TWI652062B - 雞肝水解物於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係一種雞肝水解物於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途，其中雞肝水解物係以一特定酵素製備，且包含如白胺酸(Leucine)、離氨酸(Lysine)、丙胺酸(Alanine)與谷胺酸(Glutamic acid)之游離胺基酸；藉此，本案雞肝水解物可用於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化之組合物，提升雞肝的產業價值。

Description

雞肝水解物於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途
本發明為一種雞肝水解物於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途，尤其係指一種以特定方法製備之雞肝水解物，可有效促進酒精代謝以及降低肝臟膠原蛋白堆積，以避免酒精性肝損傷與肝纖維化之情形。
肝臟疾病一直是台灣重要的全民健康議題，慢性肝病或肝硬化，以及肝炎一直都列名於台灣十大死因中。由於肝臟是人體十分重要的器官，執行相當多種重要功能，例如肝醣儲存、血漿蛋白合成、脂質代謝、有毒物質的分解代謝等等，因此肝臟受損會對人體造成廣泛的影響。肝臟損傷的起因可能是病毒感染造成的慢性發炎，或是酒精或藥物引起的肝損傷，若肝臟持續處於慢性發炎的狀況，導致肝組織細胞長期且不斷重複「受損-修復」的循環，便會導致肝臟纖維化，最終轉變成肝硬化。
目前對於肝纖維化或肝硬化並無有效的醫藥品，即使是在歐美廣泛使用的水飛薊素(silymarin)，在大型臨床試驗中仍然無法達到肝功能顯著改善的結果，因此開發具肝臟保護功效的醫藥保健物一直是研究的重點，例如美國專利US 2014007818(A1)號申請案是一種具有肝保護功效的苧麻屬植物(boehmeria)萃取物；另，中華民國專利TW I411432(B)號專利為一種由山竹萃取的山竹素(mangostin)用於肝臟保護的相關發明。但植物萃取物的使用上仍有許多要注意的要點，例如有些植物萃取物在高劑量時會有細胞毒性，有些植物萃取物不適合長期使用等等，因此開發安全性更高的保肝醫藥保健品是相當重要的研發方向。
另，過度飲酒所造成的肝臟損傷亦為一個重要的健康議題，由於基因背景的差異，有些人代謝酒精的能力較差，因此其肝臟較容易因飲酒而受損，故如何避免飲酒造成肝臟損傷，也是一重要的研發方向。本案發明人於2014年發表的期刊論文「Antioxidant activities of chicken liver hydrolysates by pepsin treatment」(International Journal of Food Science & Technology，2014年，49卷，1654~1662頁)中，發現以特定製法獲得的雞肝水解物，能降低D-半乳糖(D-galactose)誘發的氧化壓力，包含降低D-半乳糖誘發的脂質過氧化情形、提升抗氧化酵素活性等等。又，本案發明人在「Effects of chicken-liver hydrolysates on lipid metabolism in a high-fat diet」(Food Chemistry，2014年，160卷，148~156頁)一文中，亦提出在高油脂飲食的動物模式中，雞肝水解物能降低血脂、肝臟脂質含量、提 高抗氧化能力等等。但是該雞肝水解物是否能保護酒精誘發所造成的肝損傷、甚至保護肝纖維化的發生，仍屬未知。
今，發明人有鑑於現今對於雞肝水解物功效的研究仍有不足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明係有關於一種雞肝水解物於促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途，其中雞肝水解物包含100~200毫克/克(mg/g)的游離胺基酸，其中游離胺基酸可例如包含10~20毫克/克白胺酸(Leucine)、10~20毫克/克離胺酸(Lysine)、10~20毫克/克丙胺酸(Alanine)以及15~25毫克/克谷胺酸(Glutamic acid)。
於本發明之一實施例中，雞肝水解物較佳可例如含有11.28毫克/克白胺酸(Leucine)、10.68毫克/克離胺酸(Lysine)、10.01毫克/克丙胺酸(Alanine)以及18.38毫克/克谷胺酸(Glutamic acid)。
於本發明之一實施例中，雞肝水解物進一步包含選自牛磺酸(taurine)、肌肽(carnosine)以及甲肌肽(anserine)所構成之群組。
於本發明之一實施例中，牛磺酸為20~60毫克/100克，該肌肽係為10~20毫克/100克以及該甲肌肽係為150~250毫克/100克。
於本案之一實施例中，雞肝水解物係進一步提升酒精去氫酶以及乙醛去氫酶活性。
於本案之一實施例中，雞肝水解物係進一步降低酒精攝取下血清以及肝臟中三酸甘油酯含量。
於本案之一實施例中，雞肝水解物係進一步降低肝臟膠原蛋白堆積，且降低第1型膠原蛋白α鏈(collagen type 1 α，Col1 α)以及平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表現。
於本案之一實施例中，雞肝水解物係進一步降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、介白素-6(interleukin-6，IL-6)以及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表現。
於本案之一實施例中，雞肝水解物係以口服方式施予個體。
於本案之一實施例中，雞肝水解物可作為丸劑、膠囊、錠劑、顆粒、粉劑、口服液或懸浮液。
藉此，本案透過特定製備方法獲得之雞肝水解物，可用於降低肝臟膠原蛋白堆積，以達到肝臟保護之用途。
第一圖：酒精攝取下實驗動物血清肝臟生化指標影響分析圖。
第二圖：酒精攝取下實驗動物酒精代謝相關酵素影響分析圖。
第三圖(A)：酒精性肝損傷之實驗動物肝臟切片蘇木素-伊紅染色分析圖。
第三圖(B)：酒精攝取下實驗動物肝臟脂質變性指數分析圖。
第四圖：酒精攝取下實驗動物肝臟以及血清脂質含量分析圖。
第五圖：酒精攝取下實驗動物肝臟抗氧化酵素活性分析圖。
第六圖：硫代乙醯胺誘發肝損傷之實驗動物肝臟切片蘇木素-伊紅染色分析圖
第七圖：硫代乙醯胺誘發下實驗動物肝臟切片膠原蛋白染色以及膠原蛋白含量分析圖。
第八圖：硫代乙醯胺誘發下實驗動物肝纖維化指數分析圖。
第九圖：硫代乙醯胺誘發下實驗動物肝臟TGF-β、SMAD4、Col1 α與α-SMA基因表現分析圖。
第十圖：硫代乙醯胺誘發下實驗動物肝臟抗氧化力與脂質過氧化分析圖。
第十一圖：硫代乙醯胺誘發下實驗動物肝臟TNF-α、IL-6以及TGF-β蛋白質表現分析圖。
為令本發明之技術手段其所能達成之效果，能夠有更完整且清楚的揭露，茲詳細說明如下，請一併參閱揭露之圖式：
本發明係有關於一種雞肝水解物於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途，係以一有效劑量給予一所需個體，以提升酒精代謝相關酵素基因表現、酵素活性以及降低肝臟膠原蛋白堆積，並降低第1型膠原蛋白α鏈(collagen type 1 α，Col1 α)以及平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表現；此外，雞肝水解物亦可降低發炎相關因子，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、介白素-6(interleukin-6，IL-6)以及轉化生長因子-β(trahsforming growth factor-β，TGF-β)的表現；藉此，本發明之雞肝水解物具有肝臟保護之功效。本發明之雞肝水解物包含100~120mg/g的游離胺基酸，游離胺基酸可例如包含10~20mg/g白胺酸(Leucine)、10~20mg/g離胺酸(Lysine)、10~20mg/g丙胺 酸(Alanine)以及15~25mg/g谷胺酸(Glutamic acid)；此外，雞肝水解物進一步包含牛磺酸(taurine)、肌肽(carnosine)以及甲肌肽(anserine)其中之一或兩種以上之組合，其中牛磺酸為20~60mg/100g、肌肽為10~20mg/100g且甲肌肽為150~250mg/100g。
較佳而言，本發明之雞肝水解物可例如為丸劑、膠囊、錠劑、顆粒、粉劑、口服液或懸浮液之型態，並以口服方式施予所需個體。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實驗一：雞肝水解物之製備與分析
(一)雞肝水解物製備方法
本實驗所使用之雞肝收集後於-20℃冷凍儲存，製備水解物前一晚取出解凍、切割成小塊並秤重；將雞肝小塊加入去離子水(distilled water，ddH2O)並均質，放入恆溫水浴槽以熱水95℃水浴15分鐘，以去除雞肝內含的酵素活性，水浴後將樣品置於冰上並冷卻至室溫。將胃蛋白酶(pepsin，簡稱PE)加入冷卻樣品中，其酵素受質比為1：400(w/w)，並於37℃、pH=2.0之作用條件下水解2小時；2小時後以95℃加熱15分鐘以終止水解反應；冷卻後以2000G、4℃之條件離心15分鐘：離心後取上層水解液，以55mm濾紙過濾並將濾液酸鹼值調整至pH=7.0，將濾液凍乾並保存於-20℃，即獲得本發明之雞肝水解物(chicken liver hydrolysates，後續簡稱CLH)。
(二)雞肝水解物分析
本實驗委託財團法人食品發展工業研究所進行檢測，主要原理參考Konosu等人在1974年的方法，利用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)萃取所需之樣品。將5克的受測物與20mL之7%TCA溶液混 合並靜置2分鐘後再以4000g、4℃離心20分鐘，上清液以濾紙過濾，並以7%TCA溶液調整體積至100mL以獲得一TCA混合液；取40ml之TCA混合液加入等量乙醇以洗去TCA，再減壓濃縮將水層去除，最後以去離子水定量至25mL，即成為TCA可溶性抽出物。 以0.02N HCl適當稀釋1mL的TCA可溶性抽出物，並以0.2μm濾膜過濾後，以胺基酸分析儀(Hitachi L8800 amino acid analyzer,Hitachi High-Technologies Co.,Tokyo,Japan)分析之。
參見表一，為雞肝水解物的游離胺基酸及胜肽含量分析表；結果顯示雞肝水解物中，L-白胺酸、L-離胺酸、L-丙胺酸以及L-谷胺酸的含量最高，其含量皆大於10mg/g；此外，雞肝水解物中也含有牛磺酸(taurine)以及功能性雙胜肽，如甲肌肽(anserine)以及肌肽(carnosine)。
實驗二：雞肝水解物於酒精性肝損傷之功效
(一)實驗動物
自國立台灣大學實驗動物中心購買48隻雄性C57BL/6J(B6)老鼠，其週齡為8週、體重介於19~21克，並將老鼠以兩隻一籠的方式，飼養於22±2℃、12小時晝夜循環之環境當中，動物購入後會使其適應環境一週後再開始進行實驗。動物被隨機分成6組，分別為：(1)對照組(CON)：飲用一般純水，並每日管餵(oral gavage)0.2mL去離子水；(2)酒精組(EtOH)：給予Lieber-Decarli酒精流質飼料，並每日管餵0.2mL去離子水；(3)雞肝水解物低劑量組(CLH-L)：給予Lieber-Decarli酒精流質飼料，並每日管餵雞肝水解物之水溶液，含量為80mg/kg-體重，且最終體積為0.2mL；(4)雞肝水解物中劑量組(CHL-M)：給予Lieber-Decarli酒精流質飼料，並每日管餵雞肝水解物之水溶液，含量為320mg/kg-體重，最終體積為0.2mL； (5)雞肝水解物高劑量組(CHL-H)：給予Lieber-Decarli酒精流質飼料，並每日管餵雞肝水解物之水溶液，含量為1280mg/kg-體重，最終體積為0.2mL；(6)水飛薊素組(SLM)：給予Lieber-Decarli酒精流質飼料，且每日管餵水飛薊素(silymarin)水溶液，含量為150mg/kg-體重，最終體積為0.2mL。
Lieber-Decarli酒精流質飼料的配方請見表二。
動物實驗共維持8週，於實驗開始以及結束時會記錄每隻老鼠的體重，實驗過程中亦會每日紀錄老鼠流質飼料食用量，作為食物攝取量的依據。8週後犧牲老鼠，並採集其血液檢體、心臟、肝臟、 腎臟、副睪脂肪(epididymal fat)組織、腎周圍脂肪(perirenal fat)組織；臟器以及脂肪組織會秤重並保存於-80℃。
此研究使用完全隨機設計(Completely Randomized Design)，實驗數據以「平均值±平均值標準誤差(mean±SEM)」呈現，並以變異數分析(analysis of variance，ANOVA)進行統計分析，再以最小顯著差異法(least significant difference)方法比較各組之間差異；實驗數據結果皆以SAS9.2軟體處理。在呈現上，若兩組之間沒有顯著差異而分類在同一組，則會以相同之小寫英文字母標記，若有些組別被標記為「ab」，表示該組別與「a」組無顯著差異，與「b」組亦無顯著差異，故同時被分類在「a」組與「b」組。
(二)雞肝水解物對實驗動物之影響
(1)臟器重量變化
各組實驗動物的體重以及流質飼料食用量並沒有顯著差異(結果未顯示)，其各種臟器以及脂肪組織與體重的相對重量(relative size，g/100g-體重)請見表三，其中各組實驗動物的心臟與腎臟重量並無顯著差異(p>0.05)，但是EtOH組的肝臟重量與脾臟重量與CON組相比有上升的現象(p<0.05)；而餵食雞肝水解物(CLH-L組、CLH-M組、CLH-H組)以及水飛薊者(SLM組)，其脾臟、腎周圍脂肪以及副睪脂肪組織的重量與EtOH組相比，明顯下降(p<0.05)。
(2)血液生化值
肝臟中富含天門冬胺基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)以及丙胺酸胺基轉移酶(alanine aminotransderase，ALT)，在肝臟細胞受損時，AST與ALT會釋放並進入血液；而鹼性磷酸酶(alkaline phosphotase，ALKP)主要由肝臟、與骨骼與胎盤所製造，再經由肝臟排入膽汁當中，若膽汁排除管道有障礙時，膽汁會回到血液當中，而造成ALKP上升；因此分析血清中AST、ALT與ALKP的含量可以做為初步評估肝膽功能的指標。
參見第一圖，為各組實驗動物血清中AST、ALT與ALKP含量分析圖；ALT含量在CON組與EtOH組之間並無顯著差異(p>0.05)，但EtOH組血清中AST與ALKP含量顯著高於CON組(p<0.05)，而雞肝水解物組(CLH-L組、CLH-M組、CLH-H組)能顯著降低實驗動物肝臟AST以及ALKP含量(p<0.05)。
(3)酒精代謝能力評估
為檢測雞肝水解物對於酒精代謝的影響，偵測實驗動物肝臟酒精去氫酶(Alcohol dehydrogenase，Adh)以及乙醛去氫酶(Acetaldehyde dehydrogenase，Aldh)的表現。參見第二圖，與CON組比較，EtOH組的Adh基因以及Aldh基因表現稍微上升，而雞肝水解物組(CLH-L組、CLH-M組或CLH-H組)的Adh基因以及Aldh基因表現與CON組以及EtOH組相比，具有顯著上升的現象(p<0.05)。此外，相比於CON組，EtOH組可顯著提升酒精去氫酶或乙醛去氫酶的酵素 活性(p<0.05)，而CLH-M組與CLH-H組的乙醛去氫酶活性亦顯著高於EtOH組(p<0.05)。
(4)肝細胞型態觀察
將各組實驗動物的肝臟切片後使用蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin stain,H&E stain)，以觀察肝臟的型態變化。參見第三圖(A)，CON組中肝細胞型態正常(明顯的6~8角形)且整齊地圍著中央靜脈(central vein，簡稱CV)，但EtOH組中，觀察到許多膨大的脂肪小滴堆積，為典型大囊泡脂肪肝的特徵；但給予雞肝水解物者，不論是CLH-L組、CLH-M、CLH-H組與水飛薊組(SLM)，肝細胞的型態明顯與CON組幾乎沒有差異。此外，以脂質變性指數(steatosis score)針對各組切片進行脂肪變性(steatosis)的評估，將肝臟脂肪堆積情形給予0~3分進行評比。評比係以雙盲的方式進行，樣本以有產生脂肪變性的肝細胞比例做為評分的標準，評分標準請見表四：
獲得結果如第三圖(B)，EtOH組的脂質變性指數顯著高於CON組(p<0.05)，而雞肝水解物組(CLH-L組、CLH-M組與CLH-H組)的脂 質變性指數(steatosis score)與EtOH組相比顯著下降(p<0.05)，且與CON組無顯著差異(p>0.05)。
(5)血清與肝臟脂質含量
進一步測試各組實驗動物血清與肝臟的脂質含量，如第四圖，EtOH組的實驗動物肝臟與血清中的三酸甘油酯皆顯著高於CON組(p<0.05)，而雞肝水解物組(CLH-L組、CLH-M組與CLH-H組)與EtOH組相比，其肝臟與血清三酸甘油酯含量皆顯著下降(p<0.05)。此外，EtOH組雖會使血清總膽固醇上升，但雞肝水解物並不會顯著降低血清總膽固醇，另外各組別的肝臟總膽固醇含量並無顯著差異。
(6)血清與肝臟抗氧化能力評估
以ABTS自由基清除能力，作為實驗動物血清或肝臟樣品抗氧化能力(trolox equivqlent antioxidant capacity，TEAC)的評估，其單位為每單位樣品中含有多少水溶性維生素E(trolox)當量(TE)；另以硫巴比妥酸反應物質(thiobarbituiic acid reactive substance，TBARS)分析法測量樣本脂質過氧化的情形。
根據表五，EtOH組的血清與肝臟TEAC值會顯著低於CON組(p<0.05)，但雞肝水解物組(CLH-L組、CLH-M組與CLH-H組)的血清或肝臟TEAC值皆有顯著回升的現象(p<0.05)；此外，EtOH組血清以及肝臟中的TBARS值皆顯著高於CON組(p<0.05)，而CLH-M組與CLH-H組的血清與肝臟TBARS值卻顯著低於EtOH組(p<0.05)。
另，量測肝臟中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及榖胱甘肽過氧化氫酶(glutathione peroxidase，GPx)的活性，以評估實驗動物肝臟抗氧化系統；參閱第五圖，EtOH組的SOD活性與GPx活性顯著低於CON組(p<0.05)，而雞肝水解物組，尤其是CLH-M組與CLH-H組的SOD活性與GPx活性皆顯著提升(p<0.05)。根據上述實驗結果，雞肝水解物的確能提升肝臟的抗氧化能力。
實驗三：雞肝水解於減緩肝臟纖維化之功效
(一)實驗動物
由樂斯科生物科技股份有限公司(BioLASCO Taiwan Co.,Ltd.Taipei,Taiwan)40隻5週齡雄性Wistar大鼠，飼養於環境控制在22±2℃、明暗週期12小時的動物房中；動物購入後會先使其適應環境一週後才開始進行實驗，動物被隨機分配為五組，分別為： (1)對照組(CON)：腹腔注射(intraperitoneal injection)0.3mL生理食鹽水，以及管餵0.5mL去離子水；(2)硫代乙醯胺組(TAA)：腹腔注射0.3mL硫代乙醯胺(tiioacetamide，TAA)溶液，TAA之含量為100mg/kg-體重，並管餵0.5mL去離子水；(3)雞肝水解物低劑量組(CLH-L)：腹腔注射0.3mL TAA溶液，TAA之含量為100mg/kg-體重，並管餵雞肝水解物水溶液，其中雞肝水解物含量為200mg/kg-體重，且最終體積為0.5mL：(4)雞肝水解物高劑量組(CLH-H)：腹腔注射0.3mL TAA溶液，TAA之含量為100mg/kg-體重，並管餵雞肝水解物水溶液，其中雞肝水解物含量為600mg/kg-體重，且最終體積為0.5mL；以及(5)肌肽(CNS)組：腹腔注射0.3mL TAA溶液，TAA之含量為100mg/kg-體重，並管餵肌肽(carnosine)水溶液，肌肽含量為200mg/kg-體重，且最終體積為0.5mL。
動物實驗持續十週，每週以腹腔注射法施打一次TAA溶液，並每日管餵上述之去離子水、雞肝水解物或肌肽。動物飼料的成分中，每公斤含有487克醣類、239克蛋白質、50克脂質、51克纖維質以及70克灰分(ash)。實驗結束時前一晚將飼料移除並禁食，次日將實驗動物麻醉犧牲，採集其各器官秤重後保存於-80℃。
此研究使用完全隨機設計(Completely Randomized Design)，實驗數據以「平均值±平均值標準誤差(mean±SEM)」呈現，並以變異數分析(analysis of variance，ANOVA)進行統計分析，再以最小顯著差異法(least significant difference)方法比較各組之間差異；實驗數據結果皆以SAS9.2軟體處理。在呈現上，若兩組之間沒有顯著差 異而分類在同一組，則會以相同之小寫英文字母標記，若有些組別被標記為「ab」，表示該組別與「a」組無顯著差異，與「b」組亦無顯著差異，故同時被分類在「a」組與「b」組。
(二)雞肝水解物對實驗動物之影響
(1)體重以及進食狀況
表六為各組別實驗動物，其體重變化情形以及飼料效率(feed efficiency)之狀況。結果顯示，與CON組相比，TAA會使大鼠的體重明顯下降(p<0.05)，且餵食CLH與CNS並不會使大鼠的體重顯著回升(p>0.05)；餵食CLH之大鼠(CLH-L組與CLH-H組)的食物攝取量與CON組或TAA組相比顯著下降(p<0.05)。
(2)臟器或組織重量
表七為實驗後各組別大鼠之臟器或腎周圍脂肪(perirenal fat)重量，TAA組大鼠與CON組相比，肝臟、腎臟以及脾臟的相對重量顯著增加(p<0.05)，且給予CLH或CNS並不會使肝、腎及脾臟的重 量回復至與CON組相似的狀況；其他的臟器或腎周圍脂肪(perirenal fat)的相對重量於各組別之間並無顯著差異(p>0.05)。
(3)血液生化值
表八為各組實驗鼠之血液生化值分析結果，顯示與CON組相比，TAA會導致血中AST與ALT顯著上升(p<0.05)，而餵食高劑量之雞肝水解物(CLH-H組)會減緩此現象；此外，TAA組實驗大鼠血清中的總蛋白質以及三酸甘油酯的含量亦顯著低於CON組(p<0.05)，由於肝臟是大部分血清蛋白以及內源性三酸甘油酯的來源，故血清總蛋白質以及三酸甘油酯下降有可能是因為肝臟受損所致。總膽固醇以及血中尿素氮的含量於各組別之間皆無顯著差異(p>0.05)。
(4)肝細胞型態觀察
將大鼠之肝臟切片後，以蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin stain,H&E stain)觀察肝臟的型態變化。參見第六圖，CON組中肝細胞型態正常且整齊地圍著中央靜脈(central vein，簡稱CV)，反觀TAA組中，中央靜脈的週邊有許多浸潤細胞(非肝細胞)，且肝細胞的排列凌亂；但給予雞肝水解物者，尤其是CLH-H組，浸潤細胞明顯變少，且肝細胞的型態與排列皆較近似CON組。
(5)肝臟膠原蛋白堆積分析
本實驗以Sirius Red染色法觀察肝臟中膠原蛋白堆積之情形，Sirius Red染劑會與膠原蛋白的螺旋(helical)結構結合，因此可以標記出膠原蛋白的位置；參見第七圖，CON組僅在中央靜脈(CV)周邊偵測到膠原蛋白，但TAA組觀察到大面積的膠原蛋白堆積(紅色染色處)，而CLH-L與CLH-H組中膠原蛋白堆積的情形有所減緩。此外，使用METAVIR計分系統評估肝臟纖維化指數(fibrotic score)，指數越高表示纖維化情形越嚴重。參見第八圖，與CON組相比，TAA組之肝纖維化指數以及膠原蛋白含量顯著提高(p<0.05)，然而雞肝水解物的給予會顯著降低肝纖維化指數以及膠原蛋白含量(p<0.05)。
(6)肝臟發炎相關與纖維化相關基因表現
肝臟纖維化的起因多為肝組織不斷經歷「受損-修復」的過程，最終導致肝細胞外結締組織基質(matrix)改變、膠原蛋白增生且交錯 纏繞而形成結痂組織，若此現象不斷持續，最終將導致肝硬化。在此過程中，發炎反應相關的細胞激素，例如轉化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)會透過與SMAD蛋白質活化其目標基因，包括結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、第1型膠原蛋白α鏈(collagen type 1 α，Col1 α)、平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)等基因的表現。為了解雞肝水解物是否會參與調控肝纖維化過程中的基因表現，本實驗以即時定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR)檢測大鼠肝臟TGF-β、SMAD蛋白質(SMAD4)、Col1 α與α-SMA的表現情形。請參閱圖第九圖，與CON組相比，TAA組大鼠肝臟的TGF-β、SMAD4、Col1 α、α-SMA的表現量顯著上升(p<0.05)，且上述四個基因在雞肝水解物組的表現(尤其是在CLH-H組)與TAA組相比顯著下降(p<0.05)。
(7)肝臟抗氧化能力以及脂質過氧化情形
氧化壓力或是自由基亦會造成肝細胞損傷及發炎，若肝臟長久處於氧化壓力下，亦可能導致纖維化的產生。本實驗以ABTS自由基清除之情形，作為抗氧化能力(trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)的評估，單位以每重量單位樣品中含有多少trolox當量表示(TE)；另以硫巴比妥酸反應物質(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)分析法檢測樣本脂質過氧化情形。
參閱第十圖，與CON組相比，TAA組大鼠肝臟的總抗氧化能力與顯著下降(p<0.05)，且脂質過氧化情形顯著上升(p<0.05)，但給予雞肝水解物，尤其是給予高劑量雞肝水解物(CLH-H組)，可顯著提高總抗氧化能力以及降低脂質過氧化之情形(p<0.05)。
(8)雞肝水解物對發炎反應之影響
本實驗以酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測實驗動物肝臟中發炎相關分子的表現。參見第十一圖，TAA組中，實驗動物肝臟中發炎相關分子TNF-α、IL-6以及TGF-β的含量顯著高於CON組(p<0.05)，而雞肝水解物的使用可顯著降低肝臟TNF-α、IL-6以及TGF-β的含量(尤其是CLH-H組)(p<0.05)，表示雞肝水解物具有調控發炎反應的功效。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明之雞肝水解物，含有豐富的游離胺基酸，並含有功能性雙胜肽(肌肽與甲肌肽)。
2.本發明之雞肝水解物能提高酒精去氫酶或乙醛去氫酶的表現與活性，能幫助酒精代謝。
3.本發明之雞肝水解物能降低肝臟以及血清脂三酸甘油酯，具有促進脂質代謝的功效。
4.本發明之雞肝水解物降低纖維化相關基因的表現，例如降低Col1 α或α-SMA的表現，並可減少肝臟膠原蛋白堆積，以減緩降低肝臟纖維化之情形。
5.本發明之雞肝水解物能降低肝臟氧化壓力以及脂質氧化情形，並提高抗氧化酵素，如超氧化物歧化酶(SOD)或榖胱甘肽過氧化氫酶(GPx)之活性。
6.本發明之雞肝水解物能降低發炎相關分子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、介白素-6(interleukin-6，IL-6) 以及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表現，故具有調控免疫反應的潛力。
綜上所述，本發明雞肝水解物於製備降低肝臟纖維化組成物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims (4)

  1. 一種雞肝水解物於製備促進酒精代謝以及降低肝臟纖維化組成物之用途，其係以一有效劑量之雞肝水解物施予一所需個體，以提升酒精去氫酶活性、提升乙醛去氫酶活性以及降低導致肝臟纖維化之1型膠原蛋白α鏈(collagen type 1 α，Col1 α)以及平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表現以達到肝臟保護之功效，其中該雞肝水解物係將一雞肝以胃蛋白酶(pepsin)，於酵素受質1：400(w/w)之比例進行水解而得，包含100~200毫克/克游離胺基酸，且其中該游離胺基酸係含有10~20毫克/克白胺酸(Leucine)、10~20毫克/克離胺酸(Lysine)、10~20毫克/克丙胺酸(Alanine)、15~25毫克/克谷胺酸(Glutamic acid)以及選自由牛磺酸(Taurine)、肌肽(carnosine)以及甲肌肽(anserine)所構成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該游離胺基酸係含有11.28毫克/克白胺酸(Leucine)、10.68毫克/克離胺酸(Lysine)、10.01毫克/克丙胺酸(Alanine)以及18.38毫克/克谷胺酸(Glutamic acid)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該雞肝水解物係以口服方式施予該個體。
  4. 如申請專利範圍請第3項所述之用途，其中該雞肝水解物係為丸劑、膠囊、錠劑、顆粒、粉劑、口服液或懸浮液。
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