CN110302368A

CN110302368A - 防治霉浆菌感染的组合物

Info

Publication number: CN110302368A
Application number: CN201910700345.0A
Authority: CN
Inventors: 林俊宏; 王志鹏; 陈正文; 方健宇; 谢明伟; 杨平政
Original assignee: Agricultural Technology Research Institute
Current assignee: Agricultural Technology Research Institute
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: EP3072523B1; BR112016010427B1; KR20160060771A; UA116697C2; EP3072523A4; MX2016006643A; US20160264631A1; CN105792841B; MX368864B; KR101842081B1; WO2015074213A8; CN105792841A; ES2714000T3; RU2646137C2; US20180208629A1; DK3072523T3; US9951109B2; BR112016010427A2; TW201520222A; WO2015074213A1

Abstract

提供了作为抗霉浆菌的亚单位疫苗的活性成分的蛋白质及其制备的疫苗。所述疫苗含有P46、Tuf，或其组合的蛋白质，进一步还可包含MHP30、NrdFC，或其组合的蛋白。

Description

防治霉浆菌感染的组合物

本发明是申请日为2013年11月21日、申请号为201380081053.4(国际申请号：PCT/CN2013/087599)、发明名称为“防治霉浆菌感染的组合物”的分案申请，通过引用将其全部内容结合到本发明。

技术领域

本发明关于一种抗猪霉浆菌的疫苗，尤指一种抗猪霉浆菌的亚单位疫苗(SubunitVaccine)。

背景技术

霉浆菌(Mycoplasma spp.)是目前所知能在细胞外自行复制的最小细菌，其引发的猪霉浆菌肺炎虽然不会造成猪只的高死亡率，但会降低饲料换肉率、导致生长发育迟缓、造成发炎性反应及免疫抑制作用、及引起其它诸多细菌性病原的感染，因而使养猪业者蒙受严重的经济损失。

目前对于猪霉浆菌肺炎的防治方式有三种，包括：药物投予、饲养管理及疫苗接种。由于抗生素对于猪肺炎霉浆菌的预防效果不佳，因此药物投予的策略仅限于治疗目的，难以达到预防的效果。此外，考虑到药物滥用可能引发更大规模的抗药性菌种的感染，采用药物投予不仅需要更多的规划，同时面临诸多极限。

良好的饲养管理是防治猪霉浆菌感染的根本方法。优良的猪舍环境卫生质量及妥善的饲养管理有助于减少感染的发生。从另一方面来说，配合疫苗接种更可使整体的防疫工作更加完善。

领域中现行使用的疫苗是以不活化死菌作为疫苗的活性成分。然而，因为霉浆菌为营养苛求性菌(fastidious bacteria)而不容易以人工培养，造成霉浆菌疫苗的价格居高不下。为了降低霉浆菌疫苗的成本，学者不断研究以不同的策略来研发疫苗，包括：(1)减毒疫苗、(2)载体疫苗、(3)亚单位疫苗、及(4)DNA疫苗；其中，亚单位疫苗因具有容易生产及安全性高的优点，而最具应用潜力。

目前已知部分可研制为猪霉浆菌亚单位疫苗的可能候选抗原，但截至今日，领域中仍尚未有研究报告完整地提出适用于猪霉浆菌亚单位疫苗的抗原。

发明内容

于是，本发明的一目的为提供适用于猪霉浆菌亚单位疫苗的抗原，并据以制得亚单位疫苗，以降低防疫成本。

本发明的又一目的为组合本发明所得的适用于猪霉浆菌亚单位疫苗的抗原，以制得效果更优良的亚单位疫苗，提供防疫工作更多样化的选择。

为达到上述目的，本发明提供一种防治霉浆菌感染的蛋白质，其具有SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、或其组合所示的氨基酸序列。

本发明另提供一种防治霉浆菌感染的组合物，其包含：

第一活性成分，其包含P46、Tuf、或其组合的蛋白质；及

生物可接受的佐剂。

较佳地，前述第一活性成分具有SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、或其组合所示的氨基酸序列。

较佳地，前述组合物进一步包含第二活性成分，其包含MHP30、NrdFC、或其组合的蛋白质。

较佳地，前述第二活性成分具有SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、或其组合所示的氨基酸序列。

较佳地，前述第一活性成分和/或前述第二活性成分的浓度为20至2000μg/mL，其是以前述组合物的总体积为基础。

本发明又提供一种防治霉浆菌感染的组合物，其包含：

活性成分，其包含下列群组的蛋白质的至少两种：P46、Tuf、MHP30、及NrdFC；及

生物可接受的佐剂。

较佳地，前述活性成分为P46、Tuf、MHP30、及NrdFC。

较佳地，前述活性成分具有下列群组的氨基酸序列的至少两种：SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、及SEQ ID NO：04。

较佳地，前述活性成分具有SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、及SEQID NO：04所示的氨基酸序列。

较佳地，前述活性成分的浓度为20至2000μg/mL，其是以前述组合物的总体积为基础。

较佳地，前述生物可接受的佐剂为：弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳液或其组合。

较佳地，前述组合物进一步包含生物可接受的添加剂。

较佳地，前述生物可接受的添加剂为溶剂、安定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂、等张剂、吸收延缓剂或其组合。

本发明再提供一种表达载体，其是用于制备前述组合物中的活性成分，前述表达载体包含质粒；其中前述质粒包含：

核苷酸序列，其是选自下列群组的核苷酸序列中的至少一个：SEQ ID NO：05、SEQID NO：06、SEQ ID NO：07、及SEQ ID NO：08；

融合伴侣基因，其是选自于由大肠杆菌的MsyB基因、大肠杆菌的YjgD基因、大肠杆菌的GroS17基因、枯草杆菌的GroES基因、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的TrxA基因、啤酒酵母菌的SUMO基因、及透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的Vgb基因所组成的群组；及

调控元件。

较佳地，前述调控元件包含启动子及核糖体结合部位。

较佳地，前述质粒为pET-MSY、pET-YjgD、pET-GroS17、pET-GroES、pET-TrxA、pET-SUMO、或pET-Vgb。

较佳地，当前述核苷酸序列选自下列群组的核苷酸序列中的至少一个：SEQ IDNO：05、SEQ ID NO：06、及SEQ ID NO：08时，前述融合伴侣基因为大肠杆菌的MsyB基因。

较佳地，当前述核苷酸序列为SEQ ID NO：07时，前述融合伴侣基因选自于由大肠杆菌的YjgD基因、大肠杆菌的GroS17基因、枯草杆菌的GroES基因、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的TrxA基因、啤酒酵母菌的SUMO基因、及透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的Vgb基因所组成的群组。

较佳地，前述表达载体是利用于大肠杆菌表达系统。

本发明又提供一种生产可溶性抗原的方法，其包含使用前述表达载体；其中前述抗原为霉浆菌的P46、Tuf、MHP30、或NrdFC。

综上所述，本发明关于用于防治猪霉浆菌感染的抗原、组合物、及用于制备该抗原的质粒。本发明的揭露内容不仅提供猪霉浆菌防疫工作的新选择，更揭示组合两种以上抗原的“鸡尾酒”亚单位疫苗(即，含有两种以上的抗原作为活性成分)具有更加强的免疫诱发效果。此外，本发明的研究成果并指出了特别合适用于辅助抗猪霉浆菌的抗原于表达系统中表达的融合伴侣基因，有助于提升疫苗制备上的产能。

附图说明

图1为一蛋白质电泳图谱，其显示使用不同的融合伴侣对于所产出的MHP3的可溶性影响。M行：蛋白质marker(PageRulerTMpretained protein ladder；Fermentas,USA)；第1行：E.coli BL21(DE3)(pET-YjgD-MHP30)可溶性蛋白质；第2行：E.coli BL21(DE3)(pET-SUMO-MHP30)可溶性蛋白质；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-GroS17-MHP30)可溶性蛋白质；第4行：E.coli BL21(DE3)(pET-GroES-MHP30)可溶性蛋白质；第5行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-MHP30)可溶性蛋白质；第6行：E.coli BL21(DE3)(pET-MsyB-MHP30)可溶性蛋白质；第7行：E.coli BL21(DE3)(pET-Vgb-MHP30)可溶性蛋白质；第8行：E.coli BL21(DE3)(pET-TrxA-MHP30)可溶性蛋白质。

图2为一蛋白质电泳图谱，其显示使用不同的融合伴侣对于所产出的P46、NrdFC及Tuf的可溶性影响。M行：蛋白质marker(PageRulerTMpretained protein ladder；Fermentas,USA)；第1行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-P46M)可溶性蛋白质；第2行：E.coliBL21(DE3)(pET-D-P46M)不可溶性蛋白质；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-NrdFC)可溶性蛋白质；第4行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-NrdFC)不可溶性蛋白质；第5行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-Tuf)可溶性蛋白质；第6行：E.coli BL21(DE3)(pET-D-Tuf)不可溶性蛋白质；第7行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-P46M)可溶性蛋白质；第8行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-P46M)不可溶性蛋白质；第9行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-NrdFC)可溶性蛋白质；第10行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-NrdFC)不可溶性蛋白质；第11行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-Tuf)可溶性蛋白质；第12行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-Tuf)不可溶性蛋白质。

图3为一蛋白质电泳图谱，其显示本发明的MHP30、P46、NrdFC及Tuf重组蛋白的纯化结果。M行：蛋白质marker(PageRulerTMpretained protein ladder；Fermentas,USA)；第1行：E.coli BL21(DE3)(pET-YjgD-MHP30)可溶性蛋白质；第2行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-P46M)可溶性蛋白质；第3行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-NrdFC)可溶性蛋白质；第4行：E.coli BL21(DE3)(pET-MysB-Tuf)可溶性蛋白质；第5行：纯化MHP30融合蛋白质；第6行：纯化P46融合蛋白质；第7行：纯化NrdFC融合蛋白质；第8行：纯化Tuf融合蛋白质。

图4为一蛋白质印迹法(Western blot)试验，其显示以小鼠的抗血清侦测猪肺炎霉浆菌的全细胞萃取物的结果。

图5为一ELISA试验结果，其显示本发明实施例七的猪只免疫试验结果。

具体实施方式

本发明关于用于防治猪霉浆菌感染的抗原、组合物、及用于制备该抗原的质粒。更明确地说，本发明的研究成果证实了P46及Tuf这两个蛋白质的抗原性质可运用于制备防治猪霉浆菌感染的组合物。此外，本发明并证实了以“鸡尾酒”形式混合两种以上的P46、Tuf、MHP30、或NrdFC作为疫苗的活性成分，有助于提升诱发免疫的效果。另一方面，本发明揭露了特别合适使用于生产P46、Tuf、MHP30、及NrdFC等蛋白质的融合伴侣，其可显著地制得具高度可溶性(即，水溶性)的前述蛋白质，而大幅度的节省疫苗制备过程中所需的时间及成本。

在本发明的一个面向中，本发明提供一种防治霉浆菌感染的组合物，其包含：第一活性成分，其包含P46、Tuf、或其组合的蛋白质；及生物可接受的佐剂。在一可行实施态样中，前述组合物可进一步包含第二活性成分，且前述第二活性成分包含MHP30、NrdFC、或其组合的蛋白质。

在本发明的另一个面向中，本发明提供一种防治霉浆菌感染的组合物，其包含：活性成分，其包含下列群组的蛋白质的至少两种：P46、Tuf、MHP30、及NrdFC；及生物可接受的佐剂。

在本发明的一个可行实施态样中，前述P46对应具有SEQ ID NO：01所示的氨基酸序列；前述Tuf对应具有SEQ ID NO：02所示的氨基酸序列；前述MHP30对应具有SEQ ID NO：03所示的氨基酸序列；前述NrdFC对应具有SEQ ID NO：04所示的氨基酸序列。所属领域技术人员应可以理解，只要不影响前述蛋白质的抗原决定区域，前述氨基酸序列可容许相当程度的变动。在一个可行实施态样中，只要不破坏前述氨基酸序列折叠(folding)后应具有的抗原决定区域，前述活性成分可为具有任两个以上的前述氨基酸序列的融合蛋白质。

一般而言，于单一疫苗中组合两种以上的抗原并不一定对该疫苗的免疫诱发效果具有加乘的效果。于单一疫苗中组合两种以上的抗原可能反而会使得该两种以上的抗原于免疫诱发的能力产生相互抵销的不利状况。另从成本的角度来思考，即便这两种以上的抗原的免疫诱发的能力不会产生抵销，若不能具有加乘的效果，则也不值得将该两种以上的抗原混合于单一疫苗中。本发明实验证实前述P46、Tuf、MHP30、及NrdFC在混合使用下可具有更好的免疫诱发效果，因此，在一个可行实施态样中，本发明的组合物中的前述活性成分包含任两个以上的前述蛋白质，此即为本发明所述的鸡尾酒疫苗。

本发明的组合物中的活性成分的总和浓度为20至2000μg/mL，其是以前述组合物的总体积为基础。在本发明的一个较佳实施态样中，单一种前述活性成分的浓度为20至500μg/mL，其是以前述疫苗的总体积为基础。在本发明的一个可行实施态样中，本发明组合物中含有一个以上的前述活性成分，其中活性成分的总和浓度为：20至1000μg/mL、20至1500μg/mL、或20至2000μg/mL，其是以前述组合物的总体积为基础。

前述生物可接受的佐剂是用以增加活性成分的免疫效果、维持活性成分的稳定性、及提升所述组合物于疫苗用途上的安全性。本发明所述的生物可接受的佐剂包括，但不限于：弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳液或其组合。

本发明的另一面向为一种表达载体。更明确地，其是运用于大肠杆菌表达系统的表达载体。换而言之，可于大肠杆菌表达系统转译为所需蛋白质的氨基酸序列，并据以折叠(folding)为本发明的组合物所需的活性成分。然而，依据本发明的精神，所属领域技术人员当可参酌本发明说明书的揭露内容，进行变化(例如，针对不同的密码子转译偏好(CodonUsage)而进行序列的微调)以适用于不同的表达系统，而仍属于本发明的范畴。

本发明的又一面向为一种使用前述表达载体于表达用于防治霉浆菌感染的蛋白质的方法。以往领域中使用的表达载体所生产的蛋白质具有可溶性不佳的缺点，因此需要以尿素及盐酸胍(guanidinium hydrochloride)进行溶解及透析处理来纯化得到产物。然而这样的处理程序不仅增加生产成本，也会造成所生产的蛋白质变性，而需要使该变性的蛋白质进行重新折叠，才得以执行抗原的角色。在重新折叠的过程中会具有相当比例的错误折叠，因而削弱了该些蛋白质作为抗原的效果。有鉴于前述惯用技术中的不足，本发明方法的优势在于寻找出特别适合的融合伴侣，而使得生产的用于防治霉浆菌感染的蛋白质具有优异的可溶性，因此得以节省成本、简化步骤、及提高所生产的蛋白质作为疫苗的活性成分使用的效果。

在本发明的一个可行实施态样中，前述表达载体包含质粒。前述质粒包含：核苷酸序列、融合伴侣基因、及调控元件。前述核苷酸序列选自下列群组的核苷酸序列中的至少一个：SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：07、及SEQ ID NO：08，其分别用于表达出P46、Tuf、MHP30、及NrdFC。

在一个可行的实施态样中，于不影响所用表达系统的正常运作，也不影响个别前述核苷酸序列于其中的生产及后续氨基酸序列的折叠的前提下，前述质粒可包含两个以上的前述核苷酸序列。

前述融合伴侣基因是选自于由大肠杆菌的MsyB基因、大肠杆菌的YjgD基因、大肠杆菌的GroS17基因、枯草杆菌的GroES基因、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的TrxA基因、啤酒酵母菌的SUMO基因、及透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的Vgb基因所组成的群组。

前述调控元件是指于表达系统中所需的启动转录及转译程序所需的元件。前述调控元件至少应包含启动子(promoter)及核糖体结合部位。较佳地，前述调控元件可额外包含：操纵子(operator)、转录/转译的加强子序列(enhancer sequences)、或其组合。

以下实施例谨记载本发明研发所进行的试验，以进一步释明本发明的特征与优点。惟需理解的是，所列实施例仅是示范性地例示所请发明，不应用于限制本发明的申请专利范围。

实施例一：菌种及其培养

目前研究显示，由猪只中分离出来的霉浆菌共有七种：猪肺炎霉浆菌(Mycoplasmhyopneumoniae)、猪鼻霉浆菌(Mycoplasma hyorhinis)、猪滑液霉浆菌(Mycoplasmahyosynoviae)、猪絮状霉浆菌(Mycoplasma flocculare)、猪喉霉浆菌(Mycoplasmahyopharyngis)、猪肠霉浆菌(Mycoplasma sualvi)及牛生殖道霉浆菌(Mycoplasmabovigenitalium)(Gourlay et al.,1978；Blank et al.,1996；Assuncao et al.,2005)；其中猪肺炎霉浆菌是最主要造成猪霉浆菌肺炎的病原，感染率约在25％至93％之间。因此本发明以猪肺炎霉浆菌(M.hyopneumoniae PRIT-5)做为抗原基因的来源。此外，本实验中使用Escherichia coli JM109做为基因选殖(克隆)用的宿主细胞，并以Escherichia coliBL21(DE3)作为蛋白质表达用的宿主细胞。

以Friis培养基(Friis et al.,1975)进行猪霉浆菌的培养。以LB(Luria-Bertani)培养基(Difco,USA)进行大肠杆菌的培养。依实验需求，于培养基中加入适当适量的抗生素或加入1.5％琼脂配制成固体培养基。

实施例二：猪肺炎霉浆菌抗原基因的选殖

针对不同的抗原基因设计特异性引物(表一)。以猪肺炎霉浆菌染色体作为模板，利用特异性引物组合进行目标基因的扩增。有关基因扩增及选殖的步骤如下所述：

表一：目标基因的扩增所用引物对

1.猪肺炎霉浆菌染色体的提取

利用DNA纯化套组(Tissue&Cell Genomic DNA Purification kit；GeneMark,Taiwan)进行霉浆菌染色体的提取。首先取4.5mL的培养菌液至离心管中，经离心(5,870×g,5分钟)后，倒除上清液，收集菌体部分。接着加入20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)及200μL的萃取试剂，于56℃下作用3小时，其中每5分钟便轻缓地上下摇晃以使菌体与试剂充分混合。

经萃取试剂作用后，菌体会完全分解呈现澄清状。之后，加入200μL的结合试剂(Binding solution)并于70℃下作用10分钟。反应结束后，加入200μL的无水酒精至微量离心管中并均匀混合，吸取所有溶液(包括沉淀物)至spin column，并将spin column放置于收集小管中。离心2分钟(17,970×g)倒除流出液后，加入300μL的结合试剂至spin column，再离心2分钟(17,970×g)，倒除流出液。之后，再加入700μL的清洗试剂(Wash solution)至spin column，经离心2分钟(17,970×g)后，倒除流出液，并重复上述步骤一次。最后以17,970×g之条件离心5分钟，去除残留酒精。将spin column放入一灭菌微量离心管中，加入适量无菌去离子水引流DNA。

使用Quant-iT^TM dsDNA High-Sensitivity Assay Kit(Invitrogen,Madison,USA)搭配Qubit Fluorometer分光光度仪(Invitrogen,Madison,USA)定量霉浆菌染色体DNA的浓度。操作程序如下，首先以1:200比例将Quant-iT试剂与Quant-iT缓冲液混合成工作试剂(Working Solution)。取190μL的工作试剂加入10μL的标准样本，混合均匀后，于室温下静置2分钟，以Qubit Fluorometer分光光度仪建立标准曲线。之后将2μL的样品与198μL的工作试剂混合均匀后，静置2分钟，以Qubit Fluorometer分光光度仪测定染色体DNA浓度。染色体浓度(ng/μL)计算公式为测量值×100。

2.以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)进行目标基因的扩增

以猪肺炎霉浆菌染色体作为模板，分别使用针对P46基因、Tuf基因、MHP30、及NrdFC基因设计的引物来进行PCR反应，各引物及PCR反应条件如下表二中所示(引物序列如上表一中所示)；其中50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，200ng猪肺炎霉浆菌染色体及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应结束后，利用琼脂糖胶体电泳确认有无预估大小的DNA片段。

表二：PCR反应条件及引物对

3.PCR产物的回收及选殖

利用PCR-M^TM Clean Up system kit(GeneMark,Taiwan；操作方法是依据产品使用说明，不再赘述)进行PCR产物的回收，接着使用CloneJET PCR Cloning Kit来进行选殖。选殖的实验步骤参考厂商提供的操作手册进行。略述如下：将回收纯化的PCR产物与套组所附试剂及DNA连接酶(ligase)混合均匀后，于22℃反应30分钟进行黏合反应。将黏合混合物(ligation mixture)转形入大肠杆菌ECOS^TM 9-5(Yeastern,Taiwan)中，转形的条件依厂商提供的流程进行。将转形后的菌体加入1mL SOC再生培养液中，于37℃、250rpm的条件下震荡60分钟。之后，取适量菌液涂布于含安比西林(ampicillin,100μg/mL)的LB固态培养基上，于37℃下培养16小时。之后，以菌落聚合酶链式反应(colony PCR)筛选转形株。菌落聚合酶链式反应实验步骤如下所述。首先，先准备一微量离心管加入50μL 2×Taq PCRMasterMix(Genomics,Taiwan)、0.5μL扩增目标基因用的正向引物(forward primer)、0.5μL扩增目标基因用的反向引物(reverse primer)及49μL灭菌水，均匀混合后，分装于PCR小管(10μL/管)。随后再挑取培养皿上的菌落至PCR小管中，进行PCR反应。PCR反应条件为：95℃反应5分钟(1个步骤)；95℃反应30秒、55℃反应30秒、72℃，反应X分钟(25个循环)；72℃反应7分钟(1个步骤)。其中X值为DNA聚合酶延展时间，依照扩增的片段大小设定此值。TaqDNA聚合酶的延展速率为1kb/min，若欲扩增1kb大小的DNA片段，则将X值设定为1分钟。PCR反应结束后，以琼脂糖胶体电泳观察PCR的结果。以colony PCR确认转形株中的重组质粒带有外插的DNA(insert DNA)后，再提取转形株中的质粒并进行DNA定序。将含有MHP30基因、P46基因、NrdFC基因及Tuf基因的质粒分别命名为pJET-MHP30、pJET-P46、pJET-NrdFC及pJET-Tuf。

DNA定序结果获得P46的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：01及SEQ IDNO：05中所示；Tuf的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：02及SEQ ID NO：06中所示；MHP30的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：03及SEQ ID NO：07中所示；NrdFC的氨基酸序列及核苷酸序列分别如SEQ ID NO：04及SEQ ID NO：08中所示。

实施例三：P46基因的定点突变及选殖

P46基因中带有3个TGA密码子。TGA密码子在霉浆菌中可被转译为色氨酸(tryptophan)，但在大肠杆菌中则被视为终止密码子(stop codon)。为了避免无法利用大肠杆菌表达系统生产全长蛋白质，必须针对P46基因中的TGA密码子进行点突变，将其替换为大肠杆菌可以辨识并转译为色氨酸的密码子(替换为TGG)。

进行点突变所需的突变引物的设计原则包括突变点位于引物中央及引物的Tm值温度需高于78℃。突变引物的Tm值以Invitrogene公司提供的公式Tm＝81.5+0.41(％GC)-675/N-％mismatch计算，公式中的％GC为GC在引物核苷酸中所占的百分比；N为引物长度；％mismatch为突变碱基在引物核苷酸中所占的百分比。P46基因的点突变程序共使用了如下表三中所述的引物对，包括P46F/P46M2、P46M1/P46M4、P46M3/P46M6及P46M5/P46R的组合：

表三：P46基因的点突变程序所用引物

在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pJET-P46及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应的条件为98℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应45秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。

PCR反应结束后，利用琼脂糖胶体电泳确认有无预估大小的DNA片段。PCR产物以Gel-M^TM gel extraction system kit回收。操作方式是依据产品使用手册。之后，以回收的四个PCR产物作为模版，利用P46F/P46R引物组合进行基因扩增。PCR反应的条件为98℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应45秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。经此步骤后，即可获得全长定点突变的P46基因。利用PCR-M^TM Clean Up systemkit(GeneMark,Taiwan)进行PCR产物的回收。利用CloneJET PCR Cloning Kit进行突变基因的选殖。以colony PCR确认转形株中的重组质粒带有外插DNA(insert DNA)后，再提取转形株中的质粒并进行DNA定序。将含有突变P46基因的质粒命名为pJET-P46M。

实施例四：本发明的猪肺炎霉浆菌抗原表达质粒的构建

以含有不同融合伴侣(fusion partner)基因的质粒为骨架进行猪肺炎霉浆菌抗原表达质粒的构建。融合伙伴基因分别为大肠杆菌的msyB、yjgD及GroS的17个氨基酸(GroS17)的DNA序列；枯草杆菌(Bacillus subtilis)的groES；酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicylobacillus acidocaldarius)trxA经密码子最适化的合成基因；面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的SUMO基因；噬菌体phiX174D蛋白质的基因；透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白质基因vgb。表达质粒的构建流程如下所述：

1.MHP30表达质粒的构建

将pJET-MHP30以BamHI及SalI剪切后，利用T4DNA ligase将DNA片段接入以相同限制酶剪切的融合表达质粒中。将黏合产物转形入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应筛选转形株。利用DNA电泳确认有无预估大小的DNA片段。确认转形株中的重组质粒带有外插DNA后，再提取转形株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒分别命名为pET-MSY-MHP30、pET-YjgD-MHP30、pET-GroS17-MHP30、pET-GroES-MHP30、pET-TrxA-MHP30、pET-SUMO-MHP30、pET-D-MHP30、pET-Vgb-MHP30。

2.P46表达质粒的构建

将pJET-P46M以BamHI及SalI剪切后，依据前述MHP30表达质粒的构建步骤来进行实验，并将取得且确认无误的质粒分别命名为pET-D-P46M及pET-MSY-P46M。

3.NrdFC表达质粒的构建

将pJET-NrdFC以BamHI及SalI剪切后，依据前述MHP30表达质粒的构建步骤来进行实验，并将取得且确认无误的质粒分别命名为pET-D-NrdFC及pET-MSY-NrdFC。

4.Tuf表达质粒的构建

将pJET-Tuf以BamHI及SalI剪切后，依据前述MHP30表达质粒的构建步骤来进行实验，并将取得且确认无误的质粒分别命名为pET-D-Tuf及pET-MSY-Tuf。

实施例五：重组猪肺炎霉浆菌抗原的表达及纯化

在表达抗原的部分：将抗原表达质粒转形入E.coli BL21(DE3)中。挑取单一菌落接种于含有康那霉素(kanamycin)(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，于37℃、180rpm的条件下进行培养。经隔夜培养后，菌液以1：100的比例接种至含有康那霉素(kanamycin)(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，振荡培养(37℃，180rpm)至OD₆₀₀约为0.6～0.8左右，以0.1mM IPTG进行蛋白质的诱导表达，诱导4小时后，离心(10,000×g，10分钟，4℃)并收集菌体部分，再以Easy-Lyse Bacterial Protein Extraction套组(Epicentre,USA)进行可溶性蛋白质及不可溶性蛋白质的划分(即，可溶性与否)。利用蛋白质电泳观察重组抗原的可溶性表达情形。

请参图1及图2，其分别显示使用不同融合伴侣于表达MHP30，对于MHP30的可溶性的影响；及使用不同融合伴侣于表达P46、NrdFC及Tuf，对于该些蛋白质的可溶性的影响。结果显示使用YjgD、SUMO、GroS17、GroES、Vgb、及TrxA作为融合伴侣可提高MHP30的可溶性。另一方面，P46、NrdFC及Tuf在使用MsyB作为融合伴侣时，也具有优异的可溶性。

在纯化抗原的部分：利用重组蛋白质N端的His tag能与镍或钴离子形成配位共价键的特性，采用固定化金属离子亲和层析法(immobilized-metal affinitychromatography,IMAC)进行蛋白质纯化。蛋白质纯化的方式依照QIAexpressionist^TM(fourth edition,Qiagen)所述的方法进行。将菌体悬浮于裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,10mM咪唑(imidazole)),pH 8.0)中，并利用超音波破碎仪将菌体破碎后。离心(8,000×g，15分钟)收集上清液部分。将上清液注入含有1mL Ni-NTA树脂的管柱中，此阶段重组抗原会结合至树脂上。之后加入15mL的清洗缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,20mM咪唑,pH 8.0)洗涤树脂，以洗除非特异性结合的蛋白质。最后加入20mL的溶离缓冲液(50mMNaH₂PO₄,300mM NaCl,250mM咪唑,pH 8.0)冲提树脂上的重组抗原，其是藉助高浓度的与重组蛋白质竞争树脂结合部位，致使重组抗原自树脂上被冲提下来。利用蛋白质电泳观察重组抗原的纯化情形。图3显示确实可利用本发明的重组抗原N端所标记的His tag，经由固定化金属离子亲和层析法来纯化得到本发明的重组抗原。

实施例六：小鼠抗血清试验

本实施例使用五周龄的BALB/c雌小鼠(国家动物实验中心)。将小鼠饲养在具备空调设备的标准动物房中，并供应饲料及干净饮水。于饲养7天后开始进行免疫试验。将前述实施例中纯化的重组抗原(100μg)与佐剂(弗氏完全或不完全佐剂)以三向接头混合均匀后，利用皮下注射的方式将佐剂/抗原混合液注射至小鼠体内。第一次注射含弗氏完全佐剂的乳化疫苗，尔后每隔7天注射一次含弗氏不完全佐剂的乳化疫苗，连续两次。于第二次注射后7天，以眼窝采血的方式进行血液的收集。

将取得的血液放置在室温1小时后，再于4℃下放置隔夜，使血液凝固。接着，离心(5,000×g)凝固的血液30分钟，以获得抗血清。此抗血清中即含有针对重组抗原的特异性抗体。

接着，使用所得的抗血清侦测猪肺炎霉浆菌的全细胞萃取物(total celllysate)。实验步骤略述为：将猪肺炎霉浆菌PRIT-5的菌体悬浮于SET缓冲液(50mM葡萄糖,25mM-HCl,10mM EDTA,pH 8.0)中，加入5倍的样本缓冲液(312.5mM Tris-HCl(pH 6.8),50％glycerol,10％SDS,0.05％溴酚蓝)，于混合均匀后，将样品放置于100℃下加热5分钟。接着，将样品装载至样品槽中进行蛋白质电泳。电泳完毕后，将胶片浸泡于转印缓冲液中(25mM Tris碱,192mM甘氨酸,10％(v/v)甲醇,pH 8.3)。剪取适当大小的PVDF膜，以甲醇浸润数秒后，用去离子水冲洗一遍，再浸泡于转印缓冲液中。胶体与PVDF膜于转印缓冲液中浸泡15分钟后，依滤纸、胶片、PVDF膜、滤纸的顺序放入半干式转渍器中，于适当电流下进行转印。待转印完成后，将PVDF膜浸泡于20mL的填塞缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl,5％脱脂乳,pH7.4)中。于室温下填塞一小时后，加入10μL重组抗原的抗血清(稀释2000倍)，于室温下震荡1小时。之后，将填塞缓冲液倒除，以20mL TBST缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl,0.05％Tween-20,pH7.4)洗涤PVDF膜，重复进行洗涤三次(5分钟/次)。加入20mL的填塞缓冲液以及4μL碱性磷酸酶共轭山羊抗鼠抗体(alkaline phosphatase-conjugated goatanti-mouse IgG(H+L)，于室温下震荡1小时。以TBST缓冲液洗涤PVDF膜三次，即可加入NBT/BCIP溶液进行呈色反应。

实验结果显示，本发明的重组抗原与适当佐剂混合后，确实可以诱发小鼠产生抗抗原的抗体(anti-antigen antibody)，意味着本发明的蛋白质确实可以作为免疫原(immunogen)(图4)。

实施例七：猪只免疫试验及攻毒试验

1.疫苗制备

分别将一种或多种前述实施例中纯化的重组抗原与佐剂均匀混合后，制成亚单位疫苗或鸡尾酒疫苗。疫苗每剂的剂量为2mL，每剂每种蛋白质的含量为200μg。

2.猪只免疫试验

以亚单位疫苗及鸡尾酒疫苗进行猪只免疫试验。由中国台湾动物科技研究所二代SPF猪舍所购入的2周龄SPF猪只，所有猪只均饲养于SPF实验猪舍待用，使用的饲料、饲养环境及条件均相同。

于猪只21日龄时，以肌肉注射方式施予2mL的前述疫苗。再分别于21、42、70及98日龄时，进行采血并分离血清。利用IDEXX霉浆菌抗体试验套组进行血清抗体分析。操作步骤如下所述。首先将10μL血清与390μL样品稀释液(Sample Diluent)混和均匀后，取100μL稀释液放入已包覆猪肺炎霉浆菌抗原的96孔盘中。同时，取100μL阳性血清及100μL阴性血清放入不同的孔洞中。于室温下放置30分钟后，将多孔微盘的液体倒除，并加入350μL洗涤溶液重复进行三次清洗程序。取100μL山葵过氧化酶标示抗猪抗体加入96孔盘中，于室温下放置30分钟。之后，将多孔微盘中的液体倒除，加入350μL的洗涤溶液重复进行三次清洗程序。取100μL的TMB受质溶液加入96孔盘中，于室温下放置15分钟后，再加入100μL停止溶液终止呈色反应。最后，以ELISA读取器于650nm下测定每孔盘的吸光值，并利用读取值计算S/P值。S/P值＝(试验组的OD₆₅₀值－阴性对照组的OD₆₅₀值)/(阳性对照组的OD₆₅₀值－阴性对照组的OD₆₅₀值)。当S/P值越大，代表抗猪肺炎霉浆菌蛋白质的抗体越多。实验结果显示，本发明的抗原皆得以诱发免疫反应，其中又以P46疫苗及鸡尾酒疫苗组(即同时含有P46、Tuf、MHP30、及NrdFC抗原的4蛋白质疫苗组)的诱发效果最为显著，且其诱发的免疫反应可维持至14周龄(图5)。

3.攻毒试验

本实验采用以M.hyopneumoniae PRIT-5所制成的疫苗MH-PRIT-5作为实验中的对照组，以评估前述制得的亚单位疫苗及鸡尾酒疫苗的免疫效果。由中国台湾动物科技研究所二代SPF猪舍所购入的4周龄SPF猪只，所有猪只均饲养于SPF实验猪舍待用，使用的饲料、饲养环境及条件均相同。

用于进行攻毒试验的霉浆菌液的制备方法概略为：撷取一块经霉浆菌感染的猪只的肺脏(约3×3cm²)，于20mL的Friis培养基中将肺脏组织磨碎，再以148.8×g的转速离心10分钟。收集上清液到另一干净的离心管中，再以7,870×g的转速离心40分钟。接着，去除上清液，以6mL的Friis培养基将离心管中的沉淀物制为悬浮液。然后，依序以5μm、及0.45μm过滤膜过滤前述悬浮液，即制得本实验所需的攻毒菌液。

于实验猪只35日龄时，以肌肉注射方式施予2mL前述疫苗。于49日龄时，以相同方式再次进行猪只免疫试验。经疫苗免疫的猪只在63日龄时，以气管攻毒的方式，将前述攻毒菌液(5mL)打入经麻醉的实验猪只的气管。攻毒28天后，将猪只牺牲并进行解剖，取出实验猪只的肺部以评估免疫效果。病变点数的评估方式是，左右心叶及左右尖叶若有病变，则分别记为10分；心尖叶及左右膈叶若有病变，则分别记为5分，总分为55分。实验结果如下表四中所载。

表四：攻毒试验的肺部病变评分表

抗原组合	肺部病变点数
		MHP30	27
P46	25
		NrdFC	26
Tuf	23
		MHP30+NrdFC+P46+Tuf	17
PRIT-5疫苗组(阳性对照组)	23
		未免疫组(阴性对照组)	30

由表四中所载实验数据可知，使用单一种本发明的抗原所制得的亚单位疫苗皆有与习用疫苗相去不远的免疫效果，而本发明的鸡尾酒疫苗(即同时含有P46、Tuf、MHP30、及NrdFC抗原的4蛋白质疫苗组)的免疫效果则显著地优于习用疫苗。总结而言，本发明的蛋白质确实都可以作为疫苗的活性成分使用，而本发明并证实了该些蛋白质于鸡尾酒疫苗的形式下产生了加乘的免疫效果。

所属领域的技术人员当可了解，在不违背本发明精神下，依据本案实施态样所能进行各种变化。因此，显见所列的实施态样并非用以限制本发明，而是企图在所附申请专利范围的定义下，涵盖于本发明的精神与范畴中所做的修改。

序列表

<110> 财团法人农业科技研究院

<120> 防治霉浆菌感染的组合物

<130> GPI13TW3599-CN-1

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 1

Met Lys Lys Met Leu Arg Lys Lys Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Ile Tyr

1 5 10 15

Ala Thr Ser Leu Ala Ser Ile Ile Ala Phe Val Ala Ala Gly Cys Gly

20 25 30

Gln Thr Glu Ser Gly Ser Thr Ser Asp Ser Lys Pro Gln Ala Glu Thr

35 40 45

Leu Lys His Lys Val Ser Asn Asp Ser Ile Arg Ile Ala Leu Thr Asp

50 55 60

Pro Asp Asn Pro Arg Trp Ile Ser Ala Gln Arg Asp Ile Ile Ser Tyr

65 70 75 80

Val Asp Glu Thr Glu Ala Ala Thr Ser Thr Ile Thr Lys Asn Gln Asp

85 90 95

Ala Gln Asn Asn Trp Leu Thr Gln Gln Ala Asn Leu Ser Pro Ala Pro

100 105 110

Lys Gly Phe Ile Ile Ala Pro Glu Asn Gly Ser Gly Val Gly Thr Ala

115 120 125

Val Asn Thr Ile Ala Asp Lys Gly Ile Pro Ile Val Ala Tyr Asp Arg

130 135 140

Leu Ile Thr Gly Ser Asp Lys Tyr Asp Trp Tyr Val Ser Phe Asp Asn

145 150 155 160

Glu Lys Val Gly Glu Leu Gln Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu

165 170 175

Gly Lys Glu Asp Gly Ala Phe Asp Ser Ile Asp Gln Met Asn Glu Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser His Met Pro Gln Glu Thr Ile Ser Phe Tyr Thr Ile Ala

195 200 205

Gly Ser Gln Asp Asp Asn Asn Ser Gln Tyr Phe Tyr Asn Gly Ala Met

210 215 220

Lys Val Leu Lys Glu Leu Met Lys Asn Ser Gln Asn Lys Ile Ile Asp

225 230 235 240

Leu Ser Pro Glu Gly Glu Asn Ala Val Tyr Val Pro Gly Trp Asn Tyr

245 250 255

Gly Thr Ala Gly Gln Arg Ile Gln Ser Phe Leu Thr Ile Asn Lys Asp

260 265 270

Pro Ala Gly Gly Asn Lys Ile Lys Ala Val Gly Ser Lys Pro Ala Ser

275 280 285

Ile Phe Lys Gly Phe Leu Ala Pro Asn Asp Gly Met Ala Glu Gln Ala

290 295 300

Ile Thr Lys Leu Lys Leu Glu Gly Phe Asp Thr Gln Lys Ile Phe Val

305 310 315 320

Thr Gly Gln Asp Tyr Asn Asp Lys Ala Lys Thr Phe Ile Lys Asp Gly

325 330 335

Asp Gln Asn Met Thr Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Val Leu Gly Lys Val

340 345 350

Ala Val Glu Val Leu Arg Val Leu Ile Ala Lys Lys Asn Lys Ala Ser

355 360 365

Arg Ser Glu Val Glu Asn Glu Leu Lys Ala Lys Leu Pro Asn Ile Ser

370 375 380

Phe Lys Tyr Asp Asn Gln Thr Tyr Lys Val Gln Asp Lys Asn Ile Asn

385 390 395 400

Thr Ile Leu Val Ser Pro Val Ile Val Thr Lys Ala Asn Val Asp Asn

405 410 415

Pro Asp Ala

<210> 2

<211> 402

<212> PRT

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 2

Met Ala Val Val Lys Thr Thr Gly Lys Lys Asp Phe Asp Arg Ser Lys

1 5 10 15

Glu His Ile Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr

20 25 30

Thr Leu Thr Ala Ala Ile Ser Thr Val Leu Ala Lys Arg Gly Leu Ala

35 40 45

Glu Ala Lys Asp Tyr Ala Ser Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Lys Ala

50 55 60

Arg Gly Ile Thr Ile Asn Thr Ala His Ile Glu Tyr Ser Thr Asp Lys

65 70 75 80

Arg His Tyr Ala His Val Asp Cys Pro Gly His Ala Asp Tyr Ile Lys

85 90 95

Asn Met Ile Thr Gly Ala Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Gly Pro Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu

115 120 125

Ser Lys Gln Val Gly Val Pro Lys Met Val Val Phe Leu Asn Lys Ile

130 135 140

Asp Leu Leu Glu Gly Glu Glu Glu Met Val Asp Leu Val Glu Val Glu

145 150 155 160

Ile Arg Glu Leu Leu Ser Ser Tyr Asp Phe Asp Gly Asp Asn Thr Pro

165 170 175

Ile Ile Arg Gly Ser Ala Arg Gly Ala Leu Glu Gly Lys Pro Glu Trp

180 185 190

Glu Ala Lys Val Leu Glu Leu Met Asp Ala Val Asp Ser Tyr Ile Asp

195 200 205

Ser Pro Val Arg Glu Met Asp Lys Pro Phe Leu Met Ala Val Glu Asp

210 215 220

Val Phe Thr Ile Thr Gly Arg Gly Thr Val Ala Thr Gly Lys Val Glu

225 230 235 240

Arg Gly Gln Val Lys Leu Asn Glu Glu Val Glu Ile Val Gly Tyr Arg

245 250 255

Glu Glu Pro Lys Lys Thr Val Ile Thr Gly Ile Glu Met Phe Asn Lys

260 265 270

Asn Leu Gln Thr Ala Met Ala Gly Asp Asn Ala Gly Val Leu Leu Arg

275 280 285

Gly Val Asp Arg Lys Asp Ile Glu Arg Gly Gln Val Ile Ala Lys Pro

290 295 300

Lys Thr Ile Ile Pro His Thr Lys Phe Lys Ala Ala Ile Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Lys Lys Glu Glu Gly Gly Arg His Thr Pro Phe Phe Lys Asn Tyr Lys

325 330 335

Pro Gln Phe Tyr Phe Arg Thr Thr Asp Val Thr Gly Gly Ile Glu Phe

340 345 350

Glu Pro Gly Arg Glu Met Val Ile Pro Gly Asp Asn Val Asp Leu Thr

355 360 365

Val Glu Leu Ile Ala Pro Ile Ala Val Glu Gln Gly Thr Lys Phe Ser

370 375 380

Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Thr Val Thr Glu Ile

385 390 395 400

Ile Lys

<210> 3

<211> 282

<212> PRT

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 3

Ala Lys Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys

1 5 10 15

Gly Glu Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val

20 25 30

Lys Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala

35 40 45

Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys

65 70 75 80

Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro

85 90 95

Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu

100 105 110

Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys

115 120 125

Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser Pro Lys Thr Pro Glu Ile Asn Val Phe

145 150 155 160

Leu Glu Leu Val His Gln Ser Glu Tyr Glu Glu Gln Lys Ile Ile Lys

165 170 175

Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu Asn Leu Gln Tyr Gln Phe Gln Glu Val

180 185 190

Lys Val Ala Ser Asp Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His Pro Met Met Thr

195 200 205

Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln

210 215 220

Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ser Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Thr Ser Asn Gln Gln Ser

245 250 255

Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Pro Asp Leu Gly Lys Lys Ile

260 265 270

Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln Gly Lys Asn

275 280

<210> 4

<211> 96

<212> PRT

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 4

Asp Leu Leu Tyr Lys Leu Ile Glu Leu Glu Lys Asp Tyr Leu Tyr Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Ser Glu Val Gly Leu Ala Glu Ser Ala Ile Lys Phe Ser Ile

20 25 30

Tyr Asn Ala Gly Lys Phe Leu Gln Asn Leu Gly Tyr Asp Ser Pro Phe

35 40 45

Ser Lys Glu Glu Thr Glu Ile Glu Pro Glu Ile Phe Ser Gln Leu Ser

50 55 60

Ala Arg Ala Asp Glu Asn His Asp Phe Phe Ser Gly Asn Gly Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Val Met Ala Leu Ala Glu Glu Thr Glu Asp Glu Asp Trp Glu Phe

85 90 95

<210> 5

<211> 1260

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 5

atgaaaaaaa tgcttagaaa aaaattcttg tattcatcag ctatttatgc aacttcgctt 60

gcatcaatta ttgcatttgt tgcagcaggt tgtggacaga cagaatcagg ttcgacttca 120

gattctaaac cacaagccga gactctaaaa cataaagtaa gtaatgattc tattcgaata 180

gcactaaccg atccggataa tcctcgatga attagtgccc aaagagatat tatttcttat 240

gttgatgaaa cagaggcagc aacttcaaca attacaaaaa accaggatgc acaaaataac 300

tgactcactc agcaagctaa tttaagtcca gcgccaaaag gatttattat tgcccctgaa 360

aatggaagtg gagttggaac tgctgttaat acaattgctg ataaaggaat tccgattgtt 420

gcctatgatc gactaattac tggatctgat aaatatgatt ggtatgtttc ttttgataat 480

gaaaaagttg gtgaattaca aggtctttca cttgctgcgg gtctattagg aaaggaagat 540

ggtgcttttg attcaattga tcaaatgaat gaatatctaa aatcacatat gccccaagag 600

acaatttctt tttatacaat cgcgggttcc caagatgata ataactccca atatttttat 660

aatggtgcaa tgaaagtact taaagaatta atgaaaaatt cgcaaaataa aataattgat 720

ttatctcctg aaggcgaaaa tgctgtttat gtcccaggat gaaattatgg aactgccggt 780

caaagaatcc aatcttttct aacaattaac aaagatccag caggtggtaa taaaatcaaa 840

gctgttggtt caaaaccagc ttctattttc aaaggatttc ttgccccaaa tgatggaatg 900

gccgaacaag caatcaccaa attaaaactt gaaggatttg atacccaaaa aatctttgta 960

actggtcaag attataatga taaagccaaa acttttatca aagacggcga tcaaaatatg 1020

acaatttata aacctgataa agttttagga aaagttgctg ttgaagttct tcgggtttta 1080

attgcaaaga aaaataaagc atctagatca gaagtcgaaa acgaactaaa agcaaagcta 1140

ccaaatattt catttaaata tgataatcaa acatataaag tacaagataa aaatattaat 1200

acaattttag taagtccagt aattgttaca aaagctaatg ttgataatcc tgatgcctaa 1260

<210> 6

<211> 1209

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 6

atggcagttg ttaaaacgac aggaaaaaaa gactttgatc gttccaaaga acatattaat 60

attggaacaa ttggtcatgt tgaccatgga aaaacaacac taacagcagc aatttcaact 120

gttttggcaa aaagaggact cgcggaggca aaggattatg cctcaattga tgcagctcct 180

gaagaaaaag cacgaggaat tacaattaat accgcccata ttgaatatag cactgacaaa 240

cggcactatg cccatgttga ttgcccaggt catgccgatt atataaaaaa tatgatcacc 300

ggagcggccc aaatggatgg agcaatttta gtggttgcag caaccgatgg cccaatgcct 360

caaactcgtg aacacatttt attatcaaaa caagttggtg tcccaaaaat ggttgttttc 420

cttaataaaa ttgacttact tgaaggcgaa gaagaaatgg ttgatttagt tgaggtcgaa 480

attcgcgaac ttctttcttc ttatgatttt gatggcgata atactccaat tattcgggga 540

tctgctcgtg gggcccttga aggaaaacct gaatgggagg caaaagtact tgaattgatg 600

gacgcagttg attcttatat tgactcacct gttcgggaaa tggataaacc ctttttgatg 660

gccgttgagg atgtttttac aattacagga cgtggaaccg tagcaacggg aaaagttgaa 720

agaggtcaag ttaaactaaa cgaagaagtg gaaattgtgg gttatcgcga agaacctaaa 780

aagaccgtaa tcaccggaat tgaaatgttt aataaaaatc ttcaaactgc gatggctggg 840

gataatgccg gtgttctcct acgtggagta gatcgaaaag atatcgaacg tggtcaggtt 900

attgcaaaac caaaaacaat tataccgcat acaaaattta aagctgcaat ttatgccctt 960

aaaaaagaag aaggcggaag gcatacacca tttttcaaaa attataaacc acaattttat 1020

tttcgaacta ccgatgtaac aggcggaatc gagtttgaac caggtcgcga gatggtaatt 1080

ccgggggata atgttgatct taccgttgaa ttaattgccc caattgccgt tgagcaggga 1140

accaaattct cgatccgaga aggtggtaga accgtgggtg ccggaacagt taccgaaatt 1200

attaaataa 1209

<210> 7

<211> 849

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 7

gcaaaattag acgataatct tcagtattca tttgaagcta tcaaaaaagg ggaaactaca 60

aaagaaggta aaagagaaga agtagataaa aaagttaagg aattagataa taaaataaaa 120

ggtatattgc ctcagccccc agcggctaaa ccagaagcag caaaaccagt agcggctaaa 180

ccagaagcag caaaaccagt agcggctaaa cctgaagcag caaaaccagt agcggctaaa 240

cctgaagcag caaaaccagt tgcggctaaa cctgaagcag caaaaccagt tgcggctaaa 300

cctgaagcag caaaaccagt tgcagctaaa cctgaagcag caaaaccagt tgctactaat 360

actggctttt cacttacaaa taaaccaaaa gaagactatt tcccaatggc ttttagttat 420

aaattagaat atactgacga aaataaatta agcccaaaaa caccggaaat taatgtattt 480

ttagaactag ttcatcaaag cgagtatgaa gaacaaaaaa taataaagga actagacaaa 540

actgttttaa atcttcaata tcaattccag gaagtcaagg tagctagtga tcaatatcag 600

aaacttagcc acccaatgat gaccgaggga tcttcaaatc aaggtaaaaa agcagaggga 660

gctcctaacc aagggaaaaa agcagaggga gctcctaacc aagggaaaaa agcagagggc 720

gctcctagtc aaggaaaaaa agccgaagga acttctaacc aacaaagccc aactaccgaa 780

ttaactaatt accttcctga cttaggtaaa aaaattgacg aaatcattaa aaaacaaggt 840

aaaaattaa 849

<210> 8

<211> 291

<212> DNA

<213> Mycoplasma hyopneumoniae

<400> 8

gatctattat ataaactaat tgaattagaa aaagattatc tctatgattt atattctgaa 60

gttggacttg ctgaatcagc aataaaattt agcatttata atgccgggaa attcttgcaa 120

aatctaggat atgattcacc tttttcaaaa gaggaaaccg aaattgaacc tgaaattttt 180

agtcaattat cggctcgagc tgatgaaaat catgactttt tttcaggaaa tggctcttct 240

tatgtaatgg cgcttgctga agaaaccgaa gatgaagatt gggagtttta a 291

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 9

gatataggat ccgcaaaatt agacgataat cttcagtatt ca 42

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 10

caatatgtcg acttaatttt taccttgttt tttaatgatt tcgtc 45

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 11

gatataggat ccatgaaaaa aatgcttaga aaaaaattct tg 42

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 12

caatatgtcg acttaggcat caggattatc aacattagc 39

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 13

gatataggat ccgatctatt atataaacta attgaattag aaaaagatta tc 52

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 14

caatatgtcg acttaaaact cccaatcttc atcttcg 37

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 15

gatataggat ccatggcagt tgttaaaacg acaggaaaa 39

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 16

caatatgtcg acttatttaa taatttcggt aactgttccg gca 43

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 17

ctctttgggc actaatccat cgaggattat ccgg 34

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 18

ccggataatc ctcgatggat tagtgcccaa agag 34

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 19

attagcttgc tgagtgagcc agttattttg tgcatcc 37

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 20

ggatgcacaa aataactggc tcactcagca agctaat 37

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 21

cggcagttcc ataattccat cctgggacat aaac 34

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PRIMER

<400> 22

gtttatgtcc caggatggaa ttatggaact gccg 34

Claims

1.一种防治猪霉浆菌感染的组合物，其包含：

第一活性成分，其包含P46及

生物可接受的佐剂；

其中前述P46的氨基酸序列为SEQ ID NO：01所示。

2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含第二活性成分，其包含MHP30、NrdFC、或其组合的蛋白质；其中前述MHP30的氨基酸序列为SEQ ID NO：03所示；NrdFC的氨基酸序列为SEQ ID NO：04所示。

3.如权利要求1所述的组合物，其中前述第一活性成分的浓度为20至2000μg/mL，其是以前述组合物的总体积为基础。

4.如权利要求2所述的组合物，其中前述第一活性成分及/或前述第二活性成分的浓度为20至2000μg/mL，其是以前述组合物的总体积为基础。

5.如权利要求1或2所述的组合物，其中前述生物可接受的佐剂为：弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳液或其组合。

6.如权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含生物可接受的添加剂。

7.如权利要求6所述的组合物，其中前述生物可接受的添加剂为溶剂、安定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂、等张剂、吸收延缓剂或其组合。

8.如权利要求2所述的组合物，其包含P46、MHP30、及NrdFC。