TWI748090B

TWI748090B - 加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用

Info

Publication number: TWI748090B
Application number: TW107114078A
Authority: TW
Inventors: 周一鳴; 藍聖閔; 楊正昌; 李佳龍; 李榮順
Original assignee: 國立成功大學; 和康生物科技股份有限公司
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2021-12-01
Also published as: TW201945010A

Abstract

本發明有關於一種加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用。此複合生物材料是由生物可分解性支持材料以及含浸於生物可分解性支持材料中的透明質酸水溶液所組成，且透明質酸水溶液含有特定分子量範圍之透明質酸。上述複合生物材料具有抗沾黏、抗發炎、生物相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效，可直接施用於急性創傷性周邊神經創傷處。

Description

加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用

本發明是關於一種加速神經創傷復元之生物材料及其應用，特別是一種加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用。

人體神經系統是由中樞神經系統(central nervous system；CNS)以及周邊神經系統(peripheral nervous system；PNS)所組成。相較於中樞神經系統，周邊神經系統遭到損傷的機會較高，但其神經再生能力也較強。周邊神經遭到顯著急性創傷後，往往無法從疼痛、運動無力、感覺喪失中完全恢復。受損的周邊神經軸突可從近端殘肢(proximal stump)處再生，但每天的生長速度只有1至3mm，而且損傷遠端的神經纖維會發生華勒變性(Wallerian degeneration)。軸突的再生潛力以及施旺細胞(Schwann cells)支持功能，也會隨時間下降。

為了要增進周邊神經損傷的再生，須在這段「黃金時間之窗」中，給予最佳的修復介入才能取得最好的恢復結果。橫亙眼前的挑戰仍然艱鉅，有鑑於此，亟需開發一種複合生物材料，以改善修復急性創傷性周邊神經損傷的種種問題。

本發明之一態樣是在提供一種復元急性創傷性周邊神經損傷之複合生物材料，可直接施用於急性創傷性周邊神經創傷處，具有抗沾黏、抗發炎、生物相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效。

本發明之另一態樣係在提供一種加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料，含有特定分子量範圍之透明質酸以及醫藥活性成分，藉此加速急性創傷性周邊神經創傷處的修復再生。

根據本發明之上述態樣，提出一種加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料，其係由生物可分解性支持(support)材料以及含浸於生物可分解性支持材料中的透明質酸水溶液所組成，其特徵在於透明質酸水溶液之透明質酸的分子量介於一定範圍，例如為350kDa至3000kDa。

在上述實施例中，上述透明質酸水溶液之濃度為0.1重量百分比至1.5重量百分比。

在上述實施例中的支持材料具備彈性、多孔隙、生物可分解等特徵，其材料可包括但不限於膠原蛋白、明膠、幾丁質(chitosan)、聚乳酸(poly-_L-lactic acid；PLLA)、聚乳酸羥基乙酸(poly-co-lactic glycotic acid；PLGA)、聚乙醇酸(poly-glycolic acid；PGA)或上述之任意組合。

根據本發明之另一態樣，提出一種加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料，其係由生物可分解性支持材料、透明質酸溶液以及醫藥活性成分所組成，其特徵在於透明質酸水溶液之濃度為0.1重量百分比至1.5重量百分比，且透明質酸水溶液之透明質酸的分子量為350kDa至3000kDa。

在上述實施例中，上述醫藥活性成分係均勻分布於透明質酸水溶液中。

在上述實施例中，上述生物可分解性支持材料之材料可包括但不限於膠原蛋白、明膠、幾丁質(chitosan)、聚乳酸(poly-_L-lactic acid；PLLA)、聚乳酸羥基乙酸(poly-co-lactic glycotic acid；PLGA)、聚乙醇酸(poly-glycolic acid；PGA)或上述之任意組合。

在上述實施例中，上述生物可分解性支持材料之外型為海棉、泡沫棉、薄膜或膠體。

應用本發明之加速急性創傷性周邊神復元經損傷之複合生物材料，其係將生物可分解性支持材料浸於具有特定分子量的透明質酸水溶液中，所得之複合生物材料可直接施用於急性創傷性周邊神經創傷處，具有抗沾黏、抗發炎、生體相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效。

101‧‧‧坐骨神經

103/105‧‧‧箭頭

107‧‧‧受損處

111/113‧‧‧泡沫棉

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：

〔圖1A〕至〔圖1B〕係繪示根據本發明一實施例之大鼠坐骨神經軸突斷傷手術的簡單示意圖。

〔圖2〕為繪示根據本發明一實施例之大鼠坐骨神經在手術前後及處理前後的SSEP圖。

〔圖3A〕至〔圖3D〕係分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖3A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖3B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖3C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖3D)的坐骨神經切片之髓鞘(myelin)組織染色照片。

〔圖4〕係繪示根據本發明一實施例之假手術對照側、坐骨神經軸突斷傷組、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組之軸突密度柱狀圖。

〔圖5A〕至〔圖5D〕係分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖5A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖5B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖5C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖5D)之神經組織切片的神經纖維蛋白 (neurofilament)免疫螢光染色照片。

〔圖6A〕至〔圖6D〕係分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖6A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖6B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖6C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖6D)之神經組織切片的介白素一號乙型(IL-1β)之免疫螢光染色照片。

〔圖7A〕至〔圖7D〕係分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖7A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖7B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖7C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖7D)之神經組織切片的腫瘤壞死因子甲型(TNF-α)之免疫螢光染色照片。

承前所述，本發明提供一種加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用，其係由生物可分解性支持材料以及含浸於生物可分解性支持材料中的透明質酸水溶液所組成，且透明質酸水溶液含有特定分子量範圍之透明質酸。

申言之，急性創傷性周邊神經損傷(acute traumatic peripheral nerve injury)根據其嚴重程度，一般可分為神經失用症(neurapraxia)、神經軸突斷傷(axonotmesis)及神經斷裂(neurotmesis)。本發明此處所稱之急性創傷性周邊神經損傷，係指周邊神經軸突斷傷(axonotmesis)或神經斷裂(neurotmesis)，也就是因急性創傷，導致周邊神經軸突或者周邊神經的損傷或斷裂。周邊神經軸突斷傷(axonotmesis)後，軸突斷裂，損傷遠端的神經纖維發生華勒變性且喪失鞘膜，損傷近端的神經纖維之神經鞘膜尚保持完整。

本發明之複合生物材料可加速上述急性創傷性周邊神經損傷復元，具有抗沾黏、抗發炎、生體相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效。在一實施例中，本發明此處所稱之複合生物材料，係指由生物可分解性支持材料以及含浸於生物可分解性支持材料中的透明質酸水溶液所組成。

本發明此處所指之透明質酸是由β-葡萄醣醛酸鍵連接在一起的D-葡萄醣醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖的重複單元組成。透明質酸分布在不同組織的細胞外基質中，例如皮膚、臍帶、滑液或玻璃體液。一般而言，透明質酸在血管生成，廣泛參與在纖維化、發炎反應及癌症促進過程中。越來越多的證據顯示不同分子量的透明質酸具有不同的細胞和生理作用。

在一實施例中，本發明的複合生物材料所含的透明質酸水溶液之體積不拘，端視生物可分解性支持材料的材料及尺寸而定。大體而言，生物可分解性支持材料的厚度越厚及/或內部空間越多，則每平方公分之生物可分解性支持材料所含的透明質酸水溶液的體積就越多。以厚度約 3mm之生物可分解性支持材料為例，每平方公分之生物可分解性支持材料約含有0.3毫升之透明質酸水溶液，且透明質酸水溶液之透明質酸的分子量可例如為350kDa至3000kDa。在一例示中，透明質酸水溶液之透明質酸的分子量為3000kDa，由此所得之複合生物材料加速急性創傷性周邊神經損傷復元的效果更佳。

在一實施例中，上述透明質酸水溶液之濃度為0.1重量百分比至1.5重量百分比。

在另一實施例中，此處所稱之複合生物材料，係指由生物可分解性支持材料、透明質酸溶液以及醫藥活性成分所組成。本發明之技術特徵之一在於，透明質酸水溶液之濃度為0.1重量百分比至1.5重量百分比，且透明質酸水溶液之透明質酸的分子量為350kDa至3000kDa。值得留意的是，不同分子量的透明質酸會影響神經傷口發炎的程度，倘若使用上述分子量以外之透明質酸，無法預期由此所得之複合生物材料能具有抗沾黏、抗發炎、生體相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效。

在上述實施例中，上述生物可分解性支持材料之材料可包含但不限於膠原蛋白、明膠、幾丁質(chitosan)、聚乳酸(poly-_L-lactic acid；PLLA)、聚乳酸羥基乙酸(poly-co-lactic glycotic acid；PLGA)、聚乙醇酸(poly-glycolic acid；PGA)或上述之任意組合。在上述實施例中，上述生物可分解性支持材料之外型不拘，可例如為海棉、泡沫棉、薄膜或膠體等。

上述複合生物材料可視需求添加醫藥活性成分。基於透明質酸為水溶性，前述醫藥活性成分以水溶性為宜。在上述實施例中，上述醫藥活性成分係均勻分布於透明質酸水溶液中，以進一步增進抗沾黏、抗發炎、生物相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例

1.建立動物實驗模式

此實施例的動物實驗是根據國立成功大學醫學烷實驗動物照護與使用委員會頒布的實驗動物管理指南進行。此實施例使用體重400公克至450公克的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠進行評估神經再生的效果，以排除不同性別之間的差異。所有實驗動物飼養在21°C±0.5℃、12小時切換光暗循環(早上7點開燈)的環境，飼養期間不限制飼料及水的供應。

進行實驗前，大鼠以50毫克/公斤(mg kg^-1)劑量之Zoletil® 50(含有Tiletamine及Zolazepam)經腹腔注射方式進行麻醉。在麻醉過程中，如有需要，可注射戊巴比妥(pentobarbital)以維持適當的麻醉深度。

請參閱圖1A及圖1B，其係繪示根據本發明一實施例之大鼠坐骨神經軸突斷傷手術的簡單示意圖。請參閱圖1A，在麻醉後，從左側坐骨切口(left sciatic notch)至遠端大腿(distal thigh)作出切口。接著，直接切開皮下組織，暴露出股二頭肌(biceps femoris muscle)，並找出其封套筋膜中的坐骨神經(sciatic nerve)。所有大鼠左側坐骨神經101利用止血夾以箭頭103與箭頭105的方向局部施壓5分鐘，使施壓處的坐骨神經產生軸突斷傷(axonotmesis)之受損處107，如圖1A所示。

然後，將二塊含浸0.3mL處理劑(實驗組)或生理食鹽水(控制組)之泡沫棉(Gelfoam，大小0.6*1.0cm²，厚度約3mm；Pharmacia-Upjohn,Kalamazoo,MI)111及泡沫棉113，分別放在坐骨神經101的受損處107之下方及上方，如圖1B所示。術後8週，犧牲所有大鼠。

上述實驗組共6組，其中不同分子量(350kDa、3000kDa)及不同濃度(0.1% w/w、0.5% w/w、1.5% w/w)的透明質酸(hyaluronan；HA；Maxigen,New Taipei City,Taiwan)溶液作為處理劑，而泡沫棉分別含浸0.3mL上述不同分子量及不同濃度的透明質酸溶液，以進行評估。

控制組大鼠坐骨神經101的受損處107之下方及上方則分別放置含浸0.3mL生理食鹽水之泡沫棉111及泡沫棉113。

另外，所有大鼠右側進行假手術(sham operation)，即右側坐骨神經除了不給予神經傷害處置外，其他予以完全相同之處理。

2.評估體感覺誘發電位(somatosensory-evoked potential；SSEP)

此實施例係評估上述大鼠坐骨神經的體感覺誘發電位(somatosensory-evoked potential；SSEP)。電刺激模式為重複50次的方波脈衝，每次的方波脈衝在極限下強度的持續時間為0.2秒(s)。透過皮下針電極刺激踝內側的脛神經，以誘發SSEP。將雙極針電極置於胸腰交界處之椎間韌帶，並於相對高度處於皮下插入參考電極。上述訊號匯集並顯示於信號平均器(signal averager；MS-230B,Nihon Kohden Co.,Tokyo,Japan)上。每次刺激的記錄時間為20毫秒(ms)。利用帶通濾波器(bandpass filter)僅允許50赫茲(Hz)至5000Hz的信號通過。在實驗過程中，利用加熱毯使大鼠維持體溫在38℃至39℃之間。在術前、處理術後隨即、處理後15分鐘、30分鐘、2週、4週、6週、8週，分別測量實驗肢SSEP數據，同時測量上述假手術右後肢的數據。波幅是測量第一個正波峰與接續的負波峰的差值，而延遲期間(latency)則是測量電刺激假影訊號的開始至初始正波峰值。波幅與延遲期間二者經測量後，以左側數值(處理組)與右側數值(假手術對照側)之比率表示。每2週一直到第8週，大鼠接受神經行為檢查後，進行SSEP記錄，以檢測電神經功能的後期不良影響，其結果如表1、表 2及圖2所示。

請參閱表1、表2及圖2。表1為根據本發明一實施例之大鼠坐骨神經在手術處理前後的SSEP延遲期間相對變化。表2為根據本發明一實施例之大鼠坐骨神經在手術處理前後的SSEP振幅相對變化。圖2之繪示為根據本發明一實施例之大鼠坐骨神經在手術前後及處理前後的SSEP圖，其中左側為利用含浸0.3mL之0.1% w/w的透明質酸(分子量350kDa)溶液的泡沫棉的處理組，右側為假手術對照側。在處理前，左右兩側基線紀錄的SSEP波型的振幅處有一個明顯的波峰。SSEP的振幅為176mV至281mV(平均值203mV)，初始波峰的延遲期間為1.64至2.25毫秒(ms；平均值2.00ms)。在術前，所有大鼠的後肢左側坐骨神經(實驗組)及右側坐骨神經(假手術對照側)在各時間點的延遲期間及振幅等數據，並無顯著差異。在軸突斷傷手術後，所有大鼠的後肢左側(實驗組)的振幅及延遲期間急遽變化，在之後的6週內有不同程度的改善，其正常神經及斷傷神經的SSEP的時間歷程記錄如圖2所示。

如表1、表2及圖2所示，在控制組大鼠中，其左側坐骨神經(進行軸突斷傷實驗的那一側)沒有利用透明質酸處理，在延遲期間及振幅等恢復的進展皆不佳。然而，不論是否利用各種濃度及分子量的透明質酸處理的大鼠，在處理後15分鐘，即開始出現程度不同的電生理變化。

由表1之SSEP延遲期間變化的結果可知，利用含浸0.1% w/w 3000kDa、0.5% w/w 3000kDa、1.5% w/w 3000kDa、0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理的組別，其恢復進展相似且較快。利用含浸0.5% w/w 350kDa及1.5% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理的組別，其恢復進展則較遲緩。在處理後8週，所有以透明質酸處理的實驗組之延遲期間的恢復程度相當。

由表2之SSEP振幅變化的結果可知，恢復過程中的振幅(amplitude)變化比延遲(latency)變化更為顯著。在處理後8週，利用含浸0.1% w/w 3000kDa、0.5% w/w 3000kDa、1.5% w/w 3000kDa、0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理的組別，其恢復進展相似且較快。利用含浸0.5% w/w 350kDa及1.5% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理的組別，其恢復效果不佳，與控制組相近。

3.神經行為檢查

在坐骨神經軸突斷傷手術後每2週，藉由大鼠步行足跡分析評估每隻大鼠的神經行為功能。大鼠沿著8.2*42cm²的通道朝下走，通道的一端通往暗室，暗室底部有一張白紙。每隻大鼠後腳底部塗上壓克力染料，以獲得每隻大鼠的後肢足印。上述後肢足印的圖案根據下式(I)計算後，獲得坐骨神經指數(sciatic function index；SFI)，其結果如表3所示。

在式(I)中，E代表實驗側，N代表正常側，TS代表第1至5趾張開寬度，PL代表腳掌縱向長度。式(I)係參閱Inserra MM等人在1998年於期刊Microsurgery第18卷第2期第119-124頁發表之「Functional indices for sciatic,peroneal,and posterior tibial nerve lesions in the mouse」一文，在此列為參考文獻。

表3中，神經行為功能藉由坐骨神經指數(SFI)評估，正常範圍為+11至-11。如表3結果所示，在處理後8週，利用含浸3000kDa(0.1% w/w、0.5% w/w、1.5% w/w)之透明質酸的泡沫棉處理的組別，其恢復效果優於利用含浸350kDa(0.1% w/w、0.5% w/w、1.5% w/w)之透明質酸的泡沫棉處理的組別，而利用含浸350kDa(0.1% w/w、0.5% w/w、1.5% w/w)之透明質酸的泡沫棉處理的組別則仍有邊緣異常(marginally abnormal)的情況。利用含浸1.5% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理的組別在處理後4週，恢復情況比其他實驗組別還差。控制組在處理後4週的恢復情況是最不佳的。利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理的組別在處理後6週的恢復情況是最佳的。

4.評估髓鞘型態

在第8週結束，大鼠進行完神經行為及最後的電生理試驗後，用過量的異氟烷(isoflurane)進行安樂死。接著，大鼠心臟灌注4%之多聚甲醛。取神經壓砸處之5毫米(mm)近端及遠端的殘肢(stump)，固定在4%之多聚甲醛/4%之戊二醛中至隔夜。以2%四氧化鋨染色2小時後，殘肢樣本以濃度梯度遞增(70%、95%、100%)的乙醇進行脫水並以樹脂包埋。組織包埋塊切成1微米厚的組織切片，以光學顯微鏡(Axio Imager 2；Carl Zeiss Microscopy GmbH,Oberkochen,Germany；200倍放大)下觀察髓鞘。坐骨神經切片中隨機取5個視野。由二名研究人員在盲測的狀況下計算髓鞘型態指數。

在處理後8周，利用四氧化鋨對坐骨神經切片進行組織染色，並在光學顯微鏡鏡檢下觀察，如圖3A至圖3D所示。請參閱圖3A至圖3D，其分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖3A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖3B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖3C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖3D)的坐骨神經切片之髓鞘(myelin)組織染色照片。

如圖3A所示，假手術對照側的坐骨神經髓鞘並未斷傷，切片顯示厚髓鞘包覆著緊密、相對均勻且大直徑的神經纖維。然而，斷傷之坐骨神經纖維，無論未經透明質酸處理(圖3B)或經透明質酸處理(圖3C及圖3D)，其神經纖維均呈現分散、形狀異質不均、直徑較小、髓鞘較薄等情形，如圖3B至圖3D所示。

請參閱圖4，其繪示根據本發明一實施例之假手術對照側、坐骨神經軸突斷傷組、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組之軸突密度柱狀圖，其中軸突密度係以光學顯微鏡放大200倍率的單一視野下之平均軸突數(axons per x200 magnification field)。在圖4中，圖號#代表該組數值相較於假手術對照側，在統計上具有顯著性差異。圖號*代表該組數值相較於利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組，在統計上具有顯著性差異。

經計算圖3A至圖3D之神經組織切片的軸突密度後，結果顯示圖3D之利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組的軸突密度，顯著高於圖3C之利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組的軸突密度，如圖4所示。

5.免疫螢光染色

上述取得的坐骨神經在4℃、4%之多聚甲醛中浸泡至隔夜，以樹脂包埋，利用切片機切成7微米(μm)厚的組織切片，置於玻片上，並覆蓋聚-L-離氨酸(poly-L-lysine)。利用二甲苯(xylene)脫除切片中的石蠟，再利用濃度梯度遞減(100%、95%、70%)的乙醇使切片復水(rehydrated)。

上述切片利用山羊血清阻斷(blocking)後，分別與不同的初級抗體在室溫(約15度至25度)中反應至隔夜，其中初級抗體包括TNF-α(Sigma-Aldrich)或IL-1β(Abcam,UK)。接著，利用磷酸鹽緩衝生理食鹽溶液(phosphate buffered saline；PBS)清洗後，與結合螢光染劑Alexa fluor 488之山羊抗小鼠IgG或結合螢光染劑Alexa fluor 488之山羊抗兔子IgG(Jackson Immunoresearch,USA)在室溫(約15度至25度)中反應1小時。之後，利用螢光顯微鏡及影像分析軟體(ImageJ software)觀察切片的免疫螢光染色結果，其結果如圖5A至圖5D所示。

請參閱圖5A至圖5D，其分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖5A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖5B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖5C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖5D)之神經組織切片的神經纖維蛋白(neurofilament,NF)免疫螢光染色照片。神經纖維蛋白是神經元中間纖維(intermediate filament)。在軸突斷傷及分解後，斷傷神經遠端殘肢之神經纖維蛋白的量顯著減少，如圖5B所示。利用含浸透明質酸的泡沫棉處理，顯著改善軸突斷傷的不良影響，如圖5C及圖5D，其中以利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理，改善神經斷傷的情況較佳，如圖5D所示。

進一步利用抗促發炎介質(proinflammatory mediators)的抗體檢測圖5A至圖5D之神經組織切片。請參閱圖6A至圖7D，其分別顯示根據本發明一實施例之假手術對照側(圖6A及圖7A)、坐骨神經軸突斷傷組(圖6B及圖7B)、利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖6C及圖7C)、利用含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖6D及圖7D)之神經組織切片的介白素一號乙型(IL-1β)(圖6A至圖6D)及腫瘤壞死因子甲型(TNF-α)(圖7A至圖7D)之免疫螢光染色照片。

由圖6A至圖7D的結果顯示，相較於坐骨神經軸突斷傷側(圖6B)，利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉(圖6D)及含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉(圖7D)處理後，二組皆可降低神經斷傷處之促發炎介質IL-1β的表現。然而，相較於坐骨神經軸突斷傷組(圖7B)及利用含浸0.1% w/w 350kDa之透明質酸的泡沫棉處理組(圖7C)，含浸0.1% w/w 3000kDa之透明質酸的泡沫棉處理組可最大降低TNF-α的表現，如圖6D及圖7D所示。

6.統計分析

上述實施例中，每組數據之樣本數至少為3個(n≧3)。所有數據以平均值±標準差表示。上述SSEP結果進行統計分析，即在坐骨神經軸突斷傷手術後，以前處理(即壓傷前)或利用生理食鹽水進行處理的組的數值為基準，利用配對Student’s t-檢驗，比對手術前後的波幅及延遲期間(latencies)。利用單因子變異數分析法比較各種處理組別，在分析變異數是否指出顯著性結果時，再利用Tukey檢驗進行多重比較。當p值小於0.05時，判斷具有統計顯著性。

綜言之，由上述數個實施例證實，本發明之加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料，其係將生物可分解性支持材料浸於具有特定分子量的透明質酸水溶液中，所得之複合生物材料可直接施用於急性創傷性周邊神經創傷處。申言之，對於加速急性創傷性周邊神經損傷復元的程度而言，透明質酸的分子量對於加速神經損傷的影響比透明質酸濃度來得更明顯，其中較高分子量(例如3000kDa)的透明質酸用於加速神經損傷復元時，不僅生體相容性佳，有助於加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕，減少引起的促發炎細胞激素(例如IL-1β及TNF-α)的表現量，最可有效降低神經損傷處的沾黏及發炎。

需補充的是，本發明雖以特定分子量的透明質酸、特定濃度的透明質酸、特定的周邊神經創傷動物模式或特定的評估方式作為例示，說明本發明之加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料及其應用，亦可使用其他分子量或其他濃度的生物可分解性支持材料、其他的周邊神經創傷模式或其他的評估方式進行。

由上述實施例可知，本發明之加速急性創傷性周邊神經損傷復元之複合生物材料，其優點在於將生物可分解性支持材料浸於具有特定分子量的透明質酸水溶液中，所得之複合生物材料可直接施用於急性創傷性周邊神經創傷處，具有抗沾黏、抗發炎、生體相容性佳、加速神經軸突斷傷復元、恢復神經功能以及傷口保濕等功效。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種複合生物材料用於製備加速急性創傷性周邊神經損傷復元之醫藥組成物的用途，該複合生物材料是由一生物可分解性支持材料以及含浸於該生物可分解性支持材料中的一透明質酸水溶液所組成，其特徵在於該透明質酸水溶液之透明質酸的分子量為3000kDa，該透明質酸水溶液之濃度為0.1重量百分比至0.5重量百分比以下，該生物可分解性支持材料之一外型為一泡沫棉，且該急性創傷性周邊神經損傷為周邊神經軸突斷傷(axonotmesis)。
根據申請專利範圍第1項所述之複合生物材料用於製備加速急性創傷性周邊神經損傷復元之醫藥組成物的用途，其中該生物可分解性支持材料之一材料為選自於由膠原蛋白、幾丁質(chitosan)、聚乳酸(poly-_L-lactic acid；PLLA)、聚乳酸羥基乙酸(poly-co-lactic glycotic acid；PLGA)、聚乙醇酸(poly-glycolic acid；PGA)及上述之任意組合所組成之一族群。