、較佳為4至6小時。

溶解：將絲質蛋白加入溶液中並隔水加熱進行溶解以獲得溶解液。在一可行的實施例中，溶解步驟中的溶液為鹼金屬或鹼土金屬鹽類溶液、酒精、有機溶劑或其混合物。在一可行的實施例中，鹼金屬鹽類溶液為鹼金屬鹵素溶液、較佳為溴化鋰及硫氰酸鋰溶液。在一可行的實施例中，鹼土金屬鹽類溶液為鹼土金屬鹵素溶液、較佳為硝酸鈣-甲醇水溶液。

雜質分離：以0.2μm至5mm孔徑過濾絲質蛋白溶液，接著以2,000 xg至30,000 xg分離，並進行透析分離雜質，取得純度較高的上清液。在一可行的實施例中，雜質分離步驟的溫度為50℃以下。維持50℃以下溫度是為了避免絲質蛋白交聯固化。在一可行的實施例中，透析是以H₂O或磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline；PBS)進行透析置換。在一可行的實施例中，透析容積為包含絲質蛋白的上清液的100至1,000倍、較佳為500倍。先前技術會將所有溶液直接以透析，造成不僅只有絲質蛋白、就連雜質也會大量停留在 溶液中。藉此，獲得的絲質蛋白由於雜質多而透明度不佳。相對於此，本案則是採用過濾及離心以去除雜質。藉此，獲得更多的絲質蛋白，且該絲質蛋白具有高透明度並接近無色。

灌注：將該透析液加入至灌注材料上進行灌注並獲得灌注物。在在一可行的實施例中，加入有透析液的培養皿靜置於50℃以下環境、較佳為2至37℃的環境中，乾燥30至80小時、較佳為44至76小時。

退火：將灌注物進行退火(annealing)並獲得該蠶絲蛋白組合物。在一可行的實施例中，退火步驟中係於真空或局部真空下進行。在一可行的實施例中，退火是以真空箱進行。在一可行的實施例中，退火的真空壓力為100至1300mmHg、較佳為300至1000mmHg。藉此，使灌注物中的絲質蛋白進行蛋白交聯而形成膜狀的蠶絲蛋白組合物。

共軛添加物：採用溫度液壓差共軛使主體層中的蠶絲蛋白組合物與添加物結合。在一可行的實施例中，共軛步驟中的溫度為約-80至100℃、較佳為0至70℃。液壓差滲透壓為約50至1200mOsm/kg H₂O、較佳為200至500mOsm/kg H₂O。藉此，使體層中的蠶絲蛋白組合物與添加物透過共軛的方式結合。

[實施例]

實驗一：製備蠶絲蛋白組合物

實施例1：將蠶絲經清水沖洗過後，將蠶絲浸泡在水溶液中。再以85℃的高溫處理達10分鐘，以脫除蠶絲的絲膠蛋白。以ddH₂O清洗蠶絲以脫除的絲膠蛋白來獲得絲質蛋白，再以40℃熱風烘乾7小時。將乾燥之絲質蛋白溶解。將含有絲質蛋白的溶液進行雜質分離，以5mm孔徑過濾，接著以25,000 xg離心取分離液。接續以H₂O進行透析置換，其中透析容積為絲質蛋白溶液的100倍，透 析的阻斷分子量則為1至15KDa。取出上清液，稀釋成濃度4%(w/v)。將含有透析液的培養皿放入37℃環境下，靜置乾燥24小時。將乾燥後的培養皿放入真空箱退火，其中以真空壓力1300mmHg進行蛋白質交聯。藉此，形成蠶絲蛋白質組合物。將組合物與添加物於45℃、液壓差滲透壓為約50mOsm/kg H₂O環境下進行共軛，完成添加物的組合。

實施例2：將蠶絲經清水沖洗過後，將蠶絲浸泡在水溶液中。再以100℃的高溫處理達30分鐘，以脫除蠶絲的絲膠蛋白。以磷酸鹽緩衝液清洗蠶絲以脫除的絲膠蛋白來獲得絲質蛋白，再以40℃熱風烘乾2小時。將乾燥之絲質蛋白溶解。將含有絲質蛋白的溶液進行雜質分離，以0.2μm孔徑過濾，接著以2,500 xg離心取分離液。接著，以磷酸鹽緩衝液進行透析置換，其中透析容積為絲質蛋白溶液的800倍，透析的阻斷分子量則為0.1至30KDa。取出上清液，稀釋成濃度1%(w/v)。將含有透析液的培養皿放入26℃環境下，靜置乾燥48小時。將乾燥後的培養皿放入真空箱退火，其中以真空壓力300mmHg進行蛋白質交聯。藉此，形成蠶絲蛋白質組合物。將組合物與添加物於-80℃、液壓差滲透壓為約1200mOsm/kg H₂O環境下進行共軛，完成添加物的組合。

實施例3：將蠶絲經清水沖洗過後，將蠶絲浸泡在水溶液中。再以150℃的高溫處理達1分鐘，以脫除蠶絲的絲膠蛋白。以ddH₂O清洗蠶絲以脫除的絲膠蛋白來獲得絲質蛋白，再以50℃熱風烘乾5小時。將乾燥之絲質蛋白溶解。將含有絲質蛋白的溶液進行雜質分離以1μm孔徑過濾，接著以5,500 xg離心取分離液。接著，以磷酸鹽緩衝液進行透析置換，其中透析容積為絲質蛋白溶液的1000倍，透析的阻斷分子量則為1至200KDa。取出透析液，稀釋成濃度2%(w/v)。將含有透析液的培養皿放入10℃環境下，靜置乾燥60小時。將乾燥後的培養皿 放入加水之真空箱退火，其中以真空壓力1,000mmHg進行蛋白質交聯。藉此，形成蠶絲蛋白質組合物。將組合物與添加物於60℃、液壓差滲透壓為約200mOsm/kg H₂O環境下進行共軛，完成添加物的組合。

實施例4：將蠶絲經清水沖洗過後，將蠶絲浸泡在水溶液中。再以80℃的高溫處理達20分鐘，以脫除蠶絲的絲膠蛋白。以ddH₂O清洗蠶絲以脫除的絲膠蛋白來獲得絲質蛋白，再以60℃熱風烘乾8小時。將乾燥之絲質蛋白溶解。將含有絲質蛋白的溶液，進行雜質分離透析，以5mm孔徑過濾，接著以18,000 xg離心取分離液。將含有絲質蛋白的分離液進行透析。接著，以磷酸鹽緩衝液進行透析置換，其中透析容積為絲質蛋白溶液的500倍，透析的阻斷分子量則為1至300KDa。取出透析液，稀釋成濃度10%(w/v)。將含有透析液的培養皿放入0℃環境下，靜置乾燥60小時。將乾燥後的培養皿放入加水之真空箱退火，其中以真空壓力100mmHg進行蛋白質交聯。藉此，形成蠶絲蛋白質組合物。將組合物與添加物於0℃、液壓差滲透壓為約500mOsm/kg H₂O環境下進行共軛，完成添加物的組合。

實施例5：將蠶絲經清水沖洗過後，將蠶絲浸泡在水溶液中。再以150℃的高溫處理達20分鐘，以脫除蠶絲的絲膠蛋白。以ddH₂O清洗蠶絲以脫除的絲膠蛋白來獲得絲質蛋白，再以35℃熱風烘乾7小時。將絲質蛋白溶解。將含有絲質蛋白的溶液進行雜質分離，以0.8μm孔徑過濾，接著以25,000 xg離心取分離液。接著，以H₂O進行透析置換，其中透析容積為絲質蛋白溶液的600倍，透析的阻斷分子量則為1至300KDa。取出透析液，稀釋成濃度4%(w/v)。將含有透析液的培養皿放入2℃環境下，靜置乾燥72小時。將乾燥後的培養皿放入加水之真空箱退火，其中以真空壓力100mmHg進行蛋白質交聯。藉此，形成蠶絲蛋白 質組合物。將組合物與添加物於70℃、液壓差滲透壓為約800mOsm/kg H₂O環境下進行共軛，完成添加物的組合。

實驗二：測試新製程蠶絲組合物特性

將蠶絲以碳酸鈉(Na₂CO₃)處理60分鐘進行大眾習知蠶絲蛋白純化一般製程(簡稱AD製程)。另外，將蠶絲於水溶液中以85、100、150℃高溫處理，並進行上述實施例之新製程(簡稱HD1至HD3製程)。

參考圖2，其中顯示相較於AD製程處理後蠶絲纖維失重，HD1至HD3製程處理後蠶絲纖維失重較小，且有顯著差異。再者，HD1至HD3製程處理間蠶絲纖維失重沒有顯著差異。此結果說明透過改良脫膠步驟，將溶液以加熱並結合上述改良製程能減少蠶絲纖維的失重。

參考圖3，其中顯示相對於AD製程所得到的蠶絲蛋白組合物的膜的吸光度，HD1至HD3製程所得到的蠶絲蛋白組合物的膜吸光度較低，且有顯著差異。此結果說明透過改良製程，能提高蠶絲蛋白組合物的透明度。

參考圖4，其中顯示相對於AD製程所製備的膜上生長的成纖維母細胞的存活率，HD1至HD3製程所製備的膜上生長的成纖維母細胞的存活率較高，且有顯著差異。再者，隨著HD1至HD3製程差異，膜上生長的成纖維母細胞的存活率越高，且有顯著差異。此結果說明透過改良脫膠步驟，能提高蠶絲蛋白組合物上成纖維母細胞的存活率，且與處理溫度正相關。

實驗三：蠶絲蛋白組合物上類胰島素生長因子添加物的釋放模式

將實驗一製備之組合物，浸泡於10mL磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline；PBS)，分時以免疫分析方式偵測添加物累積含量，並以僅添加物及親水膠體(hydrocolloids)含添加物之組合作為對照組。

參考圖5，其中顯示在37℃下，親水膠體(Hydrocolloids)敷料的累積釋放曲線中，經過800小時後所累積的IGF-1釋放量約5%。單獨僅有IGF-1的釋放量與市售敷料約略相同。再來依序是高濃度的蠶絲蛋白組合物共軛的類胰島素生長因子釋放量約60%、低濃度、中濃度的蠶絲蛋白組合物上共軛的類胰島素生長因子的釋放量約90%。此結果說明相較於僅添加物或親水凝膠添加，採用蠶絲蛋白共軛類胰島素生長因子組合物可提升並累積類胰島素生長因子釋放量及活性。

承圖5，類胰島素生長因子經前述方法與絲質蛋白(fibroin)共軛，類胰島素生長因子的半衰期自15分鐘延長至30天，而能達到藥劑的緩效釋放，有利於長期治療。

實驗四：蠶絲蛋白組合物共軛類胰島素生長因子對糖尿病傷口癒合的時程

運用第二型糖尿病模式小鼠，經麻醉後，在背上製造直徑8mm傷口。將實驗一製備之組合物共軛類胰島素生長因子貼附在傷口上，並以未添加控制組、僅類胰島素生長因子及親水凝膠添加類胰島素生長因子作為對照，每隔3天測量傷口變化。

參考圖6，其中顯示相較於以未添加控制組、類胰島素生長因子、及親水膠體添加類胰島素生長因子處理的糖尿病傷口，在第8天的蠶絲蛋白組合物共軛類胰島素生長因子處理的糖尿病傷口面積變小。隨著時間至第10天與第13天，蠶絲蛋白組合物共軛類胰島素生長因子處理的糖尿病傷口面積與其他組別相較顯著變小。此結果說明，相較於其他對照組，採用蠶絲蛋白組合物共軛類胰島 素生長因子能促進傷口癒合，特別是針對不容易癒合的糖尿病傷口，而能加速傷口癒合的時程

實驗五：蠶絲蛋白組合物對糖尿病傷口癒合的效果

運用第二型糖尿病模式小鼠，經麻醉後，在背上製造直徑8mm傷口。將實驗一製備之蠶絲組合物貼附在傷口上，並以未添加控制組作為對照，於治療3至5天觀察傷口變化。

參考圖7，其顯示相較於控制組，糖尿病小鼠傷口使用蠶絲蛋白組合物於治療第3天可觀察到較多微血管，於傷口治療第5天可觀察到更多癒傷組織。此結果說明蠶絲蛋白組合物可促進傷口微血管增生，而能促進傷口癒傷組織修復。

實驗六：蠶絲蛋白組合物共軛類胰島素生長因子對傷口區域的再生組織的影響

運用實驗四之小鼠於13天後犧牲，取小鼠背部組織製備成組織切片及染色，並進行深層傷口組織修復統計分析。

參考圖8，其中顯示相較於未添加控制組、類胰島素生長因子及親水凝膠添加類胰島素生長因子處理的糖尿病傷口，在傷後第13天量測傷口癒合後的傷口邊緣距離(圖8a)、傷口表皮間隙(圖8b)、肉芽組織再生面積(圖8c)及表皮再生率(圖8d)的各種傷口癒合評估指標中，均以蠶絲蛋白組合物共軛類胰島素生長因子處理的效果最好，修復速度最快，且均有達統計上的顯著差異。

承圖7及8的結果說明，相較於無添加控制組、沒有蠶絲蛋白組合物的類胰島素生長因子或親水膠體添加類胰島素生長因子，採用蠶絲蛋白組合物及蠶絲蛋白組合此共軛類胰島素生長因子能促進不容易癒合的糖尿病傷口增生 微血管、增加癒傷組織、縮小邊緣的距離、縮小表皮間隙、促進肉芽組織增生、提升再上皮化的比例，而能使傷口更快癒合。

本揭露所提供的蠶絲蛋白組合物的透明度更高、厚度更薄。應用在臨床的皮膚傷口的創傷治療，可直接透過該膜狀的蠶絲蛋白組合物觀察傷口，且因薄膜具有靜電吸附不容易脫落。

本揭露所提供的包含蠶絲蛋白組合物及藥劑的組合物，在維持藥劑活性之下能促進細胞增殖、血管增生，使傷口更快、更佳地癒合。更甚者，針對個體需求還能添加不同的添加劑以促進傷口癒合，尤其是糖尿病患者也有優異效果。

以上所述僅為示例性，而非為限制性。任何未脫離本發明的精神與範疇，而對其進行的等效修改或變更，均應包含於申請專利範圍所界定的範圍中。

Claims (10)

1. 一種蠶絲蛋白組合物，其包含絲質蛋白(fibroin)，其中該組合物的透明度(transparency)於波長約500至800nm的吸光度(absorbance)為約0.001至0.599。
2. 如請求項1所述之組合物，其中該組合物為膜狀，且厚度為約5至300μm。
3. 一種包含主體層及添加物的組合物，其中該主體層包含如請求項1至2的蠶絲蛋白組合物，該添加物包含細胞修復因子、保濕劑或其組合。
4. 如請求項3所述之組合物，其中該細胞修復因子包含胰島素、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、血管內皮增生因子(Vascular endothelial growth factor)、成細胞纖維生長因子(Fibroblast Growth Factor)、表皮生長因子(Epidermal growth factor)、血小板生長因子(Platelet-derived growth factor)、或其組合。
5. 如請求項3所述之組合物，其中該保濕劑包含多元醇、胺基酸、乳酸鈉、尿素、高分子多醣、膠原蛋白、纖維素、磷酸鹽類、或上述任一添加物的組合。
6. 一種製造蠶絲蛋白組合物的方法，其包含以下步驟：提供一蠶絲；將該蠶絲浸泡在脫膠溶液中進行脫膠並獲得絲質蛋白(fibroin)；將絲質蛋白加入溶解溶液中加熱進行溶解以獲得溶解液；將該溶解液進行雜質分離以獲得上清液；將該上清液進行灌注並獲得灌注物； 將該灌注物進行退火(annealing)獲得該蠶絲蛋白組合物；其中雜質分離包含孔徑過濾、離心分離及透析分離雜質；其中退火係將該灌注物置於真空或局部真空下。
7. 如請求項7所述之方法，其中雜質分離步驟中以0.2μm至5mm孔徑過濾、以2,000 xg至30,000 xg離心分離、進行透析分離雜質或上述任一方法之組合。
8. 如請求項7所述之方法，其中退火步驟中係於真空或局部真空下進行，真空壓力介於100至1300mmHg。
9. 如請求項7所述方法，其另包含以下步驟：提供一包含該蠶絲蛋白組合物的主體層；於該主體層上共軛添加物；採用溫度液壓差共軛使主體層中的蠶絲蛋白組合物與添加物共軛。
10. 如請求項9所述方法，其中共軛步驟中的溫度為約0至70℃、液壓差滲透壓為約50至1200mOsm/kg H₂O。

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