TWI663977B - 人蔘皂苷m1用於預防或治療矽肺病之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係有關人蔘皂苷M1用於治療或預防矽肺病之新穎性用途。

Description

人蔘皂苷M1用於預防或治療矽肺病之用途 相關申請案

本申請案主張2015年3月17日申請之美國臨時申請案第62/134,236號之優先權，其內容在此全部併入作為參考資料。

本發明係有關人蔘皂苷M1用於治療或預防矽肺病之新穎用途。

矽肺病是一種吸入二氧化矽顆粒造成的肺部疾病，通常來自工作在礦場及採石場及一些其他職業如建築、鑄造廠、陶瓷及玻璃製造。二氧化矽顆粒影響肺部功能。其症狀包含呼吸急促、劇烈的格嗽及虛弱。

人蔘皂苷是人蔘之主要活性成分，已知具有多種藥理學活性，例如，抗腫瘤、抗疲勞、抗過敏及抗氧化活性。人蔘皂苷類具有相同的基礎結構，其係由具17個碳原子排成四個環的甾烷類固醇核心(gonane steroid nucleus)組成。人蔘皂苷會在體內代謝，近來許多研究指出，在體內易吸收而作為活性成分的是人蔘皂苷代謝物而非天然存在之人蔘皂苷。其中，人蔘皂苷M1已知為原人蔘二醇型(protopanaxadiol-type)人蔘皂苷代謝物之一，其係經由人體腸道細菌之絞股藍皂苷（gypenoside）途徑生成。迄今，尚未有前案報導人蔘皂苷M1於矽肺病的治療功效。

本發明不可預期地發現，人蔘皂苷M1可有效減輕或延遲矽肺病的發病或惡化。因此，本發明提供一種於個體治療或預防矽肺病之新穎方法。

具體而言，本發明提供一種於需要之個體治療矽肺病的方法，其包含將有效量之人蔘皂苷M1投予至該個體。

特定而言，本發明之治療方法有效地抑制二氧化矽結晶引起的NLRP3發炎體活化。更特定地，本發明之治療方法有效地抑制二氧化矽結晶藉由NLRP3發炎體引起的介白素（IL）1β產生。

在部分具體實施例，人蔘皂苷M1係以腸外或腸內的路徑投予。

本發明亦提供一種人蔘皂苷M1用於製造供需要之個體治療矽肺病之藥物的用途。

本發明之一或多個具體實施例之詳述係列於下方之說明中。本發明之其他特徵或優勢可由下列數個具體實施例之詳細說明及所附之主張而更臻清楚。

除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能常規理解的意義。除非另有指明，本文所使用的下列術語具有賦予其之涵義。

本文所使用的冠詞「一」與「一者」是指一個或多於一個（亦即，至少一者）之該冠詞語法對象。舉例而言，「一元件」是指一個元件或多於一個之元件。

IL-1β是一種重要的細胞激素，藉由脂多醣（LPS）活化巨噬細胞中的轉錄活性，快速地合成無活性的未成熟型態（IL-1β之先驅因子，proIL-1β）（Hsu and Wen, 2002）。不像其他細胞激素，成熟IL-1β的分泌需要藉由蛋白酶-1（一種半胱氨酸蛋白酶）處理其先驅型態proIL-1β（Miller et al., 1997）。IL-1β的釋放係由包含蛋白酶-1的多蛋白複合物控制（稱為NLRP3發炎體），其控制蛋白酶-1活性和IL-1β的釋放（Cassel et al., 2011; Jin and Flavell, 2010）。NLRP3發炎體完全的活化需要同時有一個來自LPS刺激TLR4的啟動信號及一個來自次級刺激物的活化信號，如單鈉尿酸鹽（二氧化矽結晶），前者控制NLRP3及proIL-1β表現及後者控制蛋白酶-1活性（Martinon et al., 2009; Schroder and Tschopp, 2010; Davis et al., 2011; Cassel et al., 2011; Jin and Flavell, 2010）。矽肺病及假性矽肺病係發炎性關節炎，其特徵係二氧化矽結晶及脫水焦磷酸鈣（CPPD）晶體分別沉積在關節中造成的突然自體限制攻擊之發炎反應。NLRP3發炎體與發炎疾病之發展間的密切連結越趨明顯。結晶化的矽，又稱二氧化矽（silicon dioxide, SiO₂ ）係發現於自然界中的沙或石英。雖攝入的二氧化矽無害且無毒，但吸入為小的二氧化矽結經確會導致肺部發炎。長期二氧化矽曝露會導致矽肺病，一種不可逆的肺纖維化疾病。研究曾揭示，二氧化矽藉由活化NALP3發炎體誘發成熟IL-1β分泌（Hornung et al., 2008; Peeters et al., 2014）。矽肺病的特徵係急遽的嗜中性球內流進入肺部及IL-1β之大量製造（Huaux, 2007）。偵測到暴露於二氧化矽結晶的野生小鼠中有明顯的肺部嗜中性球浸潤。而暴露於二氧化矽結晶的IL-1R-缺乏小鼠則無（Hornung et al., 2008）。抑制二氧化矽結經引起的NLRP3發炎體活化及IL-1β之產生會預防且緩和矽肺病。

本發明不可預期地發現，人蔘皂苷M1可減少巨噬細胞中二氧化矽引起的IL-1β產生（圖1）及LPS引起的NLRP3及proIL-1β表現（圖3）。這些結果指出人蔘皂苷M1可以預防及緩和矽肺病。

因此，本發明係提供一種於需要之個體治療矽肺病的方法，其包含投予該個體有效量之人蔘皂苷M1，以治療該個體。本發明也提供人蔘皂苷M1用於製造一種藥物以於需要之個體治療矽肺病。

具體而言，此治療方法係有效地抑制二氧化矽結晶引起的NLRP3發炎體活化。更具體地，此治療方法係有效地抑制二氧化矽結晶藉由NLRP3發炎體引起的IL-1β產生。

人蔘皂苷M1，即20-b-D-吡喃葡萄糖基原人蔘二醇（20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol），為本領域習知之皂素代謝物之一。人蔘皂苷M1之化學結構如下：

人蔘皂苷M1已知為原人蔘二醇型人蔘皂苷之代謝物之一，其係經由人體腸道細菌之絞股藍皂苷途徑產生。人體服用人蔘後，可於血液或尿液中發現人蔘皂苷M1。人蔘皂苷M1可製備自人蔘植物，其係以本領域習知方法如真菌發酵方式進行，例如，中華民國發明專利申請案第094116005號（I280982）及美國專利第7,932,057號，其全部內容在此列入本案以作為參考資料。在部分具體實施例中，用於製備人蔘皂苷M1的人蔘植物包括五加科（Araliaceae ）、人蔘屬（Panax genus），如人蔘（P. ginseng ）及假人蔘（P. pseudo-ginseng ）（亦稱作三七）。一般而言，人蔘皂苷M1之製備方法包括步驟：（a）提供人蔘植物材料（如葉或莖）的粉末；（b）提供真菌，以進行人蔘植物材料之發酵，其中發酵溫度範圍為20至50°C、發酵濕度範圍為70至100%、pH值範圍為4.0至6.0、及發酵時間範圍為5至15天；（c）萃取及收集發酵產物；以及（d）自發酵產物分離20-b-D-吡喃葡萄糖基原人蔘二醇。

在本發明中，當以「分離」或「純化」描述人蔘皂苷M1時，其應理解為非絕對的分離或純化，而是相對的分離或純化。舉例而言，純化的人蔘皂苷M1是指相較於其天然存在形式而言，純度更高。在一具體實施例中，含有純化的人蔘皂苷M1的製劑可包含的人蔘皂苷M1之含量為總製劑的50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或100%（w/w）。應理解的是，當以某數字顯示比例或劑量時，該數字通常包括其10%上下之範圍，或更特別地，包括其5%上下之範圍。

本文所使用的「個人」或「個體」等詞包括人類或非人類動物，例如陪伴動物（如狗、貓等）、農場動物（如牛、綿羊、豬、馬等）、或實驗動物（如大鼠、小鼠、天竺鼠等）。

本文所使用的「治療」乙詞是指施加或投予包括一或多種活性藥劑的組合物至具有疾病、疾病之症狀或病況、或疾病惡化之個體，其目的在於治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進、或影響疾病、疾病之症狀或病況、疾病引發之失能、或疾病惡化。

本文所使用的「治療有效量」乙詞是指於治療之個體產生治療功效之活性成分的量。舉例而言，用於治療矽肺病之有效量為可抑制二氧化矽結晶引起的NLRP3發炎體活化，更具體地，可以抑制二氧化矽結晶藉由NLRP3發炎體引起的介白素-1β產生的劑量。

治療有效量可因各種因素而有所變化，如投予途徑及頻率、接受該藥物之個體的體重及物種、及投予目的。熟習本領域之技術人員可基於本文之揭示、建立之方法、及其本身之經驗確定各情況的劑量。舉例而言，在部分具體實施例中，本發明所使用的人蔘皂苷M1口服劑量為每日10至1,000 mg/kg。在部分實例中，本發明所使用的人蔘皂苷M1口服劑量為每日100至300 mg/kg、每日50至150 mg/kg、每日25至100 mg/kg、每日10至50 mg/kg、或每日5至30 mg/kg。此外，在本發明之部分具體實施例中，人蔘皂苷M1係週期性投予一段時間，例如，每日投予達至少15天、一個月或二個月或更久。

依據本發明，人蔘皂苷M1可作為活性成分，以治療矽肺病。在一具體實施例中，針對輸送及吸收目的，治療有效量之活性成分可與醫藥上可接受載體配製成適當形式之醫藥組合物。依據投予模式，本發明之醫藥組合物較佳為包含約0.1%重至約100%重之活性成分，其中百分比重係以組合物之總重量為基準計算。

本文所使用的「醫藥上可接受」乙詞是指載體與組合物之活性成分相容，且較佳為可穩定該活性成分且對於接受治療之個體具安全性。該載體可為活性成分之稀釋劑、載劑、賦形劑、或介質。適用之賦形劑的一些實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿、及甲基纖維素。本組合物可額外包含潤滑劑如滑石、硬脂酸鎂、及礦物油；潤濕劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑如甲基及丙基羥基苯甲酸酯；增甜劑；以及調味劑。在投予至病患後，本發明之組合物可提供活性成分快速、持續、或緩慢釋放之效果。

依據本發明，該組合物之形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸劑、乳液、溶液、糖漿、軟與硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液、及包裝粉劑。

本發明之組合物可經由任何生理上可接受途徑輸送，例如，口服、非口服（如肌內、靜脈、皮下、及腹腔）、經皮、栓劑、及鼻內方法。關於非口服投予，較佳為使用無菌水溶液，其可包含其他物質，如足以使溶液與血液等張的鹽類或葡萄糖。水溶液可視需求適當地經緩衝（較佳為具pH值3至9）。本領域之技術人員可由習知之標準藥理學技術於無菌條件下製備適合的非口服組合物。

依據本發明，含有以人蔘皂苷M1作為活性成分的人蔘皂苷M1或組合物可用於治療罹患矽肺病或有罹患矽肺病風險之個體。特定而言，含有以人蔘皂苷M1作為活性成分的人蔘皂苷M1或組合物可投予至罹患矽肺病之個體或具有罹患矽肺病風險之個體，藉由抑制二氧化矽結晶引起的NLRP3發炎體活化，以預防疾病發生或改善症狀或延緩症狀惡化。

本發明係進一步以下列實例說明，其目的旨在闡述而非侷限。

實施例

1. 材料及方法

人蔘皂苷M1，即20-b-D-吡喃葡萄糖基原人蔘二醇（20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol）（以下命名為LCHK168），係以本領域習知之方法製備，如中華民國專利申請案第094116005號（I280982）及美國專利第7,932,057號所揭示者。

小鼠巨噬細胞細胞株J774A.1及人類單和白血球細胞株THP-1係購於美國菌種保存中心（Rockville, MD）並培養在添加10%以高溫去活性的胎牛血清及2 mM L-谷氨酰胺之RPMI 1640培養基（皆購於 Life Technologies, Carlsbad, CA）於37℃、5% CO₂ 培養箱中。為了誘導單核球分化成巨噬細胞，THP-1以添加100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（Sigma-Aldrich）培養在RPMI-1640中48小時。

圖1中，J774A.1 巨噬細胞（1x10⁵ 細胞/500μl 培養基/孔槽）係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1μg/ml LPS（來自大腸桿菌 0111:B4，購於Sigma, St Louis, MO）培養2小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時（皆購於InvivoGen, San Diego, CA）。培養基中IL-1β量係由ELISA測量。

圖2中，J774A.1巨噬細胞（2x10⁶ 細胞/2 ml 培養基/盤）係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1μg/ml LPS（來自大腸桿菌 0111:B4，購於Sigma, St Louis, MO）培養6小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少）。細胞裂解液中NLRP3及proIL-1β係由西方墨點法測量。簡言之，治療後，細胞收集並在4℃裂解於包含蛋白酶抑制劑組合物（Sigma, St Louis, MO）之裂解緩衝液中（25mM Tris-氯化氫，pH 7.5，100mM 氯化鈉，2mM EDTA，2.5mM EGTA，20mM 氟化鈉， 1mM 正釩酸鈉， 20mM β甘油磷酸鈉，10mM 焦磷酸鈉，0.5％ Triton X-100），然後完整的細胞裂解液以SDS-PAGE分離再電轉至PVDF膜。將膜於阻斷溶液中（5% 脫脂牛奶在含0.1% Tween 20之磷酸鹽緩衝鹽水）室溫反應1小時，再與NLRP3或proIL-1β抗體於阻斷溶液中室溫反應2小時。以含0.1% Tween 20之PBS沖洗三次後，膜與HRP-共軛次級抗體於阻斷溶液中室溫反應1小時並以強化化學發光西方墨點法偵測系統顯色。

在圖3-5中，THP-1巨噬細胞（1x10⁵ 細胞/500μl 培養基/孔槽）係連同或不加人蔘皂苷M1培養30小時，再連同或不加1μg/ml LPS培養5小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時（購自InvivoGen, San Diego, CA）。培養基中IL-1β量（圖3）、TNF-α（圖4）及　IL-6（圖5）係由ELISA測量。

在圖6-8中，THP-1巨噬細胞（1x10⁵ 細胞/500μl 培養基/孔槽）係連同或不加1μg/ml LPS培養5小時，再連同或不加人蔘皂苷M1培養30小時（LPS仍然存在或缺少），接著連同或不加200μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-1β量（圖6）、TNF-α（圖7）及　IL-6（圖8）係由ELISA測量

在圖9-12中，動物實驗皆於國立宜蘭大學實驗動物照護及使用委員會的倫理審議下進行，並符合NIH實驗動物照護及使用指南的倫理規範。雄性C57BL/6小鼠購於國家實驗動物中心（台北，台灣）。小鼠飼養在22-24℃，相對溼度40-70%，12小時光暗循環，自由飲食飲水。第0、1及2天，每日以管餵方式口腔投予人蔘皂苷M1（60 mg/kg 體重）。矽肺病係在第0天、第1天及第2天，每日以氣管內暴露40m懸浮200mg二氧化矽結晶之磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）誘導（n=6）。每一天小鼠在投予人蔘皂苷M1 後，暴露於二氧化矽4小時，對照組小鼠接受PBS。在最後二氧化矽結晶暴露的四小時後，所有小鼠皆以斷頸方式犧牲，支氣管灌洗係以1ml 1% BSA/PBS溶液重復滴注在吸出連續3次進行。支氣管灌洗液（BALF）中IL-1β量及IL-6量係以ELISA分析。BALF總細胞數量係以血球計數儀計數，而BALF中蛋白質濃度係以蛋白質檢定染色確定。

ELISA方法，加入50μl生物素化抗體反應物及50μl培養基至預先以抗老鼠IL-1β或IL-6塗層之stripwell培養盤，培養於室溫2小時。以沖洗緩衝液沖洗plate 3次後，加入100μl稀釋之HRP（辣根過氧化物酶）標記鏈黴親和素濃縮物至各個孔槽並培養於室溫30分鐘。重複沖洗流程，然後加入100μl預先混合的四甲基聯苯胺基底溶液至各個孔槽並顯色於黑暗中室溫30分鐘。接著另外加入100μl提供之停止溶液至各個孔槽以停止反應，以微量盤分析儀測量培養盤在波長450nm之吸光值。

2. 結果

2.1 人蔘皂苷M1減少J774A.1巨噬細胞中二氧化矽結晶引起的IL-1β產生

小鼠J774A.1巨噬細胞係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1μg/ml LPS培養5小時(人蔘皂苷M1仍然存在或缺少)，接著連同或不加200μg/ml二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-1β量係由ELISA測量。如圖1所示，結果顯示人蔘皂苷M1減少IL-1β分泌，並指出人蔘皂苷M1減少矽肺病相關的發炎反應。***表示相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級p<0.001。

2.2 人蔘皂苷M1減少J774A.1巨噬細胞中LPS引起的NLRP3及IL-1β表現

J774A.1巨噬細胞係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1μg/ml LPS培養6小時(人蔘皂苷M1仍然存在或缺少)。細胞裂解液中NLRP3量及proIL-1β量係由西方墨點法測量。如圖2所示，結果顯示人蔘皂苷M1減少LPS活化之J774A.1巨噬細胞中NLRP3量及proIL-1β量。

總而言之，我們的研究顯示人蔘皂苷M1有效地減少巨噬細胞中二氧化矽結晶引起的IL-1β產生(圖1)及LPS引起的NLRP3及proIL-1β表現(圖2)。這些發現指出人蔘皂苷M1有效地預防及緩和矽肺病。

2.3 人蔘皂苷M1減少THP-1巨噬細胞中二氧化矽結晶引起的IL-1β、TNF-α及IL-6產生

為了確認人蔘皂苷M1抗發炎活性，人類THP-1巨噬細胞係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1μg/ml LPS培養5小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-1β量、IL-6量係由ELISA測量。如圖3-5所示，結果顯示人蔘皂苷M1減少IL-1β產生（圖3）、TNF-α產生（圖4）以及IL-6產生（圖5），並指出人蔘皂苷M1減少人類巨噬細胞中矽肺病相關的發炎反應。*及***表示分別相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級p＜0.05、p＜0.01及 p＜0.001。

2.4 人蔘皂苷 M1 減少 LPS 前處理之 THP-1 巨噬細胞中二氧化矽結晶引起的 IL-1 β 、 TNF-α 及 IL-6 產生

為了探討人蔘皂苷M1是否抑制二氧化矽結晶調控之NLRP3發炎體的活化信號，人類THP-1巨噬細胞係連同或不加1μg/ml LPS前處理5小時，再連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘（LPS仍然存在或缺少），接著連同或不加200μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-1β量、TNF-α、IL-6量係由ELISA測量。如圖6-8所示，結果顯示人蔘皂苷M1減少LPS前處理之THP-1巨噬細胞中IL-1β產生（圖6）、TNF-α產生（圖7）以及IL-6產生（圖8），並指出人蔘皂苷M1藉由抑制NLRP3發炎體的活化信號減少人類巨噬細胞中矽肺病相關的發炎反應。*及***表示分別相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級p＜0.01及 p＜0.001。

2.5 人蔘皂苷 M1 減少活體內二氧化矽結晶引起的矽肺病

相較於對照組小鼠，氣管內暴露二氧化矽結晶小鼠顯著地提高小鼠BALF中IL-1β（圖9）及IL-6（圖10）產生。口腔投予人蔘皂苷M1顯著地減少小鼠BALF中二氧化矽結晶引起的IL-1β（圖9）及IL-6（圖10）產生。二氧化矽結晶也顯著地提高BALF中總蛋白濃度(圖11)及總細胞數(圖12)，而這些影響被人蔘皂苷M1顯著抑制。

相信熟習本發明領域普通知識之技術人員可基於本文之闡述最大限度利用本發明，而毋須進一步說明。因此，應理解到，所提供之說明及主張僅用於示例之目的，而非以任何方式侷限本發明之範疇。

參考資料

Cassel SL, Joly S, Sutterwala FS. 2009. The NLRP3 inflammasome: a sensor of immune danger signals. Semin Immunol 21(4): 194-198.

Davis BK, Wen H, Ting JP. 2011. The inflammasome NLRs in immunity, inflammation, and associated diseases. Annu Rev Immunol 29: 707-735.

Duewell P, Kono H, Rayner KJ, Sirois CM, Vladimer G, Bauernfeind FG, Abela GS, Franchi L, Nuñez G, Schnurr M, Espevik T, Lien E, Fitzgerald KA, Rock KL, Moore KJ, Wright SDf, Hornung V, Latz E. 2010. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature 464: 1357-1361.

Hornung V, Bauernfeind F, Halle A, Samstad EO, Kono H, Rock KL, Fitzgerald KA, Latz E. 2008. Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome through phagosomal destabilization. Nat Immunol 9(8): 847-856.

Hsu HY, Wen MH. 2002. Lipopolysaccharide-mediated reactive oxygen species and signal transduction in the regulation of interleukin-1 gene expression. J Biol Chem 277(25): 22131-22139.

Huaux F. 2007. New developments in the understanding of immunology in silicosis. Current opinion in allergy and clinical immunology 7: 168-173.

Jin C, Flavell RA. 2010. Molecular mechanism of NLRP3 inflammasome activation. J Clin Immunol 30(5): 628-631.

Martinon F, Mayor A, Tschopp J. 2009. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol 27: 229-265.

Miller DK, Myerson J, Becker JW. 1997. The interleukin-1 beta converting enzyme family of cysteine proteases. J Cell Biochem 64(1): 2-10.

Peeters PM, Eurlings IM, Perkins TN, Wouters EF, Schins RP, Borm PJ, Drommer W, Reynaert NL, Albrecht C. 2014. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Part Fibre Toxicol 11(1): 58. Schroder K, Tschopp J. 2010. The inflammasomes. Cell 140(6): 821-832.

無

欲說明本發明，圖式具體實施例如下。然而，應理解到，本發明未侷限於所示之較佳具體實施例。在圖式中：

圖1顯示小鼠J774A.1巨噬細胞係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1 μg/ml LPS培養30分鐘（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶（silica crystal）培養24小時。培養基中IL-1β量係由ELISA測量。***表示相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.001。

圖2顯示小鼠J774A.1巨噬細胞係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1 μg/ml LPS培養6小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少）。細胞裂解液中NLRP3量及proIL-1β係由西方墨點法測量。

圖3顯示人類THP-1巨噬細胞（1x10⁵ 細胞/500μl 培養基/孔槽）係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1 μg/ml LPS培養5小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-1β量係由ELISA測量。**表示相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.01。

圖4顯示人類THP-1巨噬細胞（1x10⁵ 細胞/500μl 培養基/孔槽）係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1 μg/ml LPS培養5小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中TNF-α量係由ELISA測量。**及***表示分別相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.01及p＜0.001。

圖5顯示人類THP-1巨噬細胞（1x10⁵ 細胞/500μl 培養基/孔槽）係連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘，再連同或不加1 μg/ml LPS培養5小時（人蔘皂苷M1仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-6量係由ELISA測量。*及***表示分別相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.05及p＜0.001。

圖6顯示人類THP-1巨噬細胞係連同或不加1 μg/ml LPS培養5小時，再連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘（LPS仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-1β量係由ELISA測量。**及***表示分別相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.01及p＜0.001。

圖7顯示人類THP-1巨噬細胞係連同或不加1 μg/ml LPS培養5小時，再連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘（LPS仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中TNF-α量係由ELISA測量。**表示相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.01。

圖8顯示人類THP-1巨噬細胞係連同或不加1 μg/ml LPS培養5小時，再連同或不加人蔘皂苷M1培養30分鐘（LPS仍然存在或缺少），接著連同或不加200 μg/ml 二氧化矽結晶培養24小時。培養基中IL-6量係由ELISA測量。***表示相較於單獨二氧化矽結晶組，顯著差異等級 p＜0.001。

圖9顯示BALF中IL-1β量，其係分離自對照組小鼠、二氧化矽結晶暴露之小鼠、口腔投予人蔘皂苷M1加上二氧化矽結晶暴露之小鼠，由ELISA測量。***表示相較於二氧化矽結晶暴露組，顯著差異等級 p＜0.001。

圖10顯示BALF中IL-6量，其係分離自對照組小鼠、二氧化矽結晶暴露之小鼠、口腔投予人蔘皂苷M1加上二氧化矽結晶暴露之小鼠，由ELISA測量。***表示相較於二氧化矽結晶暴露組，顯著差異等級 p＜0.001。

圖11顯示BALF中總蛋白濃度，其係分離自對照組小鼠、二氧化矽結晶暴露之小鼠、口腔投予人蔘皂苷M1加上二氧化矽結晶暴露之小鼠，由蛋白檢定染色測量。***表示相較於二氧化矽結晶暴露組，顯著差異等級 p＜0.001。

圖12顯示BALF中總細胞數量，其係分離自對照組小鼠、二氧化矽結晶暴露之小鼠、口腔投予人蔘皂苷M1加上二氧化矽結晶暴露之小鼠，由血球計數移計數。***表示相較於二氧化矽結晶暴露組，顯著差異等級 p＜0.001。

Claims (4)

1. 一種人參皂苷M1用於製造供治療個體之矽肺病之藥物的用途。
2. 如請求項1之用途，其中該藥物可有效抑制於該個體中二氧化矽結晶引的的NLRP3發炎體活化。
3. 如請求項1之用途，其中該藥物可有效抑制於該個體中二氧化矽結晶藉由NLRP3發炎體引起的介白素-1β產生。
4. 如請求項1之用途，其中人蔘皂苷M1係經由腸內或腸外途徑投予。