TWI599579B

TWI599579B - 已分離之胜肽群及其用途

Info

Publication number: TWI599579B
Application number: TW101124838A
Authority: TW
Inventors: 陳全木; 陳小玲
Original assignee: 國立中興大學
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2017-09-21
Also published as: TW201402612A

Description

已分離之胜肽群及其用途

本發明係有關具生物活性之胜肽，特別係指一種已分離之胜肽群及其用途。

按，全球人口結構已逐步邁向高齡化的社會，銀髮族除了面對癌症、腦中風、心肌梗塞等疾病之威脅外，骨質疏鬆症(osteoporosis)也逐漸受到重視。詳言之，人體的骨骼質量自出生後逐漸增加，直到三十歲前為最高峰，爾後則逐年下降，尤其停經後之婦女因大幅減少可促骨質生成之荷爾蒙雌激素，骨質流失速率更快。而患有骨質疏鬆症者，骨骼變得鬆脆，很容易發生骨骼碎裂等情形，尤其是老年人跌倒時容易引起大腿骨、頸部骨折，造成從此臥床或經常性腰痛，並且骨骼碎裂極難治癒。根據統計，台灣地區因骨質疏鬆症而發生骨折的機率，約為腦中風之2至4倍。估計到2050年，全世界因骨質疏鬆症引起之骨折發生率將比現在增加六倍，其中以亞洲地區為最多。台灣之健保局於2009之資料顯示，台灣地區停經後婦女之骨質疏鬆症發生率約為25%，而男性也無可倖免，至少每五位將有一位會罹患骨質疏鬆症。再者，統計顯示，約10~20%之髖骨骨折病人在第一年會死亡，幾乎和乳癌末期之死亡率相當。此外，骨質疏鬆症患者有50%無法獨立生活，20~25%無法獨立行動，換言之，醫療體系及社會必須付出龐大之社會成本與醫療資源。因此，正視骨質疏鬆之預防保健，為刻不容緩之重要研究議題。

骨質疏鬆症造成骨折之因素主要決定於骨密度，因此，治療之目標在於防堵骨質流失或補強已流失之骨質量。目前已有數種治療藥劑具有減緩骨質流失速度之效果，包含抑鈣素(calcitonin)、荷爾蒙療法(hormone therapy)和雙磷酸鹽藥物(bisphosphonate)等，其作用原理主要為降低骨骼吸收作用(bone resorption)；另一類是「同化性」藥物，如以副甲狀腺素(簡稱PTH)刺激骨母細胞，加速骨質生成(Riggs and Melton,1988)。此二類藥物主要用於治療已發生骨質疏鬆症之患者，惟，仍具有以下缺失，其一、對於年過三十骨質開始流失但未達骨質疏鬆標準者，則無法使用藥物；其二、服用雙磷酸鹽藥物會使患者產生顎骨壞死之副作用。而為了避免上述缺失，市面上亦推出眾多用以補充鈣質之營養品，目的在於防止骨質流失且補充骨骼鈣質，然營養補充品對於骨骼流失之控制並無實際效用，且無法有效地使人體吸收鈣質，難以補充骨骼鈣質。

近年來，天然物中生物活性肽(bioactive peptide)之研究發展快速，研究之結果已指出許多來自牛乳蛋白質之胜肽係具有生理活性，如抗高血壓(antihypertensive)、類嗎啡(opioid-like)、免疫調節(immunomodulating)、抗血栓(antithromobotic)、抗菌(antimicrobial)、與促進鈣質吸收(calcium-absorption enhancing)等(Zinn,1998；Yamamoto,1998；Shan,2000)。是以，若干研究皆致力於自天然物中獲得能夠具有改善骨質疏鬆症之蛋白質，惟，天然物中雖具有不同生理活性之胜肽，並不具有如化學合成藥物所產生之副作用，然，大部分之生物活性肽，包含ACE抑制肽、抗菌胜肽以及抗高血壓肽，都需要從原先之蛋白質被酵素水解成小片段之寡肽後，方能發揮其生理活性作用(Meisel,1999)，且發酵食品或非發酵食品係經適當之酵素水解後可增進其功能性(Vermeirssen et al.,2003；Hernandez-Ledesma et al.,2004)。

據此，如何自天然物中獲得具有生理活性之小分子胜肽，使該胜肽於生物體發揮其生理活性作用而能夠確切地具有改善骨質疏鬆症之症狀，實為目前生醫藥學研究之重要課題。

本發明之主要目的即在於提供一種已分離之胜肽群，其係為第十一圖至第十八圖中之任一圖中標號1至7所組成者。該已分離之胜肽群係用以於一生物體上提供降低骨質流失之效果，而可應用於食品、營養補充品及醫藥製品，以達到預防或治療骨質疏鬆症以及補充骨質所需營養之功效。

更進一步而言，該已分離之胜肽群係分離純化自一動物乳經克弗爾菌元或至少一由克弗爾菌元所分離之菌株於一預定發酵條件下進行發酵反應而得者，其中：將該由克弗爾菌元(kefir grain)所發酵之動物乳以高層次液相層析儀於一預定分析條件進行分析後，該胜肽群為高層次液相層析圖中分子大小小於2kD之波段，且其滯留時間為20~40分鐘；而該分析條件如下：檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱，沖提液為100mM磷酸鹽緩衝液、1M氯化鈉以及1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)，酸鹼值6.5，流速為0.5ml/min。

其中，該動物乳係可取自牛、羊、綿羊、豬、馬等動物。

本發明之次一目的係在於提供一種營養補充品，其成份至少包含上述胜肽群及一預定營養成份，其中，該營養成份係為一礦物元素，例如鈣離子。

較佳地其中，該胜肽群係為第十一圖至第十八圖中之任一圖中標號1至7所組成之胜肽群者。

本發明之另一目的係在於提供一種食品，如一發酵乳製品，其成份至少包含上述胜肽群及一食品成份。

較佳地，該胜肽群係為第十一圖至第十八圖中之任一圖中標號1至7所組成之胜肽群者。

本發明之再一目的係在提供一種治療骨質疏鬆症之醫藥組合物，其係至少包含一有效成份及醫藥上可接受之載體和/或賦形劑，而得以口服方式給予，其中，該有效成份上述所揭之胜肽群。

較佳地，該有效成份係為第十一圖至第十八圖中之任一圖中標號1至7所組成之胜肽群者。

本發明之又一目的係在於提供一種用以抑制骨質流失之醫藥組合物，其係至少包含一有效成份及醫藥上可接受之載體和/或賦形劑，而得以口服方式給予，其中，該有效成份係為上述所揭之胜肽群。

本發明所揭一種已分離之胜肽群，其係分離自一以克弗爾菌元或是由該克弗爾菌元所分離出之菌株發酵之動物乳，其中，該胜肽群係為第十一圖至第十八圖中之任一圖中標號1至7所組成者。更進一步而言，經由發酵反應能有效地將該動物乳中之大分子蛋白質分解為如第十一圖至第十八圖中之任一圖中標號1至7所示之小片段胜肽群，並各該胜肽係未被發現於未經發酵反應之動物乳中。

而由先前文獻(ZEYNEP B.GUZEL-SEYD^．IM et al.2011)中可知，由克弗爾菌元所分離出之菌株包含有乳酸菌及酵母菌，其中，乳酸菌之菌屬更包含有Lactobacillus，Lactococcus，Streptococcus，Leuconostoc及Acetobacter；酵母菌之菌屬更包含有Saccharomyces，Candida，Kluyveromyces，Issatchenkia，Pichia及Torulopsis。

再者，該已分離之胜肽群於生物體中係具有良好地改善骨質疏鬆症、防止骨質流失、促進鈣質吸收等功效。

因此，該已分離之胜肽群係得直接應用於生物體中。該已分離之胜肽群係得作為一食品組成份，如發酵乳製品；或該已分離之胜肽群係得搭配至少一營養成份，作為一營養補充品，如含有鈣離子之營養補充品；或將該已分離之胜肽群係與至少一醫藥上可接受之載體以傳統已知方法，製備成一醫藥組合物，用以治療骨質疏鬆症或是抑制骨質流失。

其中，該醫藥組合物可依據口服投予之需要而選擇適合之形式，如顆粒狀、丸型、錠劑、粉末、液體等。

以下，將藉由若干實例搭配圖式更詳細地說明本發明。

實例一：製備新穎乳發酵產物

取一定量之動物乳作為一原料乳，並以一定量之克弗爾菌元(kefir qrain)進行發酵反應，而產製出一發酵乳，其內含有本發明所揭之已分離之胜肽群。

實例二：骨質疏鬆症小鼠動物模式之試驗

本實例係採用複數隻雌性C57BL/6J純品系之黑鼠，其係購自台大實驗動物中心。

將該小鼠於八週齡時分別以手術操作切除卵巢，用以作為模擬停經後之骨質疏鬆症小鼠。再將該骨質疏鬆症小鼠分為三組，並增加一組經手術處理但未切除卵巢之小鼠做為假手術對照組，而各該組小鼠皆以不同條件處理，其中，第一組係為僅餵食水之假手術對照組；第二組係僅餵食水之骨質疏鬆症小鼠；第三組係餵食該發酵乳之骨質疏鬆症小鼠；第四組係餵食該發酵乳加鈣之骨質疏鬆症小鼠。各該組小鼠分別生長至一定周齡後予以犧牲，而各組小鼠之每週體重變化如第一圖所示。

實例三：該發酵乳及其與鈣之組合物係具有延緩骨質疏鬆之活性

將各組小鼠犧牲後，分別將第一組至第四組小鼠以高解析X-光微型電腦斷層掃描及電子顯微鏡分析各組小鼠之膝蓋端生長板骨小樑(Trabecular bone)。

各組小鼠之膝蓋端生長板之橫向截面μ-CT掃描影像圖及其μ-CT掃描3D影像圖係分別如第二圖及第三圖所示，其中，第二圖A及第三圖A係為第一組小鼠，第二圖B及第三圖B係為第二組小鼠，第二圖C及第三圖C係為第三組小鼠，第二圖D及第三圖D係為第四組小鼠。

各組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面μ-CT掃描影像圖及其局部放大μ-CT掃描影像圖係分別如第四圖及第五圖所示，其中，第四圖A及第五圖A係為第一組小鼠，第四圖B及第五圖B係為第二組小鼠，第四圖C及第五圖C係為第三組小鼠，第四圖D及第五圖D係為第四組小鼠。

各組小鼠之膝蓋端生長板向縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖如第六圖所示，其中，第六圖A係為第一組小鼠，第六圖B係為第二組小鼠，第六圖C係為第三組小鼠，第六圖D係為第四組小鼠

更進一步以電腦軟體(CTAn)分析第二至六圖，計算出各組小鼠之骨佔組織體積比例、骨小樑骨礦物質密度(Bone Mineral Density；BMD)、骨小樑數量(Trabecular Number，Tb：N)及骨小樑分離度(Trabecular Separation/Spacing，Tb.Sp)，統計結果依序如第七圖至第十圖所示。

由第二至六圖之比對可知，相較於第一組小鼠，僅餵食水之第二組小鼠之骨質結構明顯鬆散、骨小樑數量較少，而餵食該發酵乳之第三組小鼠及同時餵食鈣及該發酵乳之第四組小鼠之骨質結構皆與第一組小鼠無顯著差異。

而再分析第七至十圖，更可清楚得知僅餵食水之第二組小鼠骨佔組織比例、骨小樑礦物質密度及數量顯著降低，而骨小樑分離度提高，皆顯示出第二組小鼠之骨質嚴重流失、骨吸收增加、骨質結構鬆散；而相對於第二組小鼠，餵食該發酵乳之第三組小鼠及同時餵食該發酵乳及鈣之第四組小鼠不論骨佔組織比例、骨小樑礦物質密度及數量皆顯著提昇，並有效降低骨小樑分離度，而皆與第一組小鼠之各項數據無顯著差異。

因此，由該實例可知該發酵乳及其與鈣之組合物確實可以延緩骨質疏鬆、增加骨礦物質密度。

實例四：分離純化該發酵乳

收集實例一中所製備之該發酵乳，分批取一定量以高效能液相層析系統(HPLC)將該發酵乳分離，其中，檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱，充提液為100mM磷酸鹽緩衝液、1M氯化鈉以及1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)，酸鹼值6.5，流速為0.5ml/min。

各批發酵乳之分離結果係分別如第十一圖至第十八圖所示，比對各圖之結果，可知各批發酵乳經高效能液相層析系統分離後可得到圖中標號為1至7之胜肽群，換言之，可知第十一圖至第十八圖中任一圖標號1至7之胜肽群於該發酵乳中具有再現性，並且，經由內插法計算可知波段(1)-(7)之滯留時間為20~40分鐘。

實例五：標號1至7之各該胜肽係為小片段胜肽

請參閱第十九圖，其係一定量之蛋白質標準品以高效能液相層析系統，並依據實例四中之分離條件進行分離所得之圖。

由於標號1至7之胜肽群於該發酵乳中皆有再現性，因此，於該實例中僅取第十一圖為例而與該蛋白質標準品之HPLC圖譜比對。將第十一圖及第十九圖相比對之結果如第二十圖所示，其中，第二十圖A係為第十一圖，第二十圖B係為第十九圖。

由第二十圖可知該發酵乳中之標號為1至7之胜肽群之分子大小分別小於2kD，換言之，該發酵乳中標號為1至7之各該胜肽皆為小片段之胜肽。

實例六：標號1至7小片段胜肽群係具有抗骨質疏鬆症之活性

請參閱第二十一圖，其係取實例一中一定量之未經發酵之該原料乳以高效能液相層析系統，並依據實例四中之分離條件進行分離所得之圖。

由於標號1至7之胜肽群於該發酵乳具有再現性，因此，於本實例中係取第十二圖為例而與該原料乳之HPLC圖譜相比對。將第十二圖及第二十一圖相比對之結果如第二十二圖所示，其中，第二十二圖A係為第十二圖，第二十二圖B係為第二十一圖。

據此，由第二十二圖可知未經發酵反應之該原料乳所分離出之蛋白質，相對於該發酵乳，大多屬於大分子，且並未出現如第二十二圖A所示標號1至7之小片段胜肽群。

藉由實例四至實例六之結果可知該發酵乳中所包含之小片段胜肽群1至7係為未發酵乳中所沒有者，而該發酵乳係具有顯著延緩骨質疏鬆及提昇骨礦物質密度之能力，因此，第十一圖至第十八圖中任一圖中標號1至7所組成之胜肽群係為具有抗骨質疏鬆症活性之胜肽群。

實例七：噴霧乾燥處理之該發酵乳係具有標號1至7所組成之胜肽群

於本實例中，將該發酵乳經噴霧乾糙處理後，取一定量以高效能液相層析系統(HPLC)將進行分離粉末狀之該發酵乳，其中，分離條件如同實例四中所述，而得到一HPLC圖譜，如第二十三圖所示。

由於實例二中各批次之該發酵乳中皆含有標號1至7之胜肽群，因此，僅取第十二圖為例而與第二十三圖相比對，結果如第十四圖所示，其中，第二十四圖A係為第二十三圖，第二十四圖B係為第十二圖。

由第二十四圖可知，即使將該發酵乳以噴霧乾燥處理後，仍會具有標號為1至7之小片段胜肽群。換言之，該小片段胜肽群係不會因為該發酵乳之處理方式而被破壞。

由上述各該實例之說明，可知本發明所揭已分離之胜肽群中係至少包含有第十一圖至第十八圖中任一圖之標號1至7所組成之胜肽群，而該胜肽群係分別為小片段而具有抗骨質疏鬆症之活性，用以增加骨佔組織比例、骨礦物質密度及數量、降低骨小樑分離率。再者，將該發酵乳添加鈣後，亦仍具有上述功效。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

1‧‧‧HPLC層析圖中之波段1

2‧‧‧HPLC層析圖中之波段2

3‧‧‧HPLC層析圖中之波段3

4‧‧‧HPLC層析圖中之波段4

5‧‧‧HPLC層析圖中之波段5

6‧‧‧HPLC層析圖中之波段6

7‧‧‧HPLC層析圖中之波段7

第一圖係為各組小鼠分別飼養不同週數之體重變化圖。

第二圖A係為第一組小鼠之膝蓋端生長板橫向截面μ-CT掃描影像圖。

第二圖B係為第二組小鼠之膝蓋端生長板橫向截面μ-CT掃描影像圖。

第二圖C係為第三組小鼠之膝蓋端生長板橫向截面μ-CT掃描影像圖。

第二圖D係為第四組小鼠之膝蓋端生長板橫向截面μ-CT掃描影像圖。

第三圖A係為第一組小鼠之膝蓋端生長板μ-CT掃描3D影像圖。

第三圖B係為第二組小鼠之膝蓋端生長板μ-CT掃描3D影像圖。

第三圖C係為第三組小鼠之膝蓋端生長板μ-CT掃描3D影像圖。

第三圖D係為第四組小鼠之膝蓋端生長板μ-CT掃描3D影像圖。

第四圖A係為第一組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面μ-CT掃描影像圖。

第四圖B係為第二組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面μ-CT掃描影像圖。

第四圖C係為第三組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面μ-CT掃描影像圖。

第四圖D係為第四組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面μ-CT掃描影像圖。

第五圖A係為第四圖A之局部放大圖。

第五圖B係為第四圖B之局部放大圖。

第五圖C係為第四圖C之局部放大圖。

第五圖D係為第四圖D之局部放大圖。

第六圖A係為第一組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。

第六圖B係為第二組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。

第六圖C係為第三組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。

第六圖D係為第四組小鼠之膝蓋端生長板縱向截面電子顯微鏡掃描影像圖。

第七圖係為各組小鼠之骨佔組織體積之統計直條圖。

第八圖係為各組小鼠之骨小樑骨礦物質密度之統計直條圖。

第九圖係為各組小鼠之骨小樑數量之統計直條圖。

第十圖係為各組小鼠之骨小樑分離度之統計直條圖。

第十一圖係為第一批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十二圖係為第二批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十三圖係為第三批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十四圖係為第四批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十五圖係為第五批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十六圖係為第六批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十七圖係為第七批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十八圖係為第八批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第十九圖係為蛋白質標準品之HPLC層析圖。

第二十圖A係為第十一圖。

第二十圖B係為第十九圖。

第二十一圖係為未經發酵之原料乳之HPLC層析圖。

第二十二圖A係為第十二圖。

第二十二圖B係為第二十一圖。

第二十三圖係為經噴霧乾燥處理之發酵乳之HPLC層析圖。

第二十四圖A係為第二十三圖。

第二十四圖B係為第十二圖。