TWI742333B - 胺基酸亞鐵螯合物在治療腸道病原體感染以及提升生長性能上的用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種用於治療腸道病原體感染和/或提升生長性能的方法，其包括對一需要的個體投藥以一含有胺基酸亞鐵螯合物的組成物。本發明亦提供一種含有胺基酸亞鐵螯合物的動物飼料。

Description

胺基酸亞鐵螯合物在治療腸道病原體感染以及提升生長性能上的用途

本發明是有關於一種使用胺基酸亞鐵螯合物來治療腸道病原體感染和/或提升生長性能的方法。

在一生物體的大小腸道中存在可能會造成腸炎(enteritis)和/或結腸炎(colitis)的腸道病原體(包括感染)是有健康顧慮的。常見與腸道病原體感染有關的臨床表現為頻繁的腹瀉、噁心、嘔吐、腹痛、發燒、冷顫，以及其他正常身體狀況的改變。

常見的腸道病原體是細菌性腸道病原體(bacterial enteropathogens)[諸如，沙門桿菌屬物種(Salmonella spp.)、志賀桿菌屬物種(Shigella spp.)、大腸桿菌(Escherichia coli )、曲狀桿菌屬物種(Campylobacter spp.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae )等等]；病毒性腸道病原體(viral enteropathogens)[諸如，腸道病毒(enteroviruses)、輪狀病毒(rotaviruses)、諾羅病毒(Norwalk virus)以及腺病毒(adenoviruses)]；真菌[諸如，念珠菌(Candida)]；以及寄生蟲性腸道病原體(parastic enteropathogens)[諸如，球蟲(Coccidia)、梨形鞭毛蟲(Giardia lamblia )、大腸纖毛蟲(Balantidium coli )、人芽囊原蟲(Blastocystis hominis )、隱胞子蟲屬物種(Cryptosporidium spp.)、蟯蟲(Enterobius vermicularis )以及痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica )]。

數種預防和治療的策略(諸如，疫苗接種、抗生素或止吐劑的投藥)已被採用來對抗腸道病原體的感染。然而，仍有一需要去進一步改善這些預防和/或治療的策略。

申請人的美國專利申請案公開號2017/0224727 A1揭示一種能夠穩定地通過胃的胺基酸亞鐵螯合物，其在控制體重以及增強脂質代謝(lipid metabolism)與脂肪分解(lipolysis)上是有效的。此外，如同在申請人先前的專利申請案(包括美國專利申請案公開號2015/0065569 A1和2017/0007568 A1，以及台灣發明專利公告號I587856)中所揭示的，該胺基酸亞鐵螯合物亦能夠被用於癌症與糖尿病的治療，以及降低癌細胞的乳酸產生。這些專利申請案與專利是以它們的整體在此被併入本案以作為參考資料。

發明概要

因此，在第一個方面，本發明提供一種用於治療一腸道病原體的感染之方法，其包含有對一需要的個體投藥以一含有一胺基酸亞鐵螯合物的組成物，該胺基酸亞鐵螯合物包括亞鐵離子以及一胺基酸。

依據第二個方面，本發明是有關於一種動物飼料，其包含有如上所述的胺基酸亞鐵螯合物。

依據第三個方面，本發明提供一種用於提升在一動物中之生長性能的方法，其包括對該動物投予如上所述的組成物和/或如上所述的動物飼料。

發明的詳細說明

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。

一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所使用的術語“治療(treat)”或“治療(treatment)”意指降低(lessening)、誘發停滯(inducing stasis)或者延後(postponing)或減少(reducing)疾病或病況的進展(progression)、發展(development)、發作(onset)或嚴重性(severity)或者與本文中所描述的疾病或障礙(disorder)或病況(condition)相關的一或多個症狀(symptoms)的嚴重性，或者改善(ameliorating)現有之不受控制或非所欲的症狀、預防額外的症狀，或者緩解(relieving)或減輕(alleviating)一個體所經歷的一疾病表現的強度和/或期間。術語“治療”亦包括預防性地(prophylactically)防止(preventing)、治療(curing)、治癒(healing)、改變(altering)、醫治(remedying)、改善(ameliorating)、好轉(improving)或影響(affecting)一病況(例如，一疾病)、該病況的症狀，或對該病況的傾向(predisposition)。

本發明提供一種用於治療一腸道病原體的感染之方法，其包含有對一需要的個體投藥以一含有一胺基酸亞鐵螯合物和/或由燒結該胺基酸亞鐵螯合物所製得之經燒結的胺基酸亞鐵粒子的組成物。該胺基酸亞鐵螯合物包括亞鐵離子以及一胺基酸。

依據本發明，在該胺基酸亞鐵螯合物中亞鐵離子與胺基酸的螯合比例(chelating ratio)是落在1：1至1：4的範圍內。在某些具體例中，在該胺基酸亞鐵螯合物中亞鐵離子與胺基酸的螯合比例落在1：1.5與1：2.5之間。

用於製備該胺基酸亞鐵螯合物的方法已被揭示在，例如，US 2017/0224727 A1中，並且包括在加熱下使一亞鐵化合物與一胺基酸混合的步驟。在某些具體例中，該混合步驟可在一範圍落在60℃至90℃的溫度下被進行。在某些具體例中，該混合步驟可被進行歷時8小時至48小時。

依據本發明，在該製備方法中所使用的亞鐵化合物與胺基酸的重量比例是介於1：1.2與1：1.5之間。在本發明的一具體例中，該亞鐵化合物與該胺基酸的重量比例為1：1.3。

在某些具體例中，該亞鐵化合物可為硫酸亞鐵(ferrous sulfate)、氯化亞鐵(ferrous chloride)、焦磷酸亞鐵(ferrous pyrophosphate)，或者它們的組合。

在某些具體例中，該胺基酸可為甘胺酸(glycine)。亦即，該胺基酸亞鐵螯合物可為甘胺酸亞鐵螯合物(ferrous glycinate chelate)。

在某些具體例中，該等經燒結的胺基酸亞鐵粒子具有一範圍落在500至2600 nm內的平均粒徑(average particle size)以及一範圍落在1,500至600,000道爾頓(Dalton)內的重量平均分子量(weight average molecular weight)。

在某些具體例中，該等經燒結的胺基酸亞鐵粒子具有一範圍落在1,500至15,000道爾頓內的重量平均分子量。在其他具體例中，該等經燒結的胺基酸亞鐵粒子具有一範圍落在400,000至550,000道爾頓內的重量平均分子量。

在一示範性具體例中，該等經燒結的胺基酸亞鐵粒子具有一約為1465.90±132.29 nm的平均粒徑[其是藉由，例如，在Beckman Coulter N5 Submicron粒徑分析儀(Beckman Coulter N5 Submicron Particle Size Analyzer)上的動態光散射(dynamic light scattering, DLS)且於水中所測得]。此外，溶解於水中的該等經燒結的胺基酸亞鐵粒子之數目平均分子量(number-average molecular weight, Mn)、重量平均分子量(weight-average molecular weight, Mw)、峰值分子量(peak molecular weight, MP)以及多分散性指數(polydispersity, PDI)[藉由使用Waters Alliance 2695系統(Waters Alliance 2695 System)的凝膠滲透層析法(gel permeation chromatography)所測得]分別為68188道爾頓、525538道爾頓、286426道爾頓以及7.707205道爾頓。

如本文中所使用的，術語“個體”意指任何感興趣的動物，諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheeps)、馬(horses)、豬(pigs)、雞(chickens)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。在某些具體例中，該個體可為一雞。

在某些具體例中，該腸道病原體可為細菌性腸道病原體(bacterial enteropathogen)。細菌性腸道病原體的實例包括，但不限於：曲狀桿菌屬物種(Campylobacter spp.)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens )、大腸桿菌(Escherichia coli )[諸如腸內病原大腸桿菌(enteropathogenic E. coli , EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive E. coli , EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregative E. coli , EAEC)、腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E. coli , ETEC)等等]、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes )、霍亂弧菌(Vibrio cholerae )、沙門桿菌屬物種(Salmonella spp.)以及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )。

曲狀桿菌菌株的實例包括，但不限於：空腸曲狀桿菌(Campylobacter jejuni )、大腸曲狀桿菌(Campylobacter coli )、紅嘴鷗曲狀桿菌(Campylobacter lari )以及烏普薩拉曲狀桿菌(Campylobacter upsaliens )。

沙門桿菌菌株的實例包括，但不限於：腸道沙門桿菌(Salmonella enterica )、邦戈沙門桿菌(Salmonella bongori )，以及它們的亞種(subspecies)。腸道沙門桿菌是一種物種(species)並且被進一步分成七個亞種[亦即，腸道沙門桿菌亞利桑那亞種(S. enterica subsp.Arizonae )、腸道沙門桿菌雙相亞利桑那亞種(S. enterica subsp.Diarizonae )、腸道沙門桿菌腸道亞種(S. enterica subsp.Enteric )、腸道沙門桿菌豪頓亞種(S. enterica subsp.Houtenae )、腸道沙門桿菌印度亞種(S. enterica subsp.Indica )、腸道沙門桿菌腸炎亞種(S. enterica subsp.Enteritidis )以及腸道沙門桿菌薩拉姆亞種(S. enterica subsp.Salamae )]，該等亞種包含有超過2500個血清型(serotypes)，諸如，雞沙門桿菌(Salmonella Gallinarum )、雛白痢沙門桿菌(Salmonella Pullorum )、豬霍亂沙門桿菌(Salmonella Choleraesuis )、都柏林沙門桿菌(Salmonella Dublin )、腸炎沙門桿菌(Salmonella Enteritidis )、海登堡沙門桿菌(Salmonella Heidelberg )、副傷寒沙門桿菌(Salmonella Paratyphi )、傷寒沙門桿菌(Salmonella Typhi )，以及鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella Typhimurium )。

在某些具體例中，該腸道病原體可為寄生蟲性腸道病原體(parastic enteropathogen)。寄生蟲性腸道病原體的實例包括，但不限於：球蟲(Coccidia)、梨形鞭毛蟲(Giardia)、蟯蟲(Enterobius vermicularis )、痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica )、隱胞子蟲屬物種(Cryptosporidium spp.)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli )、人芽囊原蟲(Blastocystis hominis )以及環孢子蟲(Cyclospora)。

依據本發明，該組成物可被製備成一藥學組成物(pharmaceutical composition)或一食物組成物(food composition)的形式。

若該組成物被製備成藥學組成物的形式，該組成物可進一步包含一藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)，並且利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)。該劑型的實例包括，但不限於：溶液(solution)、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、糖漿(syrup)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、濃漿(slurry)以及類似之物。

適用於本發明之藥學上可接受的載劑的實例可包括，但不限於：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agents)、分解劑(decomposers)、黏結劑(binding agents)、賦形劑(excipients)、安定劑(stabilizing agents)、螯合劑(chelating agents)、稀釋劑(diluents)、膠凝劑(gelling agents)、防腐劑(preservatives)、潤滑劑(lubricants)、吸收延遲劑(absorption delaying agents)、脂質體(liposomes)，以及它們的組合。

依據本發明，該組成物可呈一食品添加物(food additive)的形式(食品組成物的一示範性實例)，其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明，該食物產品的實例可包括，但不限於：流體乳品(fluid milk products)[諸如，牛奶(milk)以及濃縮牛奶(concentrated milk)]、健康食品(health foods)、動物飼料(animal feeds)以及膳食補充品(dietary supplements)。

申請人進一步添加如上所述的胺基酸亞鐵螯合物至一動物飼料中並以該動物飼料來飼養雞以及離乳後仔豬(postweaning piglets)。從實驗結果中已被證實的是：依據本發明，胺基酸亞鐵螯合物能夠有效地提升動物的生長性能。

因此，本發明提供一動物飼料，其包含有如上所述的胺基酸亞鐵螯合物和/或得自於其中的經燒結的胺基酸亞鐵粒子。

本發明亦提供一種用於提升在一動物中之生長性能的方法，其包括對該動物投予如上所述的動物飼料。

如本文中所使用的術語“生長性能(growth performance)”意指生長速率(growth rate)、體重和/或飼料效率(feed efficiency)。

在某些具體例中，本發明的胺基酸亞鐵螯合物和/或得自於其中的經燒結的胺基酸亞鐵粒子能夠藉由使用本技術領域中的通常知識者所熟知的標準技術來被添加至一動物飼料。舉例來說，胺基酸亞鐵螯合物和/或經燒結的胺基酸亞鐵粒子可直接地被添加至一動物飼料，或可被用來製備成適合隨後地被添加至一動物飼料中的一中間體組成物(intermediate composition)(例如，一種飼料添加物或一預混合物)。在某些具體例中，本發明的動物飼料是由胺基酸亞鐵螯合物與一動物基質飼料混合在一起所製得。

依據本發明的動物飼料可口服地投藥，並且可藉由本技術領域中的通常知識者所熟知的技術來製造成一形式，包括，但不限於：液態形式(liquid form)、固態形式(solid form)[諸如，粉末形式(powder form)、粒狀形式(granular form)、顆粒形式(particulate form)或經壓製的錠劑(compressed tablet)]、凝膠形式(gel form)，以及濃漿形式(slurry form)。

本發明將透過下列的實施例而被進一步說明。然而，應瞭解的是：下列的實施例僅是意欲供例示說明之用，而不應被解釋為本發明於實施上的限制。實施例 一般實驗材料： 1. 胺基酸亞鐵螯合物的製備：

胺基酸亞鐵螯合物是根據在US 2017/0224727 A1的製備例1中所揭示的操作程序而被製備。具體而言，硫酸亞鐵與甘胺酸(高於98%的純度)以一為1：1.3的重量比例而被混合，繼而自60℃加熱至90℃歷時8小時至48小時，藉此而得到用於下述的進一步實驗之胺基酸亞鐵螯合物。在所得到的胺基酸亞鐵螯合物中亞鐵離子與胺基酸的螯合比例是介於1：1與1：4之間。實施例 1. 實驗方法：

台灣黑羽土雞(1日齡)是購自於國立嘉義大學的動物試驗場(Animal Research Farm in National Chia-Yi University)(台灣)，並且在符合台灣行政院農業委員會的動物照護委員會(Animal Care Committee of the Council of Agriculture, Taiwan)之準則下飼育於農場中。實驗雞隻被隨機地分成一個對照組以及一個實驗組(n=40/組)，且各組被置於一大小為6.5 m² 的圈欄中。水被任意採食地(ad libitum )提供給所有的實驗雞隻。

各個實驗雞隻是以每日0.1 kg的劑量而被餵食以混合飼料歷時12週。提供給對照組的混合飼料(每1000 kg的混合飼料有20 g的鐵)是由一基礎飼糧(basal diet)以及一硫酸亞鐵所製備。提供給實驗組的混合飼料(每1000 kg的混合飼料有20 g的鐵)是由該基礎飼糧以及如在“一般實驗材料”中標題為“1. 胺基酸亞鐵螯合物的製備”的部分中所述而製得的胺基酸亞鐵螯合物所製備。

各個雞隻的體重是在供給該混合飼料之前與之後來測定。隨後，各組雞隻的平均日增重(average daily gain, ADG)是根據體重以及攝食量(feed intake)來計算。定義為總攝食量對總體重的比值之飼料效率(feed efficiency)亦被計算。實驗數據是藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)來作分析俾以評估試驗組別之間的差異性。統計學顯著性(statistical significance)是以p ＜0.05來表示。

此外，在供給該混合飼料的期間，十五隻雞隻在指定的時間點被隨機地挑選出，以使用棉花棒從其泄殖腔(cloaca)收集糞便。

球蟲感染(Coccidia infestation)是藉由顯微鏡觀察所得到的糞便樣品來判定。

此外，所得到的糞便是使用taco^TM DNA/RNA萃取套組(taco™ DNA/RNA Extraction Kit)(GeneReach Biotechnology Corp)並依據製造商的操作指南來進行核酸萃取。所得到的DNA樣品(供作為模版)被用來進行即時聚合酶鏈反應(real time polymerase chain reaction, real-time PCR)。具體而言，即時PCR實驗在一含有5 μL的模版、1.2 μL的各個引子(10 μM)、0.5 μL的探針(10 μM)、10 μL的反應緩衝液(TaqMan^® Universal Master Mix II with UNG, Applied Biosystems)以及2.1 μL的二次水之20 μL的反應混合物中來進行。用來偵測各個腸道病原體的引子以及探針被列於表1中。 表1

註： 探針的5’-端以及3’-端分別被標示以螢光素醯胺(Fluorescein amidite, FAM)以及黑洞螢光淬滅劑-1 (Black Hole Quencher-1, BHQ^® -1)。

在起始反應(initiation)步驟期間，在PCR管中的各個樣品被預-培育在55℃下歷時2分鐘接著在95℃下歷時10分鐘以活化DNA聚合酶，繼而進行45個循環如下：在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時15秒，以及在60℃下進行引子黏合(primer annealing)與DNA延長反應(elongation)歷時60秒。 結果：

關於生長性能以及腸道病原體感染的實驗結果被顯示於表2中。 表2

1: 以平均值±標準差(standard deviation, S.D.)來表示 2: 以在所挑選出的15隻雞隻之中的感染百分比表示 *: 當與對照組作比較，p ＜0.05

從表2可看到的是：在供給該混合飼料之後，實驗組雞隻的體重是顯著地高於對照組雞隻所具者。關於實驗組的ADG以及FE是分別地優於關於對照組的ADG以及FE。此外，當相較於對照組，實驗組的各個所試驗的腸道病原體之感染百分比是顯著較低的。上面的結果顯示：本發明含有胺基酸亞鐵離子螯合物的混合飼料能夠有效地降低腸道病原體所引起的感染並且提升雞隻的生長性能。實施例 2. 實驗方法：

大約1000隻雄性仔豬與1000隻雌性仔豬(購自於台灣雲林縣海豐牧場，並且飼養於養殖場中)被使用於下面的實驗中。實驗仔豬被隨機地分成一個實驗組以及一個對照組，並且充足的水以及飼料被提供給該等實驗仔豬。

在離乳之後(亦即，在4週齡之時)，各個實驗仔豬被餵食以混合飼料歷時8週直到該等實驗仔豬達到12週齡。提供給對照組的混合飼料是由呈一為1000：1的重量比之一基礎飼糧以及硫酸亞鐵所製備。提供給實驗組的混合飼料是由呈一為1000：1的重量比之該基礎飼糧以及如在“一般實驗材料”中標題為“1. 胺基酸亞鐵螯合物的製備”的部分中所述而製得的胺基酸亞鐵螯合物所製備。

在4與12週齡時，各組離乳後仔豬的總攝食量以及體重被測量並記錄。隨後，各組離乳後仔豬的平均日增重(ADG)以及平均日攝食量(average daily feed intake, ADFI)是根據體重以及總攝食量來計算。定義為ADFI對ADG的比值之飼料效率(FE)亦被計算。實驗結果被顯示於表3中。

實驗數據是以平均值(mean)±S.D.來表示，並且藉由史徒登氏t-試驗來作分析俾以評估試驗組別之間的差異性。統計學顯著性是以p ＜0.05來表示。 結果： 表3

1： 以平均值±S.D.表示 *： 當與對照組作比較，p ＜0.05

參見表3，在仔豬12週齡時，實驗組離乳後仔豬的體重是顯著地高於對照組離乳後仔豬所具者。此外，實驗組離乳後仔豬的ADG是高於對照組離乳後仔豬的ADG，且關於實驗組的FE是顯著地低於(亦即，優於)關於對照組的FE。

上面的實驗結果顯示：本發明含有胺基酸亞鐵螯合物的混合飼料能夠有效地提升離乳後仔豬的生長性能。

於本案說明書內所引述的所有專利案與文獻資料以及其中所描述的參考資料是以它們的整體在此被併入以作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

在上面的詳細說明中，為了說明的目的，許多具體細節已被描述以供徹底瞭解具體例。然而，對於一熟悉本技藝者而言將會明顯的是，一或多個其他具體例可在沒有這些具體細節中的部分者而被實施。亦應被瞭解的是，本說明書通篇所提及之“一個具體例(one embodiment)”、“一具體例(an embodiment)”，一帶有序號標示的具體例等等意指一特定的特徵、結構或特性可被包括在本發明的實施中。在詳細說明中應被進一步瞭解的是，為了精簡本發明並有助於理解各種不同的發明方面之目的，各種不同的特徵有時被集合在一個單一的具體例、圖式或其說明中，在實施本發明時，若適當，來自於一個具體例的一或多個特徵或具體細節可與來自於另一個具體例的一或多個特徵或具體細節一起被實施。

雖然本發明已參照被視為是示範性具體例者而被描述，應被瞭解的是：本發明不受到所揭示的具體例限制，而意欲涵蓋被包括在最廣泛的解釋之精神與範疇中之各種不同的配置，俾以包含所有這類的修改以及等效的配置。

Claims (2)

1. 一種含有一甘胺酸亞鐵螯合物的組成物供應用於製備一用來治療腸道病原體的感染之醫藥品的用途，其中，該腸道病原體是選自於由下列所構成之群組：大腸桿菌、沙門桿菌屬物種、產氣莢膜芽胞梭菌、球蟲，以及它們的組合。
2. 如請求項1的用途，其中，在該甘胺酸亞鐵螯合物中的亞鐵離子與甘胺酸的螯合比例是落在1：1至1：4的範圍內。