TWI663972B - 3’-甲氧基染料木黃酮於抑制或治療黑色素瘤之用途 - Google Patents

Abstract

本發明有關於一種3’-甲氧基染料木黃酮(3’-methoxygenistein)，或稱5,7,4’-三羥基-3’-甲氧基異黃酮(5,7,4’-trihydroxy-3’-methoxyisoflavone)，於抑制或治療黑色素瘤之用途，藉此3’-甲氧基染料木黃酮可用於製備抑制黑色素瘤細胞增生之醫藥品或保健品。

Description

3’-甲氧基染料木黃酮於抑制或治療黑色素瘤之用途

本發明係有關於一種3’-甲氧基染料木黃酮於抑制或治療黑色素瘤之用途，尤其係指一種由生物轉換得到之甲氧基染料木黃酮衍生物(methoxygenistein derivative)具有抗黑色素瘤細胞增長活性，而可作為抑制或治療黑色素瘤之應用。

人類皮膚黑色素瘤(melanoma)為一種由黑色素細胞(melanocyte)發展而來的惡性皮膚癌症，黑色素瘤細胞具有極高的侵略性，容易轉移至人體各部位，目前仍無有效治療黑色素瘤的藥物或方法，因此如何研創出可有效抑制黑色素瘤增生之活性成分以有效抑制或治療黑色素癌，仍為相關領域之開發重點。

近年來，由於不同結構的大豆異黃酮(soy isoflavones)化合物其生物活性具顯著差異，因此有許多研究紛紛使用基因工程微生物(gene-engineered microorganisms)進行各種大豆異黃酮的修飾(modification)[Int.J.Mol.Sci.2014,15,5699-5716]。舉例而言，由於微生物如細菌類的大腸桿菌(E.coli)或真菌類的畢赤酵母(Pichia pastoris)於生物轉換和規模放大(scale up)程序中皆很容易處理[J.Biotechnol.2015,202,118-134]，因此相關領域研究常使用基因修飾的(genetically-modified)大腸桿菌或畢赤酵母進行異黃酮的生物轉換(biotransformation)，並藉以設計與產生理想的生物轉 換產物。例如有研究利用表現有源自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)酪胺酸酶(tyrosinase)的重組大腸桿菌，於存在硼酸鹽和抗壞血酸下催化大豆黃酮(daidzein)與染料木黃酮(genistein)的鄰位-羥基化(ortho-hydroxylation)[Biotechnol.Bioeng.2016,113,735-743]，且上述生物轉換系統也用於成功地催化大豆異黃酮糖苷(glycoside)，如大豆黃酮糖苷(daidzin)與染料木黃酮糖苷(genistin)的鄰位-羥基化[Molecules 2016,21,1723]。

自然界中常見發生於類黃酮(flavonoid)的兩種修飾作用為羥基化(hydroxylation)和甲基化(methylation)，經修飾後可產生較複雜結構的類黃酮衍生物，甚至可能具有比它們前驅物(precursor)更佳的生物活性(bioactivity)；例如染料木黃酮在30μM~60μM濃度時會促進黑色素細胞加速生成黑色素[J Nutr Biochem 2002；13：421-426]，然而經過生物轉換後之3’-羥基染料木黃酮卻具有低劑量、高效能之皮膚美白效果，與其生物轉換之前驅物具有相反之特性；又例如中華民國專利公告第I555537號已揭示證實鄰位-羥基大豆黃酮(ortho-hydroxydaidzein，OHDe)衍生物，包括6-hydroxydaidzein以及8-hydroxydaidzein具有酪胺酸酶抑制劑的活性，但其前驅物大豆黃酮(daidzein)則不具此活性。

O-甲基轉移酶(O-methyltransferase,OMT)是催化甲氧基異黃酮產生的重要酵素，其作用為將甲基基團(methyl group)，取代受質(substrate)羥基基團(hydroxyl group,-OH group)的氫原子(H)，使之成為甲氧基團(methoxy group,-OCH₃ group)。O-甲基轉移酶廣泛存在於自然界中，目前已知植物或是微生物皆能表現此類酵素。然而，甲氧基異黃酮在自然界的產量仍十分稀少，因此有研究利用生物轉換的方式來製備甲氧基異黃酮；例如美國專利US7432425B2係將源自植物的7-O-甲基轉移酶(7-OMT)基因轉殖 入紫花苜蓿(alfafa)中，此基因轉殖植物便能將大豆黃酮(daidzein)轉換成4’-O-甲基化異黃酮(4’-O-methlated-isoflavonoid)。

目前已知甲氧基異黃酮具有多種功效，如美國專利公告第US 8,742,141 B2號「Inhibition and treatment of prostate cancer metastasis」，揭示5,7,4’-三甲氧基染料木黃酮(5,7,4’-trimethoxygenistein)、7-甲氧基染料木黃酮(7-methoxygenistein)與7,4’-二甲氧基染料木黃酮(7,4’-dimethoxygenistein)具有抑制MEK4 kinase活性，故可抑制或治療前列腺癌轉移；另，美國專利公告第US 7723298 B2號「Cytokine receptor」揭示4-甲氧基染料木黃酮(4-methoxygenistein)或稱鷹嘴豆牙素A(biochanin A)具有抑制酪胺酸酶活性。

由於異黃酮種類繁多，且經過轉換後之異黃酮衍生物其具備的功能不盡相同，若能轉換出更多具有不同生物功能的甲氧基異黃酮或開發其具有的特殊生物活性，將有助於增進異黃酮衍生物應用於保健或醫藥組合物的廣泛性。

今，發明人即是藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種甲氧基染料木黃酮衍生物(methoxygenistein derivative)作為抗黑色素瘤細胞增長之應用，藉以有效抑制或治療黑色素瘤(melanoma)。

本發明提供一種3’-甲氧基染料木黃酮用於製備抑制黑色素瘤之組合物的用途，其係藉由施予一有效劑量3’-甲氧基染料木黃酮於一所需個體，達到抑制黑色素瘤生長；所述抑制黑色素瘤之組合物為抑制黑色素瘤增生之醫藥品或保健品，且組合物可例如進一步包含一藥學上可接受之載劑。

本發明亦提供一種3’-甲氧基染料木黃酮用於治療黑色素瘤之醫藥品的用途，其係藉由施予一有效劑量3’-甲氧基染料木黃酮於一所需個體，達到抑制黑色素瘤生長；所述治療黑色素瘤之醫藥品可例如進一步包含一藥學上可接受之載劑。

於本發明之一實施例中，藥學上可接受之載劑係選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。

於本發明之一實施例中，治療黑色素瘤之醫藥品可例如呈一口服的(orally)藥物劑型或非經腸道(parenterally)的藥物劑型。依據本發明，醫藥品可例如使用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成不同的投藥的劑型，其包括但不限於注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

第一圖：染料木黃酮之UPLC分析圖譜。

第二圖：3’-羥基染料木黃酮之UPLC分析圖譜。

第三圖：未知代謝產物之UPLC分析圖譜。

第四圖：本發明甲氧基異黃酮之生物轉換示意圖。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更 深入且具體之瞭解。

本發明一種3’-甲氧基染料木黃酮於製備抑制或治療黑色素瘤之組合物用途，其係藉由施予一有效劑量3’-甲氧基染料木黃酮於一所需個體，達到抑制黑色素瘤生長。

本文中所使用的術語「施予(administering)」與「投藥」以及「施用(application)」可被交換地使用；另，術語「有效劑量(effective amount)」意指當本發明的醫藥品被投予一需要抑制或治療的個體時，一足以提供所欲達致抑制功效並且不會對個體產生非所欲的不利副作用之較佳安全用量。

藉此，3’-甲氧基染料木黃酮可適用於製備抑制或治療黑色素瘤之組合物以有效抑制黑色素瘤增生，所述組合物可包含醫藥品或保健品，又可進一步包含一藥學上可接受之載劑；較佳而言，載劑可選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。

上述抑制或治療黑色素瘤之醫藥品包括以口服的藥物劑型或非經腸道的藥物劑型，較佳而言，可包括但不限於注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、外部製劑(external preparation)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

簡言之，本發明之具體實施例係先利用表現有源自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)酪胺酸酶(tyrosinase)的重組大腸桿菌進行3’-羥基化作用(3’-hydroxylation)，再利用表現有源自鏈黴菌(Streptomyces peucetius)O-甲基轉移酶(O-methyltransferase)的重組大腸桿菌進行甲基化(methylation)，藉以生物轉換染料木黃酮(genistein)；並且探討生物轉換後的代謝產物(metabolites)對於小鼠黑色素瘤(mouse melanoma)與小鼠正常成纖維細胞(mouse normal fibroblast cells)的抗細胞增殖活性(anti-proliferative activity)情形。

實施例一：製備-甲氧基染料木黃酮

(1)建構重組大腸桿菌以進行染料木黃酮生物轉換作用

〈微生物及材料〉

表現有源自巨大芽孢桿菌(B.megaterium)酪胺酸酶與表現有源自鏈黴菌(S.peucetius)O-甲基轉移酶的重組大腸桿菌係分別根據發明人先前研究Molecules 2016,21,1723或Int.J.Mol.Sci.2015,16,27816-27823所揭示之方式建立；小鼠B16黑色素瘤細胞(mouse B16-F10 melanoma cell)(BCRC 60031)與小鼠正常成纖維細胞(mouse normal fibroblast cells)(BCRC 60203)係由台灣生物資源保存及研究中心(Bioresources Collection and Research Center,BCRC)取得，並依據BCRC流程培養細胞株。染料木黃酮、isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside(IPTG)、二甲基亞碸(DMSO)、S-腺苷甲硫胺酸(SAM)與3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)係購自Sigma公司(St.Louis,MO,USA)；其他的化學物質則購自東京化成工業(Tokyo Chemical Industry,Tokyo)，並且皆為分析試劑等級。

〈製備生物催化劑(biocatalyst)〉

將重組大腸桿菌培養於100mL Luria-Bertani(LB)培養基(含100μg/ml的抗生素ampicillin)內，條件為37℃、180rpm進行培養[參照Molecules 2016,21,1723]，待細菌密度生長至光密度值(OD₆₀₀)達0.6時，加入0.1mM IPTG以誘發基因表現，並將細菌持續置放於18℃的培養槽(incubator)培養24小時；之後，將菌液以5,000rpm、4℃離心，並加入100ml的PBS(pH 6.8)清洗以得到沉澱的細胞團塊(cell pellet)，利用冷凍乾燥機凍乾(lyophilize)細胞團塊。

〈進行羥基化和甲基化的生物轉換作用〉

將200mg染料木黃酮(以100mg/mL溶於DMSO)加入含有500mM硼酸鹽、10mM抗壞血酸(pH 9.0)和20mg凍乾且表現有巨大芽孢桿菌酪胺酸酶的重組大腸桿菌的100mL反應混合物(reaction mixture)，以開始進行3’-羥基化作用；於50℃、200rpm的培養槽進行反應1.5小時，再加入1M HCl(20mL)以中止反應；之後，加入120mL乙酸乙酯以由反應混合物萃取異黃酮，並在真空下乾燥乙酸乙酯分餾物，將得到的373mg乾重物回溶於DMSO(100mg/mL)，並利用超高效液相色譜方法(ultra-performance liquid chromatography，UPLC)進行產物分析。

另將該產物加入含有1mM S-腺苷甲硫胺酸(SAM)和20mg凍乾且表現有鏈黴菌O-甲基轉移酶的重組大腸桿菌的100mL反應混合物以開始進行進一步的甲基化作用；於40℃、200rpm的培養槽進行反應24小時；之後，加入100mL乙酸乙酯以由反應混合物萃取異黃酮，並在真空下乾燥乙酸乙酯分餾物，將得到的乾重物回溶於100ml甲醇(50%(v/v))，再利用UPLC進行產物分析並將產物進行純化。

(2)利用UPLC進行產物分析

將收集的混合液利用配備有分析型C18逆向管柱(C18 reversed-phase column)(Acquity UPLC BEH C18,1.7μm,2.1mm i.d.×100mm,Waters)超高效液相色譜(UPLC)系統(Acquity UPLC H-Class,Waters,Milford,MA,USA)進行產物分析；分析的操作條件係包括：利用含有1%(v/v)醋酸(acetic acid)的水溶液A與甲醇溶液B梯度沖提(gradient elution)9分鐘，以及線性梯度(linear gradient)35%至80%的溶液B沖提1分鐘，流速為0.3毫升/分鐘，注入體積為0.2μL；並以吸光值260nm偵測。

第一圖~第三圖分別為染料木黃酮、3’-羥基染料木黃酮與未知代謝產物(化合物1、2)之UPLC分析圖譜；由第一圖與第二圖顯示染料木黃酮與3’-羥基染料木黃酮分別於滯留時間8.34分鐘和6.42分鐘出現；第三圖顯示生物轉換後的兩個主要代謝產物化合物1和化合物2，其滯留時間分別為8.52和8.81分鐘。進一步採用製備型高效液相色譜方法(preparative HPLC)將兩種代謝產物分離，並利用分光光度法(spectrophotometric method)鑑定產物。

(3)純化並利用HPLC鑑定生物轉換後的代謝產物

將生物轉換後的最終反應混合物(回溶於100ml、50%甲醇)以10,000rpm離心，再利用0.22μm尼龍膜於真空下過濾純化以得到一濾液；將濾液注入配備有製備型C18逆向管柱(C18 reversed-phase column)(Inertsil,10μm,20.0mm i.d.×250mm,ODS 3,GL Sciences,Eindhoven,The Netherlands)的製備型HPLC系統(preparative YoungLin HPLC system)(YL9100,YL Instrument,Gyeonggi-do,Korean)，以純化生物轉換作用的產物。

進行製備型HPLC分析的操作條件與UPLC相同，收集對應於UPLC分析中相同峰(peak)的沖提液(elution)，於真空下濃縮並冷凍乾燥結晶；最後得到27.9mg的化合物1與33.3mg的化合物2，利用NMR和質譜分析確認結晶物的化學結構。利用配備有電 噴霧離子化(electrospray ionization)的Finnigan LCQ Duo質譜儀(ThermoQuest Corp.,San Jose,CA,USA)進行質譜分析。¹H-和¹³C-NMR、異核多量子相關譜(heteronuclear multiple quantum coherence，HMQC)、多鍵異核相關譜(Heteronuclear multiple bond connectivity，HMBC)、核歐佛豪瑟效應頻譜(Nuclear Overhauser effect spectroscopy，NOESY)與對比光譜(correlation spectroscopy，COSY)光譜係利用AV-700 NMR spectrometer(Bruker Corp.,Billerica,MA,USA)於環境溫度下紀錄，標準脈衝序列和參數皆使用於NMR實驗，並且所有化學位移以每百萬分之幾(ppm，δ)呈現。

化合物1在對應於分子式C₁₆H₁₂O₆的電噴霧離子化質譜(ESI-MS)光譜中m/z：301處顯示[M+H]⁺離子峰，並且進行¹H和¹³C NMR以確認結構；¹H和¹³C NMR的訊號係根據HMQC、HMBC、NOESY以及COSY進行確認。由HMBC光譜顯示δ 3.79(s)處的甲氧基質子信號與δ 147.3(C-3’)處的碳共振相關，且NOESY光譜顯示距離約介於δ 3.79(s)處與δ 7.13(d,H-2’)處的質子之間。

獲得的數據如下，化合物1：¹H-NMR(DMSO-d ₆)δ：8.34(1H,s,H-2),7.13(1H,d,J=2.1Hz,H-2’),6.98(1H,d,J=8.1,2.1Hz,H-6’),6.82(1H,d,J=8.1,H-5’),6.37(1H,d,J=2.2Hz,H-8),6.21(1H,J=2.2Hz,H-6),3.79(3H,s,MeO-3’)；¹³C-NMR(DMSO-d ₆)：180.1(C-4),164.8(C-7),162.0(C-5),157.6(C-9),154.1(C-2),147.3(C-3’),146.7(C-4’),122.3(C-3),121.7(overlap,C-1’,C-6’),115.3(C-5’),113.3(C-2’),104.3(C-10),99.1(C-6),93.8(C-8),55.7(OCH₃)；根據¹H和¹³C NMR之數據，並參考文獻J.Nat.Prod.1999,62,1609-1612，得知化合物1為 5,7,4’-三羥基-3’-甲氧基異黃酮(5,7,4’-trihydroxy-3’-methoxyisoflavone)，或稱3’-甲氧基染料木黃酮(3’-methoxygenistein)。

化合物2在電噴霧離子化質譜(ESI-MS)光譜中m/z：301處顯示[M+H]⁺離子峰，並且進行¹H和¹³C NMR以確認結構；由HMBC光譜顯示δ 3.79(s)處的甲氧基質子信號與δ 157.4(C-4’)處的碳共振相關，且NOESY光譜顯示距離約介於δ 3.79(s)處與δ 7.02(d,H-5’)處的質子之間。

化合物2：¹H-NMR(DMSO-d ₆)δ：8.28(1H,s,H-2),7.02(1H,d,J=2.1Hz,H-2’),6.96(1H,d,J=8.3,H-5’),6.93(1H,dd,J=8.3,2.1Hz,H-6’),6.32(1H,d,J=2.1Hz,H-8),6.17(1H,d,J=2.1Hz,H-6),3.79(3H,s,MeO-4’)；¹³C-NMR(DMSO-d ₆)δ：179.9(C-4),165.8(C-7),162.0(C-9),157.7(C-2),154.0(C-4’),146c.1(C-3’),123.5(C-1’),122.0(C-3),119.8(C-6’),116.4(C-2’),112.0(C-5’),103.9(C-10),99.4(C-6),93.9(C-8),55.7(OCH₃)；根據¹H和¹³C NMR之數據，並參考文獻Magn.Reson.Chem.2008,46,103-106，得知化合物2為5,7,3’-三羥基-4’-甲氧基異黃酮(5,7,3’-Trihydroxy-4’-methoxyisoflavone)。

結果顯示，利用表現有源自巨大芽孢桿菌酪胺酸酶以及表現有源自鏈黴菌O-甲基轉移酶的重組大腸桿菌，可藉由羥基化與甲基化方式將染料木黃酮(genistein)生物轉換成5,7,4’-trihydroxy-3’-methoxyisoflavone和5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxyisoflavone，如第四圖所示。

實施例二：檢測甲氧基染料木黃酮對於細胞存活率(cell viability)之影響

此實驗係參照Int.J.Mol.Sci.2015,16,27816-27823，將 小鼠B16黑色素瘤細胞或正常成纖維細胞，分別利用含有10%(v/v)胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)之DMEM(Dulbecco’s modified Eagles medium)培養基，於37℃、5%二氧化碳之培養槽中培養24小時；接著，將不同劑量且不同的測試藥物分別加入細胞並培養48小時，再收集藥物處理的細胞並量測其細胞存活率；其中控制組為無添加藥物之對照組。

結果請參閱表一，「*」代表經student’s t-test分析後相較於控制組具統計上顯著差異(p<0.05)，與控制組相較下，所有測試藥物中，5,7,4’-三羥基-3’-甲氧基異黃酮(化合物1)對於B16黑色素瘤細胞具有最強的細胞毒殺性，其IC₅₀值為68.1μM，故5,7,4’-三羥基-3’-甲氧基異黃酮具有極佳的抗黑素瘤活性(anti-melanoma activity)。

為了評估抗黑色素瘤活性是否具有選擇性(selectivity)，使用正常小鼠成纖維細胞再次進行細胞毒性實驗。結果請參閱表二，「*」 代表經student’s t-test分析後相較於控制組具統計上顯著差異(p<0.05)，與控制組相較下，5,7,4’-三羥基-3’-甲氧基異黃酮(化合物1)對於正常小鼠成纖維細胞並無細胞毒殺性，即使是濃度350μM亦無細胞毒性。

由表一與表二亦可得知，生物轉換的前驅物染料木黃酮對於B16黑色素瘤細胞雖然具有毒殺作用(IC₅₀值為70.3μM)，但高濃度的染料木黃酮對於正常成纖維細胞亦具有些微細胞毒殺作用；另，5,7,3’-三羥基-4’-甲氧基異黃酮(化合物2)對於B16黑色素瘤細胞雖然亦具有細胞毒殺性，但對於正常成纖維細胞的細胞毒殺性亦很高，因此並不適用於作為抑制黑色素瘤細胞增生之藥物。

由上述之實施說明可知，本發明證實5,7,4’-三羥基-3’-甲氧基異黃酮，或稱3’-甲氧基染料木黃酮在無細胞毒性的作用濃度下，可有效抑制黑色素瘤細胞增生，故為可應用於醫藥用品業、生技醫療業，藉以解決黑色素癌難以治療的問題。

綜上所述，本發明之3’-甲氧基染料木黃酮於抑制或治療黑色素瘤之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，誠已符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims (5)

1. 一種3’-甲氧基染料木黃酮(3’-methoxygenistein)用於製備抑制黑色素瘤(melanoma)之組合物的用途。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抑制黑色素瘤之組合物係抑制黑色素瘤增生之醫藥品或保健品。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抑制黑色素瘤之組合物係進一步包含一藥學上可接受之載劑。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該藥學上可接受之載劑係選自於一或多種由溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體所構成之群組中的試劑。
5. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該醫藥品係呈一口服的藥物劑型或非經腸道的藥物劑型。