TWI734045B

TWI734045B - 杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法、生物塑料以及廢水處理方法

Info

Publication number: TWI734045B
Application number: TW107139047A
Authority: TW
Inventors: 溫添進; 林承學; 賴俊吉
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2021-07-21
Also published as: TW202018076A

Abstract

本發明提供一種杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法、生物塑料以及廢水處理方法。所述杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法包含提供一培養基質，該培養基質包含至少一單醣以及至少一無機物質；將一杜鵑擬青黴菌孢子置於該培養基質中；在有氧環境中進行一預設時間的培養，使該杜鵑擬青黴菌孢子生長形成一杜鵑擬青黴菌菌絲體；以及過濾以獲得該杜鵑擬青黴菌菌絲體。

Description

杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法、生物塑料以及廢水處理方法

本發明係關於一種杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法、生物塑料以及廢水處理方法，特別是關於一種使用不同碳源以及無機氮源來培養的杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法，及應用該杜鵑擬青黴菌菌絲體形成一生物塑料，或應用該杜鵑擬青黴菌菌絲體進行廢水處理。

隨著工業多樣性的發展，氨廢水的痕跡出現在各種工業中，如石化，半導體，光電子或晶圓製造業。隨著公眾環保意識的不斷提高，水質保護區外氨氮排放限值已從2014年的75ppm標準降至30ppm，而水質保護區中氨氮排放限值則必須低於10ppm或更少。

目前氨氮廢水處理技術可以以依照其原理分為物理、化學以及生物方法，其中生物方法以Anammox厭氧胺氧化技術最為廣泛應用，可以於生物反應器中將氨氮與亞硝酸氮同時反應為氮氣而將水中氨氮脫除，相較於傳統生物法而言可以減省很多步驟，但是缺點是該技術對於環境系統中的溶氧值、酸鹼值、溫度以及廢水中原有的微生物菌落群相當敏感，且處理程序結束後會產生許多生物污泥需要二次處理成本。

故仍有必要提供一種杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法、生物塑料以及廢水處理方法，以解決習用技術中所存在的問題。

本發明之主要目的在於提供一種杜鵑擬青黴菌菌絲體的製造方法，提供多種單醣作為碳源，並調整其最佳比例來獲得最大產率，可大量獲得杜鵑擬青黴菌菌絲體。

本發明之另一目的在於提供多種杜鵑擬青黴菌菌絲體的應用方式，包含一生物塑料以及一廢水處理方法。該生物塑料使用一杜鵑擬青黴菌菌絲體作為主要成分，具有生物可降解的特性，是綠色環保素材。該廢水處理方法則直接使用一杜鵑擬青黴菌孢子，可降解廢水中的氨氮成長出菌絲體，該菌絲體可以進一步吸附氨氮，將廢水中的氨氮集中於該杜鵑擬青黴菌孢子周邊以有利於持續進行降解。因此，在該氨氮化合物存在時，該杜鵑擬青黴菌孢子可成長出更多菌絲體，而菌絲體又可以協助降解轉化氨氮，是一種環保、可循環再生且具備經濟價值的廢水處理方法。

為達上述之目的，本發明的一實施例提供一種杜鵑擬青黴菌(Paecilomyces Saturatus)菌絲體的製造方法，其包含下列步驟：提供一培養基質，該培養基質包含至少一單醣以及至少一無機物質；將一杜鵑擬青黴菌孢子置於該培養基質中；在有氧環境中進行一預設時間的培養，使該杜鵑擬青黴菌孢子生長形成一杜鵑擬青黴菌菌絲體；以及過濾以獲得該杜鵑擬青黴菌菌絲體。

在本發明的一實施例中，該至少一單醣為葡萄糖、果糖或甘露醇。

在本發明的一實施例中，該至少一單醣包含葡萄糖、果糖及甘露醇，該葡萄糖、果糖及甘露醇的比例為1：3：1。

在本發明的一實施例中，該預設時間為大於或等於4天。

在本發明的一實施例中，該無機物質包含至少一種成分選自於由磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鈣、氯化亞鐵、鉬酸鈉及氯化銨所組成的一族群。

在本發明的一實施例中，該培養基質含有一銨離子濃度大於或等於400毫克/升。

為達上述之目的，本發明的另一實施例提供一種生物塑料，其包含一杜鵑擬青黴菌菌絲體以及一交聯劑，其中該杜鵑擬青黴菌菌絲體係以上述製造方法加以製造，且該杜鵑擬青黴菌菌絲體以重量計佔該生物塑料的90至98%。

在本發明的一實施例中，其中該交聯劑為瓊脂或京尼平。

為達上述之目的，本發明的再一實施例提供一種廢水處理方法，其包含下列步驟：在一氨氮廢水中加入一杜鵑擬青黴菌孢子；以及調整該氨氮廢水的酸鹼性至pH值為4.8至5.2。

在本發明的一實施例中，該杜鵑擬青黴菌孢子加入該氨氮廢水之前先形成一懸浮液，該懸浮液的菌數含量為10⁶/ml，且該懸浮液以重量計佔該氨氮廢水的1%以上。

第1A至1C圖：本發明的杜鵑擬青黴菌菌種在顯微鏡下的型態。

第2圖：本發明實驗3中在三種不同單糖比例中的乾燥生物質分布情況。

第3圖：本發明實驗4不同培養時間下銨濃度的變化趨勢圖。

第4圖：本發明實驗4中模擬廢水處理後的杜鵑擬青黴菌菌絲體型態。

第5圖：本發明實驗7中不同瓊脂比例所製得的生物塑料膜外觀。

第6圖：本發明實驗8中所製得的生物塑料膜外觀。

第7圖：顯示本發明實驗9中的偶氮染料吸附在菌絲體的真菌細胞壁上。

第8圖：本發明實驗10中，蘇丹黑B染料降解前後的UV-Vis光譜變化及染料顏色的變化。

為了讓本發明之上述及其他目的、特徵、優點能更明顯易懂，下文將特舉本發明較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。再者，本發明所提到的單數形式“一”、“一個”和“所述”包括複數引用，除非上下文另有明確規定。數值範圍(如10%~11%的A)若無特定說明皆包含上、下限值(即10%≦A≦11%)；數值範圍若未界定下限值(如低於0.2%的B，或0.2%以下的B)，則皆指其下限值可能為0(即0%≦B≦0.2%)。上述用語是用以說明及理解本發明，而非用以限制本發明。

本發明的一實施例提供一種杜鵑擬青黴菌(Paecilomyces Saturatus)菌絲體的製造方法，其包含下列步驟：提供一培養基質，該培養基質包含至少一單醣以及至少一無機物質；將一杜鵑擬青黴菌孢子置於該培養基質中；在有氧環境中進行一預設時間的培養，使該杜鵑擬青黴菌孢子生長形成一杜鵑擬青黴菌菌絲體；以及過濾以獲得該杜鵑擬青黴菌菌絲體。在一實施例中，該至少一單醣為葡萄糖、果糖或甘露醇。較佳的，該至少一單醣包含葡萄糖、果糖及甘露醇，其中該葡萄糖、果糖及甘露醇的比例為1：3：1。在本發明的一實施例中，該預設時間為大於或等於4天。在本發明的一實施例中，該無機物質包含至少一種成分選自於由磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鈣、氯化亞鐵、鉬酸鈉及氯化銨所組成的一族群。在本發明的一實施例中，該培養基質含有一銨離子濃度大於或等於400毫克/升。

本發明的另一實施例提供一種生物塑料，其包含一杜鵑擬青黴菌菌絲體以及一交聯劑，其中該杜鵑擬青黴菌菌絲體係以上述製造方法加以製造，且該杜鵑擬青黴菌菌絲體以重量計佔該生物塑料的90至98%。在本發明的一實施例中，其中該交聯劑為瓊脂或京尼平。

本發明的再一實施例提供一種廢水處理方法，其包含下列步驟：在一氨氮廢水中加入一杜鵑擬青黴菌孢子；以及調整該氨氮廢水的酸鹼性至pH值為4.8至5.2。在一實施例中，杜鵑擬青黴菌孢子加入該氨氮廢水之前先形成一懸浮液，該懸浮液的菌數含量為10⁶/ml，且該懸浮液以重量計佔該氨氮廢水的1%以上。

為驗證杜鵑擬青黴菌菌絲體的組成及其應用效果，本發明進行以下實驗。

實驗1：杜鵑擬青黴菌菌株的培養

首先從第一科大賴俊吉教授之共生菌發酵液接種40ppm於高濃度之含銨離子培養液中透過好氧曝氣培養14天後，於環境中篩選出真菌菌株，在37℃下培養該菌株7天后，以肉眼觀察瓊脂板上的綠棕色菌落 I。或者，從工業區污水處理廠之含銨離子廢水中篩選出真菌菌株，在37℃下培養該菌株7天后，以肉眼觀察瓊脂板上的綠棕色菌落II。將綠棕色菌落I及綠棕色菌落II的菌絲體從瓊脂平板固定到載玻片上並用考馬斯亮藍染色後，顯示出在顯微鏡下產生球形無性孢子的掃帚樣分生孢子，這是擬青黴菌菌種的典型表型。第1A至1C圖所示為該綠棕色菌落II在顯微鏡下的型態。

實驗2：杜鵑擬青黴菌的鑑定

將實驗1所收穫的綠棕色菌落I及綠棕色菌落II經過ITS測序後，實驗1所培養的真菌菌株確認與真菌菌株Paecilomyces Saturatus具有99.9%相似性，可確認實驗1所得菌株為杜鵑擬青黴菌，該菌株已由Nakazawa教授(ATCC 11971 TM)在ATCC中寄存，且實驗1的兩菌株與ATCC 11971 TM具有相同的特徵，它們都可以在液體培養基中生長並利用乙酸作為單一碳源。雖然實驗1所取得的真菌菌株來源不同，但收穫的真菌均為杜鵑擬青黴菌。

實驗3：培養菌絲體

製備含有5g/L碳源(單醣：葡萄糖、果糖、甘露醇)、1g/L磷酸氫二鉀、0.5g/L硫酸鎂、0.5g/L氯化鈉、1g/L硫酸鈣、40mg/L氯化亞鐵、5mg/L鉬酸鈉以及0.764g/L氯化銨的培養基，將1L培養基在121℃下滅菌1小時後，將1wt%的杜鵑擬青黴菌孢子懸浮液加入血清瓶中。

在有氧環境中培養4天后，通過過濾收集菌絲體，獲得總乾燥生物質，如下表1所示。

表1

從上表1可知，在第17組中所使用的單糖可獲得最大產率的乾燥生物質，該碳源的最佳比例是葡萄糖：果糖：甘露醇=1：3：1。在這個比例下，可以得到3.501g/L的乾燥生物質，請參見第2圖所示。

實驗4：模擬氨氮廢水處理

在1L批次的好氧生物反應器中，設定初始銨濃度為400mg/L(ppm)，溫度為25℃，pH為5。利用一空氣分配器自該好氧生物反應器底部進行攪拌。然後，將1wt%的杜鵑擬青黴菌孢子懸浮液(菌數含量10⁶/ml)加入該好氧生物反應器中並培養4天，接著靜置12小時，並且持續測量水中的銨濃度。

請參考第3圖，在整個實驗過程中，銨濃度從406.2ppm下降至1.82ppm，通過計算可獲得水中銨的去除率為99.5%，故已可達到廢水的放流水標準。

此外，最終的成長的菌絲體生物量是顆粒狀的形式，在生物處理過程後可以很容易地沉澱於底部，如第4圖所示。

實驗5：甲殼素/殼聚醣的提取

在有氧條件下在液體培養基中培養杜鵑擬青黴菌孢子4天後，通過重力過濾獲得菌絲體並在真空烘箱中乾燥過夜。將菌絲體生物質精細研磨並使用0.5M NaOH鹼性溶液在120℃下洗滌0.5小時，以8000rpm離心10分鐘並移去上清液，獲得一沉澱物A。取出該沉澱物A，在120℃下及10wt%乙酸中再溶解4小時，隨後以8000rpm離心10分鐘並分別收集一上清液B及一沉澱物C。在該上清液B中逐滴添加150mM NaOH調整pH值至8。最後，通過離心收集底部的一沉澱物D。將該沉澱物D冷凍乾燥過夜後，可以獲得純的真菌殼聚糖。將該沉澱物C冷凍乾燥8小時後，可以獲得純化後之真菌幾丁質。

從杜鵑擬青黴菌菌絲體所提取的殼聚糖的脫乙醯基DD%約為84%，這表明杜鵑擬青黴菌確實是可做為高DD%殼聚糖的來源。由XRD光譜計算，該殼聚糖的結晶度指數約為3.2。

甲殼素/殼聚糖廣泛存在於甲殼類動物的殼中，通常必須利用強機械力，濃碱溶液和極高的溫度來提取殼聚糖。因此，甲殼類提取出的殼聚糖的物理性質較差，且分子量及DD%都不夠好。此外，在提取過程中衍生的幾丁質也是低分子量。相比之下，使用杜鵑擬青黴菌作為提取殼聚糖及幾丁質的來源，由於其細胞壁中富含幾丁質/殼聚糖，網狀的菌絲體鬆散地由微纖維菌絲組成，殼聚糖可以通過溫和的方法容易地從細胞壁中提取，並且仍然保持高分子量和高脫乙醯率。因此，杜鵑擬青黴菌是提供高質量幾丁質/殼聚糖的一個最佳來源。

實驗6：菌絲體製成生物塑料膜

將0.2g乾燥的杜鵑擬青黴菌菌絲體在10ml去離子水中充分洗淨並加熱至100℃保持15分鐘。在加熱過程完成後，將均勻溶液倒入模具中並冷卻至室溫，然後在烘箱中37℃下乾燥8小時，獲得一菌絲體膜。

實驗7：菌絲體與瓊脂製成生物塑料膜

將0.1g乾燥的杜鵑擬青黴菌菌絲體和不同重量比例的瓊脂在10ml去離子水中充分洗淨並加熱至100℃保持15分鐘。在加熱過程完成後，將均勻溶液倒入模具中並冷卻至室溫，然後在烘箱中37℃下乾燥8小時，獲得一菌絲體/瓊脂膜，經測量含水量1~3%。亦可以應用明膠、玻尿酸取代瓊脂與分子鏈中的氫氧基產生氫鍵進行物理交聯反應。

如第5圖所示，沒有添加瓊脂時(0wt%)，該菌絲體膜的機械強度弱且易碎。然而，添加0.5wt%瓊脂後，強度可以得到顯著改善。隨著逐漸增加比例從0.5wt%到1.5wt%，製成的生物塑料膜變得更光滑和更堅韌，且疏水性也增加。

實驗8：菌絲體與京尼平(genipin)製成生物塑料膜

將0.2g乾燥的杜鵑擬青黴菌菌絲體在10ml去離子水中充分洗淨後，加入4mg京尼平並反應4小時。在完成交聯反應後，將反應溶液倒入模具中並冷卻至室溫，然後在烘箱中37℃下乾燥8小時，可獲得如第6圖所示的一菌絲體/京尼平薄膜，經測量含水量1~3%。亦可以應用戊二醛、馬來酸酐取代京尼平與分子鏈中的胺基脫水聚合產生交聯反應。

實驗9：菌絲體對染料的吸附作用

將偶氮染料化合物蘇丹黑B(SBB)與水混合製備150mg/L的SBB水溶液，然後加入2wt%乾燥的杜鵑擬青黴菌菌絲體，並滴加NaOH調節pH值。為了觀察pH值對於吸附力的影響，改變pH值從3至9，觀察該杜鵑擬青黴菌菌絲體對染料的飽和吸附效果。

當pH值為7時，SBB水溶液中的銨濃度在最初3小時可迅速下降，總偶氮染料去除率為94%。因此，可驗證該杜鵑擬青黴菌菌絲體是用於偶氮染料處理的理想生物吸附材料。在第7圖中，可以清楚地看到偶氮染料吸附在菌絲體的真菌細胞壁上。

偶氮染料是含有C-N=N-C鍵和芳環的有機化合物，廣泛用於紡織和皮革製品工業。由於杜鵑擬青黴菌菌絲體的細胞壁富含羥基、胺基、硫酸基和磷酸基，它們可以增強杜鵑擬青黴菌菌絲體對偶氮染料的吸附能力，作為良好的生物吸附劑。

實驗10：菌絲體對染料的降解作用

秤重並在100ml無菌去離子水中溶脹0.2wt%乾燥的杜鵑擬青黴菌菌絲體。製備1wt%蘇丹黑B(SBB)乙醇溶液並攪拌30分鐘直至其均勻溶解。最後，將2ml SBB溶液加入98ml菌絲體中，並使用NaOH和乙酸調整溶液的pH至7。在80rpm，37℃下震盪培養2周。

SBB最初會吸附在菌絲體上，變成深藍色。隨著時間的推移，深藍色的菌絲體會變成紫色甚至是粉紅色。從UV-Vis光譜中，600nm附近的SBB吸附峰消失，降解後在500nm附近出現新的吸收區，表明SBB的分子結構已經被破壞，如第8圖所示。從特徵吸收峰的藍移，代表了SBB降解為較小的分子，因此提供了較短的共軛電子路徑系統。

相較於先前技術，本發明所提供的廢水處理方法中，該杜鵑擬青黴菌是一種真菌類，在一個絕對好氧的環境中進行氨氮廢水的處理，因此對於水中的溶氧值要求並不嚴格，並且處理過後所衍生之真菌生物質與混合液體可以輕易分離，可直接回收具有經濟價值的真菌菌絲體副產物，進一步能被用來製備成一生物塑膠或者是一生物吸附劑。

雖然本發明已以較佳實施例揭露，然其並非用以限制本發明，任何熟習此項技藝之人士，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種廢水處理方法，其包含下列步驟：製備一杜鵑擬青黴菌孢子(Paecilomyces Saturatus)懸浮液，其中該杜鵑擬青黴菌孢子懸浮液中的的菌數含量為10⁶/ml；調整一氨氮廢水的酸鹼性至pH值為4.8至5.2，其中該氨氮廢水具有一初始銨濃度大於或等於400mg/L；以及在25℃將該杜鵑擬青黴菌孢子懸浮液加入該氨氮廢水中培養4天以上，其中該杜鵑擬青黴菌孢子懸浮液以重量計佔該氨氮廢水的1%以上。