CN113332272A - 富马酸二甲酯在制备抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡药物及治疗矽肺病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及富马酸二甲酯在制备抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡药物及治疗矽肺病药物中的应用，具体机制涉及Gsdmd以及Gsdme的剪切同时被显著抑制，且抑制炎性细胞因子IL‑1β和IL‑18的释放。DMF具有能够通过抑制Gsdmd及Gsdme的激活进而抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡的功能，并且在二氧化硅晶体诱导的小鼠矽肺病模型中具有抑制肺部炎症及肺纤维化的作用。
Description
技术领域
本发明属于化学生物学领域，具体涉及化合物富马酸二甲酯通过抑制Gsdmd和Gsdme的蛋白活性在抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡及治疗矽肺病中的应用。
技术背景
细胞焦亡(Pyroptosis)是近年来发现的一种新型程序性细胞死亡形式。具体的，细胞焦亡是机体对外界刺激(如细菌、病毒等)做出快速免疫反应的一种程序性细胞死亡。其作用是在病理感染情况下，于短时间内大量释放炎症因子与刺激免疫系统的DNA、RNA等物质，以激活下游免疫反应。细胞焦亡根据分子通路分为经典焦亡通路、非经典焦亡通路与凋亡-焦亡通路(也称凋亡-次级坏死通路)。
病原微生物感染宿主之后，固有免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等通过吞噬作用摄取病原体，限制病原微生物的感染范围。病原微生物(如革兰氏阴性菌)进入巨噬细胞等后，激活胞内的细胞焦亡信号通路引起细胞快速死亡。细胞死亡的同时伴随大量促炎因子的释放。各项研究表明，细胞焦亡在感染性疾病、神经退行性疾病以及动脉粥样硬化等疾病中均发挥重要作用。对细胞焦亡的深入研究，对于相关疾病的发展认识以及治疗开发均具有重大意义。
研究结果表明病原微生物进入免疫细胞之后由细胞内的模式识别受体(patternrecognition receptors，PRRs)识别，此类模式识别受体与病原生物表面的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的相互识别和作用是启动固有免疫应答的关键。模式识别受体包括Toll样受体TLR、RIG-I样受体(RLR)和NOD样受体(NLR)。NLR受体主要包括NLRP3、NLRC4和AIM等，能够识别不同的感染信号。
革兰氏阴性菌感染宿主细胞引起巨噬细胞焦亡的过程可分为经典焦亡通路和非经典焦亡通路。在经典焦亡通路中，革兰氏阴性菌通过其细胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活TLR4信号通路，引起转录因子NF-kB入核起始与促炎反应相关基因的表达，包括TNF-α、pro-IL1β以及proIL18等多种细胞因子。随后胞内的NLRP3炎性小体被激活，通过接头蛋白ASC招募前体Caspase-1并使其活化。活化后的Caspase-1具有蛋白水解酶的活性，一方面能够剪切IL-1β和IL-18前体，形成成熟的IL-1β和IL-18。另一方面，Caspase-1会剪切焦亡过程的执行蛋白Gsdmd，产生的Gsdmd的N端发生多聚并且移位至细胞膜上形成直径12～20μm的孔洞，最终导致细胞裂解死亡，并将大量具有生物活性的IL-1β和IL-18释放至细胞外，引起剧烈的炎症反应。入侵细胞内部的革兰氏阴性菌通过LPS直接结合并激活Caspase-4/-5/-11，进而剪切下游细胞焦亡执行蛋白Gsdmd，导致细胞裂解死亡。
另外，近期的研究表明gasdermin家族的另一个蛋白Gsdme也参与了细胞焦亡过程。细胞凋亡执行蛋白之一的Caspase-3能够特异性剪切Gsdme，与Gsdmd的激活机制类似，Gsdme的N端也会发生多聚并且移位至细胞膜上形成直径12～20μm的孔洞，最终导致细胞裂解死亡。Gsdme依赖Caspase-3激活导致细胞焦亡的过程也被称为“次级坏死(secondarynecrosis)”，并且这一过程是不依赖于炎症小体的。根据以上研究结果得知Gsdmd和Gsdme通过不同的上游激活机制共同参与了细胞焦亡的发生。因此通过调控Gsdmd和Gsdme的激活和功能，进而抑制细胞焦亡，对于抑制焦亡所产生的剧烈炎症具有重要作用。
二氧化硅晶体(silica)通过呼吸道进入肺部后会被肺泡巨噬细胞当作入侵异物吞噬，诱导巨噬细胞死亡，诱发剧烈的肺部炎症反应，最终导致矽肺病的发生。但是二氧化硅晶体是如何导致巨噬细胞焦亡的分子通路尚不明确，因此也没有针对性的疗法进行治疗。
富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)结构如下式(I)所示，是Keap1/Nrf2信号通路的激动剂，能够诱导上调抗氧化基因的表达。
近期的研究发现DMF通过对Gsdmd和Gsdme的多个半胱氨酸位点进行琥珀酰化修饰，进而抑制其被上游相关caspase蛋白酶的剪切，抑制N端结构域的寡聚以及形成孔洞导致细胞裂解性死亡的过程；该近期研究报道的是DMF可以抑制Gsdmd和Gsdme的剪切，但是DMF抑制Gsdmd的剪切以及DMF抑制Gsdme的剪切并不是同时发生的。仅当Gsdmd缺失时，Gsdme才发生剪切。而且该研究中Gsdmd的剪切是用细菌毒素脂多糖(LPS)和尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的，也与本发明研究使用的二氧化硅晶体诱导细胞焦亡不同。
之前报道中研究的就是常规意义上的细菌毒素：细菌毒素脂多糖(LPS)和尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的细胞经典焦亡。而在敲除Gsdmd的细胞中，缺失经典焦亡，细胞则发生了凋亡-焦亡。
发明内容
本发明的目的在于克服目前干预二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡以及有效治疗矽肺病药物的空白，提供了富马酸二甲酯DMF在医学上的一种新用途。
本发明公开了富马酸二甲酯DMF在制备抵抗由二氧化硅晶体导致的巨噬细胞焦亡药物以及矽肺病治疗药物的新应用，即本发明公开了富马酸二甲酯在制备抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡药物及治疗矽肺病药物中的应用。
本发明的技术方案如下：
富马酸二甲酯在制备抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡药物中的应用。
进一步地，所述药物用于同时抑制Gsdmd以及Gsdme的剪切，从而抑制二氧化硅晶体诱导的细胞焦亡，并抑制炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放。
进一步地，所述药物为治疗矽肺病的药物。
进一步地，所述药物是以富马酸二甲酯为活性成分，加入常规的助剂制备成的粉剂。
进一步地，所述药物的给药途径包括口服给药。
进一步地，所述富马酸二甲酯的工作浓度为50-100uM。
富马酸二甲酯在制备治疗矽肺病药物中的应用。
本发明的药物应用中的“细胞焦亡”是“二氧化硅诱导的巨噬细胞焦亡”，区别于现有技术中细菌毒素脂多糖(LPS)和尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的“经典细胞焦亡”；而且，本发明药物抑制细胞焦亡这一过程中同时发生的Gsdmd和Gsdme的的剪切属于本发明首先发现的，换句话说，DMF同时抑制Gsdmd和Gsdme的剪切，从而抑制二氧化硅诱导的巨噬细胞焦亡属于本发明的创新发现。
本发明的创新点就在于：之前二氧化硅晶体导致巨噬细胞焦亡的途径是不清楚的，而本发明明确了二氧化硅导致的巨噬细胞焦亡同时依赖于Gsdmd和Gsdme。而且，二氧化硅晶体导致巨噬细胞焦亡与细菌毒素诱导的焦亡是完全不同的生物学过程，对应的疾病也不相同，细菌毒素诱导细胞焦亡研究针对的是传染性疾病，而本发明研究二氧化硅晶体诱导细胞焦亡针对的是矽肺。
本发明研究发现二氧化硅晶体进入巨噬细胞之后一方面通过NLRP3炎症小体激活Gsdmd依赖的经典焦亡通路，另一方面通过激活凋亡相关的Caspase-3和Caspase-8诱导Gsdme依赖的次级坏死通路，通过两条信号通路诱导巨噬细胞死亡。
本发明通过DMF处理小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞(BMDMs)，发现50uM与100uMDMF可明显抑制0.25mg/ml二氧化硅晶体所诱导的细胞死亡。检测二氧化硅诱导细胞焦亡的主要效应蛋白，发现与LPS处理组相比，Gsdmd以及Gsdme的剪切均被显著抑制，并且这并不影响上游Caspase-1的激活。同时抑制炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放。
在小鼠矽肺病模型中，每天进行100mg/kg DMF混悬液灌胃可以显著抑制二氧化硅晶体诱导的肺部炎症和肺纤维化病理改变。并且能够显著降低肺泡灌洗液中的IL-1β和IL-18的含量。根据以上结果，DMF具有能够通过抑制Gsdmd及Gsdme的激活进而抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡的功能，并且在二氧化硅晶体诱导的小鼠矽肺病模型中具有抑制肺部炎症及肺纤维化的作用。
本发明的有益效果是：本发明药物中的活性成分合成简单，其对免疫细胞焦亡具有较好的抑制作用，体外实验证实DMF的最适抑制浓度为50μM；此外，动物实验证明100mg/kg的给药剂量能够显著缓解矽肺小鼠肺部炎症及肺纤维化病理改变，可以作矽肺病的治疗药物，治疗效果显著。
附图说明
图1为不同浓度的DMF对于0.25mg/ml二氧化硅晶体诱导的原代巨噬细胞焦亡具有抑制作用的细胞照片；
图2为LDH release assay测定不同浓度的DMF对于0.25mg/ml二氧化硅晶体诱导的原代巨噬细胞的死亡情况；
图3为不同浓度的DMF通过抑制Gsdmd和Gsdme的剪切抑制细胞焦亡、但并不影响Caspase-1的激活的示意图；
图4为不同浓度的DMF抑制巨噬细胞应对二氧化硅晶体刺激时释放炎性细胞因子IL-1β和IL-18的示意图；
图5为100mg/kg DMF灌胃能够显著抑制2周内二氧化硅晶体所导致的小鼠肺部炎症反应和肺纤维化的照片；
图6为100mg/kg DMF灌胃能够显著抑制2周内二氧化硅晶体所导致的小鼠矽肺模型中肺泡灌洗液的IL-1β和IL-18的含量的示意图；
图7为100mg/kg DMF灌胃能够显著抑制8周内二氧化硅晶体所导致的小鼠肺纤维化的照片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发做详细的说明。
本发明所开展的体外实验均使用小鼠骨髓原代巨噬细胞，分离自6至8周龄的小鼠股骨以及胫骨骨髓，使用20ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage ColonyStimulating Factor,M-CSF)体外诱导分化培养6天所得。所用培养基为HyClone DMEM培养基，添加10％胎牛血清和双抗。所使用培养基，血清以及双抗均为商购来源，按照生产厂家所提供的使用说明使用。细胞常规培养于37℃，5％CO2培养箱，细胞呈贴壁生长。
本发明所使用DMF和LPS均采购自美国sigma-aldrich公司,高效液相检测纯度＞98％。二氧化硅晶体(规格：MIN-U-SIL 15)采购于美国Frederick公司。涉及的其他材料也均为商购来源，按照生产厂家所提供的使用说明使用。
实施例一：DMF对二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡具有抑制作用
体外诱导分化的原代巨噬细胞培养在12孔板中，培养基1ml。首先加入1ug/ml LPS进行预处理,3h后加入DMF，1h后再加入终浓度为0.25mg/ml的二氧化硅晶体悬浊液。DMF处理组加入DMF的工作浓度分别为25uM、50uM和100uM，对照组加入等量DMSO。加入二氧化硅晶体两小时后，采集细胞形态图像，随后收取细胞培养基通过LDH release Assay测定分析细胞死亡的情况，同时收取上清进行炎性细胞因子IL-1β和IL8的检测。
实验结果显示DMF对二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡呈现浓度依赖性抑制作用。
关于细胞形态的表征检测：在图1中可见阴性对照组(图1A1，图1A2)的细胞生存状态良好；使用二氧化硅晶体诱导焦亡的组(图1A3)中巨噬细胞呈现焦亡的特殊形态学特征；加入梯度浓度的DMF处理后(25uM、50uM和100uM)，骨髓原代巨噬细胞对0.25mg/ml二氧化硅晶体诱导的细胞焦亡具有明显抑制作用(图1A4-6)。
另外在Gsdmd基因敲除的巨噬细胞中也得到了相似的结果(图1B1-6)。
LDH release assay试验表征：除了对细胞形态的检测之外，采取LDH releaseassay对细胞的死亡情况进行分析。如图2A和图2B所示，使用浓度梯度的DMF处理后，细胞死亡比例相较于二氧化硅晶体处理的阳性对照组呈现明显下降的趋势。
实验结果显示DMF对二氧化硅晶体诱导的细胞焦亡具有显著抑制作用。
实施例二：DMF通过抑制Gsdmd和Gsdme的剪切抑制细胞焦亡，但并不影响Caspase-1的激活
将原代巨噬细胞培养在12孔板中，培养基1ml。首先加入1ug/ml LPS进行预处理，3h后加入终浓度分别为25uM、50uM和100uM的DMF，对照组加入等量DMSO。1h后再加入0.25mg/ml的二氧化硅晶体诱导细胞发生焦亡。二氧化硅晶体处理2h后，提取细胞中蛋白，进行Western blot检测。所用抗体为anti-Caspase-1、anti-Gsdmd以及anti-Gsdme抗体，分别用于检测Caspase-1、Gsdmd和Gsdme的剪切激活情况。
如图3所示，结果显示Gsdmd和Gsdme的剪切均被显著抑制，而Caspase-1的激活则无明显变化，说明DMF抑制巨噬细胞焦亡并不干扰Caspase-1激活过程。
实施例三：不同浓度的DMF抑制巨噬细胞应对二氧化硅晶体刺激时释放炎性细胞因子IL-1β和IL-18
将小鼠骨髓来源的巨噬细胞培养在12孔板中，培养基1ml。首先加入1ug/ml LPS进行预处理，3h后加入终浓度分别为25uM、50uM和100uM的DMF，对照组加入等量DMSO。1h后再加入0.25mg/ml的二氧化硅晶体诱导细胞发生焦亡。二氧化硅晶体处理2h后，收集细胞上清检测炎性细胞因子IL-1β和IL-18的含量。
如图4所示，梯度浓度的DMF处理组中IL-1β和IL-18相较于二氧化硅晶体组显著下降。结果说明DMF可以抑制细胞焦亡导致的炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放。
实施例四：小鼠灌胃DMF混悬液干预siilica晶体诱导的矽肺病模型
实验动物：本实施案例所使用6～8周龄的C57BL/6J雄性小鼠饲养于南京大学模式动物研究所。所有实验小鼠相关饲养、实验程序严格按照南京大学模式动物研究所实验动物守则中规定进行，包括饲养于SPF环境，温度控制在23～25℃，湿度制在55±5％，间隔12h光照等。
实验方法与结果：6～8周龄C57BL/6J小鼠分为对照组和实验组，每组5只。按照每只小鼠鼻腔灌注5mg二氧化硅晶体悬浊液诱导矽肺病模型，对照组鼻腔滴注等体积PBS。实验组利用灌胃方式，按100mg/kg的剂量进行DMF给药，并使用0.5％CMC-Na(羧甲基纤维素钠)作为胶体溶液制备DMF混悬液。同样对照组给予等量0.5％CMC-Na灌胃。
在灌胃给药14天后，检测各组小鼠肺部炎症以及肺部纤维化的病理变化：如图5所示，在二氧化硅晶体诱导矽肺病的组中检测到明显的肺部出现大量炎性细胞(巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞)浸润(图5A3，图5A7)以及肺部成纤维细胞增生(图5B3)和纤维化病理变化(图5B7)，而DMF灌胃给药组的肺部炎症以及肺部纤维化程度显著降低(图5A4，图5A8,图5B4，图5B8)。
另外收集小鼠的肺泡灌洗液，通过Elisa方法测定肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量，如图6所示，DMF给药组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β(图6A)和IL-18(图6B)含量显著低于二氧化硅晶体处理组。
此外，申请人在长期给药实验中，还观察到二氧化硅晶体诱导矽肺病8周后小鼠肺部的病理变化：如图7所示，在二氧化硅晶体诱导矽肺病的组中检测肺部成纤维细胞增生(图7-3)和纤维化病理变化(图7-7)，而DMF灌胃给药组的肺部纤维化程度显著降低(图7-4，图7-8)。
综上，结果说明DMF对于矽肺病小鼠具有保护功能。
以上所述仅为本发明的优选例实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (7)
1.富马酸二甲酯在制备抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于同时抑制Gsdmd以及Gsdme的剪切，从而抑制二氧化硅晶体诱导的细胞焦亡，并抑制炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗矽肺病的药物。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物是以富马酸二甲酯为活性成分，加入常规的助剂制备成的粉剂。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括口服给药。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯的工作浓度为50-100uM。
7.富马酸二甲酯在制备治疗矽肺病药物中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FIACHRA HUMPHRIES等: "Succination inactivates gasdermin D and blocks pyroptosis", 《SCIENCE》 * |
| 王雨芳: "炎性疾病中GSDMD和GSDME调控细胞焦亡的机制", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
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