TWI721255B

TWI721255B - 一種具有抗癌作用的化合物及其製備方法和應用（一）

Info

Publication number: TWI721255B
Application number: TW107107375A
Authority: TW
Inventors: 兆龍龔; 林毅暉; 李風慶; 唐方強
Original assignee: 大陸商思路迪（北京）醫藥科技有限公司
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2021-03-11
Also published as: TW201900619A

Abstract

本發明提供一種式I結構的化合物及其製備方法和治療癌症的用途。本發明化合物對多種癌細胞具有抑制作用，可在體外(肝勻漿和脾勻漿中)經生物學轉化為活性藥物利尼伐尼(Linifanib)，以更低劑量抑制腫瘤細胞尤其是肝癌細胞的增殖。

Description

一種具有抗癌作用的化合物及其製備方法和應用(一)

本發明涉及一種化合物及其製備方法和應用，具體涉及一種在體內選擇性轉化為更強抗癌活性的化合物及其製備方法和應用。

利用抗腫瘤藥物選擇性地殺傷腫瘤細胞而對正常細胞毒性較小，一直是腫瘤治療中的難題。近年來興起的靶向治療主要針對腫瘤細胞中特定靶點的變異，為腫瘤患者帶來了福音。但是靶向治療也存在受益患者群體小以及用藥後迅速耐藥等諸多限制。這就迫使生物醫藥研發必需另闢蹊徑，來為更多的患者提供新的治療方案。

利尼伐尼(Linifanib)是一個多靶點的抗癌化合物，其靶點多為血管新生相關的激酶，對VEGFRs，PDGFRs，CSF-1R和Flt-1/3均有較好的抑制作用。在針對肝癌的大型隨機III期臨床試驗中發現，利尼伐尼對肝癌患者的TTP(time to progression，疾病進展時間)及ORR(overall response rate，總體應答率)均明顯優於肝癌唯一批准的靶向藥索拉菲尼(Sorafenib)(TTP 5.4月vs 4.0月，ORR 13.0% vs 6.9%)，但是其毒副作用也大於索拉菲尼，因此其總體藥效並不強於索拉菲尼，因而沒有通過FDA的審批(J Clin Oncol，2014，33，172-179)。

為解決上述問題，本申請將利尼伐尼或其衍生物通過多碳鏈與多肽連接在一起，形成化合物利尼伐尼-Cx-AAy(即本申請式I化合物)，利用 PSMA(Prostate-Specific Membrane Antigen，前列腺特異膜抗原)在實體瘤的腫瘤內皮細胞及部分腫瘤細胞中的高表達，在腫瘤部位特異性地降解利尼伐尼-Cx-AAy形成有活性的抗癌化合物利尼伐尼或其衍生物，從而在腫瘤部位特異性地富集抗癌化合物同時降低其全身毒性。

作為本申請的一個方面，本申請提供一種具有式I結構的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物或多晶形物：

其中，A 選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f和CH₂C(O)NR₇，其中e和f獨立為0或1，其中各個基團由其左端連接R₃和R₄取代的環；L 為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為0或1，n為0~11，p為0~8；Z 選自-CR₁₀-，-CR₁₀-O-CR₁₀-，-S-S-，-CR₁₀=CR₁₀-，-CR₁₀≡CR₁₀-，-Ar，-CO-NH-和-N=CR₁₀-中的任意一種基團或幾種基團以常規方式相連接；R₁和R₂獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳氧基、芳氧基烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、雜環基、雜環基烯基、雜環基烷氧基、雜環基烷基、雜環基氧基烷基、羥基、羥基烷氧基、羥基烷基、(NR_aR_b)烷氧基、(NR_aR_b)烯基、(NR_aR_b)烷基、(NR_aR_b)羰基烯基和(NR_aR_b)羰基烷基；R₃和R₄獨立選自氫、烷氧基、烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基和羥基；R₅和R₆獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、芳氧基、芳基烷基、羧基、氰基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、羥基、羥基烷基、硝基和-NR_cR_d；R₇和R₈獨立選自氫和烷基；R₉選自氫、羥基，氨基，烯基、炔基，烷氧基，烷胺基，烷氧基烷基、烷基、烷氧基羰基、芳基、雜環烷基；R₁₀選自氫，烷基、烷氧基、芳氧基、鏈烯氧基、硝基、鹵基、伯胺基、仲胺基和叔胺基；R_a和R_b獨立選自氫、烷基、烷基羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、鹵代烷基磺醯基和雜環基磺醯基；R_c和R_d獨立選自氫、烷基、烷基羰基、芳基、芳基烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基和雜環基烷基。

具體的，各化合物結構如下：

反應路線：

首先將多肽(反應物1)與帶苄基保護的L(反應物2)在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物1，該中間體化合物1進一步在極性溶劑中進行催化氫化脫除保護基團得到中間體化合物2；將中間體化合物2與利尼伐尼或其衍生物在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物3，該中間體化合物3進一步在酸性條件下脫除保護基團得到式I化合物。

反應路線圖：

進一步，在上述製備中間體化合物1方法中，所述反應溫度在-20℃至125℃下進行；所述有機溶劑選自含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、醯胺、腈、酯或者其混合物；所述催化劑為1-羥基苯并三唑(HOBT)；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的任意一種或幾種。該步驟中，反應中反應物1、2反應莫耳比為1：1~1：10，反應物1與縮合劑的莫耳比為1：0.1~1：10；反應物1與催化劑的莫耳比為1：0.1~1：10。

進一步，在上述製備中間體化合物2方法中，所述反應溫度在-20℃至250℃下進行；所述有機溶劑選自含有1-20個碳原子的醚、醇、鹵代烷、醯胺、腈或者其混合物，或與水各種比例的混合物；所述催化劑為鈀碳、或乾性或濕性的氫氧化鈀。上述製備方法中，中間體化合物2與催化劑反應莫耳比為1：0.1~1：10。

進一步，在上述製備中間體化合物3方法中，上述反應溫度在-20℃至125℃下進行；所述有機溶劑選自含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、醯胺、腈、酯或其混合物；所述催化劑為1-羥基苯并三唑(HOBT)；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1,3-二環己基碳二亞胺(DCC)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的任意一種或幾種。該步驟中，利尼伐尼或其衍生物與中間體化合物2莫耳比為1：1~1：10，利尼伐尼或其衍生物與縮合劑的莫耳比為1：0.1~1：10；與催化劑的莫耳比為1：0.1~1：10。

進一步，在上述製備式1化合物方法中，所述反應溫度在-20℃至125℃下進行；所述有機溶劑是含有1-20個碳原子的醚、醇、烷烴、芳香烴、酮、鹵代烷、醯胺、腈、酯或者它們各種比例的混合物；所述酸性試劑為甲酸，乙酸及三氟乙酸的任意一種或幾種。上述製備方法中，中間體化合物3與酸性試劑反應莫耳比為1：1~1：10。

作為本申請的另一個方面，本申請提供了一種藥物組合物，其包含本申請上述的式I化合物或其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物、多晶形物，和藥學上可接受的載體。所述藥物組合物包括但不限於口服劑型、胃腸外給藥劑型、外用劑型和直腸給藥劑型。在一些實施方式中，所述藥物組合物可以是口服的片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、緩釋製劑、溶液劑和懸浮液，用於胃腸外注射的無菌溶液、懸浮液或乳液，用於外用的軟膏或乳膏，或者用於直腸給藥的栓劑。在一些實施方式中，所述藥物組合物和至少一種治療劑分別以獨立的劑型組合成組合產品，如藥劑盒。

作為本申請的另一個方面，本申請提供所述式I化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物、多晶形物在製備具有抗癌作用的藥物中的應用。所述癌症包括食管癌、子宮內膜癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃腸道間質瘤、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、黑色素瘤等。優選針對肝癌效果最佳。

作為本申請的另一個方面，本申請提供一種治療癌症的方法，該方法包括將治療有效量的所述式I化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、溶劑化物、多晶形物施用於由此需求的個體。在一些實施方式中，所述癌症包括食管癌、子宮內膜癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃腸道間質瘤、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、黑色素瘤等。優選針對肝癌效果最佳。

本申請所述「藥學上可接受的鹽」是指保留了指定化合物的游離酸和游離堿的生物效力，並且在生物學或其他方面沒有不良作用的鹽。本申請中的鹽指用有機酸/無機酸形成的酸式鹽，以及用有機堿/無機堿形成的鹼式鹽。

本申請所述「溶劑化物」是指通過溶劑化作用形成的本申請化合物與溶劑分子的組合。如水合物、乙醇溶劑化物、甲醇溶劑化物等。

本申請所述「多晶形物」或「多晶形」是指以不同的晶格形式存在的本申請化合物。

本申請所述「立體異構體」是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體。

本申請所述「藥物組合物」是指任選的混合有至少一種藥學上可接受的化學成分的生物活性化合物，所述藥學上可接受的化學成分包括但不限於載體、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑。所述「載體」是指相對無毒的化學試劑，其有助於將化合物引入到細胞或組織中。

本申請所述「烷基」是指含1至10個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴鏈，包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。

所述「芳基」是指含有6至14個碳環原子的芳族碳環基。芳基可以是單環的或多環的。在多環芳族環的情況下，所述多環系中的僅一個環需要是不飽和的，而剩餘的一或多個環可以是飽和的、部分飽和的或不飽和的。芳基的例子包括苯基、萘基、茚基、茚滿基和四氫萘基。

所述「雜芳基」是指具有至少一個碳原子和一個或多個的獨立地選擇的氮、氧或硫原子的五員或六員芳族環。具體地，所述「雜芳基」是指含有5至14個環原子的芳族雜環基。雜芳基可以是單環或2個或3個稠合環。雜芳基取代基的例子包括：6員環取代基，諸如吡啶基、吡

基、嘧啶基、噠

基和1,3,5-、1,2,4-或1,2,3-三

基；5員環取代基，諸如咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、

唑基、異

唑基、噻唑基、1,2,3-、1,2,4-、1,2,5-、或1,3,4-

二唑基和異噻唑基；6/5員稠合環取代基，諸如苯并噻吩基、苯并異

唑基、苯并

唑基、咪唑基、吲哚基、苯并咪唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、嘌呤基；和6/6員稠合環，諸如苯并吡喃基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、喹唑啉基和苯并

基。

所述「環烯基」是指單環或橋連烴環系。單環環烯基具有4、5、6、7或8個碳原子和0個雜原子。四員環系具有一個雙鍵，五員或六員環系具有一個或兩個雙鍵，七員或八員環系具有一個、兩個或三個雙鍵。單環環烯基的代表性例子包括、但不限於：環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基和環辛烯基。

所述「雜環烷基」是指含有共計3至14個環原子的飽和環結構。環原子中的至少一個是雜原子(即氧、氮或硫)，其餘環原子獨立地選自碳、氧、氮和硫。如四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、三唑基、四唑基。

所述的「有效量」是指無毒性，但足夠量的提供所需的作用的藥物或藥劑。在本發明的藥物組合物或藥劑盒中，一種成分或製劑單元的「有效量」是指該成分在和其他成分聯合應用時有效提供所需效應的量。「有效量」會因受試者的不同而不同，依據年齡和個體的一般情況，特定的活性藥物等等。因此，不可能總是指精確的「有效量」，然而，任何個體病例中合適的「有效量」可以由本領域普通技術人員應用常規的實驗方法來測定。

所述「受試者」可以指患者或者其它接受本發明化合物或藥物組合物以治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。

為進行體外實驗，本申請還合成了式I化合物的代謝產物式II化合物，其反應路線為：首先利尼伐尼或其衍生物與帶Boc保護的L(反應物3)在縮合劑和催化劑條件下反應生成中間體化合物Ma，該中間體化合物Ma在三氟乙酸作用條件下脫除Boc保護生成中間體化合物Mb，該中間體化合物Mb進一步與帶保護基的天門冬氨酸縮合得到中間體化合物Mc，中間體化合物Mc在三氟乙酸條件下脫除Boc保護生成中間體化合物Md，Md在貴金屬催化劑條件下催化氫化脫除苄基得到代謝產物式2化合物。

反應路線圖：

其中，A 選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f和CH₂C(O)NR₇，其中e和f獨立為0或1，其中各個基團由其左端連接R₃和R₄取代的環；L為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為0或1，n為0~11，p為0~8；Z 選自-CR₁₀-，-CR₁₀-O-CR₁₀-，-S-S-，-CR₁₀=CR₁₀-，-CR₁₀≡CR₁₀-，-Ar，-CO-NH-和-N=CR₁₀-中的任意一種基團或幾種基團以常規方式相連接； R₁和R₂獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳氧基、芳氧基烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、雜環基、雜環基烯基、雜環基烷氧基、雜環基烷基、雜環基氧基烷基、羥基、羥基烷氧基、羥基烷基、(NR_aR_b)烷氧基、(NR_aR_b)烯基、(NR_aR_b)烷基、(NR_aR_b)羰基烯基和(NR_aR_b)羰基烷基；R₃和R₄獨立選自氫、烷氧基、烷基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基和羥基；R₅和R₆獨立選自氫、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、芳氧基、芳基烷基、羧基、氰基、鹵基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、羥基、羥基烷基、硝基和-NR_cR_d；R₇和R₈獨立選自氫和烷基；R₁₀選自氫，烷基、烷氧基、芳氧基、鏈烯氧基、硝基、鹵基、伯胺基、仲胺基和叔胺基；R_a和R_b獨立選自氫、烷基、烷基羰基、烷基磺醯基、芳基磺醯基、鹵代烷基磺醯基和雜環基磺醯基；R_c和R_d獨立選自氫、烷基、烷基羰基、芳基、芳基烷基、環烷基、環烷基烷基、雜環基和雜環基烷基。

具體的，各代謝產物結構見如下：

本發明在合成階段曾嘗試在利尼伐尼多個位點進行結構修飾連接碳鏈和氨基酸，但結果均不理想，大部分化合物均未合成成功，產率很低，還有一部分化合物雖然合成成功，但沒有起到封閉利尼伐尼活性的作用，或是在血漿中不能穩定存在。最終僅1位連接的產物不僅得率高，且能成功封閉利尼伐尼活性，並能在體外(肝勻漿和脾勻漿中)經生物學轉化為活性藥物利尼伐尼，以更低劑量抑制腫瘤細胞尤其是肝癌細胞的增殖。

圖1前體和中間體肝勻漿穩定性第1次實驗

圖2前體和中間體肝勻漿穩定性第2次實驗

圖3前體和中間體脾勻漿穩定性第1次實驗

圖4前體和中間體脾勻漿穩定性第2次實驗

圖5肝脾勻漿對比

實施例1~2：製備目標化合物1 實施例1 中間體化合物3的製備

稱取利尼伐尼600mg(1.6mmol)，HOBT 324mg(2.4mmol)、EDCI 460mg(2.4mmol)溶於50ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入市售中間體化合物2 Asp(Boc)-Glu(OtBu)-(OtBu)912mg(1.92mmol)，最後再加入DIPEA 516mg(4.0mmol)加畢，維持該反應溫度攪拌反應12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=0：1~100：1)，得類白色固體粉末716mg，收率53.8%。

實施例2 目標化合物1的製備

稱取實施例1製備的中間體化合物3 500mg(0.38mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應20~24h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入40ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得類白色固體粉末106mg，收率44.9%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：9.37(s,1H),8.67(s,1H),8.32-8.27(m,2H),7.99-7.96(m,1H),7.65-7.59(m,3H),7.42-7.39(m,2H),7.27-7.18(m,2H),7.13-7.08(m,1H),6.81-6.78(m,2H),5.25(s,2H),4.34-4.11(m,2H),3.71-3.60(m,1H),2.91-2.81(m,1H),2.37-2.31(m,2H),2.28(s,3H),2.24-2.20(m,1H),1.89-1.86(m,1H).HPLC purity：96.1%(214nm),95.5%(254nm).MS(ESI)：m/z 620.0[M+1]⁺

結構式為：

實施例3~6：製備目標化合物4 實施例3 中間體化合物1的製備

稱取苄基-(6-氨基)己烷酸酯鹽酸鹽304mg(1.18mmol)、HOBT 238mg(1.76mmol)、EDCI 192mg(1.76mmol)溶於50ml二氯甲烷中，室溫攪拌溶解。控制反應溫度20~40℃緩慢加入Asp(Boc)-Glu(OtBu)-(OtBu)584mg(1.23mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(石油醚/丙酮=10：1~2：1)，得黃色固體粉末338mg，收率42.3%。

實施例4 中間體化合物2的製備

稱取實施例3製備的中間體化合物1 285mg(0.42mmol)，溶於60ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 25mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得黃褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得淺黃色固體粉末115mg，收率46.6%。

實施例5 中間體化合物3的製備

稱取利尼伐尼600mg(1.6mmol)，HOBT 324mg(2.4mmol)、EDCI 460mg(2.4mmol)溶於50ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例4製備的中間體化合物2 1129mg(1.92mmol)，最後再加入DIPEA 516mg(4.0mmol)加畢，維持該反應溫度攪拌反應12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=0：1~100：1)，得類白色固體粉末776mg，收率51.3%。

實施例6 目標化合物4的製備

稱取實施例5製備的中間體化合物3 595mg(0.63mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應20~24h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入40ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得類白色固體粉末193mg，收率41.9%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：9.30(s,1H),8.67(d,J=7.6Hz,1H),8.58(d,J=2.0Hz,1H)8.31(d,J=8.0Hz,1H)8.25-8.22(m,1H),8.09(s,3H),7.99(d,J=6.4Hz,1H),7.64-7.58(m,3H),7.41(d,J=8.4Hz,1H),7.19-7.09(m,2H),6.83(d,J=5.6Hz,1H),5.17(s,2H),4.26-4.14(m,2H),3.15-2.97(m,4H),2.70-2.54(m,2H),2.33-2.32(m,2H),2.28(s,3H),2.00-1.69(m,4H),1.50-1.36(m,4H).HPLC purity：98.23%(214nm),98.45%(254nm).MS(ESI)：m/z 733.0[M+1]⁺

結構式為：

實施例7~10：製備目標化合物7 實施例7 中間體化合物1的製備

稱取苄基-(12-氨基)十二烷酸酯鹽酸鹽404mg(1.18mmol)、HOBT 238mg(1.76mmol)、EDCI 192mg(1.76mmol)溶於50ml二氯甲烷中，室溫攪拌溶解。控制反應溫度20~40℃緩慢加入Asp(Boc)-Glu(OtBu)-(OtBu)584mg(1.23mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(石油醚/丙酮=10：1~2：1)，得黃色固體粉末278mg，收率35.6%。

實施例8 中間體化合物2的製備

稱取實施例7製備的中間體化合物1 2270mg(3.43mmol)，溶於100ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 50mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得黃褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得淺黃色固體粉末1101mg，收率56.1%。

實施例9 中間體化合物3的製備

稱取利尼伐尼600mg(1.6mmol)，HOBT 324mg(2.4mmol)、EDCI 460mg(2.4mmol)溶於50ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例8製備的中間體化合物2 1098mg(1.92mmol)，最後再加入DIPEA 516mg(4.0mmol)加畢，維持該反應溫度攪拌反應12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=0：1~100：1)，得類白色固體粉末589mg，收率39.6%。

實施例10 目標化合物7的製備

稱取實施例9製備的中間體化合物3 585mg(0.63mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應20~24h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入40ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得類白色固體粉末223mg，收率43.3%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：9.31(s,1H),8.67(d,J=7.6Hz,1H)8.59(s,1H),8.31(d,J=8.4Hz,1H),8.21(s,1H),8.19-7.98(m,4H),7.64-7.57(m,3H),7.42(d,J=8.0Hz,2H),7.19-7.09(m,2H),6.83-6.82(m,1H),5.18(s,2H),4.29-4.13(m,2H),3.12-2.96(m,4H),2.73-2.68(m,2H),2.67-2.63(m,2H),2.28(s,3H),2.12-1.67(m,4H),1.37-1.23(m,18H).HPLC purity：99.04%(214nm),99.01%(254nm).MS(ESI)：m/z 817.1[M+1]⁺

結構式為：

實施例11~14：製備目標化合物8(利尼伐尼-C ₁₂ -AA ₅ ) 實施例11 中間體化合物1的製備

稱取苄基-(12-氨基)十二烷酸酯鹽酸鹽404mg(1.18mmol)、HOBT 238mg(1.76mmol)、EDCI 192mg(1.76mmol)溶於250ml二氯甲烷中，室溫攪拌溶解。控制反應溫度20~40℃緩慢加入Asp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-(OtBu)1267mg(1.23mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(石油醚/丙酮=10：1~2：1)，得黃色固體粉末553mg，收率35.6%。

實施例12 中間體化合物2的製備

稱取實施例11製備的中間體化合物1 4000mg(3.0mmol)，溶於100ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 50mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得黃褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得淺黃色固體粉末1595mg，收率42.8%。¹H NMR(CDCl₃)δ1.27(brs,14H),1.46~1.47(m,54H),1.65~1.85(m,8H),2.34~2.35(brs,16H),,3.06~3.36(brs,2H),4.46-4.52(m,5H),6.31(brs,1H,-NH-C=O),6.68(brs,1H,-NH-C=O),6.91(brs,2H,-NH-C=O),7.19(brs,1H,-NH-C=O),7.54(brs,1H,-NH-C=O).¹³C NMR(CDCl₃)δ192.97,190.34,173.02,172.22,172.00,171.81,171.22,171.08,170.76,82.42,82.27,82.08,82.02,80.64,80.53,52.35,51.83,51.44,39.84,33.79,32.52,32.15,31.61,31.11,29.26,29.11,28.97,28.92,28.86,28.78,28.71,28.48,28.33,28.10,28.01,27.98,27.76,27.65,26.68,24.61,12.10.

結構式為：

實施例13 中間體化合物3的製備

稱取利尼伐尼600mg(1.6mmol)，HOBT 324mg(2.4mmol)、EDCI 460mg(2.4mmol)溶於250ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例12製備的中間體化合物2 2340mg(1.9mmol)，最後再加入DIPEA 516mg(4.0mmol)加畢，維持該反應溫度攪拌反應12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入100ml二氯甲烷稀釋，再用250ml去離子水洗滌兩次，分離有機相。有機相再用150ml飽和食鹽水洗滌，分液，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=0：1~100：1)，得類白色固體粉末1132mg，收率44.7%。

實施例14 目標化合物8(利尼伐尼-C ₁₂ -AA ₅ )的製備

稱取實施例13製備的中間體化合物3 1000mg(0.63mmol)溶於60ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應20~24h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入40ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得類白色固體粉末293mg，收率38.6%。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：9.51(s,1H),8.97(s,1H),8.56(s,1H),8.32(d,J=8.4Hz,1H),8.18(s,1H),8.02-7.96(m,4H),7.66-7.57(m,3H),7.42(d,J=8.8Hz,2H),7.19-7.08(m,2H),6.82-6.81(m,1H),5.18(s,2H),4.16-3.98(m,6H),3.07-2.96(m,4H),2.67-2.63(m,2H),2.28(s,3H),2.24-2.14(m,8H),2.03-1.87(m,5H),1.77-1.67(m,4H),1.37-1.23(m,18H).HPLC purity：99.3%(214nm),99.1%(254nm).MS(ESI)：m/z 1204.5[M+1]⁺

結構式為：

實施例15~17：製備目標化合物10 實施例15 代謝產物中間體Mc的製備

稱取Boc-L-天冬氨酸1-苄酯137mg(0.42mmol)，HOBT 77.8mg(0.58mmol)、EDCI 110mg(0.58mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入利尼伐尼143mg(0.38mmol)，最後再加入DIPEA 124mg(0.96mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物221mg，收率77.3%。

實施例16 代謝產物中間體Md的製備

稱取實施例15製備的中間體化合物Mc 198mg(0.29mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物131mg，收率77.8%。

實施例17 目標化合物10的製備

稱取實施例16製備的中間體Md 336mg(0.58mmol)，溶於30ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 25mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得淡黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得白固體粉末178mg收率62.6%。HPLC purity：97.2%(214nm),98.6%(254nm).MS(ESI)：m/z 491.0[M+1]+

結構式為：

實施例18~22：製備目標化合物11 實施例18 代謝產物中間體Ma的製備

稱取6-(BOC-氨基)己烷酸136mg(0.59mmol)，HOBT 107mg(0.8mmol)、EDCI 152mg(0.8mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入利尼伐尼200mg(0.53mmol)，最後再加入DIPEA 171mg(1.3mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物207mg，收率59.8%。

實施例19 代謝產物中間體Mb的製備

稱取實施例18製備的中間體Ma 194mg(0.33mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物147mg，收率91.1%。

實施例20 代謝產物中間體Mc的製備

稱取Boc-L-天冬氨酸1-苄酯137mg(0.42mmol)，HOBT 77.8mg(0.58mmol)、EDCI 110mg(0.58mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例19製備的中間體Mb 185mg(0.38mmol)，最後再加入DIPEA 124mg(0.96mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物200mg，收率66.3%。

實施例21 代謝產物中間體Md的製備

稱取實施例20製備的中間體化合物Mc 230mg(0.29mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物158mg，收率78.4%。

實施例22 目標化合物11的製備

稱取實施例21製備的中間體Md 425mg(0.61mmol)，溶於30ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 25mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得淡黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得白固體粉末234mg收率63.4%。HPLC purity：96.2%(214nm),98.1%(254nm).MS(ESI)：m/z 604.3[M+1]⁺

結構式為：

實施例23~27：製備目標化合物12(利尼伐尼-C ₁₂ -Asp) 實施例23 代謝產物中間體Ma的製備

稱取12-(BOC-氨基)十二烷酸186mg(0.59mmol)，HOBT 107mg(0.8mmol)、EDCI 152mg(0.8mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入利尼伐尼200mg(0.53mmol)，最後再加入DIPEA 171mg(1.3mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物225mg，收率63.2%。

實施例24 代謝產物中間體Mb的製備

稱取實施例23製備的中間體Ma 225mg(0.33mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得紅褐色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物220mg，收率95%。

實施例25 代謝產物中間體Mc的製備

稱取Boc-L-天冬氨酸1-苄酯137mg(0.42mmol)，HOBT 77.8mg(0.58mmol)、EDCI 110mg(0.58mmol)溶於10ml二氯甲烷中，攪拌反應0.5h，控制反應溫度20~40℃緩慢加入實施例24製備的中間體Mb 220mg(0.38mmol)，最後再加入DIPEA 124mg(0.96mmol)，加畢，維持該反應溫度攪拌反應4h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用100ml去離子水洗滌兩次，分離有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得褐色油狀物。將該油狀物進行矽膠柱層析(DCM：MeOH=1：0~30：1)，得黃色油狀物250mg，收率74.2%。

實施例26 代謝產物中間體Md的製備

稱取實施例25製備的中間體化合物Mc 250mg(0.29mmol)溶於20ml二氯甲烷中，控制反應溫度-5~5℃緩慢加入三氟乙酸3ml(0.04mmol)，維持該反應溫度攪拌反應1.5~2h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。向反應液中加入50ml二氯甲烷稀釋，再用120ml去離子水洗滌兩次，再用60ml 5%碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，再用120ml去離子水洗滌兩次。分離有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥。濾除乾燥劑，濾液低溫濃縮得黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得黃色油狀物158mg，收率71.3%。

實施例27 目標化合物12(利尼伐尼-C ₁₂ -Asp)的製備

稱取實施例26製備的中間體Md 210mg，溶於30ml無水甲醇中，氮氣保護條件下加入10% Pd/C 25mg，通入氫氣進行3次置換，在氫氣氛下控制2MPa，20~65℃反應6~12h，TLC(DCM/MeOH=40：1)檢測反應完全。在氮氣保護條件下，將反應液過濾，回收鈀碳。濾液低溫濃縮得淡黃色油狀物。將該油狀物進行製備色譜分離，得白固體粉末102mg收率54.8%。¹H-NMR(DMSO)δ：1.22(m,12H),1.35(m,4H),1.71(s,2H),2.41(s,3H,-CH₃),2.64(m,1H),2.72(m,1H),3.34(m,6H),3.50(m,2H),5.20(s,2H),6.83(brs, 1H),7.10(m,1H),7.18(m,1H),7.40(d,J=7.5Hz,2H),7.58(m,1H),7.67(d,J=7.5Hz,2H),7.91(m,1H),8.23(m,1H),8.32(m,1H),9.01(m,1H),9.83(m,1H)¹.HPLC purity：98.5%(214nm),99.3%(254nm).MS(ESI)：m/z 688.4[M+1]⁺

結構式為：

實施例28 利尼伐尼相關化合物對腫瘤細胞株增殖的影響

本申請通過細胞增殖實驗(Alamar Blue檢測平臺)測定6個化合物(化合物1、4、7、8、12以及利尼伐尼)在54株商業化腫瘤細胞株(含26株肝癌細胞株)上的半數抑制濃度(IC₅₀值)，考察5個化合物與活性藥利尼伐尼活性的差別。

1. 儀器與材料

Thermo 311型CO₂培養箱；Haier生物安全櫃；Molecular Devices酶標儀；湘儀牌L530型臺式低速離心機；Olympus IX51倒置螢光顯微鏡，DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12 1：1培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩衝液(賽默飛世爾上海有限公司)；sigma二甲基亞碸(DMSO)、刃天青；54株商業化腫瘤細胞株(含26株肝癌細胞株)。

實驗藥物：化合物1、4、7、8、12及利尼伐尼；化療藥阿黴素(Doxorubicin)(HY-15142；上海皓元生物醫藥科技有限公司)。

2. 實驗方法

2.1 不同細胞株的培養

54株細胞株培養在含胎牛血清的培養液中，放置於37℃、5%的CO₂ 培養箱中溫育。細胞均呈貼壁狀態生長，在倒置顯微鏡下觀察生長狀況，待細胞匯合率達到80%-90%時進行傳代培養。傳代比例和數量以實驗需求為准，此次細胞株傳代培養比例一般為1：2~1：3。

2.2 對不同腫瘤細胞株的增殖抑制作用

細胞測試：取對數生長期的54株細胞株，以500~1×10⁴/孔(預實驗中確定各細胞株的最佳接種密度)的數量接種於96孔培養板中，在含5% CO₂的濕化培養箱中37℃培養4h後，每孔分別加入10μL化合物1、4、7、8、12及利尼伐尼，每個化合物測試9個藥物濃度梯度(從最高測試濃度按3.16倍梯度稀釋)，依據各化合物的溶解度不同起始濃度分別為30或100μM。並在每株細胞株測試時同步加入QC參考化合物Doxorubicin，其最終藥物濃度依次分別為10、3.16、1、0.31、0.1、0.03、0.01、0.003和0.001μM。此外同時設置陽性對照組(100%抑制)及陰性對照組(0%抑制)，藥物組每濃度重複2孔，陽性對照組和陰性對照組重複6孔，培養箱中繼續培養6天后，接後續AlamarBlue測試操作；AlamarBlue測試操作：每孔加10μL AlamarBlue試劑孵育1-4h，振盪1-2min，MD酶標儀EX：560nm,EM：590nm波長測得螢光值，記錄結果，通過計算本發明化合物對細胞抑制率(%)=(A_0%抑制-A_給藥)/(A_0%抑制-A_100%抑制)×100%，再利用GraphPad Prism 5.0或MATILAB軟體採用非線性回歸的方法(常採用四參數擬合曲線方程)作圖得到藥物劑量反應曲線，從而獲得本發明化合物作用於癌細胞株的IC₅₀值。

3. 結果與分析

3.1 6個待測樣品(化合物1、4、7、8、12及利尼伐尼)在54株商業化腫瘤細胞株上的IC₅₀匯總結果如表1所示。

由表1結果可見，幾乎所有腫瘤細胞株對化合物1的IC₅₀與對利尼伐尼的IC₅₀值很接近，這個化合物的改構幾乎沒有起到封閉利尼伐尼活性的作用；而其他的4個化合物(化合物4，7，8和12)的改構都成功地封閉了利尼伐尼抑制腫瘤細胞增殖的活性，絕大部分腫瘤細胞對這4個化合物和對利尼伐尼的IC₅₀差5倍以上。對利尼伐尼敏感的細胞有3株，分別為KASUMI-1(白血病細胞)，NCI-H1703(肺癌細胞)和AN3-CA(子宮內膜瘤細胞)，其IC₅₀分別為0.01，0.02和0.19μM，其對前體利尼伐尼-C₁₂-AA5的IC₅₀分別為0.10，0.08和3.14μM，相差分別為10，4和16.7倍。

54株商業化腫瘤細胞株中有26株為肝癌細胞株，近一半肝癌細胞株(12/26，46%)對利尼伐尼都是中度敏感，IC₅₀<5μM，同時大部分肝癌細胞株(15/26，58%)對前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅和對利尼伐尼的IC₅₀差8倍以上，而幾乎所有肝癌細胞對中間體都無應答，見表1。

實施例29 體外(血漿/肝勻漿/脾勻漿)穩定性研究

本實施例的目的是考察前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅(化合物8)、中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp(化合物12)在血漿、肝勻漿、脾勻漿中孵育穩定性(前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅代謝生成中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp和利尼伐尼；中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp進一步代謝生成利尼伐尼)，並對代謝產物進行定量分析，同時以陽性藥驗證孵育體系的穩定性，為化合物成藥性評價等提供參考。

1 儀器與材料

儀器：API3000液質聯用儀，ABI

材料：雄性SD大鼠(200-250g)，北京維通利華

供試品：陽性藥及其代謝產物M1和M2，利尼伐尼-C₁₂-AA₅及其代謝產物利尼伐尼-C₁₂-Asp和利尼伐尼。

2 利尼伐尼-C ₁₂-AA ₅和利尼伐尼-C ₁₂-Asp穩定性研究

2.1 利尼伐尼-C₁₂-AA₅和利尼伐尼-C₁₂-Asp血漿孵育穩定性研究方案

試驗動物

種類：SD大鼠；數量：2

性別：雄；體重：200-250g；

實驗步驟

1 動物採血，血樣置於EDTA抗凝管中，在4℃條件下，3000g下離心15min，分離血漿，2份血樣等體積混合；

2 稱取一定量利尼伐尼-C₁₂-AA₅/利尼伐尼-C₁₂-Asp溶於DMSO：MeOH(2：8)，經純度折算配製成200μM母液，在血漿中加入化合物使其終濃度為2μg/mL，體系中有機相比例不超過0.5%。

3 37℃水浴溫孵，設置取樣點0,0.5,1,2,4,6,8h。每個取樣點取100μL樣品加入300μL乙腈(含內標)進行沉澱處理，12000rpm離心5min，取上清200μL待LC-MS/MS進行分析。

4 配置標準曲線，定量檢測利尼伐尼，利尼伐尼-C₁₂-Asp.

2.2 利尼伐尼-C₁₂-AA₅和利尼伐尼-C₁₂-Asp肝/脾勻漿孵育穩定性研究方案

試驗動物

種類：SD大鼠；數量：2

性別：雄；體重：200-250g

實驗步驟

1 生物分析方法：建立化合物利尼伐尼-C₁₂-Asp和利尼伐尼生物分析方法；

2 實驗當天取大鼠肝臟/脾臟，2份剪碎混合，用4倍體積(1g：4mL)磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)勻漿，勻漿程序控制溫度不超過10℃；進行蛋白定量檢測，控制肝、脾臟蛋白濃度。

3 往肝/脾臟勻漿中分別加入藥物利尼伐尼-C₁₂-AA₅，利尼伐尼-C₁₂-Asp，使其濃度分別為1000ng/mL，孵育體積為1mL，並控制孵育體系中有機溶劑濃度不超過0.5%。

4 37℃水浴孵育，分別在0，0.5，1，2，4，6，8h各取樣100μL，用確定的方法對樣品進行預處理後進行LC-MS/MS分析。

5 以空白肝/脾臟勻漿液配製標準曲線，定量檢測利尼伐尼-C₁₂-Asp，利尼伐尼。

3 穩定性研究結果

3.1 血漿穩定性實驗結果

陽性藥按照預期隨時間延長在血漿中代謝為其代謝產物，說明血漿體系穩定，後續檢測結果可靠。

結果見表2。

由表2可知，利尼伐尼-C₁₂-AA₅在血漿中孵育穩定，不產生中間體L-C₁₂-ASP和利尼伐尼；中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp在血漿中孵育穩定，產生的利尼伐尼水準接近於0。

3.2 肝勻漿穩定性結果

陽性藥按照預期隨時間延長在肝勻漿中代謝為其代謝產物，說明肝勻漿體系穩定，後續檢測結果可靠。

前體和中間體的肝勻漿穩定性結果見表3-4及圖1-2。

由表3-4及圖1-2可知，前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅生成的中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp在肝勻漿中能迅速轉化為利尼伐尼，所以肝勻漿中中間體的蓄積濃度較低。

同時，當加入相同莫耳濃度的前體和中間體時，在肝勻漿中各個時間點上生成的利尼伐尼的量基本相當，說明利尼伐尼的生成基本上都是通過中間體生成的，由前體直接生成的利尼伐尼非常少。

3.3 脾勻漿穩定性結果

陽性藥按照預期隨時間延長在脾勻漿中代謝為其代謝產物，說明脾勻漿體系穩定，後續檢測結果可靠。

前體和中間體的脾勻漿穩定性結果見表5-6及圖3-4。

由表5-6及圖3-4可知，在脾勻漿中前體的代謝也與肝勻漿中相同，都是先生成中間體，而後中間體代謝為利尼伐尼。

另外，脾勻漿中中間體的蓄積濃度較高，而生成的利尼伐尼的量比肝勻漿中少。

從以上體外穩定性研究研究結果可以得出以下結論：

(1)前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅和中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp在血漿中穩定。

(2)前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅在體外的代謝途徑基本清楚，即通過PSMA代謝為中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp，而後中間體利尼伐尼-C₁₂-Asp通過某種醯胺酯酶代謝為活性藥利尼伐尼。

(3)肝勻漿中產生的活性藥物利尼伐尼更多，如圖5，表示藥物前體利尼伐尼-C₁₂-AA₅在肝中更特異性的轉化為活性藥物。

Claims

一種具有式I結構的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體或多晶形物，
其中，A選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f，其中e和f為0；L為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為1，n為1~11，p為0~8；Z選自-CH₂；R₁和R₂為氫；R₃和R₄為氫；R₅和R₆獨立選自烷基或鹵基；R₇和R₈為氫；R₉為羥基。
如請求項1所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體或多晶形物，其結構式為：
或，
或，
或，
或，
或，
一種化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體或多晶形物，其結構式為：
或，
或，
一種如請求項1或2所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體或多晶形物的製備方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟；步驟a，將多肽
與帶苄基保護的L，
，其中L為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m,q分別為1，n為1~11，p為0~8，Z選自-CH₂，在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物1
步驟b，所述中間體化合物1在極性溶劑中進行催化氫化脫除保護基團得到中間體化合物2
步驟c，中間體化合物2與利尼伐尼或其衍生物
，其中A選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f，其中e和f為0，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇和R₈為氫，及R₅和R₆獨立選自烷基或鹵基，在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物3
其中R₁、R₂、R₃和R₄為氫，及R₅和R₆獨立選自烷基或鹵基；步驟d，所述中間體化合物3在酸性條件下脫除保護基團得到式I化合物。
一種如請求項3所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體或多晶形物的製備方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟；步驟a，將多肽
與帶苄基保護的L，
，其中L為-[C_m(O)(Z)_n(NH)_q]-，其中m、q及n皆為0，p為0~8，Z選自-CH₂，在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物1
步驟b，所述中間體化合物1在極性溶劑中進行催化氫化脫除保護基團得到中間體化合物2
步驟c，中間體化合物2與利尼伐尼或其衍生物
，其中A選自(CH₂)_eN(R₇)C(O)N(R₈)(CH₂)_f，其中e和f為0，R₁、R₂、R₃、R₄、R₇和R₈為氫，及R₅和R₆獨立選自烷基或鹵基，在催化劑和縮合劑存在的條件下進行反應，得到帶保護基團的中間體化合物3
其中R₁、R₂、R₃和R₄為氫，及R₅和R₆獨立選自烷基或鹵基；步驟d，所述中間體化合物3在酸性條件下脫除保護基團得到式I化合物。
如請求項4或5所述的製備方法，其特徵在於，步驟a中所述反應溫度為-20℃~125℃；所述催化劑為1-羥基苯并三唑；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、1,3-二環己基碳二亞胺或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或幾種。
如請求項4或5所述的製備方法，其特徵在於，步驟b中所述反應溫度為-20℃~250℃；所述催化係使用催化劑，其為鈀碳、或乾性或濕性的氫氧化鈀。
如請求項4或5所述的製備方法，其特徵在於，步驟c中所述反應溫度為-20℃~125℃；所述催化劑為1-羥基苯并三唑；所述縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、1,3-二環己基碳二亞胺或4-二甲氨基吡啶中的任意一種或幾種。
如請求項4或5所述的製備方法，其特徵在於，步驟d中所述反應溫度為-20℃~125℃；所述酸性條件係使用酸性試劑，其選自甲酸，乙酸及三氟乙酸的任意一種或幾種。
一種如請求項1至3中任一項所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、多晶形物在製備治療癌症之藥物的用途，所述癌症選自食管癌、子宮內膜癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃腸道間質瘤、結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌或黑色素瘤。
如請求項10所述的用途，其特徵在於，所述癌症為肝癌。