TWI673495B - 活體樣品中來那度胺（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）之前處理方法及分析方法 - Google Patents

活體樣品中來那度胺（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）之前處理方法及分析方法 Download PDF

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Abstract

本發明之課題在於提供一種用以對含有來那度胺(Lenalidomide)之對映體之活體樣品進行前處理之新穎方法，藉此確立來那度胺之對映體之簡便且準確之定量分析方法。
本發明藉由在酸性條件下對含有來那度胺之對映體之活體樣品進行去蛋白質，而防止活體樣品中之來那度胺之對映體之外消旋化、分解，然後將以上述方式進行前處理之活體樣品供於HPLC，藉此可簡便且準確地對來那度胺之對映體進行定量。

Description

活體樣品中來那度胺(Lenalidomide)之前處理方法及分析方法
本發明係關於一種以在酸性條件下進行去蛋白質為特徵之用以對含有來那度胺之對映體之活體樣品進行前處理之方法、及以藉由高效液相層析法對以上述方式進行前處理之含有來那度胺之對映體之活體樣品進行分析為特徵之用以對活體樣品中之來那度胺之對映體進行定量之方法。
來那度胺係沙立度胺(thalidomide)之衍生物，被廣泛用作對多發性骨髓瘤等各種惡性血液疾病有效之免疫調節劑。對於來那度胺，報告有其與沙立度胺相比，具有得到改善之毒理特性(toxicological profile)及優異之免疫調節活性(非專利文獻1)。藉由利用逆相模式之HPLC法(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)，來那度胺之藥物動力學特性得以明確(非專利文獻2、非專利文獻3、及非專利文獻4)，推測來那度胺之末端排除半衰期約為3~4小時。
又，關於沙立度胺或其衍生物、類似物，報告有R體與S體之藥物活性之差異。例如報告有，僅R體可見沙立度胺之鎮靜作用(非專利文獻5)，另一方面報告有，S-泊馬度胺(Pomalidomide，3-胺基-鄰苯二甲醯亞胺-戊二醯亞胺)與R體或外消旋體相比，會顯著阻礙由bFGF(basic fibroblast growth factor，鹼性纖維母細胞生長因子)或VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內皮生長因子)誘發之角膜血管新生(非專利文獻6)。
雖然存在此種對映體之活性之差異，但仍然將沙立度胺以R體：S體=50：50之外消旋體混合物之形式進行投予。作為其主要原因之一，可列舉血液中之極速之外消旋化特性(非專利文獻7)。
明確沙立度胺之對映體藉由使用有機溶劑之反覆萃取、或者使用修飾直鏈澱粉(非專利文獻8)、纖維素(非專利文獻7)、萬古黴素(非專利文獻9)或甲基丙烯醯胺(非專利文獻10)等對映選擇型固定相之層析法進行分離、定量，於血液中極速進行外消旋化。報告有此種外消旋化由G.Blaschke等人首次揭示，人類血漿中之沙立度胺之外消旋化半衰期約為10分鐘(非專利文獻10)。考慮到沙立度胺之排出半衰期為8.7小時(非專利文獻11)，此外消旋化半衰期極短。
由於顯示出此種體內配置(disposition)，故而認為投予沙立度胺之純對映體並無藥理學上之意義，且一直認為具有與沙立度胺類似之基本骨架之來那度胺亦具有同樣之性質，因此並未對來那度胺之純對映體之藥物動力學、藥理學特性進行充分研究，迄今為止對於活體樣品中之來那度胺之純對映體之分離、定量方法完全無報告。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Hideshima T et al., Ther. Clin. Risk. Manag. 2008, 4(1), p.129-36
[非專利文獻2]Tohnya TM et al., J. Chromatogr. B Analyt.Technol. Biomed.Life. Sci., 2004, 811(2), p.135-41
[非專利文獻3]Chen N et al., Cancer.Chemother.Pharmacol., 2012, 70(5), p.717-25
[非專利文獻4]Chen N et al., J Clin Pharmacol., 2007, 47(12), p.1466-75
[非專利文獻5]Hoeglund P et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 1998 26(4), p.363-83
[非專利文獻6]Lentzsch S et al., Cancer. Res., 2002, 62(8), p.2300-5
[非專利文獻7]Eriksson T et al., Chirality., 1995, 7(1), p.44-52
[非專利文獻8]Meyring M et al., J. Chromatogr. A. 2000, 876(1-2), p.157-67
[非專利文獻9]Murphy-Poulton SF et al., J. Chromatogr. B Analyt.Technol. Biomed.Life. Sci., 2006, 831(1-2), p.48-56
[非專利文獻10]Knoche B et al., J. Chromatogr. A., 1994, 666, p.235-240
[非專利文獻11]Chen TL et al., Drug.Metab.Dispos., 1989, 17(4), p.402-5
本發明之課題在於提供一種用以抑制來那度胺之對映體之外消旋化及/或分解，於維持活體中之來那度胺之對映體各自之含量之狀態下對樣品進行前處理之新穎方法。
本發明者此次驚訝地發現，來那度胺之對映體與沙立度胺之對映體相比，於活體內滯留有意義長之時間。如上所述，由於沙立度胺之對映體於活體內之外消旋化速度極為迅速，故而認為投予純對映體並無藥理學上之意義，但若考慮來那度胺之排除半衰期，則明確其會以對映體之形式於活體內滯留長達無法忽視藥理效果之時間。因此認為，來那度胺之純對映體之藥物動力學、藥理學作用之評估具有極為重要之意義。又，於對活體樣品中之來那度胺之純對映體進行分析之情形時，為了防止因蛋白質之妨礙引起之分析精度之降低，需要預先 進行去蛋白質處理。先前，沙立度胺之前處理係藉由利用強疏水性有機溶劑將含有沙立度胺之活體樣品萃取1次或複數次，並對所獲得之有機溶劑層加以乾燥後，將其再溶解於有機溶劑中而進行。然而，由於來那度胺之極性高於沙立度胺，難以溶解於有機溶劑層中，因此無法應用先前之方法。為了解決此種課題，本發明者對pH值對來那度胺之對映體之外消旋化所產生之影響反覆進行努力研究，結果發現，來那度胺之對映體於酸性條件下極為穩定，從而完成本發明。
具體而言，本發明包含以下之發明。
[1]一種用以對含有來那度胺之對映體之活體樣品進行前處理之方法，其特徵在於：於酸性條件下進行活體樣品之去蛋白質。
[2]如[1]所記載之方法，其特徵在於：上述酸性條件為pH值5以下。
[3]如[1]或[2]所記載之方法，其特徵在於：其係添加選自過氯酸、三氯乙酸、三氟乙酸、偏磷酸、鹽酸、琥珀酸、及順丁烯二酸中之酸。
[4]如[1]至[3]中任一項所記載之方法，其特徵在於：上述活體樣品為血液、血清、血漿、尿、唾液、母乳、腦脊髓液、精液、組織、或微粒體。
[5]如[1]至[4]中任一項所記載之方法，其特徵在於：上述來那度胺之對映體為S體。
[6]如[1]至[4]中任一項所記載之方法，其特徵在於：上述來那度胺之對映體為R體。
[7]一種用以對活體樣品中之來那度胺之對映體進行定量之方法，其特徵在於：藉由高效液相層析法對藉由如[1]至[6]中任一項所記載之方法進行前處理之含有來那度胺之對映體之活體樣品進行分離分析。
[8]一種用以保存來那度胺之對映體之方法，其特徵在於：於水性緩衝液中於酸性條件下維持來那度胺之對映體。
[9]如[8]所記載之方法，其特徵在於：上述酸性條件為pH值5以下。
[10]如[8]或[9]所記載之方法，其特徵在於：上述水性緩衝液為檸檬酸緩衝液。
[11]如[8]至[10]中任一項所記載之方法，其特徵在於：上述來那度胺之對映體為S體。
[12]如[8]至[10]中任一項所記載之方法，其特徵在於：上述來那度胺之對映體為R體。
根據本發明，可抑制來那度胺之對映體之外消旋化及/或分解，於維持活體中之來那度胺之對映體含量之狀態下對樣品進行前處理，而簡便、有效率且準確地對活體樣品中之來那度胺之對映體進行分離、定量。認為藉此有助於明確活體內之來那度胺之純對映體之藥物動力學特性或藥理學特性，而發現藉由投予來那度胺之純對映體而降低副作用或提高藥效之可能性。因此，確信本發明對來那度胺之對映體之藥理藥效、安全性、物性、藥物動力研究等醫療、製藥產業中之運用、展開大有助益。
圖1係表示於室溫及50℃下在各種溶劑中保存24小時之來那度胺之穩定性之圖表。塗黑之棒狀圖表示對映體1，斜線之棒狀圖表示對映體2。
圖2表示使用乙酸乙酯作為移動相、使用Chiralpak IC(4.6mm i.d.×250mm)作為光學分割用管柱之情形時之來那度胺之對映體之分離。
圖3表示使用乙酸乙酯作為移動相、使用Chiralpak IC(20mm i.d.×250mm)作為光學分割用管柱之來那度胺之對映體之純化。將溶出至組分1中之對映體命名為LL1，將溶出至組分2中之對映體命名為LL2。
圖4係組分1(A-1)或組分2(B-1)中之純化(分取)對映體之層析圖。分析係使用Chiralpak IA。
圖5係表示S-沙立度胺(a)及R-沙立度胺(b)之層析圖。
圖6表示於室溫下添加水性緩衝液後之(S*)-LL及(R*)-LL之波峰面積之時間變化。
圖7表示於室溫下之水性緩衝液(pH值為4~9)中之對映體過量之經時變化。
圖8係於室溫下之相對於時間之log10(對映體過量)之圖。
圖9表示(a)水中之LL對映體(對照)及(b)人類血清中之LL對映體之層析圖。樣品：(a)水中0.1mg/ml之外消旋體LL；(b)人類血清中水中0.1mg/ml之外消旋體LL；(c)不含LL之人類血清。於將LL溶解於血清或水中後立即添加HClO4。HPLC條件：管柱：Chiralpak IA(4.6mm i.d.×250cm)+Security guard C8(3.0mm i.d.×4mm)，流速：0.75mL/min，注入量：2μL。
圖10係(a)Na-磷酸緩衝液中0.01mg/mL之LL(pH值為7.4)、(b)血清中0.01mg/mL之LL、及(c)不含LL之空白血清之層析圖。
圖11係37℃之人類血清中添加10μg/mL之(S*)-LL後之層析圖。
圖12表示Na-磷酸緩衝液(pH值為7.4，斜線)及人類血清(塗黑)中之LL及TD對映體之外消旋化半衰期。棒狀圖表示3次試驗之平均值，誤差杠表示SD。有意義差為* * p<0.01、* * * p<0.001。
來那度胺(LL)係作為多發性骨髓瘤治療藥而已知之沙立度胺(TD)之衍生物，被廣泛用作對多發性骨髓瘤等各種惡性血液疾病有效之免 疫調節劑。其具有如以下之式所表示之化學結構，且與沙立度胺同樣地於二氧雜哌啶環上具有不對稱中心。
來那度胺藉由與地塞米松併用，於復發、難治性多發性骨髓瘤中之有效率(response rate)高達60%，在世界中正逐漸被認可，迄今為止在約50個國家得到認可，成為銷售額超過4000億日元之暢銷藥(blockbuster drug)。在日本，雖然於2010年得到承認，但就確保安全性之觀點而言，附加有必須遵守醫療相關者、患者、家庭之管理程序或在全部病例中實施使用效果調查之條件。來那度胺之藥效高於沙立度胺，睡意或麻痹等副作用輕微，另一方面，由於與沙立度胺同樣地仍然存在致畸胎性之風險，因此禁忌對孕婦投藥。由於來那度胺係沙立度胺之衍生物，故而推測其與沙立度胺同樣地於血液中會迅速進行外消旋化。因此，係以R體：S體=50：50之外消旋體之形式銷售，目前難以獲得來那度胺之純對映體。又，由於亦尚未確立抑制外消旋化進行穩定之前處理、分離分析之條件，故而迄今為止，對於來那度胺之純對映體之體內動態或外消旋化速度等幾乎未知。
本發明者此次發現，於使用層析法之光學分割中，藉由使用選自由非質子性溶劑、二級醇及該等之混合物所組成之群中之有機溶劑作為移動相，可抑制分解或外消旋化，而對來那度胺之純對映體進行分離、定量。因此，本發明之態樣提供一種用以對來那度胺之對映體進行分離、定量之方法，其特徵在於：將含有來那度胺之對映體混合 物之樣品供於層析法，然後使用選自由非質子性溶劑、二級醇及該等之混合物所組成之群中之有機溶劑作為移動相，藉此自來那度胺之對映體混合物中將來那度胺之各對映體穩定地光學分割。
層析法係如下所述之方法：使含有對映體混合物之樣品與移動相之有機溶劑一併於擔載有具有不對稱識別能力之化合物(對掌性識別劑)之固定相中流動，而使各對映體吸附於該固定相，利用其保持時間差對各對映體進行光學分割。通常使用安裝有光學分割用管柱之高效液相層析(HPLC)裝置而進行。
用作移動相之非質子性溶劑只要可達成本發明之目的，則無特別限制，例如可列舉：乙腈、乙酸乙酯等酯類、丙酮等酮類、二乙醚、二異丙醚等醚類或該等之組合等。較佳為乙腈、乙酸乙酯或該等之組合。
用作移動相之二級醇只要可達成本發明之目的，則無特別限制，可列舉：異丙醇、2-丁醇、環戊醇、或環己醇或者該等之組合。較佳為異丙醇。
本發明之方法中所使用之光學分割用管柱只要可達成本發明之目的，則無特別限定，可為正相管柱、逆相管柱、其他分離模式之管柱或將各者組合而成之多模式管柱。典型而言，可使用多糖衍生物對掌性管柱。所謂多糖衍生物對掌性管柱係作為對掌性識別劑而於載體上固定有多糖衍生物之管柱。作為擔載於多糖衍生物對掌性管柱上之多糖衍生物，例如，可列舉直鏈澱粉衍生物或纖維素衍生物。於本發明中，較佳為使用Chiralpak(註冊商標)IA或Chiralpak(註冊商標)IC。
藉由本發明之光學分割法，可於不伴有分解或外消旋化之情況下自來那度胺之對映體混合體(外消旋體等)中將來那度胺之純對映體分離、定量。
於將活體樣品中之來那度胺之純對映體分離、定量之情形時， 通常預先去除會導致低分子之分離效率降低之蛋白質之類的高分子。先前，沙立度胺之前處理係藉由利用疏水性有機溶劑(例如，正己烷/乙酸乙酯混合液)將含有沙立度胺之活體樣品萃取1次或複數次，並對所獲得之有機溶劑層加以乾燥後，將其再溶解於二烷等有機溶劑中而進行。然而，由於來那度胺之極性高於沙立度胺，於有機溶劑層中之溶解度較小，故而先前之方法效率較低而欠佳。為了解決此種課題，本發明者等人對pH值對來那度胺之對映體之外消旋化所產生之影響反覆進行努力研究，結果發現，來那度胺之對映體於酸性條件下極為穩定。因此，本發明之另一態樣提供一種用以對含有來那度胺之對映體之活體樣品進行前處理之方法，其特徵在於：於酸性條件下對上述活體樣品進行去蛋白質。
典型而言，此種酸性條件係pH值為5以下，較佳為pH值為2~5之範圍，最佳為pH值為4~5之範圍。
為了形成酸性條件而於樣品中添加之酸只要可達成本發明之目的，則無特別限制，可列舉：過氯酸、三氯乙酸、三氟乙酸、偏磷酸、鹽酸、或者琥珀酸或順丁烯二酸等二羧酸。
活體樣品只要含有來那度胺，則無特別限制，例如可列舉：血液、血清、血漿、尿、唾液、母乳、汗、腦脊髓液、精液、組織或微粒體等。
藉由將如此進行過前處理之含有來那度胺之對映體之活體樣品供於層析法、較佳為高效液相層析法(HPLC)，可簡便且有效率地對存在於活體樣品中之來那度胺之對映體進行分離、定量。
進而，藉由向水性緩衝液中於酸性條件下維持組分經分取之來那度胺之對映體，可保存來那度胺之對映體。此種酸性條件典型而言為pH值5以下，較佳為pH值為2~5之範圍。水性緩衝液只要可維持酸性條件，則無特別限制，例如可列舉：檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、 乙酸緩衝液、甘胺酸-鹽酸緩衝液、MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，2-(N-啉基)乙磺酸)-HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸)緩衝液、Tris緩衝液、或硼酸緩衝液。
[實施例]
例1.各種溶劑中之來那度胺之穩定性
作為樣品，將甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯中之0.5mg/mL之來那度胺之外消旋體(Selleck Chemicals(美))於室溫或50℃下保溫24小時，利用以下之HPLC條件，對來那度胺之對映體進行定量，而對各種溶劑中之來那度胺之穩定性進行評估。
HPLC條件
裝置：Nano Space SI-2系列(資生堂)
管柱：Chiralpak IA(4.6×250cm，5μm，Daicel股份有限公司)，RT
移動相：EtOH(100%)
流速：1.0mL/min
注入體積：5μL
檢測：230nm之UV
將保溫前後之對映體之波峰面積示於圖1(將最初觀察到之峰值設為對映體1，將繼而觀察到之峰值設為對映體2)。於甲醇及乙醇中，來那度胺極不穩定，而於乙腈或乙酸乙酯中未觀察到分解。又，來那度胺於異丙醇中亦穩定。若考慮該等結果，則認為來那度胺之分解係由進攻羰基之α碳原子之醇之弱鹼性所促進。此情況與來那度胺在作為非質子性溶劑之乙腈或乙酸乙酯中表現出穩定性之結果亦不矛盾。
例2.使用各種溶劑之來那度胺之對映體之分離
為了明確來那度胺之對映體之外消旋化速度，極重要的是對來 那度胺之純對映體進行分離、定量。如例1所示，由於醇(尤其是甲醇與乙醇)或水(pH值>7)溶劑中之來那度胺不穩定，故而應當使用穩定性較高之非質子性溶劑作為移動相或樣品溶劑。
基於以下之HPLC條件，對使用如表1所示之各種有機溶劑作為移動相之情形時之來那度胺(LL)及沙立度胺(TD)之對映體之分離進行試驗。樣品係使用溶解於乙腈中之0.5mg/mL之LL(和光純藥工業)及TD(Sigma-Aldrich)。
HPLC條件
裝置：Nano Space SI-2系列(資生堂)
管柱：Chiralpak IC(4.6×250cm，5μm，Daicel股份有限公司)，RT
移動相：如表1所示之溶劑
流速：1.0mL/min
注入體積：5μL
檢測：230nm或254nm之UV
移動相係使用包含乙腈(ACN)、乙酸乙酯(EtOAc)、四氫呋喃(THF)及第三丁基甲基醚(BME)之非質子性溶劑。又，雖然異丙醇(IPA)為二級醇，但如圖1所示般具有優異之穩定性，因此同樣地進行試驗。對映體分離能力係使用由以下之式所規定之分離係數(RS)進行評估。
RS=2×(T2-T1)/(W1+W2)
式中，數字1及數字2分別意指與對映體1及對映體2相關(波峰1係早於波峰2溶出)，T意指保持時間，W意指波峰寬度。將使用各種溶劑作為移動相之情形時之LL對映體之分離度示於表1。
於該等移動相中，LL對映體之分離中最有效者為乙酸乙酯，於使用乙酸乙酯作為移動相之情形時(表1，No.02)獲得最高之分離度(RS=12.51)。圖2示出於使用乙酸乙酯作為移動相之情形時LL對映體良好地分離。進而，於使用混合有一定量之乙酸乙酯之移動相之情形時，表現出優於完全不含或少量含有乙酸乙酯者之分離度(例如，No.3、10、11及17)。根據該等結果，判明作為用於LL對映體分離之層析法之移動相，乙酸乙酯係極為優異之溶劑。
又，乙腈亦表現出良好之分離度(表1，No.01，RS=7.26)。進而，如圖1所示般，乙腈亦表現出優異之穩定性，因此可成為作為用於LL對映體分離之層析法之移動相而言良好之溶劑。
另一方面，關於TD，於使用任一移動相之情形時均未觀察到充 分之分離。
例3.來那度胺之純對映體之製備
基於上述來那度胺之穩定性及對映體分離中之結果，而確立用以製備來那度胺之純對映體之方法。具體而言，依照以下之流程及HPLC條件而製備來那度胺之純對映體。
HPLC條件
裝置：HPD PUMP及LAMBDA1010(Bischoff公司)
管柱：Chiralpak IC(2.0mm i.d.×250cm，5μm，Daicel股份有限公司)，RT
移動相：乙酸乙酯
流速：10mL/min
注入體積：5000μL之乙腈中2.3μL/mL之LL外消旋體
檢測：254nm之UV
如圖3所示，LL對映體完全分離。分取組分並加以乾燥後，由180mg之外消旋體獲得超過80mg之純對映體。將組分溶解於乙腈(1或0.1mg/mL)中，於-25℃下保管。基於圖4(A-2、B-2)所示之層析圖之積分波峰面積，作為來那度胺對映體1(LL1)及來那度胺對映體 1(LL2)而回收之組分1及組分2分別顯示99.02%及99.96%之充分之對映體純度。
例4.根據溶出順序推定關於LL1及LL2之絕對構型
LL1及LL2之絕對構型可藉由將LL1與LL2之溶出順序與可以商業方式獲得之R-沙立度胺及S-沙立度胺(Sigma-Aldrich)進行比較而充分合理地推定。溶出之順序係使用以下所示之HPLC條件進行確認。
HPLC條件
裝置：Nano Space SI-2系列(資生堂)
管柱：Chiralpak IA(4.6mm i.d.×250cm，5μm，Daicel股份有限公司)，RT
移動相：EtOH/H2O(95/5，v/v)中0.1%甲酸
流速：0.75mL/min
注入體積：0.1mg/mL之(S)-TD、(R)-TD，5μL
檢測：230nm之UV
根據圖5亦可明確，S-沙立度胺早於R-沙立度胺溶出。若考慮到於相同之HPLC條件下，LL1早於LL2溶出，則可認為LL1之絕對構型對應於S-對映體，LL2之絕對構型對應於R-對映體(以下，LL1及LL2係規定為S*-LL及R*-LL)。
例5.外消旋化半衰期對pH值之依存性
為了明確來那度胺之外消旋化半衰期及其pH值依存性，而依照以下之流程及HPLC條件進行實驗。
HPLC條件
裝置：Nano Space SI-2系列(資生堂)
管柱：Chiralpak IA(4.6mm i.d.×250cm，5μm，Daicel股份有限公司)，RT
移動相：EtOH/H2O(95/5，v/v)中0.1%甲酸
流速：0.75mL/min
注入：5μL
檢測：230nm之UV
將於各種pH值下之(S*)-LL之變動示於圖6。於pH值為6時之保溫中產生少量(R*)-LL，於7以上之pH值下外消旋化顯著加速。又，於pH值為9及8時，(S*)-LL及(R*)-LL之波峰面積降低，因此可知，於該等pH值條件下產生LL之外消旋化及分解。
將各點之對映體過剩率(EE，[(S-R)/(S+R)×100]，%)描繪於圖7，並且將log10(EE)相對於時間之圖示於圖8。如關於沙立度胺所報告般，認為外消旋化為準一級反應，因此圖8顯示出理想之線性近似。
利用該直線性，基於線性近似式(y=ax+b)計算出EE=50之時間，藉此推算出外消旋化半衰期。純對映體之穩定性顯示出對pH值之極強之依存性，pH值每降低1，該半衰期變長10倍，於pH值為4時無法推定半衰期。另一方面，於pH值為9時觀察到急遽之外消旋化與分解。該結果明確顯示來那度胺之對映體於酸性條件(pH值<4)下穩定。
例6.活體樣品之前處理方法之確立
迄今為止，關於使用HPLC之血液(血清及血漿)或尿中之沙立度胺或來那度胺之測定，有大量報告。關於TD，報告有活體樣品中之對映體之測定，活體內或試管內之外消旋化半衰期正得到明確(Eriksson T et al.,Chirality.,1995,7(1),p.44-52及Knoche B et al.,J.Chromatogr.A.,1994,666,p.235-240)。該等測定全部基於液-液萃取法。將此種先前之方法示於流程(a)。由於非質子性溶劑對於外消旋化或分解而言實質上為惰性，故而可藉由該方法進行測定。然而，由於疏水性之有機溶劑中之沙立度胺或來那度胺之溶解度不高，故而需要使用大量溶劑反覆進行萃取。
因此，基於例5所證實之關於酸性條件下之對映體之穩定性之見解，而確立極為簡單且有效率之來那度胺之前處理方法。將本發明之分析法示於流程(b)。為了使反應停止，且同時將蛋白質沈澱、去除，而使用HClO4作為酸。
將利用流程(b)之方法獲得之層析圖示於圖9。如圖9(b)所示，血清中之來那度胺之對映體可在不受到蛋白質等夾雜成分影響之情況下良好地分離、定量，而亦可應用於活體樣品。
例7.生理條件下之來那度胺之外消旋化
使用所獲得之純對映體，依照以下之流程評估於活體緩衝液條件(pH值為7.4，37℃)下及人類血清(37℃)中之來那度胺之外消旋化速度。
HPLC條件
裝置：Nano Space SI-2系列(資生堂)
管柱：Chiralpak IA(4.6mm i.d.×250cm，5μm)+Security guard C8(3.0mm i.d.×4mm)
溫度：40℃
移動相：EtOH/H2O(95/5，v/v)中0.1%甲酸
流速：0.75mL/min
注入：20μL
檢測：230nm之UV
根據圖10所示之(S*)-LL之層析圖[(a)緩衝液中，(b)血清中0.01mg/mL]亦明確，本發明之方法具有充分之保持、分離與檢測感度(信噪比)。僅來自不含LL之血清之空白樣品(c)於本發明之方法中不含阻礙LL之測定之夾雜物質。圖18(b)之(S*)-LL之波峰面積為圖18(a)之 91%。此情況顯示於血清中來那度胺之前處理中具有充分之回收率。
將S*-LL之保溫中之層析圖之連續變化示於圖11。LL之對映體係於未受到樣品中其他物質妨礙之情況下以對檢測出外消旋化產物而言充分之水準被分離、定量。
以與例5所記載之方法相同之方式算出外消旋化半衰期。藉此，對水性緩衝液中之外消旋化半衰期作如下推定：關於(S*)-LL、(R*)-LL、(S)-TD及(R)-TD，分別為272±1.3、267±1.1、266±10及295±24(分鐘)。根據以上結果明確，於pH值為7.4時，LL對映體於水性緩衝液中具有與TD相同之半衰期。
又，亦同樣地推算人類血清中之半衰期：關於(S*)-LL、(R*)-LL、(S)-TD及(R)-TD，分別為131±4.9、109±2.0、21.8±1.0及32.9±25(分鐘)。將該等結果示於圖12。可知人類血清中之沙立度胺與緩衝液中相比僅為8.2%(S體)及11.1%(R體)之半衰期，沙立度胺之外消旋化於血清中被極度地促進。認為於該對映體中觀察到之外消旋化之促進係由活體分子、例如血清中之人類白蛋白等蛋白質所引起。
關於血清中之LL，獲得如下結果：(S*)-LL具有較(S)-TD長6倍之外消旋化半衰期，(R*)-LL具有較(R)-TD長3倍之外消旋化半衰期。該等結果明確顯示LL對映體、尤其是(S*)-LL與沙立度胺相比極為穩定。再者，與TD之情形對照的是，(S*)-LL較(R*)-LL更穩定。亦應注意此種S-對映體及R-對映體之半衰期之差異。

Claims (12)

  1. 一種用以對含有來那度胺之對映體之活體樣品進行前處理之方法，其特徵在於：包含藉由於酸性條件下進行活體樣品之去蛋白質，以抑制來那度胺之對映體之外消旋化之步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中上述酸性條件為pH值5以下。
  3. 如請求項1之方法，其係添加選自過氯酸、三氯乙酸、三氟乙酸、偏磷酸、鹽酸、琥珀酸、及順丁烯二酸中之酸。
  4. 如請求項1之方法，其中上述活體樣品為血液、血清、血漿、尿、唾液、母乳、腦脊髓液、精液、組織、或微粒體。
  5. 如請求項1之方法，其中上述來那度胺之對映體為S體。
  6. 如請求項1之方法，其中上述來那度胺之對映體為R體。
  7. 一種用以對活體樣品中之來那度胺之對映體進行定量之方法，其特徵在於：藉由高效液相層析法對藉由如請求項1至6中任一項之方法進行前處理之含有來那度胺之對映體之活體樣品進行分離分析。
  8. 一種用以保存來那度胺之對映體之方法，其特徵在於：包含藉由於水性緩衝液中於酸性條件下維持來那度胺之對映體，以抑制來那度胺之對映體之外消旋化之步驟。
  9. 如請求項8之方法，其中上述酸性條件為pH值5以下。
  10. 如請求項8之方法，其中上述水性緩衝液為檸檬酸緩衝液。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中上述來那度胺之對映體為S體。
  12. 如請求項8至10中任一項之方法，其中上述來那度胺之對映體為R體。
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