CN111218405A - 杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法、生物塑料以及废水处理方法 - Google Patents

杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法、生物塑料以及废水处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法、生物塑料以及废水处理方法。所述杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法包含提供一培养基质，所述培养基质包含至少一单醣以及至少一无机物质；将一杜鹃拟青霉菌孢子置于所述培养基质中；在有氧环境中进行一预设时间的培养，使所述杜鹃拟青霉菌孢子生长形成一杜鹃拟青霉菌菌丝体；以及过滤以获得所述杜鹃拟青霉菌菌丝体。

Description

杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法、生物塑料以及废水处理 方法
技术领域
本发明是有关于一种杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法、生物塑料以及废水处理方法，特别是关于一种使用不同碳源以及无机氮源来培养的杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，及应用所述杜鹃拟青霉菌菌丝体形成一生物塑料，或应用所述杜鹃拟青霉菌菌丝体进行废水处理。
背景技术
随着工业多样性的发展，氨废水的痕迹出现在各种工业中，如石化，半导体，光电子或晶圆制造业。随着公众环保意识的不断提高，水质保护区外氨氮排放限值也逐渐被提高。
目前氨氮废水处理技术可以以依照其原理分为物理、化学以及生物方法，其中生物方法以Anammox厌氧胺氧化技术最为广泛应用，可以于生物反应器中将氨氮与亚硝酸氮同时反应为氮气而将水中氨氮脱除，相较于传统生物法而言可以减省很多步骤，但是缺点是所述技术对于环境系统中的溶氧值、酸碱值、温度以及废水中原有的微生物菌落群相当敏感，且处理程序结束后会产生许多生物污泥需要二次处理成本。
故仍有必要提供一种杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法、生物塑料以及废水处理方法，以解决现有技术中所存在的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，提供多种单醣作为碳源，并调整其最佳比例来获得最大产率，可大量获得杜鹃拟青霉菌菌丝体。
本发明的另一目的在于提供多种杜鹃拟青霉菌菌丝体的应用方式，包含一生物塑料以及一废水处理方法。所述生物塑料使用一杜鹃拟青霉菌菌丝体作为主要成分，具有生物可降解的特性，是绿色环保素材。所述废水处理方法则直接使用一杜鹃拟青霉菌孢子，可降解废水中的氨氮成长出菌丝体，所述菌丝体可以进一步吸附氨氮，将废水中的氨氮集中于所述杜鹃拟青霉菌孢子周边以有利于持续进行降解。因此，在所述氨氮化合物存在时，所述杜鹃拟青霉菌孢子可成长出更多菌丝体，而菌丝体又可以协助降解转化氨氮，是一种环保、可循环再生且具备经济价值的废水处理方法。
为达上述目的，本发明的一实施例提供一种杜鹃拟青霉菌(PaceliomycesSaturatus)菌丝体的制造方法，其包含下列步骤：提供一培养基质，所述培养基质包含至少一单醣以及至少一无机物质；将一杜鹃拟青霉菌孢子置于所述培养基质中；在有氧环境中进行一预设时间的培养，使所述杜鹃拟青霉菌孢子生长形成一杜鹃拟青霉菌菌丝体；以及过滤以获得所述杜鹃拟青霉菌菌丝体。
在本发明的一实施例中，所述至少一单醣为葡萄糖、果糖或甘露醇。
在本发明的一实施例中，所述至少一单醣包含葡萄糖、果糖及甘露醇，所述葡萄糖、果糖及甘露醇的比例为1：3：1。
在本发明的一实施例中，所述预设时间为大于或等于4天。
在本发明的一实施例中，所述无机物质包含至少一种成分选自于由磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸钙、氯化亚铁、钼酸钠及氯化铵所组成的一族群。
在本发明的一实施例中，所述培养基质含有一铵离子浓度大于或等于400毫克/升。
为达上述的目的，本发明的另一实施例提供一种生物塑料，其包含一杜鹃拟青霉菌菌丝体以及一交联剂，其中所述杜鹃拟青霉菌菌丝体是以上述制造方法加以制造，且所述杜鹃拟青霉菌菌丝体以重量计占所述生物塑料的90至98％。
在本发明的一实施例中，其中所述交联剂为琼脂或京尼平。
为达上述的目的，本发明的再一实施例提供一种废水处理方法，其包含下列步骤：在一氨氮废水中加入一杜鹃拟青霉菌孢子；以及调整所述氨氮废水的酸碱性至pH值为4.8至5.2。
在本发明的一实施例中，所述杜鹃拟青霉菌孢子加入所述氨氮废水之前先形成一悬浮液，所述悬浮液的菌数含量为106/ml，且所述悬浮液以重量计占所述氨氮废水的1％以上。
为让本发明的上述内容能更明显易懂，下文特举优选实施例，并配合所附图式，作详细说明如下：
附图说明
图1A至1C：本发明的杜鹃拟青霉菌菌种在显微镜下的型态。
图2：本发明实验3中在三种不同单糖比例中的干燥生物质分布情况。
图3：本发明实验4不同培养时间下铵浓度的变化趋势图。
图4：本发明实验4中模拟废水处理后的杜鹃拟青霉菌菌丝体型态。
图5：本发明实验7中不同琼脂比例所制得的生物塑料膜外观。
图6：本发明实验8中所制得的生物塑料膜外观。
图7：显示本发明实验9中的偶氮染料吸附在菌丝体的真菌细胞壁上。
图8：本发明实验10中，苏丹黑B染料降解前后的UV-Vis光谱变化及染料颜色的变化。
具体实施方式
为了让本发明的上述及其他目的、特征、优点能更明显易懂，下文将特举本发明较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。再者，本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％～11％的A)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦A≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的B，或0.2％以下的B)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦B≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。
本发明的一实施例提供一种杜鹃拟青霉菌(Paceliomyces Saturatus)菌丝体的制造方法，其包含下列步骤：提供一培养基质，所述培养基质包含至少一单醣以及至少一无机物质；将一杜鹃拟青霉菌孢子置于所述培养基质中；在有氧环境中进行一预设时间的培养，使所述杜鹃拟青霉菌孢子生长形成一杜鹃拟青霉菌菌丝体；以及过滤以获得所述杜鹃拟青霉菌菌丝体。在一实施例中，所述至少一单醣为葡萄糖、果糖或甘露醇。优选的，所述至少一单醣包含葡萄糖、果糖及甘露醇，其中所述葡萄糖、果糖及甘露醇的比例为1：3：1。在本发明的一实施例中，所述预设时间为大于或等于4天。在本发明的一实施例中，所述无机物质包含至少一种成分选自于由磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸钙、氯化亚铁、钼酸钠及氯化铵所组成的一族群。在本发明的一实施例中，所述培养基质含有一铵离子浓度大于或等于400毫克/升。
本发明的另一实施例提供一种生物塑料，其包含一杜鹃拟青霉菌菌丝体以及一交联剂，其中所述杜鹃拟青霉菌菌丝体是以上述制造方法加以制造，且所述杜鹃拟青霉菌菌丝体以重量计占所述生物塑料的90至98％。在本发明的一实施例中，其中所述交联剂为琼脂或京尼平。
本发明的再一实施例提供一种废水处理方法，其包含下列步骤：在一氨氮废水中加入一杜鹃拟青霉菌孢子；以及调整所述氨氮废水的酸碱性至pH值为4.8至5.2。在一实施例中，杜鹃拟青霉菌孢子加入所述氨氮废水之前先形成一悬浮液，所述悬浮液的菌数含量为106/ml，且所述悬浮液以重量计占所述氨氮废水的1％以上。
为验证杜鹃拟青霉菌菌丝体的组成及其应用效果，本发明进行以下实验。
实验1：杜鹃拟青霉菌菌株的培养
首先从中国台湾高雄第一科大赖俊吉教授的共生菌发酵液接种40ppm于高浓度的含铵离子培养液中透过好氧曝气培养14天后，于环境中筛选出真菌菌株，在37℃下培养所述菌株7天后，以肉眼观察琼脂板上的绿棕色菌落I。或者，从工业区污水处理厂的含铵离子废水中筛选出真菌菌株，在37℃下培养所述菌株7天后，以肉眼观察琼脂板上的绿棕色菌落II。将绿棕色菌落I及绿棕色菌落II的菌丝体从琼脂平板固定到载玻片上并用考马斯亮蓝染色后，显示出在显微镜下产生球形无性孢子的扫帚样分生孢子，这是拟青霉菌菌种的典型表型。图1A至1C所示为所述绿棕色菌落II在显微镜下的型态。
实验2：杜鹃拟青霉菌的鉴定
将实验1所收获的绿棕色菌落I及绿棕色菌落II经过ITS测序后，实验1所培养的真菌菌株确认与真菌菌株Paceliomyces Saturatus具有99.9％相似性，可确认实验1所得菌株为杜鹃拟青霉菌，所述菌株已由Nakazawa教授(ATCC 11971 TM)在ATCC中寄存，且实验1的两菌株与ATCC 11971 TM具有相同的特征，它们都可以在液体培养基中生长并利用乙酸作为单一碳源。虽然实验1所取得的真菌菌株来源不同，但收获的真菌均为杜鹃拟青霉菌。
实验3：培养菌丝体
制备含有5g/L碳源(单醣：葡萄糖、果糖、甘露醇)、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L硫酸镁、0.5g/L氯化钠、1g/L硫酸钙、40mg/L氯化亚铁、5mg/L钼酸钠以及0.764g/L氯化铵的培养基，将1L培养基在121℃下灭菌1小时后，将1wt％的杜鹃拟青霉菌孢子悬浮液加入血清瓶中。
在有氧环境中培养4天后，通过过滤收集菌丝体，获得总干燥生物质，如下表1所示。
表1
Figure BDA0001881298650000061
从上表1可知，在第17组中所使用的单糖可获得最大产率的干燥生物质，所述碳源的最佳比例是葡萄糖：果糖：甘露醇＝1：3：1。在这个比例下，可以得到3.501g/L的干燥生物质，请参见图2所示。
实验4：模拟氨氮废水处理
在1L批次的好氧生物反应器中，设定初始铵浓度为400mg/L(ppm)，温度为25℃，pH为5。利用一空气分配器自所述好氧生物反应器底部进行搅拌。然后，将1wt％的杜鹃拟青霉菌孢子悬浮液(菌数含量106/ml)加入所述好氧生物反应器中并培养4天，接着静置12小时，并且持续测量水中的铵浓度。
请参照图3，在整个实验过程中，铵浓度从406.2ppm下降至1.82ppm，通过计算可获得水中铵的去除率为99.5％，故已可达到废水的放流水标准。
此外，最终的成长的菌丝体生物量是颗粒状的形式，在生物处理过程后可以很容易地沉淀于底部，如图4所示。
实验5：甲壳素/壳聚醣的提取
在有氧条件下在液体培养基中培养杜鹃拟青霉菌孢子4天后，通过重力过滤获得菌丝体并在真空烘箱中干燥过夜。将菌丝体生物质精细研磨并使用0.5M NaOH碱性溶液在120℃下洗涤0.5小时，以8000rpm离心10分钟并移去上清液，获得一沉淀物A。取出所述沉淀物A，在120℃下及10wt％乙酸中再溶解4小时，随后以8000rpm离心10分钟并分别收集一上清液B及一沉淀物C。在所述上清液B中逐滴添加150mM NaOH调整pH值至8。最后，通过离心收集底部的一沉淀物D。将所述沉淀物D冷冻干燥过夜后，可以获得纯的真菌壳聚糖。将所述沉淀物C冷冻干燥8小时后，可以获得纯化后的真菌几丁质。
从杜鹃拟青霉菌菌丝体所提取的壳聚糖的脱乙酰基DD％约为84％，这表明杜鹃拟青霉菌确实是可做为高DD％壳聚糖的来源。由XRD光谱计算，所述壳聚糖的结晶度指数约为3.2。
甲壳素/壳聚糖广泛存在于甲壳类动物的壳中，通常必须利用强机械力，浓碱溶液和极高的温度来提取壳聚糖。因此，甲壳类提取出的壳聚糖的物理性质较差，且分子量及DD％都不够好。此外，在提取过程中衍生的几丁质也是低分子量。相比之下，使用杜鹃拟青霉菌作为提取壳聚糖及几丁质的来源，由于其细胞壁中富含几丁质/壳聚糖，网状的菌丝体松散地由微纤维菌丝组成，壳聚糖可以通过温和的方法容易地从细胞壁中提取，并且仍然保持高分子量和高脱乙酰率。因此，杜鹃拟青霉菌是提供高质量几丁质/壳聚糖的一个最佳来源。
实验6：菌丝体制成生物塑料膜
将0.2g干燥的杜鹃拟青霉菌菌丝体在10ml去离子水中充分洗净并加热至100℃保持15分钟。在加热过程完成后，将均匀溶液倒入模具中并冷却至室温，然后在烘箱中37℃下干燥8小时，获得一菌丝体膜。
实验7：菌丝体与琼脂制成生物塑料膜
将0.1g干燥的杜鹃拟青霉菌菌丝体和不同重量比例的琼脂在10ml去离子水中充分洗净并加热至100℃保持15分钟。在加热过程完成后，将均匀溶液倒入模具中并冷却至室温，然后在烘箱中37℃下干燥8小时，获得一菌丝体/琼脂膜，经测量含水量1至3％。亦可以应用明胶、玻尿酸取代琼脂与分子链中的氢氧基产生氢键进行物理交联反应。
如图5所示，没有添加琼脂时(0wt％)，所述菌丝体膜的机械强度弱且易碎。然而，添加0.5wt％琼脂后，强度可以得到显著改善。随着逐渐增加比例从0.5wt％到1.5wt％，制成的生物塑料膜变得更光滑和更坚韧，且疏水性也增加。
实验8：菌丝体与京尼平(genipin)制成生物塑料膜
将0.2g干燥的杜鹃拟青霉菌菌丝体在10ml去离子水中充分洗净后，加入4mg京尼平并反应4小时。在完成交联反应后，将反应溶液倒入模具中并冷却至室温，然后在烘箱中37℃下干燥8小时，可获得如图6所示的一菌丝体/京尼平薄膜，经测量含水量1至3％。亦可以应用戊二醛、马来酸酐取代京尼平与分子链中的胺基脱水聚合产生交联反应。
实验9：菌丝体对染料的吸附作用
将偶氮染料化合物苏丹黑B(SBB)与水混合制备150mg/L的SBB水溶液，然后加入2wt％干燥的杜鹃拟青霉菌菌丝体，并滴加NaOH调节pH值。为了观察pH值对于吸附力的影响，改变pH值从3至9，观察所述杜鹃拟青霉菌菌丝体对染料的饱和吸附效果。
当pH值为7时，SBB水溶液中的铵浓度在最初3小时可迅速下降，总偶氮染料去除率为94％。因此，可验证所述杜鹃拟青霉菌菌丝体是用于偶氮染料处理的理想生物吸附材料。在图7中，可以清楚地看到偶氮染料吸附在菌丝体的真菌细胞壁上。
偶氮染料是含有C-N＝N-C键和芳环的有机化合物，广泛用于纺织和皮革制品工业。由于杜鹃拟青霉菌菌丝体的细胞壁富含羟基、胺基、硫酸基和磷酸基，它们可以增强杜鹃拟青霉菌菌丝体对偶氮染料的吸附能力，作为良好的生物吸附剂。
实验10：菌丝体对染料的降解作用
秤重并在100ml无菌去离子水中溶胀0.2wt％干燥的杜鹃拟青霉菌菌丝体。制备1wt％苏丹黑B(SBB)乙醇溶液并搅拌30分钟直至其均匀溶解。最后，将2ml SBB溶液加入98ml菌丝体中，并使用NaOH和乙酸调整溶液的pH至7。在80rpm，37℃下震荡培养2周。
SBB最初会吸附在菌丝体上，变成深蓝色。随着时间的推移，深蓝色的菌丝体会变成紫色甚至是粉红色。从UV-Vis光谱中，600nm附近的SBB吸附峰消失，降解后在500nm附近出现新的吸收区，表明SBB的分子结构已经被破坏，如图8所示。从特征吸收峰的蓝移，代表了SBB降解为较小的分子，因此提供了较短的共轭电子路径系统。
相较于先前技术，本发明所提供的废水处理方法中，所述杜鹃拟青霉菌是一种真菌类，在一个绝对好氧的环境中进行氨氮废水的处理，因此对于水中的溶氧值要求并不严格，并且处理过后所衍生的真菌生物质与混合液体可以轻易分离，可直接回收具有经济价值的真菌菌丝体副产物，进一步能被用来制备成一生物塑胶或者是一生物吸附剂。
本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已公开的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包含于权利要求书的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，其特征在于：所述制造方法包含下列步骤：
提供一培养基质，所述培养基质包含至少一单醣以及至少一无机物质；
将一杜鹃拟青霉菌孢子置于所述培养基质中；
在有氧环境中进行一预设时间的培养，使所述杜鹃拟青霉菌孢子生长形成一杜鹃拟青霉菌菌丝体；以及
过滤以获得所述杜鹃拟青霉菌菌丝体。
2.如权利要求1所述的杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，其特征在于：所述至少一单醣为葡萄糖、果糖或甘露醇。
3.如权利要求1所述的杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，其特征在于：所述至少一单醣包含葡萄糖、果糖及甘露醇，所述葡萄糖、果糖及甘露醇的比例为1：3：1。
4.如权利要求1所述的杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，其特征在于：所述预设时间为大于或等于4天。
5.如权利要求1所述的杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，其特征在于：所述无机物质包含至少一种成分选自于由磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸钙、氯化亚铁、钼酸钠及氯化铵所组成的一族群。
6.如权利要求1所述的杜鹃拟青霉菌菌丝体的制造方法，其特征在于：所述培养基质含有一铵离子浓度大于或等于400毫克/升。
7.一种生物塑料，其特征在于：所述生物塑料包含一杜鹃拟青霉菌菌丝体以及一交联剂，其中所述杜鹃拟青霉菌菌丝体是以如权利要求1所述的制造方法加以制造，且所述杜鹃拟青霉菌菌丝体以重量计占所述生物塑料的90至98％。
8.如权利要求7所述的生物塑料，其特征在于：所述交联剂为琼脂或京尼平。
9.一种废水处理方法，其特征在于：所述废水处理方法包含下列步骤：
在一氨氮废水中加入一杜鹃拟青霉菌孢子；以及
调整所述氨氮废水的酸碱性至pH值为4.8至5.2。
10.如权利要求9所述的废水处理方法，其特征在于：杜鹃拟青霉菌孢子加入所述氨氮废水之前先形成一悬浮液，所述悬浮液的菌数含量为106/ml，且所述悬浮液以重量计占所述氨氮废水的1％以上。
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