TWI634893B - Scalp maintenance composition - Google Patents

Abstract

一種頭皮養護組成物包含一胺基酸組分，及一由一提純流程所製得的墨旱蓮組分。該提純流程包括以下步驟：將墨旱蓮與一萃取劑混合後進行萃取，其中該萃取劑是由水、醇類及酸類所組成。該頭皮養護組成物透過使用墨旱蓮組分及胺基酸組分，有助於人類頭皮細胞存活，進而達到防止掉髮、促進頭髮生長的效果。

Description

頭皮養護組成物

本發明是有關於一種頭皮養護組成物，特別是指一種包含墨旱蓮組分及胺基酸組分的頭皮養護組成物。

墨旱蓮萃取物已知可作為染髮劑使頭髮烏黑，其原理是萃取出墨旱蓮中的植物色素並利用墨旱蓮的植物色素成分使白髮染黑，此種應用屬於單純的頭髮染色，有鑑於此，本案申請人即再開發出能從根本養護頭皮的養護液。

因此，本發明之目的，即在提供一種頭皮養護組成物。

於是，本發明頭皮養護組成物，包含：一墨旱蓮組分，是由一提純流程所製得，該提純流程包括以下步驟：將墨旱蓮與一萃取劑混合後進行萃取，其中該萃取劑是由水、醇類及酸類所組成，其中，該醇類是選自於甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、異丙醇、丙二醇、正丁醇、異丁醇、第三丁醇、丁二醇、戊醇、己醇、醇醚類或上述的一組合，該酸類是選自於具有至少一羧酸基的化合物、具有一羧酸基及一胺基的化合物、 具有至少一羧酸基及至少一羥基的化合物或上述化合物的組合，且該具有至少一羧酸基的化合物是選自於甲酸、乙酸、丙酸或上述的一組合，該具有至少一羧酸基及至少一羥基的化合物是選自於蘋果酸、檸檬酸、乳酸或上述的一組合；及一胺基酸組分。

本發明之功效在於：該頭皮養護組成物透過使用墨旱蓮組分及胺基酸組分，有助於人類頭皮細胞存活，進而達到防止掉髮、促進頭髮生長的效果。

以下將就本發明內容進行詳細說明：[基質]

該胺基酸組分及墨旱蓮組分是置於在該基質中。該基質例如但不限於水。

[胺基酸組分]

該胺基酸組分能輔助人類頭皮細胞生長及存活。較佳地，該胺基酸組份是選自於麩胺酸、L-丙胺酸、L-鹽酸精胺酸、L-天冬醯胺、L-天門冬胺酸、L-鹽酸胱胺酸、L-谷胺酸、L-谷氨醯胺、甘胺酸、L-鹽酸組胺酸、L-異亮胺酸、L-亮胺酸、L-鹽酸賴胺酸、L-蛋胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺 酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-甲硫胺酸，或上述胺基酸的組合。

較佳地，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該胺基酸組分的含量範圍為0.01至5重量%。更佳地，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該胺基酸組分的含量範圍為0.1至5重量%。

[墨旱蓮組分]

該墨旱蓮組分是將一墨旱蓮(學名： Eclipta prostrate )經由該提純流程所製得。該提純流程詳述如下。

較佳地，該墨旱蓮是選自於新鮮的或乾燥的墨旱蓮。其中，該乾燥的墨旱蓮是由新鮮的墨旱蓮經乾燥所製得。較佳地，該墨旱蓮的萃取部位是選自於根、莖、葉、花、種子或上述的一組合。

該萃取劑是由水、醇類及酸類所組成。

較佳地，該酸類是選自於有機酸、無機酸或上述兩者的組合；更佳地，該酸類是選自於有機酸。該無機酸例如但不限於塩酸、硫酸、磷酸。較佳地，該有機酸是選自於具有至少一羧酸基的化合物、具有一羧酸基及一胺基的化合物、具有至少一羧酸基及至少一羥基的化合物，或上述化合物的組合；更佳地，該有機酸是 選自於具有至少一羧酸基的化合物、具有一羧酸基及一胺基的化合物，或上述化合物的組合。其中，該具有至少一羧酸基的化合物例如但不限於甲酸、乙酸、丙酸；該具有至少一羧酸基及至少一羥基的化合物例如但不限於蘋果酸、檸檬酸及乳酸；該具有一羧酸基及一胺基的化合物例如但不限於麩胺酸、L-丙胺酸、L-鹽酸精胺酸、L-天冬醯胺、L-天門冬胺酸、L-鹽酸胱胺酸、L-谷胺酸、L-谷氨醯胺、甘胺酸、L-鹽酸組胺酸、L-異亮胺酸、L-亮胺酸、L-鹽酸賴胺酸、L-蛋胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-甲硫胺酸。

該醇類例如但不限於甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、異丙醇、丙二醇、正丁醇、異丁醇、第三丁醇、丁二醇、戊醇、己醇、醚醇類，該醚醇類例如但不限於：甲氧基乙醇(MCS)、乙氧基乙醇(ECS)、丙氧基乙醇(PCS)、丁氧基乙醇(BCS)、苯氧基乙醇。

較佳地，該萃取劑的pH值範圍為4以上。

該萃取的方式例如但不限於浸泡、熬煮、蒸氣萃取、蒸餾萃取、超臨界流體萃取、超音波萃取、微波萃取。

較佳地，該提純流程還包括一將該萃取得到的萃取物進行濃縮的步驟。該濃縮的具體方式例如但不限於減壓濃縮或冷凍乾燥。

更佳地，該提純流程還包括一將該濃縮後得到的粗產物進行管柱層析的步驟。較佳地，該管柱層析所使用的樹脂是選自於大孔樹脂。該大孔樹脂的具體商品例如但不限於：X-5、D-101、HPD-100、D1300、D3520、AB-8、DM130、DS-8、DM-301、ADS-17、S-8、NKA-9、DA-201。

較佳地，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該墨旱蓮組分的含量範圍為0.0002至5重量%。更佳地，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該墨旱蓮組分的含量範圍為0.001至5重量%。

[促滲劑]

較佳地，該頭皮養護組成物還包含一促滲劑，該促滲劑能有助於該頭皮養護組成物滲透至頭皮細胞中。該促滲劑例如但不限於：1、月桂氮酮(azone)及其類似物；2、有機酸及其酯類化合物，例如：油酸、亞油酸、N,N-二甲氨基乙酸十二烷酯(DDAA)；3、鹼類化合物，例如：尿素；4、吡咯烷酮類(pyrrolidinone)衍生物；5、溶劑類，例如：乙醇、丙二醇、二甲基亞碸(DMSO)；6、磷脂類，例如：卵磷脂；7、天然產物中的促透劑，例如：薄荷醇、薄荷腦、樟腦、冰片、桉油、松節油等。

較佳地，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該促滲劑的含量範圍為0.01至5重量%。

較佳地，該頭皮養護組成物的pH值範圍為5至8。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：〔圖1〕是本發明的製備例1的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞存活分析結果的一數據圖；〔圖2〕是本發明的製備例2的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞存活分析結果的一數據圖；〔圖3〕是本發明的製備例3的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞存活分析結果的一數據圖；〔圖4〕是本發明的製備例4的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞存活分析結果的一數據圖；〔圖5〕是本發明的製備例1的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞週期分析結果的一數據圖；〔圖6〕是本發明的製備例2的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞週期分析結果的一數據圖； 〔圖7〕是本發明的製備例3的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞週期分析結果的一數據圖；〔圖8〕是本發明的製備例4的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞週期分析結果的一數據圖；〔圖9〕是本發明的製備例1的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞凋亡分析結果的一數據圖；〔圖10〕是本發明的製備例2的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞凋亡分析結果的一數據圖；〔圖11〕是本發明的製備例3的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞凋亡分析結果的一數據圖；及〔圖12〕是本發明的製備例4的CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞凋亡分析結果的一數據圖。

本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。

[製備例1]墨旱蓮組分的製備方式

將乾燥墨旱蓮[由新鮮的墨旱蓮(含有根、莖、葉、花及種子)經乾燥所製得]以粉碎機攪碎得到墨旱蓮粉末。將75克的該墨 旱蓮粉末溶於750克的萃取劑(含有650克的濃度為95%的酒精，以及100克的醋酸)中，使用超音波萃取方式萃取30分鐘後過濾掉固態殘渣，得到一萃取物。將該萃取物經由減壓濃縮後，得到一粗產物，再將該粗產物經管柱層析，得到一墨旱蓮組分。其中，管柱層析的操作條件詳述如下：管柱內徑為4公分，填充物為大孔樹脂DM301，填充高度為20公分，沖提分為兩階段，第一階段的沖提溶劑為乙酸乙酯，第二階段的沖提溶劑為酒精，第一階段及第二階段的溶劑流速皆為4毫升/分鐘。

[製備例2]墨旱蓮組分的製備方式

以與製備例1的相同流程製作製備例2墨旱蓮組分，差別在於使用不同的萃取劑：含有650克的濃度為95%的酒精、100克醋酸，及15克的麩胺酸。

[製備例3]墨旱蓮組分的製備方式

將乾燥墨旱蓮[由新鮮墨旱蓮(含有根、莖、葉、花及種子)經乾燥所製得]以粉碎機攪碎得到墨旱蓮粉末。將75克的該墨旱蓮粉末溶於750克的萃取劑(含有650克的濃度為95%的酒精，及100克的醋酸)中，使用超音波萃取方式萃取30分鐘後過濾掉固態殘渣，得到一萃取物。將該萃取物經由減壓濃縮後，得到一墨旱蓮組分。

[製備例4]墨旱蓮組分的製備方式

以與製備例3的相同流程製作製備例4墨旱蓮組分，差別在於使用不同的萃取劑：含有650克的濃度為95%的酒精、及100克醋酸及15克的麩胺酸。

製備例1至4墨旱蓮組分的製備方式整理如以下表1所示。

[性質檢測]

將製備例1至4的墨旱蓮組分進行以下所述的細胞存活率分析、細胞週期分析及細胞凋亡分析，其中，因人類纖維母細胞類似人類的頭皮細胞，故以下所述的各項試驗中使用人類纖維母細胞。各項試驗的結果如圖1至圖12所示。

1. 細胞存活率分析(MTT assay)

先在一96孔培養盤的各個孔中分別種入5×10³個CCD-966SK人類纖維母細胞，再將製備例1至4的墨旱蓮組分分別以不同濃度加至對應的孔中，其中，墨旱蓮組分的添加濃度為0mg/mL者做為控制組(control)，培養24、48、72小時後，加入0.5mg/mL的MTT試劑{[3-(4,5-二甲基-2-噻唑-2,5-二苯基-2H-溴代四唑)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide]}至該培養盤中，接著將該培養盤置於37℃及5% CO₂的培養箱中培養4小時後，去除上清液後再加入50μl的二甲基亞碸(DMSO)，得到數個細胞懸浮液。以盤式全光譜酵素免疫分析儀(Microplate Spectrophotometer，設備型號為BioTek PowerWave XS)在可見光540nm下測定該等細胞懸浮液的吸光值，以分析墨旱蓮組分對CCD-966SK人類纖維母細胞生長情形。結果如圖1至圖4所示。

2. 細胞週期分析(PI單染色法)

在單染細胞週期分析的數據圖中，「G0」表示凋亡(正常死亡)細胞(apoptotic cell)，「G1」表示細胞生長，「S」表示DNA複製，「G2」表示準備分裂，「M」表示有絲分裂。分布在「G0」的細胞數量越少，代表存活細胞的數量越多。

在數個6公分培養盤中分別種入3×10⁵個CCD-966SK人類纖維母細胞，再將製備例1至4的墨旱蓮組分分別以不同濃度加至對應的培養盤中，其中，墨旱蓮組分的添加濃度為0mg/mL者做為控制組(control)，待24小時後，取出細胞並使用冷藏儲存至少8小時的濃度為70%的冰酒精破膜固定打洞，再加入1mL的DNA染色液[其配製方法為：將0.02mL的濃度為1mg/mL的碘化丙啶(Propidium Iodide，購自BD Biosciences，USA)、0.02mL的 濃度為5%的曲拉通X-100(Triton X-100，購自Sigma，USA)，以及0.01mL的濃度為2mg/mL的核糖核酸酶A(RNase A，購自Sigma，USA)及0.95mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，PBS，購自Sigma，USA)混合，最終體積為1mL]，在25℃且避光的環境下反應30分鐘後，得到數個細胞懸浮液。將該等細胞懸浮液分別使用流式細胞儀(廠商型號為：BD Biosciences的FASCS Calibur)分析偵測1×10⁴個細胞，並以WinMDI 2.9軟體統計分析，以分析墨旱蓮組分對CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞週期的影響。結果如圖5至圖8所示。

3. 細胞凋亡分析(Annexi nV/PI雙染色法)

在正常形態下，細胞膜的磷脂絲氨基酸(phosphotidylserine，PS)只會存在於細胞膜內膜，當細胞發生凋亡時磷脂絲氨基酸才會反轉至膜外。在雙染細胞凋亡分析的數據圖中，「normal」表示存活細胞，「necrosis」表示壞死細胞，「early apoptosis」表示早期凋亡細胞，「late apoptosis」表示晚期凋亡細胞。分布在「normal」的細胞數量越多代表存活細胞的數量越多。

在數個6公分培養盤中分別種入3×10⁵個CCD-966SK人類纖維母細胞，再將製備例1至4的墨旱蓮組分分別以不同濃度加 至對應的培養盤中，其中，墨旱蓮組分的添加濃度為0mg/mL者做為控制組(control)。4小時後，取出細胞並先加入0.4mL的一倍的膜聯蛋白結合緩衝液(Annexin V Binding Buffer，購自BD Biosciences，USA)，再加入0.05mL的膜聯蛋白-異硫氰酸螢光素[Annexin V-FITC(Fluorescein isothiocyanate)，購自BD Biosciences，USA]以及0.05mL的碘化丙啶染色溶液(Propidium Iodide Staining Solution，購自BD Biosciences，USA)，在25℃且避光的環境下反應15分鐘後，得到數個細胞懸浮液。將該等細胞懸浮液分別使用流式細胞儀分析偵測1×10⁴個細胞，並以WinMDI 2.9軟體統計分析，以分析墨旱蓮組分對CCD-966SK人類纖維母細胞的細胞凋亡的影響。結果如圖9至圖12所示。

[細胞培養]

在上述性質檢測中使用的CCD-966SK人類纖維母細胞的來源及培養條件詳述如下：

1. CCD-966SK人類纖維母細胞的來源：BCRC編號為60153，ATCC編號為CRL-1881，購買自食品工業發展所的生物資源保存及研究中心，顯微型態呈梭狀排列，屬於貼附型細胞(Adherent-type cell)，培養在37℃含5% CO₂的細胞培養箱。

2. 冷凍細胞活化：解凍細胞以快速為原則以避免產生冰晶而導致細胞的死亡。先將購入的細胞從液態氮桶取出後，馬上使用37℃水浴槽快速回溫，等待溶解。溶解後，加入培養基並均勻混合以稀釋DMSO濃度，並使用離心機以轉速1280rpm在25℃下離心5分鐘，以移去含有抗凍劑的上清液後，再加入2mL的新鮮培養基。接著，取新鮮培養基置於細胞培養盒，再將細胞種於細胞培養盒裡並且每日更換新的培養基，培養一週後，待解凍的細胞恢復正常活性後才能開始性質檢測的實驗。

活化CCD-966SK人類纖維母細胞所使用的培養基的配置方法為：在一量瓶中，將1袋(含9.5克)的MEM培養基(minimum essential medium)粉末(廠商型號為：GIBCO-USA)溶於200mL的Milli-Q水(為使用Milli-Q-Biocel超純水系統處理得到的超純水)中，再以少量Milli-Q水沖淨袋內殘留粉末後，沿杯壁將附著於杯壁邊緣的MEM培養基粉末沖下，補Milli-Q水至總體積為900mL，再加入2.2g/L的碳酸氫鈉(NaHCO₃)，接著以磁石攪拌使其混合均勻，並以濃度為1N的HCl調整pH值為7.2至7.4，最後在無菌操作台裡以0.22μm瓶過濾器(Bottle Filter)的無菌過濾膜過濾，並分裝至已標示 滅菌的血清玻璃瓶中，配製成每瓶為450mL，置於4℃的冰箱中備用。使用前要先於37℃恆溫水浴槽回溫，加入1%非必需胺基酸(0.1mM non-essential amino acids，NEAA)、1%丙酮酸鈉(1mM sodium pyruvate)、1%的二合一抗生素(penicillin/streptomycin，P/S)、1%左旋-麩醯胺酸(2mM L-Glutamine)及10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，即得到CCD-966SK人類纖維母細胞所使用的培養基。

3. 細胞繼代培養：當細胞培養盒中的細胞生長達八至九分滿時即可進行繼代培養。首先移去培養基，再以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞後移去PBS，再加入胰酶-EDTA溶液(Trypsin-EDTA)作用約5分鐘，接著輕拍燒瓶使細胞自培養皿脫落分散呈圓形，再將細胞轉移至新的燒瓶中並加入新鮮培養基均勻混合即可繼續培養。繼代培養後的細胞即可進行上述的各項性質檢測。

由圖1至圖12的結果可知，製備例1至4有助於人類纖維母細胞存活，並因人類纖維母細胞類似人類頭皮細胞，故可證明製備例1至4有助於人類頭皮細胞存活。

綜上所述，本發明頭皮養護組成物透過使用墨旱蓮組分及胺基酸組分，有助於人類頭皮細胞存活，進而達到防止掉髮、促進頭髮生長的效果，故確實能達成本發明之目的。

惟以上所述者，僅為本發明之實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，凡是依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

Claims (13)

1. 一種頭皮養護組成物，包含：一墨旱蓮組分，是由一提純流程所製得，該提純流程包括以下步驟：將墨旱蓮與一萃取劑混合後進行萃取，其中該萃取劑是由水、醇類及酸類所組成，其中，該醇類是選自於甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、異丙醇、丙二醇、正丁醇、異丁醇、第三丁醇、丁二醇、戊醇、己醇、醇醚類或上述的一組合，該酸類是選自於具有至少一羧酸基的化合物、具有一羧酸基及一胺基的化合物、具有至少一羧酸基及至少一羥基的化合物或上述化合物的組合，且該具有至少一羧酸基的化合物是選自於甲酸、乙酸、丙酸或上述的一組合，該具有至少一羧酸基及至少一羥基的化合物是選自於蘋果酸、檸檬酸、乳酸或上述的一組合；及一胺基酸組分。
2. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，該墨旱蓮是選自於新鮮的或乾燥的墨旱蓮。
3. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，該墨旱蓮的萃取部位是選自於根、莖、葉、花、種子或上述的一組合。
4. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，該提純流程還包括一將該萃取得到的萃取物進行濃縮的步驟。
5. 如請求項4所述的頭皮養護組成物，其中，該提純流程還包括一將該濃縮後得到的粗產物進行管柱層析的步驟。
6. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，還包含一促滲劑。
7. 如請求項6所述的頭皮養護組成物，其中，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該促滲劑的含量範圍為0.01至5重量%。
8. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該胺基酸組分的含量範圍為0.01至5重量%。
9. 如請求項8所述的頭皮養護組成物，其中，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該胺基酸組分的含量範圍為0.1至5重量%。
10. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該墨旱蓮組分的含量範圍為0.0002至5重量%。
11. 如請求項10所述的頭皮養護組成物，其中，以該頭皮養護組成物的總量為100重量%，該墨旱蓮組分的含量範圍為0.001至5重量%。
12. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，該萃取劑的pH值範圍為4以上。
13. 如請求項1所述的頭皮養護組成物，其中，該頭皮養護組成物的pH值範圍為5至8。