CN102550490A

CN102550490A - 接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法

Info

Publication number: CN102550490A
Application number: CN2012100031123A
Authority: CN
Inventors: 龚自明; 刘明炎; 毛迎新; 谭荣荣
Original assignee: Institute of Fruit and Tea of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Fruit and Tea of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2012-01-06
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-01-06
Also published as: CN102550490B

Abstract

接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法，包括接骨草饲养茶尺蠖的方法，以及用该饲养方法扩繁EcobNPV的方法，其核心是用接骨草替代茶叶饲养茶尺蠖，并配合各种饲养操作与扩繁操作以提高养虫效果与产毒效果，不仅能克服传统饲料无法全年、继代饲养茶尺蠖的难题，而且能解决EcobNPV大量扩繁的难题。本设计不仅成本低廉、操作难度较低，而且产毒效率较高、病毒毒力较强，能够满足规模化生产EcobNPV的需要。

Description

接骨草饲养茶尺蠖,及用其扩繁EcobNPV的方法

技术领域

本发明涉及茶尺蠖饲养及茶尺蠖核型多角体病毒繁殖领域，尤其涉及接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法，具体适用于通过接骨草饲养茶尺蠖的方法来实现全年规模化繁殖EcobNPV。

背景技术

茶尺蠖Ectropis obliqua Warren，属鳞翅目，尺蛾科，是我国主要茶树害虫之一，分布遍及各主产茶区，在长江中下游，尤以浙、苏、皖、鄂地区危害严重。幼虫食叶为害，常致茶丛光秃，严重影响茶树的树势和茶叶产量，除危害茶树外，还取食大豆、向日葵、石榴等植物。

在我国茶尺蠖1年发生5–6代，第1代发生较为整齐，2代后世代重叠，防治难度较大。目前各地针对茶尺蠖的防治措施各有不同，但均以化学防治为主。化学农药的大量使用，在杀死害虫的同时，不仅严重污染了茶园生态环境，而且也杀伤了大量天敌，并带来害虫抗药性增强、茶叶农药残留、茶园生态系统恶化等诸多负面效应，严重威胁茶叶质量安全。茶叶作为加工不经洗涤、消费直接冲泡的饮品，在茶园有害生物防治中要求尽量减少化学农药的使用，优先考虑运用生物、农业、物理手段治虫保产。茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，简称EcobNPV）是茶尺蠖的重要病原微生物，它对茶尺蠖幼虫感染力强，致死率高，对人、畜及天敌昆虫安全，尤其是可通过水平扩散和垂直传播途径，形成病毒流行链，实现对靶标害虫持续控制，因此，在茶叶生产中具有非常广阔的应用前景。

由于茶尺蠖核型多角体病毒专择性极强，只能在寄主活体内或细胞中增殖，生产条件要求相对严格，因此，能否解决病毒生产问题，成为该病毒在生产实际中能否发挥作用的关键。

用离体细胞增殖病毒，现已有报道，但其成本甚高，只能供基础理论研究应用，尚不适应我国茶叶生产的经济基础。目前，生产茶尺蠖病毒主要采用宿主活体增殖的方式，即通过接毒感染宿主幼虫生产病毒。通常野外接毒和室内接毒都可以实现病毒的增殖，但前者更容易受到环境因素制约，如：温度、湿度、光照、雨水、肉食性昆虫等等，都会对病毒的产量造成影响，甚至导致病毒杀虫活性降低；相比之下，室内接毒方式可控性强，病毒生产量更为稳定，因此，也成为当前昆虫病毒活体增殖的最主要途径。室内人工饲养茶尺蠖，为病毒扩繁提供龄期和营养状况一致的宿主昆虫，是茶尺蠖病毒活体增殖的关键。但由于使用传统方法，即用茶叶养虫生产病毒效率低、成本高，不适宜作为饲料养虫增殖病毒，为此，必须筛选新饲料以有效解决茶尺蠖病毒大量扩繁的难题。

中国专利专利号为ZL200710068384.0，授权公告日为2009年9月16日的发明专利公开了一种茶尺蠖的人工饲料，其制备及茶尺蠖的饲养方法，该发明中饲料的配方组分与各组分的重量份为：琼脂0.5–6 份、山梨酸钾0.1–0.8份、精制葡萄糖1–8.5份、可溶性淀粉1.5–10份、脱脂黄豆粉2–10份、复合维生素B 0.01–0.1份、维生素C 0.1–1.5份、维生素E 0.02–0.15份、茶叶粉20–40份和纯净水100–180份。虽然该发明用配方饲料替代茶叶克服了以往在冬季与早春因饲料短缺导致茶尺蠖不能全年继代饲养的难题，但其仍旧具有以下缺陷：

首先，该发明只提及了配方饲料的养虫情况，而没有提及配方饲料养虫后的产毒效率、病毒毒力等关键技术指标，该发明由于缺乏这些数据，因而无法确定它是否能替代茶叶满足规模化生产EcobNPV的需要。

其次，该发明采取的配方饲料为人工配料，不仅种类繁多，而且配制要求较高，因而成本较大，不适合于大范围的推广应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的无法规模化生产EcobNPV、成本较高的缺陷与问题，提供一种能够规模化生产EcobNPV、成本较低的接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法。

为实现以上目的，本发明的技术解决方案是：接骨草饲养茶尺蠖的方法，该方法依次包括以下步骤：

第一步：先采集健康茶尺蠖（Ectropis obliqua Warren）的蛹，再置于消毒后的养虫容器内，并在室温下饲养至成虫羽化；

第二步：待上述虫蛹羽化后，先在养虫容器内放入10%蔗糖溶液供成虫补充营养，再用高密纱布覆盖养虫容器供交配后的雌虫在其表面产卵；

第三步：始见卵孵出幼虫后，开始用接骨草（Sambucus chinensis）喂养茶尺蠖幼虫，先将接骨草置于养虫容器周围以供孵出的幼虫取食，当接骨草上的接虫量达到一定数目要求后，再将接骨草置于养虫容器内部供孵出的幼虫取食，在整个幼虫饲养过程中，根据接骨草的新鲜程度和被取食程度，更换和添加接骨草3–4次，饲养直至幼虫化蛹为止。

所述第一步中每个养虫容器内承装虫蛹400–500头。

所述第三步中，先将接骨草置于养虫容器周围以供孵出的幼虫取食，当接骨草上的接虫量达到一定数目要求后，再将接骨草置于养虫容器内部供孵出的幼虫取食的操作步骤为：先用细口瓶水培接骨草，并将细口瓶置于养虫容器周围，以供孵出的幼虫取食细口瓶中水培的接骨草，当每个细口瓶中接骨草的接虫量达到80–120头时，再将细口瓶及瓶中水培的接骨草一并转入养虫容器中，每个养虫容器承装4瓶接骨草，共饲养龄期一致的幼虫300–500头，且在养虫容器上覆盖双层高密纱布以防止幼虫逃逸。

所述细口瓶中水培的接骨草的原料使用状态为：当接骨草长至60cm以上，先用枝剪剪取该植株顶部25–30cm长嫩梢，再选取8–10根长度一致嫩梢为一束，然后置于细口瓶内水培。

用所述接骨草饲养茶尺蠖的方法扩繁EcobNPV的方法；所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角体病毒，全称为Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，简称为EcobNPV；所述扩繁EcobNPV的方法依次包括以下步骤：

第一步：先将感染病毒死亡的茶尺蠖虫尸加少量无菌水置组织匀浆器皿中匀浆3min–5min，再取出浆液按1：6加无菌水混匀，然后在500r/min的条件下离心5min以去除细胞组织碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的条件下离心30 min，然后弃去上清液，并用无菌水悬浮沉淀，再重复上述离心操作2–3次以得到最终沉淀，然后将该最终沉淀用无菌水悬浮即可得到茶尺蠖核型多角体病毒的粗提液；

第二步：先将上述得到的茶尺蠖核型多角体病毒的粗提液用无菌水稀释至5×10⁶PIB/ml以得到病毒液，再在4℃下保存备用；

第三步：按上述接骨草饲养茶尺蠖的方法饲养茶尺蠖，在饲养过程中，当茶尺蠖幼虫长至3龄时开始接种病毒，接种病毒采用上述病毒液进行，接毒浓度为5×10⁶PIB/ml，接毒方式为在每个养虫容器内的接骨草上喷洒病毒液50ml，且初次喷毒后的接骨草必须喂养2天以上才能更换；

第四步：接种病毒5天后开始逐日收集染毒死虫，并将收集的虫尸与50%甘油按1:1的比例混合后置－20℃下保存备用，此时即可得到所需的EcobNPV。

所述第三步中接种病毒的茶尺蠖3龄幼虫为第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3龄幼虫。

所述第三步中接种病毒的茶尺蠖3龄幼虫为第1代茶尺蠖的3龄幼虫。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法中不仅涉及到茶尺蠖的饲养方法，而且提及了用该饲养方法扩繁EcobNPV的方法，整个过程以EcobNPV的规模化生产为目标，应用本发明可以获得明确的养虫数据与产毒数据，根据试验：本发明在饲养茶尺蠖时，各项指标与对照无显著差异；本发明在扩繁EcobNPV时，能使85%以上幼虫至末龄幼虫期染毒死亡，降低幼虫提早死亡或化蛹的比例，按照感病宿主虫尸生物量与病毒产量正相关原则，以接骨草为饲料增殖病毒量（平均每头重量0.0507g）高于茶叶养虫的产毒量（平均每头重量0.0490g），产毒效率高，毒力强。因此，本发明不仅能替代茶叶对茶尺蠖进行全年、继代的饲养，而且能满足规模化生产EcobNPV的需要。

2、本发明接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法中在饲养茶尺蠖时，用接骨草替代茶叶，接骨草（拉丁学名：Sambucus chinensis）的优点如下：首先，不仅养虫效果较好，而且产毒效率高、病毒毒力强；其次，接骨草不仅获取方便、成本低廉，而且枯萎期长、减少更换，一般只需更换3–4次即可，以3次为多，而现有饲料至少要替换4-6次或更多，大大增加了操作难度。因此本发明不仅成本低廉，而且操作难度较低。

3、本发明接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法中在饲养茶尺蠖时，用10%蔗糖溶液供成虫补充营养，其原因在于：10%蔗糖溶液不仅能延长成虫寿命，而且能显著提高产卵量，有利于提高养虫效果与产毒效果。因此本发明的养虫效果与产毒效果均较好。

4、本发明接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法中在扩繁EcobNPV时，要求初次喷毒后的接骨草必须喂养2天以上才能更换的原因在于：如果低于2天，则不能充分接毒，从而影响产毒效果。因此本发明的接毒效果较好、产毒效果较佳。

5、本发明接骨草饲养茶尺蠖，及用其扩繁EcobNPV的方法中在扩繁EcobNPV时，要求接种病毒的茶尺蠖幼虫为3龄幼虫的原因在于：幼虫3龄前接毒相对敏感，4–5龄幼虫敏感性较差，为确保获得较多的幼虫尸体以提高产毒量，故要求接种病毒的茶尺蠖幼虫为3龄幼虫；同时，对于3龄幼虫要求其为第1代、第2代、第3代或第6代，尤以第1代为佳的原因在于：在茶尺蠖不同世代中，以第1代、第2代、第3代或第6代发生期的温度更适宜繁殖病毒，故其病毒产量较高，尤其以第1代的病毒产量最高。因此本发明的产毒效果较佳。

具体实施方式

以下结合实施例和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

接骨草饲养茶尺蠖的方法，该方法依次包括以下步骤：

所述第一步中每个养虫容器内承装虫蛹400–500头。

本发明的原理说明如下：

一、接骨草：

替代性强：接骨草为茶尺蠖野生寄主植物，幼虫喜食，生长发育正常。在武汉地区，以接骨草为饲料饲养茶尺蠖（第4代），幼虫发育历期14.5天，存活率85.7%，蛹历期8.25天，羽化率84.3%，每雌平均产卵量138.6粒，其各项生物学特征参数与茶叶饲养的参数值无显著性差异。

成本低廉：接骨草为多年生草本植物，喜温湿气候，分布广泛，在我国浙江、安徽、江西、湖南、湖北、福建、广东、广西、四川等省区野生或栽培，其人工栽培可种子繁殖或分株繁殖。通常在茶园附近、林间、沟边生长，来源广泛，容易获得，成本十分低廉。

更换次数少：接骨草出现萎蔫一般在5天以上，比茶叶从投料至更换需要的时间更长，有利于减少换料次数，一般只需更换3–4次即可，以3次为多，而现有饲料至少要替换4-6次或更多。同时，本发明对接骨草的原料使用状态要求为：当接骨草长至60cm以上，先用枝剪剪取该植株顶部25–30cm长嫩梢，再选取8–10根长度一致嫩梢为一束，然后置于细口瓶内水培。由此可见，不仅要求剪取生命力较强的嫩梢，而且用水培的方法来延长嫩梢的生命力，因此该原料使用状态能够进一步减少接骨草在饲养中的更换次数。

试验1：接骨草与茶叶饲养茶尺蠖的效果对比试验：

本试验自2010年7月27日至2010年9月10日，采用接骨草饲养茶尺蠖一个世代，以茶叶喂养为对照。参见表1，结果表明，以接骨草饲养的茶尺蠖幼虫发育历期14.5天，比对照延长了1–2天，幼虫存活率85.7%，蛹重89.78mg，蛹发育历期8.25天，羽化率84.3%，每雌平均产卵量138.6粒，卵孵化率86.4%，其各项指标与对照无显著差异。通过试验观察还发现，水培接骨草存放时间久，出现萎蔫一般在5天以上，比茶叶投料至更换饲料时间更长，减少换料次数，节省人工。

二、应用接骨草饲养茶尺蠖增殖病毒的适宜时期和浓度为：3龄幼虫5.0×10⁶ PIB/ml，如下所示：

试验2：

将接骨草养虫增殖的病毒提纯，稀释成2.5×10⁶、5.0×10⁶、7.5×10⁶、1.0×10⁷PIB/ml 4个浓度，分别接毒1龄、2龄、3龄、4龄、5龄幼虫，饲养至幼虫化蛹，计算不同浓度病毒感染不同龄期幼虫的死亡率，参见表2，结果表明，茶尺蠖幼虫3龄前对病毒相对敏感，4–5龄幼虫敏感性较差。就感病死虫龄期而言，1龄接毒，3龄前死亡虫数占死亡总数的80%以上；2龄接毒，4龄前死亡虫数占死亡总数的40%；3龄接毒5.0×10⁶ PIB/ml，末龄幼虫染毒死亡数占死亡总数的85%以上。故，从幼虫发病率、收获病毒量综合考虑，应用接骨草饲养茶尺蠖增殖病毒的适宜时期和浓度为3龄幼虫5.0×10⁶ PIB/ml。

三、不同世代茶尺蠖增殖病毒效果的研究：

试验3：

在室内非控温条件下，以浓度为5.0×10⁶ PIB/ml病毒液，接毒感染各世代茶尺蠖3龄幼虫，接毒5天后逐日收集死虫，记载感病死亡虫数，至幼虫化蛹，计算各代幼虫的感病死亡率，并将各代增殖的病毒虫尸分别称重后，进行比较，参见表3，结果表明，在茶尺蠖不同世代都可以进行病毒增殖，其中以第1代、第2代、第3代和第6代为宜。

四、接骨草、茶叶饲养茶尺蠖增殖茶尺蠖核型多角体病毒（EcobNPV）的效率比较：

试验4：

于2009年茶尺蠖第1代至第5代发生期，以接骨草饲养茶尺蠖幼虫增殖病毒，茶叶喂养为对照，各代均饲养至幼虫化蛹，将两种饲料养虫生产的茶尺蠖病毒虫尸分别称重，折算成每头虫尸重后，进行比较，参见表4，结果表明，接骨草养病虫尸重略高于茶叶所养病虫尸重，按照感病宿主虫尸生物量与病毒产量正相关原则，接骨草养虫产毒量高于茶叶养虫的产毒量。

五、接骨草、茶叶饲养茶尺蠖增殖其核型多角体病毒的毒力比较：

试验5：

提纯接骨草、茶叶养虫增殖的典型病毒，分别稀释成1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶PIB/ml 四个浓度，室内接毒感染茶尺蠖3龄幼虫，接毒5天后逐日收集感病虫尸，饲养直至幼虫化蛹，记载感病死亡虫数，计算感病死亡率和校正死亡率，并求算毒力回归方程及LC₅₀。参见表5，结果表明，接骨草养虫增殖的病毒毒力略高于茶叶养虫增殖的病毒。

六、获取茶尺蠖核型多角体病毒的粗提液中的离心操作：

离心操作的目的是去除昆虫组织碎片和细菌，由于茶尺蠖体色及带毒量不同，因此很难从外部形态设定结束离心判断标准，科学研究中多通过电镜观察判断病毒纯净与否，但该方法不适宜在生产中应用。经本申请人试验表明：在差速离心2–3次后，可以获得较为纯净的病毒，因而重复离心2–3次的目的是提纯病毒，重复离心后，最后得到的病毒沉淀于离心管底，此时用水悬浮离心管底的最终沉淀即可得到病毒的粗体液。

实施例1：

接骨草饲养茶尺蠖的方法，该方法依次包括以下步骤：

第一步：先采集健康茶尺蠖（Ectropis obliqua Warren）的蛹，再置于消毒后的养虫容器内，每个养虫容器内承装虫蛹400–500头，并在室温下饲养至成虫羽化；

第三步：始见卵初孵出幼虫后，开始用接骨草（Sambucus chinensis）喂养茶尺蠖幼虫，先用细口瓶水培接骨草，并将细口瓶置于养虫容器周围，以供孵出的幼虫取食细口瓶中水培的接骨草，当每个细口瓶中接骨草的接虫量达到80–120头时，再将细口瓶及瓶中水培的接骨草一并转入养虫容器中，每个养虫容器承装4瓶接骨草，共饲养龄期一致的幼虫300–500头，且在养虫容器上覆盖双层高密纱布以防止幼虫逃逸，在整个幼虫饲养过程中，根据接骨草的新鲜程度和被取食程度，更换和添加接骨草3–4次，饲养直至幼虫化蛹为止；

本发明中接骨草饲养茶尺蠖的方法，不仅克服了茶叶、传统饲料无法全年、继代饲养茶尺蠖的难题，而且成本低廉、操作难度较低，能够实现全年大批量供应茶尺蠖标准试虫的目的。

用接骨草饲养茶尺蠖的方法扩繁EcobNPV的方法，该扩繁EcobNPV的方法依次包括以下步骤：

第三步：按上述接骨草饲养茶尺蠖的方法饲养茶尺蠖，在饲养过程中，当茶尺蠖幼虫长至3龄时开始接种病毒，接种病毒采用上述病毒液进行，接毒浓度为5×10⁶PIB/ml，接毒方式为在每个养虫容器内的接骨草上喷洒病毒液50ml，且初次喷毒后的接骨草必须喂养2天以上才能更换；所述接种病毒的茶尺蠖3龄幼虫为第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖3龄幼虫；

虫尸与50%甘油按1:1比例混合后的保存温度一般来说是越低越好，如：昆虫病毒在－70℃可以保存10年以上。昆虫病毒短期保存（通常不超过2个月）温度一般为4℃，保藏期超过2个月最好置于-20℃。

本发明中扩繁EcobNPV的方法，不仅提高了EcobNPV的生产效率和毒力，而且降低了生产成本，有效解决了病毒大量扩繁的难题，且操作简单，容易被茶农接受，推广应用前景广阔。

由上可见，本发明不仅成本低廉、操作难度较低，而且产毒效率较高、病毒毒力较强，能够满足规模化生产EcobNPV的需要。

Claims

1.接骨草饲养茶尺蠖的方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤：

第一步：先采集健康茶尺蠖（Ectropis oblique Warren）的蛹，再置于消毒后的养虫容器内，并在室温下饲养至成虫羽化；

2.根据权利要求1所述的用接骨草饲养茶尺蠖的方法，其特征在于：所述第一步中每个养虫容器内承装虫蛹400–500头。

3.根据权利要求1所述的用接骨草饲养茶尺蠖的方法，其特征在于：所述第三步中，先将接骨草置于养虫容器周围以供孵出的幼虫取食，当接骨草上的接虫量达到一定数目要求后，再将接骨草置于养虫容器内部供孵出的幼虫取食的操作步骤为：先用细口瓶水培接骨草，并将细口瓶置于养虫容器周围，以供孵出的幼虫取食细口瓶中水培的接骨草，当每个细口瓶中接骨草的接虫量达到80–120头时，再将细口瓶及瓶中水培的接骨草一并转入养虫容器中，每个养虫容器承装4瓶接骨草，共饲养龄期一致的幼虫300–500头，且在养虫容器上覆盖双层高密纱布以防止幼虫逃逸。

4.根据权利要求3所述的用接骨草饲养茶尺蠖的方法，其特征在于：所述细口瓶中水培的接骨草的原料使用状态为：当接骨草长至60cm以上，先用枝剪剪取该植株顶部25–30cm长嫩梢，再选取8–10根长度一致嫩梢为一束，然后置于细口瓶内水培。

5.用权利要求1所述的接骨草饲养茶尺蠖的方法扩繁EcobNPV的方法，其特征在于：所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角体病毒，全称为Ectropis grisescens nucleopolyhedrovirus ，简称为EcobNPV；所述扩繁EcobNPV的方法依次包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的用接骨草饲养茶尺蠖的方法扩繁EcobNPV的方法，其特征在于：所述第三步中接种病毒的茶尺蠖3龄幼虫为第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3龄幼虫。

7.根据权利要求6所述的用接骨草饲养茶尺蠖的方法扩繁EcobNPV的方法，其特征在于：所述第三步中接种病毒的茶尺蠖3龄幼虫为第1代茶尺蠖的3龄幼虫。