CN116634883A - 用于制备药物制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备药物制剂的方法，所述药物制剂用于治疗病毒感染，特别是由相关RNA病毒引起的感染，例如冠状病毒(COVID‑19)病。本发明还提供了使用大麦属植物(Hordeum)或大麦或大麦提取物或包含它们及它们组合的药物制剂来治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID‑19病的方法。本方法是简单的、经济的、生物友好的和工业上适用的。

Description

用于制备药物制剂的方法
技术领域
本发明涉及药物科学领域。因此，本发明涉及用于制备药物制剂的方法，所述药物制剂用于治疗病毒感染，特别是由相关RNA病毒引起的感染，例如冠状病毒(COVID-19)病。本发明还提供了使用大麦属植物(Hordeum)或大麦(Barley)或大麦提取物或包含它们及它们的组合的药物制剂来治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。本方法是简单的、经济的、生物友好的和工业上适用的。
发明背景
冠状病毒是在哺乳动物和鸟中引起疾病的一组相关RNA病毒。在人和鸟中，它们可引起范围从轻度疾病至致命疾病的呼吸道感染。人中的轻度疾病包括一些普通感冒病例(其也是由另一些病毒，主要是鼻病毒引起的)，而更致命的种类可引起SARS、MERS和COVID-19。
冠状病毒病(COVID-19)是由新发现的冠状病毒引起的感染性疾病。在2020年1月30日，世界卫生组织(World Health Organization)宣布冠状病毒病(COVID-19)爆发为突发公共卫生事件。由于确诊感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)而进入ICU的危重患者中的大多数(67至85％)发生了急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。SARS-CoV-2大流行激发了对理解与严重冠状病毒病2019(COVID-19)相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的基础病理学的新兴趣。
这是发明人的想法(brainchild)，其目的是研究可食用材料并将可食用材料转化成积极靶向治疗，以及处理危重和慢性疾病。这是发明人如何发现大麦属植物并开始研究其抗氧化和抗增殖特性的原因。在进行另外的研究和临床前研究之后，发明人观察到其抗癌活性非常显著。另外，在人中对其进行了测试，其在目前治疗不起作用的领域中取得了令人鼓舞的结果。它是独特的，因为它来源于单一产品大麦属植物，并随后涉及为最终产物带来效力的生物技术方法。
大麦属植物被称为大麦粒，并在世界各地非常普遍地种植。它既可以在夏季生长，也可以在冬季生长。它们生长的田地接近发明人的房屋。谷物首先被研磨和粉碎成粉末形式，并随后进行生物技术加工。大麦属植物的第一次使用是在2000年3月完成，用于研究其抗氧化特性。对原材料进行杀有害生物剂含量测试，并且未发现杀有害生物剂含量。
早期药物制剂具有制剂的pH为酸性的缺点。
本发明的发明人已经解决了该问题，并开发了制备药物组合物的新的和有创造性的方法。在冻干之后制剂具有酸性pH，并将其通过添加碱性溶剂来进一步处理和中和。在这样的改进下，药物制剂的生物活性改善，并且细胞形态被保留。
已在雄激素敏感性人前列腺癌细胞系Ln-Cap细胞系中对药物制剂进行了研究。在2％ V/V时实现100％抑制。这项研究是在哈佛大学(Harvard university)进行的。
本发明的药物制剂已显示出抗病毒活性，优选地抗RNA相关病毒，更优选地抗冠状病毒(COVID-19)。因此，本发明提供了制备可用于治疗病毒感染，特别地是RNA病毒感染，更特别地是COVID-19感染的药物制剂的方法。还提供了使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或者包含大麦属植物或大麦或大麦提取物的药物制剂治疗病毒感染的方法、及它们的用途。
发明目的
本发明的主要目的是提供制备药物制剂的方法，所述药物制剂包含大麦属植物或大麦或大麦提取物。
本发明的另一个目的是提供制备药物制剂的方法，所述药物制剂在治疗病毒感染，或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
本发明的另一个目的是提供使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或包含它们的药物制剂来治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
本发明的另一个目的是提供简单的、经济的、生物友好的和工业上适用的方法。
发明概述
本发明提供了用于制备药物制剂的方法，所述药物制剂用于治疗病毒感染，特别是由相关RNA病毒引起的感染，例如冠状病毒(COVID-19)病。本发明还提供了使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或包含它们及它们的组合的药物制剂来治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。本方法是简单的、经济的、生物友好的和工业上适用的。
发明详述
这是发明人的新的观点，并用于所述疾病。因此，本发明涉及用于制备药物制剂的方法，所述药物制剂用于治疗病毒感染，特别是由相关RNA病毒引起的感染例如冠状病毒(COVID-19)病。
所述方法包括以下步骤：将大麦粉(通过研磨大麦粒获得)与水混合并剧烈搅拌。然后将溶液保持在27±3℃的温度下，并在该温度下保持16小时，然后在80℃至140℃下进行蒸馏。将如此获得的馏出物适当加盖，并在10±2℃的温度下保持1小时。此外，在产物被蒸馏之后，将其冻干并稀释至不同浓度以具有增强的活性。
另外，冻干之后的药物制剂的pH为3.5，然后通过向所述制剂添加NaOH(氢氧化钠)来中和而将pH水平调至7.2。在该步骤下，增强了生物活性并且保留了细胞形态。
在抗病毒细胞培养研究期间，在处理细胞的研究期间出现的大问题是发现细胞形态改变。由于早期制剂是强酸性并且pH为约3.5，因此将其用1N NaOH中和以使其为碱性并将pH调至约7.4。
用病毒细胞系对中和的制剂进行测试。经处理细胞的形态保留。如实验结果中观察到的，药物制剂的活性也提高了，甚至在75×倍稀释下给予了与50×酸性制剂相同的结果。这给予了发明人明确的指示，即碱性性质的药物制剂在中和病毒的同时更有效并且保留了细胞形态。
根据本发明的一个优选实施方案，将大麦粉与蒸馏水混合，更优选地与双蒸水混合。
由此获得的溶液是期望制备的药物制剂。Satcon是从这种药物制剂获得的最终产物的名称。Satcon是C-JNK激酶抑制剂药物制剂，因此提出观察到的药物制剂的作用机制是其保护呼吸道上皮细胞，因为其在被冠状病毒传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitis virus，IBV)感染的细胞中抑制被激活的C-JNK途径。C-JNK诱导促炎细胞因子例如TNFa、IFN、IL1、IL2和IL6，因此抑制这种激酶可引起抗炎作用，并且JNK诱导转录因子例如NF-KB p65、C-Jun的激活，所述转录因子在调节对病毒感染的免疫应答中发挥关键作用(Nature Journal,Sing Fung和Ding Xiang Liu的文章3215,2017)。这项研究由Fluofarma在2012年4月进行，以观察Satcon对不同途径的作用。
根据本发明的另一个优选实施方案，将大麦粉溶液在27±3℃下保持16±2小时之后，在80℃至140℃的温度下进行蒸馏。
根据本发明的另一个优选实施方案，将大麦粉与水分别以1:2的比例混合。在其中通过已知的干燥方法进行干燥的第2步之后，尝试了多种手段来获得固体，但是通过蒸馏途径获得了最佳结果。
此外，在产物被蒸馏之后，将其冻干并稀释至不同浓度以具有增强的活性。
本发明的另一个实施方案提供了使用大麦属植物或大麦或大麦提取物及其组合来治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
本发明的另一个实施方案提供了大麦属植物或大麦或大麦提取物及其组合以及它们的药物制剂在治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病中的用途。
本发明的另一个实施方案提供了使用包含大麦属植物或大麦或大麦提取物及其组合的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
本发明的另一个实施方案提供了制备药物制剂的方法，其中所述方法是简单的、经济的、生物友好的和工业上适用的。
本发明的一个优选实施方案提供了大麦属植物或大麦或大麦提取物及其组合的药物制剂，其用于治疗冠状病毒(COVID-19)病。
术语“治疗”及其变化形式等意指包括减缓或逆转疾病或病症的进展。这些术语还包括减轻、改善、减弱、消除或减少疾病或障碍或病症的一种或更多种症状，即使该疾病或障碍或病症实际上没有被消除，以及即使该疾病或障碍或病症的进展本身没有被减缓或逆转。
如上所述，本发明的药物制剂可用于治疗或预防病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病。因此，本发明提供了用于治疗或预防病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的药物制剂。还提供了用于治疗患有或易患病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的患者的方法，其中所述方法包括向所述患者施用有效量的药物制剂。还提供了药物制剂在制备用于治疗或预防病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的药物中的用途。
本发明的一个主要实施方案提供了制备药物制剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将大麦粉与水混合并剧烈搅拌以形成溶液。
b)将步骤(a)的溶液在20℃至40℃的合适温度范围下保持10至20小时的足够时间，以形成另外的溶液。
c)对步骤(b)的溶液在50℃至200℃下进行蒸馏以形成馏出物。
d)将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±5℃的温度下保持1至3小时的持续时间，以形成粗产物。
e)将所述粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂。
f)用碱性溶剂处理步骤(e)的药物制剂以使pH达到碱性水平。
在本发明的另一个实施方案中，大麦粉通过研磨大麦粒获得。
在本发明的另一个实施方案中，所述水是蒸馏水。
在本发明的另一个实施方案中，所述蒸馏水更优选地是双蒸水。
在本发明的另一个实施方案中，大麦粉与水以1:1至1:4的比例混合，优选地以1:2的比例混合。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(b)的合适温度在20℃至30℃的范围内。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(b)的合适温度优选地是27±3℃。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(b)的足够时间是12至17小时。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(b)的足够时间是16小时。
在本发明的另一个实施方案中，蒸馏在60℃至150℃的温度下进行，更优选地在80℃至140℃的温度下进行。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(d)的温度是10±4℃，更优选是10±2℃。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(d)的持续时间是1至2小时的持续时间，更优选地是1小时的持续时间。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(f)的碱性溶剂是1N NaOH。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(f)的pH在7.2至8.0的范围内。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(f)的pH优选地是7.5，更优选地是7.4。
在本发明的又一个实施方案中，药物制剂在治疗病毒感染，或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
本发明的另一个实施方案提供了使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或本发明方法中制备的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
本发明的另一个实施方案提供了本发明方法中制备的药物制剂用于治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的用途。
本发明的又一个实施方案提供了制备药物制剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将大麦粉与双蒸水混合并剧烈搅拌以形成溶液。
b)将步骤(a)的溶液在27±3℃的合适温度范围下保持16小时，以形成另外的溶液。
c)将步骤(b)的溶液在80℃至140℃下进行蒸馏以形成馏出物。
d)将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±2℃的温度下保持1小时，以形成粗产物。
e)将所述粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂。
f)用1N NaOH处理步骤(e)的药物制剂以使pH为7.4。
在本发明的又一个实施方案中，药物制剂在治疗病毒感染，或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
本发明的另一个实施方案提供了使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或本发明方法中制备的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
本发明的另一个实施方案提供了本发明方法中制备的药物制剂用于治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的用途。
本发明的又一个实施方案提供了制备药物制剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将大麦粉与双蒸水混合并剧烈搅拌以形成溶液。
b)将步骤(a)的溶液在27±3℃的合适温度范围下保持16小时，以形成另外的溶液。
c)对步骤(b)的溶液在80℃至140℃下进行蒸馏以形成馏出物。
d)将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±2℃的温度下保持1小时，以形成粗产物。
e)将所述粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂。
在本发明的又一个实施方案中，药物制剂在治疗病毒感染，或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
本发明的另一个实施方案提供了使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或本发明方法中制备的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
本发明的另一个实施方案提供了本发明方法中制备的药物制剂用于治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的用途。
实施例
本发明的范围由本文中公开的以下实施例来举例说明，这并不意味着以任何方式限制本发明的范围。
制备药物制剂的方法：
制备-I
步骤包括：
·通过将大麦粉与水混合来制备溶液。
·将形成的溶液在20℃至40℃的温度范围下保持10至20小时以形成另外的溶液。对另外的溶液在50℃至200℃下进行蒸馏以形成馏出物。
·将馏出物加盖，并将其在10±5℃的温度下保持1至3小时的持续时间，以形成粗产物。将粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂。
·冻干之后的药物制剂为pH 3.5(酸性pH)，通过向制剂中添加1N碱性溶剂，即NaOH(氢氧化钠)来中和而将pH水平调至7.0至7.5的范围内，优选地为7.4。
制备-II
所述方法包括以下步骤：
·将大麦粉与双蒸水混合并剧烈搅拌以形成溶液。
·将步骤(a)的溶液在27±3℃的合适温度范围下保持16小时，以形成另外的溶液。
·对步骤(b)的溶液在80℃至140℃下进行蒸馏以形成馏出物。
·将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±2℃的温度下保持1小时，以形成粗产物。
·将粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂。
临床前研究：
药物制剂的抗病毒筛选在生物技术区域中心进行。在1×10e4 VeroE6细胞中测试药物制剂，并用MOI为0.01的SARS-CoV2感染细胞。在24和48小时之后，从100μl培养上清液中提取病毒RNA并进行qRTPCR(一式两份)，在qRTPCR中确定了N和E基因序列的Ct值。基于与对照相比经TS处理细胞的Ct值的倍数变化来确定对病毒复制的抑制。我们的药物制剂在非常低的1μl剂量(在DMSO中10倍稀释的溶液)下产生超过50％的抑制。
毒性研究测定描述：
根据OECD TG 425(急性经口毒性-上下法(Up-and-Down-Procedure，UDP))在UNIVERSITY INSTITUTE OF PHARMACEUTICAL SCIENCES,PANJAB UNIVERSITY CHANDIGARH-160014,INDIA进行研究。
该测试由单次有序剂量级数组成，其中Wistar大鼠以至少48小时的间隔每次给药一只。第一只wistar大鼠接受的剂量比LD50的最佳估计水平低一级。如果该大鼠存活，则下一只大鼠的剂量提高了初始剂量的3.2倍[因数]；如果该大鼠死亡，则下一只大鼠的剂量降低了类似的剂量级数。(3.2是对应于1/2对数单位的剂量级数的默认因数。)应仔细观察每只大鼠长至48小时，随后决定是否向下一只大鼠给药以及给药多少。该决定基于长至该时间的所有wistar大鼠的48小时存活模式。使用停止标准的组合来保持大鼠的低数目，同时调整给药模式以降低差的起始值或低斜率的影响。当满足这些标准中的一个时，停止给药，此时基于终止时所有大鼠的状态，针对测试计算LD50的估计值和置信区间。
在任何大鼠中并且在所有测试剂量下均未观察到死亡。组织病理学发现：对施用假定/默认LD50的药物制剂的大鼠进行大体病理性变化的观察。未观察到任何严重毒性的明显变化。这种药物制剂的非临床数据是存在的，并且该非临床数据已证明即使在2000mg/kg的高剂量下也非常安全且无毒。
化学、制造和控制数据(chemistry,manufacturing,and controls data，CMC)
·原材料基于农业，其来源于世界各地。
·最终产物是通过新颖的反应(生物技术)获得的。
·原材料的HPGLC指纹确保一致的品质。
·最终产物批次由HPGLC监测。
分析证明：
临床药理学：
该药物制剂经口施用。它吸收良好。如从人的数据中观察到的，它与食物和另一些药物不矛盾，也不产生负面影响。所有血液参数保持正常，并且正在使用用于甲状腺、心脏、糖尿病、神经缺陷、风湿性疾病、止痛药如(Ultracet、曲马多)、肝疾病的药物的患者继续服用该药物制剂以及他们的处方药。通常，无不良作用被报到。如果患者患有便秘，则也可使用轻泻药和抗酸剂(anti-acid)用于胃缓解。它穿过血-脑屏障。在患有肾或肝病的患者中药代动力学没有改变。以上所有信息均基于在患者中进行的临床研究。
安全性
该药物制剂已被施用于12名患者。12名中有7名患有并发症，如高血糖水平和高血压。他们被给予了6至7天的药物，并且在疗程完成之后，他们变成阴性。
SARS-CoV2抗病毒测试
研究1：
本研究的目的是探索和评价药物制剂针对SARS-CoV-2病毒的EC50值。
方法学
对于EC50估计。用SARS-CoV-2感染Vera细胞。在感染之后。分别用不同浓度的药物制剂(2μl/ml、4μl/ml、8μl/ml、12μl/ml)处理细胞，随后在22hpi下收集各自的上清液。
结果
药物制剂针对SARS CoV-2的IC50值为2.536μM。
研究-2：
本研究的目的是评价药物制剂针对SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性。
研究设计
a)使用培养的细胞通过MTT测定来检查细胞毒性。
b)使用最高浓度的具有较低细胞毒性的样品来评价抗病毒作用。
方法学
根据方案进行MTT测定，并采用最高允许的无细胞毒性的浓度来评估其抗SARS活性。
细胞毒性测定：细胞毒性测定将按照用于测定的试剂盒进行。简言之，将Vero E6细胞在80％汇合下接种在96孔板中，并用多种浓度的测试化合物或提取物进行处理。对于毒性确定，将使用至少3个浓度。在处理之后48小时将根据制造商的说明进行MTT测定。每个浓度将一式三份地进行测定，并将相对于载剂对照计算细胞生存力百分比。
抗病毒活性测定：测定将按照常规方案进行，随后用于确定针对SARS-CoV2的抗病毒活性。SAR-CoV2的已知抑制剂将在该测定中用作阳性对照。将在80％汇合下接种在96孔板中的Vero E6细胞用MOI为0.1的SARS-CoV-2分离物感染2小时。随后将吸取接种物，并将含有不同浓度测试化合物/提取物的新鲜培养基添加至细胞。每个浓度将一式三份地进行测定。显示出50％更多的抗SARS-CoV2活性的化合物将被考虑用于IC50确定。IC50将使用至少7个不同浓度来确定。在感染之后24小时，将对上清液和细胞进行病毒RNA分离，随后进行qRT-PCR以用于确定细胞(细胞缔合的)和培养上清液(释放的病毒颗粒)中的SARS-CoV-2病毒载量。qRT-PCR将使用对释放的病毒和细胞缔合病毒二者的病毒刺突、核衣壳和ORF1a具有特异性的引物来进行。将绘制与经载剂处理的对照相比细胞和培养上清液中病毒载量的降低百分比。
该药物制剂产生95％的抑制，这表明其是sars-cov2病毒的非常强的抑制剂。
CoV2-19的体外效力：
对于感染，按照方案用SARS-CoV2-19感染Vera细胞。在感染之后。用12.5μl/ml的药物制剂处理细胞，随后在22hpi下收集各自的上清液。
结果
·MTT测定：药物制剂的最大无毒性剂量在12.5μl/ml下获得(88％生存力)。
·抗病毒测定：发现通过定量实时PCR分析获得的平均Ct值为30.440(与对照相比，降低约95％)。
·仅感染(对照)：平均Ct值为25.730。
COVID-19假病毒测定
试剂和材料
表达ACE2受体的细胞
A549
细胞培养
含10％ FBS和2％青霉素-链霉素的DMEM完全生长培养基
胰蛋白酶
细胞计数器血细胞计数器
U形96孔细胞培养板
含5％ CO2的37℃培养箱
显微镜
移液器、注射器和管
无菌血清学移液器(5ml、10ml和25ml)
微量移液器
多通道微量移液器
微量移液器尖端(10μl、200μl和1000μl)
塑料注射器(1ml)
聚丙烯无菌锥形管(15ml和50ml)
96孔细胞培养板(具有平的透明底部的白色板)
假病毒
含有假病毒rVSV-ΔG-pCAGGS/刺突-萤光素酶的上清液
检测
萤火虫萤光素酶底物
光度计(BioTek synergy HT)
其他
生物安全柜
无菌储存器
水浴
计时器
70％乙醇
Millex GV过滤器单元(亲水性Durapore膜)
药物制剂样品
程序
第0天：培养目的细胞
第1天：接种目的细胞
将每孔20,000个细胞接种在具有平的、透明底部的96孔白色细胞培养板中，在37℃/5％ CO2下持续24小时。
第2天：用产生的rVSV假病毒感染细胞
制备：
首先与假病毒一起孵育：50倍、75倍和250倍最终稀释液。将50倍稀释液调节至pH7.4。
首先与细胞一起孵育：50倍、75倍、100倍和250倍最终稀释液。将50倍和100倍稀释液调节至pH 7.4。
方案
1.)涡旋并离心样品小瓶。
2.)样品首先与假病毒一起孵育。
a.样品的50倍稀释液(pH 7.4)：用1N NaOH中和以达到pH 7.4，并用0.22μM(Millex:Cat#:SLGV004SL)进行过滤。将2.4μL储备溶液与57.6μL DMEM混合。将混合样品添加至96孔板(样品目前为25倍稀释)。将60μL假病毒添加至该板(样品目前为50倍稀释)。
b.样品的75倍稀释液：将1.6μL储备溶液与58.4μL DMEM混合。将混合样品添加至96孔板(样品目前为37.5倍稀释)。将60μL假病毒添加至该板(样品目前为75倍稀释)。
c.样品的250倍稀释液：将0.48μL储备溶液与59.52μL DMEM混合。将混合样品添加至96孔板(样品目前为125倍稀释)。将60μL假病毒添加至该板(样品目前为250倍稀释)。
d.将样品/假病毒混合物在37℃/5％ CO2下孵育1小时。
e.从第1天制备的细胞中移除培养基。将100μL经稀释的样品/假病毒混合物添加至接种有细胞的96孔板。
3.)样品首先与细胞一起孵育。
a.样品的50倍稀释液(pH 7.4)：用1N NaOH中和样品以达到pH 7.4。从第1天制备的细胞中移除培养基。将1.2μL储备溶液与58.8μL DMEM混合。将60μL混合样品添加至96孔板中有细胞的每个孔(样品目前为50倍稀释)。
b.样品的100倍稀释液(pH 7.4)：用1N NaOH中和样品以达到pH7.4。将2.4μL储备溶液与57.6μL DMEM混合。从第1天制备的细胞中移除培养基。将60μL混合样品添加至96孔板中有细胞的每个孔(样品目前为100倍稀释)。
c.样品的75倍稀释液：将0.8μL储备溶液与59.2μL DMEM混合。从第1天制备的细胞中移除培养基。将60μL混合样品添加至96孔板中有细胞的每个孔(样品目前为75倍稀释)。
d.样品的250倍稀释液：将0.24μL储备溶液与59.76μL DMEM混合。从第1天制备的细胞中移除培养基。将60μL混合样品添加至96孔板中有细胞的每个孔(样品目前为250倍稀释)。
e.将样品/细胞混合物在37℃/5％ CO2下孵育1小时。
f.将60μl假病毒添加至孔。
4.)将板在37℃/5％ CO2下孵育1.5小时。
5.)添加100μl预温热的DMEM完全生长培养基。
6.)将板在37℃/5％ CO2下孵育24小时。
样品制备
阴性对照(模拟感染)：
未添加假病毒以解释背景噪音。
第3天：萤光素酶测定
从每个孔中移除200μl的上清液。
向每个孔中添加50μl萤光素酶底物。将板在300至600rpm下摇动3分钟，以裂解细胞并平衡样品。
在光度计中在0.5至1秒的积分时间下测量发光，并记录结果。
第4天：数据分析
1.)背景减除：从所有样品的光密度(optical density，OD)读取中减去“模拟感染”阴性对照重复的平均OD读取。
2.)抑制率(％)：
抑制率＝[(“无样品”阳性对照OD–样品OD)/“无样品”阳性对照OD]×100％
结果：
对于测试的两种假病毒，该制剂抑制假病毒的进入。观察到在较高稀释度下在病毒进入中和活性方面良好的逐步降低，这表明中和作用是真实的。在刺突和非刺突糖蛋白的情况下观察到这种作用，尤其是当制剂首先与假病毒混合时。测试了两种假病毒：刺突和非刺突糖蛋白。样品抑制两种病毒，因此未显示出对刺突的特异性。此外，当样品首先与假病毒一起孵育时，抗病毒特性更有效。
抑制率(％)：99.77％
样品浓度(稀释) 抑制率(％)
首先假病毒(1:75) 99.77681
首先假病毒(1:250) 70.81869
首先假病毒(1:500) 41.6263
首先假病毒(1:1000) 24.28689
首先细胞(1:75) 27.63637
首先细胞(1:250) 15.63776
首先细胞(1:500) 12.64919
首先细胞(1:1000) -0.70757
研究结果在图1中提及：
当样品首先与假病毒一起孵育时，抗病毒特性更有效。在1:75稀释下，化合物产生99.77％抑制率，这证明其是sars-cov2假病毒的强抑制剂。

Claims (26)

1.制备药物制剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将大麦粉与水混合并剧烈搅拌以形成溶液；
b)将步骤(a)的溶液在20℃至40℃的合适温度范围下保持10至20小时的足够时间，以形成另外的溶液；
c)对步骤(b)的溶液在50℃至200℃下进行蒸馏以形成馏出物；
d)将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±5℃的温度下保持1至3小时的持续时间，以形成粗产物；
e)将所述粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂；
f)用碱性溶剂处理步骤(e)的药物制剂以使pH达到碱性水平。
2.权利要求1所述的方法，其中大麦粉通过研磨大麦粒获得。
3.权利要求1所述的方法，其中所述水是蒸馏水。
4.权利要求2所述的方法，其中蒸馏水更优选地是双蒸水。
5.权利要求1所述的方法，其中大麦粉与水以1:1至1:4的比例混合，优选地以1:2的比例混合。
6.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的合适温度在20℃至30℃的范围内。
7.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的合适温度优选地是27±3℃。
8.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述足够时间是12至17小时。
9.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述足够时间是16小时。
10.权利要求1所述的方法，其中蒸馏在60℃至150℃的温度下进行，更优选地在80℃至140℃的温度下进行。
11.权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的温度是10±4℃，更优选地是10±2℃。
12.权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的持续时间是1至2小时的持续时间，更优选地是1小时的持续时间。
13.权利要求1所述的方法，其中步骤(f)的碱性溶剂是1N NaOH。
14.权利要求1所述的方法，其中步骤(f)的pH在7.2至8.0的范围内。
15.权利要求14所述的方法，其中所述pH优选地是7.5，更优选地是7.4。
16.权利要求1所述的方法，其中所述药物制剂在治疗病毒感染、或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
17.使用大麦属植物(Hordeum)或大麦或大麦提取物或权利要求1所述的方法中制备的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
18.权利要求1所述的方法中制备的药物制剂用于治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的用途。
19.制备药物制剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将大麦粉与双蒸水混合并剧烈搅拌以形成溶液；
b)将步骤(a)的溶液在27±3℃的合适温度范围下保持16小时，
以形成另外的溶液；
c)对步骤(b)的溶液在80℃至140℃下进行蒸馏以形成馏出物；
d)将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±2℃的温度下保持1小时，以形成粗产物；
e)将所述粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂；
f)用1N NaOH处理步骤(e)的所述药物制剂以使pH为7.4。
20.权利要求19所述的方法，其中所述药物制剂在治疗病毒感染，或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
21.使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或权利要求19所述的方法中制备的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
22.权利要求19所述的方法中制备的药物制剂用于治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的用途。
23.制备药物制剂的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)将大麦粉与双蒸水混合并剧烈搅拌以形成溶液；
b)将步骤(a)的溶液在27±3℃的合适温度范围下保持16小时，
以形成另外的溶液；
c)对步骤(b)的溶液在80℃至140℃下进行蒸馏以形成馏出物；
d)将步骤(c)中形成的馏出物加盖，并在10±2℃的温度下保持1小时，以形成粗产物；
e)将所述粗产物进一步蒸馏、冻干并稀释至不同浓度以获得最终药物制剂。
24.权利要求23所述的方法，其中所述药物制剂在治疗病毒感染，或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病方面有应用。
25.使用大麦属植物或大麦或大麦提取物或权利要求23所述的方法中制备的药物制剂治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的方法。
26.权利要求23所述的方法中制备的药物制剂用于治疗病毒感染或由相关RNA病毒引起的感染例如COVID-19病的用途。
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