TWI671070B - 用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑之具有黃酮醇骨架之化合物或其藥學上容許之鹽的用途 - Google Patents

Abstract

本發明係提供新穎的與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑。含有下述一般式(A)所示之化合物作為有效成分之人類凝乳酶阻礙劑，係對人類凝乳酶顯示出選擇性且優異的酵素活性阻礙作用。即便是在該化合物之中，係以從槲皮苷(quercitrin)、異槲皮苷(isoquercitrin)、金絲桃苷(hyperoside)、山奈酚(kaempferol)及木犀草素(luteolin)所組成之群組中選出之1種以上者為佳。含有該人類凝乳酶阻礙劑之藥劑，係藉由抑制人類凝乳酶的活性而有用於作為與人類凝乳酶的活性相關之各種疾病之預防及治療中所使用之醫藥。

(一般式(A)中，R¹~R⁵各自獨立地表示羥基或甲氧基，X¹表示羥基或-OG基。另外，G表示糖鏈)。

Description

用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑之具有黃酮醇骨架之化合物或其藥學上容許之鹽的用途

本發明係關於人類凝乳酶阻礙劑及與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑、以及其應用。

腎素-血管收縮素系統係保持全身血壓、體液量等之恆常性的內分泌機構之一。在腎素-血管收縮素系統中，藉由腎素而由血管緊縮素原產生血管收縮素I，再由血管收縮素I轉換成血管收縮素II。此轉換係在循環血中由血管收縮素轉換酵素(ACE)所引起。

已知血管收縮素II係由於其強烈的血管收縮作用而成為高血壓性疾病中之主要成因因子。此外，血管收縮素II係作為增殖因子促進纖維芽細胞之增殖等，特別是在心血管系統疾病中，牽涉心肌細胞之肥大、平滑肌細胞之遊走/增殖、纖維芽細胞之細胞內基質產生刺激、細胞凋亡誘導等廣泛的細胞機能之調節，在纖維化或腎硬化、動脈硬化斑塊之形成中亦扮演重要的角色。

如此，血管收縮素II係腎素-血管收縮素系統之最終活性胜肽，藉由抑制血管收縮素II之產生，便可期待預防或治療高血壓等起因於血管收縮素II之疾病。

作為產生血管收縮素II之路徑，係已知藉由血管收縮素轉換酵素(ACE)而由血管收縮素I產生血管收縮素II之路徑。於是，阻礙血管收縮素轉換酵素的活性之ACE阻礙劑係作為起因於血管收縮素II之疾病之預防治療藥，其有效性在臨床中已然明確。然而，亦已知在ACE阻礙劑中，具有乾咳等副作用，此外，雖然ACE阻礙劑被認為有用於高血壓症之預防或治療，但卻存在有即便投予ACE阻礙劑亦未認定出有效的降壓作用之高血壓症(例如，鹽分過剩攝取所引起之高血壓症)。

另一方面，人類凝乳酶(以下，有時記載為「凝乳酶」)係ACE以外具有產生血管收縮素II的能力之酵素，在人類組織局部的血管收縮素II之產生中，係作為不依存於ACE之「非ACE依存性路徑」而受到注目。

本案發明者等人從人類心臟將由血管收縮素I產生血管收縮素II之酵素進行單離萃取，由該酵素的化學構造及基因選殖，闡明人類凝乳酶係負責血管收縮素II之產生(非專利文獻1~3)。此外，人類凝乳酶係被認為在組織結合型肥胖細胞中產生並保存於分泌顆粒中，由分泌顆粒分泌後在組織局部具生理機能。一般認為在血管壁中，正常時，人類凝乳酶在外膜中較多，在內膜中反而 ACE係局部存在，但若一旦血管承受障礙，則凝乳酶係牽涉外膜的再構築及新生內膜增殖(非專利文獻4)。已有報告指出此凝乳酶所引起之非ACE依存性血管收縮素II產生路徑，相較於其他動物種而言，在人類中係貢獻較高，亦有在人類心臟中之血管收縮素II之生成係凝乳酶負責約80%之報告(非專利文獻5)。

人類凝乳酶係主要存在於人類的心臟、皮膚、血管壁、腸管等組織肥胖細胞分泌顆粒內之胰凝乳蛋白酶樣酵素，若此等組織發生障礙，則由分泌顆粒進行分泌並放出至細胞外，將組織中血管收縮素I轉換成血管收縮素II(非專利文獻3、6)。

已知血管收縮素II係與心血管的肥大或再構築深度相關，暗示人類凝乳酶係經由血管收縮素II之產生而與心臟/血管病變深度相關。因此，阻礙人類凝乳酶的活性之人類凝乳酶阻礙劑可藉由阻礙人體組織中之血管收縮素II的局部產生，而預防或治療起因於血管收縮素II之疾病，特別是利用為各種心臟疾病/血管疾病/腎疾病之治療劑。

另外，雖然人類凝乳酶係因其表現組織而使附著糖鏈量有所不同，但就絲胺酸酵素而言之基質特異性則不論其表現組織的差異皆一致。舉例而言，由心臟萃取之人類凝乳酶(參照非專利文獻1)、與由皮膚或肺萃取之人類凝乳酶(參照非專利文獻7、8)係在酵素學上具有一致的性質。即，以大致相同的速度由血管收縮素I產 生血管收縮素II，等電點或最適pH亦相同。

迄今為止，已報告有數種人類凝乳酶阻礙劑。作為具有阻礙人類凝乳酶的活性之作用的物質，已報告有三衍生物(專利文獻1)、經取代之胺基嘧啶基乙醯胺衍生物(專利文獻2)、苯并咪唑衍生物(專利文獻3)等。

此外，本發明者等人報告指出，凝乳酶阻礙劑係有用於伴隨糖耐受能力異常(專利文獻4)或血管機能異常之疾病(專利文獻5)之預防或治療，藉由併用凝乳酶阻礙劑與ACE阻礙劑，係有用於心臟病等循環器官系統疾病(專利文獻6)之預防或治療。由於凝乳酶阻礙劑係藉由某些刺激而抑制由各組織肥胖細胞放出之凝乳酶所引起之血管收縮素II產生，因而亦具有即便藉由經口投予，亦有效於組織病變及全身血液循環機能障礙(例如，高血壓)兩者之預防/改善之優點。

再者，本發明者等人報告指出，藉由凝乳酶活性阻礙，即便是對於利用血管收縮素轉換酵素(ACE)的活性抑制並未認定有降壓效果的鹽分過剩攝取所引起之高血壓症，亦可認定有降壓作用(非專利文獻5)。另外，鹽分過剩攝取所引起之高血壓症容易成為藥劑抵抗性的高血壓症。因此，已知對於鹽分過剩攝取所引起之高血壓症，利用習知的高血壓症之預防治療劑(例如，ACE阻礙劑)，大多幾乎未認定有血壓降下作用，或者血壓降下作用不充分。

此外，已暗示凝乳酶阻礙劑有用於作為對上述與血管收縮素II產生相關之疾病以外的與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑。舉例而言，由於異位性皮膚炎、乾癬、蕁麻疹等皮膚疾病係與人類凝乳酶的活性相關疾病，因而暗示凝乳酶阻礙劑係藉由抑制人類凝乳酶的活性，而可能成為有用的異位性皮膚炎治療藥(參照非專利文獻9、非專利文獻10)。

〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕

〔專利文獻1〕日本專利特開平8-208654號公報

〔專利文獻2〕日本專利特開2003-104984號公報

〔專利文獻3〕日本專利特開2001-199983號公報

〔專利文獻4〕國際公開第2005/018672號小冊

〔專利文獻5〕國際公開第2001/032214號小冊

〔專利文獻6〕國際公開第2003/018061號小冊

〔非專利文獻〕

〔非專利文獻1〕Urata H et al., The Journal of Biological Chemistry. 1990; 265: 222348-22357

〔非專利文獻2〕Urata H et al., The Journal of Biological Chemistry. 1991; 266: 17173-17179

〔非專利文獻3〕Urata H et al., The Journal of Clinical Investigation. 1993; 91: 1269-1281

〔非專利文獻4〕Uehara Y et al., Hypertension. 2000; 35: 55-60

〔非專利文獻5〕Urata H et al., Circulation Reaserch. 1990; 66: 883-890

〔非專利文獻6〕Urata H et al., Journal of Hypertension. 1994; 12: S17-22

〔非專利文獻7〕Reilly CF et al., J Biol Chem. 1982; 257: 8619-8622

〔非專利文獻8〕Wintroub BU et al., J Clin Invest. 1986; 77: 196-201

〔非專利文獻9〕Tani K et al., Journal of Leukocyte Biology, 2000, 67, 585-589

〔非專利文獻10〕Tomimori Y et al., Biochemical Pharmacology, 2002, 64, 1187-1193

另一方面，實際狀況為迄今為止所報告之作為凝乳酶阻礙劑的有效成分之化合物，對人類凝乳酶之活性阻礙作用並不充分，或者大多亦取得困難。此外，實際狀況為在針對起因於凝乳酶阻礙劑中所包含之具有人類凝乳酶的活性阻礙作用之成分對上述與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防或治療作用，迄今為止利用動物實驗數據或人類臨床數據之實證尚稱不上充分之情形下，針對該成分 實際上是否對該疾病具有預防治療作用之驗證並不充分。

此種狀況下，本發明之目的係提供用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑之特定化合物的用途。

本發明者為了解決上述課題而反覆深入研究之結果，發現迄今為止尚未針對人類凝乳酶的活性阻礙作用提出報告之具有特定骨架之化合物，該化合物顯現出對人類凝乳酶的活性具有優異的阻礙作用，遂完成以下發明。

此外，本發明之其他態樣係涉及以下發明。

<1>一種下述一般式(A)所示之化合物或其藥學上容許之鹽的用途，係用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑；

(一般式(A)中，R¹~R⁵各自獨立地表示氫原子、羥基或甲氧基，X¹表示氫原子、羥基或-OG基，G表示糖鏈)。

<2>如<1>所記載之用途，其中，在一般式(A) 所示之化合物中，X¹為羥基、鼠李糖殘基、葡萄糖殘基、或半乳糖殘基。

<3>如<1>或<2>所記載之用途，其中，一般式(A)所示之化合物係從槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷、山奈酚及木犀草素所組成之群組中選出之1種以上。

<4>如<1>至<3>中任一項所記載之用途，其中，一般式(A)所示之化合物係從槲皮素配醣體及槲皮素衍生物中選出之至少1種。

<5>如<1>至<4>所記載之用途，其中，一般式(A)所示之化合物為金絲桃苷。

<6>如<1>至<5>中任一項所記載之用途，其中，前述與人類凝乳酶的活性相關疾病為與血管收縮素II產生相關之疾病。

<7>如<6>所記載之用途，其中，前述與血管收縮素II產生相關之疾病為高血壓症及/或起因於高血壓症之疾病。

<8>如<7>所記載之用途，其中，前述高血壓症為鹽分過剩攝取所引起之高血壓症。

<9>如<7>或<8>所記載之用途，其係至少含有金絲桃苷且以對人類經口投予金絲桃苷0.1mg/kg體重/日以上之方式使用，以作為一般式(A)所示之化合物。

<10>如<1>至<5>中任一項所記載之用途，其中，前述與人類凝乳酶的活性相關疾病為與血管收縮素II產生不相關之疾病。

<11>如<10>所記載之用途，其中，前述與血管收縮素II產生不相關之疾病為異位性皮膚炎、乾癬及蕁麻疹、以及從該等的任意組合所組成之群組中選出之皮膚疾病。

<12>如<11>所記載之用途，其中，前述皮膚疾病為異位性皮膚炎。

此外，本發明係涉及以下人類凝乳酶阻礙劑、及包含該人類凝乳酶阻礙劑之與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑之發明。

<1a>一種人類凝乳酶阻礙劑，其係含有下述一般式(A)所示之化合物作為有效成分；

(一般式(A)中，R¹~R⁵各自獨立地表示氫原子、羥基或甲氧基，X¹表示氫原子、羥基或-OG基，G表示糖鏈)。

<2a>一種與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑，其係含有<1a>所記載之人類凝乳酶阻礙劑。

<3a>如<2a>所記載之藥劑，其中，前述與人類凝乳酶的活性相關疾病為與血管收縮素II產生相關之疾病。

<4a>如<3a>所記載之藥劑，其中，前述與血管收縮素II產生相關之疾病為高血壓症及/或起因於高血壓症之疾病。

<5a>如<4a>所記載之藥劑，其中，前述高血壓症為鹽分過剩攝取所引起之高血壓症。

<6a>如<4a>或<5a>所記載之藥劑，其係至少含有金絲桃苷且以對人類經口投予金絲桃苷0.1mg/kg體重/日以上之方式使用，以作為一般式(A)所示之化合物。

<7a>如<2a>所記載之藥劑，其中，前述與人類凝乳酶的活性相關疾病為與血管收縮素II產生不相關之疾病。

<8a>如<7a>所記載之藥劑，其中，前述與血管收縮素II產生不相關之疾病為異位性皮膚炎、乾癬及蕁麻疹、以及從該等的任意組合所組成之群組中選出之皮膚疾病。

根據本發明，可提供與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑，其係起因於以有效成分之形式含有之化合物，而對人類凝乳酶顯示出優異的酵素活性阻礙作用。因此，藉由使用該預防治療用藥劑，係有用於與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防及治療。

圖1係相對於食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)的收縮期血壓(SBP)之金絲桃苷的用量依存性之評估結果(8週)。

圖2係相對於食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)的擴張期血壓(DBP)之金絲桃苷的用量依存性之評估結果(8週)。

圖3係相對於食鹽依存性高血壓小鼠的心跳數之金絲桃苷的用量依存性之評估結果(8週)。

圖4係相對於食鹽依存性高血壓小鼠的收縮期血壓(SBP)之水蓼乾燥物的用量依存性之評估結果(8週)。

圖5係相對於食鹽依存性高血壓小鼠的擴張期血壓(DBP)之水蓼乾燥物的用量依存性之評估結果(8週)。

圖6係相對於食鹽依存性高血壓小鼠的心跳數之水蓼乾燥物的用量依存性之評估結果(8週)。

圖7係相對於人類的收縮期血壓(SBP)之水蓼乾燥物的用量依存性之評估結果。

圖8係相對於人類的擴張期血壓(DBP)之水蓼乾燥物的用量依存性之評估結果。

圖9係相對於人類的心跳數之水蓼乾燥物的用量依存性之評估結果。

圖10係針對異位性皮膚炎的自覺症狀之關於皮膚狀 態的問卷調查(皮膚醫學生活品質指數(DLQI：Dermatology Life Quality Index))之樣本。

圖11係水蓼乾燥物的服用前後之關於皮膚狀態的問卷調查(DLQI)之評估結果。

圖12係水蓼乾燥物的服用前後之嗜酸性球數(eosinophil number)之評估結果。

以下係針對本發明顯示例示物等而進行詳細說明，但本發明並不限定於以下例示物等，在不脫離本發明之要旨之範圍內可任意地進行變更並實施。

<1.與人類凝乳酶的活性相關疾病>

在本說明書中，「與人類凝乳酶的活性相關疾病」係意味因人類凝乳酶的酵素活性增加，而使症狀表現、增惡、進展之疾病。

與人類凝乳酶的活性相關疾病係大致區分成與血管收縮素II產生相關之疾病、及與血管收縮素II產生不相關之疾病。

與血管收縮素II產生相關之疾病係意味因血管收縮素II產生，而使症狀表現、增惡、進展之疾病。具體而言，可列舉高血壓症、起因於高血壓症之疾病、起因於耐糖能力異常之疾病等。

在本說明書中，「高血壓症」係包含起因於 鹽分的過剩攝取、運動不足、抽煙、飲酒、壓力的蓄積等之高血壓症的發病者以及其將有可能患病者(相對於健康者而言為輕度高血壓者)。此外，作為起因於高血壓症之疾病，具體而言，可列舉高血壓性動脈硬化性疾病、高血壓性循環器官系統疾病。

作為高血壓性動脈硬化性疾病，可列舉以向血管的脂質沉積為成因而引發血管機能異常從而發病之疾病、因血管的脂質沉積引發血管機能異常而使症狀惡化之疾病、因血管的脂質沉積引發血管機能異常而使治癒延遲之疾病等為例。具體而言，可列舉例如在不安定狹心症或急性心肌梗塞等心臟急性冠動脈症候群、經皮性冠動脈形成術後之再狹窄、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓血管炎、粥狀性腦動脈硬化症、腦梗塞、間歇性破行、下肢的壞疽、腎血管性高血壓症、腎動脈瘤、腎梗塞中與血管的脂質沉積相關而引發血管機能異常之情況。

作為高血壓性循環器官系統疾病，係包含所有高血壓性臟器障礙。具體而言，可列舉冠動脈疾病、心臟機能不全、動脈硬化性瓣膜症等心臟病；腦血管性病變等腦疾病；上肢/下肢閉塞性動脈硬化症、包含高血壓性腎症及高血壓性糖尿病性腎症之慢性腎臟疾病等全身血管的動脈硬化症疾病為例。

此外，作為屬於與血管收縮素II產生相關之疾病的起因於耐糖能力異常之疾病，可列舉糖尿病及/或糖尿病併發症。在糖尿病併發症中，包含糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢神經障礙、高胰島素血症、胰島素抵抗性症候群、動脈硬化症、心臟急性冠動脈症候群、閉塞性動脈硬化症、血管炎、腦梗塞、高血壓症、腎臟機能不全、腎症、腎動脈瘤、腎梗塞、或肥胖症等。

作為與人類凝乳酶的活性相關疾病中之與血 管收縮素II產生不相關之疾病，可列舉異位性皮膚炎、乾癬、蕁麻疹等皮膚疾病；脂肪肝、肝硬化及肺纖維症等纖維症關連臟器障礙；克隆氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性大腸炎等消化器官系統疾病；等。另外，即便是在與人類凝乳酶的活性相關疾病之中，異位性皮膚炎、乾癬、色素沉積性蕁麻疹等皮膚疾病係人類凝乳酶的酵素活性增加之關連性較高。

<2.用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑之一般式(A)所示之化合物的用途>

本發明係關於用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑之一般式(A)所示之化合物或其藥學上容許之鹽的用途(以下，記載為「本發明之用途」)。

(一般式(A)中，R¹~R⁵各自獨立地表示氫原子、羥基或甲氧基，X¹表示氫原子、羥基或-OG基，G表示糖鏈)。

在本發明之用途中，係使用一般式(A)所示之化合物或其藥學上容許之鹽來用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑(以下，有時記載為「本發明之預防治療用藥劑」或「本發明之藥劑」)。另外，在本說明書中，「預防治療用藥劑」係意味對於作為對象的疾病之預防、治療、症狀的改善之至少一者而言有用的藥劑。此外，在本說明書中，「藥劑」係指不僅包含醫藥品，亦包含醫藥部外品。

針對一般式(A)所示之化合物，亦包含其適宜的態樣，係後述於<3.一般式(A)所示之化合物及包含該化合物之人類凝乳酶阻礙劑>。另外，一般式(A)所示之化合物係具有黃酮醇骨架或黃酮醇類似骨架，就由類似的官能基進行取代之方面而言係共通者。此外，在本說明書中，以下有時將一般式(A)所示之化合物記載為「化合物(A)」。

涉及本發明之化合物(A)係具有阻礙人類凝乳酶的活性之作用。因此，化合物(A)可用作人類凝乳酶阻礙劑的有效成分。以下，有時將含有化合物(A)作為有效成分之人類凝乳酶阻礙劑記載為「本發明之人類凝乳酶阻礙劑」或「本發明之凝乳酶阻礙劑」。

於是，本發明之預防治療用藥劑係藉由含有 化合物(A)作為本發明之凝乳酶阻礙劑，而具有與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療作用。即，本發明之預防治療用藥劑只要包含作為實質的有效成分之化合物(A)即可。因此，亦可將本發明之凝乳酶阻礙劑本身使用作為與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療劑，在此情況，本發明之凝乳酶阻礙劑、與本發明之預防治療用藥劑並非實質上相異。

由於包含化合物(A)之本發明之預防治療用藥劑(包含本發明之凝乳酶阻礙劑)可阻礙人類凝乳酶的活性，因而藉由將其投予至人類，便可預防治療與人類凝乳酶的活性相關疾病。

針對本發明之人類凝乳酶阻礙劑及本發明之預防治療用藥劑的詳情，包含其態樣或使用方法等，係後述於<3.一般式(A)所示之化合物及包含該化合物之人類凝乳酶阻礙劑>。

<3.一般式(A)所示之化合物及包含該化合物之人類凝乳酶阻礙劑>

本發明之人類凝乳酶阻礙劑係含有上述一般式(A)所示之化合物或該化合物之藥理學上容許之鹽作為有效成分。

一般式(A)中之R¹~R⁵各自獨立地表示氫原子、羥基或甲氧基，X¹表示氫原子、羥基或-OG基。此處，G為糖鏈，詳情後述。

上述一般式(A)中，並無構成R¹~R⁵之羥基或甲氧基的數目限制，但較適宜係羥基為3以上，更適宜係羥基為4以上。

上述一般式(A)中，X¹為氫原子、羥基或-OG基。在X¹為-OG基之情況，糖鏈係經由氧原子而進行糖苷鍵結。

對於該糖鏈的構造及構成該糖鏈之糖的種類並無特別限定。對於構成糖鏈之糖的數目並無特別限定，但通常為1~4，較佳為1或2。另外，在糖鏈的數目為1之情況，係所謂的單糖殘基。構成糖鏈之糖可為五碳糖，亦可為六碳糖。

上述糖鏈中所包含之羥基亦可由其他基進行修飾。舉例而言，上述羥基可如後述般予以酯化，亦可予以烷氧基化。

作為構成上述糖鏈之糖，具體而言，可列舉核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄醣醛酸、芸香糖(rutinose)、槐糖(sophorose)、龍膽二糖(gentiobiose)、接骨木二糖(sambubiose)、香豌豆糖(lathyrose)、昆布二糖(laminaribiose)、龍膽三糖(gentiotriose)、刺槐二糖(robinobiose)等。

上述糖亦可為有機酸單獨或複數酯化鍵結而成之糖(有機酸鍵結糖)。對於該有機酸的鍵結位置並無特別限定。作為該有機酸的鍵結位置，具體而言，可列舉 例如糖的2位、3位、及6位中之1者或2者以上。對於上述有機酸的種類及構成並無特別限定。上述有機酸可為芳香族有機酸，亦可為脂肪族有機酸。

就人類凝乳酶阻礙活性優異之方面而言，較佳係一般式(A)中，X¹為氫原子、羥基、鼠李糖殘基、葡萄糖殘基或半乳糖殘基。在此情況，並無構成R¹~R⁵之氫原子、羥基或甲氧基的數目限制，但較佳係羥基為3以上。

在本發明之凝乳酶阻礙劑中，作為一般式(A)所示之化合物(化合物(A))，較佳係含有將化學式示於以下之槲皮素(quercetin)、槲皮素配醣體、槲皮素衍生物中之任一者作為有效成分，特佳為體內吸收性佳的槲皮素配醣體或槲皮素衍生物。作為槲皮素配醣體、槲皮素衍生物，可列舉槲皮苷(quercitrin)、異槲皮苷(isoquercitrin)及金絲桃苷(hyperoside)等。

此外，在本發明之凝乳酶阻礙劑中，作為上述槲皮素、槲皮素配醣體、槲皮素衍生物以外的化合物(A)，可列舉例如高良薑素(galangin)、山奈酚(kaempferol)、楊梅素(myricetin)、木犀草素(luteolin)。

作為本發明之凝乳酶阻礙劑的有效成分之化合物(A)係具有阻礙人類凝乳酶的活性之作用。另外， 評估方法只要可判斷有無人類凝乳酶的酵素活性之阻礙作用，則為任意者。將人類凝乳酶的活性之阻礙作用的評估方法之適宜的一例後述於實施例。

在本發明之凝乳酶阻礙劑中，可單獨含有化合物(A)，亦可含有2種以上。即便是在化合物(A)之中，係以含有從具有優異的凝乳酶阻礙活性之槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷、山奈酚及木犀草素所組成之群組中選出之1種以上者作為有效成分為佳。

此外，由於槲皮苷、異槲皮苷及金絲桃苷係凝乳酶活性阻礙作用優異，同時在X¹具有具糖鏈之官能基，因而可期待高生體吸收性。因此，本發明之凝乳酶阻礙劑較佳係至少含有槲皮苷、異槲皮苷及金絲桃苷中之任一者。

特定而言，由於金絲桃苷係凝乳酶活性阻礙作用特別優異，且具有高生體吸收性，本發明之凝乳酶阻礙劑較佳係含有金絲桃苷。

化合物(A)可為人工合成者，亦可為來自天然物者。在以天然物作為原料之情況，可將由原料動植物藉由公知的萃取方法獲得之萃取物依原樣使用，亦可進一步施行分離精製。

作為含有適宜作為化合物(A)的化合物之一的槲皮素之天然物，可列舉例如柑橘類、洋蔥、蕎麥、蘋果、綠茶、青花菜、長蒴黃麻、水蓼等。此外，作為大量包含同樣適宜的化合物之一的槲皮苷之天然物，可列舉魚 腥草、銀杏、水蓼等。此外，作為大量包含同樣適宜的化合物之一的異槲皮苷之天然物，可列舉芒果、蒲公英、水蓼等。此外，作為大量包含金絲桃苷(槲皮素-3-O-半乳糖苷)之天然物，可列舉茅膏菜、金絲桃、喜樹、水蓼等。作為此等原料植物中可使用之部位並無特別限制，可列舉例如地上部、根部、果實等。此等原料植物可含有1種或2種以上化合物(A)作為材料，並以未加工原樣、或乾燥物、萃取物之形式使用。

在本說明書中，「乾燥物」係指將原料植物乾燥而成者。具體而言，將原料植物利用公知的乾燥方法乾燥而成者。從使用性的觀點而言，乾燥物通常係予以粉碎而粉末化，以乾燥粉碎物之形式使用。粉碎方法並無特別限定，只要使用以往公知的粉碎器即可。粉末的粒徑係依其用途態樣而適宜決定。

在本說明書中，「萃取物」係指總括了將作為萃取對象的原料植物依未加工原樣、或視需要將其乾燥、細切而成者進行溶媒萃取，而提高有效成分的含有率之形態者的概念。

此外，此等化合物亦可以藥理學上容許之鹽之形式含有，作為該鹽之形態，並無特別限制，但可列舉例如鹼金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等)、鹼土族金屬鹽(鈣鹽、鎂鹽等)、無機鹽(醋酸鹽、銨鹽等)、有機胺鹽(二苄基胺鹽、葡萄糖胺鹽、乙二胺鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、二乙醇胺鹽、四甲基銨鹽 等)、胺基酸鹽(甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、天冬醯胺鹽等)等。

由於本發明之凝乳酶阻礙劑可阻礙人類凝乳酶的活性，因而可預防治療與人類凝乳酶的活性相關疾病。由於人類凝乳酶係獨立於ACE地由血管收縮素I產生血管收縮素II之酵素，因而含有能夠阻礙人類凝乳酶的活性之本發明之凝乳酶阻礙劑之藥劑可使用作為所謂的「非ACE依存性血管收縮素II產生抑制劑」，其係起因於人類凝乳酶活性阻礙而抑制血管收縮素II產生，可使用作為預防治療起因於血管收縮素II產生之疾病之預防治療用藥劑。

此外，在與人類凝乳酶的活性相關疾病中，亦包含起因於血管收縮素II之疾病以外的疾病，含有本發明之凝乳酶阻礙劑之藥劑亦可使用作為該起因於血管收縮素II之疾病以外的疾病之預防治療用藥劑。

針對具體的與人類凝乳酶的活性相關疾病的種類，係如上述<1.與人類凝乳酶的活性相關疾病>所說明。

另外，在人類以外亦存在具有凝乳酶之動物。舉例而言，在小鼠中已報告有數種凝乳酶。其中，小鼠肥胖細胞蛋白酶(mouse mast cell protease，MMCP)4係與人類凝乳酶同樣地具有血管收縮素II產生能力，且不具血管收縮素II分解能力的凝乳酶(Science.1996；271：502-505)。即，MMCP4係血管收縮素II產生絲胺酸酵素。因此，可使用小鼠施行與人類凝乳酶的活性相關疾 病之模式實驗。

另一方面，在使用於許多以高血壓為對象之動物實驗之大鼠中並不存在與人類凝乳酶具相同性質的凝乳酶，對於與人類凝乳酶的活性相關疾病之模式實驗並不合適。前述所言係指由於大鼠凝乳酶相較於產生血管收縮素II而言更迅速地分解血管收縮素I或II之緣故(The Journal of investigative dermatology.1984；83：336-339)。

(凝乳酶阻礙劑之形態)

本發明之凝乳酶阻礙劑係可將其有效量連同藥學上容許之載體進行調配，以固形製劑或液狀製劑之形式經口或非經口投予。劑型若為通常使用於經口投予或非經口投予者，則任何劑型皆可。

作為利用於經口投予或非經口投予之劑型，具體而言，作為固形製劑，可列舉粉末劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑、口含錠等。此外，作為液狀製劑，可例示內用液劑、外用液劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、注射液、輸液等，此等劑型或其他劑型係視目的而適宜選擇。

在固形製劑中，作為主劑的本發明之凝乳酶阻礙劑中，亦可使用賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、安定化劑等輔助劑。主劑與輔助劑之比率係視目的而適宜選擇。

作為固形製劑中之賦形劑的適宜例，可列舉例如乳糖、D-甘露糖醇、澱粉等。作為結合劑的適宜例，可列舉 例如結晶纖維素、白糖、D-甘露糖醇、糊精、羥丙基纖維素等。作為崩解劑的適宜例，可列舉例如澱粉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣等。此外，亦可視需要使用防腐劑、增黏安定劑、著色劑、甘味劑等製劑添加物。

此外，在以液狀製劑之形式使用之情況，作為溶媒，係選擇具有作為有效成分的上述化合物之分散性，且具生體安全性者。作為溶媒的適宜例，可列舉例如注射用水、乙醇、丙二醇等。

此外，液狀製劑亦可連同作為主劑的本發明之凝乳酶阻礙劑，包含溶解輔助劑、懸浮化劑、等張化劑、緩衝劑、增黏安定劑等輔助成分。

作為溶解輔助劑的適宜例，可列舉乙醇、聚乙二醇、丙二醇、安息香酸苄酯、碳酸鈉、檸檬酸鈉等。作為懸浮化劑的適宜例，可列舉月桂基硫酸鈉、月桂基胺基丙酸、卵磷脂、氯化苯二甲烴銨(benzalkonium chloride)、氯化苯銨松寧(benzethonium chloride)、單硬脂酸甘油酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羥甲基纖維素等。作為緩衝劑的適宜例，可列舉磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽等之緩衝液。作為增黏安定劑的適宜例，可列舉亞硫酸鹽、抗壞血酸鹽等。

此外，在本發明之凝乳酶阻礙劑中，在不會抑制其活性阻礙作用之範圍內，亦可含有公知的任意成分。舉例而言，可加入安定劑、濕潤劑、或乳化劑，或者以滲透壓調製劑或pH調製劑之形式適宜使用鹽作為輔助 藥。

上述固形製劑或液狀製劑之製法可應用一般的醫藥品或醫藥部外品之製法。

本發明之凝乳酶阻礙劑只要依與人類凝乳酶的活性相關疾病的種類或症狀之程度而適宜選擇劑型、投予量、投予方法即可。

另外，本發明之凝乳酶阻礙劑中之上述化合物(A)的含量係斟酌對於作為對象的疾病之預防、治療或症狀的改善所必要的活性阻礙作用或投予方法等，而在可攝取必要量之範圍內適宜決定。此外，本發明之凝乳酶阻礙劑的投予方法為任意者，亦可包含經口投予、非經口投予的選擇，視作為對象的疾病而適宜決定。

此外，在作為本發明之凝乳酶阻礙劑的有效成分之化合物(A)中亦包含缺乏生體吸收性之化合物。舉例而言，槲皮素雖然具水溶性，但生體吸收性並不高。在缺乏生體吸收性之化合物(A)中，由於無法期待基於凝乳酶阻礙作用之上述藥效，因而為了提高生體吸收性，較佳係服用生體吸收促進劑。生體吸收促進劑可以本發明之藥劑的成分之形式含有，亦可與本發明之藥劑併用而使用生體吸收促進劑。

作為生體吸收促進劑，只要是具有提高化合物(A)的生體吸收性之作用者即可，可列舉例如油脂類或檸檬酸鹽。作為油脂類並無特別限定，但可列舉從棉實油、大豆油、棕櫚油、玉米油、葵花籽油、菜籽油、芝麻油等獲得 之植物性油脂；或從沙丁魚、青花魚等魚類、或牛、豬等畜產類獲得之動物性油脂。作為檸檬酸鹽，可列舉例如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀及檸檬酸鐵。此等生體吸收促進劑可為1種，亦可混合2種以上。

再者，本發明之凝乳酶阻礙劑在各種疾病之治療中，除了前述有效成分以外，亦可視需要含有有效作為其他醫藥之成分。

此外，在欲藉由日常飲食而攝取本發明之凝乳酶阻礙劑之情況，亦可以機能性食品之形式含於該食品、飲料中。此處所謂的「機能性食品」係意味除了一般食品以外，健康食品、營養輔助食品、營養機能食品、營養保健食品等在維持健康之目的下攝取之食品及/或飲料。另外，在以機能性食品之形式製品化之情況，亦可添加用於食品之各式各樣添加劑，具體而言，著色料、保存料、增黏安定劑、抗氧化劑、漂白劑、防菌防黴劑、酸味料、調味料、乳化劑、強化劑、製造用劑、香料等。

(凝乳酶阻礙劑之應用藥劑)

本發明之與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑(以下，有時記載為「本發明之預防治療用藥劑」或「本發明之藥劑」)係含有上述本發明之凝乳酶阻礙劑。

在本說明書中，「預防治療用藥劑」係意味對於作為對象的疾病之預防、治療、症狀的改善之至少一者而言有用的藥劑。此外，在本說明書中，「藥劑」係指 不僅包含醫藥品，亦包含醫藥部外品。

本發明之藥劑在本發明之凝乳酶阻礙劑以外，在不會損及其效能之範圍內，亦可包含其他藥劑或藥理學上容許之任意成分。此外，本發明之藥劑只要包含作為實質的有效成分之化合物(A)即可，亦可使用本發明之凝乳酶阻礙劑作為本發明之藥劑。

如上述，本發明之凝乳酶阻礙劑係包含上述化合物(A)作為有效成分，化合物(A)係具有阻礙人類凝乳酶的活性之作用。因此，本發明之預防治療用藥劑對於與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防、治療、症狀的改善之至少一者而言係有用。另外，作為本發明之預防治療用藥劑之對象的與人類凝乳酶的活性相關疾病係如<1.與人類凝乳酶的活性相關疾病>所上述。

本發明之藥劑中所含有之化合物(A)係阻礙人類凝乳酶的活性。於是，人類凝乳酶係獨立於ACE地由血管收縮素I產生血管收縮素II。因此，本發明之藥劑成為非ACE依存性的血管收縮素II產生抑制劑，抑制血管收縮素II產生，可預防治療與血管收縮素II相關之疾病。另外，作為與血管收縮素II相關之疾病，可列舉高血壓症、起因於高血壓症之疾病、起因於耐糖能力異常之疾病等，其詳情係如<1.與人類凝乳酶的活性相關疾病>所上述。

本發明之藥劑可使用作為具有對於高血壓症，特別是鹽分過剩攝取所引起之高血壓症而言優異的血 壓降下作用之血壓降下劑。另外，在本說明書中之「血壓降下作用」係意味對於高血壓症的發病者以及其將有可能患病者(相對於健康者而言為輕度高血壓者)之血壓降下作用。即，對於高血壓症的發病者以及其將有可能患病者而言係藉由血壓降下作用而回復成接近正常的血壓之作用。

另外，鹽分過剩攝取所引起之高血壓症容易成為藥劑抵抗性的高血壓，若長期持續服用ACE阻礙劑或血管收縮素受體拮抗劑(ARB)等血壓抑制劑，則血壓降下作用大多會減弱。

由於本發明之藥劑並非是抑制利用ACE路徑的血管收縮素II產生，而是以藉由阻礙人類凝乳酶的活性，從而抑制利用起因於人類凝乳酶之非ACE路徑的血管收縮素II產生作為機制，因而即便是鹽分過剩攝取所引起之高血壓症，亦可認定出有效的血壓降下作用。

因此，本發明之藥劑特別適宜作為鹽分過剩攝取所引起之高血壓症、或藉此而發病之起因於高血壓症之疾病之預防治療劑。

另外，將本發明之藥劑用作血壓降下劑時，在可期待相乘的預防/治療效果之情況，亦可與ACE阻礙劑或血管收縮素II受體拮抗劑併用而使用。

雖然本發明之藥劑係藉由凝乳酶活性阻礙作用而成為非ACE依存性血管收縮素II產生抑制劑，但藉由將其與ACE阻礙劑併用而使用，則相較於單獨使用ACE阻礙劑 或凝乳酶阻礙劑而言，係完全地抑制組織局部的血管收縮素II之產生，維持ACE阻礙劑之血管舒緩激肽分解抑制等作用，且藉由抑制中介凝乳酶之各式各樣生理作用，而發揮相乘的治療效果，故為有效果的。

另外一提，作為頻繁用作習知的血壓降下劑之藥劑，有鈣拮抗藥。此藥劑係由於血管擴張性強而大多伴隨反射性頻脈。日本的疫學研究已證明心跳若其絕對數或變動增加，則平均剩餘壽命縮短(例如，田主丸研究或大迫研究)。

從而，若考慮到一般國民的長期預後，則期望開發使心跳數減少之血壓降下劑。現在所使用之血壓降下劑內，作為即便在降壓後心跳數亦不會增加之藥劑，已知有ACE阻礙劑或血管收縮素II受體拮抗藥等，但使心跳數減少之效果尚未受到證明。由於此種背景，係期望開發在充分降壓之同時使心跳數減少之降壓藥。作為唯一伴隨降壓並使心跳數減少之藥劑，既存有β阻斷藥，但實際狀況為副作用涉及多方面(過度徐脈/氣喘誘發/冠攣縮性狹心症誘發/胰島素分泌降低/脂質代謝惡化等)，在實際臨床上的用途有限。

將本發明之藥劑用作血壓降下劑時之投予量，只要在顯示出血壓降下作用之前提下適宜選擇即可，但若列舉典型之例，則可列舉依以化合物(A)為基準計為0.01mg/kg體重/日以上的用量對人類經口投予之方法。

此外，本發明之藥劑係藉由投予化合物(A)的特定量以上，而與血壓降下作用一併地表現出心跳數降低作用。

在本說明書中之「心跳數降低作用」係指使心跳數降低之作用，特定而言，藉由交感神經系統的活性上升而使增加的心跳數降低之作用。

另外，起因於鹽分過剩攝取之高血壓症的發病者以及其將有可能患病者係具有交感神經系統的活性上升而使原本的心跳數增加之傾向，但本發明之藥劑係具有使該增加的心跳數降低之作用。如後述之實施例所示，在臨床實驗之結果，除了藉由本發明之藥劑的經口投予而顯示出顯著的血壓降下作用之外，尚觀察到顯著的心跳數降低作用。若為習知的降壓藥，則伴隨著降壓，心跳數普通會增加或不產生變化，故此「心跳數降低作用」係本發明之藥劑所特異者。

作為本發明之藥劑之對象的高血壓症並無特別限制，但即便是在高血壓症之中，起因於鹽分過剩攝取之高血壓症係本發明之藥劑特別有效的高血壓症之一。起因於鹽分過剩攝取之高血壓症容易成為藥劑抵抗性的高血壓症。因此，對於起因於鹽分過剩攝取之高血壓症，利用習知的高血壓症之預防治療劑(例如，ACE阻礙劑)，大多幾乎未認定有血壓降下作用，或者血壓降下作用不充分。相對於此，本發明之藥劑對於起因於鹽分過剩攝取之高血壓症可認定有顯著的血壓降下作用。此處「顯著的血 壓降下作用」係意味將安慰劑期的血壓與本發明之藥劑之攝取期的血壓進行比較時，顯示出統計上顯著(危險率為P<0.05)低值。

此外，本發明之藥劑不一定需要以血壓降下作用為目的，亦可作為利用特定量的化合物(A)之投予所引起之心跳數降低作用之心跳數降低劑。在此情況，在高血壓症以外，亦可適宜使用於出現心跳數增加的症狀之疾病中之心跳數降低(抑制心跳數增加)的用途。於是，除了化合物(A)以外，亦可併用有效作為用於作為對象的疾病之治療的其他醫藥之成分。

此外，在即便作為對象的疾病為高血壓症之情況中亦可期待相乘的預防/治療效果之情況，亦可與公知的血壓降下劑併用。作為公知的血壓降下劑，可列舉分類成ACE阻礙劑、血管收縮素II受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑、利尿劑(包含噻系利尿劑/環部利尿劑/鉀保持性利尿劑全部)、α阻斷劑、β阻斷劑、α β阻斷劑等之血壓降下劑。

用於與血壓降下作用一併地表現出心跳數降低作用的經口投予量係取決於化合物(A)的種類，對人類而言以金絲桃苷換算重量計為0.1mg/kg體重/日以上，更佳為以金絲桃苷換算重量計為0.12~0.35mg/kg體重/日。

此處，「金絲桃苷換算重量」係意味在金絲桃苷之情況，金絲桃苷本身的重量係相當於該換算重量，而在金絲 桃苷以外的化合物(A)之情況，係由相對於0.5mM之金絲桃苷所引起之人類凝乳酶阻礙率的相對值所算出之換算重量。

此外，如上述，在使用來自天然物之化合物(A)之情況，有時在原料植物中係包含複數種化合物(A)。舉例而言，詳述於實施例，水蓼(Persicaria hydropiper)係以金絲桃苷作為主成分，在金絲桃苷以外，亦少量包含槲皮苷、槲皮素等相當於化合物(A)之成分。在使用此種原料植物作為本發明之藥劑中所包含之化合物(A)之情況，只要轉換成金絲桃苷換算重量而決定投予量即可。

此外，本發明之藥劑可使用作為對於與人類凝乳酶的活性相關疾病中之與血管收縮素II產生不相關之疾病之預防、治療、症狀的改善之至少一者而言有用的藥劑。作為該與血管收縮素II產生不相關之疾病，係如<1.與人類凝乳酶的活性相關疾病>所上述，可列舉異位性皮膚炎、乾癬、專麻疹等皮膚疾病；脂肪肝、肝硬化及肺纖維症等纖維症關連臟器障礙；克隆氏病及潰瘍性大腸炎等消化器官系統疾病；等。

另外，在作為預防治療對象的疾病為此等疾病之情況中之本發明之藥劑的投予量，係不僅考慮到疾病的種類，尚且考慮到對象者的年齡、性別等個別差異而適宜選擇。

本發明之藥劑即便是在上述與血管收縮素II 產生不相關之疾病之中，對於異位性皮膚炎等皮膚疾病之預防、治療、症狀的改善之至少一者而言係特別有用。將本發明之藥劑使用作為皮膚疾病之預防治療用藥劑之情況，若為通常使用於經口投予或非經口投予者，則任何劑型皆可。本發明之藥劑在經口投予中，係有用於異位性皮膚炎之預防、治療、症狀的改善，且對於人體的毒性或刺激性少，副作用小。因此，就本發明之藥劑而言，能夠日常攝取的經口投予用之劑型係屬適宜的形態之一。具體的劑型已於上述(凝乳酶阻礙劑之形態)中記載，故省略說明。

此外，作為非經口投予用之劑型，在以塗佈於皮膚型皮膚外用劑之形式使用之情況，一般而言係呈液狀或乳霜狀之形態。在此情況，醫藥組成物可視需要含有通常調配於醫藥品、醫藥部外品中之油性成分、可溶化劑、保濕劑、色素、乳化劑、增黏劑、香料等任意成分。

此外，作為本發明之藥劑的有效成分之化合物(A)亦可調配成醫藥品、醫藥部外品以外的製品。此種製品並無特別限定，可列舉例如入浴劑、身體皂、洗髮精等入浴用組成物。

本發明之藥劑只要依與人類凝乳酶的活性相關皮膚疾病的種類或症狀之程度而適宜選擇劑型、投予量、投予方法即可。

另外，本發明之凝乳酶阻礙劑中之上述化合物(A)的含量係斟酌對於作為對象的疾病之預防、治療或症狀的 改善所必要的活性阻礙作用或投予方法等，而在可攝取必要量之範圍內適宜決定。此外，本發明之凝乳酶阻礙劑的投予方法為任意者，亦可包含經口投予、非經口投予的選擇，視作為對象的疾病而適宜決定。

此外，如上述，在使用來自天然物之化合物(A)之情況，有時在原料植物中係包含複數種化合物(A)。舉例而言，詳述於實施例，水蓼(Persicaria hydropiper)係以金絲桃苷作為主成分，在金絲桃苷以外，亦少量包含槲皮苷、槲皮素等相當於化合物(A)之成分。在使用此種原料植物作為本發明之藥劑中所包含之化合物(A)之情況，只要轉換成金絲桃苷換算重量而決定投予量即可。

〔實施例〕

以下，藉由實施例更詳細地說明本發明，但本發明在不變更其要旨之前提下，並不限定於以下實施例。

<評估1：凝乳酶活性阻礙作用之評估(in vitro)>

使用於凝乳酶活性阻礙作用之評估的化合物(A)係如下。

「化合物(A)」

．槲皮素(quercetin)(和光純藥工業(股))

．槲皮苷(quercitrin)(SIGMA)

．異槲皮苷(isoquercitrin)(SIGMA)

．金絲桃苷(hyperoside)(和光純藥工業(股))

．高良薑素(galangin)(和光純藥工業(股))

．山奈酚(kaempferol)(和光純藥工業(股))

．楊梅素(myricetin)(和光純藥工業(股))

．木犀草素(luteolin)(Funakoshi(股))

此外，針對作為比較例之以下所示具有黃烷酮骨架及其類似骨架、黃烷醇類似骨架之化合物，亦施行凝乳酶活性阻礙作用之評估。

．聖草素(eriodictyol)(Funakoshi(股))

．(+)-黃杉素((+)-taxifolin)(SIGMA)

．(±)-黃杉素((±)-taxifolin hydrate)(SIGMA)

．兒茶素((+)-catechin)(SIGMA)

．表兒茶素(epicatechin)(和光純藥工業(股))

凝乳酶阻礙活性之評估(in vitro)係以對Eur J Biochem 268(22),5885-93(2001)中所記載之方法加以變更的以下所記述之方法施行。此評估方法係利用了使用對作為人類凝乳酶之基質的血管收縮素I進行Dnp/Nma 修飾而成之基質，凝乳酶將此基質切斷，而產生血管收縮素II；以及進行螢光發色之簡易方法。以下係記述該評估方法之概要。

培養緩衝液為含有100mM NaCl之20mM磷酸緩衝液，總培養溶液量為100μL。首先，以最終濃度成為0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM之方式加入作為測定對象的化合物，調整成於其中包含標準人類凝乳酶(SIGMA)0.0012單位，在室溫施行前培養30分鐘後，以最終濃度成為200μM之方式加入作為基質的Dnp/Nma修飾血管收縮素I(委託蛋白研製成)，在37℃培養30分鐘。加入0.5M NaOH 25μL而終止培養。測定所產生之Dnp血管收縮素II的發光螢光(460nm)，由利用標準Dnp血管收縮素II所製成之標準曲線計算產生量。以未加入阻礙劑之對照組作為對照，求出檢定樣本之人類凝乳酶阻礙活性及阻礙率。

以分別成為表1所示濃度之方式添加作為化合物(A)的槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷、高良薑素、山奈酚、楊梅素及木犀草素，並藉由上述方法，評估人類凝乳酶阻礙活性率。

此外，以成為表1所示濃度之方式添加作為比較例的聖草素、(+)-黃杉素、(±)-黃杉素、兒茶素及表兒茶素，並藉由上述方法，評估人類凝乳酶阻礙活性率。

將結果示於表1。

由以上結果，可確認化合物(A)係具有凝乳酶活性阻礙作用。特定而言，可瞭解作為化合物(A)的槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷、山奈酚及木犀草素係具有優異的凝乳酶活性阻礙作用。

<評估2：小鼠的高血壓症之改善作用之評估>

使用本發明之凝乳酶阻礙劑(本發明之藥劑)，針對作為起因於血管收縮素II之疾病的鹽分過剩攝取所引起之高血壓症之改善作用施行評估。另外，作為凝乳酶阻礙劑的有效成分，係使用金絲桃苷。

在以下5組(對照組、試驗組1~4)中，施行收縮期血壓(Systolic Blood Pressure，SBP)、及擴張期血壓(Diastolic Blood Pressure，DBP)之評估。

作為實驗動物，將從日本SLC取得之野生型小鼠 (C57BL/6J)飼育在溫度24±1℃，濕度50-60%，照明係以12小時明暗週期進行調節之實驗動物飼育室。使用CE-2(日本CLEA)作為飼料，使用2重量%之食鹽水作為飲用水，使其自由攝食。以例子數係各組N=6開始進行實驗，並未認定有在實驗中途死亡的小鼠。此外，在各組中，於體重、攝餌量及攝水量上並未認定出差異。

〔對照組(僅食鹽水)〕

使6隻小鼠自由攝食CE-2(日本CLEA)作為飼料，使用2重量%之食鹽水作為飲用水，而製作經負荷3個月2%之食鹽水溶液之食鹽依存性高血壓小鼠。對於食鹽依存性高血壓小鼠，隨後再於相同條件下施行飼育，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組1(金絲桃苷投予：20mg/kg體重/日)〕

與對照組同樣地，製作經給予3個月2%之食鹽水溶液之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)。對於該食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以20mg/kg體重/日給予金絲桃苷，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組2(金絲桃苷投予：10mg/kg體重/日)〕

與對照組同樣地，製作經給予3個月2%之食鹽水溶液之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)。對於該食鹽依存性 高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以10mg/kg體重/日給予金絲桃苷，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組3(金絲桃苷投予：5mg/kg體重/日)〕

與對照組同樣地，製作經給予3個月2%之食鹽水溶液之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)。對於該食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以5mg/kg體重/日給予金絲桃苷，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組4(金絲桃苷投予：2.5mg/kg體重/日)〕

與對照組同樣地，製作經給予3個月2%之食鹽水溶液之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)。對於該食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以2.5mg/kg體重/日給予金絲桃苷，每次於各週施行上述評估共8週。

圖1~3中係顯示對照組及試驗組1~4的收縮期血壓(SBP)及擴張期血壓(DBP)之評估結果。另外，施行二元配置的分散分析，在事後檢定中施行Bonferroni法。顯著水準設為P<0.05。

如圖1~3所示，在對照組中，於食鹽水投予3個月中，隨著投予期間經過，係認定有收縮期血壓、擴張期血壓及心跳數的上升，該狀態係於試驗期間持續。 即，一般認為在僅給予2重量%之食鹽水之對照組中，係出現起因於鹽分過剩攝取之高血壓症的症狀，起因於該高血壓症而使心跳數增加。於是，在隨後的試驗期間亦認定有收縮期血壓、及擴張期血壓的上升。

另一方面，可瞭解在食鹽水投予3個月後(出現高血壓症的症狀後)，在投予金絲桃苷之試驗組1~4中，自金絲桃苷投予第1週起，相較於對照組而言，收縮期血壓、及擴張期血壓的上升皆開始受到抑制，在第2週以後係個別受到顯著地抑制。於是，可確認金絲桃苷投予量越多，則收縮期血壓、及擴張期血壓的降壓作用越大。即，顯示出藉由投予金絲桃苷而對食鹽依存性高血壓症的改善有所貢獻。

此外，食鹽依存性高血壓症會成為藥劑抵抗性高血壓，藉由阻礙ACE係無法認定有降壓作用。因此，一般認為藉由投予金絲桃苷所引起之凝乳酶活性阻礙作用，非ACE依存性血管收縮素II產生會受到抑制，從而表現出降壓作用。

<評估3：水蓼中所包含之成分之評估>

作為包含化合物(A)之原料植物，係使用水蓼(Persicaria hydropiper)，將其乾燥物使用於後述之試驗中。

使水蓼(自Seishin企業股份有限公司購入)的芽部以棚式乾燥機乾燥，獲得水蓼的乾燥物。將所獲得之乾燥 物以氣流式粉碎機充分地粉碎。利用加熱減量法算出所獲得之粉碎後之水蓼乾燥物(5樣本)的水分含量，結果為1.5重量%(平均值)，在所有樣本中皆為2重量%以下。

作為水蓼中所包含之成分之評估，係將含有水蓼芽部的乾燥物(粉碎物)之成分利用下述方法進行評估。

首先，對既定量的水蓼乾燥物(n=3)加入10倍量(重量比)之50體積%乙醇/水，在室溫攪拌2小時，而萃取水蓼中所包含之成分。其次，將藉由離心分離(3000rpm，10分鐘)所分離出之上清液利用50體積%乙醇/水進行10倍稀釋，施行過濾器(0.45μm)過濾後，使用Alliance HPLC系統(Waters)進行分析。

將水蓼乾燥物的溶媒萃取成分之分析結果示於表2。如表2所示，水蓼芽部的乾燥物中之主成分為金絲桃苷。因此，在以下評估中，水蓼乾燥物中所包含之化合物(A)係視為金絲桃苷而施行試驗。

<評估4：小鼠的高血壓症之改善作用之評估>

使用水蓼乾燥物(粉碎物)，在以下5組(對照組、試驗組1A~4A)中，施行對食鹽依存性高血壓症小鼠投予水蓼乾燥物的收縮期血壓(SBP)、擴張期血壓(DBP)及心跳數(Heart Rate)之評估。

作為實驗動物，將從日本SLC取得之野生型小鼠(C57BL/6J)飼育在溫度24±1℃、濕度50-60%、照明係以12小時明暗週期進行調節之實驗動物飼育室。使用CE-2(日本CLEA)作為飼料，使用2重量%之食鹽水作為飲用水，使其自由攝食。以例子數係各組N=6開始進行實驗，並未認定有在實驗中途死亡的小鼠。此外，在各組中，於體重、攝餌量及攝水量上並未認定出差異。

〔對照組(僅食鹽水)〕

使6隻小鼠自由攝食CE-2(日本CLEA)作為飼料，使用2重量%之食鹽水作為飲用水，而製作經負荷3個月2%之食鹽水溶液之食鹽依存性高血壓小鼠。對於食鹽依存性高血壓小鼠，隨後再於相同條件下施行飼育，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組1A(水蓼乾燥物投予：500mg/kg體重/日)〕

對於與對照組同樣地製作而成之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以500mg/kg體重/ 日給予水蓼乾燥粉碎物，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組2A(水蓼乾燥物投予：250mg/kg體重/日)〕

對於與對照組同樣地製作而成之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以250mg/kg體重/日給予水蓼乾燥粉碎物，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組3A(水蓼乾燥物投予：125mg/kg體重/日)〕

對於與對照組同樣地製作而成之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以125mg/kg體重/日給予水蓼乾燥粉碎物，每次於各週施行上述評估共8週。

〔試驗組4A(水蓼乾燥物投予：62.5mg/kg體重/日)〕

對於與對照組同樣地製作而成之食鹽依存性高血壓小鼠(6隻)，連同上述飼料及食鹽水，以62.5mg/kg體重/日給予水蓼乾燥粉碎物，每次於各週施行上述評估共8週。

將對照組及試驗組1A~4A的收縮期血壓(SBP)、擴張期血壓(DBP)及心跳數之評估結果示於圖4~6。另外，施行二元配置的分散分析，在事後檢定中施行Bonferroni法。顯著水準設為P<0.05。

如圖4~6所示，在對照組中，於食鹽水投予3個月中，隨著時間經過，係認定有收縮期血壓、擴張期血壓及心跳數的上升，該狀態係於試驗期間持續。另一方面，在食鹽水投予3個月後，在投予水蓼乾燥物之試驗組1A~3A中，相較於對照組而言，自水蓼乾燥物投予第1週起，心跳數的增加、收縮期血壓、擴張期血壓的上升皆開始受到抑制，在第2週以後係個別受到顯著地抑制。在試驗組4A中，雖然對收縮期血壓不造成影響，但擴張期血壓的上升自第4週起皆受到顯著地抑制。對心跳數的增加之抑制則幾乎不造成影響。

根據以上結果，與上述評估2中之金絲桃苷的經口投予同樣地，可確認經口投予水蓼乾燥物所引起之小鼠中之血壓降下作用。再者，可確認若投予量變多，則會與血壓降下作用一併地表現出心跳數之降低作用。

<評估5：人類的高血壓症之改善作用之評估>

經由福岡大學筑紫病院的倫理委員會之承認，在用以確認水蓼乾燥物的服用(經口投予)所引起之有效性及安全性之目的下，以出現高血壓症的症狀之被試驗者11人(平均體重：65kg，標準偏差：12.4)為對象施行人類試驗。

服用難消化糊精400mg/人/日作為安慰劑共2週，接著，服用水蓼乾燥物200mg/人/日共2週。另外，將被試驗者的體重設為65kg，水蓼乾燥物200mg/人/日 係相當於水蓼乾燥物3.1mg/kg體重/日，相當於金絲桃苷0.03mg/kg體重/日。

接著，依水蓼乾燥物400mg/人/日、800mg/人/日、2000mg/人/日之順序各服用2週。此外，在1日中服用安慰劑及水蓼乾燥物之時機，係設為被試驗者的早餐後。將水蓼乾燥物投予量與金絲桃苷投予量之關係示於表3。

血壓測定及心跳數測定係使用Omron Healthcare股份有限公司製之自動血壓計(HEM-7251G)施行。另外，由於在此自動血壓計中，於測定後，個別的血壓數據及脈搏數據係經由網際網路自動地傳送至伺服器，因而不會受到被試驗者的主觀所左右。作為被試驗者的血壓，係採用服用水蓼乾燥物之翌日早晨的收縮期血壓(Systolic Blood Pressure，SBP)及擴張期血壓(Diastolic Blood Pressure，DBP)。此外，作為心跳數(heart rate)，係採用服用水蓼乾燥物之翌日早晨的脈搏數據。

將針對收縮期血壓(SBP)之評估結果示於圖7，將針對擴張期血壓(DBP)之評估結果示於圖8。此 外，將心跳數之結果示於圖9。另外，圖7~9中之數值係被試驗者11人之安慰劑期(2週)的平均值、及各水蓼乾燥物服用期(各2週)的平均值，投予量係表記為水蓼乾燥物中所包含之金絲桃苷服用量。

如圖7所示，若將安慰劑期及水蓼乾燥物服用期進行對比，則可認定自金絲桃苷服用量0.03mg/kg體重/日(水蓼乾燥物200mg/人/日)起，收縮期血壓係顯著地降低。此外，如圖8所示，擴張期血壓亦為同樣的結果。

另一方面，如圖9所示，可確認心跳數在金絲桃苷服用量0.03mg/kg體重/日(水蓼乾燥物200mg/人/日)、0.06mg/kg體重/日(水蓼乾燥物400mg/人/日)時係與安慰劑期為相同程度，但在金絲桃苷服用量0.12mg/kg體重/日(水蓼乾燥物800mg/人/日)、0.30mg/kg體重/日(水蓼乾燥物2000mg/人/日)時則心跳數降低。

由以上結果，可確認對人類經口投予包含金絲桃苷等化合物(A)之水蓼乾燥物所引起之血壓降下作用，再者，可闡明若水蓼乾燥物服用量變多，則會與血壓降下作用一併地表現出心跳數之降低作用。

此外，如同由評估2(小鼠)與評估5(人類)間之對比所瞭解，可確認相較於小鼠而言，人類係藉由服用以體重基準計遠遠少量的金絲桃苷，而表現出血壓降下作用及心跳數降低作用。

<評估6：對異位性皮膚炎的有效性之評估>

經由福岡大學筑紫病院的倫理委員會之承認，在用以確認水蓼乾燥物的服用(經口投予)所引起之對異位性皮膚炎的有效性之目的下，以出現異位性皮膚炎的症狀之被試驗者11人(平均體重：65kg，標準偏差：12.4)為對象施行人類試驗。

針對對異位性皮膚炎的有效性，係利用以下方法進行評估。

首先，在臨床試驗開始前，針對被試驗者之異位性皮膚炎的自覺症狀測定關於皮膚狀態的問卷調查(皮膚醫學生活品質指數(DLQI：Dermatology Life Quality Index))、以及作為異位性皮膚炎的指標之嗜酸性球數。

接著，依水蓼乾燥物800mg/人/日(金絲桃苷0.12mg/kg體重/日)、2000mg/人/日(金絲桃苷服用量0.30mg/kg體重/日)之順序各服用2週。此外，在1日中服用安慰劑及水蓼乾燥物之時機，係設為被試驗者的早餐後。

(1)利用DLQI問卷調查所得之評估

將DLQI問卷調查的樣本例示於圖10。DLQI係因皮膚狀態而感到的不便之指標，越顯示高值，則意味異位性皮膚炎的症狀越受到改善。

將水蓼乾燥物的服用前後之關於皮膚狀態的問卷調查(DLQI)之評估結果示於圖11。另外，投予量係表記為水蓼乾燥物中所包含之金絲桃苷服用量。

如圖11所示，若以在臨床試驗開始前所測定之被試 驗者的DLQI作為基準值，則攝取水蓼乾燥物800mg/人/日(金絲桃苷0.12mg/kg體重/日)、2000mg/人/日(金絲桃苷服用量0.30mg/kg體重/日)後，測定值係顯示出高值，異位性皮膚炎的症狀係受到改善。

(2)嗜酸性球數之評估

此外，施行水蓼乾燥物的服用前後之嗜酸性球數(eosinophil number)之評估。自被試驗者採取既定量的血液樣本，由該血液樣本中之白血球數(/mm³)及白血球劃分(%)，算出血液/每mm³之嗜酸性球數。另外，嗜酸性球數係有用於作為異位性皮膚炎的病態之指標，症狀惡化時係增加。

如圖12所示，相較於服用水蓼乾燥物前而言，服用水蓼乾燥物2000mg(金絲桃苷服用量0.30mg/kg體重/日)後之嗜酸性球數係顯示出低值。

由以上結果，暗示藉由服用水蓼乾燥物，而具預防/改善異位性皮膚炎的症狀之效果，且阻礙人類凝乳酶的活性之金絲桃苷為有效成分。

(3)安全性之確認

針對安全性，施行水蓼乾燥物4000mg/人/日(金絲桃苷服用量0.60mg/kg體重/日)的單次服用試驗。被試驗者係在充分地接受臨床試驗的規程或危險性之說明後，徵得本人的記名同意而參加服用水蓼乾燥物所引起之安全 性試驗。作為結果，在所有被試驗者11人中，即便施行水蓼乾燥物4000mg/人/日的單次服用試驗，亦完全未認定有腹痛/噁心/嘔吐等消化道不定愁訴或通便異常等自覺症狀。此外，在血液檢查、尿液檢查等中，亦完全未認定有服用水蓼乾燥物所引起之代謝異常。由以上結果，可確認水蓼乾燥物的安全性。

Claims (7)

1. 一種下述一般式(A)所示之化合物或其藥學上容許之鹽的用途，係用於製造與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑，且一般式(A)所示之化合物係從槲皮苷(quercitrin)、異槲皮苷(isoquercitrin)、金絲桃苷(hyperoside)、山奈酚(kaempferol)及木犀草素(luteolin)所組成之群組中選出之1種以上，(一般式(A)中，R¹~R⁵各自獨立地表示氫原子、羥基或甲氧基，X¹表示氫原子、羥基或-OG基，G表示糖鏈)。
2. 如請求項1之用途，其中，一般式(A)所示之化合物係槲皮苷(quercitrin)、異槲皮苷(isoquercitrin)及金絲桃苷(hyperoside)。
3. 如請求項2之用途，其中，前述與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑為高血壓症及/或起因於高血壓症之疾病用藥劑。
4. 如請求項2之用途，其中，前述與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑為起因於鹽分過剩攝取之高血壓症之預防治療用，且降低心跳數用藥劑。
5. 如請求項3或4之用途，其係將槲皮苷、異槲皮苷及金絲桃苷以對人類經口投予換算為金絲桃苷重量0.1mg/kg體重/日以上之方式使用。
6. 如請求項3或4之用途，其中，與人類凝乳酶的活性相關疾病之預防治療用藥劑為以水蓼芽部之乾燥物及/或萃取物含有槲皮苷、異槲皮苷及金絲桃苷。
7. 如請求項6之用途，其係以對人類經口投予換算為水蓼芽部之乾燥物重量基準為12.3mg/kg體重/日以上之方式使用。