定義
以下闡述陳述本發明技術之實例性實施例。然而，應意識到該闡述並非意欲限制本發明之範圍而是作為實例性實施例之闡述來提供。 除非使用如本說明書中所使用之以下詞語、片語及符號之上下文另有指示，否則該等詞語、片語及符號通常意欲具有下文所述之含義。 可在不存在本文中未特定揭示之任何要素、限制下適宜地實踐以闡釋方式闡述於本文中之揭示內容。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應以擴展方式理解且無限制性。另外，本文中所採用之術語及表述係作為闡述性而非限制性術語來使用，且並非意欲藉由使用該等術語及表述來排除所顯示及所闡述特徵或其部分之任何等效形式，但應意識到在所主張之本發明之範圍內可存在各種修改形式。 非介於兩個字母或符號之間之破折號(「-」)用於指示取代基之附接點。舉例而言，-C(O)NH
2
係透過碳原子附接。在化學基團前端或末端之破折號係為方便起見；化學基團可利用或不利用一或多個破折號來繪示而不失去其普通含義。結構中沿直線繪示之波形線指示基團之附接點。除非化學或結構上需要，否則書寫或命名化學基團之順序不指示或暗示方向性。 本文所提及之「約」某一值或參數包括(且闡述)與該值或參數本身相關之實施例。在某些實施例中，術語「約」包括所指示量± 10%。在其他實施例中，術語「約」包括所指示量± 5%。在某些其他實施例中，術語「約」包括所指示量± 1%。另外，術語「約X」包括「X」之闡述。另外，除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一(a)」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，所提及之「化合物」包括複數種該等化合物且所提及之「分析」包括所提及之一或多種分析及熟習此項技術者已知之其等效物。 術語「可選」或「視情況」意指隨後闡述之事件或情況可能發生或可能不發生，且該闡述包括該事件或情況發生之情形及其不發生之情形。另外，術語「視情況經取代」係指指定原子或基團上之任一或多個氫原子可或可不由除氫以外之部分替代。 此外，本發明化合物可歷經互變異構現象。倘若本發明化合物或其前藥可發生互變異構現象(例如酮-烯醇互變異構現象)，則個別形式(例如酮及烯醇形式)各自以及其任一比率之混合物在本發明之範圍內。此同樣適用於立體異構物，例如鏡像異構物、順式/反式異構物、構象異構物及諸如此類。 熟習此項技術者應瞭解，當替代取代基清單包括因化合價要求或其他原因無法用於取代特定基團之成員時，意欲按熟習此項技術者之瞭解來參閱該清單以僅納入清單中彼等適於取代該特定基團之成員。 在一些實施例中，本發明化合物可呈「前藥」之形式。術語「前藥」在醫藥領域中定義為藥物之生物無活性衍生物，其在投與人體時根據一些化學或酶路徑轉化為生物活性母體藥物。前藥之實例包括酯化羧酸。 在人類肝中，UDP-葡糖醛醯基轉移酶作用於某些具有胺基、胺甲醯基、硫基(硫氫基)或羥基之化合物以透過醣苷鍵偶聯尿苷二磷酸-α-D-葡糖醛酸，或在第II階段代謝之過程中酯化具有羧基或羥基之化合物。本發明化合物可經葡糖醛酸化(亦即偶聯至葡糖醛酸)，以形成葡萄糖醛酸苷，具體而言(β-D)葡萄糖醛酸苷。 膽汁形成中之一個步驟係使個別膽汁酸與胺基酸、具體而言甘胺酸或牛磺酸偶聯。本發明化合物可與甘胺酸或牛磺酸在可取代位置偶聯。 本發明化合物可呈醫藥上可接受之鹽之形式。術語「醫藥上可接受之鹽」係指自醫藥上可接受之無毒鹼或酸(包括無機鹼或酸及有機鹼或酸)製得之鹽。在本發明化合物含有一或多個酸性或鹼性基團之情形下，本發明亦包含其相應醫藥上或毒物學上可接受之鹽，具體而言其醫藥上可利用之鹽。因此，含有酸性基團之本發明化合物可存在該等基團且可根據本發明以(例如)鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽或銨鹽形式使用。該等鹽之更精確實例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與氨或有機胺(例如，乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或胺基酸)形成之鹽。含有一或多個鹼性基團(即可質子化之基團)之本發明化合物可以根據本發明以其與無機酸或有機酸之加成鹽之形式存在及使用。適宜酸之實例包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、胺基磺酸、苯基丙酸、葡萄糖酸、抗壞血酸、異菸鹼酸、檸檬酸、己二酸及熟習此項技術者已知之其他酸。若本發明化合物在分子中同時含有酸性及鹼性基團，則本發明除所提及之鹽形式以外亦包括內鹽或甜菜鹼(兩性離子)。各別鹽可藉由熟習此項技術者已知之習用方法來獲得，如例如，藉由在溶劑或分散劑中使該等物質與有機或無機酸或鹼反應或藉由與其他鹽進行陰離子交換或陽離子交換。本發明亦包括所有因低生理相容性無法直接適用於醫藥但可(例如)作為中間體用於化學反應或用於製備醫藥上可接受之鹽的本發明化合物之鹽。 另外，本發明化合物可以溶劑合物之形式存在，例如包括水之溶劑合物或諸如醇、具體而言乙醇之溶劑合物等醫藥上可接受之溶劑合物之彼等。「溶劑合物」係藉由溶劑及化合物之相互作用形成。 在某些實施例中，提供本文所闡述化合物之光學異構物、外消旋物或其其他混合物或醫藥上可接受之鹽或其混合物。若需要，則可藉由業內熟知之方法(例如藉由液相層析)來分離異構物。在彼等情形中，可藉由不對稱合成或藉由拆分獲得單一鏡像異構物或非鏡像異構物(即光學活性形式)。拆分可藉由(例如)習用方法(例如在解析劑存在下結晶或使用(例如)手性高壓液相層析(HPLC)管柱進行層析)來實現。 「立體異構物」係指由藉由相同鍵鍵結之相同原子製得但具有不同三維結構之化合物，該等化合物不可互換。本發明涵蓋各種立體異構物及其混合物且包括「鏡像異構物」，其係指分子彼此為不重疊鏡像之兩種立體異構物。「非鏡像異構物」係具有至少兩個不對稱原子但彼此並非鏡像之立體異構物。 本文所揭示之化合物及其醫藥上可接受之鹽可包括不對稱中心且因此可產生鏡像異構物、非鏡像異構物及可定義為(
R
)-或(
S
)-(根據絕對立體化學)或(D)-或(L)-(對於胺基酸)之其他立體異構形式。本發明意欲包括所有該等可能異構物以及其外消旋及光學純形式。光學活性(+)及(-)、(
R
)-及(
S
)-或(D)-及(L)-異構物可使用手性合成子或手性試劑來製備，或使用習用技術(例如，層析及分段結晶)來拆分。製備/分離個別鏡像異構物之習用技術包括自適宜光學純前體對掌性合成或使用(例如)對掌性高壓液相層析(HPLC)拆分外消旋物(或鹽或衍生物之外消旋物)。當本文所述化合物含有烯烴雙鍵或其他幾何不對稱性中心時，且除非另有說明，否則該等化合物意欲包括E及Z幾何異構物。 包括本文所闡述之化合物或其醫藥上可接受之鹽、異構物或混合物之本文所提供組合物可包括外消旋混合物或含有鏡像異構過量之一種鏡像異構物或單一非鏡像異構物或非鏡像異構混合物之混合物。該等化合物之所有該等異構形式皆明確地包括在本文中，如同各種及每一異構形式特定且個別地列示一般。 本文所給出之任一式或結構亦意欲代表化合物之未經標記形式以及經同位素標記形式。經同位素標記之化合物具有藉由本文所給式繪示之結構，只是一或多個原子由具有所選原子質量或質量數之原子替代。可納入本發明化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟及氯之同位素，例如(但不限於)
2
H (氘, D)、
3
H (氚)、
11
C、
13
C、
14
C、
15
N、
18
F、
31
P、
32
P、
35
S、
36
Cl及
125
I。各種經同位素標記之本發明化合物，例如納入放射性同位素(例如
3
H、
13
C及
14
C)之彼等。該等經同位素標記之化合物可用於代謝研究、反應動力學研究、檢測或成像技術(例如正電子發射斷層掃描術(PET)或單光子發射計算機化斷層掃描術(SPECT)，包括藥物或基質組織分佈分析)或患者之放射性治療。本發明之經同位素標記之化合物及其前藥通常可藉由實施在方案中或在下文所述實例及製備中所揭示之程序並藉由用易於獲得之經同位素標記之試劑取代未經同位素標記之試劑來製備。 本發明亦包括其中附接至碳原子之1至n個氫由氘替代之本文所揭示化合物之「氘化類似物」，其中n為該分子中氫之數量。該等化合物可展現增加之代謝抗性且因此在投與哺乳動物(例如人類)時可用於延長任一式I化合物之半衰期。例如參見，Foster, 「Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism,」 Trends Pharmacol. Sci. 5(12):524-527 (1984)。該等化合物係藉由業內熟知之方式來合成，例如藉由採用其中一或多個氫已由氘替代之起始材料。 本發明之氘標記或取代之治療化合物關於分佈、代謝及排泄(ADME)可具有改良之DMPK (藥物代謝及藥物代謝動力學)性質。經較重同位素(例如氘)取代可得到某些治療優點，此歸因於較大代謝穩定性，例如活體內半衰期增加或劑量需求減少及/或治療指數改良
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F標記之化合物可用於PET或SPECT研究。 此一較重同位素(特定而言氘)之濃度可藉由同位素富集係數來定義。在本發明化合物中，未特定地指定為具體同位素之任一原子意欲表示該原子之任一穩定同位素。除非另外說明，否則在將一位置特定地指定為「H」或「氫」時，該位置應理解為具有其天然豐度同位素組成之氫。因此，在本發明化合物中，特定地指定為氘(D)之任一原子意欲表示氘。 此外，本發明提供醫藥組合物，其包含至少一種本發明化合物或其前藥化合物或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物作為活性成分以及醫藥上可接受之載劑。 「醫藥組合物」意指一或多種活性成分及一或多種構成載劑之惰性成分，以及藉由以下方式直接或間接產生之任一產物：該等成分中之任兩者或更多者之合併、複合或聚集或一或多種成分之解離或一或多種成分之其他類型之反應或相互作用。因此，本發明醫藥組合物涵蓋藉由混合至少一種本發明化合物及醫藥上可接受之載劑而製成之任一組合物。
縮寫及縮寫字之清單 化合物
本文提供選自以下之化合物：
及
；或其醫藥上可接受之鹽、立體異構物、立體異構物之混合物或互變異構物。 該等化合物中之每一者之化學名稱提供於下表1中。
表 1 醫藥組合物及投與模式
此外，本發明提供醫藥組合物，其包含至少一種本發明化合物或其前藥化合物或其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物作為活性成分以及醫藥上可接受之載劑。 本發明醫藥組合物可另外包含一或多種其他化合物作為活性成分，如前藥化合物或其他核受體調節劑。 醫藥組合物可適於經口、經直腸、局部、非經腸(包括皮下、肌內及靜脈內)、經眼睛(眼用)、經肺(經鼻或經頰吸入)或經鼻投與，但在任何給定情形下，最適宜途徑將端視所治療病況之性質及嚴重程度而定。該等組合物可方便地以單位劑型呈現且可藉由製藥領域中熟知之任何方法來製備。 在實際應用中，可根據習用醫藥複合技術將作為活性成分之本發明化合物與醫藥載劑組合成均勻混合物。載劑可採用眾多形式，此端視期望投與(例如，經口或非經腸(包括靜脈內))之製劑形式而定。在口服劑型組合物製備中，可採用任何常用醫藥介質，在諸如懸浮液、酏劑及溶液等口服液體製劑情形下可採用(例如)水、二醇類、油類、醇類、矯味劑、防腐劑、著色劑及諸如此類；或在諸如粉劑、硬及軟膠囊及錠劑等口服固體製劑情形下可採用諸如澱粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、製粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及諸如此類等載劑，其中固體口服製劑較液體製劑更佳。 因錠劑及膠囊易於投與，故其代表最有利的口服劑量單元形式，在該情形下，採用固體醫藥載劑。若需要，錠劑可藉由標準水性或非水性技術來包覆。該等組合物及製劑應含有至少0.1%之活性化合物。當然，該等組合物中活性化合物之百分比可有所變化且可方便地介於單元重量之約2%至約60%之間。在如此該等治療有用組合物中活性化合物之量會獲得有效劑量。活性化合物亦可經鼻內(例如，以液滴或噴霧形式)投與。 錠劑、丸劑、膠囊及諸如此類亦可含有黏合劑，例如黃蓍膠、阿拉伯膠(acacia)、玉米澱粉或明膠；賦形劑，例如磷酸氫鈣；崩解劑，例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；及甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精。當劑量單元形式係膠囊時，其除上述類型材料外亦可含有諸如脂肪油等液體載劑。 各種其他材料可以包衣形式存在或用以改良劑量單元之物理形式存在。例如，錠劑可用蟲膠、糖或二者包覆。糖漿或酏劑除活性成分外亦可含有作為甜味劑之蔗糖、作為防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、染料及矯味劑(例如櫻桃味或橙味矯味劑)。 由於離子化合物之鹽形式可實質上影響生物利用度，故本發明化合物亦可作為用各種相對離子形成之鹽使用來產生可經口利用之調配物醫藥上可接受之相對離子可為單價或二價離子，例如銨、鹼金屬鈉或鉀或鹼土金屬鎂或鈣、某些醫藥上可接受之胺(例如參(羥基甲基)胺基甲烷、乙二胺、二乙胺、六氫吡嗪或其他)或某些陽離子胺基酸(例如離胺酸或精胺酸)。 本發明化合物亦可以非經腸方式來投與。該等活性化合物之溶液或懸浮液可在水中適宜地與諸如羥丙基纖維素等表面活性劑混合來製備。分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其於油中之混合物中製備。在儲存及使用之普通條件下，該等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。 適合於注射使用之醫藥形式包括無菌水性溶液或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情形下，該形式必須為無菌的且其流動性程度必須使其具有易注射性。其必須在製造及儲存條件下保持穩定且必須針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。載劑可為含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)、其適宜混合物及植物油之溶劑或分散介質。 可採用任一適宜投與途徑來為哺乳動物(尤其人類)提供有效劑量之本發明化合物。例如，可採用經口、經直腸、局部、非經腸、經眼睛、經肺、經鼻及諸如此類。劑型包括錠劑、口含錠、分散劑、懸浮液、溶液、膠囊、乳霜、軟膏、氣溶膠及諸如此類。在一些實施例中，本發明化合物係經口投與。
套組
本文亦提供套組，其包括本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、立體異構物、立體異構物之混合物、前藥或氘化類似物及適宜包裝。在一個實施例中，套組進一步包括使用說明書。在一態樣中，套組包括本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、立體異構物、立體異構物之混合物、前藥或氘化類似物，及該等化合物用於治療本文所述適應症(包括疾病或病況)之標記及/或說明書。 本文亦提供製品，其在適宜容器中包括本文所闡述之化合物或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、立體異構物、立體異構物之混合物、前藥或氘化類似物。容器可為小瓶、罐、安瓿、預加載注射器及靜脈內袋。
治療方法及用途
「治療(Treatment或treating)」係獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。有益或期望臨床結果可包括以下各項中之一或多者：a)抑制疾病或病況(例如，減少由疾病或病況引起之一或多個症狀，及/或減輕疾病或病況之程度)；b)減緩或停止與疾病或病況相關之一或多個臨床症狀之發展(例如，穩定疾病或病況、預防或延遲疾病或病況之惡化或進展，及/或預防或延遲疾病或病況之擴散(例如，轉移))；及/或c)減輕疾病，亦即引起臨床症狀之消退(例如，改善疾病狀態、提供疾病或病況之部分或全部緩解、增強另一藥劑之效應、延遲疾病之進展、提高生活品質及/或延長存活)。 「預防(prevention或prophylaxis)」係指使得疾病或病況之臨床症狀不發展或進展之疾病或病況之治療。在一些實施例中，化合物可投與具有疾病或病況之風險或具有該疾病或病況之家族史之個體(包括人類)以便預防該疾病或病況。 「個體」係指已為或將為治療、觀察或實驗之目標之動物，例如哺乳動物(包括人類)。本文所闡述之方法可用於人類療法及/或獸醫應用中。在一些實施例中，個體係哺乳動物。在一個實施例中，個體係人類。 術語本文所闡述化合物或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、立體異構物、立體異構物之混合物、前藥或氘化類似物之「治療有效量」或「有效量」意指在投與個體時足以實現治療從而提供治療益處(例如改善症狀或減緩疾病進展)之量。舉例而言，治療有效量可為足以減少對Cot活性抑制有反應之疾病或病況之症狀之量。治療有效量可端視以下而變化：個體及所治療之疾病或病況、個體之體重及年齡、疾病或病況之嚴重性及投與方式，其可容易地由熟習此項技術者來確定。 本發明進一步係關於該等化合物之用途，其用於透過該核受體與該等化合物之結合來治療及/或預防疾病及/或病況。另外，本發明係關於該等化合物之用途，其用於製備用以透過該核受體與該等化合物之結合來治療及/或預防疾病及/或病況之藥劑。 特定而言，本發明係關於本文所揭示化合物之用途，其用於製備用以預防及/或治療以下各項之藥劑：慢性肝內膽汁鬱積性病況或一些形式之肝外膽汁鬱積性病況、肝纖維化、急性肝內膽汁鬱積性病況、起因於不適當膽汁組成之阻塞性或慢性發炎病症、膳食脂肪及脂溶性膳食維生素之攝取有所降低之胃腸病況、發炎性腸病、脂質及脂蛋白病症、II型糖尿病及I型及II型糖尿病臨床併發症、由因強迫性脂質及特定而言甘油三酯累積及後續促纖維變性路徑活化所致之慢性器官脂肪及纖維變性退化造成之病況及疾病、肥胖症及代謝症候群(異常血脂症、糖尿病及異常高身體質量指數之合併病況)、急性心肌梗塞、急性中風、作為慢性阻塞性動脈粥樣硬化之終點發生之血栓形成、由細胞內細菌或寄生性原生動物引起之持續性感染、非惡性過度增殖病症、惡性過度增殖病症、結腸腺癌及肝細胞癌、具體而言肝脂肪變性及相關症候群、作為慢性肝病或手術肝切除術之結果之肝衰竭或肝機能障礙、B型肝炎感染、C型肝炎感染，及/或與酒精誘導之硬化或與病毒傳播形式之肝炎相關之膽汁鬱積性及纖維變性效應。 本文所提及之藥劑可藉由習用製程(包括組合本發明化合物及醫藥上可接受之載劑)來製備。 有人提出FXR為核膽汁酸感測劑。因此，其調節肝中膽汁酸之合成輸出及該等膽汁酸在腸中之再循環(藉由調控膽汁酸結合蛋白)。但除膽汁酸生理學以外，FXR似乎參與調控許多病因相關之多樣生理過程且用於治療諸如以下疾病：膽固醇膽石症、代謝失調(例如II型糖尿病、異常血脂症或肥胖症)、慢性發炎性疾病(例如發炎性腸病或慢性肝內形式之膽汁鬱積)及許多其他疾病。 FXR調控肝及胃腸道中複雜的反應基因型式。該等基因產物對多樣生理過程具有影響。在FXR之功能分析過程中，所分析之第一調節網絡為調控膽汁酸合成。儘管LXR經由誘導調節核受體LRH-1來誘導將膽固醇轉化為膽汁酸之關鍵酶Cyp7A1，但FXR經由上調編碼SHP (較LRH-1具有優性抑制性之另一核受體)之mRNA來抑制Cyp7A1之誘導。由於FXR結合此路徑之終端產物初級膽汁酸(例如膽酸(CA)或CDCA)，故此可視為反饋抑制基因表現程度之實例。與經由SHP抑制膽汁酸合成平行，FXR誘導一系列所謂的ABC (對於ATP結合盒)運輸蛋白，該等ABC運輸蛋白負責將毒性膽汁酸自肝細胞胞質液輸出至小管(膽汁起源之小膽管分支)中。利用其中顯示肝中若干ABC運輸蛋白之低表現或過表現之FXR剔除小鼠之分析首次明瞭FXR之此保肝功能。進一步詳細分析揭露，主要膽汁鹽排泄幫浦BSEP或ABCB11 (以及調介自脂蛋白至磷脂之脂質轉移之關鍵酶(PLTP)及用於磷脂之兩種關鍵小管膜運輸蛋白(MRP-2 (ABCC4)及MDR-3 (ABCB4))係藉由FXR之配體定向型轉錄活化之直接靶標。 FXR似乎為膽汁酸之合成、輸出及再循環之主要代謝物感測劑及調節劑之事實表明，使用FXR配體可誘導膽汁流動並將膽汁酸組成改變為更具親水的組成。隨著第一合成FXR配體GW4064 (作為工具化合物)及半合成人工膽汁酸配體6-α-乙基-CDCA之發展，可分析藉由強效激動劑超刺激FXR之效應。顯示兩種配體均可在膽管結紮動物中誘導膽汁流動。此外，除利膽效應以外，亦可展示保肝效應。此保肝效應可進一步縮小為由以下引起之抗纖維變性效應：基質金屬蛋白酶之組織抑制劑(TIMP-1及2)之抑制、肝星狀細胞中消除基質金屬蛋白酶2之膠原沈積物之誘導，及後續藉由FXR激動劑之α-膠原mRNA及轉變生長因子β (TGF-β) mRNA (二者均為促纖維變性因子)之減少。此外，在膽管結紮動物模型中以及在雌激素誘導之膽汁鬱積之動物模型中展示抗膽汁鬱積性活性。 遺傳研究展示在遺傳形式之膽汁鬱積(進行性家族性肝內膽汁鬱積= PFIC，I型至IV型)中，FXR本身之核定位因FIC1基因突變而減少(在I型PFIC中，亦稱為拜勒氏病(Byler´s Disease)) (F. Chen等人，Gastroenterology 2004, 126, 756；L. Alvarez等人，Hum. Mol. Genet. 2004, 13, 2451)，或編碼MDR-3磷脂輸出幫浦之FXR靶標基因之含量降低(在III型PFIC中)。綜上所述，愈來愈多的證據證明FXR結合化合物將在慢性膽汁鬱積性病況(例如原發性膽汁性肝硬化(PBC)或原發性硬化性膽管炎(PSC))之治療方案中展示實質臨床效用。 FXR活化對膽汁酸代謝及排泄之深遠影響不僅適於膽汁鬱積性症候群且甚至可更直接的用於治療膽石形成。膽固醇膽石症係由於自肝細胞主動泵送至小管管腔中之膽固醇之溶解性較低形成的。三種主要組分膽汁酸、磷脂及自由(free)膽固醇之含量之相對百分比決定混合膠束之形成及因此自由膽固醇在膽汁中之表觀溶解度。作為促成膽石疾病之一種因素，FXR多型性映射為數量性狀基因座。使用合成FXR工具化合物GW4064，可展示FXR之活化在C57L膽石易感小鼠中可改良膽固醇飽和指數(CSI)且直接廢止膽石形成，而FXR剔除小鼠中之藥物治療顯示對膽石形成無效應。 該等結果證明FXR有資格作為用於研發可用於預防膽固醇膽石形成或預防手術去除或震波碎石術之後再形成膽石症之小分子激動劑之良好靶標。 因此，在本發明之一個實施例中，本文所揭示化合物及包含該等化合物之醫藥組合物用於預防及/或治療起因於不適當膽汁組成之阻塞性或慢性發炎病症(例如膽石病，亦稱為膽固醇膽石症)。 除FXR在肝中在小分子刺激之活化後所顯示之強保肝及利膽效應以及抗纖維變性效應以外，其似乎在保護腸免受腫瘤轉變及免受在腸管中發展息肉及息肉轉型為腺癌中具有作用。類似於腸中之情形，不存在FXR導致肝細胞癌(HCC) (肝癌之最顯著形式)形成之高度增加。而功能FXR可防止形成結腸腺癌及肝細胞癌，FXR活化誘導肝切除術後之肝再生。 可在治療上開發與FXR活化相關之組合之保肝、抗贅瘤及肝再生效應以使用FXR激動劑來治療嚴重肝病。在一個實施例中，本發明化合物及包含該等化合物之醫藥組合物可用於治療諸如HCC等肝病、刺激肝再生及改善與主要肝切除術、獨立於病因之肝硬化相關之副作用，及預防或治療肝移植或主要肝手術過程中之肝缺血。 自發現第一合成FXR激動劑及將其投與齧齒類動物以來，明瞭FXR係血清甘油三酯之關鍵調節劑。在過去六年中，已公開如下累積證據：藉由合成激動劑來活化FXR可引起血清甘油三酯顯著降低(主要呈降低之VLDL之形式)，且亦引起總血清膽固醇降低。 但血清甘油三酯之降低並非獨立的效應。利用合成FXR激動劑GW4064治療db/db或ob/ob小鼠引起血清甘油三酯、總膽固醇、自由自由脂肪酸、酮體(例如3-羥基丁酸)之顯著及組合降低。此外，FXR活化與肝細胞中之細胞內胰島素信號傳導路徑結合，使得來自肝糖質新生之葡萄糖之輸出減少但伴隨肝醣增加。胰島素敏感性以及葡萄糖耐量受到FXR治療之積極影響。最近亦在過量餵飼高脂質飲食之小鼠中觀察到對降低體重之效應。此重量損失效應可能係由FXR對FGF-19 (已知引起重量損失及健壯表型之纖維母細胞生長因子)之誘導引起。已展示FXR激動劑對體重降低之效應。 綜上所述，FXR激動劑之該等藥理學效應可以不同治療方式來開發：FXR結合化合物因其胰島素敏化、肝醣分解及脂質降低效應而被視為係治療II型糖尿病之良好候選者。 在一個實施例中，本發明化合物及包含該等化合物之醫藥組合物用於預防及/或治療II型糖尿病，該II型糖尿病可藉由以下來克服：FXR介導之全身胰島素敏感性及肝中細胞內胰島素信號傳導之上調、增加之周圍葡萄糖攝取及代謝、增加之肝中肝醣儲存、減少之自肝源糖質新生輸出至血清中之葡萄糖。 在另一實施例中，該等化合物及醫藥組合物用於預防及/或治療慢性肝內(例如PBC、PSC)、進行性家族性膽汁鬱積(PFIC)、酒精誘導之硬化及相關膽汁鬱積及一些形式之肝外膽汁鬱積性病況或肝纖維化。 本發明亦係關於本文所揭示化合物或包含本文所揭示化合物之醫藥組合物，其用於預防及/或治療膳食脂肪及脂溶性膳食維生素之攝取有所降低之胃腸病況，該等胃腸病況可藉由增加之腸膽汁酸及磷脂含量來克服。 在另一實施例中，該化合物或醫藥組合物用於預防及/或治療選自由脂質及脂蛋白病症(例如呈臨床上明顯病況之高膽固醇血症、高三酸甘油脂血症及動脈粥樣硬化)組成之群之疾病，其可藉由FXR對以下各項之有益效應來改善：降低總血漿膽固醇、降低血清甘油三酯、增加肝膽固醇轉化為膽汁酸及增加肝中VLDL及其他脂蛋白之清除率及代謝轉化。 在一個其他實施例中，該化合物及醫藥組合物用於預防及/或治療如下疾病：其中可開發FXR靶向藥劑之組合之脂質降低、抗膽汁鬱積性及抗纖維變性效應用於治療肝脂肪變性及相關症候群(例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH))或用於治療與酒精誘導之硬化或與病毒傳播形式之肝炎相關之膽汁鬱積性及纖維變性效應。 結合降血脂效應，亦顯示功能FXR之損失在ApoE剔除小鼠中導致動脈粥樣硬化增加。因此，FXR激動劑作為抗動脈粥樣硬化及心臟保護藥物可具有臨床效用。血管平滑肌細胞中內皮素-1之下調亦可促成該等有益治療效應。 本發明亦係關於本文所揭示化合物或包含本文所揭示化合物之醫藥組合物，其用於預防及創傷後治療心血管病症，例如急性心肌梗塞、急性中風或作為慢性阻塞性動脈粥樣硬化之終點發生之血栓形成。 除控制腸及結腸息肉形成以外，FXR似乎表現於乳癌組織及細胞系中而非表現於健康乳房組織中且似乎在ER陽性乳癌細胞中與雌激素受體相互作用。 此可容許亦將FXR視為治療增殖性疾病、尤其表現FXR之小分子反應形式之轉移性癌症形式之潛在靶標。 在另一實施例中，該等化合物及醫藥組合物用於預防及/或治療其中干擾FXR配體將具有有益影響之惡性過度增殖病症，例如不同形式之癌症、特定而言某些形式之乳癌、肝癌或結腸癌。 最後，FXR亦似乎參與控制腸中之抗細菌防禦，但未提供確切機制。然而，根據該等公開數據，可推斷出利用FXR激動劑之治療在發炎腸病症(IBD)、具體而言其中腸之上部(迴腸)部分受影響之彼等形式(例如迴腸克隆氏病(Crohn´s disease))之療法中可具有有益影響，乃因此似乎為FXR控制細菌生長之作用位點。在IBD中，在腸免疫系統中適應性免疫反應之去敏化受到某一程度損害。細菌過生長然後可導致觸發慢性發炎反應之建立。因此，藉由FXR推動機制抑制細菌生長可為預防急性發炎發作之關鍵機制。 因此，本發明亦係關於本文所揭示化合物或包含該等化合物之醫藥組合物，其用於預防及/或治療與發炎性腸病(例如克隆氏病或潰瘍性結腸炎)相關之疾病。據信FXR介導之腸障壁功能恢復及非共生細菌負載降低有助於減少細菌抗原對腸免疫系統之暴露且因此可減少發炎反應。 本發明進一步係關於化合物或醫藥組合物，其用於預防及/或治療肥胖症及相關病症(例如代謝症候群(異常血脂症、糖尿病及異常高身體質量指數之合併病況))，該等病症可藉由FXR介導之血清甘油三酯、血糖降低及胰島素敏感性及FXR介導之重量損失增加來克服。 在另一實施例中，本發明之化合物或醫藥組合物可用於預防及/或治療I型及II型糖尿病之臨床併發症。該等併發症之實例包括糖尿病性腎病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性神經病變或周圍動脈阻塞性疾病(PAOD)。本發明亦涵蓋糖尿病之其他臨床併發症。 此外，由因強迫性脂質及特定而言甘油三酯累積及後續促纖維變性路徑活化所致之慢性器官脂肪及纖維變性退化造成之病況及疾病亦可藉由投與本發明之化合物或醫藥組合物來預防及/或治療。該等病況及疾病涵蓋肝中之NASH及慢性膽汁鬱積性病況、腎中之腎小球硬化症及糖尿病性腎病變、眼睛中之黃斑退化及糖尿病性視網膜病變及腦中之神經退化疾病(例如阿茲海默氏病(Alzheimer´s Disease))或周圍神經系統中之糖尿病性神經病變。
劑量
所用活性成分之有效劑量可端視所用具體化合物、投與模式、所治療病況及所治療病況之嚴重程度而有所變化。熟習此項技術者可容易地確定該劑量。 當治療或預防本發明化合物適於之FXR介導之病況時，當以約0.1毫克至約100毫克/公斤動物體重之日劑量投與本發明化合物時，通常獲得令人滿意的結果。在一些實施例中，本發明化合物係以單一日劑量或以一天兩次至六次之分開劑量或以持續釋放形式給予。對於大多數大型哺乳動物，總日劑量為約1毫克至約1000毫克，或約1毫克至約50毫克。在70 kg成人之情形下，總日劑量通常將為約7毫克至約350毫克。可調節此劑量方案以提供最佳治療反應。在一些實施例中，總日劑量為約1毫克至約900毫克、約10毫克至約800毫克、約20毫克至約700毫克、約30毫克至約600毫克、約40毫克至約550毫克或約50毫克至約400毫克。 本申請案之化合物或其組合物可使用上述任一適宜模式每天一次、兩次、三次或四次來投與。另外，利用該等化合物之投與或治療可持續多天；例如，通常治療之一個治療週期可持續至少7天、14天或28天。治療週期在癌症化學療法中熟知，且通常與在週期之間之約1至28天、通常約7天或約14天之休息期交替。在其他實施例中，治療週期亦可為連續的。 在具體實施例中，本文所提供之方法包含向個體投與約1 mg至800 mg本文所述化合物之初始日劑量及藉由增量來增加劑量直至達成臨床效能為止。可使用約5 mg、10 mg、25 mg、50 mg或100 mg之增量來增加劑量。劑量可每日、每隔一天、每週兩次或每週一次進行增加。
組合療法
在一些實施例中，本文所揭示之化合物係與一或多種其他治療劑組合投與來治療或預防本文所揭示之疾病或病況。在一些實施例中，該一或多種其他治療劑為(n) ACE抑制劑、乙醯基CoA羧化酶抑制劑、腺苷A3受體激動劑、脂聯素受體激動劑、AKT蛋白激酶抑制劑、AMP活化之蛋白激酶(AMPK)、澱粉素受體激動劑、血管收縮肽II AT-1受體拮抗劑、自毒素抑制劑、生物活性脂質、降鈣素激動劑、半胱天冬酶抑制劑、半胱天冬酶-3刺激物、細胞自溶酶抑制劑、微囊蛋白1抑制劑、CCR2趨化介素拮抗劑、CCR3趨化介素拮抗劑、CCR5趨化介素拮抗劑、氯離子通道刺激物、CNR1抑制劑、週期蛋白D1抑制劑、細胞色素P450 7A1抑制劑、DGAT1/2抑制劑、二肽基肽酶IV抑制劑、內皮唾液酸蛋白調節劑、伊紅趨素配體抑制劑、細胞外基質蛋白質調節劑、類法尼醇X受體激動劑、脂肪酸合酶抑制劑、FGF1受體激動劑、纖維母細胞生長因子(FGF-15, FGF-19, FGF-21)配體、半乳糖凝集素-3抑制劑、升糖素受體激動劑、類升糖素肽1激動劑、G蛋白偶聯之膽汁酸受體1激動劑、刺蝟(Hh)調節劑、C型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑、肝細胞核因子4 α調節劑(HNF4A)、肝細胞生長因子調節劑、HMG CoA還原酶抑制劑、IL-10激動劑、IL-17拮抗劑、迴腸鈉膽汁酸共運輸蛋白抑制劑、胰島素敏化劑、整聯蛋白調節劑、白介素-1受體相關激酶4 (IRAK4)抑制劑、Jak2酪胺酸激酶抑制劑、克洛索(Klotho) β刺激物、5-脂肪加氧酶抑制劑、脂蛋白脂酶抑制劑、肝臟X受體、LPL基因刺激物、溶血磷酯-1受體拮抗劑、賴胺醯氧化酶同系物2抑制劑、基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、MEKK-5蛋白激酶抑制劑、膜銅胺氧化酶(VAP-1)抑制劑、甲硫胺酸胺基肽酶-2抑制劑、甲基CpG結合蛋白2調節劑、微小RNA-21(miR-21)抑制劑、粒線體解偶合劑、髓鞘質鹼性蛋白質刺激物、NACHT LRR PYD結構域蛋白質3 (NLRP3)抑制劑、NAD依賴性去乙醯酶沉默調節蛋白刺激物、NADPH氧化酶抑制劑(NOX)、菸鹼酸受體1激動劑、P2Y13嘌呤受體刺激物、PDE 3抑制劑、PDE 4抑制劑、PDE 5抑制劑、PDGF受體β調節劑、磷脂酶C抑制劑、PPAR α激動劑、PPAR δ激動劑、PPAR γ激動劑、PPAR γ調節劑、蛋白酶活化之受體-2拮抗劑、蛋白激酶調節劑、Rho相關蛋白激酶抑制劑、鈉葡萄糖運輸蛋白-2抑制劑、SREBP轉錄因子抑制劑、STAT-1抑制劑、硬脂醯基CoA去飽和酶-1抑制劑、細胞介素信號傳導-1刺激物之抑制劑、細胞介素信號傳導-3刺激物之抑制劑、轉變生長因子β (TGF-β)、轉變生長因子β活化之激酶1 (TAK1)、甲狀腺激素受體β激動劑、TLR-4拮抗劑、轉麩醯胺酸酶抑制劑、酪胺酸激酶受體調節劑、GPCR調節劑、核激素受體調節劑、WNT調節劑或YAP/TAZ調節劑。 該一或多種其他治療劑之非限制性實例包括： ACE抑制劑，例如依那普利(enalapril)； 乙醯基CoA羧化酶(ACC)抑制劑，例如NDI-010976、DRM-01、吉卡濱(gemcabene)、PF-05175157及QLT-091382； 腺苷受體激動劑，例如CF-102、CF-101、CF-502及CGS21680； 脂聯素受體激動劑，例如ADP-355； 澱粉素/降鈣素受體激動劑，例如KBP-042； AMP活化之蛋白激酶刺激物，例如O-304； 血管收縮肽II AT-1受體拮抗劑，例如厄貝沙坦(irbesartan)； 自毒素抑制劑，例如PAT-505、PAT-048、GLPG-1690、X-165、PF-8380及AM-063； 生物活性脂質，例如DS-102； 1型大麻素受體(CNR1)抑制劑，例如那西珠單抗(namacizumab)及GWP-42004； 半胱天冬酶抑制劑，例如恩利卡生(emricasan)； 泛細胞自溶酶B抑制劑，例如VBY-376； 泛細胞自溶酶抑制劑，例如VBY-825； CCR2/CCR5趨化介素拮抗劑，例如辛利羅可(cenicriviroc)； CCR2趨化介素拮抗劑，例如丙帕鍺(propagermanium)； CCR3趨化介素拮抗劑，例如柏替木單抗(bertilimumab)； 氯離子通道刺激物，例如庫比司通(cobiprostone)； 甘油二酯醯基轉移酶2 (DGAT2)抑制劑，例如IONIS-DGAT2Rx； 二肽基肽酶IV抑制劑，例如利拉利汀(linagliptin)； 伊紅趨素配體抑制劑，例如柏替木單抗； 細胞外基質蛋白質調節劑，例如CNX-024； 類法尼醇X受體(FXR)激動劑，例如AGN-242266、AKN-083、EDP-305、GNF-5120、GS-9674、LJN-452、LMB-763、奧貝膽酸(obeticholic acid)、Px-102、Px-103、M790、M780、M450、M480、PX20606、EYP-001及INT-2228； 類法尼醇X受體(FXR)/ G蛋白偶聯膽汁酸受體1(TGR5)激動劑，例如INT-767； 脂肪酸合酶抑制劑，例如TVB-2640； 纖維母細胞生長因子19 (rhFGF19)/細胞色素P450 (CYP)7A1抑制劑，例如NGM-282； 纖維母細胞生長因子21(FGF-21)配體，例如BMS-986171，BMS-986036； 纖維母細胞生長因子21(FGF-21)/升糖素樣肽1 (GLP-1)激動劑，例如YH-25723； 半乳糖凝集素-3抑制劑，例如GR-MD-02； 類升糖素肽1(GLP1R)激動劑，例如AC-3174、利拉魯肽(liraglutide)、索馬魯肽(semaglutide)； G蛋白偶聯膽汁酸受體1(TGR5)激動劑，例如RDX-009、INT-777； 熱休克蛋白47 (HSP47)抑制劑，例如ND-L02-s0201； HMG CoA還原酶抑制劑，例如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)及斯伐他汀(simvastatin)； IL-10激動劑，例如peg-伊洛白介素(peg-ilodecakin)； 迴腸鈉膽汁酸共運輸蛋白抑制劑，例如A-4250、沃利巴特(volixibat)乙醇鉀水合物(SHP-262)及GSK2330672； 胰島素敏化劑，例如KBP-042、MSDC-0602K、Px-102、RG-125 (AZD4076)及VVP-100X； β克洛索(KLB)- FGF1c激動劑，例如NGM-313； 5-脂肪加氧酶抑制劑，例如泰魯司特(tipelukast) (MN-001)； 脂蛋白脂酶抑制劑，例如CAT-2003； LPL基因刺激物，例如阿利潑金(alipogene tiparvovec)； 肝臟X受體(LXR)調節劑，例如PX-L603、PX-L493、BMS-852927、T-0901317、GW-3965及SR-9238； 溶血磷酯-1受體拮抗劑，例如BMT-053011、UD-009. AR-479、ITMN-10534、BMS-986020及KI-16198； 賴胺醯氧化酶同系物2抑制劑，例如司妥佐單抗(simtuzumab)； MEKK-5蛋白激酶抑制劑，例如GS-4997； 胺基脲敏感性胺氧化酶/血管黏附蛋白-1 (SSAO/VAP-1)抑制劑，例如PXS-4728A； 甲硫胺酸胺基肽酶-2抑制劑，例如ZGN-839； 甲基CpG結合蛋白2調節劑，例如巰乙胺； 粒線體解偶合劑，例如2,4-二硝基苯酚； 髓鞘質鹼性蛋白質刺激物，例如奧利索西(olesoxime)； NADPH氧化酶1/4抑制劑，例如GKT-831； 菸鹼酸受體1激動劑，例如ARI-3037MO； NACHT LRR PYD結構域蛋白質3 (NLRP3)抑制劑，例如KDDF-201406-03及NBC-6； 核受體調節劑，例如DUR-928； P2Y13嘌呤受體刺激物，例如CER-209； PDE 3/4抑制劑，例如泰魯司特(MN-001)； PDE 5抑制劑，例如西地那非(sildenafil)； PDGF受體β調節劑，例如BOT-191、BOT-509； PPAR激動劑，例如艾拉非諾(elafibranor) (GFT-505)、MBX-8025、氘化吡格列酮(pioglitazone)R-鏡像異構物、吡格列酮、DRX-065、薩格列紮(saroglitazar)及IVA-337； 蛋白酶活化之受體-2拮抗劑，例如PZ-235； 蛋白激酶調節劑，例如CNX-014； Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制劑，例如KD-025； 鈉葡萄糖運輸蛋白-2(SGLT2)抑制劑，例如伊格列淨(ipragliflozin)、伊碳酸瑞格列淨(remogliflozin etabonate)、埃格列淨(ertugliflozin)、達格列淨(dapagliflozin)及索格列淨(sotagliflozin)； SREBP轉錄因子抑制劑，例如CAT-2003及MDV-4463； 硬脂醯基CoA去飽和酶-1抑制劑，例如阿拉曲(aramchol)； 甲狀腺激素受體β激動劑，例如MGL-3196、MGL-3745、VK-2809； TLR-4拮抗劑，例如JKB-121； 酪胺酸激酶受體調節劑，例如CNX-025； GPCR調節劑，例如CNX-023；及 核激素受體調節劑，例如Px-102。 在某些特定實施例中，該一或多種其他治療劑選自A-4250、AC-3174、乙醯基柳酸、AK-20、阿利潑金、阿拉曲、ARI-3037MO、ASP-8232、柏替木單抗、無水甜菜鹼、BI-1467335、BMS-986036、BMS-986171、BMT-053011、BOT-191、BTT-1023、CAT-2003、辛利羅可、CER-209、CF-102、CGS21680、CNX-014、CNX-023、CNX-024、CNX-025、庫比司通、考來維侖(colesevelam)、達格列淨、氘化吡格列酮R-鏡像異構物、2,4-二硝基苯酚、DRX-065、DS-102、DUR-928、EDP-305、艾拉非諾(GFT-505)、恩利卡生、依那普利、埃格列淨、埃格列汀(evogliptin)、F-351、GKT-831、GNF-5120、GR-MD-02、GS-4997、GS-9674、氫氯噻嗪、二十碳五烯酸乙基酯、IMM-124-E、INT-767、IONIS-DGAT2Rx、伊格列淨、厄貝沙坦、丙帕鍺、IVA-337、JKB-121、KB-GE-001、KBP-042、KD-025、M790、M780、M450、二甲雙胍(metformin)、西地那非、LC-280126、利拉利汀、利拉魯肽、LJN-452、LMB-763、MBX-8025、MDV-4463、巰乙胺、MGL-3196、MGL-3745、MSDC-0602K、那西珠單抗、NC-101、NDI-010976、ND-L02-s0201、NGM-282、NGM-313、NGM-386、NGM-395、去甲熊去氧膽酸(norursodeoxycholic acid)、O-304、奧貝膽酸、25HC3S、奧利索西、PAT-505、PAT-048、peg-伊洛白介素、吡格列酮、吡非尼酮(pirfenidone)、PRI-724、PX20606、Px-102、PX-L603、PX-L493、PXS-4728A、PZ-235、RDX-009、伊碳酸瑞格列淨、RG-125 (AZD4076)、薩格列紮、索馬魯肽、司妥佐單抗、索利黴素(solithromycin)、索格列淨、他汀類(阿托伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、斯伐他汀)、TCM-606F、TEV-45478、泰魯司特(MN-001)、TLY-012、TRX-318、TVB-2640、UD-009、熊去氧膽酸、VBY-376、VBY-825、VK-2809、維莫德吉(vismodegib)、沃利巴特乙醇鉀水合物(SHP-626)、VVP-100X、WAV-301、WNT-974及ZGN-839。
實例
包括下列實例以展示本發明之特定實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中所揭示之技術表示可良好用於本發明實踐之技術，且由此可視為構成本發明實踐之特定模式。然而，熟習此項技術者借助於本發明應瞭解，可對所揭示特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或相似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。 本發明化合物可根據以下方案及實例之程序使用適當材料來製備且可藉由以下特定實例來進一步例示。此外，藉由利用本文所闡述之程序，結合業內常規技術，可容易地製備本文所主張之其他本發明化合物。然而，各實例中所闡釋之化合物不應視為構成視為本發明之唯一類屬。該等實例另外闡釋關於本發明化合物製備之細節。熟習此項技術者可容易地瞭解，可使用下列製備型程序之條件及製程之已知變化形式來製備該等化合物。為合成本發明所闡述實施例之化合物，待合成化合物之結構的檢查將提供每一取代基之屬性。鑒於本文實例，藉由簡單檢查過程，最終產物之屬性通常可以表示明顯的得必需起始材料之屬性。本發明化合物通常係以其醫藥上可接受之鹽形式分離，例如上文所闡述之彼等。一般而言，本文所闡述之化合物通常係穩定的且可在室內溫度及壓力下分離。 可藉由以下生成對應於經分離鹽之胺自由鹼：用適宜鹼(例如碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉及氫氧化鉀水溶液)中和，並將經釋放胺自由鹼萃取至有機溶劑中，隨後蒸發。可藉由以下將以此方式分離之胺自由鹼進一步轉化為另一醫藥上可接受之鹽：將該胺自由鹼溶解於有機溶劑中，隨後添加適當酸且隨後蒸發、沈澱或結晶。可藉由以下生成對應於經分離鹽之羧酸自由酸：用適宜酸(例如鹽酸、硫酸氫鈉、磷酸二氫鈉水溶液)中和，並將所釋放羧酸自由酸萃取至有機溶劑中，隨後蒸發。可藉由以下將以此方式分離之羧酸進一步轉化為另一醫藥上可接受之鹽：將該羧酸溶解於有機溶劑中，隨後添加適當鹼，且隨後蒸發、沈澱或結晶。 下文顯示本發明化合物之製備之闡釋。除非方案中另有指示，否則變量具有與上文所闡述相同之含義。下文所呈現之實例意欲闡釋本發明之具體實施例。如下文所闡述合成中所使用之適宜起始材料、基礎材料(building block)及試劑可自(例如) Sigma-Aldrich或Acros Organics購得或可藉由如下文獻中所闡述之程序以常規方式來製備：例如「March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure」, 第5版；John Wiley & Sons或T. Eicher, S. Hauptmann 「The Chemistry of Heterocycles; Structures, Reactions, Synthesis and Application」, 第2版, Wiley-VCH 2003；Fieser等人，「Fiesers´ Reagents for organic Synthesis」 John Wiley & Sons 2000。
一般合成 1 步驟 1 ： 2- 胺基 -4- 氟苯并 [d
] 噻唑 -6- 甲腈 (1a)
經20 min向4-胺基-3-氟苯甲腈(2.0 g, 14.7 mmol)及硫氰酸鉀(5.7 g, 59 mmol)於AcOH (50 mL)中之攪拌溶液中添加溴(2.3 g, 14.7 mmol)於AcOH (5 mL)中之溶液。將混合物在rt下攪拌20 h，倒入冰水(100 mL)中。添加氫氧化銨溶液(28%)至pH 8，將混合物攪拌2 h，過濾，用水洗滌並乾燥以得到2-胺基-4-氟苯并[
d
]噻唑-6-甲腈(
1a
)。
步驟 2 ： 2- 溴 -4- 氟苯并 [d
] 噻唑 -6- 甲腈 (1b)
將2-胺基-4-氟苯并[
d
]噻唑-6-甲腈(
1a
, 2.0 g, 10 mmol)、
tert
-BuONO (1.5 g, 15 mmol)及CuBr
2
(3.3 g, 15 mmol)於MeCN (100 mL)中之溶液在rt下攪拌過夜，用水(100 mL)淬滅並用EtOAc (3 × 100 mL)萃取。將合併之有機層經Na
2
SO
4
乾燥，過濾並濃縮以得到2-溴-4-氟苯并[
d
]噻唑-6-甲腈(
1b
)。
一般合成 2 步驟 1 ： (1R
,5S
)-7- 苯甲醯基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 酮 (2a)
將3-氯-2-(氯甲基)-1-苯基丙-1-酮(10 g, 45.8 mmol)、1-(3,6-二氫-2
H
-吡喃-4-基)吡咯啶(7.0 g, 45.8 mmol)及三乙胺(5.0 g, 50.0 mmol)於CH
3
CN (150 mL)中之溶液加熱至回流並保持1 h，冷卻至rt，用水(150 mL)稀釋並在rt下攪拌過夜。用EtOAc (3 × 100 mL)萃取混合物。合併有機層，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由管柱層析純化以得到(1
R
,5
S
)-7-苯甲醯基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-酮(
2a
)。
步驟 2 ： 苯基 ((1R
,5S
)-3- 氧雜螺 [ 二環 [3.3.1] 壬烷 -9,2'-[1,3] 二氧雜環戊 ]-7- 基 ) 甲酮 (2b)
將(1
R
,5
S
)-7-苯甲醯基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-酮(7.8 g, 32.0 mmol)、乙烷-1,2-二醇(2.4 g, 38.4 mmol)及
p
-TsOH (500 mg)於甲苯(100 mL)中之溶液加熱至回流過夜，倒入NaHCO
3
(水溶液)中並用EtOAc (3 × 100 mL)萃取。合併有機層，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由管柱層析純化以得到苯基((1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-基)甲酮(
2b
)。
步驟 3 ： (1R
,5S
)-3- 氧雜螺 [ 二環 [3.3.1] 壬烷 -9,2'-[1,3] 二氧雜環戊 ]-7- 酮 (2c)
向苯基((1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-基)甲酮(7.5 g, 26.0 mmol)、第三丁醇鉀(3.4 g, 30.0 mmol)及第三丁醇(100 mL)之混合物中添加六甲基磷醯三胺(100 mL)。在55℃下攪拌之同時用O
2
使混合物飽和。在完成反應(藉由TLC測定)之後，添加水(1 L)並用EtOAc (3 × 100 mL)萃取混合物。合併有機層，用水(2 × 100 mL)洗滌，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由管柱層析純化以得到(1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-酮(
2c
)。
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
) δ 4.09-4.04 (m, 4H), 3.89 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.78 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 2.84 (dd, J = 16.0 Hz, J = 5.0 Hz, 2H), 2.40 (d, J = 16.0 Hz, 2H), 2.00 (d, J = 5.0 Hz, 2H)。
步驟 4 ： (1R
,5S
)-3- 氧雜螺 [ 二環 [3.3.1] 壬烷 -9,2'-[1,3] 二氧雜環戊 ]-7- 醇 (2d)
在0℃下以若干份向(1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-酮(1.0 g, 5.0 mmol)於MeOH/DCM (10 mL/40 mL)中之混合物中添加NaBH
4
(760 mg, 20.0 mmol)。將混合物在rt下攪拌過夜，倒入NH
4
Cl溶液中並用EtOAc (3 × 50 mL)萃取。合併有機層，經Na
2
SO
4
乾燥並濃縮以得到(1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-醇，其未經進一步純化即用於下一步驟中。
步驟 5 ： 4-(((1R
,5S
)-3- 氧雜螺 [ 二環 [3.3.1] 壬烷 -9,2'-[1,3] 二氧雜環戊 ]-7- 基氧基 ) 甲基 )-5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 (2e)
在0℃下向NaH (60%於礦物油中) (580 mg, 14.4 mmol)於THF (30 mL)中之懸浮液中添加於THF (10 mL)中之(1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-醇(570 mg, 2.88 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌1.5 h，然後在0℃下添加4-(氯甲基)-5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑(根據國際申請公開案第WO 2011/020615號中所闡述之程序來製備) (1.2 g, 3.46 mmol)並在回流下攪拌過夜。用NH
4
Cl (飽和)淬滅反應並用EtOAc (3 × 20 mL)萃取。合併有機層，用鹽水(2 × 20 mL)洗滌，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由層析純化以得到4-(((1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-基氧基)甲基)-5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑(
2e
)。
步驟 6 ： (1R
,5S
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 酮 (2f)
在rt下向4-(((1
R
,5
S
)-3-氧雜螺[二環[3.3.1]壬烷-9,2'-[1,3]二氧雜環戊]-7-基氧基)甲基)-5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑(160 mg, 0.34 mmol)於丙酮/H
2
O (25 mL, 4:1, v:v)中之攪拌溶液中添加p-TsOH (13 mg)。將混合物在回流下攪拌12 h，冷卻，在減壓下濃縮並用飽和NaHCO
3
調節至約pH 8。用EtOAc (3 × 20 mL)萃取混合物並用鹽水洗滌合併之有機相，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由矽膠層析純化以得到中間體(1
R
,5
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-酮(
2f
)。
實例 1 ： 2-((1R
,5S
,9S
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-9- 羥基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 基 )-4- 氟苯并 [d] 噻唑 -6- 甲酸 步驟 1 ： 2-((1R
,5S
,9S
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-9- 羥基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 基 )-4- 氟苯并 [d
] 噻唑 -6- 甲腈
向(1
R
,5
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-酮(
2f
, 120 mg, 0.28 mmol)及4-溴-3-氟苯甲腈(
1b
, 73 mg, 0.28 mmol)於冷卻至-78℃之無水THF (20 mL)中之溶液中逐滴添加
n
-BuLi (0.28 mmol, 1.6M)。將混合物在-78℃下攪拌2 h且然後用飽和NH
4
Cl (30 mL)淬滅並用EtOAc (3 × 50 mL)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由矽膠管柱層析(DCM/MeOH = 30:1)純化以得到標題化合物2-((1
R
,5
S
,9
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-9-羥基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-基)-4-氟苯并[
d
]噻唑-6-甲腈。
步驟 2 ： 2-((1R
,5S
,9S
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-9- 羥基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 基 )-4- 氟苯并 [d] 噻唑 -6- 甲酸 ( 實例 1)
向2-((1
R
,5
S
,9
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-9-羥基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-基)-4-氟苯并[
d
]噻唑-6-甲腈(100 mg, 0.18 mmol)於EtOH (10 mL)中之溶液中添加NaOH水溶液(4N, 2 mL)且將混合物在75℃下攪拌1 h，冷卻，藉由HCl (4M, 5 mL)酸化並用EtOAc (3 × 50 mL)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，濃縮並藉由prep-HPLC純化以得到標題化合物2-((1
R
,5
S
,9
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-9-羥基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-基)-4-氟苯并[d]噻唑-6-甲酸(
實例 1)
。
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
): δ 13.44 (br s, 1H), 8.55 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.79 (dd, J = 11.0, J = 1.0 Hz, 1H), 6.66-7.56 (m, 3H), 6.44 (br s, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.77-3.74 (m, 1H), 3.70 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.54 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 2.50-2.67 (m, 5H), 1.52 (dd, J = 13.5, J = 4.0 Hz, 2H), 1.17-1.09 (m, 4H)。LC/MS (ESI): m/z 619.1 (M+H)
+
。
實例 2 ： 2-((1R
,5S
,9S
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-9- 羥基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 基 ) 苯并 [d
] 噻唑 -6- 甲酸 步驟 1 ： 2-((1R
,5S
,9s
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-9- 羥基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 基 ) 苯并 [d
] 噻唑 -6- 甲腈
向(1
R
,5
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-酮(
2f
, 120 mg, 0.28 mmol)及2-溴苯并[
d
]噻唑-6-甲腈(70 mg, 0.28 mmol)於冷卻至-78℃之無水THF (20 mL)中之溶液中逐滴添加
n
-BuLi (0.28 mmol, 1.6M)。將混合物在-78℃下攪拌2 h且然後用飽和NH
4
Cl (30 mL)淬滅並用EtOAc (3 × 50 mL)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經Na
2
SO
4
乾燥，濃縮並藉由矽膠管柱層析(DCM/MeOH = 30:1)純化以得到2-((1
R
,5
S
,9
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-9-羥基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-基)苯并[
d
]噻唑-6-甲腈。
步驟 2 ： 2-((1R
,5S
,9s
)-7-((5- 環丙基 -3-(2,6- 二氯苯基 ) 異噁唑 -4- 基 ) 甲氧基 )-9- 羥基 -3- 氧雜二環 [3.3.1] 壬烷 -9- 基 ) 苯并 [d
] 噻唑 -6- 甲酸 ( 實例 2)
向2-((1
R
,5
S
,9
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-9-羥基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-基)苯并[
d
]噻唑-6-甲腈(100 mg, 0.18 mmol)於EtOH (10 mL)中之溶液中添加NaOH水溶液(4N, 2 mL)並將混合物在75℃下攪拌1 h，冷卻，藉由HCl (4M, 5 mL)酸化並用EtOAc (3 × 50 mL)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，濃縮並藉由prep-HPLC純化以得到標題化合物2-((1
R
,5
S
,9
S
)-7-((5-環丙基-3-(2,6-二氯苯基)異噁唑-4-基)甲氧基)-9-羥基-3-氧雜二環[3.3.1]壬烷-9-基)苯并[
d
]噻唑-6-甲酸(
實例 2)
。
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
):
1
HNMR (500 MHz, DMSO-d
6
): δ 13.15 (br s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.07-8.03 (m, 2H), 7.66-7.56 (m, 3H), 6.40 (br s, 1H), 4.24 (s, 2H), 3.79-3.75 (m, 1H), 3.68 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.53 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 2.43-2.26 (m, 5H), 1.51 (dd, J = 13.5, J = 4.0 Hz, 2H), 1.16-1.09 (m, 4H)。LCMS (ESI): m/z 600.8 (M+H)
+
。
實例 3 ： FRET 活性分析
如下實施配體調介之輔因子肽相互作用之測定以量化結合至核受體FXR之配體：人類FXR α配體結合結構域之製備：在大腸桿菌(
E. coli
)菌株BL21(DE3)中以N末端加GST標籤之融合蛋白之形式表現人類FXR α LBD。將編碼FXR配體結合結構域之DNA選殖至載體pDEST15 (Invitrogen)中。表現係在IPTG可誘導T7啟動子之控制下進行。配體結合結構域之胺基酸邊界為資料庫條目NM_005123 (RefSeq)之胺基酸187-472。FXR-LBD之表現及純化：在LB-胺苄青黴素培養基（LB-Ampicillin medium）中以1:20稀釋轉變之大腸桿菌菌株之過夜預培養物並在30℃下生長至OD
600
=0.4-0.6之光學密度。然後藉由添加0.5 mM IPTG誘導基因表現。在30℃、180 rpm下將細胞再培育6 h。藉由離心(7000 × g, 7 min, rt)收集細胞。對於每公升原始細胞培養物，將細胞再懸浮於10 mL溶解緩衝液(50 mM葡萄糖, 50 mM Tris pH 7.9, 1 mM EDTA及4 mg/mL溶菌酶)中並在冰上放置30 min。然後使細胞經受超音波處理並經由離心(22000 × g, 30 min, 4℃)去除細胞碎片。對於每10 mL上清液，添加0.5 mL預洗滌之麩胱甘肽4B瓊脂糖漿液(Qiagen)並將懸浮液在4℃下保持緩慢旋轉1 h。藉由離心(2000 × g, 15 sec, 4℃)使麩胱甘肽4B瓊脂糖珠粒沈澱並在洗滌緩衝液(25 mM Tris、50 mM KCl、4 mM MgCl
2
及1M NaCl)中洗滌兩次。對於每公升原始培養物，將沈澱再懸浮於3 mL溶析緩衝液(溶析緩衝液：20 mM Tris、60 mM KCl、5 mM MgCl
2
及80 mM麩胱甘肽，在即將以粉末形式使用之前添加)。在4℃下將懸浮液旋轉15 min，使珠粒沈澱並用第一次之一半體積之溶析緩衝液再次溶析。彙集溶析物並在含有60 mM KCl、5 mM MgCl
2
以及1 mM二硫蘇糖醇及10% (v/v)甘油之20 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)中透析過夜。藉由SDS-Page分析蛋白質。 該方法量測假設配體調節經純化細菌表現之FXR配體結合結構域(LBD)與基於SRC-1之殘基676-700之合成生物素化肽(LCD2, 676-700)之間之相互作用的能力。所用肽之序列為B-CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS-COOH (SEQ ID NO: 1)，其中N末端經生物素化(B)。使用載體pDEST15將FXR之配體結合結構域(LBD)與GST以融合蛋白形式表現於BL-21細胞中。藉由超音波處理溶解細胞，並根據製造商說明書在麩胱甘肽瓊脂糖(Pharmacia)上純化融合蛋白。應用Perkin Elmer LANCE技術，針對化合物對FXR-肽相互作用之影響來篩選化合物。此方法依賴於自供體螢光體至附接至目標結合配偶體之受體螢光體之結合依賴性能量轉移。為便於處置及減少來自化合物螢光之背景，LANCE技術利用通用螢光團標記，且在384孔板中在含有20 ng/孔至60 ng/孔重組表現之與GST融合之FXR-LBD、200-600 nM N末端生物素化肽(代表SRC1胺基酸676-700)、200 ng/孔鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)-xlAPC偶聯物(Prozyme)及6-10 ng/孔Eu W1024 – 抗GST (Perkin Elmer)之基於Tris之緩衝液(20 mM Tris-HCl pH 7.5; 60 mM KCl, 5 mM MgCl
2
; 35 ng/µL BSA)中在25 µL之最終體積中進行時間解析檢測分析。保持樣品之DMSO含量為1%。在生成分析混合物及稀釋潛在地FXR調節配體之後，在黑暗中在rt下在384孔黑色FIA板(Greiner)中將分析平衡1 h。藉由Perkin Elmer VICTOR2VTM多標記計數器來檢測LANCE信號。藉由繪製665 nm處與615 nm處發射光之間之比率使結果可視化。觀察在不存在添加配體下所形成之FXR-肽之基礎含量。促進複合物形成之配體誘導時間解析螢光信號之濃度依賴性增加。預計同等良好結合至單體FXR及FXR-肽複合物二者之化合物將不會引起信號變化，而預計優先結合單體受體之配體將誘導所觀察信號之濃度依賴性減少。 為評價化合物之促效潛能，測定如下表2中所列示之實例化合物之EC
50
值(FRET EC
50
)。
實例 4 ： 哺乳動物單雜交 (mammalian one hybrid ， M1H) 分析
如下實施配體調介之Gal4啟動子驅動型反式活化之測定以量化配體結合調介之FXR活化：將編碼FXR配體結合結構域之cDNA部分與處於CMV啟動子控制之下之酵母GAL4 DNA結合結構域以融合形式選殖至載體pCMV-BD (Stratagene)中。配體結合結構域之胺基酸邊界為資料庫條目NM_005123 (RefSeq)之胺基酸187-472。使用質體pFR-Luc (Stratagene)作為報導基因質體，其含有具有酵母GAL4結合位點之五個串聯重複之合成啟動子，該啟動子驅動作為報導基因之北美螢火蟲(Photinus pyralis) (美國螢火蟲(American firefly))螢光素酶基因之表現。為改良實驗精確度，使質體pRL-CMV(Promega)共轉染。pRL-CMV含有組成型CMV啟動子，從而控制海腎(Renilla reniformis)螢光素酶之表現。所有Gal4報導基因分析皆在37℃下及5% CO
2
中在具有L-麩醯胺酸及補充有10%胎牛血清/0.1 mM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉及100單位青黴素(Penicilin)/鏈黴抗生物素蛋白/mL之厄爾氏BSS (Earle's BSS)之MEM中生長之HEK293細胞(獲自DSMZ, Braunschweig, Germany)中進行。培養基及補充物係自Invitrogen獲得。為進行分析，將每孔5 × 10
5
個細胞平鋪於96孔板中之每孔100 µL沒有酚紅及L-麩醯胺酸且具有補充有10%木炭/聚葡萄糖處理之FBS (HyClone, South Logan, Utah)、0.1 mM非必需胺基酸、2 mM麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及100單位青黴素/鏈黴抗生物素蛋白/mL之厄爾氏BSS之MEM中，在37℃下及5% CO
2
中培育。第二天，細胞為＞90%鋪滿。去除培養基，並使用每孔20 µL包括上述三種質體之基於OptiMEM - 聚乙烯-亞胺之轉染試劑(OptiMEM, Invitrogen；聚乙亞胺, Aldrich目錄號40,827-7)瞬時轉染細胞。在添加轉染混合物之後2-4 h添加具有與針對平鋪細胞所使用相同之組成之MEM。然後添加在MEM中預稀釋之化合物原液(最終媒劑濃度不超過0.1%)。將細胞再培育16 h，隨後使用雙重光螢光素酶分析系統在同一細胞提取物中依序量測螢火蟲及海腎螢光素酶活性(Dyer等人，
Anal. Biochem.
2000, 282, 158–161)。所有實驗皆以一式三份進行。 為評價實例化合物之FXR促效功效，在M1H分析中測定功效，如下表2中所列示(M1H EC
50
)。
表 2
* * * 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域之技術者通常所理解相同之意義。 因此，應瞭解，儘管已藉由較佳實施例及可選特徵特定地揭示了本發明，但熟習此項技術者可採取本文所揭示之本發明中體現之對本發明之修改、改良及變化，且該等修改、改良及變化視為在本發明之範圍內。代表較佳實施例之本文所提供之材料、方法及實例具有例示性且並非意欲限制本發明之範圍。 本發明已經在本文中廣泛地且一般性地予以闡述。屬上位揭示內容(generic disclosure)之每一較窄種類及下位分組亦構成本發明之一部分。此包括對本發明之上位闡述，條件或消極限制係將任何標的物自該類屬中去除，而不管所除去材料是否在本文中進行特定敘述。 另外，當依據Markush組闡述本發明之特徵或態樣時，熟習此項技術者將認識到，藉此亦可依據該Markush組之任何個別成員或成員子組闡述本發明。 應瞭解，儘管已結合上文實施例闡述了本發明，但上述闡述及實例意欲進行闡釋且並非限制本發明之範圍。熟習本發明所屬領域之技術者將明瞭在本發明之範圍內之其他態樣、優點及修改。
