TWI703134B - 一種具有抗癌作用的化合物及其製備方法和應用（二） - Google Patents

Abstract

本發明提供一種式I結構的化合物及其製備方法和治療癌症的用途。本發明化合物對多種癌細胞具有抑制作用，可在體外(血漿中)經生物學轉化為活性藥物Linifanib，以更低劑量抑制腫瘤細胞尤其是肝癌細胞的增殖。

Description

一種具有抗癌作用的化合物及其製備方法和應用(二)

本發明係關於一種化合物及其製備方法和應用，具體係關於在體內選擇性轉化為更強抗癌活性的化合物及其製備方法和應用。

背景技術

利用抗腫瘤藥物選擇性地殺傷腫瘤細胞而對正常細胞毒性較小，一直是腫瘤治療中的難題。近年來興起的靶向治療主要針對腫瘤細胞中特定靶點的變異，為腫瘤患者帶來了福音。但是靶向治療也存在受益患者群體小以及用藥後迅速耐藥等諸多限制。這就迫使生物醫藥研發必需另闢蹊徑，來為更多的患者提供新的治療方案。

Linifanib是一個多靶點的抗癌化合物，其靶點多為血管新生相關的激酶，對VEGFRs，PDGFRs，CSF-1R和Flt-1/3均有較好的抑制作用。在針對肝癌的大型隨機III期臨床試驗中發現，Linifanib對肝癌患者的TTP(time to progression，疾病進展時間)及ORR(overall response rate，總體應答率)均明顯優於肝癌唯一批准的靶向藥Sorafenib(TTP 5.4月vs 4.0月，ORR 13.0% vs 6.9%)，但是其毒副作用也大於Sorafenib，因此其總體藥效並不強於Sorafenib，因而沒有通過FDA的審批(J Clin Oncol，2014，33，172-179)。

為解決上述問題，本申請將Linifanib或其衍生物通過多碳鏈與多肽連接在一起，形成化合物Linifanib-Cx-AAy(即本申請式I化合物)，利用PSMA(Prostate-Specific Membrane Antigen，前列腺特異膜抗原)在實體瘤的腫瘤內皮細胞及部分腫瘤細胞中的高表達，在腫瘤部位特異性地降解 Linifanib-Cx-AAy形成有活性的抗癌化合物Linifanib或其衍生物，從而在腫瘤部位特異性地富集抗癌化合物同時降低其全身毒性。

作為本申請的一個方面，本申請提供一種具有式I結構的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物或多晶形物：

其中，X選自O、S和NR₉；A選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f和CH₂C(O)NR₇，其中e和f獨立為0或1，其中各個基團由其左端連接R₃和R₄取代的環；L為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為0或1，n為0~11，p為0~8；Z選自-CR₁₀-，-CR₁₀-O-CR₁₀-，-S-S-，-CR₁₀=CR₁₀-，-CR_10≡CR₁₀-，-Ar，-CO-NH-和-N=CR₁₀-中的任意一種基團或幾種基團以常規方式相連接；R₁和R₂獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳氧基、芳氧基烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、雜環基、雜環基烯基、雜環基烷氧基、雜環基烷基、雜環基氧基烷基、羥基、羥基烷氧基、羥基烷基、(NR_aR_b)烷氧基、(NR_aR_b)烯基、(NR_aR_b)烷基、(NR_aR_b)羰基烯基和(NR_aR_b)羰基烷基；R₃和R₄獨立選自氫、烷氧基、烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基和羥基；R₅和R₆獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、芳氧基、芳基烷基、羧基、氰基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、羥基、羥基烷基、硝基和-NR_cR_d；R₇和R₈獨立選自氫和烷基； R₉選自氫、烯基、烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、雜環基烷基、羥基烷基和(NR_aR_b)烷基；R₁₀選自氫、烷基、烷氧基、芳氧基、鏈烯氧基、硝基、鹵基、伯胺基、仲胺基和叔胺基；R₁₁選自氫、羥基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、雜環烷基；R_a和R_b獨立選自氫、烷基、烷基羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、鹵代烷基磺醯基和雜環基磺醯基；R_c和R_d獨立選自氫、烷基、烷基羰基、芳基、芳基烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基和雜環基烷基。

具體的，各化合物結構如下：

反應路線：

首先將多肽(反應物1)與帶苄基保護的L(反應物2)在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物1，該中間體化合物1進一步在極性溶劑中進行催化氫化脫除保護基團得到中間體化合物2；將中間體化合物2與Linifanib或其衍生物在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物3，該中間體化合物3進一步在酸性條件下脫除保護基團得到式I化合物。

反應路線圖：

進一步，在上述製備中間體化合物1方法中，所述反應溫度在-20℃至125℃下進行；所述有機溶劑選自含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、醯胺、腈、酯或者其混合物；所述催化劑為1-羥基苯並三唑(HOBT)；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的任意一種或幾種。該步驟中，反應中反應物1、2反應莫耳比為1：1~1：10，反應物1與縮合劑的莫耳比為1：0.1~1：10；反應物1與催化劑的莫耳比為1：0.1~1：10。

進一步，在上述製備中間體化合物2方法中，所述反應溫度在-20℃至250℃下進行；所述有機溶劑選自含有1-20個碳原子的醚、醇、鹵代烷、醯胺、腈或者其混合物，或與水各種比例的混合物；所述催化劑為鈀碳，氫氧化鈀幹性或濕性。上述製備方法中，中間體化合物2與催化劑反應莫耳比為1：0.1~1：10。

進一步，在上述製備中間體化合物3方法中，上述反應溫度在-20℃至125℃下進行；所述有機溶劑選自含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、醯胺、腈、酯或其混合物；所述催化劑為1-羥基苯並三唑(HOBT)；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的任意一種或幾種。該步驟中，Linifanib或其衍生物與中間體化合物2莫耳比為1：1~1：10，Linifanib或其衍生物與縮合劑的莫耳比為1：0.1~1：10；與催化劑的莫耳比為1：0.1~1：10。

進一步，在上述製備式1化合物方法中，所述反應溫度在-20℃至125℃下進行；所述有機溶劑是含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、醯胺、腈、酯或者它們各種比例的混合物；所述酸性試劑為甲酸，乙酸，三氟乙酸。上述製備方法中，中間體化合物3與酸性試劑反應莫耳比為1：1~1：10。

作為本申請的另一個方面，本申請提供了一種藥物組合物，其包含本申請上述的式I化合物或其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物、多晶形物或前藥，和藥學上可接受的載體。所述藥物組合物包括但不限於口服劑型、胃腸外給藥劑型、外用劑型和直腸給藥劑型。在一些實施方式中，所述藥物組合物可以是口服的片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、緩釋製劑、溶液劑和懸浮液，用於胃腸外注射的無菌溶液、懸浮液或乳液，用於外用的軟膏或乳膏，或者用於直腸給藥的栓劑。在一些實施方式中，所述藥物組合物和至少一種治療劑分別以獨立的劑型組合成組合產品，如藥劑盒。

作為本申請的另一個方面，本申請提供所述式I化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物、多晶形物在製備具有抗癌作用的藥物中 的應用。所述癌症包括食管癌、子宮內膜癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃腸道間質瘤、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、黑色素瘤等。優選針對肝癌效果最佳。

作為本申請的另一個方面，本申請提供一種治療癌症的方法，該方法包括將治療有效量的所述式I化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物、多晶形物施用於由此需求的個體。在一些實施方式中，所述癌症包括食管癌、子宮內膜癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃腸道間質瘤、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、黑色素瘤等。優選針對肝癌效果最佳。

本申請所述“藥學上可接受的鹽”是指保留了指定化合物的遊離酸和遊離鹼的生物效力，並且在生物學或其他方面沒有不良作用的鹽。本申請中的鹽指用有機酸/無機酸形成的酸式鹽，以及用有機鹼/無機鹼形成的鹼式鹽。

本申請所述“溶劑化物”是指通過溶劑化作用形成的本申請化合物與溶劑分子的組合。如水合物、乙醇溶劑化物、甲醇溶劑化物等。

本申請所述“多晶形物”或“多晶形”是指以不同的晶格形式存在的本申請化合物。

本申請所述“立體異構體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體。

本申請所述“藥物組合物”是指任選的混合有至少一種藥學上可接受的化學成分的生物活性化合物，所述藥學上可接受的化學成分包括但不限於載體、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑。所述“載體”是指相對無毒的化學試劑，其有助於將化合物引入到細胞或組織中。

本申請所述“烷基”是指含1至10個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴鏈，包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、 2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。

所述“芳基”是指含有6至14個碳環原子的芳族碳環基。芳基可以是單環的或多環的。在多環芳族環的情況下，所述多環系中的僅一個環需要是不飽和的，而剩餘的一或多個環可以是飽和的、部分飽和的或不飽和的。芳基的例子包括苯基、萘基、茚基、茚滿基和四氫萘基。

所述“雜芳基”是指具有至少一個碳原子和一個或多個的獨立地選擇的氮、氧或硫原子的五元或六元芳族環。具體地，所述“雜芳基”是指含有5至14個環原子的芳族雜環基。雜芳基可以是單環或2個或3個稠合環。雜芳基取代基的例子包括：6元環取代基，諸如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基和1,3,5-、1,2,4-或1,2,3-三嗪基；5元環取代基，諸如咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、1,2,3-、1,2,4-、1,2,5-、或1,3,4-噁二唑基和異噻唑基；6/5元稠合環取代基，諸如苯並噻吩基、苯並異噁唑基、苯並噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯並咪唑基、吡咯並[2,3-b]吡啶基、嘌呤基；和6/6元稠合環，諸如苯並吡喃基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、喹唑啉基和苯並噁嗪基。

所述“環烯基”是指單環或橋連烴環系。單環環烯基具有4、5、6、7或8個碳原子和0個雜原子。四元環系具有一個雙鍵，五元或六元環系具有一個或兩個雙鍵，七元或八元環系具有一個、兩個或三個雙鍵。單環環烯基的代表性例子包括、但不限於：環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基和環辛烯基。

所述“雜環烷基”是指含有共計3至14個環原子的飽和環結構。環原子中的至少一個是雜原子(即氧、氮或硫)，其餘環原子獨立地選自碳、氧、氮和硫。如四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、三唑基、四唑基。

所述的“有效量”是指無毒性，但足夠量的提供所需的作用的藥物或藥劑。在本發明的藥物組合物或藥劑盒中，一種成分或製劑單元的“有效量”是指該成分在和其他成分聯合應用時有效提供所需效應的量。“有效量”會因 受試者的不同而不同，依據年齡和個體的一般情況，特定的活性藥物等等。因此，不可能總是指精確的“有效量”，然而，任何個體病例中合適的“有效量”可以由本領域普通技術人員應用常規的實驗方法來測定。

所述“受試者”可以指患者或者其它接受本發明化合物或藥物組合物以治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。

為進行體外實驗，本申請還合成了式I化合物的代謝產物式II化合物，其反應路線為：首先Linifanib或其衍生物與帶Boc保護的L(反應物3)在縮合劑和催化劑條件下反應生成中間體化合物Ma，該中間體化合物Ma在三氟乙酸作用條件下脫除Boc保護生成中間體化合物Mb，該中間體化合物Mb進一步與帶保護基的天門冬氨酸縮合得到中間體化合物Mc，中間體化合物Mc在三氟乙酸條件下脫除Boc保護生成中間體化合物Md，Md在貴金屬催化劑條件下催化氫化脫除苄基得到代謝產物式2化合物。

反應路線圖：

其中，X選自O、S和NR₉；A選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f和CH₂C(O)NR₇，其中e和f獨立為0或1，其中各個基團由其左端連接R₃和R₄取代的環；L為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為0或1，n為0~11，p為0~8；Z選自-CR₁₀-，-CR₁₀-O-CR₁₀-，-S-S-，-CR₁₀=CR₁₀-，-CR_10≡CR₁₀-，-Ar，-CO-NH-和-N=CR₁₀-中的任意一種基團或幾種基團以常規方式連接； R₁和R₂獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳氧基、芳氧基烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、雜環基、雜環基烯基、雜環基烷氧基、雜環基烷基、雜環基氧基烷基、羥基、羥基烷氧基、羥基烷基、(NR_aR_b)烷氧基、(NR_aR_b)烯基、(NR_aR_b)烷基、(NR_aR_b)羰基烯基和(NR_aR_b)羰基烷基；R₃和R₄獨立選自氫、烷氧基、烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基和羥基；R₅和R₆獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、芳氧基、芳基烷基、羧基、氰基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、羥基、羥基烷基、硝基和-NR_cR_d；R₇和R₈獨立選自氫和烷基；R₉選自氫、烯基、烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、雜環基烷基、羥基烷基和(NR_aR_b)烷基；R₁₀選自氫、烷基、烷氧基、芳氧基、鏈烯氧基、硝基、鹵基、伯胺基、仲胺基和叔胺基；R_a和R_b獨立選自氫、烷基、烷基羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、鹵代烷基磺醯基和雜環基磺醯基；R_c和R_d獨立選自氫、烷基、烷基羰基、芳基、芳基烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基和雜環基烷基。

具體的，各代謝產物結構見如下：

本發明研究表明，所述式I化合物對多種癌細胞具有抑制作用，可在體外血漿中經生物學轉化為活性藥物Linifanib，以更低劑量抑制腫瘤細胞尤其是肝癌細胞的增殖。

具體實施方式 實施例1~4：製備目標化合物8(Linifanib-C ₁₂ -AA ₅ ) 實施例1 中間體化合物1的製備

稱取苄基-(12-氨基)十二烷酸酯鹽酸鹽404mg(1.18mmol)、HOBT 238mg(1.76mmol)、EDCI 192mg(1.76mmol)溶於250ml二氯甲烷中，室溫攪拌溶解。控制反應溫度20~40℃緩慢加入Asp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-(OtBu)1267mg(1.23mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油 狀物進行矽膠柱層析(石油醚/丙酮=10：1~2：1)，得黃色固體粉末553mg，收率35.6%。

實施例2 中間體化合物2的製備

稱取實施例1製備的中間體化合物14000mg(3.0mmol)，溶於100ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 50mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得黃褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得淺黃色固體粉末1595mg，收率42.8%。¹H NMR(CDCl₃)δ1.27(brs,14H),1.46~1.47(m,54H),1.65~1.85(m,8H),2.34~2.35(brs,16H),,3.06~3.36(brs,2H),4.46-4.52(m,5H),6.31(brs,1H,-NH-C=O),6.68(brs,1H,-NH-C=O),6.91(brs,2H,-NH-C=O),7.19(brs,1H,-NH-C=O),7.54(brs,1H,-NH-C=O).¹³C NMR(CDCl₃)δ 192.97,190.34,173.02,172.22,172.00,171.81,171.22,171.08,170.76,82.42,82.27,82.08,82.02,80.64,80.53,52.35,51.83,51.44,39.84,33.79,32.52,32.15,31.61,31.11,29.26,29.11,28.97,28.92,28.86,28.78,28.71,28.48,28.33,28.10,28.01,27.98,27.76,27.65,26.68,24.61,12.10.

結構式為：

實施例3 中間體化合物3的製備

稱取1-N Boc Linifanib 760mg(1.6mmol)，HOBT 324mg(2.4mmol)、EDCI 460mg(2.4mmol)溶於250ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例2製備的中間體化合物2 2340mg(1.9mmol)，最後再加入DIPEA 516mg(4.0mmol)加畢，維持該反應溫度攪拌反應12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150 ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=0：1~100：1)，得類白色固體粉末882mg，收率32.7%。

實施例4 目標化合8(Linifanib-C ₁₂ -AA ₅ )的製備

稱取實施例3製備的中間體化合物3 1062mg(0.63mmol)溶於60ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應20~24h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入40ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得類白色固體粉末240mg，收率31.7%。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：12.94(s,1H),9.40(s,1H),9.22(s,1H),8.67(s,1H),8.55(s,1H),8.16(s,1H),8.04-8.07(m,4H),7.44-7.48(m,3H),7.33-7.40(m,3H),7.10(m,1H),6.98-6.99(m,1H),6.795(m,1H),4.17(m,6H),2.99(m,5H),2.55(m,4H),1.76-2.27(m,25H),1.13-1.32(m,22H).HPLC purity：99.831%(214nm),98.242%(254nm).MS(ESI)：m/z 1204.5[M+1]⁺

結構式為：

實施例5~9：製備目標化合物12(Linifanib-C ₁₂ -Asp) 實施例5 代謝產物中間體Ma的製備

稱取12-(Boc-氨基)十二烷酸186mg(0.59mmol)，HOBT 107mg(0.8mmol)、EDCI 152mg(0.8mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入1-N Boc Linifanib 252mg(0.53mmol)，最 後再加入DIPEA 171mg(1.3mmol)。加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物173mg，收率42.2%。

實施例6 代謝產物中間體Mb的製備

稱取實施例5製備的中間體Ma 255mg(0.33mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物155mg，收率82%。

實施例7 代謝產物中間體Mc的製備

稱取Boc-L-天冬氨酸1-苄酯137mg(0.42mmol)，HOBT 77.8mg(0.58mmol)、EDCI 110mg(0.58mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例6製備的中間體Mb 220mg(0.38mmol)，最後再加入DIPEA 124mg(0.96mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物183mg，收率54.9%。

實施例8 代謝產物中間體Md的製備

稱取實施例7製備的中間體化合物Mc 250mg(0.29mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離 有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物153mg，收率67.6%。

實施例9 目標化合物12(Linifanib-C ₁₂ -Asp)的製備

稱取實施例8製備的中間體Md 210mg(0.27mmol)，溶於30ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 25mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得淡黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得白固體粉末91mg收率49.2%。¹H-NMR(DMSO)δ：1.109-1.127(m,16H),1.234-1.352(m,2H),1.902-1.920(m,2H),2.278(s,3H),2.642-2.741(m,2H),2.993-3.040(m,2H),3.740-3,806(m,1H),6.796-6.808(m,1H),6.971-6.988(m,1H),7.089-7.118(m,1H),7.320-7.407(m,3H),7.453-7.505(m,3H),8.022-8.042(d,J=8Hz,1H),8.121-8.148(t,J=5.6Hz,1H),8.524(s,1H),9.219(s,1H),9.424(s,1H),12.956(s,1H).HPLC purity：96.6%(214nm),99.9%(254nm).MS(ESI)：m/z 688.4[M+1]+

結構式為：

以下實施例10~11中所述“前體”即為實施例1~4製備的Linifanib-C₁₂-AA₅(化合物8)，所述“中間體”即為實施例5~9製備Linifanib-C₁₂-Asp(化合物12)，所述“活性藥”為Linifanib，代謝途徑為Linifanib-C₁₂-AA₅→Linifanib-C₁₂-Asp→Linifanib。

實施例10 Linifanib相關化合物對腫瘤細胞株增殖的影響

本申請通過細胞增殖實驗(Alamar Blue檢測平臺)測定3個化合物(前體Linifanib-C₁₂-AA₅，中間體Linifanib-C₁₂-Asp和活性藥Linifanib)在54株商業化腫瘤細胞株(含26株肝癌細胞株)上的半數抑制濃度(IC₅₀值)，考察前體與活性藥Linifanib活性的差別。

1.儀器與材料

Thermo 311型CO₂培養箱；Haier生物安全櫃；Molecular Devices酶標儀；湘儀牌L530型臺式低速離心機；Olympus IX51倒置螢光顯微鏡，DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12 1：1培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩衝液(賽默飛世爾上海有限公司)；sigma二甲基亞碸(DMSO)、刃天青；54株商業化腫瘤細胞株(含26株肝癌細胞株)。

實驗藥物：前體Linifanib-C₁₂-AA₅(化合物8)；中間體Linifanib-C₁₂-Asp(化合物12)；活性藥Linifanib；化療藥阿黴素(Doxorubicin)(HY-15142；上海皓元生物醫藥科技有限公司)。

2.實驗方法

2.1不同細胞株的培養

54株細胞株培養在含胎牛血清的培養液中，放置於37℃、5%的CO₂培養箱中溫育。細胞均呈貼壁狀態生長，在倒置顯微鏡下觀察生長狀況，待細胞匯合率達到80%-90%時進行傳代培養。傳代比例和數量以實驗需求為准，此次細胞株傳代培養比例一般為1：2~1：3。

2.2對不同腫瘤細胞株的增殖抑制作用

細胞測試：取對數生長期的54株細胞株，以500~1×10⁴/孔(預實驗中確定各細胞株的最佳接種密度)的數量接種于96孔培養板中，在含5% CO₂的濕化培養箱中37℃培養4h後，每孔分別加入10μL前體Linifanib-C₁₂-AA₅，中間體Linifanib-C₁₂-Asp和活性藥Linifanib，每個化合物測試9個藥物濃度梯度(從最高測試濃度按3.16倍梯度稀釋)，根據各化合物溶解度的不同其起始濃度分別為100或30μM。並在每株細胞株測試 時同步加入QC參考化合物Doxorubicin，其最終藥物濃度依次分別為10、3.16、1、0.31、0.1、0.03、0.01、0.003和0.001μM。此外同時設置陽性對照組(100%抑制)及陰性對照組(0%抑制)，藥物組每濃度重複2孔，陽性對照組和陰性對照組重複6孔，培養箱中繼續培養6天后，接後續AlamarBlue測試操作；

AlamarBlue測試操作：每孔加10μL AlamarBlue試劑孵育1-4h，振盪1-2min，MD酶標儀EX：560nm,EM：590nm波長測得螢光值，記錄結果，通過計算本發明化合物對細胞抑制率(%)=(A_0%抑制-A_給藥)/(A_0%抑制-A_100%抑制)×100%，再利用GraphPad Prism 5.0或MATILAB軟體採用非線性回歸的方法(常採用四參數擬合曲線方程)作圖得到藥物劑量反應曲線，從而獲得本發明化合物作用於癌細胞株的IC₅₀值。

3.結果與分析

3.1 3個待測樣品(化合物8，12和Linifanib)在54株商業化腫瘤細胞株細胞株上的IC₅₀匯總結果如表1所示。

注：表中細胞株29-54表示肝癌細胞株對各化合物的應答

由表1結果可見，化合物8及12都成功地封閉了Linifanib抑制腫瘤細胞增殖的活性。絕大部分腫瘤細胞對這2個化合物和對Linifanib的IC₅₀差5倍以上。對Linifanib敏感的細胞有3株，分別為KASUMI-1(白血病細胞)，NCI-H1703(肺癌細胞)和AN3-CA(子宮內膜瘤細胞)，其IC50分別為0.01，0.02和0.19μM，其對前體Linifanib-C₁₂-AA₅(化合物8)的IC₅₀分別為0.39，0.19和5.68μM，相差分別為39，8.5和29.9倍。

54株商業化腫瘤細胞株中有26株為肝癌細胞株，近一半肝癌細胞株(12/26，46%)對Linifanib都是中度敏感，IC50<5μM，同時絕大部分肝癌細胞株(23/26，88%)對前體Linifanib-C₁₂-AA₅(化合物8)和對Linifanib的IC50差8倍以上，而幾乎所有肝癌細胞對中間體(化合物12)都無明顯應答，見表1。

實施例11 血漿穩定性研究

本實施例的目的是考察化合物8在大鼠血漿中孵育穩定性(化合物8代謝生成中間體化合物12和Linifanib，中間體化合物12進一步代謝生成Linifanib)，並對代謝產物進行定量分析，同時以陽性藥驗證孵育體系的穩定性，為化合物成藥性評價等提供參考。

1儀器與材料

儀器：API3000液質聯用儀，ABI

材料：雄性SD大鼠(200-250g)，北京維通利華

供試品：陽性藥及其代謝產物M1和M2，化合物8及其代謝產物化合物12和Linifanib。

2化合物8血漿穩定性研究

試驗動物

種類：SD大鼠；數量：2

性別：雄；體重：200-250g；

實驗步驟

1動物采血，血樣置於EDTA抗凝管中，在4℃條件下，3000g下離 心15min，分離血漿，2份血樣等體積混合；

2稱取一定量化合物化合物8溶於DMSO：MeOH(2：8)，經純度折算配製成200μM母液，在血漿中加入化合物使其終濃度為1μg/mL，體系中有機相比例不超過0.5%。

3 37℃水浴溫孵，設置取樣點0,0.5,1,2,4,6,8h。每個取樣點取100μL樣品加入300μL乙腈(含內標)進行沉澱處理，12000rpm離心5min，取上清200μL待LC-MS/MS進行分析。

4配置標準曲線，定量檢測化合物8，化合物12和Linifanib

3血漿穩定性研究結果

陽性藥按照預期隨時間延長在血漿中代謝為其代謝產物，說明血漿體系穩定，後續檢測結果可靠。

待測化合物8的血漿穩定性結果見表2。

由表2可知，化合物8在血漿中孵育比較穩定，產生的中間體化合物12和Linifanib量很少，其峰值莫耳濃度僅相當於化合物8的1/100和1/1000。

從以上血漿穩定性研究結果可以得出看到，化合物8在血漿中的穩定性很好，代謝產生的化合物12和Linifanib量都極少。

Claims (10)

1. 一種具有式I結構的化合物、其藥學上可接受的鹽或立體異構體，

   

   其中，X選自NR₉；A選自-N(R₇)C(O)N(R₈)-；L為-[(CO)_m(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為0或1，n為0~11，p為0~8；Z選自-CH₂-；R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈和R₉為氫；R₅和R₆獨立選自烷基或鹵基；R₁₁為羥基。
2. 如請求項1所述的化合物、其藥學上可接受的鹽或立體異構體，其結構式為：

   

   或，

   

   或，

   

   或，

   

   或，

   

   或，

   

   或，

   

   或，

   

   或，

   
3. 一種如請求項1或2所述的化合物、其藥學上可接受的鹽或立體異構體的製備方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟；步驟a，將多肽與帶苄基保護的L在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物1

   

   ，其中L如請求項1所定義；步驟b，所述中間體化合物1在極性溶劑中進行催化氫化脫除保護基團得到中間體化合物2

   

   ；步驟c，中間體化合物2與Linifanib或其衍生物在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物3

   

   步驟d，所述中間體化合物3在酸性條件下脫除保護基團得到式I化合物。
4. 如請求項3所述的製備方法，其特徵在於，步驟a中所述反應溫度為-20℃~125℃；所述催化劑為1-羥基苯並三唑；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、1,3-二環己基碳二亞胺或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或幾種。
5. 如請求項3所述的製備方法，其特徵在於，步驟b中所述反應溫度為-20℃~250℃；所述催化劑為鈀碳，氫氧化鈀乾性或濕性。
6. 如請求項3所述的製備方法，其特徵在於，步驟c中所述反應溫度為-20℃~125℃；所述催化劑為1-羥基苯並三唑；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、1,3-二環己基碳二亞胺或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或幾種。
7. 如請求項3所述的製備方法，其特徵在於，步驟d中所述反應溫度為-20℃~125℃；所述酸性試劑為甲酸，乙酸或三氟乙酸。
8. 一種治療有效量的請求項1或2所述的化合物、其藥學上可接受的鹽或立體異構體於製造治療癌症之藥物的用途。
9. 如請求項8所述之用途，其中所述癌症為食管癌、子宮內膜癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃腸道間質瘤、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌或黑色素瘤。
10. 如請求項9所述之用途，其特徵在於，所述癌症為肝癌。