TWI748448B - 後生元提取物用於促進皮膚再生與抗老化的用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一藉由一包含下列步驟的方法所製得的後生元提取物可被用來促進皮膚再生：提供一具有範圍落在pH 1至pH 6內之第一等電點的第一物質，以及一具有範圍落在pH 4至pH 8內之第二等電點的第二物質，其中該第二等電點是高於該第一等電點，且它們具有一落在0.5至3之間的pH差值；令該第一物質與一益生菌混合於一具有一pH值高於該第二等電點的水中，而得到一混合物；將該第二物質添加至該混合物中，繼而調整該混合物的pH值，而使得該混合物的pH值落在該第一等電點與該第二等電點之間，而使得沉澱物被形成；以及將該沉澱物拿來進行細胞壁分離提取處理。

Description

後生元提取物用於促進皮膚再生與抗老化的用途

本發明是有關於使用一種後生元提取物來促進皮膚再生(skin regeneration)。

皮膚是保護人類個體的最大屏障，它具有對抗病原菌以及各種環境損害之功能。當皮膚暴露在不同的環境因素(例如，紫外線、輻射、微粒)下時，可能會促使皮膚生成活性氧族(reactive oxygen species, ROS)以及自由基(free radicals)。當活性氧族以及自由基的數量超過皮膚細胞或組織本身的抗氧化能力時，便會形成氧化性壓力(oxidative stress)而導致皮膚細胞或組織的氧化性損害，甚至進而誘發發炎反應。

纖維母細胞(fibroblast)主要位於結締組織(connective tissue)中，為合成細胞外基質(extracellular matrix, ECM)[含有膠原蛋白(collagen)與彈性蛋白(elastin)等結構蛋白(structural protein)、透明質酸(hyaluronic acid)以及蛋白多糖(proteoglycan)]的細胞，而在傷口癒合(wound-healing)以及血管新生(angiogenesis)等方面扮演重要的角色。此外，經研究發現，纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)以及轉變生長因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)等蛋白質具有促進纖維母細胞增生以及促進膠原蛋白合成的效用。而當這些生長因子的分泌量隨著年齡的增長而減少時，會導致皮膚中的膠原蛋白、彈性蛋白與透明質酸逐漸流失(亦即它們的合成速度不及其降解的速度)，以及纖維母細胞數量變少[例如凋亡(apoptosis)]，進而產生皮膚萎縮(skin atrophy)、皮膚彈性(skin elasticity)變差、皮膚質地(skin texture)變粗糙、皮膚保水力(skin water-holding capacity)變差以及皺紋產生(wrinkle formation)等皮膚老化(skin aging)的情形。因此，目前臨床上已有利用纖維母細胞來促進皮膚再生(skin regeneration)，並且達到皮膚修復(skin repair)以及抗老化(antiaging)的效用。

益生菌(probiotics)是一群可改善腸道菌相(intestinal microflora)以及腸道免疫(intestinal immunity)的微生物。益生菌已被廣泛地應用於食品與保健品中，目前常用的益生菌包括：乳桿菌屬( Lactobacillus)、雙歧桿菌屬( Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、腸球菌屬( Enterococcus)、酵母菌屬( Saccharomyces)、鏈球菌屬( Streptococcus)等。

儘管益生菌對人體或動物的健康具有上述益處，但是益生菌在口服後會容易遭受到胃酸的破壞，而導致其無法在腸道發揮預期的功效。另外，益生菌是一種活的微生物食品成分(live microbial food ingredient)，因此由益生菌所製成的食品與保健品也存在有不易保存的問題。

近年來的研究發現，去活的益生菌(non-viable probiotics)以及益生菌的溶胞產物(lysate)、提取產物或分離部分[被稱為後生元(postbiotics)]具有相近於益生菌的功效，並且相較於益生菌具有更高的胃酸耐受性且更易於保存。後生元的功效被認為是來自於益生菌的細胞壁成分，其主要含有肽聚醣(peptidoglycan)、磷壁酸(teichoic acid)、脂壁酸(lipoteichoic acid)、多醣類(polysaccharide)以及蛋白質(protein)等成分。目前已有許多方法可供用於從益生菌的細胞壁中提取出後生元，但是這些方法普遍存在有提取效率不佳的問題。因此，本領域中仍然存在有一需要去發展能有效地提取出後生元的方法以滿足產業界所需。

經研究，申請人意外地發現：依據本發明方法所製得的後生元提取物能夠有效地促進人類纖維母細胞增生以及分泌抗發炎激素，而被預期能夠應用於促進皮膚再生與抗老化(antiaging)。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種後生元提取物(postbiotics extract)供應用於製備一用來促進皮膚再生(skin regeneration)之組成物的用途，其中，該後生元提取物是藉由一包含下列步驟的方法而被製得： 提供一第一物質以及一第二物質，其中該第一物質具有一範圍落在pH 1至pH 6內的第一等電點(first isoelectric point)，該第二物質具有一範圍落在pH 4至pH 8內且高於該第一等電點的第二等電點(second isoelectric point)，該第二等電點與該第一等電點具有一落在0.5至3之間的pH差值； 令該第一物質以及一益生菌混合於一具有一高於該第二等電點之pH值的水中，而得到一混合物； 將該第二物質添加至該混合物中，繼而調整該混合物的pH值，而使得該混合物的pH值落在該第一等電點與該第二等電點之間，而使得沉澱物被形成；以及 將該沉澱物拿來進行一細胞壁分離提取處理(cell wall isolation and extraction treatment)，藉此而得到該後生元提取物。

在第二個方面，本發明亦提供一種促進皮膚再生的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以如上所述的後生元提取物。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在本發明中，申請人藉由實驗而發現：本發明的方法能夠有效地從益生菌細胞壁中提取出後生元(postbiotics)，且所製得的後生元提取物包含有較多含蛋白質的細胞組分。此外，該後生元提取物具有促進人類纖維母細胞增生以及分泌轉變生長因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)之效用，因而被預期能夠用來促進皮膚再生(skin regeneration)與抗老化(antiaging)。

於是，本發明提供一種後生元提取物供應用於製備一用來促進皮膚再生之組成物的用途，其中，該後生元提取物是藉由一包含下列步驟的方法而被製得： 提供一第一物質以及一第二物質，其中該第一物質具有一範圍落在pH 1至pH 6內的第一等電點，該第二物質具有一範圍落在pH 4至pH 8內且高於該第一等電點的第二等電點，該第二等電點與該第一等電點具有一落在0.5至3之間的pH差值； 令該第一物質以及一益生菌混合於一具有一高於該第二等電點之pH值的水中，而得到一混合物； 將該第二物質添加至該混合物中，繼而調整該混合物的pH值，而使得該混合物的pH值落在該第一等電點與該第二等電點之間，而使得沉澱物被形成；以及 將該沉澱物拿來進行一細胞壁分離提取處理，藉此而得到該後生元提取物。

如本文中所使用的，術語“皮膚再生(skin regeneration)”、“皮膚再生(skin renewal)”與“皮膚回春(skin rejuvenation)”可被交換地使用。

依據本發明，該益生菌是選自於由下列所構成之群組：芽孢桿菌屬物種( Bacillusspp.)、鏈球菌屬物種( Streptococcusspp.)、乳球菌屬物種( Lactococcusspp.)、營養缺陷菌屬物種( Abiotrophiaspp.)、氣球菌屬物種( Aerococcusspp.)、肉食桿菌屬物種( Carnobacteriumspp.)、腸球菌屬物種( Enterococcusspp.)、乳桿菌屬物種( Lactobacillusspp.)、腸膜明串珠菌屬物種( Leuconostocspp.)、酒球菌屬物種( Oenococcusspp.)、小球菌屬物種( Pediococcusspp.)、四聯球菌屬物種( Tetragenococcusspp.)、徘徊球菌屬物種( Vagococcusspp.)、魏斯氏菌屬物種( Weissellaspp.)、雙歧桿菌屬物種( Bifidobacteriumspp.)、酵母菌屬物種( Saccharomycesspp.)、克魯維酵母菌屬物種( Kluyveromycesspp.)、葡萄球菌屬物種( Staphylococcusspp.)、片球菌屬物種( Pediococcusspp.)、丙酸桿菌屬物種( Propionibacteriumspp.)，以及它們的組合。

較佳地，該益生菌是選自於由下列所構成之群組中的乳桿菌屬物種：植物乳桿菌( Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳桿菌( Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌( Lactobacillus casei)、鼠李糖乳桿菌( Lactobacillus rhamnosus)、副乾酪乳桿菌( Lactobacillus paracasei)，以及它們的組合。

較佳地，該益生菌是選自於由下列所構成之群組中的雙歧桿菌屬物種：兩歧雙歧桿菌( Bifidobacterium bifidum)、乳雙歧桿菌( Bifidobacterium lactis)、長雙歧桿菌( Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌( Bifidobacterium breve)、動物雙歧桿菌( Bifidobacterium animalis)，以及它們的組合。

較佳地，該益生菌是選自於由下列所構成之群組中的芽孢桿菌屬物種：凝結芽孢桿菌( Bacillus coagulans)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、克勞氏芽孢桿菌( Bacillus clausii)，以及它們的組合。

依據本發明，該益生菌可以是活菌或死菌、經濃縮的(concentrated)或未經濃縮的(non-concentrated)、液態(liquid)、糊狀(paste)、半固態(semi-solid)，或固態(solid)[例如，丸(pellet)、細顆粒(granule)或粉末(powder)]，並且可以是經熱去活的(heat-inactivated)、經冷凍的(frozen)、經乾燥的(dried)，或經冷凍-乾燥的(freeze-dried)[例如，可呈冷凍乾燥形式或噴霧/流化床乾燥(spray/fluid bed dried)形式]。在本發明的一個較佳具體例中，該益生菌是經熱去活並呈經噴霧乾燥的粉末形式。

依據本發明，該益生菌的熱去活可以藉由在60-140℃下加熱歷時1秒鐘至30分鐘來進行。在本發明的一個較佳具體例中，該益生菌的熱去活是在73±2℃下加熱歷時15秒來進行。

依據本發明，該第一物質是選自於由下列所構成之群組：脫脂乳粉(nonfat dry milk)、酪蛋白(casein)、乳清蛋白(whey protein)、大豆蛋白(soybean protein)、豌豆蛋白(pea protein)、雞蛋蛋白(egg protein)、米蛋白(rice protein)、水解蛋白(hydrolyzed protein)、玉米蛋白(corn protein)、小麥蛋白(wheat protein)、大麥蛋白(barley protein)、支鏈胺基酸(branched chain amino acid)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、胺基酸(amino acid)、幾丁聚醣(chitosan)、幾丁質(chitin)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該第一物質是乳清蛋白。

依據本發明，該第二物質是選自於由下列所構成之群組：海藻酸鈉(sodium alginate)、洋菜膠(agar)、鹿角菜膠(carrageenan)、果膠(pectin)、阿拉伯膠(arabic gum)、三仙膠(xanthan gum)、刺槐豆膠(locust bean gum)、澱粉(starch)[例如修飾澱粉(modified starch)]、海藻糖(fucose)、糊精(dextrin)[例如抗性糊精(resistant maltodextrin)]、糖漿(syrup)、關華豆膠(guar gum)、魔芋精粉(konjac powder)、植物纖維(vegetable fiber)、合成纖維(synthetic fiber)、半合成纖維(semi-synthetic fiber)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該第二物質是糊精。

在本發明的一個較佳具體例中，該第二等電點與該第一等電點具有一為0.8的pH差值。

依據本發明，該沉澱物可藉由一選自於由下列所構成之群組中的固液分離(solid-liquid separation)處理來進行收取：離心、過濾、重力沉降(gravity settling)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固液分離處理是過濾。

如本文中所使用的，術語“細胞壁分離提取(cell wall isolation and extraction)”與“細胞壁萃取(cell wall extraction)”可被交換地使用，並且意指從細胞壁的組成部分中分離出(separated)原本存在於其上之一細胞壁組分(cell wall component)或一微生物代謝物(microbial metabolite)。

依據本發明，細胞壁分離提取的操作程序與條件可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行，例如，酸醇法(acid alcohol method)。在此方面，可以參考，例如，Pei-Jun Tian et al. (2015), Int. J. Mol. Sci., 16 (8): 20033–20049。

依據本發明，該組成物可進一步包含有任何已知有利於皮膚的保健物質(healthcare material)，這包括，但不限於：透明質酸(hyaluronic acid)、透明質酸鈉(sodium hyaluronate)、維生素C (vitamin C)、葡萄糖胺(glucosamine)、軟骨素(chondroitin)、第一型膠原蛋白(type I collagen)、第二型膠原蛋白(type II collagen)、第三型膠原蛋白(type III collagen)、魚皮魚鱗膠原蛋白(fish skin and fish scale collagen)、非變性第二型膠原蛋白(undenatured type II collagen)、豬膠原蛋白(porcine collagen)、牛膠原蛋白(bovine collagen)、唾液酸(sialic acid)、花青素(anthocyanin)、多酚(polyphenol)、類黃酮(flavonoid)，以及蛋殼膜(egg shell membrane)。

依據本發明，該組成物可以是藥學組成物(pharmaceutical composition)或食物組成物(food composition)，並且在形式上沒有特別的限制，所以該組成物能夠以一製劑的形式來被使用，諸如，無菌的粉末(aseptic powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、凝膠(jelly)等等，這些能夠藉由公眾所熟知的方法而被適當地製備。

依據本發明，當該組成物是藥學組成物，該藥學組成物可利用熟習此項技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道投藥(parenteral administration)、口服投藥(oral administration)或局部投藥(topical administration)之劑型(dosage form)。

依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、充填劑(filler)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學組成物亦可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的藥學組成物與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普 ^®941 (carbopol ^®941)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，當該組成物是食物組成物，該食物組成物可使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被添加至一可食性材料(edible material)中，例如，它可直接地被添加至可食性材料內，或者它可被用於製備一中間組成物(intermediate composition)[諸如，食品添加物(food additive)或預混料(premix)]，該中間組成物隨後被添加至可食性材料內。

依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：發酵食品(fermented food)、加工食品(processed food)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

依據本發明，該食品產品可進一步包含有一被廣泛地使用於食品製造技術的食品添加物，這包括，但不限於：澱粉(starch)、糊精(dextrin)、乳糖(lactose)、玉米粉(maize flour)、米麵粉(rice flour)、磷酸三鈣(tricalcium phosphate)、二氧化矽(silicon dioxide)、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、碳酸鈣(calcium carbonate)、葡萄糖、蔗糖(sucrose)、果糖(fructose)、糖醇(sugar alcohol)、寡醣(oligosaccharide)、代糖(sugar substitute)、果汁粉(fruit juice powder)、酵母粉(yeast powder)、脫脂乳粉(nonfat dry milk)、酪蛋白(casein)、乳清蛋白(whey protein)、胺基酸(amino acid)、檸檬酸(citric acid)、檸檬酸鹽(citrate)、乳酸(lactic acid)、乳酸鹽(lactate)以及核苷酸(nucleotide)。

本發明亦提供一種促進皮膚再生的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以如上所述的後生元提取物。

依據本發明，該後生元提取物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，該後生元提取物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地、非經腸道地或局部地投藥。 較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗材料： 1.  在下面的實施例中所使用的益生菌菌株是得自於國立中興大學食品暨應用生物科技學系(Department of Food Science and Biotechnology at National Chung Hsing University)的微生物研究室，並且已被整合於下面的表1中。 表1.   各個益生菌菌株

菌屬	菌株
乳桿菌 ( Lactobacillus)	植物乳桿菌CB102 ( Lactobacillus plantarumCB102)
嗜酸乳桿菌JCM1132 ( Lactobacillus acidophilusJCM1132)
乾酪乳桿菌JCM1134 ( Lactobacillus caseiJCM1134)
雙歧桿菌 ( Bifidobacterium)	兩歧雙歧桿菌JCM1255 ( Bifidobacterium bifidumJCM1255)
乳雙歧桿菌JCM10602 ( Bifidobacterium lactisJCM10602)
長雙歧桿菌CB108 ( Bifidobacterium longumCB108)

2.  人類包皮纖維母細胞株(human foreskin fibroblast cell line) Hs68的來源與培養：

在下面實施例中所使用的人類包皮纖維母細胞株Hs68是得自於台灣的財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)。

Hs68細胞被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(Thermo Fisher Scientific)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)]的10 cm培養皿(petri dish)中，並在培養條件被設定為37℃、5% CO ₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，進行繼代培養(subculture)步驟如下：移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.4)來清洗細胞，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以定量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃、5% CO ₂的培養箱中進行培養。 一般實驗方法： 1.  轉變生長因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)的含量測定：

在下面的實施例中，TGF-β含量是依據製造商的操作指南來使用ELISA套組(廠牌為BD Biosciences，貨號為559119)進行酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)而被測定。 實施例 1. 製備本發明之後生元提取物 (postbiotics extract) 實驗方法：

首先，將上面“一般實驗材料”中的植物乳桿菌CB102、嗜酸乳桿菌JCM1132、乾酪乳桿菌JCM1134、兩歧雙歧桿菌JCM1255、乳雙歧桿菌JCM10602以及長雙歧桿菌CB108分別接種至MRS培養基(商品名為BD Difco Lactobacilli MRS Broth，貨號為DF0881-17-5)中，並於37℃環境下培養歷時16小時。接著，使用高溫短時間殺菌法(high temperature short time, HTST)(73±2℃，15秒)來對各個培養物進行熱去活。

接著，經熱去活的各個培養物在25℃下以10,000 rpm進行離心歷時15分鐘，繼而倒除上澄液，所得到的沉澱物(pellets)被拿來進行噴霧乾燥，藉此而得到各個菌株的乾燥菌粉。

各個乾燥菌粉是分別依照下面所示的步驟來進行一前處理：首先，將適量之等電點(isoelectric point)為pH 4.4的乳清蛋白(whey protein)(廠牌為NZMP，貨號為WPC 80)溶解於水中，以配製成濃度為10% (w/v, g/L)的乳清蛋白溶液，繼而以食品級碳酸鈉來將該溶液的pH值調整至7.5。在持續攪拌下，將適量的乾燥菌粉散浮於該溶液中至最終濃度為5% (w/v, g/L)，接著，緩慢地加入適量之等電點為pH 5.2的糊精(dextrin)(廠牌為ZHUCHENG DONGXIAO，貨號為Maltodextrin DE8-10)至濃度為6% (w/v, g/L)，同時緩慢地加入乳酸來將該溶液的pH值調整至約為4.8，當pH為4.8時，乳清蛋白以及糊精會達到電荷中和(charge neutralization)而析出。之後，持續攪拌直到沉澱物不再增加為止。之後，使用一孔徑為25 μm的濾紙來進行過濾以分離並收取沉澱物，繼而將所得到的沉澱物拿來進行噴霧乾燥，藉此而得到經前處理的菌粉。

各個菌株之經前處理的菌粉分別被拿來進行細胞壁分離提取(cell wall isolation and extraction)，其大體上是參考Pei-Jun Tian et al. (2015), Int. J. Mol. Sci., 16 (8): 20033-20049當中所述的方法來進行，並略作修改。簡言之，秤取50 mg之經前處理的菌粉，繼而加入1 mL的10%乳酸(lactic acid)並於80℃的水浴槽中加熱歷時60分鐘。之後，於10,000 g下進行離心歷時15分鐘，然後移除上澄液並加入1 mL之混合溶劑[含有4：10 (v/v)的0.5 M檸檬酸鹽溶液(citrate solution)以及乙醇，pH值為4.6]，繼而靜置隔夜。之後，於10,000 g下進行離心歷時20分鐘，然後移除上澄液並使用95%乙醇來清洗所形成的沉澱物數次，接著置於80℃的乾浴槽中加熱歷時約40分鐘以將乙醇完全移除，藉此而得到本發明之後生元提取物。

另外，各個菌株之未經前處理的菌粉亦被拿來進行相同的細胞壁分離提取處理以獲得後生元提取物(下稱習知的後生元提取物)。 實施例 2. 本發明之後生元提取物的成份分析

依據上面實施例1所得到的習知的後生元提取物以及本發明的後生元提取物被拿來進行下面的提取率的測定(determination of extraction rate)、蛋白質含量的測定(determination of protein content)以及蛋白質電泳分析(protein electrophoresis analysis)。 實驗方法： A. 提取率的測定：

提取率是藉由將上面實施例1中所得到的後生元提取物的重量代入下列公式(I)中而被計算出： 公式 (I) ： A ＝ B/50×100其中，A＝提取率(%) B＝後生元提取物之重量(mg) B. 蛋白質含量的測定：

蛋白質含量的測定是藉由將上面實施例1中所得到的後生元提取物溶解於磷酸緩衝溶液(含有8 g/L的NaCl、0.2 g/L的KCl、1.44 g/L的Na ₂HPO ₄以及0.24 g/L的KH ₂PO ₄，pH值為6.2)中並且依據製造商的操作指南使用Pierce™ BCA蛋白質分析套組(Pierce™ BCA Protein Assay Kit)(廠牌為Thermo Scientific，貨號為23225)來進行。 C. 蛋白質電泳分析：

對上面實施例1中所得到的後生元提取物各取1 g並分別溶解於20 mL的水中，接著使用Bio-Rad電泳系統並採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析。 結果： A. 提取率的測定：

下面表2顯示依據本發明之含前處理的方法的提取率以及不含前處理的習知方法所具者。 表2.   依據本發明的方法與習知方法的提取率

菌株	提取率
本發明	習知
植物乳桿菌CB102	43.34%	21.40%
嗜酸乳桿菌JCM1132	44.14%	20.54%
乾酪乳桿菌JCM1134	43.94%	21.11%
兩歧雙歧桿菌JCM1255	30.97%	15.44%
乳雙歧桿菌JCM10602	31.24%	15.83%
長雙歧桿菌CB108	31.82%	16.75%

從表2可見，相較於習知方法，依據本發明的方法，將經前處理的菌粉拿來進行細胞壁分離提取可以獲得較高的後生元提取物之提取率。 B. 蛋白質含量的測定：

下面表3顯示依據本發明的方法與習知方法所得到的後生元提取物之蛋白質含量。 表3.  依據本發明的方法與習知方法所得到的後生元提取物之蛋白質含量

菌株	蛋白質含量
本發明	習知
植物乳桿菌CB102	0.39%	0.20%
嗜酸乳桿菌JCM1132	0.41%	0.21%
乾酪乳桿菌JCM1134	0.40%	0.20%
兩歧雙歧桿菌JCM1255	1.40%	0.69%
乳雙歧桿菌JCM10602	1.38%	0.67%
長雙歧桿菌CB108	1.35%	0.70%

從表3可見，本發明的後生元提取物中的蛋白質含量是明顯高於習知的後生元提取物所具者。 C. 蛋白質電泳分析：

圖1是一電泳膠片圖，它顯示本發明的後生元提取物與習知的後生元提取物的蛋白質電泳分析結果。從圖1可見，本發明的後生元提取物的蛋白質帶(protein band)是明顯多於習知的後生元提取物所具者。申請人據此而認為，依據本發明的方法所得到的後生元提取物含有較多的細胞壁成分，例如肽聚醣(peptidoglycan)、脂壁酸(lipoteichoic acid)、磷壁酸(teichoic acid)、醣蛋白(glycoprotein)以及蛋白聚醣(proteoglycan)等。

綜合以上的實驗結果可發現，本發明的方法能夠有效地從益生菌的細胞壁中提取出後生元提取物，並且由此所得到的後生元提取物含有較多的細胞壁蛋白質(cell wall protein)。 實施例 3. 本發明之後生元提取物在促進皮膚再生 (skin regeneration) 上的效用評估

在本實施例中，依據上面實施例1所得到的本發明的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物與習知的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物分別被拿來處理Hs68細胞，並藉由測量經處理後的Hs68細胞的TGF-β分泌量以及細胞增生數量來評估本發明之後生元提取物在促進皮膚再生上的效用。另外，申請人進一步評估本發明之後生元提取物與已知能應用於皮膚保健之市售保健物質的組合使用對於此效用的影響。 實驗材料： 1.  在本實施例中所使用的保健物質是購自於創百股份有限公司(Chambio Co., Ltd.)。有關該等保健物質的種類及其商品名已被整合於下面的表4中。 表4.   各個保健物質的種類及其商品名

保健物質種類	商品名
透明質酸鈉	Rooster comb extract
維生素C	Vitamin C
葡萄糖胺	Glucosamine
軟骨素	Chondroitin
第二型膠原蛋白	BC Collagen II
魚皮魚鱗膠原蛋白	activColla
非變性第二型膠原蛋白	Non-denatured type II collagen

實驗方法： A. 後生元提取物對於 Hs68 細胞的 TGF-β 分泌量之影響：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項來進行繼代培養的Hs68細胞分成25組，其中包括1個對照組、12個比較實驗組(亦即比較實驗組L-1至L-6以及比較實驗組B-1至B-6)以及12個實驗組(亦即實驗組L-1至L-6以及實驗組B-1至B-6)。將各組的Hs68細胞以一為1×10 ⁴細胞/井的數量分別培養於含有200 μL的DMEM培養基的96-井培養盤的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，並依據下面表5所示者，將依據上面實施例1所得到的本發明的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物與習知的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物分別添加至各組中。 表5.   各組培養物所具有之後生元提取物的最終濃度

組別	提取物	最終濃度(mg/L)
對照組	－	0
比較實驗組L-1	習知的植物乳桿菌的後生元提取物	5
比較實驗組L-2	12.5
比較實驗組L-3	25
比較實驗組L-4	50
比較實驗組L-5	100
比較實驗組L-6	200
實驗組L-1	本發明的植物乳桿菌的後生元提取物	5
實驗組L-2	12.5
實驗組L-3	25
實驗組L-4	50
實驗組L-5	100
實驗組L-6	200
比較實驗組B-1	習知的長雙歧桿菌的後生元提取物	5
比較實驗組B-2	12.5
比較實驗組B-3	25
比較實驗組B-4	50
比較實驗組B-5	100
比較實驗組B-6	200
實驗組B-1	本發明的長雙歧桿菌的後生元提取物	5
實驗組B-2	12.5
實驗組B-3	25
實驗組B-4	50
實驗組B-5	100
實驗組B-6	200

各組培養物在37℃的條件下培養歷時24小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「TGF-β的含量測定」當中所述的方法來測定TGF-β的含量。 B. 後生元提取物與其他保健物質的組合使用對於 Hs68 細胞的 TGF-β 分泌量之影響：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項來進行繼代培養的Hs68細胞分成28組，其中包括14個比較實驗組(亦即1X比較實驗組1至7以及2X比較實驗組1至7)以及14個實驗組(亦即實驗組1-L至7-L以及實驗組1-B至7-B)。將各組的Hs68細胞以一為1×10 ⁴細胞/井的數量分別培養於含有200 μL的DMEM培養基的96-井培養盤的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，並依據下面表6所示者，將上面“實驗材料”的第1項中的7種保健物質以及依據上面實施例1所得到的本發明的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物分別添加至各組中。 表6.   各組培養物所具有之後生元提取物或保健物質的最終濃度

組別	保健物質(mg/L)	本發明的植物乳桿菌的後生元提取物(mg/L)	本發明的長雙歧桿菌的後生元提取物 (mg/L)
1X比較實驗組1	透明質酸鈉	100	－	－
2X比較實驗組1	200	－	－
實驗組1-L	100	100	－
實驗組1-B	100	－	100
1X比較實驗組2	維生素Ｃ	100	－	－
2X比較實驗組2	200	－	－
實驗組2-L	100	100	－
實驗組2-B	100	－	100
1X比較實驗組3	葡萄糖胺	100	－	－
2X比較實驗組3	200	－	－
實驗組3-L	100	100	－
實驗組3-B	100	－	100
1X比較實驗組4	軟骨素	100	－	－
2X比較實驗組4	200	－	－
實驗組4-L	100	100	－
實驗組4-B	100	－	100
1X比較實驗組5	第二型膠原蛋白	100	－	－
2X比較實驗組5	200	－	－
實驗組5-L	100	100	－
實驗組5-B	100	－	100
1X比較實驗組6	魚皮魚鱗膠原蛋白	100	－	－
2X比較實驗組6	200	－	－
實驗組6-L	100	100	－
實驗組6-B	100	－	100
1X比較實驗組7	非變性第二型膠原蛋白	100	－	－
2X比較實驗組7	200	－	－
實驗組7-L	100	100	－
實驗組7-B	100	－	100

各組培養物在37℃的條件下培養歷時24小時之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「TGF-β的含量測定」當中所述的方法來測定TGF-β的含量。 C. 後生元提取物對於 Hs68 細胞的細胞增生 (proliferation) 之影響：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項來進行繼代培養的Hs68細胞分成3組，其中包括1個對照組以及2個實驗組(亦即實驗組L以及實驗組B)。將各組的Hs68細胞以一為1×10 ⁴細胞/井的數量分別培養於含有200 μL的DMEM培養基的96-井培養盤的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，並依據下面表7所示者，將依據上面實施例1所得到的本發明的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物分別添加至各組中。 表7.   各組培養物所具有之後生元提取物的最終濃度

組別	提取物	最終濃度(mg/L)
對照組	－	0
實驗組L	本發明的植物乳桿菌的後生元提取物	100
實驗組B	本發明的長雙歧桿菌的後生元提取物	100

各組培養物在37℃的條件下培養歷時24小時之後，繼而計數各井中的Hs68細胞之細胞數。 D. 後生元提取物與其他保健物質的組合使用對於 Hs68 細胞的細胞增生之影響：

首先，將依據上面“一般實驗材料”的第2項來進行繼代培養的Hs68細胞分成28組，其中包括14個比較實驗組(亦即1X比較實驗組1至7以及2X比較實驗組1至7)以及14個實驗組(亦即實驗組1-L至7-L以及實驗組1-B至7-B)。將各組的Hs68細胞以一為1×10 ⁴細胞/井的數量分別培養於含有200 μL的DMEM培養基的96-井培養盤的各井中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。接著，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的培養基，並依據上面表6所示者，將上面“實驗材料”的第1項中的7種保健物質以及依據上面實施例1所得到的本發明的植物乳桿菌以及長雙歧桿菌的後生元提取物分別添加至各組中。

各組培養物在37℃的條件下培養歷時24小時之後，計數各井中的Hs68細胞之細胞數，然後計算出相對於對應的1X比較實驗組所具者的倍數。 結果： A. 後生元提取物對於 Hs68 細胞的 TGF-β 分泌量之影響：

下面的表8顯示各組培養物所測得的TGF-β含量。 表8.   各組培養物的TGF-β含量

組別	TGF-β (pg/mL)	組別	TGF-β (pg/mL)
對照組	10.5	比較實驗組B-1	12.1
比較實驗組L-1	10.4	比較實驗組B-2	28.2
比較實驗組L-2	21.6	比較實驗組B-3	67.4
比較實驗組L-3	42.6	比較實驗組B-4	79.1
比較實驗組L-4	76.4	比較實驗組B-5	86.8
比較實驗組L-5	88.5	比較實驗組B-6	97.6
比較實驗組L-6	88.7	實驗組B-1	20.7
實驗組L-1	20.8	實驗組B-2	43.7
實驗組L-2	40.9	實驗組B-3	98.2
實驗組L-3	73.5	實驗組B-4	156.3
實驗組L-4	123.1	實驗組B-5	199.9
實驗組L-5	154.5	實驗組B-6	200.3
實驗組L-6	156.7

從表8可見，本發明的植物乳桿菌的後生元提取物對於Hs68細胞的TGF-β分泌量之促進效用是明顯優於習知的植物乳桿菌的後生元提取物所具者。此外，本發明的長雙歧桿菌的後生元提取物亦展現類似的優異效用。這個實驗結果顯示：依據本發明的方法所得到的後生元提取物能有效地促進Hs68細胞分泌TGF-β。 B. 後生元提取物與其他保健物質的組合使用對於 Hs68 細胞的 TGF-β 分泌量之影響：

下面表9顯示各組培養物的TGF-β含量。 表9.   各組培養物的TGF-β含量

組別	TGF-β (pg/mL)	組別	TGF-β (pg/mL)
1X比較實驗組1	289.9	1X比較實驗組5	178.8
2X比較實驗組1	304.8	2X比較實驗組5	188.7
實驗組1-L	397.7	實驗組5-L	284.2
實驗組1-B	424.1	實驗組5-B	310.6
1X比較實驗組2	52.2	1X比較實驗組6	51.5
2X比較實驗組2	63.1	2X比較實驗組6	61.5
實驗組2-L	154.7	實驗組6-L	155.3
實驗組2-B	181.1	實驗組6-B	181.7
1X比較實驗組3	51.1	1X比較實驗組7	52.1
2X比較實驗組3	61.3	2X比較實驗組7	60.6
實驗組3-L	154.1	實驗組7-L	154.7
實驗組3-B	180.5	實驗組7-B	181.1
1X比較實驗組4	120.5
2X比較實驗組4	128.8
實驗組4-L	224.0
實驗組4-B	250.4

從表9可見，各個實驗組的TGF-β含量皆是明顯高於對應的1X比較實驗組與2X比較實驗組所具者。特別地，各個實驗組相較於對應的1X比較實驗組之提高幅度是顯著高於2X比較實驗組相較於對應的1X比較實驗組之所具者，這表示：使用本發明的後生元提取物來替代等量的保健物質能夠大幅提升保健物質在促進Hs68細胞分泌TGF-β上的效用。 C. 後生元提取物對於 Hs68 細胞的細胞增生之影響：

下面表10顯示各組培養物中的細胞數。 表10. 各組培養物中的細胞數

組別	細胞數(個)
對照組	1.1×10 4
實驗組L	1.7×10 4
實驗組B	2.1×10 4

從表10可見，實驗組L與B的細胞數皆是明顯高於對照組所具者。這個實驗結果顯示：本發明的後生元提取物可以促進Hs68細胞的細胞增生。 D. 後生元提取物與其他保健物質的組合使用對於 Hs68 細胞的細胞增生之影響：

下面表11顯示各組培養物中的細胞增生情形(相對於對應的1X比較實驗組所具者的倍數)。 表11. 各組培養物中的細胞增生情形

組別	倍數*	組別	倍數*
1X比較實驗組1	1.0	1X比較實驗組5	1.0
2X比較實驗組1	1.1	2X比較實驗組5	1.1
實驗組1-L	1.3	實驗組5-L	1.2
實驗組1-B	1.3	實驗組5-B	1.2
1X比較實驗組2	1.0	1X比較實驗組6	1.0
2X比較實驗組2	1.1	2X比較實驗組6	1.1
實驗組2-L	1.5	實驗組6-L	1.4
實驗組2-B	1.5	實驗組6-B	1.4
1X比較實驗組3	1.0	1X比較實驗組7	1.0
2X比較實驗組3	1.1	2X比較實驗組7	1.1
實驗組3-L	1.2	實驗組7-L	1.4
實驗組3-B	1.2	實驗組7-B	1.4
1X比較實驗組4	1.0
2X比較實驗組4	1.1
實驗組4-L	1.3
實驗組4-B	1.3

*：各組的細胞數相對於對應的1X比較實驗組所具者的倍數。

從表11可見，各個實驗組的細胞增生情形是明顯優於對應的1X比較實驗組與2X比較實驗組所具者。特別地，各個實驗組相較於對應的1X比較實驗組之增生幅度是顯著高於2X比較實驗組相較於對應的1X比較實驗組之所具者，這表示：使用本發明的後生元提取物來替代等量的保健物質能夠大幅提升保健物質在促進Hs68細胞的細胞增生上的效用。

綜合以上各項實驗結果可知，本發明的方法能夠有效地從益生菌細胞壁中提取出後生元，且所製得的後生元提取物包含有較多含蛋白質的細胞組分，並且在促進纖維母細胞增生以及分泌抗發炎激素上具有優異的效用。因此，申請人認為：依據本發明的方法所得到的後生元提取物能夠應用於促進皮膚再生，並且具有發展成為皮膚修復、促進皮膚傷口癒合以及抗老化的商品之高潛力。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1是一電泳膠片圖，它顯示本發明的後生元提取物與習知的後生元提取物的蛋白質電泳分析結果。

Claims (4)

1. 一種後生元提取物供應用於製備一用來促進皮膚再生之組成物的用途，其中，該後生元提取物是藉由一包含下列步驟的方法而被製得：提供一第一物質以及一第二物質，其中該第一物質具有一範圍落在pH 1至pH 6內的第一等電點，該第二物質具有一範圍落在pH 4至pH 8內且高於該第一等電點的第二等電點，該第二等電點與該第一等電點具有一落在0.5至3之間的pH差值；令該第一物質以及一益生菌混合於一具有一高於該第二等電點之pH值的水中，而得到一混合物，其中該益生菌是選自於由下列所構成之群組：乳桿菌屬物種、雙歧桿菌屬物種，以及它們的組合；將該第二物質添加至該混合物中，繼而調整該混合物的pH值，而使得該混合物的pH值落在該第一等電點與該第二等電點之間，而使得沉澱物被形成；以及將該沉澱物拿來進行一細胞壁分離提取處理，藉此而得到該後生元提取物。
2. 如請求項1的用途，其中該第一物質是選自於由下列所構成之群組：脫脂乳粉、酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、雞蛋蛋白、米蛋白、水解蛋白、玉米蛋白、小麥蛋白、大麥蛋白、支鏈胺基酸、明膠、膠原蛋白、胺基酸、殼聚醣、殼寡糖，以及它們的組合。
3. 如請求項1的用途，其中該第二物質是選自於由下列所構成之群組：海藻酸鈉、洋菜膠、鹿角菜膠、果膠、阿拉伯膠、三仙膠、刺槐豆膠、澱粉、海藻糖、糊精、糖漿、關華豆膠、魔芋精粉、植物纖維、合成纖維、半合成纖維，以及它們的組合。
4. 如請求項1的用途，其中該組成物進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的保健物質：透明質酸、透明質酸鈉、維生素C、葡萄糖胺、軟骨素、第一型膠原蛋白、第二型膠原蛋白、第三型膠原蛋白、魚皮魚鱗膠原蛋白、非變性第二型膠原蛋白、豬膠原蛋白、牛膠原蛋白、唾液酸、花青素、多酚、類黃酮、蛋殼膜，以及它們的組合。

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