TWI753918B - 作為ｊａｋ抑制劑的吡咯並嘧啶化合物的結晶 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於醫藥化學領域。具體而言，本發明涉及作為JAK抑制劑的吡咯並嘧啶化合物(式I)的結晶A和結晶B，還涉及結晶A和結晶B的製備方法、包含結晶A或結晶B的結晶組合物、包含結晶A或結晶B或其結晶組合物的藥物組合物以及它們的醫藥用途。本發明的結晶A和結晶B具有純度高、結晶度高、穩定性好等優點。

Description

作為JAK抑制劑的吡咯並嘧啶化合物的結晶
本發明屬於醫藥化學領域。具體而言，涉及作為JAK抑制劑的吡咯並嘧啶化合物(3R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-環戊基丙腈的結晶、晶體組合物、藥物組合物及其製備方法和用途。
兩面神激酶(Janus kinase，JAK)是一類非受體型酪氨酸激酶(PTK)，其存在於細胞內，通過JAK-STAT路徑傳導細胞因子刺激信號。JAK-STAT路徑將細胞外的化學信號經細胞膜傳導入位於細胞核內DNA上的基因啟動子上，最終影響細胞中DNA轉錄且活性水準發生改變。JAK-STAT路徑由三個主要部分組成：1)受體；2)兩面神激酶(JAK)和3)信號傳導和轉錄啟動蛋白(STAT)。所述受體可由干擾素、白細胞介素、生長因子或其它化學信使活化，活化導致JAK自身磷酸化；接下來STAT蛋白與磷酸化受體結合，使得STAT被JAK磷酸化；然後磷酸化STAT蛋白從受體上分離、二聚並易位到細胞核中，以結合到特異性DNA位點並改變轉錄(Scott,M.J.,C.J.Godshall et al.(2002).“Jaks,STATs,Cytokines,and Sepsis”Clin Diagn Lab Immunol 9(6)：1153-9)。
JAK家族在涉及免疫應答的細胞增殖和功能性細 胞因子依賴性調節中產生作用。目前，有四種已知的哺乳動物JAK家族成員：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2(Tyrosine kinase 2)。JAK蛋白的大小範圍在120-140kDa，其包含7個保守的JAK同源性(JH)結構域；其中之一為功能性催化激酶結構域，而另一個為假性激酶(pseudokinase)結構域，其有效地發揮調節功能和/或作為STAT的停靠位點起作用(Scott,Godshall et al.2002，supra)。
目前，已有多種兩面神激酶的抑制劑的報導，其中申請日為2014年12月16日、申請號為201410784461.2的中國專利申請中公開了多個JAK抑制劑(在此全文引入作為參考)，其中包含如下式I所示的(3R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-環戊基丙腈化合物：
Figure 106119959-A0202-12-0002-2
除了治療效力外，藥物研發者試圖提供具有作為藥物的性質的活性分子的適合形式。從獲得一種商業上可行的生產方法的角度或者從生產含有活性化合物的藥用組合物的角度出發，活性成分的化學穩定性、固態穩定性和儲存期限均是非常重要的因素。因此，提供具有所需性質的形式對藥物研發至關重要。
本發明實施例的一方面提供式I所示化合物的結晶A，
Figure 106119959-A0202-12-0003-3
 式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射(XRD)圖譜具有2 θ為9.35°±0.2°、11.93°±0.2°、16.32°±0.2°、21.23°±0.2°、23.13°±0.2°和25.58°±0.2°的衍射角。
本發明實施例的另一方面提供式I所示化合物的結晶A的製備方法，其方法包含以下步驟： 1)使式I所示化合物溶於結晶溶劑中，結晶溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙二醇單甲醚、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六環、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸異丙酯、二氯甲烷、氯仿、水或上述溶劑中任意兩種或兩種以上的混合溶劑；以及 2)析晶。
本發明實施例的另一方面提供了結晶組合物，其中式I所示化合物的結晶A占結晶組合物重量的50%以上，較好的是80%以上，更好的是90%以上，最好的是95%以上。
本發明實施例的另一方面提供了藥物組合物，藥物組合物中包含有效量的式I所示化合物的結晶A；或者包含式I所示化合物的結晶A的結晶組合物。
本發明實施例的另一方面提供了式I所示化合物的結晶A、或上述結晶組合物或上述藥物組合物在製備治療或預防兩面神激酶介導的疾病的藥物中的用途。
本發明實施例的再一方面提供了式I所示化合物的結晶B：
Figure 106119959-A0202-12-0004-4
 式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射(XRD)圖譜具有2 θ為8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、12.90°±0.2°、17.70°±0.2°、20.31°±0.2°和23.63°±0.2°的衍射峰。
本發明實施例的另一方面提供式I所示化合物的結晶B的製備方法，方法包括以下步驟：1)使式I所示化合物溶於乙腈中；以及2)析晶。
本發明實施例的另一方面提供了結晶組合物，其中式I所示化合物的結晶B占結晶組合物重量的50%以上，較好的是80%以上，更好的是90%以上，最好的是95%以上。
本發明實施例的另一方面提供了藥物組合物，藥物組合物中包含有效量的式I所示化合物的結晶B；或者包含式I所示化合物的結晶B的結晶組合物。
本發明實施例的另一方面提供了式I所示化合物的結晶B、或上述結晶組合物或上述藥物組合物在製備治療或 預防兩面神激酶介導的疾病的藥物中的用途。
圖1為式I所示化合物的結晶A(實施例2方法1)的XRD圖譜。
圖2為式I所示化合物的結晶A(實施例2方法1)的DSC圖譜。
圖3為式I所示化合物的結晶A(實施例2方法2，乙醇-乙酸乙酯(4：1))的XRD圖譜。
圖4為式I所示化合物的結晶A(實施例2方法3)的XRD圖譜。
圖5為式I所示化合物的結晶B(實施例3)的XRD圖譜。
圖6為式I所示化合物的結晶B(實施例3)的DSC圖譜。
本發明實施例的一方面提供了式I所示化合物的結晶A：
Figure 106119959-A0202-12-0005-6
 式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射(XRD)圖譜具有2 θ為9.35°、11.93°、16.32°、21.23°、23.13°和25.58°±0.2°的衍射峰；典型地具有2 θ為9.35°、11.93°、16.32°、18.82°、20.54°、21.23°、23.13°和25.58°±0.2°的衍射峰；更典型地具有2 θ為9.35°、10.93°、11.93°、14.46°、16.32°、18.82°、20.54°、 21.23°、21.66°、23.13°、25.58°和26.34°±0.2°的衍射峰；進一步典型地具有2 θ為9.35°、10.93°、11.93°、14.46°、16.32°、17.28°、18.82°、19.25°、20.54°、21.23°、21.66°、22.15°、23.13°、24.09°、25.58°和26.34°±0.2°的衍射峰。
在本發明實施例的部分實施方式中，本發明實施例的式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射(XRD)圖譜中，相對強度最大的峰出現在2 θ為11.93°、16.32°或21.23°±0.2°的衍射峰位置；優選地，相對強度最大的峰出現在2 θ為11.93°±0.2°的衍射峰位置。
在本發明實施例的部分實施方式中，本發明實施例的式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射(XRD)圖譜中，相對強度前三位的峰出現在2 θ為9.35°、11.93°、16.32°、21.23°、23.13°或25.58°±0.2°的衍射峰位置。
在本發明實施例的部分實施方式中，本發明實施例的式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射峰具有如下特徵：
Figure 106119959-A0202-12-0006-7
在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜如圖1所示。
在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶A的DSC圖譜如圖2所示。
在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜如圖3所示。
在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜如圖4所示。
本發明實施例的另一方面提供式I所示化合物的結晶A的製備方法，方法包含以下步驟：1)使式I所示化合物溶於結晶溶劑中，結晶溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙二醇單甲醚、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六環、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸異丙酯、二氯甲烷、氯仿、水或上述溶劑中任意兩種或兩種以上的混合溶劑；以及2)析晶和任選地過濾、洗滌和/或乾燥。
在本發明實施例的部分實施方式中，製備式I所示化合物的結晶A的結晶溶劑為乙醇、異丙醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、水或上述溶劑中任意兩種或兩種以上的混合溶劑；優選乙醇、乙醇-乙酸乙酯混合溶劑、乙醇-水混合溶劑、乙醇-異丙醚混合溶劑、丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。
在本發明實施例的部分實施方式中，製備式I所示化合物的結晶A的結晶溶劑優選乙醇或包含乙醇的混合溶 劑；更優選地，包含乙醇的混合溶劑中的其他溶劑選自甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙二醇單甲醚、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六環、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸異丙酯、二氯甲烷、氯仿或水。
在本發明實施例的部分實施方式中，製備式I所示化合物的結晶A時，式I所示化合物(以重量單位g計)相比結晶溶劑的使用量(以體積單位mL計)的比例選自1：5~1：50，優選1：7.5、1：10、1：12、1：15、1：18、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45或1：50，更優選1：7.5~1：30。
在本發明實施例的部分實施方式中，當製備式I所示化合物的結晶A的結晶溶劑選自包含乙醇的混合溶劑時，乙醇的含量(以體積計算)為10%~90%；優選10%、20%、25%、30%、33%、40%、50%、60%、66%、70%、75%、80%或90%。
在本發明實施例的部分實施方式中，當製備式I所示化合物的結晶A的結晶溶劑選自包含乙醇的混合溶劑時，乙醇與其他溶劑的比(以體積計算)為9：1~1：9；優選9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8或1：9。
在本發明實施例的部分實施方式中，可以藉由降溫進行析晶，例如，降溫至0-5℃析晶。在本發明實施例的部分實施方式中，可以藉由減壓濃縮進行析晶。
本發明實施例的另一方面提供了包含式I所示化 合物的結晶A的結晶組合物。在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶A占結晶組合物重量50%以上，較好的是80%以上，更好的是90%以上，最好的是95%以上。
本發明實施例的另一方面提供了包含式I所示化合物的結晶A的藥物組合物，藥物組合物中包含有效量的式I所示化合物的結晶A；或者包含式I所示化合物的結晶A的結晶組合物。此外，藥物組合物還可以含有或不含有藥學上可接受的載體、賦形劑和/或介質。
本發明實施例的另一方面提供了式I所示化合物的結晶A、或上述結晶組合物或上述藥物組合物在製備治療或預防兩面神激酶介導的疾病的藥物中的用途。
本發明實施例的另一方面提供了治療或預防兩面神激酶介導的疾病的方法，其包括向有需要的哺乳動物給予治療有效量的上述式I所示化合物的結晶A，或上述晶體組合物，或上述藥物組合物。
本發明實施例的另一方面提供了用於治療或預防兩面神激酶介導的疾病的上述式I所示化合物的結晶A，或上述晶體組合物，或上述藥物組合物。
本發明實施例的再一方面提供了式I所示化合物的結晶B：
Figure 106119959-A0202-12-0009-8
 式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射(XRD)圖譜具有2 θ為8.97°、9.39°、12.90°、17.70°、20.31°和23.63°±0.2°的衍射峰；典型地具有2 θ為8.97°、9.39°、12.90°、16.54°、17.70°、19.20°、20.31°、22.78°和23.63°±0.2°的衍射峰；更典型地具有2 θ為8.97°、9.39°、11.24°、12.90°、14.56°、16.54°、17.70°、19.20°、20.31°、22.23°、22.78°、23.63°和25.55°±0.2°的衍射峰。
在本發明實施例的部分實施方式中，本發明實施例的式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射(XRD)圖譜中，相對強度最大的峰出現在2 θ為9.39°、17.70°或23.63°±0.2°的衍射峰位置；優選地，相對強度最大的峰出現在2 θ為17.70°±0.2°的衍射峰位置。
在本發明實施例的部分實施方式中，本發明實施例的式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射峰具有如下特徵：
Figure 106119959-A0202-12-0010-9
在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合 物的結晶B的X-射線衍射圖譜如圖5所示。
在本發明實施例的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶B的DSC圖譜如圖6所示。
本發明實施例的式I所示化合物的結晶B是式I所示化合物的乙腈合物，其中式I所示化合物與乙腈的摩爾量之比選自1：0.5~1：2.0，優選為1：0.5、1：1、1：1.5或1：2.0。
本發明實施例的另一方面提供式I所示化合物的結晶B的製備方法，方法包含以下步驟：1)使式I所示化合物溶於乙腈中；以及2)析晶和任選地過濾、洗滌和/或乾燥。
在本發明實施例的部分實施方式中，製備式I所示化合物的結晶B時，式I所示化合物(以重量單位g計)相比結晶溶劑乙腈的使用量(以體積單位mL計)的比例選自1：5~1：50，優選1：7.5、1：10、1：12、1：15、1：18、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45或1：50，更優選1：10~1：25。
在本發明實施例的部分實施方式中，可以藉由降溫進行析晶，例如，降溫至0-5℃析晶。
本發明實施例的另一方面提供了包含式I所示化合物的結晶B的結晶組合物。在本發明的部分實施方式中，式I所示化合物的結晶B占結晶組合物重量的50%以上，較好的是80%以上，更好的是90%以上，最好的是95%以上。
本發明實施例的另一方面提供了包含式I所示化合物的結晶B的藥物組合物，藥物組合物中包含有效量的式I所示化合物的結晶B或者包含式I所示化合物的結晶B的結晶 組合物。此外，藥物組合物還可以含有或不含有藥學上可接受的載體、賦形劑和/或介質。
本發明實施例的另一方面提供了式I所示化合物的結晶B、或上述結晶組合物或上述藥物組合物在製備治療或預防兩面神激酶介導的疾病的藥物中的用途。
本發明實施例的另一方面提供了治療或預防兩面神激酶介導的疾病的方法，其包括向有需要的哺乳動物給予治療有效量的上述式I所示化合物的結晶B，或上述晶體組合物，或上述藥物組合物。
本發明實施例的另一方面提供了用於治療或預防兩面神激酶介導的疾病的上述式I所示化合物的結晶B，或上述晶體組合物，或上述藥物組合物。
本發明實施例中，X-射線衍射圖譜採用下述方法測定：儀器：Bruker D8 ADVANCE X-射線衍射儀；方法：靶：Cu：K-Alpha；波長λ=1.54179
Figure 106119959-A0202-12-0012-39
；管壓Voltage：40kV；管流Current：40mA；掃描範圍：4~40°；掃描速度：每步0.1秒，每步0.02°。
本發明實施例中，差示掃描量熱分析(DSC)採用下述方法測定：儀器：梅特勒DSC-1差示掃描量熱儀；方法：取樣品(~5mg)置於DSC鋁鍋內進行測試，方法為：30℃-300℃，升溫速率10℃/min。
需要說明的是，在X-射線衍射光譜中，由結晶化合物得到的衍射譜圖對於特定的晶型往往是特徵性的，其中譜帶(尤其是在低角度)的相對強度可能會因為結晶條件、粒徑 和其它測定條件的差異而產生的優勢取向效果而變化。因此，衍射峰的相對強度對所針對的晶型並非是特徵性的，判斷是否與已知的晶型相同時，更應該注意的是峰的相對位置而不是它們的相對強度。此外，對任何給定的晶型而言，峰的位置可能存在輕微誤差，這在晶體學領域中也是公知的。例如，由於分析樣品時溫度的變化、樣品移動、或儀器的標定等，峰的位置可以移動，2 θ值的測定誤差有時約為±0.2°。因此，在確定每種晶型結構時，應該將此誤差考慮在內。在XRD圖譜中通常用2 θ角或晶面距d表示峰位置，兩者之間具有簡單的換算關係：d=λ/2 sin θ，其中d代表晶面距，λ表入射X射線的波長，θ為衍射角。對於同種化合物的同種晶型，其XRD譜的峰位置在整體上具有相似性，相對強度誤差可能較大。還應指出的是，在混合物的鑒定中，由於含量下降等因素會造成部分衍射線的缺失，此時，無需依賴高純試樣中觀察到的全部譜帶，甚至一條譜帶也可能對給定的晶體是特徵性的。
需要說明的是，DSC測定當晶體由於其晶體結構發生變化或晶體熔融而吸收或釋放熱時的轉變溫度。對於同種化合物的同種晶型，在連續的分析中，熱轉變溫度和熔點誤差典型的在約5℃之內，當我們說一個化合物具有某一給定的DSC峰或熔點時，這是指該DSC峰或熔點±5℃。DSC提供了一種辨別不同晶型的輔助方法。不同的晶體形態可根據其不同的轉變溫度特徵而加以識別。
本發明實施例所述的兩面神激酶介導的疾病包含但不限於腫瘤(例如，淋巴瘤、白血病)。本發明實施例所述 的淋巴瘤可以包含但不限於霍奇金病(Hodgkins disease)或非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤包含但不限於B-細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)或T-細胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)。本發明實施例所述的白血病包含但不限於急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴細胞白血病(Chronic lymphocyticleukemia)、急性粒細胞白血病(Acute myeloid leukemia)、慢性粒細胞白血病(Chronic myelocytic leukemia)。
本發明實施例中，術語“藥物組合物”是指一種或多種本發明實施例的化合物與在本領域中通常接受的用於將生物活性化合物輸送至有機體(例如人)的載體、賦形劑和/或介質的製劑。藥物組合物的目的是有利於對有機體給予本發明實施例的化合物。
術語“載體”定義為有利於將化合物引入細胞或組織的化合物。例如二甲亞碸(DMSO)通常用作載體，這是因為它易於將某些有機化合物引入生物體的細胞或組織中。
“藥物可接受的載體”包含但不限於任何被國家藥品管理機構批准為可接受用於人或家畜的佐劑、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等張劑、溶劑或乳化劑。
“治療有效量”是指本發明實施例的化合物的量，當其被給予哺乳動物，優選為人時，足以如下文定義地在哺乳動物，優選為人中實現對病毒感染的治療。構成“治療有效量”的 本發明實施例的化合物的量，根據化合物、疾病狀態及其嚴重性、給藥方式以及要治療的哺乳動物的年齡而改變，但可常規地由本發明所屬技術領域中具有通常知識者根據其自有知識及本發明實施例內容而決定。
本文中使用的“治療”涵蓋對患有病毒感染的哺乳動物，優選為人中的病毒感染的治療，且包含：(i)抑制病毒感染，即阻止其發展；(ii)緩解病毒感染，即引起病毒感染的復原；或(iii)緩解由病毒感染引發的症狀。
本發明實施例所使用的所有溶劑是市售的，無需進一步純化即可使用。反應一般是在惰性氮氣下、無水溶劑中進行的。
在本發明實施例中，質子核磁共振資料記錄在BRUKER AVANCE Ⅲ HD 500M分光儀上，化學位移以四甲基矽烷低場處的(ppm)表示；質譜是在Waters ACQUITY UPLC+XEVO G2 QTof測定。質譜儀配備有一個正或負模式下操作的電噴霧離子源(ESI)。
本發明實施例提供的式I所示化合物的結晶A和結晶B具有純度高、結晶度高、穩定性好等優點；同時，本發明實施例提供的式I所示化合物結晶A和結晶B的製備方法簡單，溶劑價廉易得，結晶條件溫和，適合工業化生產。
以下實施例對本發明實施例技術方案作進一步非限制性的詳細說明。它們不應該被認為是對本發明範圍的限制，而只是本發明的示例性說明和典型代表。本發明實施例中 使用的溶劑、試劑和原料等均為市售化學純或分析純產品。
實施例1(3R)-3-{3-氨基-4-{7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙腈(I)
Figure 106119959-A0202-12-0016-12
步驟A：3-環戊基丙烯酸
Figure 106119959-A0202-12-0016-11
室溫下，向盛有5M丙二酸(312g，3.0mol，1.0eq.)吡啶溶液中滴加環戊基甲醛(344.4g，3.51mol，1.17eq.)，加完後攪拌10分鐘，緩慢滴加呱啶(6.2g，0.075mol，0.025eq.)，加完後室溫下攪拌反應1小時。升溫至70~80℃攪拌反應8小時，減壓濃縮蒸去溶劑，餘物濃鹽酸調pH至3.0，乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，2.5M氫氧化鈉溶液洗滌五次，水層濃鹽酸調pH至3.0，乙酸乙酯萃取三次，合併有機層，水洗三次，飽和食鹽水洗，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮得3-環戊基丙烯酸(391.2g，收率：93%)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ：7.08(dd,J=15.6,8.1Hz,1H)、5.81(dd,J=15.6,1.1Hz,1H)、11.25(s,1H)、2.64(m,1H)、1.63(m,2H)、1.42(m,2H)、1.86(m,2H)、1.72(m，2H)；HRMS(ESI)calcd.for C8H12O2[M-H]- 139.0765；Found：139.0760。
步驟B：5-環戊基吡唑烷-3-酮
Figure 106119959-A0202-12-0016-40
室溫攪拌下，80%水合肼(253.5g，4.05mol，1.5eq.)滴加至環戊基丙烯酸(378g，2.7mol，1.0eq.)中，升溫至70~80℃攪拌反應6小時，降溫至0~10℃攪拌析晶，過濾，濾餅水洗兩次，45℃鼓風乾燥12小時得5-環戊基吡唑烷-3-酮(292.5g，68%收率)。
步驟C：R-5-環戊基吡唑烷-3-酮-D-酒石酸鹽
Figure 106119959-A0202-12-0017-13
室溫攪拌下，D-酒石酸(135g，0.9mol，0.5eq.)加入到5-環戊基吡唑烷-3-酮(278g，1.8mol，1.0eq.)丙酮溶液中，攪拌反應2小時後析晶，過濾，濾餅丙酮打漿5次，50℃鼓風乾燥得R-5-環戊基吡唑烷-3-酮-D-酒石酸鹽(241g，88%收率，99.5%ee值)。
步驟D：R-5-環戊基吡唑烷-3-酮
Figure 106119959-A0202-12-0017-14
室溫攪拌下，R-5-環戊基吡唑烷-3-酮-D-酒石酸鹽(228g，0.75mol，1.0eq.)加入到4M氫氧化鈉(52.2g，2.61mol，1.74eq.)溶液中，二氯甲烷萃取，合併有機層，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得R-5-環戊基吡唑烷-3-酮(100.6g，85.2%收率，99.5%ee值)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H)、5.15(s,1H)、1.89(m,1H)、1.67(m,2H)、1.55(m,2H)、1.47(m,2H)、1.26(m,1H)、1.14(m,1H)；HRMS(ESI)calcd.for C8H14N2O[M+H]+ 155.1179；Found： 155.1183。
步驟E：4-氯-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶
Figure 106119959-A0202-12-0018-18
冰浴下，向4-氯吡咯並[2,3-d]嘧啶(200g，1.3mol，1.0eq.)N,N-二甲基甲醯胺溶液中加入60%NaH(62.4g，1.56mol，1.2eq.)，加完後室溫下攪拌反應1小時，冰浴冷卻下緩慢滴加2-(三甲基矽烷基)乙氧甲基氯(SEMCl，260g，1.56mol，1.2eq)。加畢，冰浴下攪拌反應1小時，加水淬滅，乙酸乙酯萃取，合併有機相飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得餘物，矽膠柱層析純化得4-氯-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(312.2g，91.8%收率)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ8.64(s,1H)、7.38(d,J=3.6Hz,1H)、6.65(d,J=3.6Hz,1H)、5.64(s,2H)、3.52(t,J=8.2Hz,2H)、0.90(t,J=8.2Hz,2H)、-0.07(s,9H)；HRMS(ESI)calcd.for C12H18N3OSi[M+H]+ 284.0980；Found：284.0995。
步驟F：2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯
Figure 106119959-A0202-12-0018-15
室溫攪拌下，碳酸鉀(207g，1.5mol，3.0eq.)加 入到4-氯-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶(142g，0.5mol，1.0eq.)和氰基乙酸乙酯(85g，0.75mol，1.5eq)DMF溶液中，升溫至120℃攪拌反應4小時，降至室溫，加水淬滅，攪拌析晶，過濾，濾餅水洗50℃鼓風乾燥得2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯(167g，92.6%收率)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 13.46(s,1H)、8.45(s,1H)、7.56(d,J=3.6Hz,1H)、7.18(d,J=3.6Hz,1H)、5.56(s,2H)、4.32(q,J=7.1Hz,2H)、3.52(t,J=8.2Hz,2H)、1.27(t,J=7.1Hz,3H)、0.83(t,J=8.2Hz,2H)、-0.08(s,9H)；HRMS(ESI)calcd.for C17H24N4O3Si[M+H]+ 361.1690；Found：361.1699。
步驟G：2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}乙腈
Figure 106119959-A0202-12-0019-17
室溫下攪拌下，氯化鈉(263g，4.5mol，10eq.)加入到2-氰基-2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}乙酸乙酯(162.2g，0.45mol，1.0eq.)N-甲基吡咯烷酮和水的混合溶液中，升溫至160~170℃攪拌反應30小時。加水淬滅，乙酸乙酯萃取，有機層飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮所得餘物，矽膠柱層析純化得2-(7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)乙腈(98.6g，76%收率)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ8.18(s,1H)、7.77(d,J=3.4Hz,1H)、6.83(d,J=3.4Hz,1H)、5.65 (s,2H)、4.56(s,2H)、3.52(t,J=7.6Hz,2H)、0.82(t,J=7.6Hz,2H)、-0.10(s,9H)；HRMS(ESI)calcd.forC14H20N4OSi[M+H]+ 289.1479；Found：289.1498。
步驟H：3-(二甲氨基)-2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}丙烯腈
Figure 106119959-A0202-12-0020-19
DMF-DMA(119g，1.0mol，3.0eq.)加入到2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}乙腈(95g，0.33mol，1.0eq.)DMF溶液中，升溫至回流反應2小時，降至室溫，加水攪拌析晶，過濾，濾餅水洗，50℃鼓風乾燥，得3-(二甲氨基)-2-(7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)丙烯腈(106.5g，94%收率)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 8.50(s,1H)、8.38(s,1H)、7.26(d,J=3.7Hz,1H)、7.18(d,J=3.7Hz,1H)、5.56(s,2H)、3.49(t,J=8.4Hz,2H)、3.43(s,3H)、3.23(s,3H)、0.87(t,J=8.4Hz,2H)、-0.10(s,9H)；；HRMS(ESI)calcd.for C17H25N5OSi[M+H]+ 344.1901；Found：344.1907。
步驟I：(R)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙酸
Figure 106119959-A0202-12-0021-20
室溫攪拌下，乙酸鉀(1.5eq)加入到3-(二甲氨基)-2-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}丙烯腈(68.7g，0.2mol，1.0eq.)和R-5-環戊基吡唑烷-3-酮(37.0g，0.24mol，1.2eq.)N-甲基吡咯烷酮溶液中，升溫至120~130℃攪拌反應12小時。加水淬滅，乙酸乙酯萃取，有機層水洗三次，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉乾燥。過濾，減壓濃縮得餘物經矽膠柱層析純化，得(R)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙酸(37.6g，40.1%收率，ee值99.8%)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 8.74(s,1H)、7.96(s,1H)、7.32(d,J=3.4Hz,1H)、6.67(d,J=3.4Hz,1H)、5.63(m,2H)、4.19(t,J=8.2Hz,2H)、3.52(m,1H)、3.52(t,J=8.4Hz,2H)、3.09(dd,J=16.7,8.2Hz,1H)、2.87(d,J=16.7Hz,1H)、2.41(m,1H)、1.87(m,1H)、1.69(m,1H)、1.60(m,2H)、1.51(m,2H)、1.15(m,1H)、0.91(t,J=8.4Hz,2H)、-0.06(s,9H)；HRMS(ESI)calcd.for C17H25N5OSi[M+H]+ 471.2534；Found：471.2538。
步驟J：(R)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙酸
Figure 106119959-A0202-12-0022-21
室溫攪拌下，向0.2M(R)-3-{3-氨基-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基]-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙酸(35.0g，74.3mmol，1.0eq.)甲苯溶液中加入丁二酸酐(10.4g，104mmol，1.4eq.)，氮氣保護下升溫至回流反應(分水)14小時。減壓濃縮蒸去溶劑，餘物中加入乙酸乙酯溶解，水洗，飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，乙酸乙酯層加入無水硫酸鈉及活性炭攪拌乾燥脫色，過濾，減壓濃縮得(R)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙酸(39g，70.6mmol，95%收率)。1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 8.65(s,1H)、8.28(s,1H)、7.28(d,J=3.7Hz,1H)、6.62(d,J=3.7Hz,1H)、5.59(d,J=11.1Hz,1H)、5.53(d,J=11.1Hz,1H)、4.44(td,J=9.9,3.2Hz,1H)、3.48(m,2H)、3.02(dd,J=16.8,10.0Hz,1H)、2.83(m,1H)、2.43(m,1H)、1.78(m,1H)、1.69(m,1H)、1.61(m,1H)、1.52(m,1H)、1.51(m,1H)、1.50(m,2H)、1.14(m,1H)、0.88(m,2H)、-0.07(s,9H)；HRMS(ESI)calcd.for C27H36N6O5Si[M+H]+ 553.2589；Found：553.2603。
步驟K：(R)-3-環戊基-3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧 啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙醯胺
Figure 106119959-A0202-12-0023-41
冰浴，氮氣保護攪拌下，向0.18M(R)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙酸(35.0g，63.3mmol，1.0eq.)二氯甲烷溶液中滴加草醯氯(20.0g，158mmol，2.5eq.)，加畢，滴加DMF(0.1g，1.3mmol，0.02eq.)，室溫下攪拌反應1小時，減壓濃縮蒸去溶劑，加入鈉絲乾燥重蒸THF溶解，滴加至2M氨水(20.0，0.32mol，5.0eq.)THF溶液中，冰浴下攪拌反應30分鐘，減壓濃縮蒸去THF，冰浴降溫析晶2小時，過濾，濾餅水洗，50℃鼓風乾燥得(R)-3-環戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙醯胺(29.8g，85.5%收率)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 8.65(s,1H)、8.24(s,1H)、7.32(d,J=3.7Hz,1H)、6.63(d,J=3.7,1H)、6.12(s,1H)、5.60(d,J=11.1Hz,1H)、5.56(d,J=11.1Hz,1H)、5.44(s,1H)、4.40(td,J=10.6,3.2Hz,1H)、3.47(dd,J=9.1,7.5Hz,2H)、2.99(dd,J=14.4,11.0Hz,1H)、2.91(s,4H)、2.67(dd,J=14.4,3.3Hz,1H)、2.48(m,1H)、1.84(m,1H)、1.66(m,1H)、1.58(m,2H)、1.57(m,1H)、1.50(m,1H)、1.31(m,1H)、 1.21(m,1H)、0.88(dd,9.1,7.5,2H)、-0.08(s,9H)；；HRMS(ES)calcd.for C27H37N7O4Si[M+H]+ 552.2749；Found：552.2759。
步驟L：(R)-3-環戊基-3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈
Figure 106119959-A0202-12-0024-23
冰浴攪拌下，向0.2M(R)-3-環戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙醯胺(25g，45.3mmol，1.0eq)二氯甲烷溶液中滴加三氯氧磷(27.8g，181mmol，4.0eq.)。加畢，室溫下攪拌反應2小時，加水淬滅，有機層水洗，加入無水硫酸鎂及活性炭攪拌乾燥、脫色。過濾，減壓濃縮除去溶劑得(R)-3-環戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙腈(22.2g，41.7mmol，92%收率)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 8.70(s,1H)、8.35(s,1H)、7.35(d,J=3.7Hz,1H)、6.66(d,J=3.7Hz,1H)、5.62(d,J=10.8Hz,1H)、5.58(d,J=10.8Hz,1H)、4.30(m,1H)、3.50(m,2H)、3.09(dd,J=16.8,4.3Hz,1H)、3.01(dd,J=16.8,4.3Hz,1H)、2.94(s,4H)、2.62(m,1H)、1.96(m,1H)、1.69(m, 2H)、1.60(m,1H)、1.58(m,2H)、1.27(m,2H)、0.90(t,J=8.3Hz,2H)、-0.06(s,9H)；HRMS(ESI)calcd.for C27H35N7O3Si[M+H]+ 534.2643；Found：534.2657。
步驟M：(R)-3-環戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{(7-羥甲基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙腈
Figure 106119959-A0202-12-0025-42
冰浴攪拌下，向0.2M(R)-3-環戊基-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{7-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}丙腈(20g，37.5mmol，1.0eq.)二氯甲烷溶液中滴加47%三氟化硼乙醚溶液(34g，112.5mmol，3.0eq.)。加畢，室溫攪拌反應4小時。加水淬滅，10%NaOH溶液調pH至6~7，乙酸乙酯萃取，有機層水洗，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂攪拌乾燥。過濾，減壓濃縮得(R)-3-環戊基-3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-(7-羥甲基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈(14.4g，88.5%收率)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 8.54(s,1H)、8.31(s,1H)、7.31(d,J=3.7Hz,1H)、6.52(d,J=3.7Hz,1H)、5.68(d,J=10.9Hz,1H)、5.61(d,J=10.9Hz,1H)、4.32(m,1H)、3.13(dd,J=17.2,7.9Hz,1H)、3.03(dd,J=17.2,4.3Hz,1H)、2.94(s,4H)、2.62(m,1H)、1.98(m,1H)、1.74(m,1H)、1.65(m, 1H)、1.64(m,2H)、1.30(m,1H)、1.29(m,2H)；HRMS(ESI)calcd.for C22H23N7O3[M+H]+ 434.1935；Found：434.1944。
步驟N：(R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-環戊基丙腈(I)
Figure 106119959-A0202-12-0026-25
室溫攪拌下，向0.2M(R)-3-{3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-4-{(7-羥甲基)-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基}-1H-吡唑-1-基}-3-環戊基丙腈(12g，27.7mmol，1.0eq.)甲醇溶液中滴加80%水合肼(8.7g，138mmol，5.0eq.)。加畢，升溫至回流反應8小時，減壓濃縮蒸去溶劑，餘物乙酸乙酯溶解，水洗，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉乾燥過夜。過濾，減壓濃縮得(R)-3-[3-氨基-4-(7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]-3-環戊基丙腈(I)(7.7g，收率87%,ee值99.8%)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：δ 11.73(s,1H)、8.79(s,1H)、8.06(s,1H)、7.32(d,J=3.5Hz,1H)、6.62(d,J=3.5Hz,1H)、5.03(s,2H)、4.05(td,J=9.5,3.5Hz,1H)、3.12(dd,J=17.1,8.9Hz,1H)、2.91(dd,J=17.1,3.6Hz,1H)、2.54(m,1H)、1.74(m,1H)、1.63(m,4H)、1.27(m,1H)、1.26(m,2H)；HRMS(ESI)calcd.for C17H19N7[M+H]+ 322.1775；Found：322.1783。
實施例2式I化合物結晶A
方法1
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入24mL無水乙醇升溫至回流溶清，降溫至0-5℃攪拌析晶4小時，過濾，濾餅用2mL無水乙醇淋洗，50℃減壓乾燥得產物1.62g，81%收率。
方法2
取實施例1得到的式I化合物2.0g共4份，分別加入20mL無水乙醇-乙酸乙酯(4：1、2：1、1：1、1：4)混合溶劑升溫至回流溶清，降溫至0-5℃攪拌析晶4小時，過濾，濾餅用2mL乙酸乙酯淋洗，50℃減壓乾燥得產物1.34g、1.06g、1.00g、1.60g，收率67%、53%、50%、80%。
方法3
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入20mL無水乙醇-水(4：1)混合溶液升溫至回流溶清，降溫至0-5℃攪拌析晶4小時，過濾，濾餅用2mL無水乙醇淋洗，50℃減壓乾燥得產物1.6g，80%收率。
方法4
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入15mL丙酮升溫至回流溶清，降溫至0-5℃攪拌析晶4小時，過濾，濾餅用2ml丙酮淋洗，50℃減壓乾燥得產物1.22g，61%收率。
方法5
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入50mL乙酸乙酯升溫至回流溶清，減壓濃縮蒸去溶劑得產物1.98g，99%收率。
方法6
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入60ml二氯甲烷升溫至回流溶清，減壓濃縮蒸去溶劑得產物2.0g，100%收率。
方法7
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入24mL無水乙醇升溫至回流溶清，滴加異丙醚120mL，降溫至0-5℃攪拌析晶4小時，過濾，濾餅用2mL異丙醚淋洗，50℃減壓乾燥得產物1.56g，78%收率。
式I化合物結晶A的典型的XRD圖譜和DSC圖譜分別如圖1和圖2所示(實施例2方法1)。
式I化合物結晶A的另一典型的XRD圖譜如圖3所示(實施例2方法2，乙醇-乙酸乙酯(4：1))。
式I化合物結晶A的又一典型的XRD圖譜如圖4所示(實施例2方法3)。
實施例3式I化合物結晶B
取實施例1得到的式I化合物2.0g，加入25mL乙腈升溫至回流溶清，降溫至0-5℃攪拌析晶4小時，過濾，濾餅用2ml乙腈淋洗，50℃減壓乾燥得產物1.82g，91%收率。
式I化合物結晶B是其乙腈合物，其典型的XRD圖譜和DSC圖譜分別如圖5和圖6所示。
實施例4穩定性實驗
將實施例2方法1得到的結晶A和實施例3得到的結晶B置於開口潔淨容器中，60℃下放置，分別於第5和 10天取樣檢測，檢測結果與第0天的初始檢測結果進行比較，試驗結果見下表所示：
Figure 106119959-A0202-12-0029-26
實施例5生物活性實驗
1.化合物酶學活性(IC50)檢測
採取勻相時間分辨螢光(HTRF)方法建立了JAK2(野生型)的激酶活性檢測平臺，進行化合物活性的測定。將化合物從1mM開始用100% DMSO進行3倍的梯度稀釋(共11個濃度)，每個濃度取4μL加入到96μL的反應緩衝液中(50mM HEPES,pH7.4,10mM MgCl2,1mM EGTA,0.01% Tween-20,0.005% BAS,2mM DTT)混勻，然後取2.5μL加入到384孔板(OptiPlate-384，購買於PerkinElmer)，然後加入5μL的JAK2激酶(購買於Carna)，離心混勻，再加入2.5μL的ATP(終濃度為相應的Km值)與TK peptide(HTRF® KinEASETM-TK，購買於Cisbio)混合物啟動反應(總反應體積為10μL)。將384孔板放於孵育箱中23℃反應120分鐘，然後加入5μL的Eu3+cryptate-labled anti-phosphotyrosine antibody(購買於Cisbio)，5μL的Streptavidin-XL-665(HTRF® KinEASETM-TK，購買於Cisbio)停止反應。在孵育箱中孵育1小時後，在Envision(購買於PerkinElmer)上讀取螢光值(320nm激發，檢測665nm與620nm的發射光，二者比值為酶活性)。在11個濃度下測定 酶的活性，使用GraFit6.0軟體(Erithacus Software)計算數據，得到式I化合物的IC50值。結果可知，式I化合物和對照Ruxolitinib的IC50值都<20nM。
2.在小鼠皮下異種移植瘤模型中有效性的測定
SPF級Balb/c裸鼠，雌性，5-6周齡。將無血清培養基混懸的Ba/F3-JAK2V617F細胞懸液0.1mL(含1×107cells，50% MatriGel)皮下注射於每只小鼠右側面。待平均腫瘤體積達到約500mm3時，處死荷瘤鼠，無菌摘取腫瘤組織，剪成小塊，植入Balb/c裸鼠左右兩側皮下，待平均腫瘤體積達到約100mm3時，將各鼠按流水號標記，分別測量其腫瘤大小及體重，按腫瘤體積從小到大隨機分組，並適當調整使各組動物的平均體重亦處於同一水準。5組分別為陰性對照組、陽性對照組、低、中及高劑量組，每組5只小鼠，分組當天開始給藥，每天給藥2次，連續給藥14天，期間每週測量腫瘤體積及體重2次。實驗結束時處死小鼠，分離脾臟並稱重。
試驗過程中測量腫瘤最長徑(L)和垂直方向的最大橫徑(W)，計算腫瘤體積(V)，V(mm3)=L×W2/2。腫瘤生長抑制率TGI(%)=100%×(1-(Tt-T0)/(Vt-V0))，Tt為治療組每次測量的平均腫瘤體積，T0治療組分組時的平均腫瘤體積，Vt為對照組每次測量的平均腫瘤體積，V0為對照組分組時的平均腫瘤體積。
結果如下表所示：
Figure 106119959-A0202-12-0031-27
由表中數據可見，在Ba/F3-JAK2V617F荷瘤小鼠模型中，測定了式I化合物的鹽酸鹽在動物體內的腫瘤抑制效果，發現其對Ba/F3-JAK2V617F腫瘤生長呈現劑量依賴性的抑制作用，抑瘤效果非常顯著。口服每天兩次給藥式I化合物的鹽酸鹽(100mg/kg)14天之後，對腫瘤生長的抑制率(TGI)達到85.8%，而同等條件下的陽性對照品Ruxolitinib(100mg/kg)對腫瘤生長的抑制率(TGI)僅為64.5%。50mg/kg的式I化合物的鹽酸鹽腫瘤抑制效果也很明顯，TGI達到68.4%，與100mg/kg的陽性對照品Ruxolitinib的腫瘤抑制效果相當。
3.成年雄性/雌性SD大鼠中藥物動力學的測定
健康成年雌性SD大鼠來源於北京維通利華實驗動物技術有限公司，將大鼠分2組，每組3只，分別口服單次灌胃給予待測樣品混懸液(30mg/kg)。動物在實驗前禁食過夜，禁食時間從給藥前10小時至給藥後4小時。給藥後的0.25、0.5、1、2、4、6、8、和24小時採血。使用小動物麻醉機經異氟烷麻醉後藉由眼底靜脈叢採取0.4mL全血，放於肝素抗凝管中，樣品於4oC、4200rpm離心5min，血漿轉移至離心管中，並放於-80℃保存直到分析。血漿中樣品使用蛋白質 沉澱法萃取，萃取液通過LC/MS/MS分析。
Figure 106119959-A0202-12-0032-30
大鼠(30mg/kg PO)的PK顯示，式I化合物的資料優於Ruxolitinib。
4.成年米格魯中藥物動力學的測定
研究使用4只健康成年米格魯，來源於北京瑪斯生物技術有限公司。研究分為兩次：第一次，動物(雌雄各2只)單次靜脈注射給藥，劑量為5mg/kg；第二次，一周後同一組動物(雌雄各2只)單次灌胃給藥，劑量為10mg/kg。灌胃給藥的動物在實驗前禁食過夜，禁食時間從給藥前10小時至給藥後4小時。靜脈給藥組的動物無食物限制。靜脈給藥組在給藥後的0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小時採血；灌胃給藥組在給藥後的0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小時採血。動物通過異氟烷淺麻醉，用玻璃採血管於眼眶靜脈叢採血約0.4mL全血，放於肝素抗凝管中，樣品於4℃、4200rpm離心5min，血漿轉移至離心管中，並放於-80℃保存直到分析。血漿中樣品使用蛋白質沉澱法萃取，萃取液通過LC/MS/MS分析。
Figure 106119959-A0305-02-0035-1
狗(10mg/kg PO,5mg/kg IV)的PK顯示，式I化合物IV給藥後AUC與陽性對照Ruxolitinib相當，但口服給藥的生物利用度更優(114% vs 57%)。
Figure 106119959-A0202-11-0002-1

Claims (19)

  1. 一種如式I所示化合物的結晶A：
    Figure 106119959-A0305-02-0036-2
     該式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜具有2θ為9.35°±0.2°、11.93°±0.2°、16.32°±0.2°、21.23°±0.2°、23.13°±0.2°和25.58°±0.2°的衍射峰。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的式I所示化合物的結晶A，其中所述式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜具有2θ為9.35°±0.2°、11.93°±0.2°、16.32°±0.2°、18.82°±0.2°、20.54°±0.2°、21.23°±0.2°、23.13°±0.2°和25.58°±0.2°的衍射峰。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的式I所示化合物的結晶A，其中所述式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜具有2θ為9.35°±0.2°、10.93°±0.2°、11.93°±0.2°、14.46°±0.2°、16.32°±0.2°、18.82°±0.2°、20.54°±0.2°、21.23°±0.2°、21.66°±0.2°、23.13°±0.2°、25.58°±0.2°和26.34°±0.2°的衍射峰。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的式I所示化合物的結晶A，其中所述式I所示化合物的結晶A的X-射線衍射圖譜具有2θ為9.35°±0.2°、10.93°±0.2°、11.93°±0.2°、14.46°±0.2°、 16.32°±0.2°、17.28°±0.2°、18.82°±0.2°、19.25°±0.2°、20.54°±0.2°、21.23°±0.2°、21.66°±0.2°、22.15°±0.2°、23.13°±0.2°、24.09°±0.2°、25.58°±0.2°和26.34°±0.2°的衍射峰。
  5. 一種如申請專利範圍第1-4項中任一項所述之式I所示化合物的結晶A的製備方法，該方法包括以下步驟：1)使式I所示化合物溶於結晶溶劑中，該結晶溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙二醇單甲醚、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、二氧六環、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、丙酮、1-丁酮、2-丁酮、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸異丙酯、二氯甲烷、氯仿、水或上述溶劑中任意兩種或兩種以上的混合溶劑；以及2)析晶。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中該結晶溶劑為乙醇、異丙醚、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、水或上述溶劑中任意兩種或兩種以上的混合溶劑。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中所述結晶溶劑為乙醇、乙醇-乙酸乙酯混合溶劑、乙醇-水混合溶劑、乙醇-異丙醚混合溶劑、丙酮、乙酸乙酯或二氯甲烷。
  8. 一種結晶組合物，其中如申請專利範圍第1-4項中任一項所述的式I所示化合物的結晶A占該結晶組合物重量的50%以上。
  9. 一種藥物組合物，其包括有效量的如申請專利範圍第1-4項 中任一項所述的式I所示化合物的結晶A或如申請專利範圍第8項所述的結晶組合物。
  10. 一種如申請專利範圍第1-4項中任一項所述的式I所示化合物的結晶A、如申請專利範圍第8項所述的結晶組合物、或者如申請專利範圍第9項所述的藥物組合物在製備治療或預防兩面神激酶(Janus kinase)介導的疾病的藥物中的用途。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其中所述兩面神激酶(Janus kinase)介導的疾病為腫瘤。
  12. 一種如式I所示化合物的結晶B：
    Figure 106119959-A0305-02-0038-3
     其為式I所示化合物的乙腈合物，其中式I所示化合物與乙腈的摩爾量之比為1：1，該式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射圖譜具有2θ為8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、12.90°±0.2°、17.70°±0.2°、20.31°±0.2°和23.63°±0.2°的衍射峰。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的式I所示化合物的結晶B，其中所述式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射圖譜具有2θ為8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、12.90°±0.2°、16.54°±0.2°、17.70°±0.2°、19.20°±0.2°、20.31°±0.2°、22.78°±0.2°和23.63°±0.2°的衍射峰。
  14. 如申請專利範圍第12項所述的式I所示化合物的結晶B，其中所述式I所示化合物的結晶B的X-射線衍射圖譜具有2θ為8.97°±0.2°、9.39°±0.2°、11.24°±0.2°、12.90°±0.2°、14.56°±0.2°、16.54°±0.2°、17.70°±0.2°、19.20°±0.2°、20.31°±0.2°、22.23°±0.2°、22.78°±0.2°、23.63°±0.2°和25.55°±0.2°的衍射峰。
  15. 一種如申請專利範圍第12-14項中任一項所述的式I所示化合物的結晶B的製備方法，該方法包括以下步驟：1)使式I所示化合物溶於乙腈中；以及2)析晶。
  16. 一種結晶組合物，其中如申請專利範圍第12-14項中任一項所述的式I所示化合物的結晶B占該結晶組合物重量的50%以上。
  17. 一種藥物組合物，其包括有效量的如申請專利範圍第12-14項中任一項所述的式I所示化合物的結晶B或者如申請專利範圍第16項所述的結晶組合物。
  18. 一種如申請專利範圍第12-14項中任一項所述的式I所示化合物的結晶B、如申請專利範圍第16項所述的結晶組合物、或者如申請專利範圍第17項所述的藥物組合物在製備治療或預防兩面神激酶介導(Janus kinase)的疾病的藥物中的用途。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的用途，其中所述兩面神激酶(Janus kinase)介導的疾病為腫瘤。
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