TWI682035B - 用於單分子定序的設備及對核酸分子進行定序的方法 - Google Patents

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Abstract

一種適用於單分子定序的設備。所述設備包括至少一個奈米井、多個核酸固定部分及多種類型的核酸片段。所述奈米井具有觀察區。所述核酸固定部分設置在所述觀察區中或鄰近所述觀察區。所述核酸片段分別被固定到所述核酸固定部分。至少一個聚合酶設置在所述觀察區中。提供一種使用上述設備對核酸分子進行定序的方法。本發明適用於單分子定序的設備提供具有高通量且樣本製備時間縮短的優點。

Description

用於單分子定序的設備及對核酸分子進行定序的方法
本發明是有關於一種用於定序的設備及方法，且特別是有關於一種用於單分子定序的設備以及一種對核酸分子進行定序的方法。 [相關申請的交叉參考]
本申請主張在2017年6月13日提出申請的序號為62/518，620的美國臨時申請的優先權。上述專利申請全文併入本申請供參考並構成本說明書的一部分。
用於單分子合成定序（sequencing-by-synthesis，SBS）的傳統策略將一個聚合酶或一個模版固定在一個觀察空間內的反應區內或反應區附近。目前單分子定序方法中的一種方法包括以下步驟。使要定序的核酸模版（例如DNA或RNA）形成閉環（環型模版）。然後，通過固定在可檢測區內的聚合酶來捕獲核酸模版，其中所述聚合酶具有鏈置換活性及高持續合成能力的性質。然後，經由單分子合成定序製程將模版的序列讀取若干次。在此種方法中，最終定序結果是通過有用冗餘讀取（redundant reads）的統計共識（statistical consensus）來確定。然而，所述方法需要聚合酶具有鏈置換活性及高持續合成能力，且一旦聚合酶喪失活性或釋放核酸模版，則會終止定序。所述方法還需要非常精確的裝載（loading）製程以維持一個模版且使得每一可檢測區中僅具有一個模版，以使得不具有模版或具有多於一個模版的那些可檢測區將被視為失敗位點。因此這種嚴格要求使得操作裕度變窄。
本發明提供一種具有高通量且樣本製備時間縮短的優點的適用於單分子定序的設備。
本發明另提供一種通過使用上述設備對核酸分子進行定序的方法。
本發明的適用於單分子定序的設備包括至少一個奈米井、多個核酸固定部分、多種類型的核酸片段及至少一個聚合酶。所述奈米井具有觀察區。所述核酸固定部分設置在所述觀察區中或鄰近所述觀察區。所述核酸片段分別被固定到所述核酸固定部分。所述聚合酶設置在所述觀察區中。
在本發明的一實施例中，所述觀察區的直徑介於10 nm到500 nm範圍內，且所述觀察區的高度小於200 nm。
在本發明的一實施例中，所述多種類型的核酸片段是直線型核酸片段。
在本發明的一實施例中，所述多種類型的核酸片段在長度上包括50個核苷酸到200個核苷酸。
在本發明的一實施例中，所述至少一個聚合酶為一個聚合酶。
在本發明的一實施例中，所述核酸片段在長度上包括多於200個核苷酸。
在本發明的一實施例中，所述至少一個聚合酶包括多個聚合酶，且所述設備還包括多個聚合酶固定部分。所述聚合酶固定部分設置在所述觀察區中，且所述聚合酶被固定到所述聚合酶固定部分。
本發明的對核酸分子進行定序的方法，且包括以下步驟。（a）提供至少一個奈米井，其中所述奈米井具有觀察區。（b）將多種類型的核酸片段通過多個核酸固定部分固定到所述觀察區。（c）向所述奈米井中提供一個引物及多個經標記核苷酸類似物，其中所述引物與所述核酸片段中的一者在所述觀察區中形成引物-核酸片段複合體。（d）通過使用聚合酶並將所述經標記核苷酸類似物納入到所述引物-核酸片段複合體中來起始所述引物-核酸片段複合體的新生鏈合成反應， 以形成新生鏈。（e）通過檢測經納入後所述經標記核苷酸類似物的序列來確定所述核酸片段的序列。
在本發明的一實施例中，所述方法還包括以下步驟。（f）將所述新生鏈離解。（g）重複步驟（c）到步驟（f）。
在本發明的一實施例中，所述步驟（c）還包括添加所述聚合酶。
在本發明的一實施例中，所述方法還包括以下步驟。將多個聚合酶通過多個聚合酶固定部分固定到所述觀察區，其中在步驟（d）中使用的所述聚合酶是所述多個聚合酶中的一者。
在本發明的一實施例中，所述固定所述多個聚合酶的步驟是在步驟（c）之前執行。
在本發明的一實施例中，所述方法還包括以下步驟。（f）將所述新生鏈離解。（g）重複步驟（c）到步驟（f），其中在所重複的步驟（d）中使用的所述聚合酶是所述多個聚合酶中的一者。
在本發明的一實施例中，所述多種類型的核酸片段的製備方法包括以下步驟。提供經萃取基因組DNA。將所述經萃取基因組DNA分裂成多個DNA片段。將所述多個DNA片段的一端接合到多個dsDNA（雙鏈DNA）銜接子上，其中所述多個dsDNA銜接子被固定在固相上。將多個經標記銜接子接合到所述多個DNA片段的另一端上以形成多個經標記DNA片段。通過離解所述多個經標記DNA片段來洗脫多個單鏈DNA片段。
在本發明的一實施例中，在接合所述多個經標記銜接子之前及在洗脫所述多個單鏈DNA片段之前，還包括分別執行洗滌製程。
在本發明的一實施例中，所述多種類型的核酸片段的製備方法包括以下步驟。提供經萃取基因組DNA。將所述經萃取基因組DNA分裂成多個DNA片段。將探針雜交到所述多個DNA片段中的一者。使用DNA聚合酶及經標記核苷酸類似物對經雜交的所述探針進行延伸以形成經標記新生鏈DNA片段複合體。對所述經標記新生鏈DNA片段複合體進行純化。通過離解所述經標記新生鏈DNA片段複合體來洗脫多個單鏈DNA片段。將多個銜接子接合到所述單鏈DNA片段的一端上以形成多個經標記單鏈DNA片段。
在本發明的一實施例中，製備所述多種類型的核酸片段還包括：在所述對所述經標記新生鏈DNA片段複合體進行純化的步驟中執行洗滌製程。
基於上述，本發明提供一種用於單分子定序的設備以及一種對核酸分子進行定序的方法，其中所述設備包括至少一個奈米井、多個核酸固定部分及多種類型的核酸片段。在此方法中，儘管同時添加多種類型的核酸片段，然而在每一時刻僅形成一個引物-聚合酶-核酸複合體，且在每一時刻僅對一種核酸片段（被表示為單分子）進行定序。在一些實施例中，在對一種類型的核酸片段進行定序之後，連續地對同一類型或另一種類型的核酸片段進行定序，且省去了在這兩個定序製程之間添加要定序的核酸片段的時間。因此，本發明的設備及方法具有高通量且樣本製備時間縮短的優點。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
下述詳細說明旨在作為對目前根據本發明的方面所提供的示例性裝置的說明，而並非旨在表示其中本發明可製備或利用的僅有形式。確切來說，應理解，相同或等效功能及元件可通過也旨在囊括在本發明的範圍及精神內的不同實施例來實現。
除非另外定義，否則本文所使用的全部技術及科學用語具有與本發明所屬領域中的一般技術人員所通常理解的含義相同的含義。儘管與所述方法、裝置及材料相似或等效的任何方法、裝置及材料可用於實踐或測試本發明，然而現在闡述示例性方法、裝置及材料。
圖1A到圖1D是根據本發明實施例的一種對核酸分子進行定序的方法的示意圖。圖2示出根據本發明實施例的一種對核酸分子進行定序的方法的流程圖。同時參照圖1A及圖2，首先，在步驟S100中，提供至少一個奈米井110，其中奈米井110具有觀察區112。在一些實施例中，提供包括奈米井110的設備100，且設備100適用於單分子定序。詳細來說，設備100包括奈米井110、多個核酸固定部分120a、120b、多種類型的核酸片段130a、130b及至少一個聚合酶140a、140b、140c。在一些實施例中，設備100適用於對在長度上具有多於200個核苷酸的核酸片段進行定序。應注意，核酸固定部分、核酸片段及聚合酶的數目被例示用於說明目的，且本發明不受其限制。換句話說，核酸固定部分及核酸片段的數目可分別為三個或更多個，且聚合酶的數目可為1個或多個。應注意，在一些實施例中，聚合酶140a、140b、140c已位於設備100中，在一些替代實施例中，聚合酶也可隨後進行添加。
奈米井110具有觀察區112。在一些實施例中，觀察區112形成在奈米井110的底部處或奈米井110的底部附近。奈米井110的底部可為透明的，且因此可通過觀察區112觀察或檢測到奈米井110中的定序製程。因此，可將觀察區112稱為可檢測區、定序位點或單分子定序井。在一些實施例中，觀察區112的直徑介於例如10 nm到500 nm範圍內。在一些實施例中，觀察區112的高度小於例如200 nm。在一些實施例中，觀察區112的高度小於例如100 nm。在一些實施例中，觀察區112的上邊界可呈彎曲形狀。
然後，在步驟S110中，將多種類型的核酸片段130a、130b通過多個核酸固定部分120a、120b固定到觀察區112。核酸固定部分120a、120b設置在觀察區112中或鄰近觀察區112。在一些實施例中，核酸固定部分120a設置在觀察區112中，且核酸固定部分120b鄰近觀察區112設置。核酸片段130a、130b為要定序的模版，且分別固定到核酸固定部分120a、120b。核酸片段130a與核酸片段130b是不同類型的核酸片段，此意味著核酸片段130a與核酸片段130b具有不同的序列。在一些實施例中，所述多種類型的核酸片段130a、130b是直線型。在一些實施例中，核酸片段可為直線型單鏈的，或例如髮夾結構的部分雙鏈。在一些實施例中，核酸片段130a、130b在長度上包括例如多於200個核苷酸。在一些替代實施例中，核酸片段在5’端或3’端、優選地在3’端處具有固定錨，且核酸片段通過固定錨固定到核酸固定部分。固定錨也可位於核酸片段的其他位置(非端處)中。
核酸固定部分120a、120b可為通過共價鍵結或親和結合來固定核酸片段130a、130b的官能基。進行共價鍵結的示例性官能基可例如為硫醇基、一級胺、二級胺、二醇、醛、羧基、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯矽烷、氨基矽烷、巰基矽烷、醛矽烷、二醇矽烷、疊氮基矽烷、半胱胺酸、半胱胺酸衍生物、氨基官能磷酸及其衍生物、環氧、馬來醯亞胺、矽烷馬來醯亞胺、矽烷聚乙二醇（PEG）馬來醯亞胺、或矽烷PEG疊氮化物。進行親和結合的示例性官能基可為生物素、組胺酸、鏈黴抗生素蛋白、蛋白質、蛋白抑制劑、蛋白質底物、抗體、抗原或適配體。
在一些實施例中，聚合酶140a、140b、140c設置在觀察區112中。在一些實施例中，核酸片段130a、130b具有更長的長度，且不完全設置在觀察區112中，且因此如果聚合酶140d不被固定在觀察區112中，則聚合酶核酸複合體可設置在觀察區112外側。因此，設備100還包括用於固定聚合酶140a、140b、140c的位於觀察區112中的多個聚合酶固定部分150a、150b、150c。以此種方式，所述多個聚合酶140a、140b、140c通過分別固定到聚合酶固定部分150a、150b、150c而位於觀察區112中，且因此聚合酶-核酸複合體也位於觀察區112中。應注意，聚合酶固定部分的數目被例示用於說明目的，且本發明不受其限制。
然後，同時參照圖1B及圖2，在步驟S120中，向所述至少一個奈米井110中提供一個引物160a及多個經標記核苷酸類似物170，其中引物160a與所述多種類型的核酸片段130a、130b中的一者在觀察區112中形成引物-核酸片段複合體180a。在一些實施例中，向奈米井110中僅添加一個引物160a。在一些實施例中，引物160a可具有與核酸片段130a互補的序列，且因此使引物160a黏合到核酸片段130a以在觀察區112中形成引物-核酸片段複合體180a。
在一些實施例中，核酸片段130a、130b在長度上包括例如多於200個核苷酸。在一些實施例中，可使引物160a黏合到核酸片段130a的中間部分，以使得核酸片段130a的中間部分為定序製程的起點。然而，本發明並非僅限於此。在一些替代實施例中，定序製程可通過所設計的引物（探針）或通過隨機引發（random priming）核酸片段（圖中未示出）而從5’端或任何其他地方開始。在一些實施例中，通過添加僅一個引物，一次僅引發核酸片段130a、130b中的一者用於定序。在一些實施例中，經標記核苷酸類似物170包括例如經標記dATP、dCTP、dGTP及dTTP。經標記核苷酸類似物170可為經螢光標記核苷酸類似物。
然後，同時參照圖1C及圖2，在步驟S130中，通過使用聚合酶140a、140b、140c並將所述多個經標記核苷酸類似物170納入到引物-核酸片段複合體180a中來起始引物-核酸片段複合體180a的新生鏈合成反應。在一些實施例中，使用聚合酶140a、140b、140c中的一者（例如，聚合酶140a）來合成新生鏈190a。在一些實施例中，在形成含有核酸片段130a、130b中的一者、聚合酶140a、140b、140c中的一者及一個引物160a的引物-聚合酶-核酸複合體之後，起始單分子合成定序製程。即，定序製程的起點位於引物-聚合酶-核酸複合體中，且定序製程是在引物-聚合酶-核酸複合體中起始以合成新生鏈190a。應注意，儘管步驟S110、S120及S130是依序闡述的，然而一旦添加引物及核苷酸類似物，這些步驟便同時進行，因為核酸片段及聚合酶已先被添加到奈米井中。
然後，在步驟S140中，通過檢測經納入後經標記核苷酸類似物170的序列來確定核酸片段130a的序列。在一些實施例中，由於在每一時刻僅一個經標記核苷酸類似物170被納入到觀察區112中的引物-核酸片段複合體180a中，因此可利用高準確度來確定核酸片段130a的序列。在一些實施例中，經標記核苷酸類似物170分別包括具有不同螢光的經標記dATP、dCTP、dGTP及dTTP。在一些實施例中，可通過檢測經納入後經標記dATP、dCTP、dGTP及dTTP的序列的不同螢光訊號來確定核酸片段130a的序列。
然後，在步驟S150中，將新生鏈190a離解。在一些實施例中，通過合成新生鏈190a而進行的定序製程可能因聚合酶140a喪失活性或釋放核酸片段130a而被終止。然而，在將新生鏈190a離解之後，可通過重新捕獲附近的聚合酶140a、140b、140c來恢復定序製程。具體來說，如果定序製程因聚合酶140a喪失活性而終止，則聚合酶140a可視需要被移除，且可重新捕獲附近的另一聚合酶140b、140c來恢復定序製程。如果定序製程因釋放核酸片段130a而終止，則可重新捕獲同一聚合酶140a或附近的另一聚合酶140b、140c來恢復定序製程。
然後，同時參照圖1D及圖2，在步驟S160中，重複步驟S120到步驟S150。在一些實施例中，在所重複的步驟S120中，添加新的引物160b，且重新捕獲聚合酶140a、140b、140c中的一者來合成新生鏈190b。在一些實施例中，是以捕獲聚合酶140b為例，但此僅用於說明目的。換句話說，如上所述，在一些替代實施例中，在所重複的步驟S130中，可重新捕獲聚合酶140a或另一聚合酶140c以合成新生鏈190a。因此，可通過將新生鏈離解、提供新的引物且重新捕獲聚合酶中的一者，將定序製程重複若干次。在一些實施例中，重複步驟S120到步驟S150以增大核酸片段130a、130b的序列覆蓋率，直到達到共有序列的必要準確度為止。應注意，由於聚合酶140a、140b、140c從開始便已添加到奈米井中，因此添加引物會起始單分子合成定序製程。應注意，在一些實施例中，儘管核酸片段130b鄰近觀察區112固定，然而核酸片段130b、引物160b及聚合酶140b的引物-聚合酶-核酸複合體也可形成於並位於觀察區112中。換句話說，“鄰近”意味著核酸片段130b靠近觀察區112，且核酸片段130b與觀察區112隔開一定距離，其中所述距離適用於核酸片段130b在觀察區112中形成引物-聚合酶-核酸複合體。對於單鏈DNA分子來說，每一鹼基的平均長度為約0.6 nm到0.7 nm（單鏈DNA的持久長度及每一鹼基的長度是通過螢光相關光譜測量利用平均場理論（物理A：統計機械學及其應用（Physica A: Statistical Mechanics and its Applications），2013年3月1日第5期第392卷，第1072到1079頁）來獲得）。儘管核酸片段130b中的一些部分並不完全固定在觀察區內，但所述片段的一部分足夠長而擴散到觀察區中並與固定在觀察區內的聚合酶形成引物-聚合酶-核酸複合體，藉此可進行定序製程。在一些實施例中，從觀察區112邊界到核酸片段130b的核酸固定部分120b之間的距離必須處於例如L × 0.6 × 50% nm範圍內以在從觀察區112邊界到核酸固定部分120b之間的觀察區112中有效地形成引物-聚合酶-核酸複合體，其中L為鹼基中的片段長度。
在一些實施例中，核酸片段130a、130b固定在同一觀察區112中或鄰近同一觀察區112，以使得核酸片段130a、130b可在同一觀察區112中交替地及完全地進行定序，且不會清理並重新裝載另一核酸片段。換句話說，由於核酸片段130a、130b已存在於奈米井中，因此在對一種類型的核酸片段130a進行定序之後，可連續地對同一類型的核酸片段130a或另一種類型的核酸片段130b進行定序，故省去了在這兩個定序製程之間添加要定序的核酸片段的時間。在一些實施例中，由於核酸片段130a、130b已存在於奈米井中，因此在對一條核酸片段130a進行定序之後，可連續地對同一條的核酸片段130a或另一條的核酸片段130b進行定序，故省去了在這兩個定序製程之間添加要定序的核酸片段的時間。應注意，儘管核酸片段130a、130b同時固定在同一觀察區112中或鄰近同一觀察區112，因為在每一時刻僅形成一個引物-聚合酶-核酸複合體，因此在每一時刻僅對一種核酸片段（被表示為單分子）130a進行定序。
應注意，儘管在圖1A到圖1D中，核酸片段130a、130b在長度上包括例如多於200個核苷酸，然而本發明並非僅限於此。在一些實施例中，如圖3所示，核酸片段130c、130d、130e在長度上包括例如50個核苷酸到200個核苷酸。在一些實施例中，核酸片段130c、130d、130e為例如游離DNA或微RNA等短的片段。在一些實施例中，核酸片段130c、130d、130e分別固定到核酸固定部分120c、120d、120e。由於核酸片段130c、130d、130e具有更短的長度，因此核酸片段130c、130d、130e實質上完全設置在觀察區112中或鄰近觀察區112。因此，無需將聚合酶140d固定在觀察區112中。另外，在一些實施例中，向奈米井110中添加一個引物160c及一個聚合酶140d會起始引物-聚合酶-核酸複合體的形成以及執行單分子合成定序製程。在一些實施例中，通過合成新生鏈190c而進行的定序製程可能因聚合酶140d喪失活性或釋放核酸片段130e而被終止。然而，在將新生鏈190c離解之後，可通過重新捕獲另一新添加的聚合酶（圖中未示出）來恢復定序製程。具體來說，如果定序製程因聚合酶140d喪失活性而終止，則聚合酶140d可視需要被移除，且可重新捕獲新添加的聚合酶（圖中未示出）來恢復定序製程。如果定序製程因釋放核酸片段130e而終止，則可重新捕獲同一聚合酶140d來恢復定序製程。應注意，儘管在圖3中示意性地示出三個核酸片段130c、130d、130e，然而本發明並非僅限於此。在一些替代實施例中，核酸片段也可一次裝載數十個、甚至數百個片段，且可重複對每一片段進行定序。因此，設備100a的定序容量可成倍增加。
圖3是根據本發明實施例的適用於單分子定序的設備的示意圖。設備100a的元件與設備100的元件相似，且設備100與設備100a之間的主要不同在於設備100適用於對更長的核酸片段（例如在長度上具有多於200個核苷酸）進行定序，且設備100a適用於對更短的核酸片段（例如在長度上具有少於200個核苷酸）進行定序。以下闡述不同之處。參照圖3，設備100a包括至少一個奈米井110、多個核酸固定部分120c、120d、120e（為了說明目的，在圖3中示意性地示出三個核酸固定部分120c、120d、120e）、多種類型的核酸片段130c、130d、130e（為了說明目的，在圖3中示意性地示出三種類型的核酸片段130c、130d、130e）及僅一個聚合酶140d。此處，核酸片段130c、130d、130e在長度上包括例如50個核苷酸到200個核苷酸。核酸片段130c、130d及130e是不同類型的核酸片段，此意味著核酸片段130c、核酸片段130d及核酸片段130e具有不同的序列。在一些實施例中，聚合酶140d設置在觀察區112中。在一些實施例中，核酸片段130c、130d、130e具有更短的長度，且完全設置在觀察區112中或鄰近觀察區112，且因此引物-聚合酶-核酸複合體可位於觀察區112中。在一些實施例中，引物-聚合酶-核酸複合體是含有一個引物、一個聚合酶及一種核酸片段的複合體。因此，聚合酶140d不需要另外固定在觀察區112中。
簡單來說，在用於單分子定序的設備中，所述多個核酸固定部分設置在奈米井的觀察區中或鄰近奈米井的觀察區，且所述多種類型的核酸片段固定到核酸固定部分。儘管在奈米井中同時添加多種類型的核酸片段，然而在每一時刻僅形成一個引物-聚合酶-核酸複合體，且在每一時刻僅對一種類型的核酸片段（被表示為單分子）進行定序。另外，因為所述核酸片段已存在於奈米井中，在對一種類型的核酸片段進行定序之後，連續地對同一類型或另一種類型的核酸片段進行定序，故省去了在這兩個定序製程之間添加要定序的核酸片段的時間。因此，本發明的設備及方法具有高通量且樣本製備時間縮短的優點。
圖4A至圖4G是本發明實施例中的一種用於製備多種類型的核酸片段的方法的示意圖。圖5A至圖5G是本發明另一實施例中的用於製備多種類型的核酸片段的另一方法的示意圖。
參照圖4A至圖4G，一種用於製備所述多種類型的核酸片段的方法包括以下步驟。首先，提供經萃取基因組DNA 210。然後，將經萃取基因組DNA 210分裂成多個DNA片段212。然後，將DNA片段212的一端212a接合到dsDNA銜接子220上，其中dsDNA銜接子220被固定在固相230上。然後，執行洗滌製程以洗掉未結合的DNA片段212。然後，將經標記銜接子240接合到附接在固相230上的DNA片段212的另一端212b上以形成經標記DNA片段214。在一些實施例中，經標記銜接子240例如為具有單鏈部分的部分雙鏈DNA，其中標記F標記在單鏈部分的端部上。在一些實施例中，標記F例如為生物素。然後，執行洗滌製程以洗掉未附接的經標記銜接子240。然後，通過離解經標記DNA片段214來洗脫多個單鏈DNA片段214a。此處，單鏈DNA片段214a可直接用作進行定序的核酸片段。
參照圖5A至圖5G，另一種製備所述多種類型的核酸片段的方法包括以下步驟。首先，提供經萃取基因組DNA 310。然後，將經萃取基因組DNA 310分裂成多個DNA片段312。然後，將探針320雜交到DNA片段312中的一者。然後，使用DNA聚合酶330及經標記核苷酸類似物340對經雜交的探針322進行延伸以形成經標記新生鏈DNA片段複合體313。在一些實施例中，經標記核苷酸類似物340中的每一者含有標記，且所述標記例如為生物素。然後，對經標記新生鏈DNA片段複合體313進行純化。執行洗滌製程以洗掉未標記的DNA片段312。在一些實施例中，經標記新生鏈DNA片段複合體313是通過經鏈黴抗生素蛋白披覆的磁珠350及磁體360來純化。然後，通過離解經標記新生鏈DNA片段複合體313來洗脫多個單鏈DNA片段313a。然後，將錨370接合到單鏈DNA片段313a的一端313a1（或另一端313a2）上以形成經標記單鏈DNA片段314。此處，經標記單鏈DNA片段314可直接用作進行定序的核酸片段。
在一些實施例中，每一定序製程可得到核酸片段的部分序列。所述部分序列可始於同一起點或不同的起點，且在不同的終點處結束。可將定序製程重複若干次，以在一個奈米井中獲得若干部分序列。然後，通過將若干部分序列一起對齊，可獲得核酸片段的更長共有序列。
綜上所述，本發明提供一種用於單分子定序的設備以及一種對核酸分子進行定序的方法，且所述設備包括至少一個奈米井、多個核酸固定部分及多種類型的核酸片段。在一些實施例中，定序製程的起始可通過添加一個引物或一個聚合酶來控制，且因此確保僅形成一個引物-聚合酶-核酸複合體。因此，在每一時刻，僅將一個經標記核苷酸類似物納入到引物-聚合酶-核酸複合體中，且可通過奈米井的觀察區將此經標記核苷酸類似物檢測作為定序結果。因此，可準確地獲得定序結果而不受干擾。另外，因為所述核酸片段從開始便已添加到奈米井中，可連續地對核酸片段進行定序，且省去了添加要定序的核酸片段的時間。此外，由於在一次裝載期間，在一個奈米井中裝載多個核酸片段和/或多個聚合酶，因此可防止裝載失敗。因此，本發明的設備及方法具有高通量且樣本製備時間縮短的優點。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
100、100a‧‧‧設備110‧‧‧奈米井112‧‧‧觀察區120a、120b、120c、120d、120e‧‧‧核酸固定部分130a、130b、130c、130d、130e‧‧‧核酸片段140a、140b、140c、140d‧‧‧聚合酶150a、150b、150c‧‧‧聚合酶固定部分160a、160b、160c‧‧‧引物170‧‧‧核苷酸類似物180a‧‧‧引物-核酸片段複合體190a、190b、190c‧‧‧新生鏈210、310‧‧‧經萃取基因組DNA212、312‧‧‧DNA片段212a、212b、313a1、313a2‧‧‧端214‧‧‧經標記DNA片段214a、313a‧‧‧單鏈DNA片段220‧‧‧dsDNA銜接子230‧‧‧固相240‧‧‧經標記銜接子313‧‧‧經標記新生鏈DNA片段複合體314‧‧‧經標記單鏈DNA片段320‧‧‧探針322‧‧‧經雜交的探針330‧‧‧DNA聚合酶340‧‧‧經標記核苷酸類似物350‧‧‧經鏈黴抗生素蛋白披覆的磁珠360‧‧‧磁體370‧‧‧錨F‧‧‧標記S100、S110、S120、S130、S140、S150、S160‧‧‧步驟
包括附圖是為了提供對本公開的進一步理解，且所述附圖併入本說明書中並構成本說明書的一部分。圖式示出本公開的示例性實施例，並且與本說明一起用於解釋本公開的原理。 圖1A到圖1D是根據本發明實施例的一種對核酸分子進行定序的方法的示意圖。 圖2示出根據本發明實施例的一種對核酸分子進行定序的方法的流程圖。 圖3是根據本發明實施例的適用於單分子定序的設備的示意圖。 圖4A至圖4G是根據本發明實施例的一種用於製備多種類型的核酸片段的方法的示意圖。 圖5A至圖5G是根據本發明實施例的用於製備多種類型的核酸片段的另一方法的示意圖。
100‧‧‧設備
110‧‧‧奈米井
112‧‧‧觀察區
120a、120b‧‧‧核酸固定部分
130a、130b‧‧‧核酸片段
140a、140b、140c‧‧‧聚合酶
150a、150b、150c‧‧‧聚合酶固定部分
160a‧‧‧引物
170‧‧‧核苷酸類似物
180a‧‧‧引物-核酸片段複合體
190a‧‧‧新生鏈

Claims (20)

  1. 一種適用於單分子定序的設備，包括： 至少一個奈米井，其中所述至少一個奈米井具有觀察區； 多個核酸固定部分，設置在所述觀察區中或鄰近所述觀察區； 多種類型的核酸片段，分別被固定到所述多個核酸固定部分；以及 至少一個聚合酶，設置在所述觀察區中。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的設備，其中所述觀察區的直徑介於10 nm到500 nm範圍內，且所述觀察區的高度小於200 nm。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的設備，其中所述多種類型的核酸片段是直線型核酸片段。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的設備，其中所述多種類型的核酸片段在長度上包括50個核苷酸到200個核苷酸。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的設備，其中所述至少一個聚合酶為一個聚合酶。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的設備，其中所述多種類型的核酸片段在長度上包括多於200個核苷酸。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的設備，其中所述至少一個聚合酶包括多個聚合酶，所述設備還包括位於所述觀察區中的多個聚合酶固定部分，且所述多個聚合酶被固定到所述多個聚合酶固定部分。
  8. 一種對核酸分子進行定序的方法，包括： （a）提供至少一個奈米井，其中所述至少一個奈米井具有觀察區； （b）將多種類型的核酸片段通過多個核酸固定部分固定到所述觀察區； （c）向所述至少一個奈米井中提供一個引物及多個經標記核苷酸類似物，其中所述引物與所述多種類型的核酸片段中的一者在所述觀察區中形成引物-核酸片段複合體；以及 （d）通過使用聚合酶並將所述多個經標記核苷酸類似物納入到所述引物-核酸片段複合體中來起始所述引物-核酸片段複合體的新生鏈合成反應， 以形成新生鏈；以及 （e）通過檢測經納入後所述多個經標記核苷酸類似物的序列來確定所述多種類型的核酸片段的序列。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中還包括以下步驟： （f）將所述新生鏈離解；以及 （g）重複步驟（c）到步驟（f）。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中所述觀察區的直徑介於10 nm到500 nm之間，且所述觀察區的高度小於200 nm。
  11. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中所述多種類型的核酸片段在長度上包括50個核苷酸到200個核苷酸。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中步驟（c）還包括添加所述聚合酶。
  13. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中所述多種類型的核酸片段在長度上包括多於200個核苷酸。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中還包括將多個聚合酶通過多個聚合酶固定部分固定到所述觀察區，其中在步驟（d）中使用的所述聚合酶是所述多個聚合酶中的一者。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的方法，其中所述固定所述多個聚合酶的步驟是在步驟（c）之前執行。
  16. 如申請專利範圍第14項所述的方法，其中還包括以下步驟： （f）將所述新生鏈離解；以及 （g）重複步驟（c）到步驟（f），其中在所重複的步驟（d）中使用的所述聚合酶是所述多個聚合酶中的一者。
  17. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中所述多種類型的核酸片段的製備方法包括： 提供經萃取基因組DNA； 將所述經萃取基因組DNA分裂成多個DNA片段； 將所述多個DNA片段的一端接合到多個雙鏈DNA銜接子上，其中所述多個雙鏈DNA銜接子被固定在固相上； 將多個經標記銜接子接合到所述多個DNA片段的另一端上以形成多個經標記DNA片段；以及 通過離解所述多個經標記DNA片段來洗脫多個單鏈DNA片段。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的方法，其中在接合所述多個經標記銜接子之前及在洗脫所述多個單鏈DNA片段之前，還包括分別執行洗滌製程。
  19. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中所述多種類型的核酸片段的製備方法包括： 提供經萃取基因組DNA； 將所述經萃取基因組DNA分裂成多個DNA片段； 將探針雜交到所述多個DNA片段中的一者； 使用DNA聚合酶及經標記核苷酸類似物對經雜交的所述探針進行延伸以形成經標記新生鏈DNA片段複合體； 對所述經標記新生鏈DNA片段複合體進行純化； 通過離解所述經標記新生鏈DNA片段複合體來洗脫多個單鏈DNA片段；以及 將多個錨接合到所述多個單鏈DNA片段的一端上以形成多個經標記單鏈DNA片段。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的方法，其中還包括：在所述對所述經標記新生鏈DNA片段複合體進行純化的步驟中執行洗滌製程。
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