CN109007462A - 一种用于培养果蝇的组合物的制备方法 - Google Patents

一种用于培养果蝇的组合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于培养果蝇的组合物的制备方法，制备步骤为：将蔗糖、琼脂、玉米粉加水煮沸，得到第一混合物；将丙酸加入第一混合物，得到第二混合物；将酵母粉加入第二混合物，得到培养果蝇用基础培养基；将香椿子果瓣和/或香椿子中轴粉加入到培养果蝇用基础培养基，制备成用于培养果蝇的组合物。通过上述方法制备的组合物能够提高果蝇繁殖力，缩短果蝇产卵前期，延长果蝇幼虫期，缩短果蝇蛹期。

Description

一种用于培养果蝇的组合物的制备方法
技术领域
本发明属于生命科学领域，涉及一种用于培养果蝇的组合物的制备方法。
背景技术
香椿子，又名香椿果、椿芽树花、香椿铃、椿树子等，系楝科(Meliaceae)椿属(Toona)落叶乔木香椿Toona sinensis(A.Juss.)Roem.的干燥果实[1]，于秋季采收，晒干。据《唐本草》、《中药大辞典》、《四川中药志》等记载，香椿子性温，味辛，苦，无毒，具有祛风、散寒、止血止痛之功效。香椿各部分均可入药，通过药理研究表明，香椿具有抗氧化、抗血栓、抗炎、抑菌、降血糖及抑制癌细胞增殖等生物活性[2-6]。香椿子富含多种药理活性物质，如黄酮、蛋白质、多糖、酚类、生物碱、挥发油等活性成分[7-11]，而基于香椿子的多种活性物质，国内外学者对其化学成分的分离提取、鉴定进行了大量研究，但对于其药理作用的研究报道较少。
黑腹果蝇Drosophila melanogaster是一种真核多细胞生物，属双翅目昆虫，具有完全变态。相较于其他的模式生物而言，果蝇具有体积小、易饲养、生长迅速、繁育周期短、子代数量多等优势，以及与哺乳动物基本相似的生长发育、代谢系统、生理功能，是遗传发育研究的最为理想的模式生物[12，13]。
未见到香椿子或其提取物对果蝇生理性能影响的报道。
参考文献：
[1]China's state administration of traditional ahinese medicine,thechinese herbal materia medica editorial board.The chinese herbal materiamedica[M].Fifth,Shanghai:Science andTechnologyPress,1999.
[2]Hseu YC,Chang WH,Chen CS,et al.Antioxidant activities of Toonasinensis leaves extracts using different antioxidant models[J].Food andChemical Toxicology,2008,46(1):105-114.
[3]Wang CC,Tsai YJ,Hsieh YC,et al.The aqueous extract from Toonasinensis leaves inhibits microglia-mediated neuroinflammation[J].Kaohsiung JMed Sci,2014,30:73-81.
[4]HSIEHA T J,TSAIB Y H,LIAOA M C,et al.Anti-diabetic properties ofnon-polar Toona sinensis Roem extract prepared by supercriticalCO2fluid[J].Food and Chemical Toxicology,2012,50(3/4):779-789.
[5]Lin QX,Li M,Zhou RM,et al.Chemical composition and anti-bacterialactivity of essential oil from Cedrela sinensis(A.Juss.)Roem.seed[J].AfricanJournal of Biotechnology,2012,11(7):1789-1795.
[6]Huang PJ,Hseu YC,Lee MS,et al.In vitro and in vivo activity ofgallic acid and Toona sinensis leaf extracts against HL-60human premyelocyticleukemia[J].Food Chem Toxicol,2012,50(10):3489–3497.
[7]Hou LL,Li SL,Yan YP,et al.Ding SH,Liu B,Zhao SW,et al.Anti-complement constituents from fruits of Toona sinesis[J].Chinese Journal ofExperimental Traditional Medical Formulae,2017,23(21):91-94.
[8]Wang RS,Meng C,Zhang SJ,et al.Rapid purification of antioxidantproteins from Toona sinensis seeds using affinity chromatography[J].Nat ProdRes Dev,2017,29:96-100，86.
[9]Yan Y,Min Y,Min H,et al.n-Butanol soluble fraction of the waterextract of Chinese toon fruit ameliorated focal brain ischemic insult in ratsvia inhibition of oxidative stress and inflammation[J].J Ethnopharmaco,2014,151:176-182.
[10]Huang XY,Li SL,Dang CZ,et al.Study on antioxidative activity andingredient of extract from Toona Sinensis fruit[J].Seed,2011,30(7):79-82.
[11]Liu ZL,Ma TB,Sun LM,et al.Analysis of the essential oil from theseeds of Toona sinensis by GC-MS[J].Chin Pharm J,2002,37(2):94-96.
[12]Beller M,Oliver B.One hundred years of high-throughput Drosophilaresearch[J].Chromosome Res,2006,14(4):349-362
[13]Chien S,Reiter L T,Bier E,et al.Homophila:human disease genecognates in Drosophila[J].Nucleic Acids Res,2002,30(1):149-151.
发明内容
为了研究香椿子果瓣和中轴的药理作用，本研究在黑腹果蝇培养基中添加不同浓度的香椿子果瓣和中轴粉末，研究其对果蝇子代发育各时期历时、数量、性比等指标进行检测，研究比较了香椿子不同部位对黑腹果蝇发育和繁殖的影响差异，以期为更好地开发和利用香椿子资源提供实验依据。
本试验旨在研究香椿子果瓣和中轴对黑腹果蝇各阶段发育历期和繁殖能力的影响。试验以黑腹果蝇为对象，用添加不同浓度香椿子果瓣和中轴的培养基(2.5g/L、10g/L、25g/L)培养果蝇，统计果蝇的产卵前期、卵期、幼虫期、蛹期以及繁殖后代的能力。结果显示，随着浓度的升高，香椿子果瓣和中轴对子代果蝇产卵前期、卵期的影响不同，香椿子果瓣使子代果蝇产卵前期缩短，中轴是先延长后缩短，对于子代果蝇卵期的影响，只有2.5g/L浓度的香椿子果瓣与对照相比差异显著(p﹤0.05)外，其余均差异不显著，但均能延长幼虫期，缩短蛹期；香椿子果瓣和中轴均能增加子代♀、♂果蝇数量，提高其增殖率，且♂果蝇增殖率显著高于♀果蝇以及相同浓度条件下中轴培养基的♀、♂果蝇增殖率均显著高于果瓣。这表明，香椿子果瓣和中轴可改变果蝇发育历期并具有提高果蝇繁殖力的作用。
较为具体地，本申请提供了一种组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将香椿子与培养果蝇用基础培养基混合，得到所述组合物。
在一些实施方式中，所述香椿子在所述培养果蝇用基础培养基中的浓度为1-100g/L，
优选所述香椿子在所述培养果蝇用基础培养基中的浓度为2.5g/L、10g/L、25g/L。
在一些实施方式中，所述香椿子为香椿子果瓣和/或香椿子中轴。
在一些实施方式中，所述果蝇为黑腹果蝇。
在一些实施方式中，所述香椿子为香椿子粉。
在一些实施方式中，将所述香椿子粉为过40目筛。
在一些实施方式中，所述培养果蝇用基础培养基的制备步骤为：
(a)将蔗糖、琼脂、玉米粉加水煮沸，得到第一混合物；
(b)将丙酸加入所述第一混合物，得到第二混合物；
(c)将酵母粉加入所述第二混合物，得到所述培养果蝇用基础培养基。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述蔗糖、所述琼脂、所述玉米粉、所述水的重量比为：50-150:5-15:60-180:1000，
优选，所述蔗糖、所述琼脂、所述玉米粉、所述水的重量比为：31:3.1:41.3:380。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述丙酸与所述第一混合物的重量比为：100-300:1，
优选，所述丙酸与所述第一混合物的重量比为：455.4:2.5。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述酵母粉与所述第二混合物的重量比为：80-200:1，
优选，所述酵母粉与所述第二混合物的重量比为：457.9:3.5。
通过上述方法制备的组合物能够提高果蝇繁殖力，缩短果蝇产卵前期，延长果蝇幼虫期，缩短果蝇蛹期。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香椿子，购于安徽亳州药材市场，产地来自安徽太和，自然晒干备用；
野生型黑腹果蝇，由阜阳师范学院生物与食品工程学院遗传学实验室提供，饲养在玉米粉-蔗糖培养基上，培养温度25±1℃，湿度为60％-70％，光照周期为光照、黑暗各12h；丙酸、蔗糖、酵母粉、琼脂等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，玉米粉购于阜阳华联超市。
1.2 仪器与设备
仪器：GZL-P800B型智能光照培养箱：合肥达斯卡特科学器材有点公司；GI54TW型全自动立式高压灭菌锅：致微(厦门)仪器有限公司；FST-GX-80型普力菲尔超纯水机：上海富诗特仪器公司；FSH-Z型可调高速匀浆机：金坛市杰瑞尔电器有限公司；FA2204型电子天平：天津天马衡基仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 配制培养基
将香椿子的干燥果瓣和中轴两部分分开，分别适当粉碎，过40目筛，保存备用。实验采用三种培养基：基础培养基(CK)、香椿子果瓣培养基(Ⅰ)和香椿子中轴培养基(Ⅱ)。
基础培养基(CK)的配制：称取蔗糖31g，琼脂3.1g，玉米粉41.3g，加水380mL，反复煮沸3次，使琼脂粉彻底溶解。稍冷却后加入2.5mL丙酸并充分搅拌，最后加入3.5g酵母粉搅拌均匀分装到培养管中作为空白对照组；香椿子果瓣培养基(Ⅰ)和中轴培养基(Ⅱ)是在基础培养基中分别加入果瓣和中轴粉末，致其终浓度分别为2.5g/L、10g/L、25g/L。
1.3.2 处女蝇的收集
一般认为，雌果蝇自羽化8h内未交配称之为处女蝇。向新鲜配制的基础培养基中接入雌雄黑腹果蝇，放入培养箱中培养7d，将成蝇移走，培养管继续培养，直至有成虫羽化。乙醚麻醉后用放大镜将雌雄果蝇分开，挑选健康、生命力强的果蝇用于实验。
1.3.3 观察并记录黑腹果蝇F1代发育和繁殖情况
将按照1.3.2方法收集到的♀、♂果蝇，随机分组，分别在含有不同浓度的Ⅰ和Ⅱ培养基中饲养繁殖，CK作为空白对照组。♀、♂成虫1:1单头配对，1对/管，每一浓度的不同培养基分别设12个重复，交配产卵后除去成虫，培养管继续培养，待其进行变态发育，直到不再有F1代成虫形成。期间，每隔8h观察记录每组果蝇产卵前期、卵的孵化、幼虫化蛹及蛹的羽化情况，计算子代果蝇每个生长阶段发育所需时间，且自第1只成虫羽化后连续10d统计子代(F1)雌雄数量、成蝇总数，并计算子代雌雄比、增殖率。其中，产卵前期即从雌雄果蝇配对至培养管内有卵出现的时间；卵期即是从卵发育至一龄幼虫出现的时间；幼虫期即是从一龄幼虫发育至有蛹出现的时间；蛹期即是从化蛹时起至成虫羽化所经历的时间。
1.3.4 观察并记录黑腹果蝇F2代发育和繁殖情况
收集羽化8h内的F1代个体，随机分组，分别在含有不同浓度的Ⅰ和Ⅱ培养基中饲养繁殖，CK作为空白对照组。每隔8h观察记录每组果蝇产卵前期、卵的孵化、幼虫化蛹及蛹的羽化情况，计算F2代果蝇每个生长阶段发育所需时间。
1.3.4 数据统计分析
采用SPSS21.0统计分析软件对数据进行统计学分析，试验数据以“平均值±标准差”表示，组间差异性检验采用单因素方差分析，p﹤0.05为具有统计学差异意义。
2 结果与分析
2.1 香椿子不同成份对F1代果蝇不同阶段发育历期的影响
不同浓度香椿子果瓣和中轴处理组的F1代果蝇不同阶段的发育历期见表1。与对照组相比，香椿子果瓣培养基条件下的F1代果蝇产卵前期随浓度升高而缩短，且在浓度为10g/L、25g/L时，与对照差异显著(p﹤0.05)或极显著(p﹤0.01)，此时产卵前期分别为31.36h、24h；此培养基对卵期的影响不大，只有在浓度为2.5g/L时与对照达到差异显著(p﹤0.05)，延长了2.8h；当香椿子果瓣浓度为25g/L时，使F1代果蝇幼虫期延长了14.4h(p﹤0.05)，蛹期缩短15.6h(p﹤0.01)。
与香椿子果瓣培养基一样的模式，香椿子中轴培养基对F1代果蝇卵期的影响，与对照相比差异均不显著，而对产卵前期的影响是随着浓度的增加先延长后缩短(分别延长4.08h，7.44h，缩短19.92h)，延长果蝇的幼虫期，最大可延长67.2h，缩短蛹期，最大可缩短24h，且均在浓度为10g/L、25g/L时与对照达到差异极显著(p﹤0.01)。
通过对相同浓度不同香椿子部位培养基对果蝇发育历期的影响比较发现，相同浓度的香椿子果瓣和中轴培养基对F1代果蝇蛹期的影响，两者差异均不显著，对幼虫期的影响均差异极显著(p﹤0.01)，最大差距52.8h；当浓度为2.5g/L和10g/L时，两者对果蝇产卵前期的影响达到差异极显著(p﹤0.01)，此时所需时间差距分别为8.54h、20h，见表1。分析产生此种现象的原因可能是由于果瓣和中轴所含的有效活性成分及药理作用不同。
表1 香椿子果瓣和中轴对F1代果蝇不同阶段发育历期的影响
Tab.1 Effects of carpel and axial of fructus T.Sinensis at differentdosages on the developmental duration of F1 of drosophilas(n＝12)
注：同列同组数据后上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列同组数据后上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；同列同浓度数据后下标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；同列同浓度数据后下标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
2.2 香椿子不同成份对F2代果蝇不同阶段发育历期的影响
通过与对照组比较发现，不同浓度香椿子果瓣培养基对F2代果蝇的产卵前期、卵期、幼虫期和蛹期的影响差异均不显著。
而不同浓度香椿子中轴培养基对F2代果蝇的卵期影响与对照差异均不显著外，其他浓度均是随着浓度的升高，使果蝇的产卵前期先延长后缩短(分别延长7.52h、12.75h，缩短25.8h)，幼虫期延长(分别延长21.51h、28.21h、68.5h)，蛹期缩短(分别缩短15.83h、34.34h、48.03h)，与对照相比，均达到差异显著(p﹤0.05)或极显著(p﹤0.01)，见表2。
从表2还可以看出，除卵期外，相同浓度的香椿子果瓣和中轴培养基对F2代果蝇的产卵前期、幼虫期、蛹期差异均达到差异显著(p﹤0.05)或极显著(p﹤0.01)，且均在25g/L浓度条件下差值最大，分别为20.8h、73.44h和44.09h。通过比较还发现，香椿子中轴培养基对果蝇产卵前期、幼虫期、蛹期的影响效果较果瓣明显，并且可持续至子代，程度不断加深。
表2 香椿子果瓣和中轴对F2代果蝇不同阶段发育历期的影响
Tab.2 Effects of carpel and axial of fructus T.Sinensis at differentdosages on the developmental duration of F2 of drosophilas(n＝12)
2.3 香椿子不同成份对果蝇F1代繁殖力的影响
果蝇在不同浓度香椿子果瓣和中轴培养基中培养后，F1代♀、♂果蝇数量与对照相比，数量均增加(25g/L浓度果瓣培养基除外)(表3)，说明香椿子果瓣和中轴具有促进果蝇繁殖的能力。不同浓度香椿子果瓣培养基使F1代♀果蝇数量先增加后降低，且只在浓度为25g/L时，其数量低于对照组并与对照组差异显著(p﹤0.05)，增殖率为-5.95％。F1代♂果蝇的增殖率随着香椿子果瓣培养基浓度的增大，呈现先增加后降低的趋势，在浓度为10g/L时，♂果蝇数量与对照差异显著(p﹤0.05)，此时增殖率最大，为41.69％；香椿子中轴培养基对F1代♀、♂果蝇数量的影响是随着浓度的增大，先增加后逐渐降低，但均高于对照组♀、♂果蝇数量，当浓度为2.5g/L时，♀、♂果蝇的增殖率均达到最大，分别为61.71％、80.18％。
进一步比较发现，相同浓度条件下的香椿子果瓣和中轴培养基条件下的F1代♀、♂果蝇数量，除10g/L浓度条件下的♂果蝇数量差异不显著外，其余均差异显著(p﹤0.05)或者极显著(p﹤0.01)，见表3。通过对F1代♀、♂果蝇增殖率的比较发现，香椿子果瓣和中轴对♂果蝇数量的影响较♀果蝇明显，但均对♀、♂果蝇性比的影响较小(表3)。
表3 不同浓度香椿子果瓣和中轴培养基条件下果蝇F1代繁殖力(n＝12)
Tab.3 The effect of different concentrations of carpel and axial offructus T.Sinensis on the F1 generation of fertility(n＝12)
2.4 香椿子不同成份对果蝇F2代繁殖力的影响
如表4所示，不同浓度香椿子果瓣和中轴亦是使F2代♀、♂果蝇数量增加。通过比较发现，随着香椿子果瓣培养基浓度的增大，F2代♀、♂果蝇数量均是先增加后降低，但均高于对照组，且只有在浓度为10g/L时，F2代♂果蝇数量与对照差异极显著(p﹤0.01)，此时增殖率为29.48％；而不同浓度的香椿子中轴培养基条件下的F2代♀、♂果蝇数量与对照相比，均达到差异极显著(p﹤0.01)，且均在浓度为2.5g/L时，♀、♂果蝇数量最多，增殖率分别为77.91％、87.39％，均高于同浓度条件下的F1代♀、♂的增殖率，说明香椿子中轴具有较显著的增强果蝇繁殖的能力，且有逐代累积效应。
从表4还可以看出，香椿子果瓣和中轴培养基条件下的F2代♀、♂果蝇数量，在相同浓度条件下均呈现差异极显著(p﹤0.01)，即中轴培养基中的F2代♀、♂果蝇数量明显高于果瓣培养基，说明香椿子中轴促进果蝇繁殖的能力优于香椿子果瓣。与F1代一样，香椿子中轴和果瓣对F2代♀、♂果蝇的性比影响较小。
表4 不同浓度香椿子果瓣和中轴培养基条件下果蝇F2代繁殖力(n＝12)
Tab.4 The effect of different concentrations of carpel and axial offructus T.Sinensis on the F2generation of fertility(n＝12)
3 结论与讨论
本研究结果显示，随着浓度的升高，香椿子果瓣培养基使F1、F2代果蝇的产卵前期缩短、幼虫期延长和蛹期缩短；而香椿子中轴培养基使子代果蝇的产卵前期先延长后缩短，幼虫期延长，缩短蛹期，并且随着代数增加，程度不断加深。此外，相同浓度条件下，香椿子中轴对子代果蝇的产卵前期、幼虫期、蛹期的影响均大于香椿子果瓣的影响，推测香椿子果瓣和中轴的生物活性成分以及药理作用存在差别。而对于子代果蝇卵期的影响，除2.5g/L浓度的香椿子果瓣培养基使F1代果蝇的卵期延长外，其余浓度的香椿子果瓣和中轴均不能改变子代果蝇的卵期，这可能是由于卵的外面包被一层具有高度不透性的坚硬的卵壳，使外界物质很难渗透进入对其产生影响。
本试验结果还显示，不同浓度的香椿子果瓣和中轴培养基均能使子代♀、♂果蝇数量增加，但对子代♀、♂果蝇的性比影响较小(0.94-1.13)。通过对子代果蝇数量的比较分析发现，在相同浓度条件下，中轴培养基中的F1、F2代♀、♂果蝇的增殖率明显高于果瓣。因此推测香椿子中轴和果瓣含有能增强果蝇繁殖能力的活性物质，且中轴的促进繁殖的作用优于果瓣。通过进一步分析发现，香椿子中轴培养基的F2代果蝇增殖率高于F1代，以及♂果蝇增殖率显著高于♀果蝇，但随着浓度的升高，F1、F2代♀、♂果蝇数量的增殖幅度均逐渐减小。
我国香椿子分布广泛，资源丰富，富含多种活性物质，目前关于其药理活性的研究相对较少，特别是将香椿子果瓣和中轴分开进行生物活性分析特别是对果蝇生理影响的研究尚未见报道。因此，本研究结果显示，香椿子果瓣和中轴对子代果蝇不同阶段发育历期和繁殖力的影响存在显著差异。
本发明的组合物能够缩短果蝇产卵前期，有助于果蝇大量繁殖，降低了饲养成本，提高了饲养效率，对于快速提供大量果蝇的生产具有有益意义。
果蝇唾腺染色体是果蝇幼虫期唾腺细胞核内染色线连续复制但细胞核不分裂而形成的多线染色体又称为巨型染色体。本发明的组合物能够延长果蝇幼虫期，有助于增加唾腺染色体的存在时间，为对唾腺染色体的研究提高了可利用时间，增加科研实验或生产中的可操作性。
本发明的组合物能够缩短蛹期，有助于减少研究其他时期的等待时间。
本发明的组合物能够提高果蝇繁殖力，有利于增加果蝇养殖效率，节约饲料(培养基)。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将香椿子与培养果蝇用基础培养基混合，得到所述组合物。
2.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，
所述香椿子在所述培养果蝇用基础培养基中的浓度为1-100g/L，
优选所述香椿子在所述培养果蝇用基础培养基中的浓度为2.5g/L、10g/L、25g/L。
3.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，
所述香椿子为香椿子果瓣和/或香椿子中轴。
4.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，
所述果蝇为黑腹果蝇。
5.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，
所述香椿子为香椿子粉。
6.如权利要求5所述的组合物的制备方法，其特征在于，
将所述香椿子粉为过40目筛。
7.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，
所述培养果蝇用基础培养基的制备步骤为：
(a)将蔗糖、琼脂、玉米粉加水煮沸，得到第一混合物；
(b)将丙酸加入所述第一混合物，得到第二混合物；
(c)将酵母粉加入所述第二混合物，得到所述培养果蝇用基础培养基。
8.如权利要求7所述的组合物的制备方法，其特征在于，
在步骤(a)中，所述蔗糖、所述琼脂、所述玉米粉、所述水的重量比为：50-150:5-15:60-180:1000，
优选，所述蔗糖、所述琼脂、所述玉米粉、所述水的重量比为：31:3.1:41.3:380。
9.如权利要求7所述的组合物的制备方法，其特征在于，
在步骤(b)中，所述丙酸与所述第一混合物的重量比为：100-300:1，
优选，所述丙酸与所述第一混合物的重量比为：455.4:2.5。
10.如权利要求7所述的组合物的制备方法，其特征在于，
在步骤(c)中，所述酵母粉与所述第二混合物的重量比为：80-200:1，
优选，所述酵母粉与所述第二混合物的重量比为：457.9:3.5。
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