TWI651314B - 聚乙烯吡咯衍生物用於治療發炎之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關式(I)之化合物或其醫藥上可接受鹽類用於製造治療發炎藥劑之用途。
Description
本發明係有關聚乙烯吡咯衍生物用於治療發炎之新穎用途。
共軛多烯類為一種廣泛存在的天然聚酮類的有趣類別,其已證實具有極佳生物性質,如抗菌性(Shim SH et al.,(2011)J Nat Prod 74(3):395-401)、抗真菌性(Shim SH et al.supra;Chomcheon P et al.,(2010)Chemistry 16(36):11178-11185)及抗腫瘤活性(Gross H et al.(2009)Org Lett 11(21):5014-5017;Yang YL et al.(2007)Chemistry 13(24):6985-6991)。
發炎反應的發生在於反應多種情況,包括物理性傷害、刺激、組織腫瘤生長、及細菌、寄生蟲、真菌、或病毒之感染。發炎反應造成局部及全身性影響。傷害、刺激、或疾病部位所發生的代表性影響為血管通透性增加、降解酶(包括金屬蛋白酶)釋出、白血球移行至受影響部位、嗜中性球爆發反應以消滅入侵細胞、及細胞介素分泌。重要的全身性影響包括疼痛、發熱、及肝臟急性反應。
發炎細胞包括淋巴細胞、單核巨噬細胞及樹狀細胞。一旦活化,這些發炎細胞可藉由釋放發炎介質而誘導一連串發炎反應、對抗感染或外來顆粒。此外,一氧化氮(NO)、介白素-6(IL-6)、及TNF-α為重要的
促發炎介質,其主要由脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)活化型巨噬細胞產生,並媒介多種生物效應,包括活化免疫反應。此外,發炎體為多蛋白傳訊複合體,可活化凋亡蛋白酶-1(caspase-1)。在發炎體之中,NLRP3發炎體為最被充分研究之其中一者。在LPS活化型巨噬細胞中,三磷酸腺苷可活化NLRP3發炎體,其造成凋亡蛋白酶-1活化及IL-1β分泌(Hu Y,et al.,J Immunol.2010 Dec 15;185(12):7699-705)。
在先前研究中,我們自嗜熱真菌嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)分離某些聚酮類,並證實這些化合物之一些具抗腫瘤活性(Yang YL et al.,同前)。我們亦合成一種類型的聚乙烯吡咯類及其類似物,並評估其抗腫瘤活性。然而,並未揭示聚乙烯吡咯衍生物的抗發炎活性。
在本發明中,意外發現本文所定義之式(I)聚乙烯吡咯衍生物具極佳抗發炎活性。特別地,這些化合物不具細胞毒性。因此,本發明提供一種新穎方法,係以這些聚乙烯吡咯衍生物治療發炎反應。
在一方面,本發明提供治療發炎反應之方法,其包含投予治療上有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受鹽類至有需求之個體:
其中R1、R2及R3獨立地為H或烷基,且Ar為含有一、二或三個選自於由N、O及S所組成群組之雜原子的芳基或五元雜芳基,其中芳基及雜芳基
係未經取代或由一或二個獨立地選自於由鹵素及甲磺醯基所組成群組之取代基取代,惟當R3為甲基、Ar不為3-氯吡咯基。
本發明亦提供如本文所述之式(I)化合物或其醫藥上可接受鹽類之用途,以製造用於治療發炎之藥劑。
在本發明之某些具體實施例中,芳基為六元單環、十元雙環、或十四元三環芳基。芳基之實例包括但不限於,苯基、萘基、芘基、蒽基、及菲基。
在本發明之某些具體實施例中,五元雜芳基係選自於由吡咯基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、異噁唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、噁二唑基、及噻二唑基組成之群組。
在本發明之一具體實施例中,R1為H或甲基。
在本發明之一具體實施例中,R3為H或甲基。
在本發明之一具體實施例中,R2為H。
在本發明之一些具體實施例中,Ar係選自於由3-氯吡咯-2-基、3-氯噻吩-2-基、2-氯苯基、及3-氯-1-甲磺醯基-吡咯-2-基組成之群組。
在本發明之某些實例中,式(I)之化合物係選自於由化合物1h、化合物1i、化合物1j、化合物1k、化合物1l、化合物1m及化合物1n組成之群組,其具下列結構:
在本發明之一具體實施例中,式(I)之化合物係於個體之發炎細胞中以治療上有效量(i)抑制NO產生或iNOS、IL-6或TNF-α表現、(ii)抑制NLRP3發炎體媒介之IL-1β表現、或(iii)抑制活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)產生、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPR)磷酸化、NF-κB活化或蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活化。
在本發明之具體實施例中,發炎細胞為巨噬細胞或樹狀細胞。
本發明亦提供用於治療發炎反應之組合物,其包含本文所述之式(I)化合物。進一步提供本文所述之式(I)化合物之用途,用於製造治療發炎之藥劑。本發明之一或多個具體實施例之詳述係列於下方說明中。本發明之其他特徵或優勢可由下列數個具體實施例之詳細說明及所附之申請專利範圍而更臻清楚。
欲說明本發明,圖示具體實施例如下。然而,應理解到,本發明未侷限於所示之較佳具體實施例。在圖式中:圖1係顯示合成之聚乙烯吡咯類之骨架。
圖2係顯示聚乙烯吡咯衍生物對於RAW 264.7巨噬細胞之發炎調節物表現的影響。在(A)及(C)中,細胞(5×105/ml)以聚乙烯吡咯衍生物或DMSO(載劑)培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激24h,隨後分別以革利士反應(Griess reaction)及ELISA分析培養液中NO(A)、IL-6及TNF-α(C)的濃度。在(B)中,細胞(5×105/ml)以聚乙烯吡咯衍生物或DMSO預處理30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激24h,隨後以西方墨點法分析iNOS及COX-2的蛋白表現。在(A)及(C)中,三個個別實驗的數據以平均值±SD表示,而在(B)中,其結果代表三次不同實驗所得者,而柱狀圖為定量結果並以平均值±SD表示。*、**、及#係分別代表相較於LPS組的顯著差異程度p<0.05、p<0.01、p<0.001。
圖3係顯示化合物1h對於J774A.1巨噬細胞、腹腔巨噬細胞、及JAWSII樹狀細胞之IL-6及TNF-α分泌的影響。(A)J774A.1巨噬細胞(4×105/ml)、(B)腹腔巨噬細胞(4×105/ml)、及(C)JAWSII樹狀細胞(4×105/ml)以化合物1h或DMSO培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激24h,隨後以ELISA分析培養液之IL-6及TNF-α濃度。三個個別實驗的數據以平均值±SD表示。*、**、及***係分別代表相較於LPS組的顯著差異程度p<0.05、p<0.01、p<0.001。
圖4係顯示化合物1h對於LPS+ATP活化型J774A.1巨噬細胞之NLRP3發炎體活化的影響。(A)J774A.1巨噬細胞(1×106/ml)
及(B)腹腔巨噬細胞(1×105/ml)以化合物1h培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激5.5h,隨後細胞額外以ATP(5mM)刺激30min。以ELISA測定培養液之IL-1β,並以西方墨點法測定活化型凋亡蛋白酶-1(p10)的表現。在(C)及(D)中,J774A.1巨噬細胞(1×106/ml)以LPS(1μg/ml)培養5.5h,接著細胞以化合物1h培養30min,隨後額外以ATP(5mM)刺激30min。以ELISA測定培養液之IL-1β及IL-6,並以西方墨點法測定活化型凋亡蛋白酶-1(p10)的表現。在(E)中,J774A.1巨噬細胞(1×106/ml)以化合物1h培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激6h。以西方墨點法測定NLRP3及proIL-1β的表現。在ELISA方面,三個個別實驗的數據以平均值±SD表示,而在西方墨點法方面,其結果代表三次不同實驗所得者,而柱狀圖為定量結果並以平均值±SD表示。*、**、及***係分別代表相較於LPS+ATP組或LPS組的顯著差異程度p<0.05、p<0.01、及p<0.001。
圖5係顯示化合物1h對於LPS活化型巨噬細胞之ROS產生及MAPK磷酸化的影響。在(A)中,RAW 264.7巨噬細胞(5×105/ml)以化合物1h(20μM)、N-乙醯半胱胺酸(NAC;10mM)或DMSO(載具)培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激一指定時間,隨後藉由檢測螢光團羧基-DCF之螢光強度以測定ROS的量,並以相對於時間點零的值表示。在(B)中,RAW 264.7巨噬細胞(5×105/ml)以化合物1h(20μM)或DMSO培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激0至60min,隨後以西方墨點法分析ERK1/2、JNK1/2、p38磷酸化的量。在(C),J774A.1巨噬細胞(5×105/ml)以化合物1h或DMSO培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激20min,隨後以西方墨點法分析ERK1/2、JNK1/2、p38磷酸化的量。
在(A)中,三個個別實驗的數據以平均值±SD表示,而在(B)及(C)中,其結果代表三次不同實驗所得者,而柱狀圖為定量結果並以平均值±SD表示。*代表相較於LPS組的顯著差異程度p<0.05。
圖6係顯示化合物1h對於LPS活化型巨噬細胞之NF-κB活化作用。(A)RAW 264.7巨噬細胞(5×105/ml)或(B)J774A.1巨噬細胞(5×105/ml)以化合物1h或DMSO培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激20min,隨後以西方墨點法分析IKK-α及IκB-α磷酸化的量及總IκB-α蛋白量。(C)RAW 264.7巨噬細胞(5×105/ml)或(D)J774A.1巨噬細胞(5×105/ml)以化合物1h(10至40μM)或DMSO培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激20min,隨後以ELISA分析NF-κB之核易位。(E)RAW-BlueTM細胞(5×105/ml)以化合物1h(2.5至40μM)或DMSO培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激24h,隨後以QUANTI-BlueTM測定SEAP活性。在(A)及(B)中,其結果代表三次不同實驗所得者,而柱狀圖為定量結果並以平均值±SD表示。p-IKK-α及p-IκB-α係分別以IKK-α及肌動蛋白標準化。在(C)、(D)、及(E)中,三個個別實驗的數據以平均值±SD表示。*、**、及***係分別代表相較於LPS組的顯著差異程度p<0.05、p<0.01、及p<0.001。
圖7係顯示化合物1h對於ATP活化型巨噬細胞之ROS產生及PKC-α磷酸化作用的影響。在(A)中,J774A.1巨噬細胞(1×106/ml)以LPS(1μg/ml)培養5.5h,接著以化合物1h(20μM)、DPI(100μM)、或DMSO(載具)培養30min,隨後以ATP(5mM)刺激一指定時間,最後藉由檢測螢光團羧基-DCF之螢光強度以測定ROS的量,並以相對於時間點零
的值表示。在(B)中,J774A.1巨噬細胞(1×106/ml)以化合物1h(20μM)、DPI(100μM)、或DMSO(載具)培養30min,接著以LPS(1μg/ml)刺激5.5h,隨後細胞以ATP(5mM)刺激一指定時間。藉由檢測螢光團羧基-DCF之螢光強度以測定ROS的量,並以相對於時間點零的值表示。在(C)中,LPS處理之J774A.1巨噬細胞(1×106/ml)係以化合物1h(20μM)或DMSO(載具)培養30min,接著以ATP(5mM)刺激0至60min,隨後以西方墨點法分析PKC-α磷酸化的量。在(A)及(B)中,三個個別實驗的數據以平均值±SD表示,而在(C)中,其結果代表三次不同實驗所得者,而柱狀圖為定量結果並以平均值±SD表示。*係代表相較於ATP組的顯著差異程度p<0.05。
下列描述僅旨在說明本發明之各具體實施例。因此,本文所論及之特定具體實施例或改良不可解釋為侷限本發明之範疇。熟習本領域之技術人員可顯見的是,所進行的各種變更或等同物並未背離本發明之範疇。
為了使本發明更明確且易於理解,必須先定義特定術語。額外的定義係列於實施方式全文中。除非另有定義,本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能常規理解的意義。
本文所使用的冠詞「一」與「一者」是指一或大於一者(亦即,至少一者)的該冠詞語法對象。舉例而言,「一元件」是指一元件或大於一者之元件。
下表係顯示一些術語之縮寫。
先天性免疫通常由病原體相關聯之分子類型所觸發,這些分子類型分屬不同微生物病原體族群,其由表現於免疫細胞表面上的類鐸受體(toll-like receptor,TLR)或其他細胞受體辨識(Medzhitov R,Janeway CA.(1997)Cell 91:295-298)。LPS為一種革蘭氏陰性菌之病原體相關聯分子類型,其能誘導發炎介質(包括NO、TNF-α、及IL-6)表現,並結合至TLR4(Takeda K,Kaisho T,Akira S.(2003)Annu.Rev.Immunol 21:335-376)。不同於其他細胞介素,於活化之巨噬細胞,IL-1β係經由轉錄活化而合成不活化之不成熟型(IL-1β之前驅物,proIL-1β)(Hsu HY,Wen MH.(2002)J Biol Chem 277(25):22131-22139)。IL-1β之釋出係由NLRP3發炎體調控,NLRP3發炎體為含有凋亡蛋白酶-1的多蛋白複合體(Cassel SL,Joly S,Sutterwala FS.(2009)Semin Immunol 21(4):194-198;Jin C,Flavell RA.(2010)J Clin Immunol 30(5):628-631)。NLRP3發炎體可控制疾病進程及感染(Kanneganti TD et al.(2006)Nature 440(7081):233-236;Allen IC et al.(2009)Immunity 30(4):556-565;Gross O et al.(2009)Nature 459
(7245):433-436)、肥胖(Vandanmagsar B et al.(2011)Nat Med 17(2):179-188)、膽固醇結晶(Duewell P et al.(2010)Nature 464(7293):1357-1361)、二氧化矽結晶(Hornung V et al.(2008)Nat Immunol 9(8):847-856)、澱粉樣蛋白β(Halle A et al.(2008)Nat Immunol 9(8):857-865)、及尿酸結晶(Martinon F et al.(2006)Nature 440(7081):237-241)等所導致之發炎反應。近來的發現顯示,ROS調節NLRP3發炎體活化或TLR4傳訊傳遞(Hsu HY et al..(2010)Eur J Immunol 40(3):616-619;Liao PC et al.(2010)J Agric Food Chem 58(19):10445-10451),而抑制NLRP3活化為發炎相關疾病的治療策略之一(Tsai PY et al.(2011)Free Radic Biol Med 51(3):744-754)。
在本發明中,意外發現式(I)之聚乙烯吡咯衍生物具抗發炎活性,具體而言是在減少NO表現、及減少iNOS、IL-6或TFN-α表現、及抑制NLRP3發炎體媒介之IL-1β表現的功效方面,但不會減少COX-2表現。發明人亦發現,本發明式(I)之聚乙烯吡咯衍生物之抗發炎活性的潛在機制係涉及減少ROS產生、MAPK磷酸化、及NF-κB活化,以及減少ATP誘導型ROS產生及PKC-α磷酸化。
因此,本發明提供治療發炎反應之方法,其包含投予一治療有效量之式(I)化合物或其醫藥上可接受鹽類至有需求之個體:
其中R1、R2及R3獨立地為H或烷基,且Ar為含有一、二或三個選自於由N、O及S所組成群組之雜原子的芳基或五元雜芳基,其中芳基及雜芳基係未經取代或由一或二個獨立地選自於由鹵素及甲磺醯基所組成群組之取代基取代,惟當R3為甲基、Ar不為3-氯吡咯基。
亦提供用於治療發炎反應之組合物,其包含本文所述之式(I)化合物。進一步提供本文所述之式(I)化合物之用途,用於製造治療發炎反應之藥劑。
本文所使用的「烷基」乙詞是指含有,除非特別指明,1至20個碳原子(如C1-C10、C1-C8、或C1-C4,)的直鏈或支鏈單價碳氫化合物。烷基之實例包括但不限於,甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、及三級丁基。
本文所使用的「芳基」乙詞是指單價六碳單環、十碳雙環、十四碳三環芳環系統。芳基之實例包括但不限於,苯基、萘基、芘基、蒽基、及菲基。在一實例中,芳基為苯基。本文所使用的「雜芳基」乙詞是指具有一、二或三個雜原子如N、O及/或S之五元單環芳環系統。雜芳基之實例包括但不限於,吡咯基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、異噁唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、噁二唑基、及噻二唑基。雜芳基之較
佳實例為吡咯基及噻吩基。芳基及雜芳基係未經取代或由一或二個取代基,包括但不限於,鹵素或甲磺醯基(CH3SO2-)取代。
在本發明之一些具體實施例中,R1及R3獨立地為H或甲基,且R2為H。
在本發明之一些具體實施例中,Ar係選自於由3-氯吡咯-2-基、3-氯噻吩-2-基、2-氯苯基、及3-氯-1-甲磺醯基-吡咯-2-基組成之群組。
特定而言,表1係顯示本發明之示例性式(I)化合物。
示例性化合物之結構如下:
本文所使用的「治療」乙詞是指施加或投予一或多個活性藥劑至具有疾病、疾病症狀或疾病傾向之個體,其目的在於治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、改善、改進、或影響疾病、疾病症狀或疾病傾向。舉例而言,本文所使用的「治療發炎反應或發炎性疾病」乙詞是指減少局部或全身性的過度發炎反應,其係藉由抑制NO、iNOS、IL-6或TNF-α表現
及抑制NLRP3發炎體媒介之IL-1β表現,但不減少COX-2表現。
本文所使用的「有效量」乙詞是指個體中足以達到上述治療功效之活性藥劑或組合物的量。有效量可例如依藥劑或組合物之種類或劑量及欲治療個體之體重、年齡及健康狀況而變。
本文所使用的「個體」乙詞包括人類及動物,例如陪伴動物(如狗、貓及其類似物)、農場動物(如牛、綿羊、豬、馬及其類似物)、或實驗動物(如大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似物)。
本文所使用的「發炎性疾病」乙詞包括類風濕關節炎、全身性紅斑性狼瘡、斑禿、關節黏連性脊椎炎、抗磷脂質症候群、自體免疫愛迪生氏病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫內耳疾病、自體免疫淋巴球增生症候群(autoimmune lymphoproliferative syndrome,alps)、自體免疫血小板減少性紫瘢病(autoimmune thrombocytopenic purpura,ATP)、貝塞特氏症、大皰性類天皰瘡、心肌病、口炎性腹瀉-皮膚炎、慢性疲勞症候群性免疫缺乏症候群(chronic fatigue syndrome immune deficiency syndrome,CFIDS)、慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變、疤痕性類天皰瘡、冷凝集素病、CREST症候群、克隆氏症、德哥氏症、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盤狀狼瘡、自發性混合冷凝球蛋白血症、纖維肌疼痛-纖維肌炎、格雷氏病、格巴二氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、原發性肺纖維化、原發性血小板減少性紫瘢病(idiopathic thrombocytopenia purpura,ITP)、Iga腎病、胰島素依賴型糖尿病(第一型)、幼年型關節炎、美尼爾氏病、混合性結締組織病、多發性硬化、重症肌無力、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺性症候群、風濕性多肌痛、多肌炎與皮肌炎、
原發性無γ球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾氏現象、萊特爾氏症候群、風濕熱、類肉瘤病、硬皮病、修格連氏症候群、僵硬人症候群、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑病、及華格納氏肉芽病。
本文所使用的「醫藥上可接受鹽類」乙詞是指不會危害欲治療個體且保留活性化合物之生物有效性及性質的鹽類。鹽類亦可衍生自下列藥理學上或生理學上可接受之無機酸或有機酸:鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、延胡索酸、磷酸、二磷酸、琥珀酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸,但不限於此。鹽類亦可衍生自下列藥理學上或生理學上可接受之無機鹼及有機鹼:鹼金屬(如鈉)、鹼土金屬(如鎂)、及銨鹽,但不限於此。
可藉由醫學上可接受途徑投予本發明化合物,如口服、非口服(如肌肉、靜脈、皮下、腹腔)、經皮、直腸、吸入、及其類似方式。
此外,本發明化合物較佳為合併醫藥上可接受載體配製,以形成醫藥組合物並用於上述之治療。據此,本發明係進一步有關醫藥組合物,其包含上述化合物之至少一者或其醫藥上可接受鹽類並伴隨醫藥上可接受載體,以用於本文所述之治療。
載體可作為活性成分之稀釋劑、載具、賦形劑、或介質。適用之賦形劑的一些實例包括鹽液、緩衝鹽液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、糖漿及甲基纖維素。本組合物可額外包括潤滑劑如滑石、硬脂酸鎂、及礦
物油;潤濕劑;乳化劑及懸浮劑;防腐劑如甲基-及丙基羥基-苯甲酸酯;增甜劑;以及調味劑。
本發明之組合物可為任何所欲形式,包括但不限於,片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、栓劑、懸劑、乳液、溶液、糖漿、軟與硬明膠膠囊、無菌注射液、包裝粉劑、霧劑、植入物或貼劑。可由藥學領域之常規習知方法製備本發明組合物。
無需進一步闡述,相信以上描述已適當陳述本發明。因此,下列實施例僅用於說明,且不可解釋為以任何方式侷限其餘之揭示部分。本文所引用的所有出版品,包括專利,皆在此併入本案以作為參考資料。
本發明係進一步以下列實施例說明,其提出係旨在證明而非侷限。
實施例
1. 材料及方法
1.1 材料
依據聚乙烯吡咯類、生長結合素A(auxarconjugatin A)及12E-異路潤(12E-isorumbrin)之化學結構,發明人合成一類型之聚乙烯吡咯類及其類似物。3-氯吡咯基於生長結合素A及12E-異路潤之細胞毒性效用上扮演重要角色;因此,以其他2-或3-氯取代芳環代替3-氯吡咯基。以H、Me、或n-Bu代替聚乙烯吡咯類之不同R位置。合成之聚乙烯吡咯類的骨架如圖1所示(Fang Z et al.(2010)J Med Chem 53(22):7967-7978)。
LPS(源自大腸桿菌菌株0111:B4)、ATP、抗小鼠磷-ERK1/2、磷-JNK1/2、磷-p38、及肌動蛋白的小鼠抗體係購自Sigma(St.Louis,MO)。
抗小鼠磷-IKK-α/β、IKK、磷-IκB-α、IκB-α、磷-PKC-α、IL-1β、凋亡蛋白酶-1、iNOS及COX-2之兔抗體、抗小鼠磷-IKK-α/β之兔抗體、及山葵過氧化酶標記之二次抗體係購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。NLRP3抗體係購自Enzo Life Sciences,Inc.(Farmingdale,NY)。IL-1β、TNF-α及IL-6 ELISA套組係購自R&D Systems(Minneapolis,MN)。
1.2 細胞培養
鼠科巨噬細胞RAW 264.7及J774A.1細胞、及永生化C57BL/6鼠科骨髓衍生性樹狀細胞株JAWSII係購自American Type Culture Collection(CRL-11904)。以購自InvivoGen(San Diego,CA)之NF-κB受體基因(RAW-BlueTM細胞)穩定轉染RAW 264.7巨噬細胞。將RAW 264.7、J774A.1、及RAW-BlueTM細胞培養於以10%熱失活胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)補充的RPMI-1640培養液(Life Technologies,Carlsbad,CA)。將JAWSII細胞培養於以20%非失活FBS與5ng/ml鼠科GM-CSF補充的RPMI-1640培養液(R&D Systems)。所有細胞培養於含5% CO2之37℃培養箱。
1.3 AlamarBlue®細胞存活力試驗
於96孔平底培養盤每個孔,將RAW 264.7細胞以5000個細胞之密度種植於含10%熱失活FBS之100μl RPMI 1640培養液,並於含5% CO2之37℃培養箱中培養24h。以受測樣本培養細胞24h,並以AlamarBlue®試驗測定受測樣本之細胞毒性。本流程係依據製造商之說明步驟進行(AbD Serotec Ltd)。
1.4 酵素結合免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)
依據製造商之說明,以ELISA測定受測樣本對於IL-1β、TNF-α及IL-6產生的影響。簡言之,將50μl生物素化抗體試劑及50μl上清液加入預塗佈抗小鼠IL-1β、TNF-α及IL-6抗體之微孔盤,並於室溫下培養2h。以清洗緩衝液清洗培養盤三次之後,將100μl經稀釋之卵白素-HRP濃縮物加入各孔,並於室溫下培養30min。重複清洗步驟;接著將預混合之100μl四甲基聯苯胺受質溶液加入各孔,並於室溫下閉光培養30min。接著,將100μl終止溶液加入各孔以終止反應,以微盤讀儀於450nm波長下測定培養盤吸光值。
1.5 NO抑制試驗
將RAW 264.7細胞以每毫升5×105個細胞之密度種植於24孔培養盤,接著於存在或不存在受測樣本之下,以有或無LPS(1μg/ml)之條件培養24h。以革利士反應(Griess reaction)分析亞硝酸鹽的量,間接測定受測樣本對於NO產生的影響。
1.6 NF-κB受體試驗
將RAW-BlueTM細胞及穩定表現NF-κB誘導之分泌型胚胎鹼性磷酸酶(secreted embryonic alkaline phosphatase,SEAP)基因的RAW 264.7巨噬細胞係以每毫升5×105個細胞之密度種植於60mm培養盤,並於含5% CO2之37℃培養箱中培養整夜。以化合物1h預處理細胞30min,接著以LPS刺激24h,隨後收取培養液。隨後,於37℃之96孔培養盤中,
將培養液(20μl)與QUANTI-BlueTM(InvivoGen)培養液(200μl)混合15min。以ELISA盤讀儀測定655nm之光學密度,評估SEAP活性之結果。
1.7 西方墨點法
以SDS-PAGE分離全細胞裂解物,並電轉移至PVDF薄膜。在室溫下,將薄膜培養於阻斷溶液(溶於磷酸緩衝鹽液之5%脫脂奶並含有0.1% Tween 20)並歷時1h。在室溫下將各薄膜培養於專一性一次抗體2h。以含有0.1% Tween 20之PBS清洗三次之後,將薄膜培養於HRP結合之二次抗體以偵測一次抗體。以強化型化學放光西方墨點檢測系統偵測薄膜。
1.8 細胞內ROS產生之測定
藉由檢測2’,7’-二氯螢光素二乙酸酯(H2DCFDA)氧化產物(DCF)(Molecular Probes,Eugene,OR)之螢光強度,測定LPS刺激產生的細胞內ROS。簡言之,在LPS誘導ROS產生方面,將RAW 264.7巨噬細胞(5×105/ml)培養於無酚紅之RPMI培養液中24h,接著於37℃下以H2DCFDA(2μM)、化合物1h(20μM)、或NAC(10mM)預處理30min,隨後以LPS刺激一指定時間。在ATP誘導ROS產生方面,將LPS處理之J774A.1巨噬細胞(5×105/ml)培養於無酚紅之RPMI培養液中6h,接著於37℃下以H2DCFDA(2μM)、化合物1h(20μM)、或NAC(10mM)預處理30min,隨後以ATP刺激一指定時間。利用微盤吸收盤讀儀(Bio-Rad Laboratories,Inc),在激發波長485nm及發散波長530nm之下,偵測非螢光前驅物之過氧化物氧化反應所產生之螢光團DCF的相對螢光強度。
1.9 NF-κB p65核易位之測定
依據製造商之說明,以Nuclear Extract Kit(Active Motif)萃取RAW 264.7及J774A.1細胞之核蛋白質,並依據製造商之步驟,以ELISA為主之TransAM NF-κB套組(Active Motif,Tokyo,Japan)量化細胞核之NF-κB p65活化量,其係以微盤吸收盤讀儀(Bio-Rad Laboratories,Inc)於450nm及參考物波長655nm下判讀吸光值。
1.10 統計分析
所有數值以平均值±SD表示。以單因子變異數分析(one-way ANOVA)及雪費事後檢定(Scheffé test)分析數據。
2. 結果
2.1 聚乙烯吡咯衍生物對於巨噬細胞存活力之影響
本發明之目的在於分辨出可作為抗發炎藥劑的無毒聚乙烯吡咯衍生物。在處理24h之後,評估化合物1a-n對於鼠科巨噬細胞株RAW 264.7之細胞毒性。如表2所示,化合物1a-g對於RAW 264.7細胞具有高細胞毒性,其中IC50低於10μM,顯示這些化合物不適合進一步評估其抗發炎活性。非細胞毒性化合物1h-n具有抗發炎活性,其係減少LPS活化型巨噬細胞之NO產生。三個最有效的化合物為1h、1i及1n,其中ED50值分別為15±2、16±2及17±2μM。
aIC50值代表至少三次AlamarBlue®試驗之三重複培養孔的平均值。
bED50值係指LPS誘導之NO產生的50%抑制作用。N.D.:不確定。
2.2 化合物1h、1i及1n減少LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞之NO、iNOS、及IL-6產生
欲評估化合物1h、1i及1n對於LPS誘導之發炎反應的抑制功效,以革利士反應測定培養於DMSO(載具)或化合物1h、1i及1n之LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞之上清液的NO量。實驗結果顯示,以化合物1h、1i及1n單獨處理不會改變NO的背景量(未顯示數據),但以劑量依賴性方式處理減少LPS活化型細胞的NO產量(圖2A)。接著,發明人評估化合物1h、1i及1n對於iNOS蛋白表現之影響,該酵素為NO產生酵素。在LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞中,相較於載具,以化合物1h、1i及1n處理減少iNOS蛋白表現,但不影響COX-2表現,該酵素為產生前列腺素E2的酵素(圖2B)。此外,發明人檢測化合物1h、1i及1n對於LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞之細胞介素產生的影響。發明人發現,以化合物1h、1i及1n單獨處理不改變巨噬細胞之IL-6及TNF-α背景量(未顯示數據),但以劑量依賴性方式處理減少LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞的IL-6分泌且化合物1h比1i及1n更有效(圖2C)。化合物1h、1i及1n輕微減少TNF-α分泌,但不明顯(圖2C)。
2.3 化合物1h減少LPS活化型J774A.1巨噬細胞、腹腔巨噬細胞、及JAWSII樹狀細胞之IL-6及TNF-α分泌
欲確認化合物1h之抗發炎活性,以另一鼠科巨噬細胞株J774A.1及C57BL/6小鼠初代腹腔巨噬細胞評估化合物1h對於LPS誘導之細胞介素分泌的影響。發明人發現,化合物1h減少J774A.1細胞(圖3A)
及腹腔巨噬細胞(圖3B)的IL-6及TNF-α分泌。此外,化合物1h亦減少鼠科樹狀細胞株JAWSII細胞的IL-6及TNF-α分泌(圖3C)。
2.4 化合物1h經由抑制NLRP3發炎體而減少IL-1β分泌
ATP已知可活化LPS處理之巨噬細胞的NLRP3發炎體,其造成凋亡蛋白酶-1活化及IL-1β分泌(Hu Y et al.(2010)J Immunol 185(12):7699-7705)。欲檢測是否化合物1h能調控NLRP3發炎體活化,選用小鼠巨噬細胞株J774A.1(RAW 264.7巨噬細胞不適合研究NLRP3發炎體)。NLRP3發炎體的完整活化需要引發傳訊及活化傳訊,因此,本發明探討是否化合物1h能調控NLRP3發炎體的引發傳訊及活化傳訊。在以LPS及ATP處理之前,以化合物1h培養細胞會以劑量依賴方式顯著抑制IL-1β分泌及凋亡蛋白酶-1活化(圖4A)。在相同條件下,以初代腹腔巨噬細胞確認化合物1h之IL-1β抑制活性(圖4B)。此外,欲確認是否化合物1h能影響ATP媒介之活化傳訊,發明人在ATP刺激之前以化合物1h培養LPS處理之巨噬細胞30min,並發現化合物1h抑制IL-1β分泌,而非凋亡蛋白酶-1活化(圖4C),而化合物1h對於IL-6分泌不具顯著影響(圖4D)。這些結果顯示,化合物1h專一性抑制NLRP3發炎體媒介之IL-1β分泌,但不抑制IL-6分泌,其與NLRP3發炎體無關。此外,發明人檢測化合物1h於LPS活化型細胞中抑制NLRP3(NLRP3發炎體之必需組分)及proIL-1β(IL-1β前驅物)表現的能力。在此實驗中,細胞以化合物1h培養30min,接著另以LPS刺激6h。發明人發現,化合物1h以劑量依賴方式抑制LPS誘導之proIL-1β表現,但增加NLRP3表現(圖4E)。
2.5 化合物1h於LPS活化型巨噬細胞抑制ROS產生及MAPK活化
已經證實,ROS在LPS媒介之細胞介素表現中扮演重要角色(Hsu HY,Wen MH.,同前;Liao PC et al.,同前)。欲檢測是否化合物1h於LPS活化型細胞媒介之抗發炎功效係經由向下調控ROS產生,發明人測定LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞的細胞內ROS產生。發明人發現,細胞的LPS刺激會迅速誘導ROS產生,且預處理有效的抗氧化劑N-乙醯半胱胺酸(NAC)會減少ROS產生。化合物1h能減少LPS刺激之ROS產生,顯示化合物1h之抗發炎功效可部分地由其抗氧化活性所媒介(圖5A)。
LPS有效誘導巨噬細胞活化及前發炎細胞介素產生,其係經由許多傳訊途徑包括MAPK傳訊途徑而活化TLR4(Su SC et al.(2006)Clin Chim Acta 374(1-2):106-115)。欲證實是否化合物1h對於LPS誘導之巨噬細胞之影響與MAPK傳訊級聯反應相關聯,在有或無化合物1h存在下,以LPS處理RAW 264.7巨噬細胞。利用西方墨點法,測定MAPK磷酸化的量,包括ERK1/2、JNK1/2及p38。實驗結果顯示,化合物1h抑制LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞ERK1/2、JNK1/2、及p38之磷酸化的量(圖5B)。這些結果在J774A.1巨噬細胞中證實(圖5C)。這些結果顯示,化合物1h於LPS活化型巨噬細胞抑制MAPK傳訊級聯反應活化。
2.6 化合物1h於LPS活化型巨噬細胞抑制NF-κB活化
在靜止的巨噬細胞中,NF-κB由其抑制蛋白IκB隔離於細胞質中作為不活化的前驅物複合物。在LPS刺激時,IκB經IκB激酶(IKK)磷酸化、泛素化、及迅速經由蛋白酶體降解以釋放NF-κB(Baeuerle PA.(1998)
Cell 95:729-731)。在測定是否化合物1h於巨噬細胞能抑制LPS刺激之NF-κB傳訊時,發明人發現,化合物1h抑制IKK-α及IκB-α磷酸化的量,且部分地挽救LPS活化型RAW 264.7巨噬細胞(圖6A)及J774A.1巨噬細胞(圖6B)的IκB-α降解。此外,化合物1h於RAW 264.7(圖6C)及J774A.1巨噬細胞(圖6D)抑制NF-κB核易位。此外,藉由使用NF-κB-依賴型鹼性磷酸酶受體細胞,發明人證實,化合物1h亦於LPS刺激之巨噬細胞抑制NF-κB轉錄活性(圖6E)。這些結果顯示,化合物1h於LPS活化型巨噬細胞抑制NF-κB傳訊級聯反應之活化。
2.7 化合物1h於ATP活化型巨噬細胞抑制ROS產生及PKC-α磷酸化
ATP經由NADPH氧化酶誘導ROS產生,其為巨噬細胞凋亡蛋白酶-1活化及IL-1β分泌所必需(Moore SF,MacKenzie AB.(2009)J Immunol 183(5):3302-3308;Cruz CM et al.(2007)J Biol Chem 282(5):2871-2879)。欲確定是否化合物1h媒介之IL-1β向下調控係經由抑制ATP誘導之ROS產生而發生,在ATP刺激作用前,先以化合物1h培養LPS處理之細胞30min。發明人發現,化合物1h在LPS處理之前加入時,會輕微減少ATP誘導之ROS產生(圖7A),但明顯抑制ATP誘導之ROS產生(圖7B)。此外,發明人亦發現,化合物1h於LPS處理之細胞會抑制ATP誘導之PKC-α磷酸化(圖7C)。
總之,發明人確認化合物1h至1n能抑制LPS誘導之NO產生而不會降低細胞存活力。在這之中,發明人進一步證實,化合物1h、1i及1n於LPS活化之巨噬細胞能減少NO、iNOS及IL-6產生,且化合物
1h抑制NLRP3發炎體活化,以及經由降低LPS與ATP誘導之ROS產生及LPS誘導之MAPK與NF-κB活化而抑制NO及IL-6表現。本發明之化合物,具體而言是化合物1h,可發展為抗發炎藥劑。
熟習本領域之技術人員應理解到,上述之具體實施例可進行變更而不背離其廣義發明概念。因此,可理解到,本發明未侷限於所揭示之特定具體實施例,但旨在涵蓋本發明之精神及範疇內之改良,係如所附申請專利範圍之定義。
經由前述說明,熟習本領域之技術人員可容易確定本發明之必要特徵,而不背離其精神及範疇,並可進行本發明之各種變更及改良,以供各種用途及條件使用。因此,其他具體實施例亦落於申請專利範圍之範疇內。
Claims (3)
- 一種式(I)之化合物或其醫藥上可接受鹽類用於製造抑制發炎細胞中介白素-6(IL-6)或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表現、或抑制發炎細胞中活性含氧物(ROS)產生、促分裂原活化蛋白激酶(MAPR)磷酸化、NF-κB活化或蛋白激酶C(PKC)活化的藥劑之用途:其中,該式(I)之化合物係選自於由化合物1h、化合物1i、化合物1j、化合物1k、化合物1l、化合物1m及化合物1n組成之群組,其具下列結構:
- 如申請專利範圍第1項之用途,其中該式(I)之化合物為化合物1h、1i或1n,其具下列結構:
- 如申請專利範圍第1項之用途,其中該發炎細胞為巨噬細胞或樹狀細胞。
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