TWI615402B - 防治黴漿菌感染的組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供合適作為抗黴漿菌之次單位疫苗的活性成分的蛋白質及以其製得之疫苗。前述蛋白質經實驗證實可引發足夠強度的免疫反應而避免豬隻感染黴漿菌。前述疫苗可含有一種前述之蛋白質作為活性成分，或含有兩種以上前述之蛋白質而形成雞尾酒疫苗的形式。本發明之疫苗不僅較習用疫苗更具安全性，同時具有相當、甚至是更優異的免疫效果。此外，本發明並證實了合適於生產出具高可溶性之前述蛋白質的融合伴子，可顯著地節省生產成本。

Description

防治黴漿菌感染的組合物
本發明關於一種抗豬黴漿菌的疫苗，尤指一種抗豬黴漿菌的次單位疫苗。
黴漿菌(Mycoplasma spp.)是目前所知能在細胞外自行複製的最小細菌，其引發的豬黴漿菌肺炎雖然不會造成豬隻的高死亡率，但會降低飼料換肉率、導致生長發育遲緩、造成發炎性反應及免疫抑制作用、及引起其他諸多細菌性病原的感染，因而使養豬業者蒙受嚴重的經濟損失。
目前對於豬黴漿菌肺炎的防治方式有三，包括：藥物投予、飼養管理及疫苗接種。由於抗生素對於豬肺炎黴漿菌的預防效果不佳，因此藥物投予的策略僅限於治療目的，難以達到預防的效果。此外，考量到藥物濫用可能引發更大規模之抗藥性菌種的感染，採用藥物投予不僅需要更多的規劃，同時面臨諸多極限。
良好的飼養管理是防治豬黴漿菌感染的根本方法。優良的豬舍環境衛生品質及妥善的飼養管理有助於減少感染的發生。從另一方面來說，配合疫苗接種更可使整體的防疫工作更加完善。
領域中現行使用的疫苗是以不活化死菌作為疫苗的活性成分。然而，因為黴漿菌為營養苛求性菌(fastidious bacteria)而不容易以人工培養，造成黴漿菌疫苗的價格居高不下。為了降低黴漿菌疫苗的成本，學者不斷研究以不同的策略來研發疫苗，包括：(1)減毒疫苗、(2)載體疫苗、(3)次單位疫苗、及(4)DNA疫苗；其中，次單位疫苗因具有容易生產及安全性高的優點，而最具應用潛力。
目前已知部分可研製為豬黴漿菌次單位疫苗的可能候選抗原，但截至今日，領域中仍尚未有研究報告完整地提出適用於豬黴漿菌次單位疫苗的抗原。
爰是，本發明之一目的為提供適用於豬黴漿菌次單位疫苗的抗原，並據以製得次單位疫苗，以降低防疫成本。
本發明之又一目的為組合本發明所習得之適用於豬黴漿菌次單位疫苗的抗原，以製得效果更優良的次單位疫苗，提供防疫工作更多樣化的選擇。
為達到上述目的，本發明提供一種防治黴漿菌感染的蛋白質，其具有SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、或其組合所示之胺基酸序列。
本發明另提供一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一第一活性成分，其包含P46、Tuf、或其組合之蛋白質；及一生物可接受之佐劑。
較佳地，前述第一活性成分具有SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、或其組合所示之胺基酸序列。
較佳地，前述組合物進一步包含一第二活性成分，其包含 MHP30、NrdFC、或其組合之蛋白質。
較佳地，前述第二活性成分具有SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、或其組合所示之胺基酸序列。
較佳地，前述第一活性成分及/或前述第二活性成分的濃度為20至2000μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
本發明又提供一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一活性成分，其包含下列群組之蛋白質的至少兩種：P46、Tuf、MHP30、及NrdFC；及一生物可接受之佐劑。
較佳地，前述活性成分為P46、Tuf、MHP30、及NrdFC。
較佳地，前述活性成分係具有下列群組之胺基酸序列的至少兩種：SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、及SEQ ID NO：04。
較佳地，前述活性成分具有SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、及SEQ ID NO：04所示之胺基酸序列。
較佳地，前述活性成分的濃度為20至2000μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
較佳地，前述生物可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
較佳地，前述組合物進一步包含一生物可接受之添加劑。
較佳地，前述生物可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。
本發明再提供一種表現載體，其係用於製備前述組合物中的活性成分，前述表現載體包含一質體；其中前述質體包含：一核苷酸序列，其係選自下列群組之核苷酸序列中的至少一個： SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：07、及SEQ ID NO：08；一融合伴子基因，其係選自於由大腸桿菌之MsyB基因、大腸桿菌之YjgD基因、大腸桿菌之GroS17基因、枯草桿菌之GroES基因、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)之TrxA基因、啤酒酵母菌之SUMO基因、及透明顫菌(Vitreoscilla sp.)之Vgb基因所組成之群組；及一調控元件。
較佳地，前述調控元件包含一啟動子及核醣體結合部位。
較佳地，前述質體為pET-MSY、pET-YjgD、pET-GroS17、pET-GroES、pET-TrxA、pET-SUMO、或pET-Vgb。
較佳地，當前述核苷酸序列選自下列群組之核苷酸序列中的至少一個：SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、及SEQ ID NO：08時，前述融合伴子基因為大腸桿菌之MsyB基因。
較佳地，當前述核苷酸序列為SEQ ID NO：07時，前述融合伴子基因係選自於由大腸桿菌之YjgD基因、大腸桿菌之GroS17基因、枯草桿菌之GroES基因、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)之TrxA基因、啤酒酵母菌之SUMO基因、及透明顫菌(Vitreoscilla sp.)之Vgb基因所組成之群組。
較佳地，前述表現載體係利用於大腸桿菌表現系統。
本發明又提供一種生產可溶性抗原的方法，其包含使用前述表現載體；其中前述抗原為黴漿菌之P46、Tuf、MHP30、或NrdFC。
綜上所述，本發明關於用於防治豬黴漿菌感染之抗原、組合物、及用於製備該抗原的質體。本發明的揭露內容不僅提供豬黴漿菌防疫工作的新選擇，更揭示組合兩種以上抗原的「雞 尾酒」次單位疫苗(即，含有兩種以上的抗原作為活性成分)具有更加強之免疫誘發效果。此外，本發明的研究成果並指出了特別合適用於輔助抗豬黴漿菌之抗原於表現系統中表現的融合伴子基因，有助於提升疫苗製備上的產能。
第一圖係為一蛋白質電泳圖譜，其顯示使用不同的融合伴子對於所產出之MHP3的可溶性影響。M行：protein marker(PageRulerTM pretained protein ladder；Fermentas,USA)；第1行：E.coli BL21(DE3)(pET-YjgD-MHP30)可溶性蛋白質；第2行：E.coli BL21(DE3)(pET-SUMO-MHP30)可溶性蛋白質；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-GroS17-MHP30)可溶性蛋白質；第4行：E.coli BL21(DE3)(pET-GroES-MHP30)可溶性蛋白質；第5行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-MHP30)可溶性蛋白質；第6行：E.coli BL21(DE3)(pET-MsyB-MHP30)可溶性蛋白質；第7行：E.coli BL21(DE3)(pET-Vgb-MHP30)可溶性蛋白質；第8行：E.coli BL21(DE3)(pET-TrxA-MHP30)可溶性蛋白質。
第二圖係為一蛋白質電泳圖譜，其顯示使用不同的融合伴子對於所產出之P46、NrdFC及Tuf的可溶性影響。M行：protein marker(PageRulerTM pretained protein ladder；Fermentas,USA)；第1行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-P46M)可溶性蛋白質；第2行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-P46M)不可溶性蛋白質；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-NrdFC)可溶性蛋白質；第4行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-NrdFC)不可溶性蛋白質；第5行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-Tuf)可溶性蛋白質；第6行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-Tuf)不可溶性蛋白質；第7行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-P46M)可溶性蛋白質；第8行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-P46M)不可溶性蛋白質；第9行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-NrdFC)可溶性蛋白質；第10行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-NrdFC)不可溶性蛋白質；第11行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-Tuf)可溶性蛋白質；第12行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-Tuf)不可溶性蛋白質。
第三圖係為一蛋白質電泳圖譜，其顯示本發明之MHP30、P46、NrdFC及Tuf重組蛋白的純化結果。M行：protein marker(PageRulerTM pretained protein ladder；Fermentas,USA)；第1行：E.coli BL21(DE3)(pET-YjgD-MHP30)可溶性蛋白質；第2行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-P46M)可溶性蛋白質；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-NrdFC)可溶性蛋白質；第4行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-Tuf)可溶性蛋白質；第5行：純化MHP30融合蛋白質；第6行：純化P46融合蛋白質；第7行：純化NrdFC融合蛋白質；第8行：純化Tuf融合蛋白質。
第四圖係為一西方墨點法試驗，其顯示以小鼠之抗血清偵測豬肺炎黴漿菌的全細胞萃取物的結果。
第五圖係為一ELISA試驗結果，其顯示本發明實施例七的豬隻免疫試驗結果。
本發明關於用於防治豬黴漿菌感染之抗原、組合物、及用於製備該抗原的質體。更明確地說，本發明的研究成果證實了P46及Tuf這兩個蛋白質的抗原性質可運用於製備防治豬黴漿菌感染的組合物。此外，本發明並證實了以「雞尾酒」形式混合兩種以上之P46、Tuf、MHP30、或NrdFC作為疫苗的活性成分，有助於提升誘發免疫的效果。另一方面，本發明揭露了特別合適使用於生產P46、Tuf、MHP30、及NrdFC等蛋白質的融合伴子，其可顯著地製得具高度可溶性(即，水溶性)的 前述蛋白質，而大幅度的節省疫苗製備過程中所需的時間及成本。
在本發明的一個面向中，本發明提供一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一第一活性成分，其包含P46、Tuf、或其組合之蛋白質；及一生物可接受之佐劑。在一可行實施態樣中，前述組合物可進一步包含一第二活性成分，且前述第二活性成分包含MHP30、NrdFC、或其組合之蛋白質。
在本發明的另一個面向中，本發明提供一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一活性成分，其包含下列群組之蛋白質的至少兩種：P46、Tuf、MHP30、及NrdFC；及一生物可接受之佐劑。
在本發明的一個可行實施態樣中，前述P46對應具有SEQ ID NO 01所示之胺基酸序列；前述Tuf對應具有SEQ ID NO 02所示之胺基酸序列；前述MHP30對應具有SEQ ID NO 03所示之胺基酸序列；前述NrdFC對應具有SEQ ID NO 04所示之胺基酸序列。所屬領域具有通常知識者理應可以理解，只要不影響前述蛋白質的抗原決定區域，前述胺基酸序列可容許相當程度的變動。在一個可行實施態樣中，只要不破壞前述胺基酸序列摺疊(folding)後應具有的抗原決定區域，前述活性成分可為具有任兩個以上之前述胺基酸序列的融合蛋白質。
一般而言，於單一疫苗中組合兩種以上之抗原並不一定對該疫苗的免疫誘發效果具有加乘的效果。於單一疫苗中組合兩種以上之抗原可能反而會使得該兩種以上之抗原於免疫誘發的能力產生相互抵銷的不利狀況。另從成本的角度來思考，即便該兩種以上之抗原的免疫誘發的能力不會產生抵銷，若不能具有加乘的效果，則也不值得將該兩種以上之抗原混合於單一 疫苗中。本發明實驗證實前述P46、Tuf、MHP30、及NrdFC在混合使用下可具有更好的免疫誘發效果，因此，在一個可行實施態樣中，本發明之組合物中的前述活性成分包含任兩個以上的前述蛋白質，此即為本發明所述之雞尾酒疫苗。
本發明之組合物中的活性成分之總和濃度為20至2000μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。在本發明的一個較佳實施態樣中，單一種前述活性成分的濃度為20至500μg/mL，其係以前述疫苗的總體積為基礎。在本發明的一個可行實施態樣中，本發明組合物中含有一個以上的前述活性成分，其中活性成分之總和濃度為：20至1000μg/mL、20至1500μg/mL、或20至2000μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
前述生物可接受之佐劑係用以增加活性成分的免疫效果、維持活性成分的穩定性、及提升所述組合物於疫苗用途上的安全性。本發明所述之生物可接受之佐劑包括，但不限於：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
本發明的另一面向為一種表現載體。更明確地，其係運用於大腸桿菌表現系統之表現載體。換言之，可於大腸桿菌表現系統轉譯為所需之蛋白質的胺基酸序列，並據以摺疊(folding)為本發明之組合物所需的活性成分。然，依據本發明的精神，所屬領域具有通常知識者當可參酌本發明說明書的揭露內容，進行變化(例如，針對不同的密碼子轉譯偏好(Codon Usage)而進行序列的微調)以適用於不同的表現系統，而仍屬於本發明的範疇。
本發明的又一面向為一種使用前述表現載體於表現用於 防治黴漿菌感染的蛋白質的方法。以往領域中使用的表現載體所生產的蛋白質具有可溶性不佳的缺點，因此需要以尿素及鹽酸胍(guanidinium hydrochloride)進行溶解及透析處理來純化得到產物。然而這樣的處理程序不僅增加生產成本，也會造成所生產之蛋白質變性，而需要使該變性的蛋白質進行重新摺疊，才得以執行抗原的角色。在重新摺疊的過程中會具有相當比例的錯誤摺疊，因而削弱了該些蛋白質作為抗原的效果。有鑑於前述習用製程中的不足，本發明方法的優勢在於尋找出特別適合的融合伴子，而使得生產之用於防治黴漿菌感染的蛋白質具有優異的可溶性，因此得以節省成本、簡化步驟、及提高所生產之蛋白質作為疫苗之活性成分使用的效果。
在本發明的一個可行實施態樣中，前述表現載體包含一質體。前述質體包含：一核苷酸序列、一融合伴子基因、及一調控元件。前述核苷酸序列係選自下列群組之核苷酸序列中的至少一個：SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：07、及SEQ ID NO：08，其係分別用於表現出P46、Tuf、MHP30、及NrdFC。
在一個可行的實施態樣中，於不影響所用表現系統的正常運作，也不影響個別前述核苷酸序列於其中的生產及後續胺基酸序列的摺疊的前提下，前述質體可包含兩個以上的前述核苷酸序列。
前述融合伴子基因係選自於由大腸桿菌之MsyB基因、大腸桿菌之YjgD基因、大腸桿菌之GroS17基因、枯草桿菌之GroES基因、酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)之TrxA基因、啤酒酵母菌之SUMO基因、及透明顫菌(Vitreoscilla sp.)之Vgb基因所組成之群組。
前述調控元件係指於表現系統中所需之啟動轉錄及轉譯程序所需的元件。前述調控元件至少應包含一啟動子(promoter)及核醣體結合部位。較佳地，前述調控元件可額外包含：操縱子(operator)、轉錄/轉譯的加強子序列(enhancer sequences)、或其組合。
以下實施例謹記載本發明研發所進行的試驗，以進一步釋明本發明的特徵與優點。惟需理解的是，所列實施例僅是示範性地例示所請發明，不應用於限制本發明的申請專利範圍。
實施例一：菌種及其培養
目前研究顯示，由豬隻中分離出來的黴漿菌共有七種：豬肺炎黴漿菌(Mycoplasm hyopneumoniae)、豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis)、豬滑液黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae)、豬絮狀黴漿菌(Mycoplasma flocculare)、豬喉黴漿菌(Mycoplasma hyopharyngis)、豬腸黴漿菌(Mycoplasma sualvi)及牛生殖道黴漿菌(Mycoplasma bovigenitalium)(Gourlay et al.,1978；Blank et al.,1996；Assuncao et al.,2005)；其中豬肺炎黴漿菌是最主要造成豬黴漿菌肺炎的病原，感染率約在25%至93%之間。因此本發明以豬肺炎黴漿菌(M.hyopneumoniae PRIT-5)做為抗原基因的來源。此外，本實驗中使用Escherichia coli JM109做為基因選殖用之宿主細胞，並以Escherichia coli BL21(DE3)作為蛋白質表現用之宿主細胞。
以Friis培養基(Friis et al.,1975)進行豬黴漿菌之培養。以LB(Luria-Bertani)培養基(Difco,USA)進行大腸桿菌之培養。依實驗需求，於培養基中加入適當適量之抗生素或加入 1.5% agar配製成固體培養基。
實施例二：材料與方法豬肺炎黴漿菌抗原基因之選殖
針對不同之抗原基因設計特異性引子(表一)。以豬肺炎黴漿菌染色體作為模板，利用特異性引子組合進行標的基因之擴增。有關基因增幅及選殖之步驟如下所述：
Figure TWI615402BD00001
1. 豬肺炎黴漿菌染色體之抽取
利用DNA純化套組(Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GeneMark,Taiwan)進行黴漿菌染色體之抽取。 首先取4.5mL之培養菌液至離心管中，經離心(5,870×g,5分鐘)後，倒除上清液，收集菌體部分。接著加入20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)及200μL的萃取試劑，於56℃下作用3小時，其中每5分鐘便輕緩地上下搖晃以使菌體與試劑充分混合。
經萃取試劑作用後，菌體會完全分解呈現澄清狀。之後，加入200μL的結合試劑(Binding solution)並於70℃下作用10分鐘。反應結束後，加入200μL的無水酒精至微量離心管中並均勻混合，吸取所有溶液(包括沉澱物)至spin column，並將spin column放置於收集小管中。離心2分鐘(17,970×g)倒除流出液後，加入300μL的結合試劑至spin column，再離心2分鐘(17,970×g)，倒除流出液。之後，再加入700μL的清洗試劑(Wash solution)至spin column，經離心2分鐘(17,970×g)後，倒除流出液，並重複上述步驟一次。最後以17,970×g之條件離心5分鐘，去除殘留酒精。將spin column放入一滅菌微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流DNA。
使用Quant-iTTM dsDNA High-Sensitivity Assay Kit(Invitrogen,Madison,USA)搭配Qubit Fluorometer分光光度儀(Invitrogen,Madison,USA)定量黴漿菌染色體DNA之濃度。操作程序如下，首先以1：200比例將Quant-iT試劑與Quant-iT緩衝液混合成工作試劑(Working Solution)。取190μL的工作試劑加入10μL的標準樣本，混合均勻後，於室溫下靜置2分鐘，以Qubit Fluorometer分光光度儀建立標準曲線。之後將2μL的樣品與198μL的工作試劑混合均勻後，靜置2分鐘，以Qubit Fluorometer分光光度儀測定染色體DNA濃度。染色體濃度(ng/μL)計算公式為測量值×100。
2. 以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)進行標的基因之擴增
以豬肺炎黴漿菌染色體作為模板，分別使用針對P46基因、Tuf基因、MHP30、及NrdFC基因設計之引子來進行PCR反應，各引子及PCR反應條件係如下表二中所示(引子序列如上表一中所示)；其中50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，200ng豬肺炎黴漿菌染色體及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。
Figure TWI615402BD00002
3. PCR產物之回收及選殖
利用PCR-MTM Clean Up system kit(GeneMark,Taiwan；操作方法係依據產品使用說明，不再贅述)進行PCR產物之回 收，接著使用CloneJET PCR Cloning Kit來進行選殖。選殖之實驗步驟係參考廠商提供之操作手冊進行。略述如下：將回收純化之PCR產物與套組所附試劑及DNA接合酶(ligase)混合均勻後，於22℃反應30分鐘進行黏合反應。將黏合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌ECOSTM 9-5(Yeastern,Taiwan)中，轉形之條件依廠商提供之流程進行。將轉形後之菌體加入1mL SOC再生培養液中，於37℃、250rpm之條件下震盪60分鐘。之後，取適量菌液塗佈於含安比西林(ampicillin,100μg/mL)之LB固態培養基上，於37℃下培養16小時。之後，以菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應實驗步驟如下所述。首先，先準備一微量離心管加入50μL 2×Taq PCR MasterMix(Genomics,Taiwan)、0.5μL增幅標的基因用之前置引子(forward primer)、0.5μL增幅標的基因用之反置引子(reverse primer)及49μL滅菌水，均勻混合後，分裝於PCR小管(10μL/管)。隨後再挑取培養皿上的菌落至PCR小管中，進行PCR反應。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃，反應X分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。其中X值為DNA聚合酶延展時間，依照增幅之片段大小設定此值。Taq DNA polymerase之延展速率為1kb/min，若欲增幅1kb大小之DNA片段，則將X值設定為1分鐘。PCR反應結束後，以瓊脂醣膠體電泳觀察PCR之結果。以colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有外插之DNA(insert DNA)後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將含有MHP30基因、P46基因、NrdFC基因及Tuf基因之質體分別命名為pJET-MHP30、pJET-P46、pJET-NrdFC及pJET-Tuf。
DNA定序結果獲得P46的胺基酸序列及核苷酸序列分別 如SEQ ID NO 01及SEQ ID NO 05中所示；Tuf的胺基酸序列及核苷酸序列分別如SEQ ID NO 02及SEQ ID NO 06中所示；MHP30的胺基酸序列及核苷酸序列分別如SEQ ID NO 03及SEQ ID NO 07中所示；NrdFC的胺基酸序列及核苷酸序列分別如SEQ ID NO 04及SEQ ID NO 08中所示。
實施例三：P46基因之定點突變及選殖
P46基因中帶有3個TGA codon。TGA codon在黴漿菌中可被轉譯為色胺酸(tryptophan)，但在大腸桿菌中則被視為停止碼(stop codon)。為了避免無法利用大腸桿菌表現系統生產全長蛋白質，必須針對P46基因中的TGA密碼子進行點突變，將其替換為大腸桿菌可以辨識並轉譯為色胺酸的密碼子(替換為TGG)。
進行點突變所需之突變引子的設計原則包括突變點位於引子中央及引子之Tm值溫度需高於78℃。突變引子之Tm值以Invitrogene公司提供之公式Tm=81.5+0.41(%GC)-675/N-%mismatch計算，公式中之%GC為GC在引子核苷酸中所佔的百分比；N為引子長度；%mismatch為突變base在引子核苷酸中所佔的百分比。P46基因的點突變程序共使用了如下表三中所述的引子對，包括P46F/P46M2、P46M1/P46M4、P46M3/P46M6及P46M5/P46R之組合：
Figure TWI615402BD00003
Figure TWI615402BD00004
在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pJET-P46及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應45秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。
PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-MTM gel extraction system kit回收。操作方式係依據產品使用手冊。之後，以回收之四個PCR產物作為模版，利用P46F/P46R引子組合進行基因增幅。PCR反應之條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應45秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。經此步驟後，即可獲得全長定點突變之P46基因。利用PCR-MTM Clean Up system kit(GeneMark,Taiwan) 進行PCR產物之回收。利用CloneJET PCR Cloning Kit進行突變基因之選殖。以colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA(insert DNA)後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將含有突變P46基因之質體命名為pJET-P46M。
實施例四：本發明之豬肺炎黴漿菌抗原表現質體的建構
以含有不同融合伴子(fusion partner)基因之質體為骨架進行豬肺炎黴漿菌抗原表現質體之建構。融合夥伴基因分別為大腸桿菌之msyB、yjgD及GroS之17個胺基酸(GroS17)之DNA序列；枯草桿菌(Bacillus subtilis)之groES；酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicylobacillus acidocaldarius)trxA經密碼子最適化之合成基因；麵包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之SUMO基因；噬菌體phiX174 D蛋白質之基因；透明顫菌(Vitreoscilla sp.)之血紅蛋白質基因vgb。表現質體之建構流程如下所述：
1. MHP30表現質體之建構
將pJET-MHP30以BamHI及SalI剪切後，利用T4 DNA ligase將DNA片段接入以相同限制酶剪切之融合表現質體中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體分別命名為pET-MSY-MHP30、pET-YjgD-MHP30、pET-GroS17-MHP30、pET-GroES-MHP30、pET-TrxA-MHP30、pET-SUMO-MHP30、pET-D-MHP30、pET-Vgb-MHP30。
2. P46表現質體之建構
將pJET-P46M以BamHI及SalI剪切後，依據前述MHP30表現質體之建構步驟來進行實驗，並將取得且確認無誤之質體分別命名為pET-D-P46M及pET-MSY-P46M。
3. NrdFC表現質體之建構
將pJET-NrdFC以BamHI及SalI剪切後，依據前述MHP30表現質體之建構步驟來進行實驗，並將取得且確認無誤之質體分別命名為pET-D-NrdFC及pET-MSY-NrdFC。
4. Tuf表現質體之建構
將pJET-Tuf以BamHI及SalI剪切後，依據前述MHP30表現質體之建構步驟來進行實驗，並將取得且確認無誤之質體分別命名為pET-D-Tuf及pET-MSY-Tuf。
實施例五：重組豬肺炎黴漿菌抗原之表現及純化
在表現抗原的部分：將抗原表現質體轉形入E.coli BL21(DE3)中。挑取單一菌落接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，於37℃、180rpm之條件下進行培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)之LB培養基中，振盪培養(37℃，180rpm)至OD600約為0.6~0.8左右，以0.1mM IPTG進行蛋白質之誘導表現，誘導4小時後，離心(10,000×g，10分鐘，4℃)並收集菌體部分，再以Easy-Lyse Bacterial Protein Extraction套組(Epicentre,USA)進行可溶性蛋白質及不可溶性蛋白質之劃分(即，可溶性與否)。利用蛋白質電泳觀察重組抗原之可溶性表現情形。
請參第一圖及第二圖，其分別顯示使用不同融合伴子於表現MHP30，對於MHP30的可溶性的影響；及使用不同融合伴子於表現P46、NrdFC及Tuf，對於該些蛋白質的可溶性的影響。結果顯示使用YjgD、SUMO、GroS17、GroES、Vgb、及TrxA作為融合伴子可提高MHP30的可溶性。另一方面，P46、NrdFC及Tuf在使用MsyB作為融合伴子時，也具有優異的可溶性。
在純化抗原的部分：利用重組蛋白質N端之His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和層析法(immobilized-metal affinity chromatography,IMAC)進行蛋白質純化。蛋白質純化之方式依照The QIAexpressionistTM(fourth edition,Qiagen)所述之方法進行。將菌體懸浮於Lysis buffer(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,10mM imidazole,pH 8.0)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後。離心(8,000×g，15分鐘)收集上清液部分。將上清液注入含有1mL Ni-NTA樹脂之管柱中，此階段重組抗原會結合至樹脂上。之後加入15mL之清洗緩衝液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8.0)洗滌樹脂，以洗除非特異性結合之蛋白質。最後加入20mL的溶離緩衝液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM imidazole,pH 8.0)沖提樹脂上的重組抗原，其係藉助高濃度的imidazole與重組蛋白質競爭樹脂結合部位，致使重組抗原自樹脂上被沖提下來。利用蛋白質電泳觀察重組抗原之純化情形。第三圖顯示確實可利用本發明之重組抗原N端所標記的His tag，經由固定化金屬離子親和層析法來純化得到本發明的重組抗原。
實施例六：小鼠抗血清試驗
本實施例使用五週齡的BALB/c雌小鼠(國家動物實驗中心)。將小鼠飼養在具備空調設備的標準動物房中，並供應飼料及乾淨飲水。於飼養7天後開始進行免疫試驗。將前述實施例中純化的重組抗原(100μg)與佐劑(弗氏完全或不完全佐劑)以三向接頭混合均勻後，利用皮下注射之方式將佐劑/抗原混合液注射至小鼠體內。第一次注射含弗氏完全佐劑之乳化疫苗，爾後每隔7天注射一次含弗氏不完全佐劑之乳化疫苗，連續兩次。於第二次注射後7天，以眼窩採血之方式進行血液之收集。
將取得的血液放置在室溫1小時後，再於4℃下放置隔夜，使血液凝固。接著，離心(5,000×g)凝固的血液30分鐘，以獲得抗血清。此抗血清中即含有針對重組抗原之特異性抗體。
接著，使用所得之抗血清偵測豬肺炎黴漿菌的全細胞萃取物(total cell lysate)。實驗步驟略述為：將豬肺炎黴漿菌PRIT-5之菌體懸浮於SET緩衝液(50mM glucose,25mM-HCl,10mM EDTA,pH 8.0)中，加入5倍的樣本緩衝液[312.5mM Tris-HCl(pH 6.8),50% glycerol,10% SDS,0.05% bromophenol blue]，於混合均勻後，將樣品放置於100℃下加熱5分鐘。接著，將樣品裝載至樣品槽中進行蛋白質電泳。電泳完畢後，將膠片浸泡於轉印緩衝液中[25mM Tris base,192mM glycine,10%(v/v)methanol,pH 8.3]。剪取適當大小之PVDF膜，以甲醇浸潤數秒後，用去離子水沖洗一遍，再浸泡於轉印緩衝液中。膠體與PVDF膜於轉印緩衝液中浸泡15分鐘後，依濾紙、膠片、PVDF膜、濾紙之順序放入半乾式轉漬器中，於適當電流下進行轉印。待轉印完成後，將PVDF膜浸泡於20mL的填塞緩衝液(20mM Tris,150mM NaCl,5% skim milk,pH7.4)中。於室溫下填塞一小時後，加入10μL重組抗原之抗血清(稀釋2000倍)，於室 溫下震盪1小時。之後，將填塞緩衝液倒除，以20mL TBST緩衝液(20mM Tris,150mM NaCl,0.05% Tween-20,pH7.4)洗滌PVDF膜，重複進行洗滌三次(5分鐘/次)。加入20mL的填塞緩衝液以及4μL鹼性磷酸酵素共軛山羊抗鼠抗體(alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)，於室溫下震盪1小時。以TBST緩衝液洗滌PVDF膜三次，即可加入NBT/BCIP溶液進行呈色反應。
實驗結果顯示，本發明之重組抗原與適當佐劑混合後，確實可以誘發小鼠產生抗抗原之抗體(anti-antigen antibody)，意味著本發明之蛋白質確實可以作為免疫原(immunogen)(第四圖)。
實施例七：豬隻免疫試驗及攻毒試驗 1. 疫苗製備
分別將一種或多種前述實施例中純化的重組抗原與佐劑均勻混合後，製成次單位疫苗或雞尾酒疫苗。疫苗每劑之劑量為2mL，每劑每種蛋白質之含量為200μg。
2. 豬隻免疫試驗
以次單位疫苗及雞尾酒疫苗進行豬隻免疫試驗。由台灣動物科技研究所二代SPF豬舍所購入之2週齡SPF豬隻，所有豬隻均飼養於SPF實驗豬舍待用，使用的飼料、飼養環境及條件均相同。
於豬隻21日齡時，以肌肉注射方式施予2mL的前述疫苗。再分別於21、42、70及98日齡時，進行採血並分離血清。利用IDEXX黴漿菌抗體試驗套組進行血清抗體分析。操作步驟 如下所述。首先將10μL血清與390μL樣品稀釋液(Sample Diluent)混和均勻後，取100μL稀釋液放入已包覆豬肺炎黴漿菌抗原之96孔盤中。同時，取100μL陽性血清及100μL陰性血清放入不同之孔洞中。於室溫下放置30分鐘後，將多孔微盤之液體倒除，並加入350μL洗滌溶液重複進行三次清洗程序。取100μL山葵過氧化酶標示抗豬抗體加入96孔盤中，於室溫下放置30分鐘。之後，將多孔微盤中的液體倒除，加入350μL的洗滌溶液重複進行三次清洗程序。取100μL的TMB受質溶液加入96孔盤中，於室溫下放置15分鐘後，再加入100μL停止溶液終止呈色反應。最後，以ELISA讀取器於650nm下測定每孔盤之吸光值，並利用讀取值計算S/P值。S/P值=(試驗組之OD650值-陰性對照組之OD650值)/(陽性對照組之OD650值-陰性對照組之OD650值)。當S/P值越大，代表抗豬肺炎黴漿菌蛋白質之抗體越多。實驗結果顯示，本發明之抗原皆得以誘發免疫反應，其中又以P46疫苗及雞尾酒疫苗組(即同時含有P46、Tuf、MHP30、及NrdFC抗原的4蛋白質疫苗組)的誘發效果最為顯著，且其誘發之免疫反應可維持至14週齡(第五圖)。
3.攻毒試驗
本實驗採用以M.hyopneumoniae PRIT-5所製成之疫苗Bayovac® MH-PRIT-5作為實驗中的控制組，以評估前述製得之次單位疫苗及雞尾酒疫苗的免疫效果。由台灣動物科技研究所二代SPF豬舍所購入之4週齡SPF豬隻，所有豬隻均飼養於SPF實驗豬舍待用，使用的飼料、飼養環境及條件均相同。
用於進行攻毒試驗的黴漿菌液的製備方法概略為：擷取一塊經黴漿菌感染之豬隻的肺臟(約3×3cm2)，於20mL的Friis培養基中將肺臟組織磨碎，再以148.8×g的轉速離心10分鐘。 收集上清液到另一乾淨的離心管中，再以7,870×g的轉速離心40分鐘。接著，去除上清液，以6mL的Friis培養基將離心管中的沉澱物製為懸浮液。然後，依序以5μm、及0.45μm過濾膜過濾前述懸浮液，即製得本實驗所需之攻毒菌液。
於實驗豬隻35日齡時，以肌肉注射方式施予2mL前述疫苗。於49日齡時，以相同方式再次進行豬隻免疫試驗。經疫苗免疫之豬隻在63日齡時，以氣管攻毒的方式，將前述攻毒菌液(5mL)打入經麻醉之實驗豬隻的氣管。攻毒28天後，將豬隻犧牲並進行解剖，取出實驗豬隻的肺部以評估免疫效果。病變點數的評估方式是，左右心葉及左右尖葉若有病變，則分別記為10分；心尖葉及左右膈葉若有病變，則分別記為5分，總分為55分。實驗結果如下表四中所載。
Figure TWI615402BD00005
由表四中所載實驗數據可知，使用單一種本發明之抗原所製得的次單位疫苗皆有與習用疫苗相去不遠的免疫效果，而本發明之雞尾酒疫苗(即同時含有P46、Tuf、MHP30、及NrdFC抗原的4蛋白質疫苗組)的免疫效果則顯著地優於習用疫苗。 總結而言，本發明之蛋白質確實都可以作為疫苗的活性成分使用，而本發明並證實了該些蛋白質於雞尾酒疫苗的形式下產生了加乘的免疫效果。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。
<110> 財團法人台灣動物科技研究所
<120> 防治黴漿菌感染的組合物
<130>
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 1
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Claims (5)

  1. 一種防治黴漿菌感染的組合物，其包含：一第一活性成分，其包含Tuf；一第二活性成分，其包含P46、MHP30、NrdFC、或其組合之蛋白質及一生物可接受之佐劑；其中前述Tuf、P46、MHP30及NrdFC分別具有SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：03及SEQ ID NO：04所示之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中前述第一活性成分及/或前述第二活性成分的濃度為20至2000μg/mL，其係以前述組合物的總體積為基礎。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中前述生物可接受之佐劑為：弗氏完全或不完全佐劑、鋁膠、界面活性劑、聚陰離子、肽、油乳液或其組合。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其進一步包含一生物可接受之添加劑。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之組合物，其中前述生物可接受之添加劑為溶劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑或其組合。
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