TWI636039B - 治療法布瑞氏症 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於一種多羥化吡咯啶的新穎用途，其可用以製備一藥物以治療法布瑞氏症。據此，本揭示內容提供一種用以治療罹患或疑似罹患法布瑞氏症之個體的方法。該方法包含對該個體投予一治療有效量之式(I)化合物、其鹽類、酯類或溶劑合物，其中，R1 是H或以–COR2 任選取代的C1-3 胺；R2 是以具有至少一取代基之環烷基或苯基任選取代的烷基或烯烴，其中該取代基是選自由鹵素、烷基、鹵烷基及烷氧基所組成的群組；藉以改善、減緩、減輕及/或預防與法布瑞氏症相關之病徵。依據本揭示內容較佳的實施方式，式(I)化合物為一人類突變溶酶體α-半乳糖苷酶A的伴護蛋白。

Description

治療法布瑞氏症
本揭示內容是關於藥物伴護蛋白(pharmacological chaperon)的領域；特別是關於天然多羥化吡咯啶(polyhydroxylated pyrrolidine)之衍生物，以及其於治療或預防法布瑞氏症(Fabry disease)之用途。
法布瑞氏症(Fabry disease, FD)是一種遺傳性溶酶體代謝疾病，於GLA 基因中已確認超過300個誤義突變(missense mutation)。內質網(Endoplasmic reticulum, ER)品質管制會降解由該些突變基因編碼產生的突變蛋白；缺乏溶酶體α-半乳糖苷酶A (α–galactosidase A, α-Gal A)的活性會使細胞中堆積具有末端α-半乳糖殘基的中性醣神經鞘脂質-糖鞘脂(globotriaosylceramide, GL-3)。罹患FD之病患通常出現慢性神經病變疼痛、胃腸道紊亂、兒童肢端假淋巴瘤性血管角化瘤、心肌病變及早發性心肌梗塞等病徵。迄今，FD仍是最常見之溶酶體儲積病(lysosomal storage disease, LSD)之一，初步估計每476,000到117,000位活產新生兒中即會有1位罹患FD，且該數據有被低估的可能性。令人訝異地，近期研究報告指出，台灣男性罹患FD的比例偏高，其中新生兒篩檢試驗發現每1,250位個體即有1位罹患FD。
利用重組人類α-Gal A (rh-α-Gal A)進行的酵素取代治療(Enzyme replacement therapy, ERT)可用以治療FD，且對多數病患而言，ERT可改善或穩定其病況。然而，ERT的臨床應用仍受限於高價位、低便利性、酵素蛋白於血液中的低穩定性及無法穿透血腦障蔽(blood-brain barrier, BBB)等因素。此外，注入的重組蛋白在中性pH環境中穩定性不佳，會降低正確折疊之活性酵素於活體內的循環半衰期。因此，相關領域亟需一種可用以治療FD或改善rh-α-Gal A功效的新穎方法。
化學(或藥物)伴護蛋白治療為一種治療LSD的新興策略，其係利用小分子來輔助突變酵素的折疊，藉以防止由ER品質控制造成的降解反應，而後使得突變酵素可被轉移至溶酶體。去氧半乳糖野生黴素鹽酸鹽(1-Deoxygalactonojirimycin, DGJ)是一種對α-Gal A具有抑制活性的六員亞胺醣(iminosugar)，已知可作為一種有效的藥物伴護蛋白來回復法布瑞氏症細胞及組織中的突變α-Gal A。近期Migalastat (DGJ)的III期臨床試驗結果顯示，化學伴護蛋白可作為治療FD的替代性選擇。多數用以治療具有α-Gal A突變之法布瑞氏症病患的化學伴護蛋白皆為DGJ衍生物或哌啶(piperidine)型亞胺醣。相較之下，相關領域較缺乏利用五員亞胺醣作為治療FD之化學伴護蛋白的研究分析。近期高通量篩選(約230,000種化合物)研究結果亦未發現可作為α-Gal A抑制劑或活化劑的潛力分子。缺乏研究報導延緩了用以治療FD之新穎化學伴護蛋白的發展。
諸如2,5-二脫氧-2,5-亞胺基-d-甘露糖醇(2,5-dideoxy-2,5-imido-d-mannitol, DMDP)等天然多羥化吡咯啶為一種對不同糖苷酶具有抑制活性的化合物。舉例來說，本揭示內容的主要發明人發現了一種新穎之與DMDP相關的化學伴護蛋白，可用以治療高歇氏病(Gaucher disease)，其中該化學伴護蛋白可增加溶酶體α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase, GCase)的活性(Cheng et al., Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 5021)。此外，一篇近期研究亦指出三種DMDP 立體異構物，包含2,5-二脫氧-2,5-亞胺基-d-阿卓糖醇(2,5-dideoxy-2,5-imido-d-altritol, DIA)、C4- 表異構物 DGDP (DGDP為DMDP的2-表異構物)，以及C3-表異構物DGDP，對α-Gal (咖啡豆)皆具有良好的抑制活性(Ayers et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 7777)。
在本揭示內容中，發明人進一步研發天然多羥化吡咯啶(例如胺基-DMDP或ADMDP)之不同衍生物及立體異構物作為分子伴護蛋白的用途，據以治療或預防FD。
本揭示內容是基於發明人意外發現某些ADMDP及其衍生物為α-Gal A的潛力抑制劑，且可用以輔助突變α-Gal A的折疊；據此，該些化合物可作為突變α-Gal A的分子伴護蛋白，並用以製備可治療或預防FD的藥物。
據此，本揭示內容是關於一種用以治療罹患或疑似罹患FD之個體的方法。該方法包含對該個體投予一治療有效量之式(I)化合物、其鹽類、酯類或溶劑合物，其中， R1 是H或以–COR2 任選取代的C1-3 胺；以及 R2 是以具有至少一取代基之環烷基或苯基任選取代的烷基或烯烴，其中該取代基是選自由鹵素、烷基、鹵烷基及烷氧基所組成的群組； 藉以改善、減緩、減輕及/或預防與法布瑞氏症相關之病徵。
依據本揭示內容某些實施方式，式(I)化合物可抑制α-GAL A的活性。
依據本揭示內容其他實施方式，式(I)化合物是人類溶酶體α-半乳糖苷酶A (α–galactosidase A, α-Gal A)突變體的伴護蛋白。
依據本揭示內容較佳的實施方式，該人類α-Gal A突變體包含一突變，其係選自由R112H、P205T、Q279E、R301Q、R356W及R363C所組成的群組。
依據本揭示內容較佳的實施方式，式(I)化合物是選自由、、、、、及所組成的群組。
依據本揭示內容一較佳實施方式，式(I)化合物是、或。
依據本揭示內容實施方式，式(I)化合物是以每天0.001-500公克之劑量投予至該個體體內；較佳約為每天0.05-450公克。
依據某些較佳的實施方式，該方法更包含在投予式(I)化合物之前、同時或之後，對該個體投予一治療有效量之人類α-Gal A。
本揭示內容的另一態樣是關於一種新穎的ADMDP衍生物，具有式(I-1)的化學結構，其中， R3 是H或–COR2 ；以及 R2 是以具有至少一取代基之環烷基或苯基任選取代的烷基或烯烴，其中該取代基是選自由鹵素、烷基、鹵烷基及烷氧基所組成的群組。
依據一較佳實施方式，式(I-1)化合物是。
依據另一較佳實施方式，式(I-1)化合物是。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
1. 定義
除非另有所指，否則「胺」(amine)一詞是指具有1到20個(例如1到10個、1到 9個、1到8個、1到7個、1到6個、1到5個、1到4個、1到3個、1到2個，或1個)碳原子且包至少一胺基的直鏈型、支鏈型及/或環狀(環烷基)的碳氫化合物。較佳地，本揭示內容之胺是指低烷基胺，例如C1-3 胺。適用於本發明之胺為一級或二級胺，且除非另有所指，否則可以一或多取代基獨立任選取代胺基中至少一氫原子，即胺可為無取代基的胺(一「無取代胺」)或以一或多取代基取代的胺(一「有取代胺」)。在某些實施方式中，胺為亞甲基胺(methylene amine)。在其他實施方式中，是以一醯基來取代亞甲基胺之胺基中的一氫原子。
在一特定實施方式中，「可經取代的」(substituted)一詞在形容一化學結構或官能基時，是指該結構或官能基的衍生物，其一或多氫原子可以醯基、烷氧基、烷基、芳基、鹵素、鹵烷基或羥基進行取代。
「溶劑合物」(solvate)一詞在本揭示內容是指由一化合物(例如本發明之式(I)化合物)與其周圍的溶劑分子(例如水、醇類及其他極性有機溶劑)形成的複合物。醇類包含甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇及叔丁醇醇類亦可包含聚合性醇類，例如聚乙二醇(polyethylene glycol)及聚丙二醇(polypropylene glycol)等聚烯烴二醇(polyalkylene glycol)。最為人所熟知且較佳的溶劑為水，一般將以水溶劑化形成的溶劑合物化合物稱為水合物(hydrates)。
除非另有所指，否則一化合物的「治療有效量」(therapeutically effective amount)是指在治療或處理疾病或病狀時，足以產生治療效益，或是延緩或降低一或多種與該疾病或病狀有關之病徵的劑量。一化合物的治療有效量是指一治療藥劑的劑量，其可單獨投予或與其他治療共同投予至個體體內， 藉以產生治療或處理疾病或病狀之治療效益。「有效量」(effective amount)一詞包含可改善整體治療、減少或避免疾病或病狀之病徵或成因，或是增加另一治療藥劑之治療功效的劑量。
一化合物的「預防有效量」(prophylactically effective amount)是指一化合物於個體體內足以防止、延緩發生或減少疾病或病狀發生風險的劑量。
「病患」(patient)及「個體」(subject)在本揭示內容為可互換的詞彙，且可為一動物或一人類個體。「FD病患」(FD patient)在本揭示內容是指經診斷罹患FD之個體，且具有α-Gal A的突變形式，該突變會使酵素在內質網中無法形成穩定的構型。無法形成穩定構型進而會導致大量α-Gal A走向降解反應，而不是傳送至溶酶體。例示性之與FD相關的α-Gal A突變包含，但不限於，L32P、N34S、T41I、M51K、E59K、E66Q、I91T、A97V、R100K、R112C、R112H、F113L、T141L、A143T、G144V、A156V、L166V、D170V、C172Y、G183D、P205T、Y207C、Y207S、N215S、A228P、S235C、D244N、P259R、N263S、N264A、G272S、S276G、Q279E、Q279K、Q279H、M284T、W287C、I289F、M296I、M296V、L300P、R301Q、V316E、N320Y、G325D、G328A、R342Q、R356W、E358A、E358K、R363C、R363H及P409A。依據本揭示內容較佳的實施方式，不穩定的α-Gal A包含R112H、P205T、Q279E、R301Q、R356W或R363C任一種突變。
除非另有所指，否則「治療」(treat、treating或treatment)一詞是指一動作，當一個體罹患特定疾病或病狀時，該動作可減少該疾病或病狀的嚴重程度、一或多種病徵，或是延緩或降低該疾病或病狀的進程。
須知，當未特別以粗線或斷線標示出一結構或一結構之部分的立體化學構造時，應將該結構或該結構之部分解讀為包含其所有立體異構物。相似地，在敍述具有一或多掌性中心的化合物時，若未特別指明該些中心的立體化學，則應將之解讀為包含純立體異構物及其混合物。此外，圖式中任一具有不飽和價數之原子應假設其係與足夠的氫原子結合，以滿足其價數。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
2. 本發明化合物
本發明之化合物為1-胺基脫氧-DMDP (1-aminodeoxy-DMDP, ADMDP)的立體異構物及其衍生物。ADMDP的化學結構包含至少4個不對稱的碳原子(即掌性中心)，ADMDP因此包含至少16種立體異構物。本發明之發明人研發了一種策略，可依據本揭示內容實施例1來合成16種ADMDP立體異構物(即化合物9 到24 )及其衍生物(即化合物28 、29 及33-37 )。接著對得到的ADMDP及/或其衍生物(即化合物9-24 、28 、29 及33-37 )進行各種分析，以評估其作為治療法布瑞氏症之分子伴護蛋白的應用性。該些分析方法至少包含抑制α-Gal A、穩定重組α-Gal A、輔助突變α-Gal A之折疊，以及當與α-Gal A共同投予自源自FD病患的淋巴細胞時所產生的加乘作用。依據本揭示內容之結果，以上述評估方法確認的化合物(即式(I)化合物)可作為一種具有潛力之先導化合物，據以製備FD之治療藥物。
因此，本發明包含式(I)化合物、其鹽類、酯類或溶劑合物，其中， R1 是H或以–COR2 任選取代的C1-3 胺；以及 R2 是以具有至少一取代基之環烷基或苯基任選取代的烷基或烯烴，其中該取代基是選自由鹵素、烷基、鹵烷基及烷氧基所組成的群組。
例示性之式(I)化合物包含，但不限於，、、、、、及。
依據某些實施方式，本揭示內容之化合物具有式(I-1)的化學結構，其中， R3 是H或–COR2 ；以及 R2 是以具有至少一取代基之環烷基或苯基任選取代的烷基或烯烴，其中該取代基是選自由鹵素、烷基、鹵烷基及烷氧基所組成的群組。
在一較佳實施例中，式(I-1)化合物為。
在另一較佳實施例中，式(I-1)化合物為。
依據本揭示內容某些實施方式，式(I)化合物可抑制α-GAL A的活性。
依據本揭示內容其他實施方式，式(I)化合物為人類溶酶體α-半乳糖苷酶A (α-galactosidase A, α-Gal A)突變體的伴護蛋白。具體來說，式(I)化合物可輔助不穩定之α-Gal A或突變之α-Gal A的折疊，其中該突變之α-Gal A包含R112H、P205T、Q279E、R301Q、R356W或R363C任一種突變。
3. 使用方法
本發明因此包含一種用以治療或預防一罹患或疑似罹患FD之個體的方法。該方法包含對該個體投予一治療或預防有效量之式(I)化合物、其鹽類、酯類或溶劑合物，藉以改善、減緩、減輕及/或預防FD之病徵。在某些實施方式中，該方法更包含在投予式(I)化合物之前、同時或之後，對該個體投予一治療有效量之人類α-Gal A。
依據本揭示內容實施方式，式(I)化合物是選自由、、、、、及所組成的群組。
較佳地，式(I)化合物是化合物17 、33 或37 ，其鹽類、酯類及/或溶劑合物。更佳地，式(I)化合物是化合物17 。再更佳地，式(I)化合物是化合物33 。
依據本揭示內容實施方式，本揭示內容式(I)化合物是以每天0.001-500公克之劑量投予至該個體體內，例如每天0.001、0.01、0.1、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490及500公克；較佳地，每天約0.05-450公克，例如每天0.05、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440及450公克；更佳地，每天約5-400公克，例如每天5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390及400公克。
可依據特定因素來調整式(I)化合物的投予劑量、路徑及給藥順序，例如欲治療、預防或處理的特定病徵、年齡、性別及病患的生理況狀。該些因素對疾病的影響為本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知，且可以慣常實驗來分析得知。
式(I)化合物可與適當的藥學賦形劑或載體結合，據以製備藥劑(例如藥學組合物或藥學製劑)，且以口服、非口服、經皮、局部及黏膜等路徑投予至FD病患體內。
式(I)化合物的重量可佔藥劑總重量的0.1%到99%。在某些實施方式中，式(I)化合物的重量至少佔藥劑總重量的1%。在某些實施方式中，式(I)化合物的重量至少佔藥劑總重量的5%。在其他實施方式中，式(I)化合物的重量至少佔藥劑總重量的10%。在另外的實施方式中，式(I)化合物的重量至少佔藥劑總重量的25%。
某些藥劑是配製為適用於口服、黏膜(例如鼻腔、舌下、陰道內、頰內或直腸內)、非口服(例如皮下、靜脈內、單次全劑量注射(bolus injection)、肌肉內或動脈內)或經皮投予的單一劑型。例示性之劑型包含，但不限於，片劑、囊片、膠囊(例如軟式彈性明膠膠囊)、扁囊劑、錠劑、錠片、分散體、栓劑、軟膏、泥罨劑、乳劑、硬膏劑、溶液、貼劑、噴霧劑、凝膠、適用以口服或黏膜方式投予至病患體內的液體劑型(包含懸浮液(例如與水相容或不溶的液體懸浮液、水包油乳劑，或是油包水乳劑)、溶液及酏劑)、適用以非口服方式投予至病患體內的液體劑型及無菌固體(例如晶質或非晶質固體)，其可重製為適用以非口服方式投予至病患體內的液體劑型。
可依據特定的投予路徑來配製本發明藥劑。舉例來說，口服投予需要腸溶衣包覆，藉以保護本發明化合物避免於胃腸道中分解。相似地，藥劑可包含額外的成分，藉以將活性成分傳遞到作用位置。舉例來說，可以微脂體劑型來投予化合物，以防止其受到酵素作用而分解，輔助運送通過個體的循環系統，以及穿透細胞膜傳送至細胞內位置。
相似地，溶解性較差的化合物可與助溶劑、乳化劑及表面活性劑共同配置為液體劑型(及適用於重製的劑型)，該些助溶劑、乳化劑及表面活性劑包含，但不限於，環糊精(例如α-環糊精及β-環糊精)，以及無水溶劑，其包含，但不限於，酒精、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、二甲亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)、生物相容性油(例如棉籽油、花生油、玉米油、小麥胚芽油、蓖麻油、橄欖油、芝麻油)、甘油、四氫呋喃、聚乙二醇、山梨醇酐的脂肪酸酯類及其組合(例如DMSO：玉米油)。
可依據特定的使用需求來調整藥劑的組成、形狀及種類。舉例來說，相較於一疾病的慢性治療，對相同疾病進行急性治療時，藥物可包含較大量之一或多種活性成分。相似地，相較於口服藥劑，非口服藥劑在治療相同疾病時可包含較少量之一或多種活性成分。本發明所屬技術領域具有通常知識者可了解本發明特定藥劑之間的差異性。例如可參照Remington’s Pharmaceutical Sciences , 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)。
3.1 適用於口服投予的藥劑
可將包含本發明式(I)化合物的藥劑配製為適用於口服的不連續劑型，例如片劑(例如咀嚼片)、錠劑、膠囊及液體(例如糖漿)。該些劑型包含特定量之活性成分，且可依據習知技藝人士所熟知之方法進行製備。例如可參照Remington’s Pharmaceutical Sciences , 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)。
一般來說，可依據傳統醫藥化合物製成技術，將活性成分與至少一賦形劑混合，據以製備口服劑型。可依據特定的投予需求來採用不同類形的賦形劑。
基於易於投予的特性，片劑及膠囊為二種最常見的口服劑型。若有必要，可以標準水性或非水性技術來包覆片劑。可以傳統藥學方法來製備該些劑型。一般來說，可將活性成分與液體載體、細分的固體載體或其組合均勻混合後，製為特定形狀。可以固體劑型中加入崩解劑，以輔助快速溶液。亦可加入潤滑劑以輔助製備劑型(例如片劑)。
3.2 適用於非口服投予的藥劑
非口服藥劑可以皮下、靜脈內(包含單次全劑量注射)、肌肉內及動脈內等方式投予至病患體內。基於該種投予方式可避開病患對污染物的自我防禦機制，因此非口服劑型一般為無菌，或於投予前進行無菌處理。例示性之非口服藥劑包含，但不限於，直接注射的溶液、可溶解或懸浮於用以注射之藥學上可接受之載體的乾燥產物、直接注射之懸浮液及乳化劑。
適用於製備本發明非口服藥劑之載體為本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知之載體。例示性之載體包含，但不限於，水、液體載體(例如，但不限於，氯化鈉溶液、林格氏液及葡萄糖)、與水互溶之載體(例如，但不限於，乙醇、聚乙二醇及聚丙二醇)及非水性載體(例如，但不限於玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)及苯甲酸苄酯(benzyl benzoate))。
3.3 適用於經皮、局部及 / 或黏膜投予的藥劑
經皮、區部及黏膜藥劑包含，但不限於，眼用溶液、噴劑、霧劑、乳劑、洗劑、軟膏、凝膠、溶液、乳化劑、懸浮液及其他本發明所熟領域具有通常知識者所熟知之形式。例如可參照Remington’s Pharmaceutical Sciences , 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1990)。經皮藥劑包含「儲藥型」(reservoir type)或「基質型」(matrix type)貼片，其可於皮膚貼附一特定時間，藉以促使特定劑量之活性成分穿透皮膚。
適當的賦形劑(例如載體及稀釋劑)及其他可製備經皮、局部及黏膜劑型的材料為藥學領域習知技藝人士所熟知之物質，且可依欲投予藥學組合物之特定組織及其劑型來選用適合的賦形劑。
依據治療組織的不同，可於投予本發明活性成分之前、同時或之後給予額外的成分。舉例來說，可使用穿透增強劑來輔助活性成分傳送至組織。
亦可調整藥物或劑型的pH值，或是投予藥物或劑型之組織的pH值，來改善一或多種活性成分的傳送功效。相似地，可調整溶劑載體的極性、離子強度及張力來改善傳送功效。可將硬脂酸鹽等化合物添加於藥物及劑型中，以改變一或多種活性成分的親水性或親油性，藉以改善傳送功效。此時，硬脂酸鹽可作為一種製劑的脂質載體、一種乳化劑或表面活性劑，以及一種傳送增加劑或穿透增強劑。可利用活性成分的鹽類、水合物或溶劑合物來進一步調整組合物的特性。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。實施例
材料及方法
細胞培養
將人類淋巴細胞(08C0058)及源自法布瑞氏症病(GM04391)病患之淋巴細胞培養於包含15% FBS (胎牛血清，Invitrogen)、2 mM L-麩胺酸及1%青黴素/鏈黴素(Gibco )的RPMI-1640 (Gibco )細胞培養液中。將COS-7細胞培養於包含10%經熱處理之FBS、4 mM L-麩胺酸及1%青黴素/鏈黴素的DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium;Gibco )細胞培養液中。將所有的細胞培養於37°C、包含5% CO2 之潮溼的細胞培養箱中，培養細胞至1-30代時，進行後續生物評估。
利用人類淋巴細胞進行細胞毒性試驗
將野生型人類淋巴細胞(08C0058)種植於96孔洞盤中，細胞密度為每孔洞50,000個細胞。24小時後，置換細胞培養液，並加入最終濃度為10-200 μM的測試化合物。所有的化合物皆係溶於DMSO或H2 O中，實驗對照組則以DMSO來進行。將細胞培養於37°C之5% CO2 中48-72小時。之後，對懸浮於細胞培養液中的細胞加入10微升的alamarBlue，再將該混合物培養於37°C之5% CO2 共3-5小時。以 560奈米之激發光譜及590奈米之發散光譜來定量及測量存活細胞的數量。
α-Gal A 的活體外穩定度
利用法布瑞酶(Fabrazyme，一種rh-α-Gal A)來檢測小分子於穩定α-Gal A，避免其進行降解反應的功效。將酵素(20微升，pH 7.0)與0、0.5、5或50 μM之化合物17 –19 於冰上反應10分鐘。將檢體加熱至48°C (作為時間函數)，以熱去活化(降解) α-Gal A，之後將檢體釋稀至3倍體積之0.1 M檸檬酸磷酸鹽緩衝液(pH 4.6)中。立即將酵素與受質(0.2 mM之4-甲基傘型酮α-D-半乳糖苷(4-methyllumbelliferyl α-D-galactoside))於37°C反應15分鐘，再以甘胺酸緩衝液淬熄(quenching)反應。測量解離之甲基傘型酮(激發光譜為355奈米，發散光譜為460奈米)。以相對於未加熱處理之酵素來表示酵素活性。
N215S 病患淋巴細胞之細胞內活性增強試驗
將法布瑞氏症N215S病患的淋巴細胞(GM04391)種植於無菌透明底之96孔洞盤中，細胞密度為每孔洞20,000個細胞，之後將細胞培養於37o C之5% CO2 的環境12-24小時。接著，將細胞培養於包含或不包含潛力化合物的環境4天。進行酵素試驗：以PBS洗滌細胞3次後，利用50微升、0.1%之溶於pH 4.6緩衝液(檸檬酸磷酸鹽)的triton X 100均質化細胞，以14,000g 的轉速離心後，取20微升之上清液與20微升之受質溶液(包含8 mM之4-甲基傘型酮α-d-半乳糖苷(4-MU-α-Gal)及150 mM之N -乙醯半乳胺糖(N - acetylgalactosamine)，用以抑制α-Gal B (N -乙醯半乳胺糖酶(N -acetylgalactosamidase))，溶於0.1 M檸檬酸磷酸鹽緩衝液(pH 4.6))以進行酵素試驗)於37o C反應1小時。之後加入停止溶液(每公升0.4莫耳之K2 CO3 ，pH 10.6)，利用Victor盤讀取器以355奈米之激發光譜及460奈米之發散光譜測量螢光值。將螢光值減去背景值，以計算僅由受質溶液得到的螢光量。利用MicroBCA蛋白試驗套組來決定蛋白濃度。利用每公升0微莫耳到每公升200微莫耳的4-甲基傘型酮標準曲線將螢光數值轉換為α-Gal A的絕對活性，並將其表示為每小時每毫克蛋白之奈莫耳(nmol/mg protein per h)。以未處理之酵素活性標準化螢光數值，藉以得到α-Gal A的相對活性，並以倍數來表示。
選殖溶酶體 α-Gal A
由RT-PCT得到包含α-Gal A之全長cDNA的質體。以KOD Hot Start DNA聚合酶及正向引子5’-AGGTCGGATCCGACAATGCAGCTGAGGAACC-3’ (序列編號：1)與反向引子5’-GGTGGAATTCTTAAAGTAAGT CTTTTAATGACATCTGCA-3’ (序列編號：2)擴增選殖的野生型人類GLA 基因，並導入特定限制酶切點BamHI及EcoRI。以電泳分析觀察大小為1.4 kb的PCR產物，且以限制酶進行確認。將擴增產物插入哺乳動物的選殖載體pJET2.1，據以製備突變的構建載體。
溶酶體 α-Gal A 的突變
利用QuikChange Lightining定點突變套組以定點PCR突變來製備具有α-Gal A　突變之選殖載體。以PCR擴增反應與QuikChange Lightning酵素進行個別的核苷酸置換，其中是以包含野生序列之pJET2.1/GLA載體作為模板，表1列出使用之30-40單元的引子(具有特定序列修飾的正股及反股引子)。以限制酶及DNA電泳分析來確認各突變質體，第2圖闡述了台灣基因體的定序結果。以限制酶BamHI及EcoRI切割pJET2.1/GLA後，利用電泳分析進行純化。
將GLA基因連接至載體pcDNA3.1後，轉形至大腸桿菌中，藉以擴增產生包含野生型及突變序列的pcDNA3.1/GLA質體，以供後續轉染實驗使用。表 1 .　 用以定點PCR突變的引子
短暫轉染 COS-7 及伴護蛋白試驗
將COS7細胞種植於24孔洞盤中，細胞密度為每孔洞1x105 個細胞，培養16-20小時後，利用MirusILT-1 試劑暫時性地轉染包含人類野生型或突變α-Gal cDNA的表現質體。培養5-8小時後，加入包含或不包含欲測試伴護功效之化合物的新鮮細胞培養液，培養60個小時。之後，以0.1% EDTA-胰蛋白酶收集細胞，並以100微升、0.1%之溶於pH 4.6緩衝液(檸檬酸磷酸鹽)的triton X100均質化細胞，接著以14,000g 的轉速進行離心。檢測細胞分解產物中α-Gal A的活性。簡單來說，取10微升之上清液與 10微升之受質溶液(包含8 mM之4-甲基傘型酮α-d-半乳糖苷(4-MU-α-Gal)及150 mM之N -乙醯半乳胺糖(N -acetylgalactosamine)，用以抑制α-Gal B (N -乙醯半乳胺糖酶(N -acetylgalactosamidase)，溶於0.1 M檸檬酸磷酸鹽緩衝液(pH 4.6))以進行酵素試驗)，於37o C反應1小時。之後加入停止溶液(每公升0.4莫耳之K2 CO3 ，pH 10.8)，利用Victor盤讀取器以355奈米之激發光譜及460奈米之發散光譜測量螢光值。將螢光值減去背景值，以計算僅由受質溶液得到的螢光量。利用MicroBCA蛋白試驗套組來決定蛋白濃度。利用每公升0微莫耳到每公升200微莫耳的4-甲基傘型酮標準曲線將螢光數值轉換為α-Gal A的絕對活性，並將其表示為每小時每毫克蛋白之奈莫耳(nmol/mg protein per h)。
糖苷酶活性試驗
利用多重偵測讀取器(SpectraMax M5, Molecular Device)以405奈米之吸收光譜或以355奈米之激發光譜及460奈米之發散光譜來檢測不同濃度之對硝苯基-吡喃葡萄糖苷(p -nitrophenyl-glycopyranoside)或4-甲基傘型酮-吡喃葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-glycopyranoside)於室溫或37o C的水解初始速度。藉由GraphPad將數據代入Michaelis-Menten公式，藉以決定Km值及Vmax值。利用每毫升0.1單位之商業來源的酵素、20 nM之Myozyme® (重組人類酸性α-葡萄糖苷酶)、10 nM之Cerezyme (重組人類酸性α-葡萄糖苷酶)及每毫升62微克之源自人類正常淋巴細胞的α-Gal A建立理想的增長曲線，抑制劑的測試濃度則為100 μM。以 96孔洞微量盤進行試驗，其中投予α-葡萄糖苷酶(脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus ))及α-Gal (綠咖啡豆)處理時，是使用磷酸鈉緩衝液(100 mM, pH 6.8)；在投予Myozyme®、Cerezyme®及β-葡萄糖苷酶(杏仁)時，是使用檸檬酸鈉緩衝液(100 mM, pH 5.2)；而在投予α-甘露糖苷酶(α-mannosidase, 刀豆(Jack bean))及源自人類正常淋巴細胞的α-Gal時，則是使用檸檬酸鈉緩衝(100 mM, pH 4.5)。
熱穩定轉移試驗 (Thermal stability shift assay)
利用經改良之螢光熱穩定試驗以Rotor-Gene系統於中性pH緩衝液(磷酸鉀，pH 7.0)或酸性pH緩衝液(檸檬酸磷酸鹽緩衝液，pH 4.6)來檢測α-Gal A的穩定性。簡單來說，將α-Gal A (2微克)與SYPRO橘染劑及不同濃度之17 、28 及29 均勻混合，最終反應體積為20微升。以每分鐘1°C的溫度梯度加熱反應盤，並持續監測SYPRO橘的螢光值。在完全溫度降解後，以最大螢光值標準化各溫度的螢光強度。
對病患淋巴細胞共同投予法布瑞酶及化合物 17 後進行 α-Gal A 活性試驗分析
將法布瑞氏症病患之淋巴細胞種植於無菌、透明的96孔洞盤中，細胞密度為每孔洞20,000個細胞，並於37°C、5% CO2 的環境中培養12-16個小時。接著對細胞單獨投予法布瑞酶(每公升1奈莫耳)，或是合併投予法布瑞酶(每公升1奈莫耳)及化合物17 (每公升1、10、50微莫耳)，反應24小時。以生長培養液洗滌細胞3次，之後以生長培養液於37°C、5% CO2 的環境培養3天。進行酵素試驗：在以PBS洗滌2次後，以50微升、0.1%之溶於pH 4.6緩衝液(檸檬酸磷酸鹽)的triton X 100均質化細胞，接著以14,000g 的轉速離心後，取出20微升之上清液與20微升之受質溶液(包含8 mM之4-甲基傘型酮α-d-半乳糖苷(4-MU-α-Gal)及150 mM之N -乙醯半乳胺糖，溶於0.1 M檸檬酸磷酸鹽緩衝液(pH 4.6))以進行酵素試驗)於37o C反應1小時。之後加入停止溶液(每公升0.4莫耳之K2 CO3 ，pH 10.8)，利用Victor盤讀取器以355奈米之激發光譜及460奈米之發散光譜測量螢光值。將螢光值減去背景值，以計算僅由受質溶液得到的螢光量。利用MicroBCA蛋白試驗套組來決定蛋白濃度。利用每公升0微莫耳到每公升200微莫耳的4-甲基傘型酮標準曲線將螢光數值轉換為α-Gal A的絕對活性，並將其表示為每小時每毫克蛋白之4-MU解離的奈莫耳數(nmol/mg protein/hour)。以未處理之酵素活性標準化螢光數值，藉以得到α-Gal A的相對活性，將其以倍數來表示。
初步以酵素篩選化合物庫之流程
稀釋化合物庫(20微升)，使其最終濃度為20 μM；與溶於pH 4.6緩衝液(50微升)之受質4-甲基香豆素基 α-D- 半乳哌喃糖苷(4- Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside，20微升)及重組人類α-Gal A (10微升)均勻混合後，於37o C反應15分鐘。加入停止溶液(每公升0.4莫耳之K2 CO3 ，pH 10.8)，以355奈米之激發光譜及460奈米之發散光譜測量螢光值。對照組為由HBTU、DIEA、酸性化合物庫(總體積為20微升)、受質(20微升)、緩衝液(50微升)及酵素(10微升)組成的混合物，其不包含醯胺(amide)產物。空白對照組(Blank)則包含溶於pH 4.6緩衝液(70微升)的受質(20微升)及酵素(10微升)。評估抑制功效，並表示為相對於對照組之相對酵素活性。
在由 N215S 病患淋巴細胞移除化合物後，追踪分析細胞內活性增強之流程
將具有N215S突變之人類淋巴細胞以20,000的細胞數量種植於96孔洞盤(coster)，培養12-16小時。加入特定濃度(0-50 μM)的抑制劑後，持續培養細胞4天。更新96孔洞盤之細胞培養液，再另外培養0、2或4天。以PBS洗滌細胞3次後，將50微升之細胞分解緩衝液(具有0.1% TX 100之0.1 M磷酸鈉/檸檬酸緩衝液)加入淋巴細胞中，均勻混合後，以4,000 rpm的轉速離心1小時。取20微升之細胞分解產物加入20微升之受質溶液，其係包含溶於0.1 M磷酸鈉/檸檬酸緩衝液之8 mM 4MU-α-D-半乳哌喃糖苷及150 mM N-乙醯半乳胺糖，之後於37o C反應1小時。加入40微升之停止溶液(碳酸氫鈉，pH 10.6)，再以355奈米之激發光譜及460奈米之發散光譜來觀測其螢光值。以溶於0.1M磷酸鈉/檸檬酸緩衝液(20微升)之每公升0奈莫耳到200莫耳的甲基傘型酮及20微升之具有0.1% TX 100之0.1M磷酸鈉/檸檬酸緩衝液建立標準曲線，藉以將螢光數值轉換為α-Gal A的絕對活性，將其表示為每小時每毫克蛋白之奈莫耳。以MicroBCA蛋白試驗套組(Pierce, Rockford, IL, USA)來決定20微升之細胞分解物中的蛋白濃度。
實施例 1 製備及確認化合物 9 到 37
1.1 合成化合物 9 到 24
在本實施例中，是依據Tsou et al (Tetrahedron 2009, 65, 93)所述之方法，由8種對應之吡咯啶類掌性三-O-芐基環環亞基胺-N-氧化物(tri-O-benzyl cyclic nitrones)來製備胺基-DMDP (或ADMDP)的16種非天然立體異構物(即化合物9 到24 )。依據使用環亞基胺-N-氧化物的化學構型，各環亞基胺-N-氧化物可作為一種先驅物，以製備二種特定之具有2,3-順向及2,3-反向結構的類ADMDP產物。流程圖1提供了合成化合物17 及18 的流程。具體來說，將具有高度非鏡像選擇性之親核性TMSCN於50o C加入溶於甲醇之環亞基胺-N-氧化物25 後，主要產物為其同分異構物26 (78%, dr ≥ 20/1)，經由還原-N-保護(reductive-N -protection)及O-Bn去保護作用(O-Bn deprotection)可進一步將化合物26 以高產率(60%)地方式轉換為化合物17 。另一方面，利用消去-還原循序處理(elimination-reduction sequence)將化合物26 中的C-2腈基團轉換而產生化合物27 (二步驟為38%)。接著，全面氫解化合物27 以製備化合物18 ，其為化合物17 的C2表異構物(產率為71%)。以與流程圖1相似的方法由對應之環亞基胺-N-氧化物來製備其他的同分異構物，其產率約為30-35%。
流程圖1. 製備化合物17 及18 之流程條件及試劑：(a) TMSCN, MeOH , 50o C, 10小時, 78%; (b) 1) MsCl, Et3 N, THF, 20分鐘, 2) NaBH4 , MeOH/THF, 13小時, 38%; (c)　 Pd(OH)2 , conc. HCl, H2 , MeOH, 71%; (d) 1) Raney Ni, Boc2 O, H2 , MeOH, rt, 5小時, 2) conc. HCl, MeOH, reflux, 1小時; 3) Pd(OH)2 , conc. HCl, H2 , MeOH, rt, 10小時，三步驟之產率為60%。
製備化合物 25. 將2,3,5-三-O -芐基-L-核呋喃糖(2.4公克，5.8 毫莫耳)與溶於甲醇(15毫升)之氫氯酸胲(hydroxylamine hydrochloride，3.2公克，46 毫莫耳)及甲氧化鈉(sodium methoxide，4.3毫升，23 毫莫耳，於甲醇之濃度為5.4 M)混合反應。於室溫攪拌混合物5小時後，蒸發溶劑。利用EtOAc萃取殘留物，並以H2 O洗滌之，之後以無水MgSO4 進行乾燥，再濃縮產物。將溶於CH2 Cl2 (7.5毫升)之肟(oxime)殘留物、叔丁基二苯基氯矽烷(tert -butylchlorodiphenylsilane (TBDPSCl)，2.07公克，7.5 毫莫耳)及咪唑(imidazole，0.6公克，9.0 毫莫耳)於室溫攪拌2小時後，以水(10毫升)淬熄反應。以鹽水洗滌有機層後，利用無水MgSO4 乾燥產物並進行濃縮。以溶於CH2 Cl2 (15毫升)之甲磺醯氯(methanesulfonyl chloride，0.67毫升，8.7 毫莫耳)及三乙胺(triethylamine，1.2毫升，8.7 毫莫耳)處理矽烷(silane)殘留物之混合物，於0o C反應3小時，之後以水(15毫升)淬熄反應混合物。以鹽水洗滌有機層後，利用無水MgSO4 乾燥產物並進行濃縮。在室溫下，於乾燥THF (15毫升)中攪拌粗製中間產物及TBAF (7.0毫升，THF中濃度為1 M) 30分鐘。真空移除溶劑，於80o C攪拌溶於MeOH/H2 O (4/1，體積比，58毫升)之殘留物、氫氯酸胲(3.13公克，45 毫莫耳)及碳酸氫鈉(3.78公克，45 毫莫耳) 24小時。真空移除溶劑，再以CC (50% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物以製備白色固體-環亞基胺-N-氧化物25 (1.09公克，2.61 毫莫耳，45%);1 H NMR (600 MHz, CDCl3 )δ 4.09 (dd, 1H,J = 3.3, 9.2 Hz), 4.15–4.19 (m, 2H), 4.37 (t, 1H,J = 5.9 Hz), 4.53–4.60 (m, 4H), 4.68 (s, 2H), 4.70 (d, 1H,J = 11.8 Hz), 6.91 (s, 1H), 7.24–7.35 (m, 15H);13 C NMR (150 MHz, CDCl3 )δ 137.7, 137.3, 137.2, 132.7, 128.5, 128.4, 128.3, 128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.6, 127.5, 74.5, 74.0, 73.4, 73.0, 72.4, 66.5. HRMS calcd for [C26 H27 NO4 +Na]+ 440.1832, found 440.1843.
製備化合物 26. 將溶於乾燥甲醇(5毫升)之包含化合物25 (420 毫克，1 毫莫耳)及三甲基矽化腈(trimethylsilyl cyanide，320 微升，2.5 毫莫耳)的混合物於50o C攪拌10小時。真空移除溶劑，再以CC (20% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物以製備純白色固體化合物26 (344 毫克，0.78 毫莫耳，78%);1 H NMR (600 MHz, CDCl3 )δ 3.57 (dd, 1H,J = 6.8, 12.9 Hz), 3.69 (dd, 1H,J = 6.8, 9.7 Hz), 3.76 (dd, 1H,J = 6.8, 9.7 Hz), 4.25 (t, 1H,J = 5.5, 5.4 Hz), 4.32 (d, 1H,J = 5.7 Hz), 4.33 (t, 1H,J = 5.5, 5.3 Hz), 4.47–4.53 (m, 3H), 4.63 (d, 1H,J = 11.9 Hz), 4.68–4.73 (m, 2H), 7.22–7.35 (m, 15H);13 C NMR (150 MHz, CDCl3 )δ 141.6, 141.5, 140.7, 132.5, 132.3, 132.2, 132.1, 131.9, 131.8, 131.7, 131.6, 120.4, 84.1, 81.2, 81.0, 80.9, 79.8, 72.9, 71.3, 64.3. HRMS calcd for [C27 H28 N2 O4 +Na]+ 467.1941, found 467.1959.
製備化合物 17. 於氫氣環境中，於無水甲醇(3毫升)中混合化合物26 (0.29公克，0.65 毫莫耳)、雷氏鎳(Raney nickel，0.05公克)及二碳酸二叔丁酯(di-tert -butyl dicarbonate，700 毫克，3.25 毫莫耳)並攪拌直到其完全溶解。5小時後，真空移除溶劑，再以CC (10% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以製備具有Boc保護之中間產物。於50o C回流溶於甲醇(3毫升)之具有Boc保護之中間產物及37% HCl (1毫升)。1小時後，加入氫氧化鈀(50毫克)，於室溫、氫氣環境中再次攪拌反應混合物10小時。利用矽鈣石過濾反應混合物，再以CC (25%水性NH4 OH (37%)於1-丙醇，矽膠)進行純化，以製備淡黃色的油狀產物-17 (63.2 毫克，0.39 毫莫耳，60%)。1 H NMR (600 MHz, D2 O)δ 2.81 (dd, 1H,J = 8.0, 13.0 Hz), 2.97 (dd, 1H,J = 4.4, 13.0 Hz), 3.12–3.16 (m, 1H), 3.24 (d, 1H,J = 3.6 Hz), 3.60 (dd, 1H,J = 6.6, 11.2 Hz), 3.74 (dd, 1H,J = 6.6, 11.2 Hz), 3.90 (dd, 1H,J = 4.4, 8.0 Hz), 4.11 (s, 1H);13C NMR (150 MHz, D 2 O)δ 75.4, 71.9, 60.2, 59.8, 59.7, 43.1. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +H]+ 163.1077, found 163.1083.
製備化合物 27. 以溶於THF (10毫升)之甲磺醯氯(280 微升，3.4 毫莫耳)及三乙胺(680 微升，4.54 毫莫耳)與化合物26 (1.09 g, 2.27 毫莫耳) 反應20分鐘。 以水淬熄反應後，利用EtOAc進行純化。以無水MgSO4 乾燥有機層後，濃縮產物。於冰水浴中攪拌溶於MeOH/THF (1/1，體積比，8毫升)之包含上述殘留物及硼氫化鈉(210 毫克，5.2 毫莫耳)的混合物13小時。移除溶劑後，以EtOAc萃取反應混合物，並以鹽水洗滌之。以無水MgSO4 乾燥有機層並濃縮後，利用CC (25% EtOAc於己烷，矽膠)進行純化，以製備白色固體-純27 (391 毫克，0.91 毫莫耳，38%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ 3.41 (dd, 1H,J = 6.2, 10.3 Hz), 3.59 (dd, 1H,J = 7.3, 9.2 Hz), 3.72 (dd, 1H,J = 6.2, 9.2 Hz), 4.02 (m, 2H), 4.19 (d, 1H,J = 7.3 Hz), 4.45 (d, 1H,J = 11.7 Hz), 4.50 (d, 1H,J = 11.7 Hz), 4.60–4.65 (m, 2H), 4.70(d, 1H,J = 11.9 Hz), 4.95 (d, 1H,J = 11.9 Hz), 7.24–7.40 (m, 15H);13C NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ 138.3, 137.9, 137.0, 128.3, 128.1, 128.0, 127.8, 127.6, 127.5, 127.5, 127.4, 127.2, 119.2, 80.2, 76.6, 73.2, 73.1, 72.6, 70.1, 58.5, 48.5. HRMS calcd for [C27 H28 N2 O3 +H]+ 429.2173, found 429.2181.
製備化合物 18. 於氫氣環境中，將含化合物27 (69 毫克，0.16 毫莫耳)及氫氧化鈀 (200 mg)物與甲醇(1毫升)混合並攪拌24小時，使完全溶解。以矽鈣石過濾後，濃縮並以CC (11.1% 水性NH4 OH (37%)於1-丙醇，矽膠)純化過濾產物，以製備淡黃色固體-18 (18.5 毫克，0.11 毫莫耳，71%)。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.45 (dd, 1H,J = 5.8, 13.8 Hz), 3.59 (dd, 1H,J = 6.7, 13.8 Hz), 3.77–3.80 (m, 1H), 3.91 (dd, 1H,J = 8.4, 12.2 Hz), 3.99 (dd, 1H,J = 4.9, 12.2 Hz), 4.06 (q, 1H,J = 6.5 Hz), 4.46 (t, 1H,J = 4.6 Hz), 4.62 (dd, 1H,J = 4.3, 7.0 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 70.3, 69.8, 61.9, 57.7, 56.0, 37.2. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +Na]+ 185.0897, found 185.0901.
製備 19 之流程圖 條件及試劑：[1] Tsou et al.之方法,Tetrahedron 2009, 65, 93; (a) TMSCN, MeOH, 50o C, 7小時, 83%; (b) 1) Raney Ni, Boc2 O, H2 , MeOH, rt, 12小時; 2) conc. HCl, MeOH, reflux, 1小時; 3) Pd(OH)2 , conc. HCl, H2 , MeOH, 三步驟之產率為51%。
製備化合物 S1. 依據與製備化合物25 相似之流程製備化合物S1 ，不同之處在於將甲磺醯化反應(mesylation)置換為碘化反應(iodination)。回流溶於甲苯(15毫升)之包含矽烷殘留物(3.2公克，4 毫莫耳)、三苯膦(triphenylphosphine，3.15公克，12.0 毫莫耳)、咪唑(0.82公克，12.0 毫莫耳)及碘(2.03公克，8.0 毫莫耳)的混合物1小時，過濾反應混合物後，以EtOAc洗滌之。利用鹽水洗滌有機層後，以無水MgSO4 乾燥並濃縮產物。將粗製中間產物溶於甲苯(20毫升)，並加入TBAF (4.8毫升，1 M於THF)。於110o C回流反應30分鐘後，濃縮混合物，並以CC (25% EA於己烷，矽膠)進行純化，據以製備糖漿狀產物-環亞基胺-N-氧化物S1 (0.53公克，1.27 毫莫耳，32%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 )δ 3.62 (dd, 1H,J = 2.4, 10.6 Hz), 4.10–4.11 (m, 1H), 4.14 (dd, 1H,J = 2.5, 10.7 Hz), 4.41 (d, 1H,J = 11.9 Hz), 4.46 (dd, 1H,J = 4.7, 6.0 Hz), 4.55 (dd, 2H,J = 3.5, 11.7 Hz), 4.59–4.70 (m, 4H), 6.93 (s, 1H), 7.22–7.37 (m, 15H);13 C NMR (150 MHz, CDCl3 )δ 137.6, 137.4, 137.2, 133.4, 128.63 (x2), 128.58 (x2), 128.5 (x2), 128.21, 128.16 (x4), 128.1(x2), 127.9, 127.7(x2), 76.4, 75.4, 75.1, 73.5, 72.5, 72.1, 64.8. HRMS calcd for [C26 H27 NO4 +H]+ 418.2013, found 418.2020.
製備化合物 S2. 由S1 依據製備化合物26 之反應來製備化合物S2 (83%)的白色固體。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ 3.31 (q, 1H,J = 4.6 Hz), 3.49–3.54 (m, 2H), 3.83 (t, 1H,J = 5.2 Hz), 4.06–4.11 (m, 2H), 4.44–4.53 (m, 3H), 4.58 (d, 1H,J = 11.8 Hz), 4.63 (d, 1H,J = 11.8 Hz), 4.68 (d, 1H,J = 11.7 Hz), 7.24–7.35 (m, 15H);13 C NMR (150 MHz, CDCl3 ) δ 137.5, 137.4, 136.7, 128.5 (x2), 128.41 (x2), 128.38 (x2), 128.2, 128.1 (x2), 128.0 (x2), 127.9, 127.83, 127.81 (x2), 118.5, 77.3, 75.1, 73.3, 72.7, 72.1, 71.9, 67.9, 61.8. HRMS calcd for [C27 H28 N2 O3 +H]+ 445.2122, found 445.2130.
製備化合物 19. 由S2 作為起始物依據製備化合17 之反應來製備化合物19 (51%)的淡黃色固體。.1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 2.75 (dd, 1H,J = 7.6, 13.1 Hz), 2.93 (dd, 1H,J = 5.1, 13.1 Hz), 3.07–3.11 (m, 2H), 3.59 (dd, 1H,J = 5.8, 11.7 Hz), 3.67 (dd, 1H,J = 4.7, 11.7 Hz), 3.76 (t, 1H,J = 6.2), 3.86 (t, 1H,J = 5.7 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 73.5, 72.0, 63.6, 62.4, 62.3, 43.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +H]+ 163.1077, found 163.1071.
製備化合物 9. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出淡黃色固體化合物-9 (45%).1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.18 (dd, 2H,J = 8.4, 13.3 Hz), 3.31 (dd, 1H,J = 4.8, 13.3 Hz), 3.40–3.43 (m, 1H), 3.73 (dd, 1H,J = 6.1, 11.9 Hz), 3.81 (dd, 1H,J = 3.9, 12.1 Hz), 3.92–3.95 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 78.6, 76.4, 62.1, 60.5, 58.0, 41.3. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +H]+ 163.1077, found 163.1071.
製備化合物 10. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出化合物10 (25%)的淡黃色固體.1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.09 (dd, 1H,J = 6.3, 13.1 Hz), 3.13 (q, 1H,J = 5.5 Hz), 3.24 (dd, 1H,J = 6.0, 13.1 Hz), 3.59 (q, 1H,J = 6.1 Hz), 3.64 (dd, 1H,J = 6.5, 11.6 Hz), 3.74 (dd, 1H,J = 4.5, 11.6 Hz), 3.90 (dd, 1H,J = 3.8, 5.3 Hz), 4.20 (dd, 1H,J = 3.8, 5.8 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 77.9, 76.8, 64.0, 62.2, 55.9, 39.2. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1074.
製備化合物 11. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出化合物11 (43%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.24 (dd, 1H,J = 6.9, 13.8 Hz), 3.35 (dd, 1H,J = 6.6, 13.8 Hz), 3.68 (dd, 1H,J = 8.8, 12.1 Hz), 3.79 (dd, 1H,J = 4.7, 12.1 Hz), 3.80–3.90 (m, 2H), 4.28 (d, 1H,J = 3.6 Hz), 4.32 (d, 1H,J = 3.6 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 75.8 (x2), 61.8, 58.8, 57.3, 38.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1078.
製備化合物 12. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出化合物12 (27%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.24 (dd, 1H,J = 7.6, 13.3 Hz), 3.31 (dd, 1H,J = 5.3, 13.3 Hz), 3.43–3.45 (m, 1H), 3.61 (dd, 1H,J = 5.2, 12.2 Hz), 3.73 (dd, 1H,J = 7.2, 11.5 Hz), 3.83 (dd, 1H,J = 5.3, 11.5 Hz), 4.02 (t, 1H,J = 3.2 Hz), 4.20 (dd, 1H,J = 3.0, 4.9 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 78.8, 75.6, 61.5, 60.8, 59.3, 41.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1069.
製備化合物 13. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出化合物13 (55%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.54 (m, 2H), 3.81 (dd, 1H,J = 4.0, 9.0 Hz), 3.86 (m, 2H), 3.95 (dd, 1H,J = 3.8, 12.6 Hz), 4.22-4.27 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 72.5, 70.2, 65.9, 58.8, 58.4, 38.65. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +H]+ 163.1077, found 163.1078.
製備化合物 14. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出化合物14 (31%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.46 (dd, 1H,J = 6.5, 13.8 Hz), 3.61 (dd, 1H,J = 6.7, 13.8 Hz), 3.69–3.72 (m, 1H), 3.85 (dd, 1H,J = 5.9, 12.7 Hz), 3.97–4.02 (m, 2H), 4.32 (dd, 1H,J = 3.8, 8.7 Hz), 4.43 (t, 1H,J = 3.5 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 71.2, 70.1, 62.4, 57.9, 57.7, 36.1. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1073.
製備化合物 15. 由掌性環亞基胺-N-氧化物作為起始物依據上述步驟製備出化合物15 (47%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.11 (dd, 1H,J =8.5, 13.1 Hz), 3.24 (dd, 1H,J = 4.8, 13.1 Hz), 3.35–3.41 (m, 2H), 3.68 (dd, 1H,J = 7.0, 11.5 Hz), 3.82 (dd, 1H,J = 6.1, 11.5 Hz), 4.03 (dd, 1H,J = 4.0, 8.7 Hz), 4.17 (t, 1H,J = 3.8 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 75.4, 71.5, 60.3, 59.7, 57.7, 42.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +H]+ 163.1077, found 163.1073.
製備化合物 16. 由掌性環亞基胺-N-氧化物依據上述步驟製備出化合物16 (15%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.16 (dd, 1H,J = 5.3, 11.6 Hz), 3.24 (dd, 1H,J = 5.9, 13.5 Hz), 3.44 (d, 1H,J = 5.2 Hz), 3.64-3.69 (m, 2H), 3.82 (dd, 1H,J = 5.3, 11.5 Hz), 4.3 (t, 1H,J = 4.7 Hz), 4.45 (dd, 1H,J = 4.6, 7.2 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 71.4, 70.7, 60.0, 55.0 (□2), 39.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1074.
製備化合物 20. 由掌性環亞基胺-N-氧化物依據上述步驟製備出化合物20 (43%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.46 (dd, 1H,J = 6.5, 13.8 Hz), 3.61 (dd, 1H,J = 6.7, 13.8 Hz), 3.69–3.72 (m, 1H), 3.85 (dd, 1H,J = 5.9, 12.7 Hz), 3.97–4.02 (m, 2H), 4.32 (dd, 1H,J = 3.8, 8.7 Hz), 4.43 (t, 1H,J = 3.5 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 71.2, 70.1, 62.4, 57.9, 57.7, 36.1. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1073.
製備化合物 21·HCl. 由掌性環亞基胺-N-氧化物依據上述步驟製備出化合物21 (36%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.48 (dd, 1H,J = 6.9, 13.8 Hz), 3.57 (dd, 1H,J = 6.6, 13.8 Hz), 3.90 (dd, 1H,J = 8.8, 12.1 Hz), 3.98 (dd, 1H,J = 4.7, 12.1 Hz), 4.03–4.06 (m, 1H), 4.14–4.17 (m, 1H), 4.39 (d, 1H,J = 3.6 Hz), 4.41 (d, 1H,J = 3.6 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 74.6, 74.2, 63.7, 58.2, 57.3, 36.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1078.
製備化合物 22. 由掌性環亞基胺-N-氧化物依據上述步驟製備出化合物22 (27%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.24 (dd, 1H,J = 7.6, 13.3 Hz), 3.31 (dd, 1H,J = 5.3, 13.3 Hz), 3.43–3.45 (m, 1H), 3.61 (dd, 1H,J = 5.2, 12.2 Hz), 3.73 (dd, 1H,J = 7.2, 11.5 Hz), 3.83 (dd, 1H,J = 5.3, 11.5 Hz), 4.02 (t, 1H,J = 3.2 Hz), 4.20 (dd, 1H,J = 3.0, 4.9 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 78.8, 75.6, 61.5, 60.8, 59.3, 41.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O+H]+ 163.1077, found 163.1069.
製備化合物 23. 由掌性環亞基胺-N-氧化物依據上述步驟製備化合物23 (46%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.03 (m, 2H), 3.18 (dd, 1H,J = 4.3, 12.9 Hz), 3.24 (m, 1H), 3.64 (dd, 1H,J = 5.7, 11.4 Hz), 3.71 (dd, 1H,J = 3.4, 11.5 Hz), 3.78-3.83 (m, 2H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 79.2, 77.1, 61.7, 61.1, 57.9, 42.0. HRMS calcd for [C6 H14 N2 O3 +H]+ 163.1077, found 163.1071.
製備化合物 24. 由掌性環亞基胺-N-氧化物依據上述步驟製備化合物24 (37%)的淡黃色固體。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.51 (dd, 1H,J = 6.5, 13.8 Hz), 3.60 (dd, 1H,J = 6.5, 13.8 Hz), 3.67–3.70 (m, 1H), 3.85 (dd, 1H,J = 8.6, 12.1 Hz), 3.97 (dd, 1H,J = 4.8, 12.1 Hz), 4.08–4.11 (m, 1H), 4.13 (s, 1H), 4.36 (s, 1H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 75.7, 74.7, 67.9, 59.3, 58.6, 35.6. HRMS calcd for [C6H14N2O+H]+ 163.1077, found 163.1072.
1.2 合成化合物 28 及 29
依據流程圖2之方法分別製備化合物28 及29 。具體來說，利用氫解反應由流程圖1之環亞基胺-N-氧化物25 來製備化合物28 ，而藉由選擇性醯化反應由化合物17 合成化合物29 。
流程圖2條件及試劑：(a) MeOH, Pd(OH)2 , H2(g) , 79% (b) Ac2 O, MeOH / H2 O, rt, 4小時, 56%.
製備化合物 28. 於氫氣環境中，攪拌混合甲醇(1.5毫升)及化合物25 (81 毫克，0.19 毫莫耳)及氫氧化鈀(30毫克) 24小時，直到完全溶解。以矽鈣石過瀘後，濃縮且以CC (25%水性NH4 OH (37%)於1-丙醇，矽膠)純化過濾產物，據以製備化合物28 的淡黃色固體(20.0 毫克，0.15 毫莫耳，79%)。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.23 (dd, 1H,J = 7.3, 12.1 Hz), 3.55 (dd, 1H,J = 7.3, 12.1 Hz), 3.74–3.77 (m, 2H), 3.91 (dd, 1H,J = 8.6, 12.2 Hz), 4.01 (dd, 1H,J = 4.8, 12.2 Hz), 4.37 (t, 1H,J = 4.2 Hz), 3.86 (td, 1H,J = 4.1, 7.4 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 70.0, 69.8, 62.4, 57.6, 47.0. HRMS calcd for [C5 H11 NO3 +H]+ 134.0812, found 134.0813.
製備化合物 29. 於室溫下攪拌混合H2 O/MeOH溶液(1/3，體積比，400微升)與化合物17 (10.0 毫克，0.06 毫莫耳)及乙酐(acetic anhydride，15.0 微升，0.15 毫莫耳) 4小時，直到完全溶解。以 Dowex 550A (OH- )陰離子交換樹脂中和反應混合物。過濾混合物後，以MeOH (2毫升)洗滌之。濃縮過濾產物，並以CC (12.5%水性NH4 OH (37%)於丙醇，矽膠)純化殘留物，以製備黃色糖漿狀產物-29 (6.9 毫克，0.03 毫莫耳，56%)。1 H NMR (600 MHz, D2 O)δ 2.04 (s, 3H), 3.57 (dd, 1H,J = 8.1, 15.8 Hz), 3.66 (m, 2H), 3.77 (m, 1H), 3.88 (dd, 1H,J = 8.4, 12.0 Hz), 3.97 (dd, 1H,J = 5.2, 12.0 Hz), 4.20 (dd, 1H,J = 3.9, 8.9 Hz), 4.31 (t, 1H,J = 3.5 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O)δ 176.0, 72.7, 69.9, 61.8, 60.4, 57.6, 39.1, 21.6. HRMS calcd for [C8 H16 N2 O4 +H]+ 205.1183, found 205.1184.
1.3 合成化合物 30 到 37 ,, ,,
在本實施例中，依據流程圖3及4之方法來篩選初始化合物庫 5 及化合物庫 6 中的60種化合物；之後依據流程圖5所述之用以合成化合物33 的方法來分別合成5種潛力化合物(即化合物33 到 37 )。
流程圖3條件及試劑：(a) TMSCN, MeOH, 50o C, 10小時, 78%; (b) 1) MsCl, Et3 N, THF, 20分鐘, 2) NaBH4 , MeOH/THF, 13小時, 38%; 3) Pd(OH)2 , conc. HCl, H2 , MeOH, 71%; (c) 1) Raney Ni, Boc2 O, H2 , MeOH, rt, 5小時, 2) conc. HCl, MeOH, 回流, 1小時; 3) Pd(OH)2 , conc. HCl, H2 , MeOH, rt, 10小時, 三步驟之產率為60 %。
流程圖4
化合物17 及18 具有共通的(3R, 4S, 5R )構型(流程圖3)，利用該些化合物來製備二化合物庫，即化合物庫5 及化合物庫6 (流程圖4)，其中是對化合物17 及18 之外–胺甲基團進行具有取代多樣性的平行合成，其係以溶於DMF之HBTU (1.5當量)、HOBt (1.5當量)及DIEA (3當量)活化羧酸後，與隨機由60種酸類挑選之其中一種的取代羧酸形成醯胺鍵結。24小時後，分析反應物可發現胺17 及18 已被完全消耗，且合成顯著含量之特定產物。不需進行其他純化步驟，直接以α-Gal A酵素相關之抑制試驗來評估具有60種化合物之初始化合物庫 5 (源自化合物17 )及化合物庫 6 (源自化合物18 )，評估濃度為20 μM。
初步篩選結果產生5種潛力化合物，其可產生有效的抑制活性(＞60%抑制反應)(結果未顯示)。相較之下，於化合物庫 6 則未發現具有潛力之抑制劑(結果未顯示)。該些發現指出，C2位置的構型會影響抑制功效。為了更進一步確認該些抑制劑，重新合成該5種潛力化合物，即化合物33-37 。流程圖5提供了用以合成化合物33 之例示性流程。
流程圖5試劑及反應：(a) SmI2 , HOAc, THF, 0o C to rt, 1小時, 70%; (b) Boc2 O,DIEA, CH2 Cl2 , 12小時; (c) Raney Ni, H2 , MeOH, 3小時,二步驟為50% (d) 1) RCOOH, EDC,DMAP, CH2 CL2 , 3小時, 2) Pd(OH)2 , H2 , HCl, 8小時,二步驟為50%。
製備 化合物 25. 使2,3,5-三-O -芐基-L-核呋喃糖(2.4公克，5.8 毫莫耳)與溶於甲醇(15毫升)之氫氯酸胲(3.2 公克，46 毫莫耳)及甲氧化鈉(4.3毫升，23 毫莫耳，於甲醇之濃度為5.4 M)共同反應。於室溫攪拌混合物5小時後，蒸發溶劑。利用EtOAc萃取殘留物，並以H2 O洗滌產物，之後以無水MgSO4 進行乾燥，予以濃縮。於室溫攪拌溶於CH2 Cl2 (7.5毫升)之肟殘留物、叔丁基二苯基氯矽烷(TBDPSCl，2.07公克，7.5 毫莫耳)及咪唑(0.6 公克，9.0 毫莫耳) 2小時後，以水(10毫升)淬熄反應。利用鹽水洗滌有機層後，以無水MgSO4 乾燥，並進行濃縮。以溶於CH2 Cl2 (15毫升)之甲磺醯氯(0.67毫升, 8.7 毫莫耳)及三乙胺(1.2毫升, 8.7 毫莫耳)於0o C處理矽烷殘留混合物3小時，再以水(15毫升)淬熄反應混合物。以鹽水洗滌有機層，利用無水MgSO4 乾燥後，進行濃縮。於室溫攪拌溶於乾燥THF (15毫升)之粗製中間產物及TBAF (7.0毫升，1 M於THF) 30分鐘。真空移除溶劑後，於80o C攪拌溶於MeOH/H2 O (4/1，體積比，58毫升)之殘留物、氫氯酸胲(3.13公克，45 毫莫耳)及碳酸氫鈉(3.78 g, 45 毫莫耳) 24小時。真空移除溶劑後，以CC (50% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以製備白色固體-環亞基胺-N-氧化物25 (1.09公克，2.61 毫莫耳，45%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 )δ 4.09 (dd, 1H,J = 3.3, 9.2 Hz), 4.15–4.19 (m, 2H), 4.37 (t, 1H,J = 5.9 Hz), 4.53–4.60 (m, 4H), 4.68 (s, 2H), 4.70 (d, 1H,J = 11.8 Hz), 6.91 (s, 1H), 7.24–7.35 (m, 15H).13C NMR (150 MHz, CDCl 3 )δ 137.7, 137.3, 137.2, 132.7, 128.5, 128.4, 128.3, 128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.6, 127.5, 74.5, 74.0, 73.4, 73.0, 72.4, 66.5. HRMS calcd for [C26 H27 NO4 +Na]+ 440.1832, found 440.1843.
製備 化合物 26. 於50o C攪拌混合無水甲醇(5毫升)、化合物25 (420 毫克，1 毫莫耳)及三甲基矽化腈(320 微升，2.5 毫莫耳)的混合物10小時。真空移除溶劑後，以CC (20% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以製備白色固體-純26 (344 毫克，0.78 毫莫耳，78%)；1 H NMR (600 MHz, CDCl3 )δ 3.57 (dd, 1H,J = 6.8, 12.9 Hz), 3.69 (dd, 1H,J = 6.8, 9.7 Hz), 3.76 (dd, 1H,J = 6.8, 9.7 Hz), 4.25 (t, 1H,J = 5.5, 5.4 Hz), 4.32 (d, 1H,J = 5.7 Hz), 4.33 (t, 1H,J = 5.5, 5.3 Hz), 4.47–4.53 (m, 3H), 4.63 (d, 1H,J = 11.9 Hz), 4.68–4.73 (m, 2H), 7.22–7.35 (m, 15H);13 C NMR (150 MHz, CDCl3 )δ 141.6, 141.5, 140.7, 132.5, 132.3, 132.2, 132.1, 131.9, 131.8, 131.7, 131.6, 120.4, 84.1, 81.2, 81.0, 80.9, 79.8, 72.9, 71.3, 64.3. HRMS calcd for [C27 H28 N2 O4 +Na]+ 467.1941, found 467.1959.
製備 化合物 30. 於室溫攪拌溶於THF(0.1M)之化合物26 (800毫克，1.8毫莫耳)與75毫升之碘化釤(I)，以及HOAc(2.2毫升)共1小時。以矽鈣石板過濾後，移除溶劑，再以EtOAc及Na2 S2 O3( 液體 ) 萃取反應混合物。以MgSO4 乾燥有機層並進行濃縮後，利用CC (25% EtOAc於己烷，矽膠)純化以得到無色油狀產物-純產物(540毫克，0.91毫莫耳，70%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ 3.55-3.58(m, 2H), 3.65(dd, 1H,J = 9.2, 12.2 Hz), 4.07-4.09(m, 2H), 4.26(dd, 1H,J = 4.1, 6.6 Hz), 4.51-4.53(m, 2H), 4.58(d, 1H,J = 11.6 Hz), 4.65-4.68(m, 2H), 4.77(s, 1H, 11.6 Hz), 7.32-7.40(m, 15H).13 C NMR (150 MHz, CDCl3 ) δ 141.8, 141.7, 140.8, 132.5, 132.3, 132.2, 132.0, 131.8, 131.7, 131.7, 131.7, 131.6, 124.4, 87.5, 81.2, 81.0, 80.9, 80.8, 72.7, 62.9, 53.9. HRMS calcd for [C27 H28 N2 O3 + H]+ 429.2173, found 429.2174.
製備 化合物 32. 於室溫攪拌溶於DCM之化合物30 (540毫克，1.26毫莫耳)、Boc2 O (550毫克)及三乙胺(0.17毫升) 24小時。濃縮反應溶液後，以溶於甲醇之雷氏Ni及H2 (g)還原氰化物基團3小時。濃度混合物，並以CC (6% MeOH於DCM，矽膠)進行純化，以得到無色油狀產物-純產物(340毫克，0.63毫莫耳，50%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ 1.43(d, 9H), 2.53(dd, 1H, 8.5,J = 17.9 Hz), 2.87-2.97(m, 1H), 3.59(d, 1H,J = 8.9 Hz),3.74-3.80(m, 1H), 3.93(d, 1H,J = 3.8 Hz), 4.14-4.20(m, 3H), 4.45-4.80(m, 6H), 7.24-7.33(m, 15H).13 C NMR (150 MHz, CDCl3 ) δ 154.3, 138.5, 138.3, 138.2, 128.3, 128.2, 128.0, 127.8, 127.6, 127.5, 127.3, 127.2, 127.1, 79.9, 79.5, 77.7, 73.1, 72.3, 71.9, 70.2, 64.3, 58.3, 42.6, 28.4. HRMS calcd for [C32 H41 N2 O5 + H]+ 533.3010, found 533.3015.
製備 化合物 33. 於室溫攪拌溶於CH2 Cl2 之化合物32 (33.3毫克，0.0625毫莫耳)、EDC●HCl (35.9毫克，0.1875 毫莫耳)、4-二甲胺基吡啶(4-dimethylamnopyridine，7.64毫克，0.0625毫莫耳)及環己戊酸(cyclohexanepentanoic acid，17.27毫克，0.0937毫莫耳) 3小時。以水淬熄反應後，利用CH2 Cl2 萃取產物。藉由無水MgSO4 乾燥有機層。以CC (33% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以得到醯胺中間產物。於50o C回流溶於甲醇之醯胺中間產物及37% HCl。1小時後，加入氫氧化鈀(50毫克)，於室溫、氫氣環境中，持續攪拌反應混合物10小時。以矽鈣石過濾反應混合物並濃縮後，利用CC (4.5% H2 O及28% MeOH於CHCl3 ，矽膠)純化過濾產物，以得到淡黃色油狀產物-33 (9.87 毫克，0.03 毫莫耳，48%產率)。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 1.04-1.24(m,11 H), 1.49-1.63(m, 6H), 2.18(s, 2H), 3.09(s, 1H), 3.22-3.24(m, 2 H), 3.35(d, 1 H,J = 11.6 Hz), 3.52-3.55(m, 1H), 3.70-3.67(m, 1H), 3.82(s, 1H), 4.08(s, 1H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 176.4, 75.2, 71.9, 60.6, 59.9, 59.7, 41.7, 37.4, 37.1, 36.0, 33.2, 26.6, 26.4, 26.3, 25.9. HRMS calcd for [C17 H32 N2 O4 + H]+ 329.2435, found 329.2435.
製備 化合物 34. 於室溫攪拌溶於CH2 Cl2 之化合物32 (53.9毫克，0.1毫莫耳)、EDC●HCl (57.5毫克，0.3毫莫耳)、4-二甲胺基吡啶(12.2毫克，0.1毫莫耳)及3-(3-甲氧苯基)-丙酸 ( 3-(3-methoxyphenyl)-propionic acid，27毫克，0.15毫莫耳) 3小時。以H2 O淬熄反應後，利用CH2 Cl2 進行萃取。藉由無水MgSO4 乾燥有機層並予以濃縮。以CC (33% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以製備醯胺中間產物。於50o C回流溶於甲醇之醯胺中間產物及37% HCl。1小時後，加入氫氧化鈀(50毫克)，於室溫、氫氣環境中，持續攪拌反應混合物10小時。以矽鈣石過濾反應混合物並濃縮後，利用CC (4.5% H2 O及28% MeOH於CHCl3 ，矽膠)進行純化，以製備無色油狀產物-34 (14.52 毫克，0.047 毫莫耳，47.1%產率)。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 263-2.70(m, 2H), 2.96(t, 2H), 3.03(m, 1H), 3.19(s, 1H), 3.32(dd, 1H,J = 6.0, 14.6 Hz), 3.45(dd, 1H,J = 3.3, 14.6 Hz), 3.58(dd, 1H,J = 4.0, 8.7 Hz), 3.64(dd, 1 H,J = 7.1, 11.2 Hz), 3.77(dd,J = 6.0, 11.2 Hz), 3.86(s, 3H), 4.03(t, 1H,J = 3.3 Hz), 6.91-6.95(m, 3H), 7.35(t, 1H,J = 7.5 Hz);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 176.5, 158.9, 142.2, 129.9, 121.4, 121.2, 114.2, 111.9, 73.5, 71.3, 59.9, 59.7, 55.2, 40.0, 36.8, 31.1. HRMS calcd for [C16 H24 N2 O5 + H]+ 325.1763, found 325.1764.
製備 化合物 35. 於室溫攪拌溶於CH2 Cl2 之化合物32 (40.1毫克，0.075毫莫耳)、EDC●HCl (43毫克，0.225 毫莫耳)、4-二甲胺基吡啶(9.16毫克，0.075毫莫耳)及3-(2, 4, 5-三甲氧-苯基)-丙酸 (3-(2, 4, 5-trimethoxy-phenyl)-propionic acid，27毫克，0.1125毫莫耳) 3小時。以H2 O淬熄反應後，利用CH2 Cl2 進行萃取。藉由無水MgSO4 乾燥有機層並予以濃縮。以CC (33% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以得到醯胺中間產物。於50o C回流溶於甲醇之醯胺中間產物及37% HCl。1小時後，加入氫氧化鈀(50毫克)，於室溫、氫氣環境中，持續攪拌反應混合物10小時。以矽鈣石過濾反應混合物並濃縮後，利用CC (4.5% H2 O及28% MeOH於CHCl3 ，矽膠)進行純化，以得到淡黃色固體-35 (15.08 毫克，0.039 毫莫耳，52%產率)。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 2.49-2.54(m, 1H), 2.55-2.60(m, 1H), 2.77-2.83(m, 2H), 3.06(t, 1H,J = 7.6 Hz), 3.22-3.37(m, 2H), 3.47(d, 1H,J = 12.9 Hz), 3.63(dd, 1H,J = 3.5, 8.3 Hz),3.68(dd ,1H ,J = 8.3 Hz, 11.6 Hz),3.74(s, 3H), 3.75(d, 1H,J = 5.7 Hz), 3.77(s, 3H), 3.79(s, 3H), 3.97(t, 1H,J = 3.5 Hz), 6.70(s, 1H), 6.81(s, 1H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 177.6, 151.7, 147.5, 141.9, 120.2, 114.5, 98.8, 72.5, 70.4, 61.2, 60.2, 58.3, 56.7, 56.4, 55.9, 39.0, 35.5, 25.5. HRMS calcd for [C18 H28 N2 O7 + H]+ 385.1975, found 385.1978.
製備 化合物 37. 於室溫攪拌溶於CH2 Cl2 之化合物32 (35毫克，0.0657毫莫耳)、EDC●HCl (37.8毫克，0.197毫莫耳)、4-二甲胺基吡啶(8.03毫克，0.0657毫莫耳)及反式-4-(三氟-甲基)肉桂酸 (trans -4-(trifluoro-methyl)cinnamic acid，21.3毫克，0.131毫莫耳) 3小時。以H2 O淬熄反應後，利用CH2 Cl2 進行萃取。藉由無水MgSO4 乾燥有機層並予以濃縮。以CC (33% EtOAc於己烷，矽膠)純化殘留物，以得到醯胺中間產物。於-78o C 回流溶於CH2 Cl2 之醯胺中間產物及BBr3 (32微升) 2小時。以EtOH淬熄反應混合物並濃縮後，利用CC (4.5% H2 O及28% MeOH於CHCl3 ，矽膠)進行純化，以製備淡黃色固體-37 (15.24 毫克，0.0423 毫莫耳，64.4%產率)。1 H NMR (600 MHz, D2 O) δ 3.44(d, 1H,J = 4.6 Hz), 3.51-3.58(m, 2H), 3.70(dd,J = 1H, 4.6, 13.2 Hz), 3.75(dd, 1H,J = 7.2, 11.3 Hz), 3.88(dd, 1H,J = 6.2, 11.3 Hz), 4.10(dd, 1H,J = 3.9, 8.4 Hz), 4.26(t, 1H,J = 3.4, 3.4 Hz), 6.75(d, 1H,J = 15.8 Hz), 7.58(d, 1H,J = 15.8 Hz), 7.76(s, 4H);13 C NMR (150 MHz, D2 O) δ 169.0, 140.1, 137.9, 128.3, 125.8, 122.1, 74.5, 71.3, 60.3, 59.9, 59.5, 41.2. HRMS calcd for [C16 H19 F3 N2 O4 + H]+ 361.1380, found 361.1370.
1.4 確認化合物 9 到 24
在本實施例中，將分別評估化合物9 to24 (濃度為50 uM)於pH 4.6及7.0 (化學伴護蛋白會在中性pH 7.0時與ER酵素緊密結合，而在酸性pH 4.6時由溶酶體釋放出來)時對α-Gal A的抑制活性。結果闡述於第1圖。
如第1圖之結果所示，在測試的16種化合物(即化合物9到24)中，僅化合物17 及18 於pH 4.6時具有超過60%的抑制活性。該發現指出，化合物17 及18 的(3R,4S,5R )構型於抑制α-Gal A的過程中扮演著重要的角色。同分異構物19 (具有(2R,3R,4S,5S )構型)於pH 4.6時抑制潛力較差，在 pH 7.0時則具有良好的抑制潛力。其他的同分異構物則於活體外對α-Gal A具有不佳或不具抑制活性。此外，進一步分析化合物17 –19 的抑制活性，表2闡述了該些結果。 表2 [a]: 以三重複實驗來測量IC50 的數值。
化合物17 於pH 7.0時之抑制潛力(IC50 = 0.053 µM)約為其於pH 4.6時之抑制潛力(IC50 = 0.67 µM)的13倍。該發現指出，在活體外的模擬條件下，化合物17 具有有利的結合優勢，其於ER (中性pH)可與缺陷型α-Gal A酵素緊密結合，於溶酶體(酸性pH)則具有較差的結合能力。相似地，化合物19 於中性pH之抑制潛力約為其於酸性pH之抑制潛力的19倍。相對地，化合物18 於中性環境(pH 7.0)之抑制潛力僅約為其於酸性環境(pH 4.6)之抑制潛力的3.2倍。化合物1 7 於pH 7.0的潛力約為化合物18 的200倍，且為化合物19 的264倍。值得注意的是，化合物18 的抑制活性較化合物17 的抑制活性差，顯示著C2-胺甲基結構的位向會顯著影響抑制活性。
1.5 確認化合物 33 到 37
接著分別評估化合物33 到37 (濃度為50 uM)於pH 4.6及7.0時對α-Gal A的抑制活性。表3總結了該些結果。
在中性pH時，除了化合物34 ，低微莫耳濃度之化合物33 及35-37 即可對rh-α-Gal A產生活體外抑制功效。此外，所有的化合物於pH 4.6時皆具有較低的抑制潛力。其抑制活性較二種參照化合物-DGJ (IC50 = 0.013 μM)及DIA (IC50 = 0.75 μM)低。 表3 [a]: 以三重複實驗來測量IC50 的數值。 [b]: 參照化合物是用以比對分析。 [c]: 本試驗是以4MU-α-半乳哌喃糖苷作為受質，pH 4.6時之Km=0.3 mM，pH 7.0時之Km=2.4mM。
實施例 2 確認化合物 17 、 33 及 37 的伴護功效
基於實施例1之結果，挑選化合物17 、33 及37 進行後續分析，以了解其作為突變α-Gal A之分子伴護蛋白的功效。具體來說，是對具有特定誤義突變之FD病患細胞株N215S投予化合物17 、33 或37 ，結果闡述於第2圖。
令人訝異地，不同濃度(由0到100 µM)之化合物17 皆可增加突變α-Gal A的活性。相較於對照組之未處理的細胞，對N215S病患淋巴細胞投予化合物17 、33 或37 任一種化合物(100 µM)皆會顯著增加α-Gal A的活性(化合物17 及33 分別增加10及18倍)(第2圖)。此外，化合物17 或33 的伴護功效皆較DGJ或DIA佳。具體來說，在相同濃度(25 µM)時，33 的伴護功效約為DGJ的4倍，且在相同濃度(100 µM)時，33 的伴護功效約為DIA的13倍。
分別探討化合物17 及33 對其他誤義α-Gal A突變體的作用，其包含R112H、S148N、P205T、Q279E、R310Q、R356W及R363C，第3圖總結了該些結果。第3圖之結果指出，除了S148N之外，化合物17 對該些突變皆可產生令人滿意的伴護活性，其中加入化合物17 (濃度為10或100 μM)可增加缺陷型α-Gal A的活性。於化合物33 亦可觀察到相似的結果，即除了S148N之外，化合物33 於COS7細胞可產生令人滿意的伴護活性。
利用一系列的糖苷酶來檢測化合物17 的抑制潛力及選擇性，該些糖苷酶包含α-葡萄糖苷酶、b-葡萄糖苷酶、α-Gal、人類β-Gal、重組人類酸性β-葡萄糖苷酶(rh-GCase)及重組人類酸性α-葡萄糖苷酶(rh-GAA)(結果未顯示)，其中DGJ是作為參照化合物。可發現化合物17 為人類溶酶體α-Gal A的潛力抑制劑，且對人類溶酶體 GCase、rh-GAA及β-Gal (源自經分解之人類淋巴細胞)等其他糖苷酶具有低抑制活性。值得注意的是，正對照組(DGJ)對β-Gal之抑制活性為化合物17 對β-Gal之抑制活性的8倍。推測是因為化合物17 可能對細胞溶酶體 β-Gal活性具有較差的影響力。
至於33 的抑制潛力及選擇性，本實驗分析其對一系列糖苷酶的作用，包含脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus )之α-葡萄糖苷酶、杏仁之b-葡萄糖苷酶、蝸牛之b-甘露糖苷酶、刀豆之α-甘露糖苷酶、咖啡豆之α-Gal、重組人類α-Gal A及人類溶解產物之b-Gal。表4闡述了該些結果。 表4 a: 測試抑制劑的濃度為100 μM； b: 源自脂肪嗜熱芽孢桿菌； c: 源自杏仁； d: 源自蝸牛； e: 源自刀豆； f: 源自咖啡豆； g: 重組人類α-Gal A； h: 源自人類溶解產物。
除了α-Gal (源自重組人類α-Gal-A及咖啡豆)，化合物33 (100 μM)並無法對其他測試的糖苷酶產生抑制功效。
此外，即使濃度高達200 μM，化合物17 及33 仍不會對細胞培養產生毒殺作用(結果未顯示)。
實施例 3 化合物 28 及 29 的伴護功效
依據實施例1.2所述方法製備化合物17 的二種類似物，包含化合物28 及29 ；直接測量其酵素活性及利用熱轉移分析來比對該些類似物與化合物17 對rh-α-Gal的功效。
結果指出，化合物17 、28 及29 於pH 7.0對rh-α-Gal A的抑制活性分別為0.053、9.5及22.1 µM。
熱轉移分析是一種與螢光相關之熱降解試驗，本實驗藉由測量不同條件下酵素的熔化溫度(Tm)來探討化合物17 、28 或29 是否會改善rh-α-Gal A的穩定性。結果分別闡述於表5及第4圖。
rh-α-Gal A於中性pH (7.0)的Tm為51.3o C，在酸性 pH (4.6)的Tm則為54.8o C；該結果指出，rh-α-Gal A於中性pH的環境相當不穩定。當化合物17 溶於中性pH的酵素溶液時，可發現rhα-Gal A的穩定度會隨著其濃度而改變，其中加入1、10及100 µM之化合物17 會分別使rh-α-Gal A的Tm呈現51.3o C→53.5o C→60.8o C→65.2o C的轉移。相較之下，化合物28 及化合物29 則對rhα-Gal A的穩定度不具濃度相關之影響。 表5.　 化合物17 、 28 或29 對rhα-Gal A熔化溫度的作用
有趣的是，於熱轉移分析觀察到之該些類似物(即化合物28 及29 )的穩定功效趨勢與其抑制活性的趨勢相似。
實施例 4 共同投予化合物 17 及 α -Gal A 會產生加乘性的功效
在本實施例中，將探討對FD病患合併投予化學伴護蛋白化合物17 及rh-α-Gal A作為酵素取代治療的功效。簡單來說，對源自法布瑞氏症病患的細胞株N215S 投予rh-α-Gal A (1n M)及不同濃度的化合物17 (0、1、10及50 μM)，接著決定α-Gal A的活性。結果闡述於第5圖。
結果指出，化合物17 本身可作為化學伴護蛋白，藉以增加細胞內溶酶體-α-Gal A的活性，其中相較於對照組，投予50 μM之化合物17可增加2倍之細胞內溶酶體-α-Gal A的活性(第5圖之圖B)。最重要的是，當共同投予化合物17 (50 μM)及rh-α-Gal A (1 nM)時，可顯著增加α-Gal A整體的活性(約增加9倍)(第5圖之圖A)。相較於單獨投予rh-α-Gal A或17 ，化合物17 (化學伴護蛋白治療)及rh-α-Gal A (ERT)可於法布瑞氏症細胞株N215S產生顯著的加乘功效。
整體來說，本發明式(I)化合物(特別是化合物17 )不僅為一種α-Gal A抑制劑，亦可作為一種化學伴護蛋白，藉以增加具有突變α-Gal A 之FD病患的細胞內酵素活性。此外，化合物17 可與α-Gal A共同投予至個體體內，以對細胞內的α-Gal A活性產生加乘性功效。
實施例 5 化合物 33 的伴護功效
在本實施例中，將探討化合物33 對N215S淋巴細胞之伴護功效的耐久性。將0-50 μM之測試化合物加入N215S淋巴細胞的細胞培養液中，培養4天後，更換新鮮的細胞培養液。在移除測試化合物後，持續培養細胞0、2或4天。在以PBS洗滌2次後，以4-MU-α-Gal作為受質來決定細胞均質產物的酵素活性。第6圖闡述該些結果。
如第6圖所示，活性曲線會隨著時間些微移動。在追蹤期間(由0到4天)，所有的脈衝濃度皆會顯著地增加酵素活性；該結果指出，在投予33 後，合成的酵素可穩定存在於細胞中至少4天。以相同條件投予藥物伴護蛋白DGJ時，可發現在移除DGJ後，N215S淋巴細胞中的酵素活性仍會增加，唯該增加的酵素活性會於第4天時急劇下降。
總結上述，化合物33 可作為一種新穎之藥物伴護蛋白，用以處理N215S法布瑞氏症病患淋巴細胞及 COS7細胞中其他人類α-Gal A突變。即使對rh α-Gal A的抑制活性不如DGJ或DIA，其卻可對N215S法布瑞氏症病患之淋巴細胞及COS7細胞中其他人類α-Gal A突變產生令人滿意的伴護功效。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第 1 圖 為依據本揭示內容一實施方式所闡述之柱狀圖，其係關於化合物9 到24 於pH 4.6或pH 7.0時，對α-Gal A的抑制功效；第 2 圖 為依據本揭示內容一實施方式所闡述之線性圖，其係關於(a)化合物17 及(b)化合物33 或37 對人類淋巴細胞株N215S的伴護功效；第 3 圖 為依據本揭示內容一實施方式所闡述之柱狀圖，其係關於(a)化合物17 及(b)化合物33 對rh-α-Gal A突變體的伴護功效；第 4 圖 為依據本揭示內容一實施方式所闡述之線性圖，其係關於化合物17 對 rhα-Gal A熔化溫度的作用；第 5 圖 為依據本揭示內容一實施方式所闡述之柱狀圖，其係關於對法布瑞氏症病患細胞株N125S (a)合併投予化合物17 及α-Gal A，或(b)單獨投予化合物17 所產生的功效；以及第 6 圖 為依據本揭示內容一實施方式所闡述之線性圖，其係關於(a)化合物33 及(b) DGJ對N125S之伴護作用的耐久性。
序列表<110> 中央研究院<120> 治療法布瑞氏症<130> P2897-TW<150> PCT/US NO. 62/354,139<151> 2016-06-24<160> 8<170> BiSSAP 1.3<210> 1<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> 正向引子<400> 1aggtcggatc cgacaatgca gctgaggaac c 31<210> 2<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> 反向引子<400> 2ggtggaattc ttaaagtaag tcttttaatg acatctgca 39<210> 3<211> 38<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> N215S-F_引子<400> 3ggccctttca aaagcccagt tatacagaaa tccgacag 38<210> 4<211> 38<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> N215S-R_引子<400> 4ctgtcggatt tctgtataac tgggcttttg aaagggcc 38<210> 5<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> Q279E-F_引子<400> 5tttggcctca gctggaatga gcaagtaact cagatggcc 39<210> 6<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> Q279E-R_引子<400> 6ggccatctga gttacttgct cattccagct gaggccaaa 39<210> 7<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> R301Q-F_引子<400> 7ttcatgtcta atgacctcca acacatcagc cctcaagcc 39<210> 8<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220> <223> R301Q-R_引子<400> 8ggcttgaggg ctgatgtgtt ggaggtcatt agacatgaa 39

Claims (11)

  1. 一種式(I)化合物、其鹽類、酯類或溶劑合物之用途，其係用以製備一藥物以治療法布瑞氏症，其中該式(I)化合物是選自由、、、、及所組成的群組。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該式(I)化合物可抑制α-GAL A的活性。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該式(I)化合物為一人類溶酶體α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,α-Gal A)突變體的伴護蛋白。
  4. 如請求項3所述之用途，其中該人類α-Gal A突變體包含一突變，其係選自由R112H、P205T、Q279E、R301Q、R356W及R363C所組成的群組。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該式(I)化合物是
  6. 如請求項4所述之用途，其中該式(I)化合物是
  7. 如請求項4所述之用途，其中該式(I)化合物是
  8. 如請求項4所述之用途，其中該藥物是以每天0.001-500公克之劑量投予至該個體體內。
  9. 如請求項8所述之用途，其中該藥物更包含一人類α-Gal A。
  10. 一種具有式(I-1)之結構的化合物，其中該式(I-1)化合物是選自由、及所組成的群組。
  11. 如請求項10所述之化合物，其中式(I-1)化合物是
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