TWI690592B - 日本腦炎疫苗及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種日本腦炎疫苗之製備方法，包括將製造疫苗用的細胞接種於一細胞培養載體上，於一潮汐式培養系統中培養3~10天後，再將日本腦炎病毒接種至該細胞上，並培養3~10天後多次收穫病毒液，進行純化及不活化處理，以得到日本腦炎去活化病毒疫苗。本發明係關於一種如上述之方法所製備之日本腦炎不活化病毒疫苗。

Description

日本腦炎疫苗及其製備方法
本發明係關於一種日本腦炎疫苗及其製備方法，特別是一種具有穩定抗原的日本腦炎死毒疫苗，以及一種可以增加日本腦炎死毒疫苗抗原穩定性的製備方法。
日本腦炎為一種台灣夏季地方性流行傳染病，高峰通常出現在6、7月，流行地區幾乎遍布全台，九歲以下幼童為常見之感染對象。由於日本腦炎的預後不良，對個人、家庭以及社會造成極大的影響，以及經濟、醫療的負擔。因此，如何降低日本腦炎病例數的發生，是目前重要的公共衛生議題。目前無有效的抗日本腦炎病毒藥物可供治療，只有支持性療法。而對抗日本腦炎病毒感染最有效、也是唯一的辦法就是接種日本腦炎疫苗。
最早的日本腦炎疫苗製備方法為，將日本腦炎病毒強毒株接種至鼠腦中進行病毒增殖，再取出病毒進行去活化作用(inactivation)，以製成日本腦炎不活化全病毒疫苗。然而使用此種不活化病毒疫苗最大的問題為無法提供長期之免疫力，而且追加的疫苗注射次數必需增加，這會造成成本負擔及注射不便，而增加疫苗注射次數亦有引發過敏反應的機會。此外，以鼠腦製備的日 本腦炎疫苗有安全性的疑慮，以鼠腦製備的日本腦炎疫苗在接種部位約有20%會發生紅腫、疼痛等反應，約有10%的人有中度全身性副作用，如發燒、畏寒、頭痛、出疹、肌肉疼痛等症狀。更甚者，在日本曾有一例15歲青少年在接種以鼠腦製備的日本腦炎疫苗後，產生疑似急性瀰漫性腦脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis,ADEM)的症狀。於是日本政府於2005年宣佈停止將以鼠腦製備的不活化日本腦炎疫苗用於例行性預防接種，同時也停止該種疫苗之生產，而改以細胞培養的方式來生產日本腦炎疫苗。為配合國際趨勢，台灣的疾病管制署也公佈台灣於2017年改用細胞培養產製取代現行鼠腦產製之日本腦炎疫苗。
以細胞培養方法生產的日本腦炎疫苗雖然較以鼠腦製備者具有較高的安全性。然而，以細胞培養方法生產的日本腦炎疫苗卻有保存穩定性的問題。為了增加疫苗中抗原的穩定性而添加明膠作為穩定劑，但明膠亦可能會誘發受試者體內的過敏反應，從而產生其他安全性的問題。因此，研發具有穩定抗原的日本腦炎疫苗及其製備方法，是刻不容緩且極為重要的事。
本發明於第一部份中提供一種日本腦炎疫苗之製備方法，包括以下步驟：(1)將製造疫苗用的細胞接種於一細胞培養載體上，於一潮汐式培養系統中，於34~37℃、5~10% CO2下，以一無血清培養基培養，該細胞培養載體與該無血清培養基的體積比為1：5~1：20，且該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基 液面下降完全後停留時間為0~60秒，調整的CO2濃度使pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上，進行細胞接種1~12小時；(2)該細胞繼續於34~37℃、0~10% CO2下培養3~10天，該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，調整的CO2濃度使pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上；(3)將日本腦炎病毒接種至該細胞上，病毒感染劑量(multiplicity of infection,M.O.I.)為1x10-2~1x10-6，於34~37℃、5~10% CO2下，以該無血清培養基培養，且該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，調整的CO2濃度使pH值維持在6.8~7.2之間，進行病毒接種1~12小時，葡萄糖含量維持在1g/L以上；(4)接種後的日本腦炎病毒及細胞繼續於34~37℃、0~10% CO2的培養環境下培養，且該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，調整的CO2濃度使pH值維持在6.8~7.2之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上；以及(5)病毒接種後每隔5~8天收穫病毒液一次，並進行純化及不活化處理，以得到日本腦炎去活化病毒疫苗；其中該日本腦炎去活化病毒疫苗於2~8℃下存放4個月後，病毒蛋白裂解率為5%以下。
本發明於第二部份中提供一種如上述之方法所製備之日本腦炎不活化病毒疫苗。
圖1所示為小鼠經過不同日本腦炎病毒不活化疫苗免疫後，於試驗第28天(第2次免疫二週後)採集之血液樣品進行中和抗體力價分析之結果。
本發明於第一部份中提供一種日本腦炎疫苗之製備方法，包括以下步驟：(1)將製造疫苗用的細胞接種於一細胞培養載體上，於一潮汐式培養系統中，於34~37℃、5~10% CO2下，以一無血清培養基培養，該細胞培養載體與該無血清培養基的體積比為1：5~1：20，且該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，進行細胞接種1~12小時，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度約為8~10%，在細胞接種期間使培養基的pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上；(2)該細胞繼續於34~37℃、0~10% CO2下培養3~10天，該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度約為0~8%，在培養期間使培養基的pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上； (3)將日本腦炎病毒接種至該細胞上，病毒感染劑量(multiplicity of infection,M.O.I.)為1x10-2~1x10-6，於34~37℃、5~10% CO2下，以該無血清培養基培養，且該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，進行病毒接種1~12小時，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度為8~10%，在病毒接種期間使培養基的pH值維持在6.8~7.2之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上；(4)接種後的日本腦炎病毒及細胞繼續於34~37℃、0~10% CO2的培養環境下培養，且該無血清培養基液面升降速度為1000~2000ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為0~60秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為0~60秒，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度為0~8%，在培養期間使pH值維持在6.8~7.2之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上；以及(5)病毒接種後每隔5~8天收穫病毒液一次，並進行純化及不活化處理，以得到日本腦炎去活化病毒疫苗；其中該日本腦炎去活化病毒疫苗於2~8℃下存放4個月後，病毒蛋白裂解率為5%以下。
於某些具體實施例中，該製造疫苗用的細胞為非洲綠猴腎細胞(VERO細胞)。
於某些具體實施例中，該無血清培養基培養為VP-SFM。
於某些實施例中，該細胞培養載體與該無血清培養基的體積比為約1：5~1：20。於某些具體實施例中，該細胞培養載體與該無血清培養基的體積比較佳為約1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、 1：17、1：18、1：19，或1：20。
於某些實施例中，該步驟(1)中的細胞接種約1~12小時。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的細胞接種較佳為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，或12小時。
於某些實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基液面升降速度為約1000~2000ml/min。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基液面升降速度較佳為約1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900，或2000ml/min。
於某些實施例中，該無血清培養基液面上升至剛好覆蓋所有的該細胞培養載體即為上升完全，使所有的該細胞培養載體完全浸泡於該無血清培養基中，但並不懸浮於該無血清培養基中，以避免該細胞培養載體懸浮於該無血清培養基中所產生的剪力對細胞造成之傷害。
於某些實施例中，該無血清培養基的pH值由調整培養環境中的CO2濃度來維持，以避免使用鹽酸(HCl)及/或氫氧化鈉(NaOH)調整培養基的pH值而對細胞造成傷害。
於某些實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基液面下降完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基液面下降完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基的pH值維持在約7.0~7.4之間。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的無血清培養基的pH值較佳維持在約7.0、7.1、7.2、7.3，或7.4之間。
於某些實施例中，該步驟(1)中的CO2濃度為約8~10%。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的CO2濃度較佳為約8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9，或10%。
於某些實施例中，該步驟(1)中的葡萄糖含量維持在約1g/L以上。於某些具體實施例中，該步驟(1)中的葡萄糖含量較佳維持在約1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10g/L以上。
於某些具體實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基於細胞培養約3~4天時以及病毒攻毒前各更換一次。
於某些實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基液面升降速度為約1000~2000ml/min。於某些具體實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基液面升降速度較佳為約1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900，或2000ml/min。
於某些實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基液面下降完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基液面 下降完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基的pH值維持在約7.0~7.4之間。於某些具體實施例中，該步驟(2)中的無血清培養基的pH值較佳維持在約7.0、7.1、7.2、7.3，或7.4之間。
於某些實施例中，該步驟(2)中的CO2濃度為約0~8%。於某些具體實施例中，該步驟(2)中的CO2濃度較佳為約0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，或8%。
於某些實施例中，該步驟(2)中的葡萄糖含量維持在1g/L以上。於某些具體實施例中，該步驟(2)中的葡萄糖含量較佳維持在約1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10g/L以上。
於某些實施例中，該步驟(3)中的病毒感染劑量(M.O.I.)為約1x10-2~1x10-6。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的病毒感染劑量(M.O.I.)為約1x10-2、1x10-3、1x10-4、1x10-5，或1x10-6。
於某些實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基液面升降速度為約1000~2000ml/min。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基液面升降速度較佳為約1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900，或2000ml/min。
於某些實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基液面下降完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基液面下降完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基的pH值維持在約6.8~7.2之間。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的無血清培養基的pH值較佳維持在約6.8、6.9、7.0、7.1，或7.2之間。
於某些實施例中，該步驟(3)中的CO2濃度為約8~10%。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的CO2濃度較佳為約8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9，或10%。
於某些實施例中，該步驟(3)中的葡萄糖含量維持在1g/L以上。於某些具體實施例中，該步驟(3)中的葡萄糖含量較佳維持在約1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10g/L以上。
於某些實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基液面升降速度為約1000~2000ml/min。於某些具體實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基液面升降速度較佳為約1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900，或2000ml/min。
於某些實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基液面上升完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基液面下降完全後 停留時間為約0~60秒。於某些具體實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基液面下降完全後停留時間較佳為約0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60秒。
於某些實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基的pH值維持在約6.8~7.2之間。於某些具體實施例中，該步驟(4)中的無血清培養基的pH值較佳維持在約6.8、6.9、7.0、7.1，或7.2之間。
於某些實施例中，該步驟(4)中的CO2濃度為約0~8%。於某些具體實施例中，該步驟(4)中的CO2濃度較佳為約0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，或8%。
於某些實施例中，該步驟(4)中的葡萄糖含量維持在1g/L以上。於某些具體實施例中，該步驟(4)中的葡萄糖含量較佳維持在約1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10g/L以上。
於某些實施例中，該步驟(5)中的病毒接種後每隔約5~8天收穫病毒液一次。於某些具體實施例中，該步驟(5)中的病毒接種後較佳為每隔約5、6、7，或8天收穫病毒液一次。
於某些具體實施例中，該步驟(5)中的不活化處理(或去活化處理，inactivated treatment)包含但不限於：滅活劑處理、熱處理等適用本發明之不活化方法。其中滅活劑包含但不限於：甲醛(formaldehyde)、多聚甲醛(paraformaldehyde)、β-丙內酯(Beta-Propiolactone,BPL)、2-溴乙胺(binary ethyleneimine,BEI)，或適用本發明之滅活劑等。於一較佳具體實施例中，該滅活劑為2-溴乙胺(BEI)。
於一部分，本發明提供一種如上述之方法所製備之日本腦炎不活 化病毒疫苗。
於一具體實施例中，該疫苗包含一藥學上可接受之載劑。
其中該藥學上可接受之載劑包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、界面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
其中該佐劑包含但不限於：油質佐劑(如：礦物油、植物油、動物油、佛氏完全佐劑、佛氏不完全佐劑等)、水質佐劑(如：氫氧化鋁)、雙相油質佐劑(如：水包油包水劑型，w/o/w)、生物型佐劑(如：CpG寡核苷酸、細菌類毒素toxoid)等。其中該雙相油質佐劑係包含一界面活性劑以及一油相物質；該界面活性劑係包括一或多種下列所選之群組者：山梨醇(sorbitol)脂肪酸酯；山梨醇脂肪酸酯與環氧乙烷(ethylene oxide)或環氧丙烷(propylene oxide)濃縮物；甘露醇(mannitol)脂肪酸酯；甘露醇脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；甘露醇脂肪酸酯與下列所選之親水基：羧酸(carboxylic acid)、胺基(amine)、醯胺(amide)、醇類(alcohol)、聚酯多元醇(polyol)、醚類(ether)、氧基(oxide)之接合物；無水甘露醇(anhydromannitol)脂肪酸酯；無水甘露醇脂肪酸酯與下列所選之親水基：羧酸、胺基、醯胺、醇類、聚酯多元醇、醚類、氧基之接合物；蔗糖(saccharose)脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；甘油脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；脂肪酸與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；脂肪醇與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；以及甘油磷脂(glycerophospholipid)。該油相物質包 括一或多種下列所選之群組者：礦物油、植物油以及動物油。
於某些具體實施例中，本發明所述之疫苗，可進一步包含一種或多種病原抗原，該病原抗原包含但不限於：克沙奇病毒(Coxsackievirus)、伊科病毒(Echovirus)、小兒痲痹病毒(Poliovirus)、腸病毒(Enterovirus)、B型肝炎病毒(Hepatitis B virus)、牛型結核桿菌(Mycobacterium bovis)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、破傷風桿菌(Clostridium tetani)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、水痘病毒(varicella-zoster virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、德國麻疹病毒(Rubella virus)、輪狀病毒(Rotavirus)及流感病毒(Influenza virus)。
如本文所用，術語「潮汐式培養系統」係指一種包含一細胞培養容器與一培養基容置容器的細胞培養系統，該細胞培養容器係用於裝載該細胞培養載體，並與該培養基容置容器連接，使培養基可在該細胞培養容器與該培養基容置容器之間流通。當部分培養基由該培養基容置容器流至該細胞培養容器時，造成該細胞培養容器中培養基液面上升；反之，當存在於該細胞培養容器中的部分培養基流至該培養基容置容器時，造成該細胞培養容器中培養基液面下降。於一較佳具體實施例中，該細胞培養容器為一血清瓶，其底部設有一開口，以一管線與該培養基容置容器連接。於某些較佳具體實施例中，該培養基容置容器可為，但不限於，塑料袋、玻璃瓶、培養瓶、血清瓶等。於某些較佳具體實施例中，以抽放該潮汐式培養系統中的空氣來控制培養基流動的方向。於某些較佳具體實施例中，以該細胞培養容器及該培養基容置容器的高低位差來控制培養基流動的方向。
如本文所用，冠詞「一」、「一個」以及「任何」是指一個或多 於一個(即至少一個)。例如，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
如本文所用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一 日本腦炎不活化病毒疫苗的製備
將非洲綠猴腎細胞(VERO cells)接種至潮汐式培養系統中的細胞培養載體上，以VP-SFM無血清培養基(GIBCO®,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)培養，載體與培養基的體積比為1：10。於34~37℃、約10% CO2的培養箱中進行細胞接種，潮汐式培養系統中培養基液面升降速度為1800ml/min，當培養基液面上升至剛好覆蓋所有的細胞培養載體時即為上升完全，培養基液面上升完全後停留時間為約20秒，而培養基液面下降完全後停留時間為約5秒，以此條件進行細胞接種1~12小時，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度為8~10%，在細胞接種期間使培養基的pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在2g/L以上。
完成細胞接種後，繼續於34~37℃、0~10% CO2的培養箱中培養細胞3~10天，潮汐式培養系統中培養基液面升降速度為1800ml/min，當培養基液面上升至剛好覆蓋所有的細胞培養載體時即為上升完全，培養基液面上升完 全後停留時間為10秒，而培養基液面下降完全後停留時間為30秒，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度為0~8%，在培養期間使培養基的pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在2g/L以上。此外，在細胞培養階段中，培養基的溶氧量約為新鮮未使用過的培養基的溶氧量的50%以上。於細胞培養3~5天時以及病毒攻毒前各更換一次VP-SFM無血清培養基。
於VERO細胞接種培養3~10天後，以日本腦炎病毒北京株(強毒株，獲自於衛生福利部疾病管制署，台灣)作為疫苗病毒株進行病毒接種，病毒感染劑量(M.O.I)為1x10-2~1x10-6。於34~37℃、5~10% CO2的培養箱中進行細胞接種，潮汐式培養系統中培養基液面升降速度為1800ml/min，當培養基液面上升至剛好覆蓋所有的細胞培養載體時即為上升完全，培養基液面上升完全後停留時間為20秒，而培養基液面下降完全後停留時間為5秒，以此條件進行病毒接種1~12小時，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度為8~10%，在病毒接種期間使培養基的pH值維持在6.8~7.2之間，葡萄糖含量維持在2g/L以上。
完成病毒接種後，繼續於34~37℃、0~10% CO2的培養箱中進行病毒培養，潮汐式培養系統中培養基液面升降速度為1800ml/min，當培養基液面上升至剛好覆蓋所有的細胞培養載體時即為上升完全，培養基液面上升完全後停留時間為10秒，而培養基液面下降完全後停留時間為30秒，並根據培養基的pH值調整CO2濃度，CO2濃度為0~8%，在病毒培養期間使pH值維持在6.8~7.2之間，葡萄糖含量維持在2g/L以上。此外，在病毒培養階段中，培養基的溶氧量約為新鮮未使用過的培養基的溶氧量的40%以上。病毒接種後每隔5~8天收穫病毒液一次，並補充新的培養基。測定病毒力價，病毒力價可達1 x 108.6 TCID50/ml，每批培養基可收穫10L病毒液。
接著，病毒液收穫後，以100kDa濾膜卡匣(cassette)進行濃縮/透析、核酸酶(Benzonase)去除宿主細胞DNA、sepharoase 6 FF管柱進行管柱層析，再利用市售之JEV E抗原抗體對管柱層析的各分層(fraction)進行病毒量檢測(Dot Blot)以確定病毒所在之fraction後，收集病毒所在之fraction再以100kDa cassette濃縮，並以2-溴乙胺(binary ethyleneimine,BEI)對病毒液進行去活化，最後以0.22μm濾膜進行無菌過濾。製得的不活化病毒純化液可直接作為不活化疫苗使用，或是再以Al(OH)3佐劑配製為含有佐劑之不活化疫苗。
實施例二 日本腦炎不活化病毒疫苗穩定性試驗
分別將使用無血清培養基以轉瓶培養獲得的日本腦炎不活化病毒疫苗，以及由上述實施例一所製得的日本腦炎不活化病毒疫苗，置於4℃下保存，並在不同時間點以二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)分析法定量疫苗樣品中日本腦炎不活化病毒疫苗中抗原蛋白質的含量及產率。轉瓶培養獲得的日本腦炎不活化病毒疫苗，以及由上述實施例一所製得的日本腦炎不活化病毒疫苗，二者的差別在於前者的日本腦炎病毒以轉瓶培養生產，而後者的日本腦炎病毒以上述實施例一之潮汐式培養系統生產，其餘如細胞株(VERO cells)、培養基(VP-SFM無血清培養基)、病毒、病毒感染劑量(M.O.I)、培養條件(34~37℃、0~10% CO2)、後續製程等皆相同。
疫苗中抗原蛋白質的產率分析結果顯示，除了日本腦炎病毒培養的方式不同外，以相同製程製備及儲存之日本腦炎不活化病毒疫苗的產率並不同。以轉瓶培養製得的日本腦炎病毒疫苗，其病毒蛋白的每公升病毒收穫液產率為1.84mg/L，以每劑日本腦炎疫苗含有15μg病毒蛋白質來計算，轉瓶培養之 產率為約每公升病毒液可產製約123劑疫苗。而以上述實施例一所製得的日本腦炎不活化病毒疫苗，其病毒蛋白的每公升病毒收穫液產率為5.6mg/L，以每劑日本腦炎疫苗含有15μg病毒蛋白質來計算，以本發明之方法製備日本腦炎疫苗之產率為約每公升病毒液可產製373劑疫苗，為以轉瓶培養製得的日本腦炎病毒疫苗產率的3倍。由上述結果可知，相較於傳統轉瓶培養，以本發明之方法製備之日本腦炎疫苗每單位體積產製之疫苗劑量高出許多。
疫苗中抗原蛋白質的穩定性分析結果顯示，除了日本腦炎病毒培養的方式不同外，以相同製程製備及儲存之日本腦炎不活化病毒疫苗的病毒蛋白穩定性不同。以轉瓶培養製得的日本腦炎病毒疫苗，經過約4個月的冷藏儲存，疫苗中的病毒蛋白含量已由300μg/ml裂解至230μg/ml(病毒蛋白裂解率為23.3%)。反觀以上述實施例一所製得的日本腦炎不活化病毒疫苗，經過約4個月的冷藏儲存，疫苗中的病毒蛋白含量仍維持為280μg/ml，幾乎沒有裂解(病毒蛋白裂解率為1.75%)。
由上述結果可知，以本發明之方法所製得的日本腦炎不活化病毒疫苗穩定性高且產率明顯高於以轉瓶培養製得的日本腦炎病毒疫苗，疫苗中的病毒蛋白品質好不易裂解。
實施例三 日本腦炎不活化病毒疫苗的免疫原性試驗
1.小鼠免疫計畫
以6至8週齡健康BALB/c小鼠30隻作為試驗動物。所有小鼠的血清在試驗前皆呈現日本腦炎病毒抗體陰性的狀態。將這30隻小鼠隨機分為6組，每組5隻，分別依照下列組別施打日本腦炎病毒疫苗，以腹腔注射進行免疫，注射體積為200μl/隻/次，分別於試驗第0天及第14天進行第一次免疫及第 二次免疫，並且於試驗第0天、第14天、第28天進行採血，分離取得血清樣品。試驗組別每次每劑注射疫苗如下：第1組：國光日本腦炎疫苗(以鼠腦製備之不活化日本腦炎疫苗)(正對照組)；第2組：15μg以BEI不活化之轉瓶培養日本腦炎病毒+50μg Al(OH)3佐劑；第3組：3μg以BEI不活化之轉瓶培養日本腦炎病毒+50μg Al(OH)3佐劑；第4組：15μg以BEI不活化之潮汐式培養日本腦炎病毒+50μg Al(OH)3佐劑；第5組：3μg以BEI不活化之潮汐式培養日本腦炎病毒+50μg Al(OH)3佐劑；第6組：磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS)(負對照組)。
2.中和抗體測試：
以BHK-21細胞50%溶斑減少中和試驗法(50% Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT50)測定日本腦炎病毒中和抗體效價(Russell,1967)。於24孔培養盤準備單層BHK-21細胞，置於37℃二氧化碳培養箱。測試用的血清樣品先於56℃水浴進行不活化處理30分鐘。測試血清、陽性對照血清，以及陰性對照血清以1：10稀釋後開始以2倍系列稀釋後使用。日本腦炎病毒株以病毒稀釋液稀釋後(病毒量為600-700PFU/ml)，與等量(130μl)不活化之血清樣品均勻混合，於25℃下反應90分鐘。再將50μl病毒血清混合物感染BHK-21細胞，於37℃,5% CO2培養箱中培養60分鐘，使病毒吸附。然後，每孔添加含1%甲基纖維素培養基，於35℃,5% CO2培養箱培養3~7天。最後，以0.9% NaCl溶液洗掉甲基纖維素培養基，再以Naphthol blue-black solution染色，計算溶斑數。中和效價的定義為最高血清稀釋倍數降低了50%溶斑數。
中和抗體測試的結果如圖1所示，結果顯示施打以本發明之方法製備之日本腦炎疫苗(第4組、第5組)可引起較高的中和抗體。而施打15μg以轉 瓶培養生產之日本腦炎疫苗(第2組)所引起的中和抗體力價則與施打市售國光日本腦炎疫苗(第1組)所引起的中和抗體力價相當。由上述結果可知，以本發明之方法所製得的日本腦炎不活化病毒疫苗的免疫原性顯著高於以轉瓶培養製得的日本腦炎病毒疫苗，以及高於現行使用之以鼠腦製備之市售日本腦炎疫苗。

Claims (6)

  1. 一種日本腦炎疫苗之製備方法，包括以下步驟：(1)將製造疫苗用的細胞接種於一細胞培養載體上，於一潮汐式培養系統中，於34~37℃、5~10% CO2下，以一無血清培養基培養，該潮汐式培養系統包含一細胞培養容器、一培養基容置容器，以及一管線，該細胞培養容器以該管線與該培養基容置容器連接，該潮汐式培養系統以抽放空氣的方式來控制該無血清培養基在該細胞培養容器與該培養基容置容器之間流動的方向；該細胞培養載體與該無血清培養基的體積比為1：5~1：20，且該無血清培養基液面升降速度為1800ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為20秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為5秒，調整的CO2濃度使pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上，進行細胞接種1~12小時；(2)該細胞繼續於34~37℃、0~10% CO2下培養3~10天，該無血清培養基液面升降速度為1800ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為10秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為30秒，該無血清培養基的溶氧量為新鮮未使用過的無血清培養基的溶氧量的50%以上，調整CO2濃度使pH值維持在7.0~7.4之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上，該無血清培養基於細胞培養3~5天時以及病毒攻毒前各更換一次；(3)將日本腦炎病毒接種至該細胞上，病毒感染劑量(multiplicity of infection,M.O.I.)為1x10-2~1x10-6，於34~37℃、5~10% CO2下，以 該無血清培養基培養，且該無血清培養基液面升降速度為1800ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為20秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為5秒，調整的CO2濃度使pH值維持在6.8~7.2之間，進行病毒接種1~12小時，葡萄糖含量維持在1g/L以上；(4)接種後的日本腦炎病毒及細胞繼續於34~37℃、0~10% CO2的培養環境下培養，且該無血清培養基液面升降速度為1800ml/min，該無血清培養基液面上升完全後停留時間為10秒，該無血清培養基液面下降完全後停留時間為30秒，該無血清培養基的溶氧量為新鮮未使用過的無血清培養基的溶氧量的40%以上，調整CO2濃度使pH值維持在6.8~7.2之間，葡萄糖含量維持在1g/L以上；以及(5)病毒接種後每隔5~8天收穫病毒液一次，每批培養基可收穫10L病毒液，並進行純化及不活化處理，以得到日本腦炎去活化病毒疫苗；其中該日本腦炎去活化病毒疫苗於2~8℃下存放4個月後，病毒蛋白裂解率為5%以下。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該製造疫苗用的細胞為非洲綠猴腎細胞(VERO細胞)。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該無血清培養基培養為VP-SFM。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該無血清培養基液面上升至剛好覆蓋所有的該細胞培養載體即為上升完全，使所有的該細胞培養載體完全浸泡於該無血清培養基中，但並不懸浮於該無血清培養基中。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(5)中的不活化處理為滅活劑處理及熱處理其中之一。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該滅活劑包含甲醛(formaldehyde)、多聚甲醛(paraformaldehyde)、β-丙內酯(Beta-Propiolactone,BPL)，以及2-溴乙胺(binary ethyleneimine,BEI)其中之一。
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