KR101966882B1 - 신규한 제니스테인 글리코시드 유도체, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 제니스테인 글리코시드 유도체, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 다양한 제니스테인 유도체들의 제조가 가능하고, 상기 신규한 제니스테인 유도체는 항암활성 및 향상된 물 용해성을 가지므로 의약 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항암활성을 가지며, 향상된 물 용해성을 가지는 제니스테인 글리코시드 유도체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 신규한 제니스테인 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염, 이를 포함하는 암질환 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
플라보노이드는 식물에 존재하는 저분자 폴리페놀릭 화합물로, 식물체를 포식자나 병원균, 자외선으로부터 보호하는 역할을 하고(Dixon et al., Mol. Plant Pathol ., 3:371, 2002), 식물의 성장과 발달에 있어 중요한 역할을 한다(Frick et al., Phytochem ., 56:1, 2001). 또한, 라디칼제거, 항염증, 항돌연변이, 항에이즈, 항알레르기, 항혈소판, 산화방지, 항신경퇴화 활성을 포함하는 몇몇의 생물학적 활성을 가지고 있어, 만성질병 예방효과를 나타낸다(Manach et al., Curr . Opin . Lipidol ., 16:77, 2005; Heo and Lee, J. Agric . Food Chem ., 53:1445, 2005; Heo and Lee, J. Agric . Food Chem., 52:7514, 2004; Mojzisova and Kuchta, Physiol. Res, 50:529, 2001; Middleton et al., Pharmacol. Rev., 52:673, 2000).
플라보노이드에 의해 나타나는 기능적 다양성은 플라본 중심에 있는 수산기에 글루코실트랜스페라아제, 메틸전이효소, 프레닐전달효소, 설포트랜스페라아제와 같은 다양한 수산화효소에 의해 발생되는 핵심 구조의 변형에 의한 것이다(Martens et al., Phytochem., 71:1040, 2010; Prescott et al., Annual Rev Plant Physiol Plant Mol . Biol., 47:245, 1996). 페놀릭 화합물의 생물학적 역할은 플라보노이드 복합체에 붙는 작용기의 타입과 위치에 따라 규정되며 반응성과, 용해성, 그리고 다른 화학 물질이나 단백질 구조와 상호작용하는 능력을 변화시킨다(Buer et al., J. Integr. Plant Biol., 52:98, 2010).
이소플라보노이드(isoflavonoids)는 플라보노이드의 서브그룹에 속해 있으며, 식물에 의해 2차 대사산물(metabolities)로 생산되며, 이의 15-탄소(C6-C3-C6) 백본(backbone)이 1,2-diphenylpropane 골격으로 정렬되어 있다. 이소플라보노이드는 대두(Soybeans) 및 기타 콩과(leguminous) 식물에 주로 포함되어 있으며, Iris(Iridaceae), Prunus(Rosaceae), Podocarpus(Podocarpaceae), Maclura(Moraceae), 및 Iresine(Amaranthaceae)에 존재하는 것으로 알려져 있다(Ollis WD, Pergamom Press LTD, Oxford pp, 353-399, 1962; Lapcik O et al., Plant Sci, 148:111-119, 1999).
일부 이소플라보노이드는 미생물에 존재하는 것으로 밝혀진 바 있으며(Matthies A et al., Appl Envrion Microbiol, 74:1847-1852, 2008), 이들은 식물-미생물간 상호작용시 피토알렉신(phytoalexins)을 형성시키는 전구체로서 중요한 기능을 수행한다(Aoki T et al., J Plant Res, 113:475-488, 2000). 이소플라보노이드의 대사는 고정된 탄소가 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)를 통해서 개시된다. 몇가지의 효소과정을 거친 후 페놀 화합물(phenolic compounds) 및 이소플라보노이드가 생성된다(Weisshaar B et al., Curr Opin Plant Biol, 1:251-257, 1998).
이소플라보노이드인 제니스타인(Genistein)은 에스트로겐 활성(estrogenic activity)을 일부 동물 모델에서 나타내므로 일반적으로 피토에스트로겐(phytoestrogens)으로 알려졌다. 따라서, 갱년기 여성의 에스트로겐 결핍증의 부작용을 경감을 위한 약물 및 예방제로서 연구되고 있다(Yan GR et al., Proteomics, 10:976-986, 2010). 또한, 단백질 티로신 키나아제(G2/M 저지 및 세포 자살을 유도)(Mizushina Y et al., Int . J. Oncol. 43:1117-1124, 2013), 토포아이소머레이즈 II(topoisomerase II)(Schmidt F et al., Oncol . Rep, 19:1061-1066, 2008; Weigt C et al., J. Steroid Biochem . Mol . Biol, 154:12-22, 2015), 포스파티딜이노시톨 턴오버(Schmidt F et al., Oncol . Rep, 19:1061-1066, 2008)를 포함하는 효소들, 에스트로겐 수용체(Weigt C et al., J. Steroid Biochem . Mol . Biol , 154:12-22, 2015) 및 ABC 수송(Boqush TA et al., Antibiot . Khimioter, 48:11-15, 2003) 같은 생물학적 타겟을 포함하는 살아있는 세포의 생화학 경로에서 억제 작용이 밝혀져 있다.
제니스테인은 잠재적인 의약품으로 사용할 수 있는 생물학적 활성을 나타내지만, 다양한 분야에서 응용하기 위하여 많은 제니스테인의 유도체가 생합성되었다. 그러나 제니스테인은 낮은 수용성과 생물학적 이용가능성에 관한 문제점을 가지고 있다(Yang Z et al., Anticancer Agents Med Chem, 12:1264-1280, 2012; Zhang H et al., Int . J. Nanomedicine, 10:2461-2473, 2015). 문제점을 극복하기 위하여, 제니스테인의 유도체는 글리코실화, 메틸화, 수산화, 프레닐화(prenylation) 및 아실화와 같은 효소의 후 변형 또는 치료상의 효과를 증진시키기 위한 생분해성 나노 입자의 제조를 포함하는 화학적 접근법을 이용하여 제조된다(Zhang H et al., Int . J. Nanomedicine , 10:2461-2473, 2015; Rusin A et al., Acta . Biochem . Pol, 57:23-34, 2010; Cress BF et al., Springer, New York, NY., Doi: 10.1007/978-3-642-22144-6_53, 2013). 탈로신(talosins)(탈로오스 당이 컨쥬게이션된 제니스테인)(talosin A 및 B)과 같은 글리코실화된 유도체는 항균 활성과 같은 추가적인 효능이 있다고 밝혀졌다(Yoon TM et al., J. Antibiot .(Tokyo), 59:633-639, 2006). 식물에서, 제니스테인은 아실화, 말로닐화된 글리코시드 형태로 존재한다. 핵심 골격 외에도, 다른 변형된 그룹(아세틸기, 말로닐기, 글루코실기)은 생물학적 이용가능성을 향상시킨다(Miadokova E, Interdiscip . Toxicol , 2:211-218, 2009). 예를들어, 제니스테인 글루코피라노사이드 등은 아글리콘과 비교해서 더 향상된 생물학적 이용가능성을 가진다(Steensma A et al., J. Agric . Food Chem, 54:8006-8012, 2006). 또한, 4-하이드록실 그룹이 에피머화된 dTDP-α-L-람노오스의 유사체인 탈로스가 결합된 제니스테인인 탈로신은 항진균 활성을 나타낸다(Yoon TM et al., J. Antibiot .(Tokyo), 59:633-639, 2006). 많은 세균성 천연물은 고도로 변형되고 특이적인 데옥시당 잔기를 포함하고 있으며, 이것은 종종 생물학적 활성에 중요하지만 식물 이차 대사 물질에서 흔한 것은 아니다(Thibodeaux CJ et al., Nature, 446:1008-1016, 2007; Whit-Phillip J et al., Methods Enzymmol , 459:521-544, 2009). 따라서, 천연물에서 당 부분의 결합은 핵심 생물학적 활성에 다른 영향을 줄 수 있다.
이에, 본 발명자들은 잠재적인 의약품으로 사용할 수 있는 생물학적 활성을 나타내면서 향상된 수용성과 생물학적 이용가능성을 가지는 제니스테인 글리코시드 유도체를 만들고자 예의 노력한 결과, 신규한 제니스테인 글리코시드 유도체를 제조하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 항암활성을 가지며, 향상된 물 용해성을 가지는 제니스테인 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제니스테인 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제니스테인 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
[화학식 1]
화학식 1에서, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소원자, β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(β-2-deoxy-D-glycopyranoside), O-메틸람노피라노시드(O-methyl rhamnopyranoside), α-L-람노피라노시드(α-L-rhamnopyranoside) 또는 β-D-글루코피라노시드(β-D-glucopyranoside)임.
본 발명은 또한, (a) 글리코실전달효소 또는 당-O-메틸전이효소 존재 하에 제니스테인(Genistein)과 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스 또는 dTDP-L-람노오스를 반응시켜 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 회수하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 글리코실전달효소(GT)를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체 또는 당-O-메틸전이효소(SOMT)를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체를 제니스테인(Genistein)과 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스 또는 dTDP-L-람노오스를 반응시켜 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 회수하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따르면 다양한 제니스테인 유도체들의 제조가 가능하고, 본 발명의 신규한 제니스테인 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 항암활성 및 향상된 물 용해성을 가지므로 의약 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 생물전환 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그래피 및 UV 흡광도를 분석한 결과를 나타낸 것이다; A) AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그래피 및 UV 흡광도를 분석한 결과이다(●: 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(genistein-7-O-β-D-glucopyranoside), 
: 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside), ○: 제니스테인). B) SpnK와 함께 AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그래피 및 UV 흡광도를 분석한 결과이다(
: 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genestein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)). C) SpnH 및 AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그래피 및 UV 흡광도를 분석한 결과이다(
: 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)). D) YjiC에 의해 촉매된 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그래피 및 UV 흡광도를 분석한 결과이다(●: 제니스테인-4′,7-β-D-디글루코피라노시드(genistein-4′,7-β-D-diglucopyranoside), 
: 제니스테인-7-β-D-글루코피라노시드(genistein-7-β-D-glucopyranoside), ▲: 제니스테인-4′-β-D-글루코피라노시드(genistein-4′-β-D-glucopyranoside)). E) YjiC에 의해 촉매된 시험관 내(in vitro) 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그래피 및 UV 흡광도를 분석한 결과이다(●: 제니스테인-4′,7-β-2-데옥시 D-디글루코피라노시드(genistein-4′,7-β-2-deoxy D-diglucopyranoside), 
: 제니스테인-7-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드(genistein-7-β-2-deoxy D-glucopyranoside), ▲: 제니스테인-4′-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드).
도 2는 재조합 균주(strain-1, strain-2, strain-3 및 strain-4)를 배양하여 생산한 제니스테인 글리코피라노사이드의 양에 관한 데이터를 나타낸 것이다.
도 3은 제니스테인 및 제니스테인 글리코피라노사이드 유도체의 상대적 물 용해도에 관한 데이터를 나타낸 것이다.
도 4는 네 가지 암 세포주(AGS: 위암 세포, B16F10: 피부암 세포, HeLa: 자궁 경부암 세포 및 HepG2: 간암 세포)에 대한 제니스테인 유도체의 항암 활성을 MTT 에세이를 이용하여 확인한 결과이다; A) 다른 농도(1.56μM ~ 50μM)의 암세포주에 제니스테인 유도체(2: 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드, 3: 제니스테인-7-O-3″-O-α-L-람노피라노시드, 4: 제니스테인-7-O-4″-O-α-L-람노피라노시드 및 1: 제니스테인)를 처리한 결과를 나타낸 것이고, B) 여러 농도(0.31μM ~ 10μM)의 암세포주에 제니스테인 유도체(11: 제니스테인-4′, 7-O-β-2-데옥시 D-디글루코피라노시드, 9: 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드, 8: 제니스테인-7-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드 및 1: 제니스테인)를 처리한 결과를 나타낸 것이고, C) 여러 농도(3.12μM ~ 100μM)의 암세포주에 제니스테인 유도체(6: 제니스테인-4′, 7-O-β-D-디글루코피라노시드, 7: 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드, 5: 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드 및 1: 제니스테인)를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 SpnH 및 SpnK의 PCR 증폭을 전기영동으로 확인한 결과이며(왼쪽: SpnH, 오른쪽: SpnK), 5b는 SpnH 유전자 및 SpnK 유전자를 연결한 pGEM -T 이지 벡터에 제한효소를 처리한 결과를 전기영동으로 확인한 결과이고, 5c는 SpnH 유전자 및 SpnK 유전자를 연결한 발현벡터 pET32a에 제한효소를 처리한 결과를 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 6은 당-O-메틸 전이효소(SpnH, SpnK) 단백질의 가용성 부분을 SDS-PAGE을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 글리코실전달효소(GT)와 당-O-메틸 전이효소(SOMT)로 촉매된 반응 혼합물을 HRQTOF ESI/MS 분석한 결과를 나타낸 것이다; A) 및 B) AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, C) SpnK와 동시 발현된 AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, D) SpnH와 동시 발현된 AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, E), F) 및 G) YjiC에 의해 촉매된 in vivo 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, H) I) J) 및 K) YjiC에 의해 촉매된 in vitro 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이다.
도 8a는 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 8b는 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 8c는 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9a는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 9b는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 9c 및 도 9d는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10a는 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 10b는 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 10c 및 도 10d는 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11a는 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 11b는 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 11c 및 도 11d는 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12a는 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 12b는 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 12c는 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13a는 제니스테인-4′-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 13b는 제니스테인-4′-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 13c는 제니스테인-4′-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14a는 제니스테인-7-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 14b는 제니스테인-7-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 14c는 제니스테인-7-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 15a는 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-deoxy-D-diglucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 15b는 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-deoxy-D-diglucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 15c 및 도 15d는 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-deoxy-D-diglucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 16a는 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 16b는 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 16c 및 도 16d는 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 17a는 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 17b는 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 17c 및 도 17d는 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 18은 제니스테인 유도체와 항진균제 나이스타틴 A1(Nystatin A1)의 항 진균 활성을 비교한 결과이다(1: 제니스테인, 2: 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside), 3: 제니스테인-7-O-3″-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-α-L-rhamnopyranoside), 4: 제니스테인-7-O-4″-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-α-L-rhamnopyranoside), 5: 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside), 6: 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside), 7: 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-D-glucopyranoside), 8: 제니스테인-7-O-β-D-2-데옥시-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-2-deoxy-glucopyranoside), 9: 제니스테인-4′-O-β-D-2-데옥시-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-D-2-deoxy-glucopyranoside), 11: 제니스테인-4′,7-O-β-D-2-데옥시-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-D-2-deoxy-diglucopyranoside)).
도 2는 재조합 균주(strain-1, strain-2, strain-3 및 strain-4)를 배양하여 생산한 제니스테인 글리코피라노사이드의 양에 관한 데이터를 나타낸 것이다.
도 3은 제니스테인 및 제니스테인 글리코피라노사이드 유도체의 상대적 물 용해도에 관한 데이터를 나타낸 것이다.
도 4는 네 가지 암 세포주(AGS: 위암 세포, B16F10: 피부암 세포, HeLa: 자궁 경부암 세포 및 HepG2: 간암 세포)에 대한 제니스테인 유도체의 항암 활성을 MTT 에세이를 이용하여 확인한 결과이다; A) 다른 농도(1.56μM ~ 50μM)의 암세포주에 제니스테인 유도체(2: 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드, 3: 제니스테인-7-O-3″-O-α-L-람노피라노시드, 4: 제니스테인-7-O-4″-O-α-L-람노피라노시드 및 1: 제니스테인)를 처리한 결과를 나타낸 것이고, B) 여러 농도(0.31μM ~ 10μM)의 암세포주에 제니스테인 유도체(11: 제니스테인-4′, 7-O-β-2-데옥시 D-디글루코피라노시드, 9: 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드, 8: 제니스테인-7-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드 및 1: 제니스테인)를 처리한 결과를 나타낸 것이고, C) 여러 농도(3.12μM ~ 100μM)의 암세포주에 제니스테인 유도체(6: 제니스테인-4′, 7-O-β-D-디글루코피라노시드, 7: 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드, 5: 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드 및 1: 제니스테인)를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 SpnH 및 SpnK의 PCR 증폭을 전기영동으로 확인한 결과이며(왼쪽: SpnH, 오른쪽: SpnK), 5b는 SpnH 유전자 및 SpnK 유전자를 연결한 pGEM -T 이지 벡터에 제한효소를 처리한 결과를 전기영동으로 확인한 결과이고, 5c는 SpnH 유전자 및 SpnK 유전자를 연결한 발현벡터 pET32a에 제한효소를 처리한 결과를 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 6은 당-O-메틸 전이효소(SpnH, SpnK) 단백질의 가용성 부분을 SDS-PAGE을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 글리코실전달효소(GT)와 당-O-메틸 전이효소(SOMT)로 촉매된 반응 혼합물을 HRQTOF ESI/MS 분석한 결과를 나타낸 것이다; A) 및 B) AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, C) SpnK와 동시 발현된 AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, D) SpnH와 동시 발현된 AtUGT89C1에 의해 촉매된 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, E), F) 및 G) YjiC에 의해 촉매된 in vivo 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이고, H) I) J) 및 K) YjiC에 의해 촉매된 in vitro 반응 혼합물의 질량 분석을 나타낸 것이다.
도 8a는 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 8b는 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 8c는 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9a는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 9b는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 9c 및 도 9d는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10a는 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 10b는 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 10c 및 도 10d는 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11a는 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 11b는 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 11c 및 도 11d는 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12a는 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 12b는 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 12c는 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13a는 제니스테인-4′-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 13b는 제니스테인-4′-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 13c는 제니스테인-4′-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14a는 제니스테인-7-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 14b는 제니스테인-7-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 14c는 제니스테인-7-O-β-2-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 15a는 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-deoxy-D-diglucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 15b는 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-deoxy-D-diglucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 15c 및 도 15d는 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-deoxy-D-diglucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 16a는 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 16b는 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 16c 및 도 16d는 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 17a는 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 17b는 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 도 17c 및 도 17d는 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 18은 제니스테인 유도체와 항진균제 나이스타틴 A1(Nystatin A1)의 항 진균 활성을 비교한 결과이다(1: 제니스테인, 2: 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside), 3: 제니스테인-7-O-3″-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-3″-O-α-L-rhamnopyranoside), 4: 제니스테인-7-O-4″-O-α-L-람노피라노시드(Genistein-7-O-4″-O-α-L-rhamnopyranoside), 5: 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside), 6: 제니스테인-4′,7-O-β-2-D-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-2-D-diglucopyranoside), 7: 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-D-glucopyranoside), 8: 제니스테인-7-O-β-D-2-데옥시-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-2-deoxy-glucopyranoside), 9: 제니스테인-4′-O-β-D-2-데옥시-글루코피라노시드(Genistein-4′-O-β-D-2-deoxy-glucopyranoside), 11: 제니스테인-4′,7-O-β-D-2-데옥시-디글루코피라노시드(Genistein-4′,7-O-β-D-2-deoxy-diglucopyranoside)).
본 발명에서는 생물전환 반응을 통하여 신규한 제니스테인 유도체를 제조하였으며(도 1), 상기 유도체들은 항암활성, 향상된 물 용해성 및 향상된 생물학적 이용 가능성을 가지는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염에 관한 것이다.
[화학식 1]
화학식 1에서, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소원자, β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(β-2-deoxy-D-glycopyranoside), O-메틸람노피라노시드(O-methyl rhamnopyranoside), α-L-람노피라노시드(α-L-rhamnopyranoside) 또는 β-D-글루코피라노시드(β-D-glucopyranoside)임.
본 발명에 있어서 상기 제니스테인 글리코시드 유도체는 화학식 2 내지 화학식 11로 구성된 군에서 선택되는 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 한다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
본 발명은 다른 관점에서, (a) 글리코실전달효소 또는 당-O-메틸전이효소 존재 하에 제니스테인(Genistein)과 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스 또는 dTDP-L-람노오스를 반응시켜 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 회수하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 상기 (a) 단계의 글리코실전달효소는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 하며, 당-O-메틸전이효소는 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa) NRRL 18395 유래인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 (a) 단계의 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스는 원-포트 효소 반응에 의해 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 글리코실전달효소(GT)를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체 또는 당-O-메틸전이효소(SOMT)를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체를 제니스테인(Genistein)과 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스 또는 dTDP-L-람노오스를 반응시켜 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 회수하는 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 상기 (a) 단계의 글리코실전달효소(GT)는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 하며, 당-O-메틸전이효소(SOMT)는 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa) NRRL 18395 유래인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 당-O-메틸전이효소(SOMT)는 SpnK 및 SpnH인 것을 특징으로 하며, 상기 SpnK는 당-3'-O-메틸전이효소(sugar-3'-O-methyltransferase)이며, 상기 SpnH는 당-4'-O-메틸전이효소(sugar-4'-O-methyltransferase)이다.
본 발명의 상기 (a) 단계의 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스는 원-포트 효소 반응에 의해 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 위암, 피부암, 자궁 경부암 또는 간암인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위용량의 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기의 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 아카시아 고무, 인산칼슘, 젤라틴, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸하이드록시벤조에이트, 활석, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 파라옥시안식향산메틸, 솔빈산칼륨 등과 같은 방부제, 안정화제, 매실향, 레몬향 등의 천연향료, 클로로필린 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 설탕 등과 같은 감미료, 염료, 항-산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여의 경우에는 복강주입, 정맥내 주입, 피하주입, 근육주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 위암, 피부암, 자궁 경부암 또는 간암인 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 화학제 및 균주 준비
화학제 및 시약의 준비
제니스테인은 SigmaAldrich(세인트 루이스, 모건 오닐, 미국)에서 구매하였으며, dTDP-α- 2-데옥시-D-글루코스는 원 포트 효소접근법으로 합성하여 사용하였다.
PCR, 배양 조건, 플라스미드 및 재조합 균주
재조합 플라스미드의 클로닝 및 증식을 위하여 대장균 Escherichia coli XL-1 blue (MRF) (Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 재조합 플라스미드는 제한효소 분해 및 시퀀싱으로 확인하였고, 단백질 발현과 생물전환을 위하여 E. coli BL21 (DE3)을 사용하였다. 중합효소 연쇄반응(PCR) 조각을 클로닝하고 시퀀싱하기 위하여 pGEM -T 이지 벡터 시스템(Promega, 미국)을 사용하였다. 재조합 플라스미드 제조 및 단백질 발현을 위하여, pET41b(+), pET28a(+) 및 pET32a(+)(Novagen, 독일)을 사용하였다. pET 41b-AtUGT89C1 및 pET28a-YjiC는 미리 클로닝하여 준비하였다. SOMTs spnH(GeneBank 기탁번호: AAG23269) 및 spnK (GeneBank 기탁번호: AAG23272)는 S. spinosa의 총 DNA로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다: 제한 부위 EcoRI/HindIII를 포함하는 spnK forward F: 5-AAGCTTATGTCCACAACGCACGAG-3 및 reverse R: 5-GAATTCTCACTCGTCCTCCGCGCT-3 및 제한 부위 EcoRV/NdeI를 포함하는 spnH forward F: 5-CATATGATGCCCTCCCAGAACGCG-3 및 reverse R: 5-GATATCTCACCAGCTGCGGCGCCA-3이다. 대장균은 적절한 양의 항생제(100μg/mL의 암피실린(ampicillin) 및 50μg/mL의 카나마이신(kanamycin))가 공급된 아가배지 또는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 배양하였다. 생물전환 에세이를 위하여 LB 액체 배지를 사용하였다.
재조합 플라스미드 및 균주는 표 1 및 표 2에 나타내었다.
| 재조합 균주 | 설명 | 균주 번호 | 출처 |
| E. coli Bl21 (DE3) | ompT hsdT hsdS (rB-mB-) gal (DE3) | Novagen | |
| E. coli BL21 (DE3)/pET41b-AtUGT89C1 | BL21(DE3) carrying pET41b-AtUGT89C1 | 균주-1 |
Kim HJ et al., . J. Am. Chem . Soc. 132:2901-2903, 2010 |
| E. coli BL21 (DE3)/pET28a-YjiC | BL21(DE3) carrying pET28a-YjiC | 균주-2 | Popper AZ et al., Biochem . Syst. Ecol . 32:279-289, 2004 |
| E. coli BL21 (DE3)/ pET32a | BL21(DE3) carrying pET32a | 본 발명 | |
| E. coli BL21 (DE3)/p41b-AtUGT89C1 and pET32a-SpnK | BL21(DE3) carrying p41b-AtUGT89C1 및 pET32a-SpnK | 균주-3 |
본 발명 |
| E. coli BL21 (DE3)/p41b-AtUGT89C1 and pET32a-SpnH | BL21(DE3) carrying p41b-AtUGT89C1 및 pET32a-SpnH | 균주-4 |
본 발명 |
| E. coli BL21 (DE3)/pET32a-SpnH | BL21(DE3) pET32a-SpnH | 균주-5 | 본 발명 |
| E. coli BL21 (DE3)/pET32a-SpnK | BL21(DE3) pET32a-SpnK | 균주-6 | 본 발명 |
| 재조합 플라스미드 | 설명 | 출처 |
| pGEM -T easy ector | General cloning vector, T7 and Sp6 promoters, f1 ori, Ampr | Promega, USA |
| pET32a-SpnK | pET32a vector carrying SpnK | 본 발명 |
| pET32a-SpnH | pET32a vector carrying SpnH | 본 발명 |
| pET41b-AtUGT89C1 | pET41b vector carrying AtUGT89C1 | Kim HJ et al., . J. Am. Chem . Soc . 132:2901-2903, 2010 |
단백질 발현
단백질 발현을 위하여 재조합 균주-5 및 균주-6를 사용하였다. 5ml 재조합 균주는 적절한 항생제가 공급된 LB 배지가 포함된 15mL 팔콘 튜브에서 37oC 조건으로 하룻밤 동안 배양하였다. IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)유도를 위하여, 500μL의 종균배양은 대장균 배양 플라스크에서 100mL LB배지로 옮겼고, 37oC조건에서 배양하였다. 600nm에서 광학 밀도(OD600)가 0.6에 도달하였을 때, 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종 농도 0.5mM의 IPTG를 각 플라스크에 첨가한 후, 20oC조건에서 15시간동안 배양하였다. 이 후, 세포를 수확하고, 10% 글리세롤 버퍼를 포함하는 50mM Tris HCl로 두 번 세척하였다. 그 다음에 볼텍싱하고 280xg로 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 단백질을 얻기 위하여, 세포 펠렛(pellet)은 초음파처리 하였다. 세포용해물 및 펠렛은 16,000 xg에서 30분 동안 고속 원심분리를 이용하여 분리하였다. 단백질의 가용성 및 불용성 부분은 나트륨 도데실 설폰산염 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE))으로 분석하였다.
실시예 2: 시험관 내 글리코실화 반응
2-데옥시 글루코피라노시드 유도체의 시험관 내 글리코실화 반응
시험관내 글리코실화 반응을 위하여, YjiC의 조단백질(crude protein)을 사용하였다. 최종 부피 25mL의 반응 혼합물은 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide(DMSO))에 용해된 10mM의 제니스테인, 기질 두배 농도의 당 공여체인 티미딘 이인산-2-데옥시-α-D-글루코스(thymidine diphosphate-2-deoxy-α-D-glucose(dTDP-α-2-deoxy-D-glucose)), pH 7.4에서 100mM Tris-HCl 버퍼를 포함하는 10mM의 MgCl2.6H2O 및 5mL의 조단백을 포함한다. 반응은 37 oC 조건에서 12시간 동안 배양하였고, 두 배 부피의 냉장 메탄올을 이용하여 쿨링하였다. 변성된 효소와 같은 농도의 모든 다른 성분들을 포함하는 전체 부피 500μL의 반응 혼합물을 대조군으로 사용하였다. 그 결과, cooling한 반응(quenched reaction) 혼합물은 단백질 침전물을 제거하기 위하여 16,000xg로 20분동안 원심분리하였다. 크로마토 그래픽 분석을 위하여, 20μL의 상기 반응 혼합물을 포토다이오드 어레이와 연결된 고성능 액체 크로마토그래프(high performance liquid chromatograph(HPLC-PDA))에 주입하였다. 또한, 생산물을 확인하기 위하여, 상기 반응 혼합물은 HR-QTOF ESI/MS 분석(liquid chromatography high resolution quadrupole time-of-flight electrospray ionization mass spectrometry)을 수행하였다. 제니스테인-2-데옥시-D-글루코피라노실 유도체(genistein-2-deoxy-D-glucopyranosyl derivatives)을 정제하기 위하여, 많은 양의 반응 혼합물을 건조하고 농축하였다.
실시예 3: 생물전환 반응
생물전환반응을 위하여, E. coli BL21(DE3)에 AtUGT89C1를 포함하는 재조합 균주-1, YjiC를 포함하는 재조합 균주-2, AtUGT89C1 및 SOMT spnK를 포함하는 재조합 균주-3 및 SOMT spnH를 포함하는 재조합 균주-4를 사용하였다(표 1 및 표 2). 상기 균주의 종균배양은 500mL 유가식 플라스크에서 100mL 배양 부피로 준비하였고, 적절한 항생제를 첨가하여 세포밀도 성장(OD600nm)이 1.5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 50mL 팔콘 튜브에 무균하게 옮기고 2000xg으로 10분 동안 원심분리 하였다. 상층 배양 배지는 제거하고, 보이는 세포는 멸균한 증류수로 세척하였다. 생물전환을 위하여 상기 세포들을 균일한 세포 밀도를 위하여 준비된 100mL의 LB배지에서 초기 배양하였다. OD600이 0.6이 되었을 때, 단백질 발현을 위하여 0.5mM의 IPTG을 첨가하고, 20oC 조건에서 12시간동안 배양하였다. 본 발명에서 생물전환을 위한 배양은 상기 조건으로 실험하였다. 글루코피라노사이드 유도체 합성을 위하여 재조합 균주-2를 사용하였고, 제니스테인 람노피라노사이드의 합성을 위하여 균주-1을 사용하였다. 또한, 제니스테인-O-메틸 람노피라노시드(genistein-O-methyl rhamnopyranosides)의 합성을 위하여, 재조합 균주-3 및 균주-4를 사용하였다. 상기 생물전환 반응을 위하여, DMSO에 용해된 200μM의 제니스테인을 공급하였다. 20oC 조건에서 36시간동안 배양한 후, 두 배 부피의 에틸아세테이트를 섞은 다음 1시간 후에 추출하였다. 유기층은 회전 증발기를 사용하여 건조시켰고, 추출한 화합물은 1mL메탄올에 용해하였다. 상기 반응 혼합물은 HPLC-PDA를 이용하여 분석하였고, 양이온 모드에서 HR-QTOF ESI/MS 분석으로 확인하였다.
제니스테인 람노피라노시드, 메틸람노피라노시드 및 글루코피라노시드의 미생물적 생산을 위하여, 생물전환 반응에 재조합 균주(각각 균주-1, 균주-2 및 균주-3)를 사용하였고, 제니스테인은 외인성 공급하였다. 각 균주의 종균 배양은 각각 500mL의 LB배지를 포함하는 네 개의 플라스크에서 수행하였다. 구조 분석 및 생산량 계산을 위한 유도체를 제조하기 위하여 각 재조합 균주를 총 부피 2L shake 플라스크에서 배양하였다. IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 다음, 235.2μM(32mg/L) 농도의 기질을 외인성 공급하고, 36시간동안 배양한 후, 두 배 부피의 에틸아세테이트를 섞고 1시간 후에 합성된 유도체를 추출하였다.
실시예
4: 합성된
제니스테인
유도체의 분석
배양 추출물은 메탄올에 용해하고, 시험관 내 반응 혼합물은 30분 동안 1mL/min 의 유속속도로 H2O(0.05% 트리플루오로아세트산 버퍼(trifluroaceticacid buffer)) 및 100% 아세토나이트릴(acetonitrile(ACN))의 binary 조건을 이용하여 C18 칼럼(MightysilRP-18GP(4.6×250mm, 5μm))과 연결된 reverse-phase HPLCPDA을 사용하여 분석하였다. 아세토나이트릴의 농도는 10%(0분 ~ 2분), 70%(20분 ~ 24분), 100%(24분 ~ 28분) 및 50%(28분 ~ 30분)이다. 각 화합물들의 HPLC 크로마토그래피를 조사하기 위하여 260nm UV 흡광도를 사용하였다. 생산물을 정량하기 위하여, 다른 농도(10μg/mL, 25μg/mL, 50μg/mL, 75μg/mL 및 100μg/mL)의 제니스테인-7-O-α-D-글루코피라노시드(제니스테인-7-O-α-D-glucopyranoside)의 보정 곡선을 사용하였다. 화합물의 정확한 질량은 양이온 모드에서 HR-QTOF ESI/MS 분석[ACQUITY (UPLC, Waters, Milford, MA, USA)-SYNAPT G2-S (Waters)]을 수행하였다. 각 생산물은 35분 동안 10mL/min의 유속속도에서 H2O(0.05% 트리플루오로아세트산 버퍼(trifluoroaceticacid buffer)) 및 100% 아세토나이트릴(acetonitrile(ACN))의 binary 조건에서 UV detector(260nm)와 연결된 C18칼럼[YMC-PackODS-AQ(250×20mm I.D., 10μm)] 및 preparative HPLC(prep-HPLC)를 이용하여 정제하였다. 아세토나이트릴(ACN)의 농도는 20%(0분 ~ 5분), 50%(5분 ~ 10분), 70%(10분 ~ 15분), 90%(15분 ~ 25분), 50%(25분 ~ 30분) 및 20%(20분 ~ 35분)이다. 글리코사이드의 정확한 구조를 분석을 위하여, 상기 정제한 샘플은 DMSO-d 6(hexadeuterio dimethylsulfoxide)에서 용해시키고, 1차원 1H-NMR(양성자 NMR), 13C-NMR(탄소 NMR) 및 2차원 NMR(HMBC- hetero nuclear multiple-quantum correlation spectroscopy)을 Varian Unity INOVA 800MHz spectrometer(Varian, USA)에서 수행하였다.
제니스테인
람노피라노사이드의
생합성 및 확인
제니스테인의 람노실 유도체를 생합성하기 위하여 재조합 균주-1을 사용하였다. 외인성으로 제니스테인을 공급하면서 배양하였다. HR-QTOF ESI/MS분석에 따르면, AtUGT89C1만을 포함하는 균주의 생물전환반응 혼합물은 21분에서의 표준 정체시간에 관련하여 17.6분 및 15.7분의 정체시간에서 두 개의 상이한 생산물 피크를 나타내었다(도 1A). 질량 분석은 정체시간 17.6분에서 화합물의 질량은 [M+H]+m/z+~417.1192로 측정되었고, 제니스테인 람노피라노사이드의 질량은 m/z+~ 417.1180로 상기 화합물과 유사하다(도 7B). 또한, 정체시간 15.7분에서 화합물의 질량은 [M+H]+m/z+~433.1129로 측정되었고, 제니스테인 글루코피라노사이드의 질량은 m/z +~433.1135로 상기 화합물과 유사하다(도 7A). 상기 질량 스펙트럼 결과는 제니스테인과 결합된 람노오스(정체시간 17.6) 및 포도당의 질량(정체시간 15.7분)과 일치했다. 상기 AtUGT89C1는 이전에 플라보노이드의 7-OH위치를 단일 람노오스 당으로 전환하였지만, 제니스테인에서의 AtUGT89C1의 결과는 다르다. 두 화합물을 정제한 후 다양한 타입의 NMR 분석으로 분석하였다(표 3 및 표 4).
상기 화합물들의 1H-NMR 및 13C-NMR 화학 변화는 표 3 및 표 4에 기재하였다.
| 유도체 | 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드 | 제니스테인-7-O-3′′-O-메틸-α-L-람노피라노시드 | 제니스테인-7-O-4′′-O-메틸-α-L-람노피라노시드 | 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시D-글루코피라노시드 | 제니스테인-4′,5,7-O-β-2-데옥시-D-트리글루코피라노시드 | 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드 | 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드 | 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드 | 제니스테인-4′,7-O-β-D-디글루코피라노시드 | 제니스테인-7-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드 |
| 위치 | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H | 1 H |
| 5-OH | 12.94 | 12.94 | 12.94 | 12.93 | 12.89 | 12.87 | 12.95 | 12.94 | 12.82 | 12.91 |
| 7-OH | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 4′-OH | 9.64 | 9.63 | 9.65 | 9.68 | - | - | - | 9.64 | - | - |
| H-2 | 8.41 | 8.43 | 8.42 | 8.42 | 8.31 | 8.42 | 8.42 | 8.44 | 8.50 | 8.38 |
| H-2′ | 7.39 | 7.40 | 7.39 | 7.40 | 7.48 | 7.51 | 7.40 | 7.41 | 7.53 | 7.50 |
| H-6′ | 7.39 | 7.40 | 7.39 | 7.40 | 7.48 | 7.51 | 7.40 | 7.41 | 7.53 | 7.50 |
| H-3′ | 6.83 | 6.83 | 6.83 | 6.83 | 7.07 | 7.09 | 6.84 | 6.84 | 7.11 | 7.10 |
| H-5′ | 6.83 | 6.83 | 6.83 | 6.83 | 7.07 | 7.09 | 6.84 | 6.84 | 7.11 | 7.10 |
| H-8 | 6.74 | 6.76 | 6.75 | 6.71 | 6.30 | 6.73 | 6.72 | 6.73 | 6.74 | 6.40 |
| H-6 | 6.48 | 6.51 | 6.49 | 6.47 | 6.15 | 6.48 | 6.48 | 6.48 | 6.49 | 6.23 |
| H-1″ | 5.57 | 5.63 | 5.57 | 5.42 | 5.29 | 5.30 | 5.07 | 5.07 | 5.08 | 4.92 |
| H-1′′′ | - | - | - | - | - | 5.43 | - | - | 4.92 | - |
| H-2″ | 3.0-4.0 | 4.09 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 |
| H-2′′′ | - | - | - | - | - | 3.0-4.0 | - | - | 3.0-4.0 | - |
| H-3″ | 3.0-4.0 | 3.45 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 |
| H-3′′′ | - | - | - | - | - | 3.0-4.0 | - | - | 3.0-4.0 | - |
| H-4″ | 3.0-4.0 | 3.40 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 |
| H-4′′′ | - | - | - | - | - | 3.0-4.0 | - | - | 3.0-4.0 | - |
| H-5″ | 3.0-4.0 | 3.40 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 |
| H-5′′′ | - | - | - | - | - | 3.0-4.0 | - | - | 3.0-4.0 | - |
| 6″-CH2 | - | - | - | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 | 3.0-4.0 |
| 6′′′-CH2 | - | - | - | - | - | 3.0-4.0 | - | - | 3.0-4.0 | - |
| 6″-CH3 | 1.12 | 1.12 | 1.15 | - | - | - | - | - | - | - |
| OCH3-3″ | - | 3.40 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| OCH3-4″ | - | - | 3.47 | - | - | - | - | - | - | - |
| 2-deoxy | - | - | - | 2.21 | 2.19 | 2.20 | - | - | - | - |
| 2-deoxy | - | - | - | 1.60 | 1.60 | 1.60 | - | - | - | - |
| 유도체 | 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드 | 제니스테인-7-O-3′′-O-메틸-α-L-람노피라노시드 | 제니스테인-7-O-4′′-O-메틸-α-L-람노피라노시드 | 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시D-글루코피라노시드 | 제니스테인-4′,5,7-O-β-2-데옥시-D-트리글루코피라노시드 | 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드 | 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드 | 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드 | 제니스테인-4′,7-O-β-D-디글루코피라노시드 | 제니스테인-7-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드 |
| 위치 | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C | 13 C |
| 5 | 161.73 | 162.16 | 162.15 | 164.39 | 164.74 | 162.96 | 161.70 | 162.11 | 163.55 | 162.44 |
| 7 | 161.80 | 162.08 | 161.45 | 162.89 | 162.36 | 162.08 | 163.06 | 163.49 | 162.06 | 165.22 |
| 4′ | 157.56 | 157.98 | 157.85 | 157.06 | 157.07 | 157.21 | 157.54 | 157.70 | 157.71 | 157.75 |
| 2 | 154.60 | 155.07 | 155.06 | 155.06 | 154.49 | 155.51 | 154.59 | 155.07 | 155.54 | 154.85 |
| 2' | 130.21 | 130.65 | 130.65 | 130.65 | 130.51 | 130.55 | 130.21 | 130.65 | 130.55 | 130.53 |
| 6′ | 130.21 | 130.65 | 130.65 | 130.65 | 130.44 | 130.55 | 129.83 | 130.26 | 130.55 | 130.53 |
| 3′ | 115.15 | 115.57 | 115.57 | 115.58 | 116.32 | 116.37 | 115.14 | 115.57 | 116.54 | 116.52 |
| 5′ | 115.15 | 115.57 | 115.57 | 115.58 | 116.27 | 116.37 | 115.14 | 115.57 | 116.54 | 116.52 |
| 8 | 94.64 | 95.17 | 95.10 | 95.00 | 94 | 95.07 | 94.59 | 95.01 | 95.09 | 94.27 |
| 6 | 99.70 | 100.16 | 100.12 | 106.51 | 104.71 | 106.51 | 99.64 | 106.57 | 100.76 | 104.79 |
| 1″ | 98.45 | 98.80 | 98.55 | 98.83 | 97.00 | 96.97 | 99.93 | 100.05 | 100.13 | 99.62 |
| 1′′′ | - | - | - | - | - | 96.83 | - | - | 100.31 | - |
| 2″ | 70.30 | 66.31 | 69.11 | 70.60 | 70.84 | 70.88 | 76.44 | 73.56 | 73.55 | 70.18 |
| 2′′′ | - | - | - | - | - | 70.83 | - | - | 70.18 | - |
| 3″ | 69.88 | 57.06 | 82.47 | 71.52 | 71.63 | 71.63 | 73.12 | 76.89 | 77.10 | 73.71 |
| 3′′′ | - | - | - | - | - | 71.52 | - | - | 76.88 | - |
| 4″ | 71.63 | 70.84 | 60.52 | 77.90 | 77.71 | 77.90 | 69.64 | 77.67 | 77.66 | 77.53 |
| 4′′′ | - | - | - | - | - | 77.71 | - | - | 77.54 | - |
| 5″ | 70.12 | 70.43 | 70.54 | 70.56 | 70.60 | 70.60 | 77.24 | 70.07 | 70.06 | 70.18 |
| 5′′′ | - | - | - | - | - | 70.23 | - | - | 70.18 | - |
| 6″-CH2 | - | - | - | 61.21 | 61.28 | 61.28 | 60.67 | 61.10 | 61.16 | 61.16 |
| 6′′′-CH2 | - | - | - | - | - | 61.21 | - | - | 61.09 | - |
| 6″-CH3 | 17.96 | 18.34 | 18.39 | - | - | - | - | - | - | - |
| OCH3-3″ | - | 57.06 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| OCH3-4″ | - | - | 60.52 | - | - | - | - | - | - | - |
| 2-deoxy | - | - | - | 70.60 | 70.84 | 70.88 | - | - | - | - |
| 2-deoxy | - | - | - | 70.60 | 70.84 | 70.83 | - | - | - | - |
정체시간 17.6분에서 화합물의 1H-NMR 스펙트럼, δ 5.57 ppm(d, J=180Hz, 1H)에서 더블릿의 아노머 양성자(1″-H) 및 5.0ppm보다 낮은 다른 당 스펙트럼은 알파 입체배치에서 당 일부분의 컨쥬게이션(conjugation)을 나타낸다(도 8a). 7-OH 그룹의 양성자 피크가 없기 때문에, 7번째 위치에서 글리코실화 될 때 물분자가 제거되는 것을 관찰하였다. HMBC 분석에서, 아노머 양성자와 C-7 사이의 교차 피크가 뚜렷하게 나타났고(도 8c), 7-OH 그룹에서 글리코실화의 위치를 확인하였다. δ 1.12ppm에서 더블릿 피크 및 13C-NMR 스펙트럼에서 δ 17.96ppm에서 메틸 피크로 당 일부분에 메틸기 그룹이 있음을 확인하였다(도 8a 및 도 8b). 상기 피크들은 6-데옥시 당의 특징이다. AtUGT89C1는 람노실전이효소(rhamnosyltransferase)의 특징을 가지고 있고, 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼에서 특정 피크의 존재는 제니스테인의 7-OH 부분에서 람노오스 일부분이 부착된다는 증거를 제공하기 때문에, 제니스테인 7-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)임을 알 수 있다.
제니스테인 글루코피라노시드와 유사한 분자량을 가진 같은 균주의 생물전환반응 혼합물에서 정체시간 15.7분에서 관찰된 새로운 피크를 조사하기 위하여 NMR 분광학을 이용하였다. 아노머 더블릿 양성자는 δ 5.07ppm(d, J=7.0Hz, 1H)에서 발견되었고(도 9a), 베타-입체배치(β-configuration)에 당 부착을 의미한다. 포도당의 다른 양성자들은 3.0ppm ~ 4.5ppm에 위치한다. 13C-NMR분석을 통하여, δ 62.67ppm에서 포도당의 C-6″와 δ 99.64ppm에서 아노머 탄소를 관찰하였다. HMBC분석을 통하여, 아노머 양성자와 아글리콘의 7-하이드록실 위치에서 당 부착 증거를 제시하는 제니스테인의 C-7 하이드록실 위치와의 연관성을 확인하였다(도 9c). 또한, C-2″(76.85ppm), C-3″(73.53ppm) 및 C-5″(77.64ppm)의 아노머 양성자(5.08ppm)의 교차 피크를 관찰하였다(도 9d). 상기 피크들을 통하여, 정체시간 15.7분에서 새로운 피크가 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(genistein 7-O-β-D-glucopyranoside)임을 알 수 있다.
상기 화합물들의 미생물적 생산을 위하여, 생물전환 균주-1에 32mg/L(117μM)의 기질을 첨가한 후, 36시간 동안 배양하였다. 그 결과, 12mg/L(28.8μM)의 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside) 및 11mg/L(25.4μM)의 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)을 수득하였다(도 2).
제니스테인 메틸화 람노피라노사이드의 생합성 및 확인
메틸화된 람노오스가 결합된 제니스테인 분자를 합성하기 위하여, 균주-3은 spnK(S. spinosa NRRL.18395 유래의 당-3-O-메틸트랜스퍼라아제(sugar-3-O-methyltransferase)) 및 AtUGT89C1를 같이 발현시켰고, 균주-4는 spnH(S. spinosa NRRL.18395 유래의 당-4-O-메틸트랜스퍼라아제(sugar-4-O-methyltransferase)) 및 AtUGT89C1를 같이 발현시켰다(표 1 및 표 2).
균주-3 및 균주-4의 반응 혼합물들은 구조 분석을 위하여 prep-HPLC로 정제한 후, HPLC-PDA 크로마토그램에서 HR-QTOF ESI/MS 분석을 이용하여 제니스테인 글루코피라노사이드 및 람노피라노사이드 피크 옆에 두 개의 새로운 피크를 정체시간 18.9분과 19.6분에서 관찰하였다(도 1b 및 도 1c). 새로운 피크의 질량은 제니스테인과 컨쥬게이션된 O-메틸 람노오스(O-methyl rhamnose)와 일치한다. 정확한 질량은 대략 각 피크(정체시간 18.9분 및 19.6분)에서 동일하게 [M+H]+ m/z +~431.1355로 관찰되었고, 제니스테인 메틸 람노피라노사이드의 질량 m/z +~431.1342와 일치하였다(도 7C 및 도 7D).
반면 균주-3에서 정체시간 18.9분에서 화합물의 1H-NMR 스펙트럼을 분석한 결과, δ 5.63ppm(d, J=1.9Hz, 1H)에서 더블릿의 아노머 양성자가 관찰되었고, 알파-입체배치(α-configuration)의 당부착을 확인하였으며 7-OH 그룹의 피크가 사라진 것을 관찰하였다. 또한, 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(genistein7-O-α-L-rhamnopyranoside)에서 1.12ppm의 독특한 메틸기를 확인하였다(도 10a). 이전 연구에서 분석을 통하여, 3″-O-CH3의 독특한 양성자 피크가 3.40ppm에 나타남을 확인하였다. HMBC분석을 통하여, 1″-H(5.63 ppm)과 C-7(162.07ppm)사이의 교차 피크는 제니스테인의 7-하이드록실 위치에 람노오스의 컨쥬게이션을 보여준다. 반면에 1″-H(5.63ppm) 및 C-3″(80.60ppm)사이의 교차 피크와 3″-O-CH3(3.40ppm) 및 C-3″(80.59ppm)사이의 교차 피크는 람노오스 3″-OH 위치에서 O-메틸화(O-methylation)를 보여준다(도 10d). 따라서, 상기 화합물이 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)임을 확인하였다. 또한 상기 화합물들의 1H-NMR 및 13C-NMR 화학적 변화를 관찰하였다(표 3 및 표 4).
또한, 균주-4로 획득한 화합물은 1H-NMR스펙트럼을 통하여 δ 5.57 ppm(d, J=1.9Hz, 1H)에서 더블릿의 아노머 양성자를 확인하였고, 이를 통하여 7-OH 그룹의 피크에서 α-입체배치의 당 부착을 확인하였다. 또한, δ 1.15ppm에서 독특한 메틸기 및 δ 3.47ppm에서 4″-O-CH3의 독특한 피크를 확인하였다(도 11A). 13C-NMR분석을 통하여, δ 18.39ppm에서 람노오스 메틸기의 피크를 확인하였다. 4″-C는 δ 82.47ppm으로 이동하였고, 4″-O-CH3는 60.52ppm에 위치하였다(도 11b). HMBC 분석을 통하여, 아노머 양성자 1″-H (5.56ppm) 및 C-7(162.04ppm) 사이의 교차 피크를 확인하였고, 제니스테인의 7-OH 위치에 람노오스가 부착함을 확인하였다. 4″-O-CH3(3.47ppm)과 C-4″(60.54ppm)사이의 교차 피크는 4″-OH 위치에서 람노오스 일부분의 메틸화를 나타낸다(도 11d). 이를 통하여, 상기 산물이 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드임을 확인하였다.
생체변환을 통하여 두 개의 새로운 제니스테인의 O-메틸 람노오스 유사체를 제조하였다. 상기 당 O-메틸기전이효소(sugar O-methyltransferases)는 글리코실화된 페놀 요소 폴리칼신외에도 메틸화된 람노실 플라보노이드의 제조에 사용하였다. GT와 SOMT의 동시형질전환을 통한 미생물적 생산으로, 12mg/L(28.8μM)의 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)로부터 3.56mg/L(8.27μM)의 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(genistein 7-O-3″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside) 및 3.05mg/L(7μM)의 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-4″-O-methyl-α-L-rhamnopyranoside)를 제조하였다(도 2).
제니스테인 글루코피라노사이드의 생합성 및 확인
제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(Genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)는 AtUGT89C1를 포함하는 균주-1를 이용하여 생합성하였다. 다른 제니스테인 글루코피라노사이드(glucopyranosides)는 YjiC를 포함하는 재조합 균주-2를 이용하여 생합성하였다. 생물전환반응의 실험방법은 상기의 생합성 방법과 동일하다. 글루코피라노시드의 생산을 확인하기 위하여, 생물전환반응 36시간 후에 HPLC-PDA 샘플을 준비하였다. HPLC-PDA 크로마토그램은 정체시간 20분의 표준피크와 관련한 14.2분, 16.5분 및 16.9분에서 세 개의 상이한 피크를 나타냈다(도 1d). HR-QTOF ESI/MS 분석을 통하여, 제니스테인 디-글루코피라노사이드(genistein di-glucopyranoside)는 질량 [M+H]+m/z+~595.1660을 나타냈고, 정체시간 14.2분에서 화합물의 측정된 질량은 m/z+~595.1663이다. 정체시간 16.5분에서 화합물은 [M+H]+m/z+~433.1143을 나타냈고, 상기 화합물은 제니스테인 글루코피라노시드의 계산된 질량 m/z+~433.1135과 일치한다. 유사하게, [M+H]+m/z+~433.1148의 질량은 정체시간 16.5분의 화합물인 두 번째 제니스테인 글루코피라노사이드 m/z+~433.1135의 계산된 질량과 유사하다(도 7E, 도 7F 및 도 7G). NMR을 이용하여 YjiC에 의해 생산된 제니스테인의 글루코피라노사이드의 구조를 분석하였다. 상기 화합물들의 1H-NMR 및 13C-NMR 화학적 변화를 관찰하였다(표 3 및 표 4).
정체시간 14.2분에서 화합물은 δ 5.08ppm(d, J=7.6Hz, 1H) 및 δ 4.92ppm(d, J=7.4Hz, 1H)에서 두 개의 더블릿 아노머 양성자로 나타났고, β-입체배치(configuration)로 두 개의 당이 부착된 것을 확인하였다(도 12A). 또한, HMBC분석으로 관찰된 C-7(163.56ppm)의 H-1″-H(5.08ppm) 및 C-4′(157.84ppm)의 H-1″(4.93ppm)의 교차 피크들을 통하여, 제니스테인의 7-OH 와 4′-OH 위치에 당이 부착함을 확인하였다(도 12C). 1H-NMR 및 13C-NMR에서 다른 피크들은 제니스테인과 당 부분(moieties)의 각자 위치를 나타낸다. 이를 통하여, 상기 화합물은 제니시테인-4′,7-O-β-D-디글루코피라노시드(genistein-4′,7-O-β-D-diglucopyranoside)임을 확인하였다. 또한, 정체시간 16.5분 및 16.9분의 화합물들에서 δ 4.92ppm(d, J=7.5Hz, 1H), δ 5.07ppm(d, J=7.7Hz, 1H)에서 더블릿 아노머 양성자가 관찰되었고, 이를 통하여 β-입체배치의 당 부착을 확인하였다(도 13a). HMBC 분석을 통하여, 정체시간 16.5분에서 H-1″(4.92ppm)과 C-4′(157.75ppm)사이의 교차 피크가 나타났으며, 이를 통하여 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드(genistein-4′-O-β-D-glucopyranoside)임을 확인하였다(도 13c). 정체시간 16.9분의 화합물에서 H-1″(5.07ppm)와 C-7(163.49ppm)사이의 교차 피크는 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)임을 보여준다(도 14c).
제니스테인 글루코피라노시드의 생물학적 생산을 위하여, 균주-2를 36시간 동안 배양하였다. 그 결과, 35.4mg/L(81.8μM)의 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드, 59.06mg/L(136.4μM)의 제니스테인-4′-O-β-D-글루코피라노시드 및 32.64mg/L(54.8μM)의 제니스테인-4′,7-O-β-D-디글루코피라노시드를 획득하였다(도 2).
제니스테인-2-데옥시 글루코피라노시드의 생합성 및 확인
제니스테인의 2-데옥시 글루코피라노시드 유도체는 시험관 내 반응에서 YjiC을 사용하여 제조하였다. 제니스테인과 dTDP 2-데옥시-α-D-글루코스의 글리코실화를 확인하기 위하여 연구실 스케일 글리코실화 반응을 수행하였다. HPLC-PDA 분석을 통하여, 정체시간 21분의 기질 표준 피크와 관련하여 16.9분, 18.1분 및 18.4분에서 세 개의 상이한 피크를 관찰하였다(도 1E). 질량 분석을 통하여, 상기 피크의 질량은 제니스테인-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(genistein-2-deoxy D-diglucopyranoside) 및 두 개의 제니스테인-2-데옥시-D-모노글루코피라노시드(genistein-2-deoxy D-monoglucopyranoside)의 분자량과 유사함을 확인하였다. 질량 분석을 통하여 4번째 생산물을 관찰하였고, 이것은 제니스테인-2-데옥시-D-트리글루코피라노시드(genistein-2-deoxy D-triglucopyranoside)의 질량 피크와 유사하다. 양이온 모드에서, HPLC-PDA로 관찰되지 않는 피크의 화합물 질량 스펙트럼은 [M+Na] + m/z + ~ 731.2168이고, 2-데옥시-D-트리글루피라노시드(2-deoxy D-triglucopyranoside)의 측정된 질량은 m/z + ~ 709.2344이다(도 7K). 유사하게, 정체시간 16.9분에서 화합물의 질량 스펙트럼은 [M+H] + m/z + ~ 563.1770이고, 제니스테인-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(genistein-2-deoxy D-diglucopyranoside)의 측정된 질량은 m/z + ~ 563.1765이다(도 7J). 질량 분석 결과, 정체시간 18.1분 및 18.4분에서 화합물들은[M+H] + m/z + ~417.1183 및 ~417.1179으로 나타난다. 제니스테인-2-데옥시-D-모노글루코피라노시드(genistein-2-deoxy-D-monoglucopyranoside)의 측정된 질량은 m/z + ~ 417.1186이다(도 7I, 도 7H).
제니스테인의 2-데옥시 글루코피라노시드 유도체를 생합성하기 위하여, 25mL 반응 부피를 준비하였다. 68mg(25mL 중 10mL)의 제니스테인을 수용기질로 사용하였고, 두 배 농도인 135mg(25mL 중 10mM)의 dTDP-α-2-데옥시 D-글루코스를 당 공여체로 사용하였다. 다른 반응물질들은 반응 혼합물의 마지막 부피까지 첨가하였고, 5mL 조단백질을 첨가한 후, 37 oC조건에서 12시간동안 배양하였다. 생산물을 정제한 후, NMR을 이용하여 구조를 분석하였다.
4개의 상이한 화합물은 시험관 반응에서 dTDP-2-데옥시-D-글루코스의 존재하에 YjiC를 이용하여 생합성하였다. 정체시간 16.9분에서 생산물은 δ 5ppm(dd, J=9.82.1Hz, 1H), 5.43ppm(dd, J=9.82.1Hz, 1H)에서 두 개의 아노머 양성자를 나타내고, 이를 통해 7-OH 및 4′-OH가 존재하지 않음을 확인하였다(도 15A). 2-위치의 수소와 관계된 α-2-데옥시 D-글루코스의 입체배치에서 아노머 양성자는 적도면에 위치한다. 즉, 적도방향이며 결합 상수는 3Hz이다. β-2-데옥시 D-글루코스에서, 당 2-데옥시 위치의 양성자는 아노머 양성자에 대하여 축-적도방향을 지향한다. 결합 상수(coupling values)는 ~8Hz 및 ~2Hz의 범위이다. 만약, 1″-H가 적도 방향이라면, 2-데옥시 포도당은 더블릿 스펙트럼의 더블릿을 나타낸다. 그 현상은 W-coupling(4JHH)라고 하며, 비시날 양성자(vicinal protons)의 결합상수와 이면각에 의존한다. 0°C ~ 180°C의 범위에서 J값이 다양하지만, 아노머 탄소 값들은 δ 96.97ppm 및 δ 96.83ppm으로 일치한다. 당이 부착된 α-linkage 부위인 100ppm 보다 윗부분은 β-입체배치를 나타낸다. 아노머 탄소의 화학적 변화는 δ 97ppm ~ δ 101ppm의 α-linkage 범위에 있는 반면에 아노머 양성자는 5.1ppm ~ 5.5ppm사이에서 화학적 변화가 나타난다. 2.20ppm(2H) 및 1.60ppm(2H)에서 특정 2-데옥시 양성자는 1H-NMR에서 원상태로 나타난다(도 15a). HMBC 분석을 통하여, 4′-C(157.28ppm)의 아노머 양성자(5.29ppm ~ 5.30ppm) 및 C-7(163.01ppm)의 아노머 양성자(5.42ppm ~ 5.43ppm)의 교차 피크는 제니스테인에서 당 결합 위치를 나타낸다(도 15c 및 도 15d). 이를 통하여, 제니스테인-4′, 7-O-β -D-2-데옥시 디글루코피라노시드(genistein-4′, 7-O-β -D-2-deoxy diglucopyranoside)임을 확인하였다. 또한 상기 화합물들의 1H-NMR 및 13C-NMR 화학적 변화를 관찰하였다(표 3 및 표 4).
NMR 분석을 통하여, 정체시간 18.1분 및 18.4분에서 나타나는 두 생산물의 정확한 질량은 제니스테인의 모노-2-데옥시 D-글루코피라노시드의 질량과 일치함을 확인하였다. 정체시간 18.1분에서 화합물의 아노머 양성자는 δ 5.29ppm(dd, J= 9.7, 1.9Hz, 1H)에서 더블릿 피크의 더블릿을 나타내고, 18.4분의 화합물은 δ 5.42ppm(dd, J= 9.6, 2.1Hz, 1H)에 더블릿 피크의 더블릿을 나타낸다(도 16a 및 17a). 아노머 탄소 값은 97.00ppm 및 96.83ppm로 나타났고, 이를 통해 β-입체배치로 당이 부착함을 확인하였다(도 16b 및 도 17b). 2-데옥시 당은 2.19ppm(1H) 및 1.60ppm(1H)이고, 정체시간 18.1분의 화합물에서 다른 당 양성자는 3.0ppm ~ 4.5ppm로 나타난다(도 16a). 유사하게, 정체시간 18.4분의 화합물에서 2-데옥시 당 양성자는 2.21ppm 및 1.60ppm으로 나타난다.(도 17a). 또한, HMBC 분석을 통하여, C-1″(97ppm)와 C-2″(70.84ppm)사이에서 δ 1.60ppm의 정체시간 18.1분의 화합물 교차 피크 및 C-2″(70.83ppm)과 C-3″(72.11ppm)사이에 δ2.19ppm에서 정체시간 18.1분의 화합물 교차 피크가 관찰되었다(도 16c). 1″-H와 4′-C사이의 교차 피크를 통하여 4′-OH 위치에서 2-데옥시 포도당의 컨쥬게이션을 확인하였고, 이를 통해 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드임을 확인하였다(도 16d). 또한, 정체시간 18.4분의 화합물에서, 1″-H(5.42ppm) 및 C-7(162.95ppm)사이의 피크와 함께 C-1″(96.76ppm) 및 C-3″(71.32ppm)사이에서 δ 2.21ppm에서 교차 피크는 7-OH 위치에 2-데옥시-D-포도당이 결합함을 나타낸다. 이를 통해 상기 화합물은 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드임을 확인하였다(도 17c 및 도 17d). 또한 상기 화합물들의 1H-NMR 및 13C-NMR 화학적 변화를 관찰하였다(표 3 및 표 4).
25mL 부피의 전체 반응으로부터 16mg(28.3μM)의 제니스테인-4,7-O-β-2-데옥시-D-디-글루코피라노시드, 30mg(72.1μM)의 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드 및 17mg(40.9μM)의 제니스테인-4′-O-β-2-데옥시 D-글루코피라노시드의 세 개의 글루코피라노시드를 합성하였다. HR-QTOF ESI/MS 분석으로, 극소량 생산된 4번째 생산물인 제니스테인 트리글루코피라노시드를 확인하였다. 글리코실전이효소(glycosyltransferases)는 β-입체배치의 2-데옥시 당 부착을 촉매하고, 제니스테인의 5-OH 위치에서 세 번째 하이드록실기의 이용가능성은 제니스테인-4′, 5, 7-O-β-2-데옥시-D-트리글루코피라노시드(Genistein-4′, 5, 7-O-β-2-deoxy-D-triglucopyranoside)이 제니스테인의 신규한 글리코시드 유도체임을 나타낸다(도 1E).
실시예 5: 제니스테인 유도체의 상대적 용해도 비교
글루코피라노시드의 상대적 용해도를 확인하게 위하여, 균주-1, 균주-2, 균주-3, 균주-4, 균주-5 및 균주-6을 50mL 배양배지에서 배양한 후, 최종농도 0.2mM의 제니스테인을 외인성으로 공급하였다. 36시간동안 배양한 후에, 화합물을 추출하기 위하여 두 배 부피의 에틸 아세테이트를 첨가하고, 로타 증발기(rota evaporator)에서 상층액을 농축시켰다. 농축된 샘플을 상온(24oC)에서 1:2의 비율의 에틸 아세테이트와 물에 혼합하였다. 상기 혼합물을 잘 섞고, 각 부분(수용성 및 유기 부분)은 HPLC-PDA를 수행하였다. 2-데옥시 글루코시드는 실시예 2와 같은 방법으로 동일한 실험실 규모의 시험관 내 반응(in vitro)을 200μL에서 수행하였다. 2시간 동안 배양한 후, 메탄올로 담금질하였다. 반응 혼합물을 건조한 후, 1:2의 비율의 에틸 아세테이트와 물에 혼합하였다. 분리된 부분은 HPLC-PDA를 이용하여 분석하였다. 용해도 향상은 물에서 보통의 제니스테인의 용해도와 비교하였다.
글루코피라노사이드 화합물의 상대적인 용해도
제니스테인과 비교하여 글루코피라노사이드의 상대적 용해도 연구는 에틸 아세테이트와 물 부분을 각각 HPLC-PDA로 분석하였다. 제니스테인의 용해도는 온도범위가 다양하지만, 상온(24oC)에서 실험하였다. 제니스테인-4′, 7-O-β-D-디글루코피라노시드 및 제니스테인-4′,7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드의 상대적 용해도는 제니스테인 아글리콘과 비교하여 3배 높다. 다른 글루코피라노사이드(genistein-4′-O-β-D-glucopyranoside, genistein-7-O- β-D-glucopyranoside, genistein-4′-O-β-2-deoxy D-glucopyranoside, genistein-4′-O-β-2-deoxy D-glucopyranoside 및 genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside)는 제니스테인과 비교하여 물에 약 2.1배 더 잘 녹는다. 제니스테인-7-O-3″-O-메틸-α-L-람노피라노시드 및 제니스테인-7-O-4″-O-메틸-α-L-람노피라노시드의 용해도는 표준 제니스테인과 비교하여 2.2배 더 잘 녹는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 6: 제니스테인 유도체의 생물학적 활성 확인
합성된 화합물의 항진균 및 항암 활성은 아글리콘과 비교하여 관찰하였다. 항진균 활성에서, 곰팡이 균주 Aspergillus nidulans를 사용하고, Nystatin A1는 대조군 항진균제로 사용하였다. 페이퍼 디스크(6mm 지름)를 준비하고 오토클레이브 처리하였다. NMR 분석을 위하여 다른 농도(0.5mg/mL ~ 20mg/mL)의 정제된 제니스테인 유사체를 준비하였다. 스톡(stock)으로부터 항진균 저해 존을 조사하기 위하여, DMSO에 용해된 제니스테인을 포함하는 500μg/mL의 각 유사체와 정확한 저해 존을 관찰하기 위하여 고농도인 100μg/mL의 Nystatin A1을 준비하였다. 감자 한천배지(Potato Dextrose Agar)(PDA) 플레이트는 배지로 사용하기 위하여 시그마에서 구매하였다. 곰팡이 균주는 튜브에서 오트클레이브 처리한 100μL 증류수로 접종한 후, 잘 섞었다. 상기 혼합물을 스프레드하고 PDA 평판에 도말하였다. 각 종이 디스크에 500 μg/mL농도의 제니스테인 유사체, 제니스테인, Nystatin A1 또는 대조군 DMSO(100%)을 처리한 후, 곰팡이가 도말된 PDA 플레이트에 올렸다. 이 후, 28oC조건에서 배양하고 명확한 저해 존이 보일 때까지 다른 시간 간격으로 관찰하였다.
세포 배양 및 세포 성장 분석을 이용하여 항암 활성을 관찰하기 위하여, AGS(위암세포(gastric carcinoma cells))는 10% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. B16F10 흑색종(피부 암 세포), 헬라(자궁 경부 암 세포) 및 HepG2 간암세포(hepatocarcinoma)는 10% FBS가 포함된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium)에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2 배양기에서 37°C조건으로 유지하였다. 세포 성장 분석을 위하여, 다양한 암세포는 96 웰 배양 플라이크에 2×103cells/well로 접종하였다. 제니스테인 유도체는 다양한 농도로 각 웰에 첨가하였고, 상기 세포들은 72시간동안 배양하였다. 세포 성장은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 비색 에세이를 이용하여 측정하였다. 50ml의 MTT(2mg/ml stock 용액)를 첨가하였고, 각 플레이트는 추가적으로 4시간동안 배양하였다. 배지를 제거한 후에, 100ml의 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide(DMSO))를 첨가하였다. 흡광도는 microplate spectrophotometer(Thermo Scientific Multiskan Spectrum)를 이용하여 540nm에서 측정하였다.
항진균 및 항암 에세이
제니스테인을 포함하는 500μg/mL 제니스테인 유도체의 항진균 활성은 A. nidulans에 대해 디스크 확산법으로 측정하였다. NMR분석을 위하여 500μg/mL 농도의 정제된 제니스테인 유도체를 준비하였다. 또한, 저해 존을 명확하게 관찰하기 위하여, 100μg/mL Nystatin A1를 준비하였다. 배양 후 16시간, 30시간 및 50시간 간격으로 관찰하였다. 500μg/mL농도의 Nystatin A1에서는 항진균 저해 존이 관찰되지 않았다(도 18).
제니스테인이 항암 성질을 가지므로, 제니스테인과 제니스테인 유도체의 네 가지 암 세포주(AGS, B16F10, HeLa 및 HepG2)에 대한 세포성장저해를 측정하였다. 몇몇 제니스테인 유도체는 제한된 농도를 가지고 있어서 이용 가능한 농도에 기반하여 실험을 수행하였다. 다른 농도의 제니스테인과 제니스테인 유도체를 이용하여 각 그룹의 세포 생존능력을 측정하였다. A그룹에서는 네 개의 암세포주에 1.56μM ~ 50μM 농도범위의 제니스테인-7-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-α-L-rhamnopyranoside), 제니스테인-7-O-3″-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-3″-O-α-L-rhamnopyranoside), 제니스테인-7-O-4″-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-4″-O-α-L-rhamnopyranoside)를 처리하였고, 제니스테인과 세포 생존력을 비교하였다. 상기 유도체들은 상이한 민감도로 각 암세포주의 증식을 저해하였다. 실험 유도체 중에 제니스테인-7-O-3″-O-α-L-람노피라노시드(genistein-7-O-3″-O-α-L-rhamnopyranoside) 는 제니스테인과 비슷한 항암효과를 나타낸다(도 4A). B그룹에서는 네 개의 암세포주에 0.31μm ~ 10μM 농도범위의 제니스테인-4',7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(genistein-4',7-O-β-2-deoxy D-diglucopyranoside), 제니스테인-4'-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(genistein-4'-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside), 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(genistein-7-O-β-2-deoxy D-glucopyranoside)를 처리하였다. 2-2-데옥시 글루코피라노시드 유도체는 복용량-의존적으로 제니스테인과 유사하게 암세포주의 증식을 저해하였다. 특히, 제니스테인-4',7-O-β-2-데옥시-D-디글루코피라노시드(genistein-4', 7-O-β-2-deoxy D-diglucopyranoside)의 저해 효과는 제니스테인의 효과와 비슷하고, 제니스테인-4'-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(genistein-4'-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside) 및 제니스테인-7-O-β-2-데옥시-D-글루코피라노시드(genistein-7-O-β-2-deoxy-D-glucopyranoside)에 비하여 더 효과적이다(도 4B). 그룹 C에서는 네 개의 암 세포주에 3.12μm ~ 100μM의 농도 범위의 제니스테인-4',7-O-β-D-디글루코피라노시드(genistein-4',7-O-β-D-diglucopyranoside), 제니스테인-4'-O-β-D-글루코피라노시드(genistein-4'-O-β-D-glucopyranoside), 제니스테인-7-O-β-D-글루코피라노시드(genistein-7-O-β-D-glucopyranoside)를 처리한 후, 제니스테인과 비교하였다. 그 결과, 상기 제니스테인 글루코시드는 제니스테인보다는 덜 효과적이지만, 암세포 생장에 저해 활성이 나타남을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- 하기의 화학식 3 내지 화학식 4 및 화학식 8 내지 화학식 11로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화학식으로 표시되는 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염:
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
- 삭제
- 다음 단계를 포함하는 제1항의 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법:
(a) 글리코실전달효소 또는 람노실전이효소 또는 추가로 당-O-메틸전이효소 존재 하에 제니스테인(Genistein)과 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스 또는 dTDP-L-람노오스를 반응시켜 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 회수하는 단계.
- 제3항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전달효소는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당-O-메틸전이효소는 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa) NRRL 18395 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 단계를 포함하는 제1항의 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법:
(a) 글리코실전달효소 또는 람노실전이효소를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체 또는 추가로 당-O-메틸전이효소를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체를 제니스테인(Genistein)과 dTDP-α-2-데옥시-D-글루코스 또는 dTDP-L-람노오스를 반응시켜 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 회수하는 단계.
- 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 글리코실전달효소는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 또는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당-O-메틸전이효소는 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa) NRRL 18395 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항의 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 암은 위암, 피부암, 자궁 경부암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학 조성물.
- 제1항의 제니스테인(Genistein) 글리코시드 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제11항에 있어서, 상기 암은 위암, 피부암, 자궁 경부암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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| Adv. Nutr. Vol. 6, Pages 408-419(공개일: 2015.)* |
| Journal of Natural Products, Vol. 79, Pages 3072-3078(공개일: 2016. 12. 2.)* |
| Mol. Cells, Vol. 37, No. 2, Pages 172-177(공개일: 2014. 2. 19.)* |
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