TWI699348B - 魚鱗分解菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種魚鱗分解菌株及其用途，所述魚鱗分解菌株為屎腸球菌(
Enterococcus faecium)，其係將魚鱗分解菌株接種於一含有魚鱗之培養液，並於30-37℃培養24-168小時以分解魚鱗；經分解的含有魚鱗之培養液可作為植物肥料。
Description
本發明有關於一種魚鱗分解菌株及其用途，其中所述魚鱗分解菌株為屎腸球菌(
Enterococcus faecium)，係將魚鱗分解菌株接種於一含有魚鱗之培養液，並於30-37℃培養24-168小時以分解魚鱗，經分解含有魚鱗之培養液可用於製備植物肥料。
臺灣因為四面環海，所以漁業為重要的產業之一，而漁業在加工過程中會產生相當多的廢棄物，例如魚鱗。魚鱗的成分包含膠原蛋白、氫氧基磷灰石，鈣元素、氮元素與磷元素等等，若能妥善利用亦具有相當大的經濟價值，若能將廢棄魚鱗進行再利用，可以降低垃圾量且提高魚鱗的經濟價值。
因為魚鱗富含膠原蛋白，目前多數研發係專注在從魚鱗當中提取膠原蛋白，例如中華民國專利第 TW I362393(B)號發明專利為一種新式魚鱗膠原蛋白胜肽製作流程，製作流程包含(1)利用水溫控制與攪拌法分離魚鱗與魚皮，(2)將魚鱗洗淨並於零下20~85℃冷凍硬化處理1~30天，進一步以121℃處理20~100分鐘、45~110℃乾燥1~8小時及粉碎機粉碎、過篩後得到魚鱗粉末製品，以及(3)添加蛋白分解酵素處理魚鱗粉以獲得魚鱗膠原蛋白胜肽溶液，並加入果皮以降低魚腥味。
又，中國專利第CN101734956(B)號發明專利為一種魚皮魚鱗製備微生物醱酵液的方法及含該醱酵液的菌肥，係先將魚鱗經過酸鹼處理和酵素分解以獲得一膠原蛋白母液，並將膠原蛋白母液作為醱酵培養基的主要成分，再以含有特定比例之解磷菌，矽酸鹽細菌，固氮菌，枯草芽胞桿菌，酵母菌，乳酸菌，光合菌與木黴菌的複合微生物進行醱酵，以製成複合微生物醱酵液；但是此方法流程繁複，且需要同時使用多種菌種，於實行上具有較大的難度。
今，發明人即是鑑於上述現有以微生物醱酵魚鱗的相關研究仍然不足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，研創出本發明。
本發明提供一種魚鱗分解菌株及其用途，其中魚鱗分解菌株為屎腸球菌(
Enterococcus faecium)，且經分解的魚鱗可應用於製備植物肥料；係將魚鱗分解菌株接種於含有魚鱗之培養液中，並於30~37℃作用24~168小時以分解魚鱗，並將分解後的含有魚鱗之培養液用於製備植物肥料。
於本發明之一實施例中，含有魚鱗之培養液係包含3.12 (v/v)%~50 (v/v)%之一營養培養液以及一魚鱗，且該營養培養液係於1公升純水中，加入5克明膠蛋白腖(gelatin peptone)以及3克之牛肉萃取物(beef extract)以製成。
於本發明之一實施例中，植物肥料為一液態植物肥料。
藉此，本案之魚鱗分解菌株及其用途，不僅可有效分解魚鱗，且經分解後的魚鱗可製得具有促進植物生長功效的植物肥料。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明關於一種魚鱗分解菌株及其用途，其中所述的魚鱗分解菌株為屎腸球菌(
Enterococcus faecium)；係將屎腸球菌接種於含有魚鱗之培養液中，例如培養於包含3.12 (v/v)%~50 (v/v)%營養培養液以及魚鱗的培養液中，並於30~37℃作用24~168小時，以分解魚鱗並製得一植物肥料；其中營養培養液之製備方法係於1公升純水中，加入5克明膠蛋白腖(gelatin peptone)以及3克之牛肉萃取物(beef extract)以製成。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實驗一、菌株分離、純化與初步鑑定
(
一
)
、各培養基之配製
請參見表一，為本案使用之各培養基/液名稱及其組成。
表一
| 成分 | |
| (1)NB培養液 | 於1 L純水中，加入8克(g)NB培養基粉末(內含5(g)克明膠蛋白腖(gelatin peptone)以及3克(g)之牛肉萃取物(beef extract))，混勻後以後於121℃、1.2 kg/cm 2滅菌20分鐘 |
| (2)NA培養基平板 | 取8克(g)之NB培養基粉末，與15克(g)洋菜膠粉末，加入去離子水直至體積為1 L，混合後以121℃、1.2 kg/cm 2滅菌20分鐘，滅菌後冷卻至適當溫度，再將溶液倒入培養皿中，靜置使其凝固 |
| (3)營養濃度篩選用魚鱗培養液 | 將NB培養液以純水稀釋成3.125 (v/v)%、6.25 (v/v)%、12.5 (v/v)%、25 (v/v)%或是50 (v/v)%，並於10 mL稀釋後之NB培養液中加入1克(g)魚鱗，再於121℃、1.2 kg/cm 2滅菌20分鐘； |
| (4)液肥醱酵用培養液 | 製作魚鱗液肥所使用之培養液，取20 mL之稀釋32倍之營養濃度篩選用魚鱗培養液(3.125 (v/v)%之NB培養液)，加入2克(g)魚鱗，並於121℃、1.2 kg/cm 2滅菌20分鐘 |
| (5)魚鱗分解測試培養液 | 取1克(g)液肥醱酵用魚鱗，加上10 mL之25 (v/v)% NB培養液，於121℃、1.2 kg/cm 2滅菌20分鐘 |
(
二)、微生物分離用材料採集
於台南市區漁會魚市場，採集無變黑、無破裂變形之魚鱗，以作為欲分離之微生物來源，收集時係將魚鱗放置於一塑膠袋中，並保存於4℃；此外，本案亦自吉田田有機農場(台南市仁德區)之自製堆肥及液肥中，純化分離微生物。
將廢棄魚鱗與堆肥進行去雜質處理，再將10克樣本(廢棄魚鱗或堆肥)放置於含有10 mL無菌水之燒杯中，蓋上鋁箔紙，以轉速150 rpm震盪約30分鐘，再將該燒杯靜置15分鐘，並取上清液進行微生物分離。
將上述獲得之上清液進行10倍序列稀釋，再將稀釋液於NA培養基平板上進行畫線培養，於37℃培養24小時之後，計算菌落數量，並取平板培養基上生長有30~300個菌落之培養基平板備用；首先選擇型態相近且數量較多的菌落，再挑選型態特殊或不同的菌落，將選擇之菌落培養於6 mL之NB培養液中，於37℃培養24小時，再以接種環將菌液以劃線平板法進行分離，最後將已劃線之平板培養基倒置、於37℃培養箱培養24小時。
本案於吉田田有機農場堆肥中分離出4株菌株，分別命名為CNU1、CNU2、CNU3與CNU13；本案亦自廢棄魚鱗中分離到29株菌株，分別為CUN4~CNU12、CNU14~CNU29、CNU31-CNU34；將分離到的菌株以含有20%甘油之NB培養液保存於-80℃冷凍櫃中以永久保存，欲測試時再利用NB培養液進行活化培養。
此外，本案發明人在魚市開市後，收集業者剛刮下、剛脫離魚身的魚鱗，將其放入塑膠袋中立即帶回實驗室；回到實驗室之後立即以清水以及少許清潔劑反覆清洗，直到沖脫出的水呈現清澈狀後，再將魚鱗於陽光下曝曬，直到魚鱗片乾燥並呈現捲曲狀為止，以獲得液肥醱酵用魚鱗。
實驗二、魚鱗分解能力測試
(一)、溫度對於微生物分解魚鱗能力之影響
在實驗前一天，將欲測試菌株以30℃之培養溫度進行活化，亦即先將菌株劃線培養於NA培養基平板上，培養24小時之後挑選適量菌落接種於6 mL之NB培養液，並於培養箱中震盪培養24小時；24小時之後，於無菌環境下取1 mL菌液，並調整其濃度，使其OD
600之吸光值為0.1，以作為活化菌液。
實驗時，取100 μL之活化菌液，接種於魚鱗分解測試培養液，於30℃或37℃，130 rpm之速度震盪培養168小時；168小時之後進行醱酵後魚鱗乾重測定、並測量上清液之蛋白質濃度與上清液之pH值。此實驗中的魚鱗分解測試培養液之成分為1 g液肥醱酵用魚鱗與10 mL的25 (v/v)% NB培養液。
醱酵後魚鱗乾重之測量步驟如下：將培養168小時之後的魚鱗分解測試培養液，以14000 rpm、低溫離心5分鐘，取上清液測量蛋白質濃度以及pH值；再將離心後所得到的沉澱物放置於濾紙上，於烘箱中以40℃烘乾72小時，並於烘乾後秤量其乾重，將測得之重量扣除濾紙重量後便可獲得醱酵後魚鱗乾重，以計算魚鱗分解率。魚鱗分解率之計算公式為：
分解率(%)=初始魚鱗乾重-醱酵後魚鱗乾重/初始魚鱗乾重 X 100%
上清液的蛋白質濃度測定方法，係使用BioVision之市售套組，其係以BSA(bovine serum albumin)標準品作為對照基準，並利用BCA蛋白質定量法(Bicinchoninic acid protein assay)之原理測量待測樣本中的蛋白質濃度。
實驗結果請參見表二，根據表二，於30℃培養168小時的各組別中，魚鱗乾重有明顯減少之菌株為CNU8菌株、CNU10菌株、CNU11菌株、CNU15菌株、CNU19菌株、CNU23菌株與CNU25菌株，其魚鱗分解率皆超過50%；於37℃培養的各組別中，魚鱗乾重有明顯減少之菌株為CNU15菌株與CNU29菌株，又以CNU29菌株達到的52%分解率為最佳。
表二
| 組別 | 培養溫度 | 醱酵後上清液 | 醱酵後魚鱗乾重(g) | 魚鱗分解率 | |
| 蛋白質濃度(μg/mL) | pH值 | ||||
| 對照組(無菌株) | 30℃ | 10120.91 | 8.2 | 0.595 | 40.5% |
| 37℃ | 10063.64 | 8 | 0.585 | 41.5% | |
| CNU1 | 30℃ | 10268.18 | 8.3 | 0.605 | 39.5% |
| 37℃ | 10652.73 | 8 | 0.67 | 33% | |
| CNU2 | 30℃ | 10464.55 | 7.8 | 0.6 | 40% |
| 37℃ | 11098.64 | 7.8 | 0.605 | 39.5% | |
| CNU4 | 30℃ | 2220.91 | 8 | 0.52 | 48% |
| 37℃ | 2165.45 | 8 | 0.565 | 43.5% | |
| CNU5 | 30℃ | 816.36 | 7.7 | 0.525 | 47.5% |
| 37℃ | 466.82 | 7.7 | 0.525 | 47.5% | |
| CNU6 | 30℃ | 10464.55 | 8 | 0.61 | 39% |
| 37℃ | 10395.00 | 8.4 | 0.57 | 43% | |
| CNU8 | 30℃ | 1292.73 | 7.8 | 0.47 | 53% |
| 37℃ | 965.00 | 7.7 | 0.525 | 47.5% | |
| CNU9 | 30℃ | 1930.45 | 8.1 | 0.58 | 42% |
| 37℃ | 1492.27 | 7.6 | 0.59 | 41% | |
| CNU10 | 30℃ | 1400.91 | 7.8 | 0.455 | 54.5% |
| 37℃ | 1492.27 | 7.8 | 0.55 | 45% | |
| CNU11 | 30℃ | 1877.73 | 8 | 0.5 | 50% |
| 37℃ | 2245.45 | 8.1 | 0.54 | 46% | |
| CNU12 | 30℃ | 1983.18 | 7.7 | 0.54 | 46% |
| 37℃ | 1730.91 | 8 | 0.59 | 41% | |
| CNU13 | 30℃ | 9883.64 | 8 | 0.61 | 39% |
| 37℃ | 10419.55 | 7.9 | 0.58 | 42% | |
| CNU15 | 30℃ | 1043.18 | 7.8 | 0.445 | 55.5% |
| 37℃ | 1468.18 | 7.6 | 0.46 | 54% | |
| CNU17 | 30℃ | 10112.73 | 7.7 | 0.57 | 43% |
| 37℃ | 10730.45 | 7.5 | 0.59 | 41% | |
| CNU19 | 30℃ | 1577.73 | 7.8 | 0.475 | 52.5% |
| 37℃ | 2280.45 | 7.5 | 0.555 | 44.5% | |
| CNU23 | 30℃ | 1528.18 | 7.8 | 0.475 | 52.5% |
| 37℃ | 1911.82 | 7.8 | 0.535 | 46.5% | |
| CNU24 | 30℃ | 10137.27 | 7.8 | 0.555 | 44.5% |
| 37℃ | 9642.27 | 7.8 | 0.565 | 43.5% | |
| CNU25 | 30℃ | 1616.36 | 7.8 | 0.5 | 50% |
| 37℃ | 2034.55 | 7.7 | 0.525 | 47.5% | |
| CNU26 | 30℃ | 2372.73 | 8.1 | 0.595 | 40.5% |
| 37℃ | 1697.27 | 7.8 | 0.605 | 39.5% | |
| CNU28 | 30℃ | 10530.00 | 7.9 | 0.585 | 41.5% |
| 37℃ | 10120.91 | 7.8 | 0.575 | 42.5% | |
| CNU29 | 30℃ | 10521.82 | 7.7 | 0.6 | 40% |
| 37℃ | 1993.18 | 7.7 | 0.48 | 52% |
此外，根據表二之結果，將測試的各菌株進行分群，請參見表三：第一群菌株為醱酵後上清液蛋白質濃度大於9500 μg/mL且醱酵後魚鱗乾重大於0.5 g者，此群菌株之醱酵後魚鱗乾重的測量結果與對照組相近，表示此群菌株並無法有效分解魚鱗；第二群菌株為上清液蛋白質濃度小於2500 μg/mL且醱酵後魚鱗乾重大於0.5 g者，此群菌株之醱酵後魚鱗乾重與對照組相近，但是上清液蛋白質濃度有明顯下降的情形，表示此群菌株會利用上清液中的蛋白質生長，但是並不具有分解魚鱗或是魚鱗中氫氧基磷灰石的能力；第三群菌株為上清液蛋白質濃度大於9500μg/mL且醱酵後魚鱗乾重小於0.5 g者，此群菌株之醱酵後魚鱗乾重小於對照組，表示該些菌株可以分解魚鱗並將魚鱗結構中的蛋白質釋放至培養液中，但本案測試的菌株中並無屬於第三群者；第四群菌株為上清液蛋白質濃度小於2500 μg/mL且醱酵後魚鱗乾重小於0.5 g者，此群菌株之醱酵後魚鱗乾重小於對照組，表示測試之菌株可以分解魚鱗，例如分解魚鱗成分中的氫氧基磷灰石，且此群之菌株可利用魚鱗成分中的膠原蛋白繁殖，因此屬於第四群的菌株為本實驗之目標菌株。本案測試的菌株中，屬於第四群的菌株為CNU8菌株、CNU10菌株、CNU11菌株、CNU15菌株、CNU19菌株、CNU23菌株與CMU25菌株。
表三
| 培養溫度30℃ | 培養溫度37℃ | |||
| 上清液蛋白質濃度大於9500 μg/mL | 上清液蛋白質濃度小於2500 μg/mL | 上清液蛋白質濃度大於9500 μg/mL | 上清液蛋白質濃度小於2500 μg/mL | |
| 醱酵後魚鱗乾重大於0.5 g | CNU1, CNU2, CNU6, CNU13, CNU17, CNU2, CNU26, CNU28, CNU29 (第一群) | CNU4, CNU5, CNU9, CNU12 (第二群) | CNU1, CNU2, CNU6, CNU13, CNU17, CNU24, CNU25, CNU28 (第一群) | CNU4, CNU5, CNU8, CNU9, CNU10, CNU11, CNU12, CNU19, CNU23, CNU25, CNU26 (第二群) |
| 醱酵後魚鱗乾重小於0.5 g | 無菌株屬於此類 (第三群) | CNU8, CNU10, CNU11, CNU15, CNU19, CNU23, CNU25 (第四群) | 無菌株屬於此類 (第三群) | CNU15, CNU29 (第四群) |
(二)、營養成分對於微生物分解魚鱗能力之影響
先將NB培養液以純水稀釋成不同比例，再於10 mL之各稀釋NB培養液中加入1 g液肥醱酵用魚鱗，滅菌後獲得營養濃度篩選用魚鱗培養液(後簡稱「營養培養液」)；將待測試菌株於實驗前一天進行30℃活化培養，於10 mL之各培養液中分別接種100 μL的活化菌液，於30℃、130 rpm下震盪培養168小時，並於培養後168小時測量醱酵後魚鱗乾重以及上清液的蛋白質濃度；此實驗中係以含有1 g液肥醱酵用魚鱗之PBS溶液作為營養成分0%的對照組。請參見表四、第一圖至第三圖，所測試的菌株在對照組(不含NB培養液之組別)中皆無法分解魚鱗；但當菌株培養於含有不同稀釋比例的NB培養液時，該些組別皆觀察到醱酵後魚鱗乾重下降，以及上清液蛋白質濃度下降的現象，表示魚鱗被分解，且菌株利用了上清液含有的蛋白質生長，但比較同一菌株、培養於含有不同稀釋比例NB培養液的各組別間，培養後測得的醱酵後魚鱗乾重與上清液蛋白質濃度的差異皆不大，故後續使用含有3.125 (v/v)% NB培養液的營養培養液作為液肥製作的基礎培養液。
表四
| 對照組 | 營養濃度篩選用魚鱗培養液 (NB培養液+魚鱗) | ||||||
| 50% NB | 25% NB | 12.5% NB | 6.25% NB | 3.125% NB | |||
| CNU8 | 蛋白濃度(μg/mL) | 10865.45 | 1604.55 | 1637.73 | 1410.00 | 1878.18 | 1779.09 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.595 | 0.560 | 0.525 | 0.505 | 0.525 | 0.525 | |
| CNU10 | 蛋白濃度(μg/mL) | 10887.27 | 1605.91 | 1279.55 | 1313.64 | 1906.82 | 1853.18 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.645 | 0.535 | 0.505 | 0.505 | 0.495 | 0.505 | |
| CNU11 | 蛋白濃度(μg/mL) | 10240.00 | 1508.64 | 1390.00 | 1330.00 | 2010.45 | 1777.73 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.635 | 0.560 | 0.540 | 0.525 | 0.560 | 0.540 | |
| CNU15 | 蛋白濃度(μg/mL) | 9221.82 | 1450.91 | 1633.64 | 1646.82 | 1790.45 | 1937.73 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.615 | 0.525 | 0.525 | 0.540 | 0.490 | 0.505 | |
| CNU19 | 蛋白濃度(μg/mL) | 9705.45 | 1632.27 | 1709.09 | 1690.91 | 1922.73 | 2293.18 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.595 | 0.555 | 0.530 | 0.530 | 0.510 | 0.525 | |
| CNU23 | 蛋白濃度(μg/mL) | 1107.73 | 1405.00 | 1237.73 | 1391.36 | 1687.27 | 1760.91 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.605 | 0.530 | 0.510 | 0.505 | 0.490 | 0.525 | |
| CNU25 | 蛋白濃度 | 10545.45 | 1370.91 | 1196.36 | 1406.36 | 1502.73 | 2117.27 |
| 魚鱗乾重(g) | 0.655 | 0.560 | 0.545 | 0.545 | 0.555 | 0.540 |
(三)、魚鱗添加對於微生物生長之影響
將待測試菌株於前一天進行30℃活化培養，並於20 mL之培養液中分別接種活化菌液，於30℃、130 rpm下震盪培養168小時，此實驗使用的培養液分別為液肥醱酵用培養液，以及無添加魚鱗的液肥醱酵用培養液；於培養後的每24小時收集培養液，將一部分培養液進行序列稀釋、塗盤培養後以計算總菌數，另一部分培養液則用於測量鈣、鉀、以及磷含量。另，以無接種菌株之培養液作為對照組。
請參見表五、第五圖與第六圖，不論在有無添加魚鱗的狀況下，CNU10菌株、CNU15菌株與CNU23菌株的生長情形都會在培養後48小時達到高峰；於培養液有添加魚鱗之組別中，以CNU10菌株於培養後48小時的總菌量最高，為3.8 X 10
8CFUs/mL，而培養液中無添加魚鱗的組別，CNU23菌株於培養後48小時的菌數最高，為2.6 X 10
8CFUs/mL；培養後72小時，培養液中添加魚鱗組的總菌數雖然呈現下降的趨勢，但是每一菌株的菌數仍可維持在一定程度，而無添加魚鱗組的總菌數則是有迅速下降的情形。
表五
| 菌數(X 10 8CFUs/mL) | |||||||||
| 時間(hr) | 0 | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | 144 | 168 | |
| CNU10 | 魚鱗(+) | 0.620 | 11.967 | 38.000 | 5.133 | 7.700 | 2.603 | 3.800 | 4.233 |
| 魚鱗(-) | 0.623 | 1.403 | 11.967 | 0.022 | 0.032 | 0.031 | 0.018 | 0.007 | |
| CNU15 | 魚鱗(+) | 0.410 | 12.033 | 23.000 | 4.800 | 9.800 | 3.833 | 5.700 | 4.733 |
| 魚鱗(-) | 0.410 | 1.003 | 26.033 | 0.003 | 0.008 | 0.033 | 0.029 | 0.002 | |
| CNU23 | 魚鱗(+) | 0.363 | 3.333 | 26.067 | 3.600 | 9.833 | 3.500 | 4.433 | 1.303 |
| 魚鱗(-) | 0.360 | 1.400 | 28.000 | 0.008 | 0.017 | 0.055 | 0.090 | 0.002 |
另，本實驗中，測量培養液中鈣、鉀、以及磷含量之方法簡述如下：取0.2 mL之培養液，加入4.8 mL二次酸混合液(含有體積比1:4之過氯酸與硝酸)，並以微波消化儀器於160℃作用15分鐘，完成後再以二次水將體積補足至50 mL；利用原子吸收光譜儀測量作用後之產物的鈣、鉀含量的測試，並以鉬黃法測量作用後之產物的磷含量。
請參見表六，為培養液中鈣含量的檢測結果，在無添加魚鱗的各組別中，對照組的鈣含量維持在200 μg/mL上下，而接種各菌株的組別，其鈣含量亦維持在一定的濃度，而沒有明顯上升或下降的趨勢。
但是在有加入魚鱗的組別中，對照組中各時間點的培養液鈣含量維持在300 μg/mL上下，並無明顯變化；接種CNU10菌株的組別，培養後24小時，培養液中鈣含量為430.4 μg/mL，而培養168小時後培養液的鈣含量上升至827.2 μg/mL；接種CNU15菌株者，培養後24小時，培養液中的鈣含量為355.6 μg/mL，培養168小時後的鈣含量上升至802.8 μg/mL；接種CNU23菌株的組別中，培養24小時後培養液的鈣含量為460.4 μg/mL，而培養168小時之後的培養液鈣含量為835.6 μg/mL。此結果顯示各菌株確實會分解魚鱗，使得培養液的鈣含量上升。
表六
| 鈣元素含量(μg/mL) | ||||||||
| 魚鱗 | 24 hr | 48 hr | 72 hr | 96 hr | 120 hr | 144 hr | 168 hr | |
| 對照組 | + | 283.20 | 310.23 | 302.12 | 312.13 | 308.16 | 332.17 | 343.47 |
| - | 200.20 | 222.12 | 201.33 | 231.2 | 216.78 | 225.38 | 212.73 | |
| CNU10 | + | 430.4 | 442.4 | 637.2 | 637.6 | 743.2 | 820.8 | 827.2 |
| - | 264 | 288 | 378.8 | 312 | 331.6 | 313.2 | 286 | |
| CNU15 | + | 355.6 | 532.8 | 626 | 688.4 | 789.2 | 748.2 | 802.8 |
| - | 301.6 | 355.6 | 368.4 | 314.4 | 396.8 | 376.8 | 345.2 | |
| CNU23 | + | 460.4 | 604 | 673.6 | 640.8 | 764 | 835.2 | 835.6 |
| - | 314 | 345.2 | 322.8 | 380.4 | 408.8 | 345.2 | 320 |
請參見表七，為培養液中鉀含量的測試結果；根據表七，不論是有添加魚鱗或是無添加魚鱗的組別，有無接種菌株者的培養液所測到的鉀含量，與對照組相比並無顯著上升或下降的情形。
表七
| 鉀元素含量(μg/mL) | ||||||||
| 魚鱗 | 24 hr | 48 hr | 72 hr | 96 hr | 120 hr | 144 hr | 168 hr | |
| 對照組 | + | 70 | 65.4 | 70.34 | 67.32 | 58.66 | 63.25 | 61.2 |
| - | 66.4 | 62.14 | 68.11 | 58.96 | 64.57 | 71.02 | 55.38 | |
| CNU10 | + | 65.2 | 63.2 | 63.6 | 58.6 | 77.2 | 65.2 | 78 |
| - | 70.2 | 65.6 | 72.4 | 76.8 | 80.4 | 60.2 | 68.8 | |
| CNU15 | + | 70.0 | 61.6 | 65.2 | 65.2 | 70.2 | 66 | 61.3 |
| - | 48.4 | 53.2 | 68.8 | 72.5 | 57.2 | 61.2 | 72 | |
| CNU23 | + | 81.6 | 63.6 | 78.8 | 72.4 | 56.8 | 57.3 | 61.6 |
| - | 89.3 | 71.6 | 61.2 | 65.2 | 69.2 | 54.4 | 77.6 |
又，在磷含量的檢測結果中，培養液中無加入魚鱗的各組別，皆無法在培養液中測到磷含量。請參見表八，於培養液有加入魚鱗的各組中，對照組的磷濃度變化不大，其含量皆在400 μg/mL上下；而有接種菌株的組別，培養之後的培養液中磷濃度皆有增加的趨勢，其中接種CNU10菌株的組別，在培養後24小時、培養液中的磷含量已升高至584.94 μg/mL，而培養後168小時，磷含量更是上升至918.23 μg/mL；接種CNU15菌株的組別，在培養後24小時、培養液磷含量已升高至593.39 μg/mL，而培養後168小時，磷含量更是上升至948.94 μg/mL；而接種CNU23組，培養後24小時之磷含量為562.42 μg/mL，而培養後168小時之磷含量為1010.36 μg/mL；此結果顯示本實驗測試之菌株，尤其是CNU23菌株，能有效分解魚鱗，並使魚鱗中的磷元素釋出到培養液中。
表八
| 磷元素含量(μg/mL) | ||||||||
| 魚鱗 | 24 hr | 48 hr | 72 hr | 96 hr | 120 hr | 144 hr | 168 hr | |
| 對照組 | + | 400.094 | 402.03 | 398.12 | 411.63 | 432.12 | 433.25 | 426.16 |
| CNU10 | + | 584.94 | 695.39 | 726.10 | 856.81 | 887.52 | 872.74 | 918.23 |
| CNU15 | + | 593.39 | 795.39 | 847.52 | 856.73 | 948.94 | 911.81 | 948.94 |
| CNU23 | + | 562.42 | 626.10 | 787.52 | 848.92 | 926.31 | 958.65 | 1010.36 |
(四)、其他微生物對於本案測試菌株生長之影響
將待測試菌株於實驗前一天進行30℃活化培養，並於10 mL之液肥醱酵用培養液中分接種100 μL的活化菌液，其中一組的液肥醱酵用培養液有經過滅菌處理，另一組之液肥醱酵用培養液沒有經過滅菌處理；將接種菌株之培養液於30℃、130 rpm下震盪培養168小時，並於168小時之後測量醱酵後魚鱗乾重以及上清液蛋白質濃度，並計算魚鱗分解率；其中以無加入菌株之培養液作為對照組。
請參見表九，對照組中，在醱酵後魚鱗乾重的檢測項目，無滅菌處理組的醱酵後魚鱗乾重就比有滅菌處理組減少0.19克，表示無滅菌處理組中有其他微生物會分解魚鱗；此外在無滅菌處理的各組別中，接種本實驗中測試之各菌株的組別，其魚鱗乾重的檢測結果與對照組沒有顯著差異。接種各菌株之有滅菌處理組，其魚鱗乾重不僅少於有滅菌處理的對照組，也少於同菌株培養於無滅菌處理培養液之組別；經分析，本實驗中以CNU10菌株、CNU15菌株以及CNU23菌株具有較佳的魚鱗分解率
表九
| 滅菌處理 | 上清液蛋白質濃度(μg/mL) | 魚鱗乾重(g) | 魚鱗分解率(%) | |
| 對照組 | 有 | 10065.45 | 1.44 | 28 |
| 無 | 924.09 | 1.25 | 37.5 | |
| CNU8 | 有 | 1936.36 | 1.10 | 45 |
| 無 | 1086.67 | 1.28 | 35 | |
| CNU10 | 有 | 1854.55 | 1.02 | 49 |
| 無 | 959.09 | 1.26 | 37 | |
| CNU11 | 有 | 2267.58 | 1.13 | 43.5 |
| 無 | 1146.06 | 1.21 | 39.5 | |
| CNU15 | 有 | 1925.76 | 1.03 | 48.5 |
| 無 | 1014.24 | 1.28 | 36 | |
| CNU19 | 有 | 2174.24 | 1.11 | 44.5 |
| 無 | 999.09 | 1.29 | 35.5 | |
| CNU23 | 有 | 1813.94 | 1.07 | 46.5 |
| 無 | 995.15 | 1.29 | 35.5 | |
| CNU25 | 有 | 1854.55 | 1.08 | 46 |
| 無 | 966.36 | 1.30 | 35 |
實驗三、菌株分解魚鱗培養液對植物生長之影響
本實驗係於吉田田有機農場(台南市仁德區)的育苗室進行，供試作的作物為小白菜(稼穡種子有限公司，品種名為「好佳」)，播種方法為在五吋盆內選定中心點與四個角落進行播種，每個實驗組別進行六重覆之實驗；於播種後兩天、待新葉長出之後就可以施灑液肥，每個五吋盆施灑共200 mL液肥，並於每週的一固定時間施灑；本實驗中使用的液肥為稀釋100倍以及稀釋50倍之魚鱗分解液肥，魚鱗分解液肥即為以本案之各菌株於液肥醱酵用培養液中培養168小時之後所獲得之醱酵液；於種植後28天，將植株連同土壤自五吋盆中倒出，並小心不要使葉片受損，利用清水洗淨植株之葉片以及根部土壤後，將植株平放於實驗桌上測量植株長度與根部長度。
請參見表十，為本實驗中各組別施用肥料或是液肥的狀況；第一組為無施肥的組別，僅使用Gramoflor培養土培養；第二組為施予基礎肥料(有機肥426)的組別，使用比例為Gramoflor培養土: 有機肥426=21:0.56，並於實驗期間不追加液肥；第三組為農場對照組，係於施予有機肥426之外，於實驗期間每週施予稀釋100倍農場自製的液肥，總共施予200 mL，農場自製液肥係以豆粉、海草粉、黑糖、骨粉、糖蜜等物質為基質，並以益生菌醱酵而製成；第四組至第七組，其栽培介質與第二組(基肥組)相同，但是於每週追加施予稀釋100倍以及稀釋50倍之魚鱗分解液肥，總共施予200 mL。
另，測量植株葉片面積的方法如下：先取A4影印用紙，並裁切成10 x 10 cm
2之大小再秤重，便可以計算出每1 cm
2的紙重；選定由根部數上來第一對葉片，將葉片自葉炳部位剪下，放置於10 x 10 cm
2大小之紙片上描繪輪廓，並將紙片沿著的葉片輪廓剪下並秤重，再將重量除以上述獲得的每1 cm
2的紙重，以獲得葉片面積。又，將採集的葉片以70℃烘乾48小時，以測量葉片乾重。
表十
| 組別 | 一 | 二 | 三 | 四 | 五 | 六 | 七 |
| 無施肥 | 基肥 | 農場液肥 | 無菌株 | CNU10液肥 | CNU15液肥 | CNU23液肥 | |
| 培養土 | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 有機肥料 | X | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 農場液肥 | X | X | ○ | X | X | X | X |
| 3.125% NB培養液 | X | X | X | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 菌株 | X | X | X | X | ○ | ○ | ○ |
| 魚鱗 | X | X | X | ○ | ○ | ○ | ○ |
請參見表十一，為各種植組別中，小白菜生長情形的分析結果；其中第三組(基肥組)的小白菜，不論是植株高度、根長、葉片乾重、植株乾重等等的生長情形皆優於第一組(對照組)；而施加液肥的組別，不論是第三組(施加農場液肥)或是第四到七組(施加魚鱗分解液肥)之各組別，小白菜的整體生長情形又優於第二組(基肥組)。第四組至第七組的實驗結果中，若追加施予的液肥稀釋倍數為50倍時，各植株的生長情形與第三組(農場液肥)相比不相上下；其中，在第四至第七組當中，「CNU23液肥-稀釋50倍」之組別，其植株整體生長情形為各組別當中最佳，其植株高度為23.64 cm，根長為3.16 cm，葉片乾重為0.69 g，全株乾重為1.42 g，葉片面積為200.58 cm
2，葉片單位面積重量為3.46 mg/cm
2；故，以CNU23菌株製作之魚鱗分解液肥，能夠達到良好的促進植物生長功效。
表十一
| 液肥稀釋倍數 | 植株高度(cm) | 根長(cm) | 葉片乾重(g) | 全株乾重(g) | 葉片面積(cm 2) | 葉片單位面積重量(mg/cm 2) | |
| 第一組 | 無添加 | 15.99 | 2.78 | 0.21 | 0.45 | 155.66 | 1.35 |
| 第二組 | 無添加 | 18.14 | 2.83 | 0.42 | 0.54 | 164.46 | 2.52 |
| 第三組 | 100 | 24.80 | 3.38 | 0.81 | 1.60 | 220.32 | 3.65 |
| 第四組 (無菌株) | 50 | 20.36 | 3.10 | 0.55 | 0.75 | 173.11 | 3.22 |
| 100 | 18.31 | 3.03 | 0.51 | 0.69 | 166.08 | 3.07 | |
| 第五組 (CNU10) | 50 | 22.95 | 3.09 | 0.62 | 1.32 | 187.29 | 3.30 |
| 100 | 19.58 | 3.11 | 0.58 | 1.21 | 184.28 | 3.15 | |
| 第六組 (CNU15) | 50 | 23.01 | 3.13 | 0.63 | 1.34 | 190.83 | 3.31 |
| 100 | 22.08 | 3.20 | 0.60 | 1.26 | 187.35 | 3.25 | |
| 第七組 (CNU23) | 50 | 23.64 | 3.16 | 0.69 | 1.42 | 200.58 | 3.46 |
| 100 | 22.18 | 3.18 | 0.63 | 1.30 | 194.10 | 3.25 |
由上述之各實驗結果，可知本案所分離的CNU23菌株，具有良好分解魚鱗的能力，且以CNU23菌株所製作的魚鱗分解液肥，亦可達到良好的促進植物生長功效，因此本案發明人委託財團法人食品工業研究所進行CNU23菌株的細菌學名鑑定(請參見附件一)，鑑定報告中指出CNU23菌株為革蘭氏陽性球菌，不具觸酶、氧化酶及運動性，且於好氧環境或是厭氧環境皆可生長；又根據其16S rDNA的序列分析，CNU23菌株與屎腸球菌(
Enterococcus faecium)的16S rDNA序列相似性為100%；此外本案之CNU23菌株以VITEK2鑑定系統進行分析之結果，亦顯示CNU23菌株為屎腸球菌。
綜上所述，本發明之魚鱗分解菌株及其用途，係以屎腸球菌(
Enterococcus faecium)有效分解魚鱗，且魚鱗分解後的培養液亦可作為促進植物生長的肥料；此利用單一菌株分解魚鱗並製作植物肥料之方法，與現有技術相比不僅步驟簡單易操作，且製得之植物肥料能達到明顯的植物生長促進效果。
綜上所述，本發明魚鱗分解菌株及其用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
無
第一圖：不同菌株魚鱗分解能力分析圖(一)。
第二圖：不同菌株魚鱗分解能力分析圖(二)。
第三圖：不同菌株魚鱗分解能力分析圖(三)。
第四圖：不同菌株魚鱗分解能力分析圖(四)。
第五圖：魚鱗對不同菌株生長之影響分析圖(一)。
第六圖：魚鱗對不同菌株生長之影響分析圖(二)。
Claims (4)
- 一種利用屎腸球菌(Enterococcus faecium)分解魚鱗之方法，其係將該屎腸球菌接種於一含有魚鱗之培養液，並於30℃培養24-168小時以分解魚鱗，其中該含有魚鱗之培養液係包含3.12(v/v)%~50(v/v)%之一營養培養液以及一魚鱗，且該營養培養液係於1公升純水中，加入5克明膠蛋白腖(gelatin peptone)以及3克之牛肉萃取物(beef extract)所製成。
- 一種屎腸球菌(Enterococcus faecium)用於製備植物肥料之方法，其係將該屎腸球菌添加至一含有魚鱗之培養液中，並於30℃作用24-168小時以製得一植物肥料，其中該含有魚鱗之培養液係包含3.12(v/v)%~50(v/v)%之一營養培養液以及一魚鱗，且該營養培養液係於1公升純水中，加入5克明膠蛋白腖(gelatin peptone)以及3克之牛肉萃取物(beef extract)所製成。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該植物肥料為一液態植物肥料。
- 一種植物肥料，係由如申請專利範圍第2-3項任一項所述之方法所製得。
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| Merk KGaA，Nutrient Broth 產品型錄，2008.08.26 * |
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